JP2002542831A - 改変型ビタミンｋ依存性ポリペプチド - Google Patents

改変型ビタミンｋ依存性ポリペプチド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、膜結合親和力が増強されたビタミンＫ依存性ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは哺乳動物における血塊形成の調節に使用することができる。哺乳動物における血塊形成の調節方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 ビタミンＫ依存性タンパク質は、アミノ末端の45残基中に９〜13個のγ−カル
ボキシグルタミン酸残基(Gla)を含む。Gla残基は、肝臓内の酵素によって、ビタ
ミンＫを用いて、タンパク質前駆体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化
することにより産生される。ビタミンＫ依存性タンパク質は、いくらかの生物学
的プロセスに関与している。それらの中でも血液凝固が最もよく記述されている
(Frie,B.とFurie,B.C.，によって総説されている。1988，Cell, 53: 505-518)。
ビタミンＫ依存性タンパク質は、プロテインＺ、プロテインＳ、プロトロンビン
、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、Gas６などがある。後の方のタ
ンパク質は、細胞成長の調節において機能する(Matsubaraら、1996，Dev. Biol.
, 180：499-510)。 Gla残基は、これらのタンパク質による適当なカルシウム結
合と膜相互作用に必要である。第X因子の膜接触部位は、アミノ酸残基1〜37に存
在すると考えられている(EvansとNelsestuen, 1996，Protein Science 5 : supp
l. 1 ,163 Abs)。血漿タンパク質のGlaを含む領域は、高い配列相同性を示すが,
膜親和力においては、少なくとも1000倍の分布幅を持つ(McDonald,J.F.ら、1997
， Biochemistry, 36 ：5120-5137)。
【０００２】 第VII因子は、血液凝固の初期反応において機能し、血塊を形成する際のきっ
かけとなる要素である。不活性型前駆体、つまりチモーゲンは、酵素活性が低い
が、タンパク質分解のR152I153での切断によって、活性は大幅に増し、第VIIａ
因子を形成する。この活性化は、第VIIa組織因子だけでなく、第Xa因子(これら
は、いくらかの細胞型に見られる内在性膜タンパク質である)によっても触媒さ
れ得る( Fiore,M.M.ら、1994, J. Biol. Chem.,269 ： 143-149)。第VIIa組織因
子による活性化は、自己賦活であると言われる。それは、該活性化(第VII因子か
らの第VIIa因子の形成)と、第VIIa因子のその後の活性の、両方に関係する。in
vivoでの、活性化のための最も重要な経路は知られていない。第VIIａ因子は、
血液凝固第IX因子と第X因子を活性化し得る。
【０００３】 組織因子は、いくらかの腫瘍細胞の表面上に、高レベルで発現される。組織因
子と第VIIa因子は、腫瘍の発達と組織の浸潤における役割が考えられる(Vrana,
J. A .ら、Cancer Res., 56： 5063-5070)。 組織因子の細胞発現作用は、内毒
素性ショックに対する中毒反応の主要な要因でもある(Dackiw , A . A .ら、199
6 , Arch. Surg., 131 : 1273-1278)。
【０００４】 プロテインCは、内皮細胞の内在性膜タンパク質であるトロンボモジュリンの
存在下で、トロンビンによって活性化される( Esmon，N.L.ら、1982, J. Biol.
Chem.,257：859-864)。 活性型プロテインC(APC)は、その補因子であるプロテイ
ンＳと協同して、第Ｖａ因子と第VIIIａ因子を分解する。APCに対する抵抗性は
、先天的な血栓症の最も一般的な形態である( Dahlback, B.,1995，Blood，85 :
607-614)。 ビタミンＫ阻害剤は、一般的には、血栓症の予防のために投与され
る。
【０００５】 ビタミンＫ依存性タンパク質は、ある型の血友病を治療するのに用いられる。
血友病Ａは、活性型第VIII因子、第VIIIa因子の欠損、また第VIII因子の阻害剤
の存在により特徴づけられる。血友病Bは、活性型第IX因子、第IXa因子の欠損に
より特徴づけられる。第VII因子の欠損は、まれにしか見られないが、第VII因子
の投与に対してよく応答する( Baur, K. A.,1996，Haemostasis , 26 : 155-158
, suppl. 1)。 一部の患者においては、第VIII因子置換療法は、高力価の阻害性
第VIII因子抗体が生ずることにより制限される。その代わりに、第VIIa因子を血
友病AとBの治療に使うことができる。第IXa因子と第VIIIa因子は、第X因子を活
性化する。第VIIa因子は、第X因子を直接活性化することにより第IX因子と第VII
I因子の必要性を排除し、ほとんど免疫学的な結果をもたらすことなく第IX因子
と第VIII因子の欠損の問題を克服することができる( Hednerら、1993, Transfus
. Medi. Rev.,7 : 78-83 ; Nicolaisen, E. M.ら、1996, Thromb. Haemost., 76
: 200-204.)。第VIIa因子の有効な投与量はしばしば高く(体重1kgに対して45〜
90μg)、数時間ごとに繰り返し投与する必要があるかもしれない(Shulmav, S.
ら、1996, Thromb. Haemost., 75 : 432-436)。
【０００６】 膜接触領域を含まない組織因子の可溶性形態(可溶性組織因子、sTFと略す)は
、第VIIa因子と共に投与されると、血友病の治療において有効であることが見出
されている。例えば米国特許第 5,504,064号を参照されたい。イヌの場合、sTF
は、血友病の治療に必要とされる第VIIa因子の量を、減じることが示された。sT
F-VIIaによる膜会合は、第VII因子の膜接触部位に完全に依存する。これは、組
織因子とVII(a)の両方を介して膜に結合する正常の組織因子と第VIIa因子との複
合体と対照的である。
【０００７】発明の概要 ビタミンＫ依存性ポリペプチドのγ−カルボキシグルタミン酸(GLA)ドメイン
内の改変は該ポリペプチドの膜結合親和力を増強することが見出された。このよ
うな方法で改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドは増強された活性を有し、
抗凝血剤、前凝血剤(pro-coagulant)としてまたはビタミンＫ依存性タンパク質
を利用するその他の機能のために使用することができる。例えば、改良された第
VII因子分子は必要とされるVIIaの投与量、相対的投与回数を低減させることに
より、かつ／または欠損状態のより有効な治療を可能にする質的変化をもたらす
ことにより、いくつかの利点を提供する。
【０００８】 本発明は、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペ
プチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなるビタミンＫ
依存性ポリペプチドを特徴とする。実施形態のあるものでは、ビタミンＫ依存性
ポリペプチドの活性もまた増強される。改変型GLAドメインはアミノ酸１付近か
らアミノ酸45付近までであり、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。例えば、
アミノ酸置換はアミノ酸２、５、９、11、12、29、33、34、35または36およびそ
れらの組合せに存在し得る。特に、該アミノ酸置換は、アミノ酸11、12、29、33
または34、アミノ酸11、12、29、34または35、アミノ酸２、５または９、アミノ
酸５、９、35または36、アミノ酸11または12、アミノ酸29または33、あるいはア
ミノ酸34、35または36、およびそれらの組合せであってもよい。改変型GLAドメ
インは、カルシウム飽和状態で、電気陰性電荷のかさ(halo)と共に陽イオン性の
コアを有する三次構造を形成するアミノ酸配列を含むことができる。該ビタミン
Ｋ依存性ポリペプチドは血塊障害の治療に利用でき、また血塊形成を増加または
阻害(減少)させ得る。
【０００９】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、例えば、プロテインC、活性型プロテインC
、第IX因子、第IXa因子もしくは活性部位改変型第IXa因子、第VII因子、第VIIa
因子もしくは活性部位改変型第VIIa因子、プロテインS、プロテインＺまたは第X
a因子もしくは活性部位改変型第Xa因子である。活性部位改変型第VIIa因子であ
り得る。プロテインCまたは活性型プロテインCの改変型GLAドメインは、アミノ
酸11のグリシン残基、またはアミノ酸33のグルタミン酸残基の置換を含む。さら
に、プロテインCまたは活性型プロテインCのGLAドメイン内の置換には、アミノ
酸12のグルタミンまたはグルタミン酸残基、アミノ酸29のフェニルアラニン残基
、アミノ酸33のグルタミン酸残基、アミノ酸34のフェニルアラニン、ロイシン、
イソロイシンまたはアスパラギン酸残基、アミノ酸35のアスパラギン酸またはグ
ルタミン酸残基、あるいはアミノ酸36のグルタミン酸残基の１つ以上が含まれて
もよい。
【００１０】 第VII因子、第VIIa因子、および活性部位改変型第VIIa因子の改変型のGLAドメ
インは、アミノ酸11、29、33、34、もしくは35に置換を含んでいてもよく、また
それらを組み合わせて含んでいてもよい。例えば、アミノ酸11にグルタミン残基
、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、もしくはアスパラギン残基を置換す
ることができ、アミノ酸29にグルタミン酸残基もしくはフェニルアラニン残基を
置換することができ、アミノ酸33にグルタミン酸残基を置換することができ、ま
た残基11と29、残基11と29と33、および残基11と33に置換する場合のようにそれ
らを組み合わせることができる。アミノ酸11にグルタミン残基を置換することが
特に好ましい。１実施形態では、アミノ酸11にグルタミン残基を置換し、アミノ
酸33にグルタミン酸残基を置換する。改変型のGLAドメインはさらに、アミノ酸3
4もしくは35に少なくとも１個の疎水性残基を含有することができる。アミノ酸3
4にフェニルアラニン残基、ロイシン残基、もしくはイソロイシン残基を、およ
び／またはアミノ酸35にアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を置換し
てもよい。
【００１１】 プロテインＳの改変型のGLAドメインは、アミノ酸９にイソロイシン残基、ロ
イシン残基、バリン残基、またはフェニルアラニン残基の置換を含むことができ
る。さらなる置換として、アミノ酸34にフェニルアラニン残基、ロイシン残基、
イソロイシン残基、アスパラギン酸残基、もしくはグルタミン酸残基を、または
アミノ酸35にアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を含有することがで
きる。プロテインＳの改変型のGLAドメインは、アミノ酸５にフェニルアラニン
残基を含有することができ、さらにトロンビン感受性ループ中に、例えば、アミ
ノ酸49、60、または70に置換を含むことができる。活性部位改変型第IXa因子の
改変型のGLAドメインは、アミノ酸29にフェニルアラニン残基を、またはアミノ
酸５にフェニルアラニン残基、ロイシン残基、もしくはイソロイシン残基を含有
することができ、またそれらを組み合わせることができる。改変型のGLAドメイ
ンはさらに、アミノ酸34にフェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン
残基、アスパラギン酸残基、もしくはグルタミン酸残基を、またはアミノ酸35に
アスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を、あるいはアミノ酸34と35の両
方に置換を含むことができる。
【００１２】 活性部位改変型第Xa因子の改変型のGLAドメインは、アミノ酸11にグルタミン
残基を、またはアミノ酸35にアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を含
有することができる。プロテインZの改変型のGLAドメインは、アミノ酸２にアス
パラギン残基もしくはグルタミン残基を、アミノ酸34にフェニルアラニン残基、
ロイシン残基、もしくはイソロイシン残基を、またはアミノ酸35にアスパラギン
酸残基もしくはグルタミン酸残基を含有することができる。
【００１３】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変型のGLAドメインはさらに、不活性化さ
れた開裂部位を有することができる。例えば、第VII因子は、アミノ酸152にアラ
ニン残基を置換する場合のように不活性化された開裂部位を有し得る。
【００１４】 他の態様において、本発明は、ポリペプチドの膜結合親和力および活性を増強
する改変型のGLAドメインを含んでなるビタミンＫ依存性ポリペプチドを特徴と
する。そのようなポリペプチドの改変型のGLAドメインは、アミノ酸4に少なくと
も１個のアミノ酸挿入を含む。ポリペプチドは、第VII因子もしくは第VIIa因子
、プロテインＣもしくは活性型プロテインＣ、第X因子もしくは第Xa因子、また
はプロテインＳであってよい。例えば、ポリペプチドは、第VII因子もしくは第V
IIa因子、またはプロテインＣもしくは活性型プロテインＣであってよく、そし
てチロシン残基もしくはグリシン残基の挿入を含むことができる。
【００１５】 本発明はさらに、ビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する哺乳動物宿主細胞
を特徴とする。このポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペ
プチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメイ
ンを含む。改変型のGLAドメインは、上記の少なくとも１個のアミノ酸置換を有
するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えば第VII因子または第VII
a因子である。
【００１６】 本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を阻
止するのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関
する。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存
性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGL
Aドメインを含む。実施例のあるものにおいては、ポリペプチドの活性もまた増
強される。ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変型のGLAドメインは、上記の通
り少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペ
プチドは例えばプロテインC、活性型プロテインCまたは活性部位改変型第VIIa因
子、プロテインSまたは活性部位改変型第IXa因子であり得る。該組成物は抗凝固
剤(アスピリンなど)をさらに含んでもよい。
【００１７】 本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を増
加させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を
特徴とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミン
Ｋ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変
型のGLAドメインを含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変型のGLAドメイン
は、上記の通り少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ
依存性ポリペプチドは例えば第VII因子、第VIIa因子、第IX因子または第IXa因子
であり得る。この医薬組成物は可溶性の組織因子を含んでいてもよい。
【００１８】 哺乳動物において血塊の形成を低減させる方法も開示される。この方法は哺乳
動物において血塊の形成を低減させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプ
チドを投与することを含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型
のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増
強する改変型のGLAドメインを含む。実施例のあるものいおいては、ポリペプチ
ドの活性もまた増大される。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸
置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えばプロテインＣ
、活性型プロテインＣまたは活性部位改変型第VIIa因子または第IXa因子または
プロテインSであり得る。
【００１９】 本発明はまた、哺乳動物において血塊の形成を増加させる方法を特徴とする。
この方法は哺乳動物に血塊の形成を増加させるのに有効な量のビタミンＫ依存性
ポリペプチドを投与することを含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応す
る天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親
和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは上記の通り
、少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペ
プチドは例えば第VII因子、第VIIa因子、第IX因子または第IXa因子であり得る。
【００２０】 別の態様においては、本発明は、膜結合親和力および活性が増大したビタミン
Ｋ依存性ポリペプチドの同定のための方法である。該方法は、ポリペプチドのGL
Aドメイン中の少なくとも１個のアミノ酸の置換するようにポリペプチドのGLAド
メインを改変すること、改変型のGLAドメインを有するポリペプチドの膜結合親
和力と活性をモニターすること、および、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド
のポリペプチドの膜結合親和力と活性が対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペ
プチドと比べて増大した場合にはその改変型を増大した膜結合親和性と活性を有
するものとして同定することを含む。好適な置換は上記の通りである。該ポリペ
プチドは、血塊形成を増加または阻害する。
【００２１】 このビタミンＫ依存性ポリペプチドを、血塊形成障害の治療のための医薬の製
造に使用できる。
【００２２】 特にほかで定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はす
べて、本発明の属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有する。本発
明の実施にあたって、ここに記載するものと類似したまたは等価の方法および材
料を使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細
書中で挙げた刊行物、特許出願明細書、特許明細書、その他の文献はすべて、そ
の全体を参照によりここに含めるものとする。対立する場合には、定義を含む本
明細書が優先するだろう。加えて、材料、方法および実施例は単なる例示であっ
て、限定するものではない。
【００２３】 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明
らかとなろう。
【００２４】詳細な説明 一つの態様において本発明は、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチ
ドと比較して膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含むビタミンＫ依存
性ポリペプチドを特徴とする。ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性もまた増大
され得る。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、それらの生合成過程において、ビ
タミンＫを利用してタンパク質前躯体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル
化するタンパク質群である。GLAドメインはポリペプチドのN末端領域において、
典型的にはアミノ酸１からアミノ酸45付近に9〜13のγ−カルボキシグルタミン
酸残基を含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドの例としては、プロテインZ、プ
ロテインS、第X因子、第II因子(プロトロンビン)、第IX因子、プロテインC、第V
II因子およびGas６がある。本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸位置は、
第IX因子に従って番号を付けた。プロテインS、プロテインC、第X因子、第VII因
子およびヒトプロトロンビンのいずれもアミノ酸が1つ少ない(第4位)ので、それ
らの番号付けを調整しなければならない。例として、ウシプロテインCの事実上
の第10位はプロリンであるが、容易に比較するために本明細書においては全体に
わたってアミノ酸11と番号を付ける。本明細書中で用いられる「ポリペプチド」
なる語は、アミノ酸長または翻訳後修飾に拘わらず、任意のアミノ酸鎖のことで
ある。本明細書においてアミノ酸は標準の3文字または1文字略号により表記して
いる。
【００２５】 GLAドメインにおける改変は少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。その置換は
保存的または非保存的である(すなわち１〜10の置換)。保存的アミノ酸置換では
1アミノ酸が同種の1アミノ酸と置き換わるが、非保存的アミノ酸置換では1アミ
ノ酸が異種の1アミノ酸と置き換わる。非保存的置換の結果、ポリペプチドの疎
水性またはアミノ酸残基側鎖の嵩だかさの実質的な変化が生じることもある。さ
らに、非保存的置換は、ポリペプチドの電荷において電気的陽性電荷を減少また
は電気的陰性電荷を導入するような実質的な変化を生じさせることもある。非保
存的置換の例として、非極性アミノ酸に対して塩基性アミノ酸または酸性アミノ
酸に対して極性アミノ酸が含まれる。そのアミノ酸置換はアミノ酸２、５、９、
11、12、29、33、34、35または36、およびそれらの組合せにおいて生じ得る。好
ましくは、アミノ酸11、33または34においてアミノ酸置換が生じる。改変型GLA
ドメインは、カルシウム飽和状態において電気的陰性電荷のかさ(halo)と共に陽
イオン性のコア(core)を有する三次構造の形成に寄与するアミノ酸配列を含み得
る。最も親和性の高いタンパク質はアミノ酸35および36にわたり広がる負の電荷
を有する。特定の理論に拘束されずに、電気的陰性の表面に完全に取り囲まれた
電気的陽性のコアからなる特定の静電気パターンにより、増強された膜親和力が
生じることもある。
【００２６】 さらに、該GLAドメインの改変は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの位置４に
おける挿入が含み得る。好適なポリペプチドは、ビタミンＫ依存性ポリペプチド
の配列アラインメントに基づくこの位置でアミノ酸を欠失している(プロテインS
、プロテインC、第X因子、第VII因子およびヒトプロトロンビン)。
【００２７】 多数のビタミンＫ依存性ポリペプチドは膜結合酵素の基質である。ビタミンＫ
依存性ポリペプチドは最大ポテンシャル(potential)のGLAドメイン膜結合親和力
を全く示さないので、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの全ては結合親和力を減少
させるためのアミノ酸を含む必要がある。結果的に、多数のビタミンＫ依存性ポ
リペプチドは最大膜結合親和力の見地からすれば最適でないアミノ酸を含んでい
る。これらのアミノ酸残基は結合部位を効果的に壊し、酵素反応のためのより迅
速な代謝回転を提供する。
【００２８】 低下した膜親和力はいくつかの目的に役立つ効果がある。高い親和力には反応
速度を制限しうるゆっくりとした交換(slow exchange)が伴う。例えば、プロト
ロンビナーゼ酵素が基質に対して高い親和力をもって膜上に集合した際に、酵素
触媒作用よりむしろ膜からのタンパク質の交換が律速段階である。Lu, Y.および
Nelsestuen, G.L. (1996) Biochemistry, 35:8201-8209を参照されたい。ある
いは、非最適アミノ酸による置換によって膜親和力を調節すると、前血液凝固(p
rocoagulation)(第X、第IX、第VII因子およびプロトロンビン)と抗血液凝固(ant
icoagulation)(プロテインC、S)との競合過程のバランスを保つことができる。
天然タンパク質の膜親和力は通常状態においては最適であるが、膜親和力の増強
により、in vivoにおける病理学的症状において血液凝固を制御するための治療
の改善とならびにin vitro研究において有用なタンパク質を産生可能とする。
【００２９】 GLAドメインのが改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの種々の例を以下
に記載する。
【００３０】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドはプロテインCまたは活性化プロテインC(APC)
でありうるだろう。表1に野生型ヒトプロテインC(hC、配列番号１)およびウシプ
ロテインC(bC、配列番号２)GLAドメインのアミノ酸配列を示した。XはGlaまたは
Glu残基である。一般的に、第11、33、34、35および36位において中性残基(例え
ばQである)または塩基性残基(例えばD、Eである)を含むタンパク質は、膜親和力
が高い。
【００３１】
【表１】 表１ プロテインCまたはAPCのGLAドメインは、アミノ酸11、12、29、33、34、35ま
たは36、およびそれらの組合せを含んでもよい。例えば、改変型GLAドメインは
アミノ酸33においてグルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含みうる。改変型
GLAドメインはアミノ酸12のグリシン残基のセリンへの置換を含んでもよく、ま
たさらにアミノ酸33のグルタミン酸残基、およびアミノ酸34のアスパラギン酸残
基またはグルタミン酸残基を含んでもよい。第33位のグルタミン酸はin vivoに
おいて更にγ−カルボキシグルタミン酸に修飾されうる。最適活性のために、改
変型GLAドメインはアミノ酸11において更なる置換を含んでもよい。例えば、グ
ルタミン残基はアミノ酸11において置換されてもよく、または代わりに、グルタ
ミン酸またはアスパラギン酸残基が置換されてもよい。ヒスチジン残基はウシプ
ロテインCにおけるアミノ酸12において置換されてもよい。プロトロンビンに見
られるアミノ酸であるフェニルアラニンによるアミノ酸29の置換(配列番号25)は
、もう一つの有用な改変である。位置34においてフェニルアラニン、ロイシンま
たはイソロイシンが置換されていてもよい。またアミノ酸35で、グルタミン酸ま
たはアスパラギン酸残基が、またはアミノ酸36でグルタミン酸が置換されていて
もよい。このように、改変型プロテインCは、例えば、１個以上の置換を、11、1
2、29、33、34、35または36で、例えば、残基12と33、残基12と34、残基33と34
、残基12と35、残基33と35、残基12と36、残基33と36、残基11、12、33と34、残
基12、33と34、残基12、33、と35、残基12、33、34と35、または残基12、33、34
、35と36で含み得る。増強された膜結合親和力をもつ改変型プロテインCは、へ
パリンのような他の注射可能な抗血液凝固剤(anticoagulant)の代用として、ま
たは組み合わせて利用できるだろう。へパリンは典型的に大部分のタイプの外科
手術において用いられるが、低い効力／毒性(efficacy／toxicity)比を有してい
る。位置11のグルタミン、12のグリシン、33のグルタミン酸および34のアスパラ
ギン酸を含むAPCは、血塊形成の阻害に関して、野生型APCよりも少なくとも10倍
高い効果を有する。更に、増強された膜親和力をもつ改変型プロテインCはクマ
リン(coumarin)ファミリーにおけるワルファリン(warfarin)のような経口抗血液
凝固剤(アスピリンおよび抗血液凝固剤を含む)の代用として、または組み合わせ
て利用できるだろう。
【００３２】 活性部位改変型APCでは、上記の改変もなし得る。化学的には、例えば、N−ダ
ンシル−グルタミルグリシルアルギニルクロロメチルケトン(DEGR)、フェニルア
ラニル-フェニルアラニル-アルギニルクロロメチルケトン(FFR)により、または
活性部位の部位特異的突然変異誘発により、APCの活性部位を不活性にすること
ができる。Sorensen, B.B.ら, (1997) J. Biol. Chem., 272:11863-11868を参照
されたい。活性部位改変型APCはプロトロンビナーゼ複合体のインヒビターとし
て機能する。活性部位改変型APCの増強された膜親和力は、治療においてより効
果的なポリペプチドとなしうる。
【００３３】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドは第VII因子または活性型の第VII因子、第VIIa
因子であるだろう。本来のすなわち天然の第VII因子ポリペプチドは膜に対し、
低い親和力をもつ。表２に野生型ヒト第VII因子(hVII、配列番号３)およびウシ
第VII因子(ｂVII、配列番号４)GLAドメインのアミノ酸配列を示した。
【００３４】
【表２】 表２ 第VII因子または第VIIa因子のGLAドメインは、例えばアミノ酸11、29、33、34
、35または36、およびそれらの組合せにおける置換を含んでもよい。第VII因子
または第VIIa因子の改変型GLAドメインは、例として、アミノ酸11においてグル
タミン酸、グルタミン、アスパラギンまたはアスパラギン酸残基を含むか、アミ
ノ酸29においてフェニルアラニンまたはグルタミン酸残基を含むか、またはアミ
ノ酸33または35においてアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含むことがで
きる。他の中性の残基もまた、これらの位置で置換され得る。この改変GLAドメ
インは、位置34、35および36の１以上で疎水性残基を含んでもよい。改変GLAド
メインは、アミノ酸残基11と29、残基11と33、残基11と35、残基11、33と35、残
基11、29と33、残基11、29、33と35、残基29と33、残基29と35、または残基29、
33と35においてそのような置換の組合せを含み得る。例えば、第VII因子または
第VIIa因子のGLAドメインは、アミノ酸11のグルタミン残基とアミノ酸33のグル
タミン酸残基、またはアミノ酸11のグルタミン残基とアミノ酸29のフェニルアラ
ニン残基を有する。また改変GLAドメインは、上記のアミノ酸11、29、33および3
5での１以上の置換と組み合わせて、アミノ酸34での置換を含んでもよい。例え
ば、フェニルアラニン、またはロイシンやイソロイシンなどの他の疎水性残基が
、アミノ酸34、35および／または36で置換されていてもよい。さらに、改変GLA
ドメインは、位置４への挿入(チロシンまたはグリシン残基など)を単独で、また
は上記の置換とともに含んでもよい。位置４へ挿入されたチロシン残基を、位置
11のグルタミン残基、位置33のグルタミン酸残基、および位置34のフェニルアラ
ニン残基とともに有する第VII因子は、野生型第VIIa因子の160倍高い活性となっ
た。
【００３５】 これらの様式で改変された第VII因子および第VIIa因子は、天然または野生型
のポリペプチドよりも膜に対してはるかに高い親和力がある。第VII因子および
第VIIa因子はまた、自己活性化、第Xa因子生成、および複数の血液凝固アッセイ
においてはるかに高い活性を示す。活性は組織因子および／またはリン脂質の低
レベルのような限界の血液凝固状態において、特に増強される。例として、改変
型第VII因子は最適トロンボプラスチンレベルにおいて天然の第VIIa因子より約4
倍効果的であるが、トロンボプラスチンの最適レベルの１％においては約20倍効
果的である。限界に近い前血液凝固シグナルがおそらくin vivoにおいてもっと
も支配的であろう。トロンボプラスチンの最適レベルを用いた現在使用可能な血
液凝固アッセイでは、正常な血漿と血友病患者の血漿の凝固時間の差を検出する
ことができない。そのようなサンプル間における凝固の差は、血液凝固アッセイ
においてトロンボプラスチンの非最適レベルまたは希釈トロンボプラスチンを用
いたときにのみ検出できる。
【００３６】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドのもう一つの例として、活性部位改変型第VIIa
因子がある。第VIIa因子の活性部位は、例えばDEGR、FFRにより、または活性部
位の部位特異的突然変異誘発により化学的に改変され得る。DEGR改変型第VII因
子はいくつかの投与経路による血液凝固の効果的なインヒビターである。Arnljo
ts, B.ら (1997) J. Vasc. Surg., 25:341-346を参照されたい。GLAドメインの
改変は活性部位改変型第VIIa因子をより有効にさせうる。好適な置換または挿入
は上記の通りである。
【００３７】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドはまた第IX因子または活性型の第IX因子、第IX
a因子でありうる。活性部位改変型第VIIa因子と同様に活性部位改変型IXaおよび
Xaは血液凝固のインヒビターとなりうる。活性部位改変型第IXa因子はその補因
子である第VIII因子に結合できるが、血塊を形成しないであろう。活性部位改変
型第IXa因子(野生型)は、卒中の動物モデルにおいて出血を増やすことなく血液
凝固を防ぐ。例えば、Choudhriら、J. Exp. Med., 1999, 190:91-99を参照され
たい。
【００３８】 野生型のヒト第IX因子GLAドメインのアミノ酸配列(hIX、配列番号５)およびウ
シ第IX因子GLAドメインのアミノ酸配列(bIX、配列番号６)を表３に示す。例えば
、アミノ酸５にバリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、もしくはイ
ソロイシン残基を置換してもよいし、アミノ酸11にアスパラギン酸残基もしくは
グルタミン酸残基を、アミノ酸29にフェニルアラニン残基を、またはアミノ酸34
もしくは35にアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を置換してもよいし
、またそれらを組み合わせてもよい。
【００３９】
【表３】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドのさらなる例は、プロテインＳである。ヒトプ
ロテインＳのアミノ酸配列(hPS、配列番号19)を表４に示す。プロテインＳの改
変型GLAドメインは、例えば、アミノ酸５、9、34もしくは35に置換を有していて
もよく、またそれらを組み合わせて有していてもよい。例えば、アミノ酸５にフ
ェニルアラニン残基を、アミノ酸９にイソロイシン残基、ロイシン残基、バリン
残基もしくはフェニルアラニン残基を、またはアミノ酸34もしくは35にアスパラ
ギン酸残基もしくはグルタミン酸残基を置換してもよい。GLAドメイン中の少な
くとも１個の置換に加えて、プロテインＳはさらに、トロンビン感受性ループ中
に置換を有していてもよい。特に、いずれもアルギニン残基であるトロンビン感
受性ループ中の残基49、60もしくは70を、例えば、アラニン残基で置換してもよ
い。
【００４０】
【表４】 本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドはまた、ポリペプチドが活性型に変換
されないように不活化された開裂部位を有していてもよい。例えば、不活性化さ
れた開裂部位を有する第VII因子は第VIIa因子に変換されないであろうが、依然
として組織因子に結合することができるであろう。一般的には、アルギニン残基
がビタミンＫ依存性ポリペプチドの開裂部位に見いだされる。開裂部位を不活化
するためにこの位置のアルギニンを任意の残基で置換することができる。特に、
第VII因子のアミノ酸152にアラニン残基を置換することが可能である。不活性化
された開裂部位をさらに有する本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、阻害
剤として機能する。
【００４１】 他の態様において、本発明は、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチド
と比べて、ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを有する
ビタミンＫ依存性ポリペプチドを含む哺乳動物宿主細胞を特徴とする。いくつか
の実施形態でビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性を増強することができる。好
適なビタミンＫ依存性ポリペプチドおよびGLAドメインの改変については、上述
されている。哺乳動物宿主細胞は、例えば、改変型第VII因子もしくは改変型第V
IIa因子を含んでいてもよい。改変型第VII因子もしくは改変型第VIIa因子のGLA
ドメインは、アミノ酸11およびアミノ酸33にアミノ酸置換を含んでいてもよい。
好ましくは、アミノ酸置換は、第VII因子もしくは第VIIa因子のアミノ酸11にグ
ルタミン残基を、アミノ酸33にグルタミン酸残基を含んでいてもよい。好適な哺
乳動物宿主細胞は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドのグルタミン酸残基をγ-カ
ルボキシグルタミン酸残基に改変することができる。腎臓および肝臓に由来する
哺乳動物細胞は、宿主細胞として特に有用である。
【００４２】改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする核酸 本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする単離された核酸分
子は、標準的な方法で調製することができる。本明細書中で使用する場合、「単
離された」とは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする遺伝子の一
部分もしくは全部に相当する配列を指すが、この配列は、哺乳動物ゲノム中の野
生型遺伝子の片側もしくは両側に通常フランキングしている配列が含まれていな
いものである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、組換えDNA分子であっ
てもよいが、ただし、天然に存在するゲノム中で組換えDNA分子のすぐ隣にフラ
ンキングして通常見いだされる核酸配列の一方は除去されるかもしくは存在しな
いことが前提となる。従って、単離されたポリヌクレオチドとしては、限定され
るものではないが、他の配列から独立して個別の分子として存在するDNA(例えば
、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されたcDNA断片もしくは
ゲノムDNA断片)、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス(例えば、
レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス)、または原核生
物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAが挙げられる。このほ
かに、単離されたポリヌクレオチドとして、ハイブリッドポリヌクレオチドもし
くは融合ポリヌクレオチドの一部分である組換えDNA分子を挙げることができる
。
【００４３】 cDNAもしくはゲノムライブラリー内またはゲノムDNA制限消化物を含有するゲ
ルスライス内の100〜100万の他のポリヌクレオチド中に存在するポリヌクレオチ
ドは単離されたポリヌクレオチドとはみなされないことは当業者には自明であろ
う。
【００４４】 単離された核酸分子は長さが少なくとも約14ヌクレオチドである。例えば、核
酸分子は長さが約14〜20、20〜50、50〜100ヌクレオチドであってもよいし、ま
たは150ヌクレオチドを超えてもよい。いくつかの実施形態では、単離された核
酸分子は、全長の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードしている。核酸
分子は、線状もしくは環状およびセンス配向もしくはアンチセンス配向のDNAで
あってもRNAであってもよい。
【００４５】 例えばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などによって、野生型ビタミン
Ｋ依存性ポリペプチドをコードする核酸配列中に特定の点変化を導入することが
できる。この方法では、所望の変化をオリゴヌクレオチド中に組み込み、次いで
これを野生型の核酸にハイブリダイズさせる。DNAポリメラーゼを用いてオリゴ
ヌクレオチドを伸長させることによって、導入された点変化の位置にミスマッチ
を含みかつDNAリガーゼによりシールされる一本鎖ニックを5’末端に含むヘテロ
二本鎖を生成させる。ミスマッチは、大腸菌もしくは他の適切な生物の形質転換
の際に修復され、そして改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする遺伝
子は、大腸菌もしくは他の適切な生物から再び単離することができる。部位特異
的突然変異誘発用のキットは、市販品として購入することができる。例えば、Bi
o-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA)からMuta-Gene7 in vitro突然変異誘
発キットを購入することができる。
【００４６】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いて突然変異を導入することもできる。例
えば、Vallette et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17(2):723-733を参照され
たい。PCRとは、標的の核酸を増幅する手順もしくは技法を意味する。対象とな
る領域の端部もしくは典型的には端部を超えた部分から得られる配列情報を利用
して、増幅しようとする鋳型の対向する鎖と配列が同等であるオリゴヌクレオチ
ドプライマーを設計するが、突然変異を導入するために、所望の変化を取り込む
オリゴヌクレオチドを用いて対象となる核酸配列を増幅する。全ゲノムDNAもし
くは全細胞RNAに由来する配列を含めて、DNAおよびRNAに由来する特定の配列を
増幅するためにPCRを使用することができる。プライマーは、典型的には、14〜4
0ヌクレオチド長であるが、10ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド長の範囲の長さ
であってもよい。一般的なPCR法については、例えば、PCR Primer: A Laborator
y Manual, Dieffenbach, C.およびDveksler, G.編, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1995に記載されている。
【００４７】 改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする核酸はまた、化学合成によ
り単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしても生成させるこ
とができる。例えば、オリゴヌクレオチド対をアニーリングしたときに二本鎖が
形成されるようにそれぞれの対が相補性の短いセグメント(例えば、約15ヌクレ
オチド)を含む形で所望の配列を含有する１対以上の長いオリゴヌクレオチド(例
えば、>100ヌクレオチド)を合成することができる。DNAポリメラーゼを用いてオ
リゴヌクレオチドを伸長させると、オリゴヌクレオチド対ごとに二本鎖の核酸分
子が得られ、次にこれをベクター中にライゲートすることができる。
【００４８】改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの産生 本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードす
る核酸配列を発現ベクターのような核酸構築物中にライゲートして、この発現ベ
クターで細菌宿主細胞もしくは真核宿主細胞を形質転換することにより産生する
ことができる。一般的には、核酸構築物は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコ
ードする核酸配列に機能しうる形で連結された調節配列を含んでいる。調節配列
は、典型的には遺伝子産物をコードしていないが、その代わりに核酸配列の発現
に影響を及ぼす。本明細書中で使用する場合、「機能しうる形で連結された」と
は、核酸配列の発現を可能にするように調節配列が核酸配列に結合されているこ
とを意味する。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター配列、エンハン
サー配列、応答エレメント、もしくは誘導性エレメントを挙げることができる。
【００４９】 細菌系では、BL-21のような大腸菌株を使用することができる。好適な大腸菌
ベクターとしては、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク
質を産生するpGEX系のベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない
。典型的には、形質転換された大腸菌を指数関数的に増殖させ、次いでイソプロ
ピルチオガラクトピラノシド(IPTG)で刺激した後で回収する。一般に、そのよう
な融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させ
てから遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に
精製することができる。pGEXベクターは、クローン化標的遺伝子産物がGST部分
から放出されるようにトロンビンプロテアーゼ開裂部位または第Xa因子プロテア
ーゼ開裂部位を含むように設計される。
【００５０】 真核生物宿主細胞では、ウイルスをベースとしたいくつかの発現系を利用して
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを発現させることができる。ビタミンＫ依
存性ポリペプチドをコードする核酸を、例えば、pBlueBac (Invitrogen, San Di
ego, CA)のようなバキュロウイルスベクター中にクローン化し、次いで、これを
用いて、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多重エン
ベロープ（multiply enveloped）核多角体病ウイルス(AcMNPV)に由来する野生型
DNAと一緒にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）(Sf9)のよ
うな昆虫細胞を共トランスフェクトすることができる。改変型ビタミンＫ依存性
ポリペプチドを産生する組換えウイルスは、標準的な方法で同定することができ
る。このほか、ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする核酸をSV-40ベクタ
ー、レトロウイルスベクター、もしくはワクシニアベースのウイルスベクターに
導入し、これを用いて好適な宿主細胞に感染させることもできる。
【００５１】 改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを安定に発現する哺乳動物細胞系は、適
切な制御エレメントおよび選択可能なマーカーを含む発現ベクターを用いて産生
することができる。例えば、真核生物発現ベクターpCDNA.3.1＋(Invitrogen, Sa
n Diego, CA)は、例えば、COS細胞、HEK293細胞、またはベビーハムスター腎細
胞において改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを発現するのに好適である。エ
レクトロポレーション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カ
ルシウム媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、も
しくは他の好適な方法により発現ベクターを導入した後、安定な細胞系を選択す
ることができる。このほか、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを産生するた
めに、一過性にトランスフェクトされた細胞系が使用される。また、小麦胚芽抽
出物もしくはウサギ網状赤血球溶解物を用いて改変型ビタミンＫ依存性ポリペプ
チドをin vitroにて転写および翻訳してもよい。
【００５２】 改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、培地をイムノアフィニティーカラム
にアプライすることにより調整細胞培地から精製することができる。例えば、第
VII因子に対する特異的結合親和力を有する抗体を用いて改変型第VII因子を精製
することができる。このほか、アフィニティクロマトグラフィーと組み合わせて
コンカナバリンA (Con A)クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラ
フィー（例えばDEAE）を使用することにより第VII因子を精製することもできる
。第VII因子に対する特異的結合親和力を有するカルシウム依存性もしくは非依
存性モノクロナール抗体を第VII因子の精製に使用することもできる。
【００５３】 改変型プロテインＣのような改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、それに続いて、プロテインＣに対する特異的結合親
和力を有する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーにより、精製
することができる。
【００５４】 改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、標準的な方法を用いて化学的に合成
することもできる。タンパク質合成法のレビューについては、Muir, T. W. and
Kent, S. B., Curr. Opin. Biotechnol., 1993, 4(4):420-427を参照されたい。
【００５５】医薬組成物 本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊形成を阻止
するのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を特徴
とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型ビタミンＫ依存
性ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの膜結合親和力を増強する少なくとも１
個のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入を有する改変型GLAドメインを含むもの
である。いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性も増強
される。医薬組成物に含まれる有用な改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドとし
ては、限定されるものではないが、先に記載したように、プロテインＣもしくは
APC、活性部位改変型APC、活性部位改変型第VIIa因子、活性部位改変型第IXa因
子、活性部位改変型第Xa因子、またはプロテインＳを挙げることができる。医薬
組成物はまた、アスピリン、ワルファリン、またはヘパリンのような抗凝血剤を
含有してもよい。
【００５６】 哺乳動物において血塊形成を阻止するのに有効なビタミンＫ依存性ポリペプチ
ドの濃度は、投与する化合物の好ましい用量、利用する化合物の化学的特性、配
合賦形剤の処方および投与の経路を含めていくつかの要因に依存して変化する可
能性がある。また、投与する医薬組成物の最適用量は、特定の患者の全体的健康
状態および選択された化合物の相対的生物学的効力のような変数に依存する可能
性がある。これらの医薬組成物はin vivoで凝血を調節するために使用すること
が可能である。例えば、この組成物は、一般に、血栓症を治療するために使用す
ることが可能である。先に述べたようにポリペプチド中のアミノ酸残基を少しだ
け変更しても、一般には、変異型ポリペプチドの抗原性は有意な影響を受けない
。
【００５７】 改変型GLAドメインを含むビタミンＫ依存性ポリペプチドは、製薬上許容され
る非毒性の賦形剤もしくは担体と混合することにより製剤化して医薬組成物にす
ることが可能である。そのような化合物および組成物は、非経口投与を行うため
に、特に、生理学的緩衝水溶液中の液剤もしくは懸濁剤の形態で、経口投与を行
うために、特に、錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または鼻腔内投与を行うた
めに、特に、散剤、点鼻剤もしくはエアゾール剤の形態で調製することが可能で
ある。所望により、他の投与経路に用いるための組成物を標準的な方法により調
製することが可能である。
【００５８】 非経口投与を行うための製剤には、一般的な賦形剤として、滅菌水もしくは生
理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起
源の油、硬化ナフタレンなどが含まれていてもよい。特に、生体適合性生分解性
のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、もしくはポリオキシエ
チレン-ポリオキシプロピレンコポリマーは、in vivoで本発明の化合物の放出を
制御するための賦形剤の例である。他の好適な非経口送達系としては、エチレン
-ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、埋植可能な注入系、およびリ
ポソームが挙げられる。吸入投与を行うための製剤には、所望により、ラクトー
スのような賦形剤が含まれていてもよい。吸入製剤は、例えば、ポリオキシエチ
レン-9-ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する
水性溶液であってもよいし、または点鼻剤の形態で投与するための油性溶液であ
ってもよい。所望により、鼻腔内に適用するためのゲル剤として化合物を製剤化
してもよい。非経口投与を行うための製剤にはまた、バッカル投与を行うために
グリココレートが含まれていてもよい。
【００５９】 このほかの実施形態において、本発明はまた、製薬上許容される担体および哺
乳動物において血塊形成を増加させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプ
チドを含有する医薬組成物を特徴とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは
、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの膜結
合親和力を増強する少なくとも１個のアミノ酸置換を有する改変型GLAドメイン
を含むものである。これらの医薬組成物は、血友病Ａ、血友病Ｂおよび肝臓病の
ような凝血障害を治療するのに有用であると考えられる。
【００６０】 この実施形態では、医薬組成物に含まれる有用なビタミンＫ依存性ポリペプチ
ドは、限定されるものではないが、第VII因子もしくは第VII因子の活性型である
第VIIa因子を含有することができる。第VII因子もしくは第VIIa因子の改変型GLA
ドメインは、アミノ酸11およびアミノ酸33に置換を含んでいてもよい。例えば、
アミノ酸11にグルタミン残基を、アミノ酸33にグルタミン酸残基を含んでいても
よい。医薬組成物にはさらに、可溶性組織因子が含まれていてもよい。第VII因
子は、凝血カスケードの開始点に位置しかつ第IX因子と第X因子の２種のタンパ
ク質を活性化する能力があるため、血液を凝固させるのに特に重要である。第VI
Ia因子による第X因子の直接的活性化は、血友病の主要な形態であるＡ型および
Ｂ型の可能性のある治療を行うのに重要である。なぜなら、第IX因子および第VI
II因子の関与する過程が完全にバイパスされるからである。第VII因子を患者に
投与したところ、血友病のいくつかの形態を治療するのに有効であることが判明
した。GLAドメインの改変により第VII因子もしくは第VIIa因子の膜親和力を改良
すると、ポリペプチドが多くの凝血状態に対しより応答するようになったり、必
要なVII/VIIaの用量が低減したり、第VII因子/第VIIa因子を投与しなければなら
ない間隔が長くなったり、より有効な治療が行われるさらなる質的変化を生じた
りする可能性が得られる。全体として、第VII因子の膜接触部位を改良すると、
その活性化速度が増加するだけでなく、第X因子もしくは第IX因子に対する第VII
a因子の活性も改良される可能性がある。これらの過程は、in vivoにおいて全体
的血液凝固速度に対して相乗的効果を有する可能性があり、結果として、いくつ
かの血液凝固障害の優れた治療を行うための非常に効力の強い第VIIa因子が得ら
れる。
【００６１】 血塊形成を増加させるための他の有用なビタミンＫ依存性ポリペプチドとして
は、第IX因子と第IXa因子、および第X因子と第Xa因子が挙げられる。
【００６２】 他の態様において、哺乳動物における血塊形成の低減方法について説明する。
この方法には、哺乳動物において血塊形成を低減させるのに有効な量のビタミン
Ｋ依存性ポリペプチドを投与することが含まれる。このビタミンＫ依存性ポリペ
プチドは、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、ポリペプチ
ドの膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含むものである。いくつかの
実施形態では、活性も増大される。改変型GLAドメインは、少なくとも１個のア
ミノ酸置換を有している。GLAドメインに置換を有している改変型プロテインＣ
もしくはAPC、プロテインＳ、または活性部位改変型第VIIa因子、第IXa因子およ
び第Xa因子は、この方法に使用することが可能である。この方法にはさらに、抗
凝血剤を投与することが含まれていてもよい。
【００６３】 別の態様において、本発明は哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有
効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを投与することを含む哺乳動物において
血塊の形成を増加させる方法を特徴とする。ビタミンK依存性ポリペプチドは、
対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親
和力を増強する改変型GLAドメインを含む。改変型GLAドメインは少なくとも1個
のアミノ酸置換を含む。改変型第VII因子または第VIIa因子および改変型第IX因
子または第IXa因子を本方法に使用できる。
【００６４】 本発明を下記の実施例において更に説明するが、特許請求の範囲に記載される
本発明の範囲を制限するものではない。
【００６５】 (実施例)実施例１ 膜親和力と活性の増強された第VII因子 ヒト血液凝固第VII因子の膜結合親和力は、部位直接的な突然変異誘発によっ
て増強され得ることが見出された。P11Q,K33E変異体〔本明細書中では、第VIIQ1
1E33因子または、変異型第VII因子という(配列番号30)〕の性質が特徴づけられ
た。膜親和力は、野生型タンパク質に対して約20倍増強された。変異体による自
己活性化は、野生型第VII因子に比べて、少なくとも100倍増強された。活性型の
VIIQ11E33( VIIaQ11E33とする )は、第X因子に対して約10倍高い活性を示した。
正常血漿中の可溶性組織因子存在下でのVIIaQ11E33の凝血活性は、野生型VIIaの
活性より約10倍高かった。正常な組織因子(トロンボプラスチン‐HSの1：100希
釈物として供給)存在下における、チモーゲン、VIIQ11E33の凝血活性は、野生型
第VII因子に比べて20倍高かった。活性が増強される程度は諸条件に左右され、
凝血刺激が低い条件下でVIIQ11E33は特に活性であった。
【００６６】 一般的に、タンパク質濃度は、標準品としてウシ血清アルブミンを使用するブ
ラドフォードアッセイによって測定した( Bradford, M. M., 1976, Analyt. Bio
chem. 248-254)。 モル濃度は、分子量を第VII因子については50,000、第X因子
については55,000として得られた。指示されない限り、全ての活性測定は、標準
バッファー(0.05 M Tris, pH 7.5, 100mM NaCl)中で実施した。
【００６７】変異型第VII因子の産生 変異型第VII因子を、野生型第VII因子cDNA(GenBank受け入れ番号M13232, NID
g182799)から作製した(Petersenら、1990,Biochemistry 29 : 3451-3457)。 P11
Q変異(アミノ酸11のプロリン残基のグルタミン残基への変換)とK33E変異(アミノ
酸33のリシン残基のグルタミン酸残基への変換)を、PCR法で、野生型第VII因子c
DNAに誘導した。(Valletteら、1989, Nucreic Acid Res. 17:723-733)。この工
程において、変異診断用XmaIII制限酵素部位が排除された。4つのPCRプライマー
を、M13232の２つの変異フラグメント(一方は位置221〜301のMluIからBglIIまで
、他方は位置302〜787のBglIIをからSstIIまで)の合成を開始するために設計し
た。これらのプライマーを用いて、標準のPCRサイクル条件(GENEAMP, Perkin El
mer)において、フラグメントの合成を開始した。その際鋳型として１ ngの野生
型第VII因子cDNAを用いた。得られたフラグメントをゲル精製し、MluIとBglII、
またはBglIIとSstIIで消化した。そして、２つの精製したフラグメントを発現ベ
クター Zem219b(対応する野生型配列を、MluI-SstIIフラグメンとして取り除い
てある)中の第VIII因子cDNAに結合した(Petersenら、1990, 前掲)。変異したフ
ラグメントの全体の配列決定を行って、P11QとK33Eの置換を確認し、PCRに誘導
されるその他の配列変化の可能性を排除した。
【００６８】トランスフェクション、選択、精製 ベビーハムスター腎(BHK)細胞を、10％のウシ胎児血清とペニシリンストレプ
トマイシンを補ったダルベッコ改良イーグル培地に増殖させた。サブコンフルエ
ントな細胞を、製造業者の薦めにより、リポフェクトアミン(lipofectAMINE; Gi
bco BRL )を用いて第VII因子発現プラスミドでトランスフェクトした。２日間、
あらかじめトランスフェクトした後、細胞をトリプシンで処理し、１μMのメト
トレキセート(MTX)を含む選択培地に希釈した。安定にトランスフェクトされたB
HK細胞を、続いて、ペニシリンストレプトマイシン、５μg/ｍLのビタミンＫ1、
そして１μMのMTXを補った血清を含まないダルベッコ改良イーグル培地で培養し
、ならし培地を回収した。ならし培地は、Affi-Gel 10に結合したカルシウム依
存性モノクロナール抗体(CaFVII22)を含む免疫アフィニティーカラムに2度アプ
ライした(Nagasakiら、1991, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。 最終的に精
製された第VIIQ11E33因子は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において、単
一のバンドとして泳動し、調製物中には、第VIIa因子の形跡はなかった。純粋な
VII(P11Q,K33E)変異体は1400〜2800 第VII因子units/mgを示した。
【００６９】第VII因子の活性化 活性型第VIIaQ11E33因子は、VIIQ11E33を第Xa因子で開裂することによって生
成した( 重量比1：100、37℃で1時間インキュベーション)。または、第VIIaQ11E
33因子は、７μMのVIIQ11E33と0.7μMのsTFとリン脂質〔ホスファチジルセリン
／ホスファチジルコリン(PS/PC), 25/75, タンパク質1gあたり0.1 g〕の混合物
中で、自己活性化により得られた(37℃，20 分)。
【００７０】 野生型第VIIa因子は、均一な組換えタンパク質である(NOVO Nordisk)。２つの
調製物は、市販の凍結乾燥製品と非凍結乾燥製品からなるものである。後者のタ
ンパク質を、FPLC mono-Qでさらに精製したところ、80,000 units/mg の特異的
な活性(Geroge King NPP 標準でキャリブレーション)を示した。
【００７１】第VIIQ11E33因子によって増強された膜相互作用 リン脂質の調製、タンパク質−膜結合のアッセイと測定はNelsestuenとLimに
よって開示された方法で実施した(1977, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。大
きな単ラメラ小胞(LUV)と小さな単ラメラ小胞(SUV)は、以前に開示された方法で
調製した(Hope, M.J.ら、Bilchem. Biophys. Acta., 812 : 55-65 ; Huang, C.,
1969, Biochemistry, 8 : 344-352)。 高純度のホスファチジルセリン(ウシ脳)
と卵ホスファチジルコリン(Sigma Chemical Co.)をクロロホルム中で混合した。
溶媒は、窒素ガス流で取り除いた。乾燥させたリン脂質をバッファー中で懸濁さ
せた。SUVは、超音波処理とゲル濾過によって作製し、一方、LUVは凍結−融解と
押出しによって作製した。リン脂質の濃度は、リン：リン脂質重量比を25と仮定
して、有機リン酸アッセイにより決定した。
【００７２】 PS/PC (25/75)またはPS/PC (10/90)のいずれかのSUVを調製した。タンパク質
を図１に示す重量比でリン脂質に加えた。タンパク質-膜結合は、Nelsestuen と
Limの方法(1977,前掲)で90℃において光散乱によってアッセイした。簡単に言う
と、リン脂質小胞単独(I1)とタンパク質を加えたもの(I2)の光散乱強度を測定し
、バッファーと未結合のタンパク質によるバックグラウンドについて、補正した
。タンパク質-小胞複合体(M2)の小胞単独のもの(M1)に対する分子量比を、式１
の関係から見積もることができる。この式において、δn/δcは個々の種の屈折
率である。
【００７３】 I2 / I1 = (M2/M1)2 (δn/δc2/δn/δc1)2 (式 1) リン脂質とタンパク質の濃度がわかっていれば、結合したタンパク質 [P*PL]
と遊離のタンパク質 [P] の濃度を見積もることができる。これらの値を、小胞
のタンパク質結合能の最大値 [P*PLmax](すべてのタンパク質に関して1.0 g/gで
あると仮定する)とともに用いることにより、式 ２の関係から、タンパク質と膜
の相互作用の平衡定数が得られる。式 ２において、全ての濃度は、モルタンパ
ク質またはタンパク質結合部位として表されている。
【００７４】 KD = [P] [P*PLmax-P*PL] / [P*PL] (式 2) 結合を、5 mMのカルシウムで評価し、M2/M1の比で表した。
【００７５】 図１は、野生型第VIIa因子(白丸)と第VIIQ11E33因子(黒丸)のPS/PC=25/75, 25
μg/ml(図1A)または、PS/PC = 10/90 , 25μg/ml(図1B)の膜への結合を示してい
る。VIIQ11E33は、野生型タンパク質よりも、かなり高い親和力を有していた。P
S/PC (25/75)への結合は、定量的なレベルだったので、実質的に[Proteinfree]
はゼロであった。解離定数(Kd)をこのデータから見積もることはできなかった。
ウシ第X因子(黒三角)の膜結合は、図1に対照標準として示す。ウシ第X因子はこ
のファミリーのなかで、最も親和力のあるタンパク質のうちのひとつであり、カ
ルシウム2 ｍMのとき、PS/PC (20/80)の解離定数(Kd) 40 nMを与える(McDonald
ら、1997, Biochemistry, 36 : 5120-5127) 。タンパク質/リン脂質の比が0.55
であるときの結果(図1)から得られたウシ第Ｘ因子の解離定数(Kd)は、0.025μM
だった。
【００７６】 また、野生型および変種型第VII因子のPS/PC (10/90)の膜への結合も測定され
た(図1B)。VIIQ11E33は、定量的なレベルよりも低いレベルで結合するので結合
定数を式 3の関係より見積もることができた。
【００７７】 Kd = [Proteinfree] [Binding sitesfree] / [Proteinbound] (式 3) [Binding sitesfree]は、 M2/M1の最大値を1.0と仮定し、式4の関係から見積
もった(すなわち、[Binding sitestotal] = [Phospholipidweight conc./Protei
nMW])。これは、このファミリーに属する種々のタンパク質にみられる共通の値
である(McDonaldら、1997, 前掲)。
【００７８】 [Binding sitesfree] = [Binding sitestotal] - [Proteinbound] (式 4) これらの仮定およびタンパク質：リン脂質比0.37であるときのデータを用いる
と、解離定数(Kd)の値はウシ第X因子については0.7μM、野生型第VII因子につい
ては5.5μM、VIIQ11E33については0.23μMであった。これより、第VIIQ11E33因
子の膜結合力は野生型第VII因子に比べ大幅に増強されたことが明らかとなり、
ビタミンＫ依存性タンパク質の中で最も高い膜結合力を持つもののひとつである
といえる。
【００７９】 また野生型第VIIa因子と第VIIa因子-Q11E33との間の差異は、リン脂質ベシク
ルの組成に関して若干変動することが観察されている。例えば、PS/PE/PC(20/40
/40)を含む膜は、第VIIa因子-Q11E33について33倍高い活性をもたらし、一方特
定のPS/PC調製物(20/80〜25/75)では、第VIIa因子-Q11E33について10〜19倍高い
活性を示した。
【００８０】第VIIQ11E33因子の増強された活性 凝血の最初のステップは、第VII因子の活性化を必要とする。VIIの自己活性化
を、100 nMのsTF〔 Walter Kisiel博士から入手した高純度の組換え産物(Fiore
ら、1994, J.Biol.Chem., 269: 143-149)〕、36 nMのVIIQ11E33および PS/PC (2
5/75, 22μg/mL)を含む溶液中で行った。0.15 mmの基質 S-2288(Kabi社)を加え
て、p-ニトロフェニルホスフェート生成物の放出速度を405 nMにおける吸光度変
化によって評価することにより、VIIaQ11E33の活性を様々な時間的間隔において
評価した。VIIQ11E33調製物におけるの初期の活性は、十分に活性のあるVIIaQ11
E33の活性の4％にも満たなかった。
【００８１】 VIIQ11E33は野生型VII因子よりも活性化のための一層優れた基質であることが
見出された。図2 は、VIIQ11E33の自己活性化を示す。このデータを、式 5の関
係により解析した(Fioreら、1994, 前掲 における式 7)。
【００８２】 ln[VIIa]t = ln[VIIa]0 + kcat*y*t (式 5) ln[VIIa]tは時間tにおける第VIIa因子の濃度、kcatは第VIIa因子がVIIに作用
するときの触媒速度定数、そしてｙはVIIa部位の飽和率である。野生型第VIIa因
子について、この関係および1 μMのsTFから、0.0045/sのkcatおよび7*103M-1s- 1 のkcat/Km 比が得られた(Fioreら、1994, 前掲)。 VIIQ11E33酵素については、
自己活性化が速く(図2)、kcatの下限を見積もることしかできなかった。これは
、第VIIa因子の約25秒の倍化時間から得られた〔kcat = (ln2)/t1/2〕。得られ
た値(kcatmin=0.03/s)と、この反応における基質濃度(3.6*10-8 M)およびy=1.0
とする仮定から、kcat / [S] = 8 * 105 M-1 s-1の値が得られた。この値は、実
際のVIIaQ11E33のkcat/Kmの値よりもかなり低いものであるといえる。しかし、F
ioreら(1994、前掲)によって見積もれらた野生型VIIa/sTF因子のkcat/Kmの値よ
りは、約100倍大きいものであった。従って、凝血の活性化ステップにおいては
、VIIaQ11E33酵素と基質第VIIQ11E33因子の組合せは、野生型タンパク質よりも
優れていた。これは、最低限の凝血条件において、VIIQ11E33が野生型タンパク
質よりも優れていることを示唆していた。
【００８３】VIIaQ11E33の増強された活性 ひとたび生成されると、第VIIa因子は、第X因子か第IX因子のいずれかを活性
化する。ウシ第X因子(0.1μM)の第VIIa因子による活性化を、pH 7.5の50 mM Tri
s HClバッファー〔100 mMのNaCl、5 mMのカルシウム、様々な量のリン脂質 (PS/
PC, 25/75)、1 mg/mLのウシ血清アルブミンを含む〕中22.5℃で行った。第VIIa
因子( 0.06 nMのVIIaQ11E33または0.6 nMの野生型VIIa )をゼロ時間に加え、1分
、3分および5分時点におけるXaの活性を測定した。反応混合物のうちの一定量(0
.2ｍL)を10 mMのEDTAおよび第Xa因子に対する色原体基質である0.4 mMのS-2222(
Kabi社)を含むバッファー(0.2 mL)と混合した。とした。405 nmにおける吸光度
の変化をBeckman DU8 分光光度計で測定した。生成した第Xa因子の量は、p-ニト
ロフェニルホスフェートの反応生成物の吸光係数(1 * 104 M-1 cm-1)およびこの
アッセイ条件下での精製ウシXaによる基質加水分解の速度(33/sec)より算出した
。
【００８４】 図3は、野生型第VIIa因子(白丸)とVIIaQ11E33(黒丸)が精製系において第X因子
を活性化する能力を比較したものである。この反応においても、再び、VIIaQ11E
33の方が野生型第VIIa因子よりもずっと優れていた。この差は、リン脂質の濃度
が低いときに最大になり、リン脂質が1 mlあたり200 μgのときは2倍にまで低減
した。高い膜濃度では高い割合で野生型VIIaの膜への結合が引き起こされるとい
う事実からも、このような結果は予想された。さらにまた、VIIaQ11E33の増強さ
れた機能は、リン脂質が少ない条件下で最も顕著であった。
【００８５】 また、活性化された血小板表面上の第X因子を活性化する第VIIa因子の能力を
測定した。ウシ血清アルブミンクッション上への遠心分離、およびゲル濾過によ
る単分子性血小板の取得からなる標準的な方法により血小板を単離した。カルシ
ウムイオノホア(A23187)で血小板を活性化し、2×108/mLの濃度に希釈した。緩
衝液は、0.05 M Tris、pH 7.5-0.1 M NaClであり、5 mM CaCl2を含有していた。
200 nM第X因子と一緒に第VIIa因子もしくはQ11E33-VIIa (50 nM)を添加した。種
々の時間間隔で、過剰のEDTAを添加することにより反応を停止させた。生成した
第Xa因子の量は、特異的な第Xa因子基質であるS-2222に対するその活性により測
定した。既知の第Xa因子の濃度と比較することにより、第Xa因子の量を計算した
。20分の時点において、野生型第VIIa因子を含む反応では0.34 nM 第Xa因子が生
成し、一方、Q11E33-VIIaを含む反応では7.7 nM 第Xa因子が生成した。このアッ
セイは、組織因子には左右されず、また生物学的膜を利用している。
【００８６】 生物学的膜を用いる他のアッセイを、J82細胞を用いて行った。この細胞系は
、その表面上に高レベルの組織因子を発現し、多くの場合、組織因子に結合する
第VII因子を調べるために使用される(例えば、Sakai, T. et al., 1989, J. Bio l. Chem. 264, 9980-9988)。標準的な方法により細胞を単細胞層として増殖させ
、マイルドなトリプシン処理により表面から遊離させた。懸濁液中の細胞による
第Xa因子生成の速度を、2 nM活性部位改変型第VIIa因子(DEGR-VIIa)の存在下で
測定した。DEGR-VIIaは阻害剤であり、反応に加えられた活性第VIIa因子により
組織因子から追い出されるはずである。これは競合反応である。組織因子から活
性部位改変型第VIIa因子を第VIIa因子で追い出す尺度として、第Xa因子生成速度
を使用した。Q11E33-VIIaは、野生型の第VIIa因子で必要となる濃度の1/28の濃
度でDEGR-VIIaを追い出した。この優れた性質は、多くの他の競合アッセイにお
いて観測された性質と類似したものであった。
【００８７】VIIaQ11E33の優れた凝血性 凝血アッセイを、血塊の形成を検出するため、ハンドチルト法(hand tilt met
hod)を用いて37℃において行った。ヒト血漿(0.1 mL)は、37℃で1分間、平衡化
させた。様々な試薬を0.1 mL容の標準バッファー中に加えた。可溶性組織因子(5
0 nM)とリン脂質(PS/PC, 10/90, 75 μg/mL)を第VIIa因子と共に血漿に加えた。
なお、第VIIa因子の濃度は、図４に示すとおりである(0.1〜32 nM)。最後に0.1
mLの25 mM CaCl2を加え反応を開始させた。血塊が形成される時間を測定した。
ほとんどの場合複数回数測定した試料の平均値と標準偏差を記録した。
【００８８】 図４は、正常なヒト血漿中のVIIaQ11E33に対する野生型VIIa因子の凝血時間を
示したものである。凝血はsTFと添加したリン脂質小胞によって促進された。内
因性野生型第VIIa因子の濃度はおよそ10 nMで、実質的には、凝血時間になんら
影響を及ぼさなかった。sTF存在下、非存在下におけるバックグラウンド凝血は
、120秒であった。第VIIaQ11E33因子は、これらのアッセイ条件において野生型V
IIaよりもおよそ8倍高い活性を示した。同様の結果が第VIII因子欠損血漿におい
ても得られ、この系のおもな凝血経路には、第VIIa因子による第X因子の直接の
活性化が必要であることが示唆された。全体的に見て、第VIIaQ11E33因子は膜小
胞と可溶性組織因子が促進する前凝血活性において野生型VIIaより優れていた。
野生型チモーゲンは、同様の2分であるバックグラウンド凝血時間が示すように
、sTFを加えたかどうかにかかわらず、これらの条件下で、事実上全く活性を示
さなかった。
【００８９】正常な組織因子存在下における前凝血活性 正常な組織因子によって促進される凝血はカルシウムを含む標準ウサギ脳トロ
ンボプラスチン-HS(HSは高感度を意味する)(Sigma Chemical Co.)でアッセイし
た。この混合物は、リン脂質と膜結合型組織因子の両方を含む。ウサギ脳トロン
ボプラスチン-HSをバッファーで1:100に希釈し、VII(10 nMの第VII因子を含む正
常ヒト血漿の形で添加)およびVIIQ11E33(純粋なタンパク質として添加)のアッセ
イに用いた。トロンボプラスチン(0.2 mL)を血漿(0.1 mL)に加えて反応を開始さ
せ、血塊を形成するのに要する時間を測定した。また、製造元が示したように十
分な濃度のトロンボプラスチンを用いてアッセイを行った。
【００９０】 ヒトトロンボプラスチンの最適なレベルでは、野生型VIIは正常なレベルの活
性(約1500 unit/mg)を示した。これは、野生型第VIIa因子の活性(80,000 unit/m
g)のおよそ25分の1である。VIIQ11E33は標準のアッセイ条件においては1 mgあた
りおよそ1500〜3000ユニットで、野生型VIIの2倍にすぎなかった。
【００９１】 野生型VIIとVIIQ11E33の差は、凝血条件が最適状態に及ばないときはさらに大
きいものであった。図5は正常なトロンボプラスチンの量の0.01倍を含むアッセ
イにおける凝血時間とチモーゲンの濃度を示す。これらの条件下で、VIIQ11E33
は野生型第VII因子に比べおよそ20倍の活性があった。このように、VIIQ11E33変
異体のより大きな効力は、in vivoでの多くの状況に関連する制限された凝血条
件下において特にはっきりあらわれた。
【００９２】DEGR-VIIaQ11E33の抗凝血活性 標準的な凝血アッセイは正常なヒト血清とバッファーに1:10で希釈したヒトト
ロンボプラスチンを用いて行った。第VIIaQ11E33因子の活性部位をSorenson, B.
B.ら、(1997,前掲)が記載するように、DEGRで改変した。前掲)。図6はカルシウ
ムバッファー中、血漿を加える前に15秒間トロンボプラスチンと共にでインキュ
ベートしたDEGR-VIIaQ11E33(0〜4 nm)の凝血時間を示す。血塊を形成する時間は
、ハンドチルト法(hand tilt method)で評価した。凝血時間は、約1 nMのDEGR-V
IIaQ11E33でおよそ45秒だった。活性部位改変型第VIIa因子Q11E33は抗血液凝固
活性が増大していた。
【００９３】実施例２ - 第VII因子の精製 : コンカナバリンＡ(Con A)、DEAE、およびアフィ
ニティクロマトグラフィーにより第VII因子(野生型または突然変異型)を精製し
た。トランスフェクトされた293細胞の粗製培地をCon A樹脂(Pharmacia)と共に4
℃で4時間インキュベートした。次に、50 mM Tris、pH 7.5、10 mMベンズアミジ
ン、1 mM CaCl2、および1 mM MgCl2を含有する溶液で樹脂を洗浄し、0.2 M D-メ
チルマンノシド、0.5 M NaClを含有する50 mM Tris緩衝液、pH 7.5で溶出させた
。50 mM Tris、pH 8.0、50 mM NaCl、10 mMベンズアミジン、および25 mM D-メ
チルマンノシドを用いて第VII因子を一晩透析した。
【００９４】 次に、透析した第VII因子をDEAE樹脂(Pharmacia)と共に１時間インキュベート
し、混合物をカラムに充填した。50 mM Tris、pH 8.0、10 mMベンズアミジン、
および50 mM NaClでDEAEカラムを洗浄し、2 mL/分の流量において、50 mM〜500
mM NaClのグラジエントを有する50 mM Tris緩衝液、pH 8.0で第VII因子を溶出さ
せた。第VII因子活性を有する画分をプールし、50 mM Tris、pH 8.0、50 mM NaC
l、および5 mM CaCl2を用いて一晩透析した。Con AおよびDEAEを用いて部分的に
精製した第VII因子を、37ECで１時間かけてウシ第Xa因子（重量比1:10、Enzyme
Research Laboratory)により活性化させた。
【００９５】 活性化された第VII因子をアフィニティクロマトグラフィーによりさらに精製
した。Broze et al., J. Clin. Invest., 1985, 76:937-946に記載されているよ
うに、第VII因子に対するカルシウム非依存性モノクロナール抗体(Sigma)をaffi
gel-10 (Bio-Rad Laboratory)に結合させ、そしてアフィニティーカラムを用い
て4ECで一晩インキュベートした。50 mM Tris、pH 7.5、0.1 M NaClでカラムを
洗浄し、0.2 mL/分の流量において、50 mM Tris、pH 7.5、3 M NaSCNで第VIIa因
子を溶出させた。溶出させた画分を、直ちに、50 mM Tris、pH 7.5、0.1 M NaCl
中に5倍希釈した。第VIIa因子活性を有する画分をプールし、濃縮し、そして50
mM Tris、pH 7.5、0.1 M NaClを用いて一晩透析した。
【００９６】 標準としてBSAを使用してBio-Radタンパク質アッセイキットにより第VIIa因子
のタンパク質濃度を測定した。還元および変性条件下でのクマシーゲルおよびウ
ェスタンブロットにより、第VIIa因子の純度をアッセイした。トロンボプラスチ
ン(Sigma)の存在下で合成ペプチド基質spectrozyme-FVIIa (American Diagnosti
ca)を用いて第VIIa因子のタンパク質分解活性を測定した。精製した第VIIa因子
は、0.1 mg/ml BSA、0.1 M NaCl、50 mM Tris、pH 7.5中に-80ECで保存した。
【００９７】 標準的なin vitro凝血アッセイ（およびそれらの変形実施例）を用いて、特に
、プロトロンビン時間(PT)アッセイおよび活性化部分トロンボプラスチン(aPTT)
アッセイを用いて、第VIIa因子突然変異体の凝血促進効果を評価した。プールし
た正常ヒトドナー血漿中および凝血因子欠損(第VIII因子、第IX因子、第VII因子
)ヒト血漿(Sigma)中において、種々の濃度の第VIIa因子突然変異体を評価した。
0.3 mLプローブを用いるFibroSystem fibrometer (BBL)およびSysmex CA-6000 A
utomated Coagulation Analyzer (Dade Behring)の両方を用いて37ECで凝血時間
を測定した。
【００９８】 プールした正常ヒトドナー血液から血小板欠乏血漿(PPP)を調製した。各健常
ドナーからクエン酸塩添加(3.2%クエン酸ナトリウム緩衝液0.5mL)Vacutainer管
に血液(4.5mL)を採取した。2,000gで10分間遠心分離した後、血漿を取得し、使
用するまで氷上で保存した。製造業者の取扱説明書に従って、購入した因子欠損
血漿を再構成した。第VIIa因子突然変異体の各ストックを血漿に全て加えて段階
的な希釈液を調製した。使用するまで、すべての血漿(第VIIa因子突然変異体を
含むものと含まないもの)を氷上で保存した。全ての場合において、血塊形成時
間を測定した。反復サンプルの平均および標準偏差を記録した。
【００９９】 次のPT試薬: トロンボプラスチンC-Plus (Dade)、Innovin (Dade)、カルシウ
ム添加トロンボプラスチン(Sigma)、もしくはカルシウム添加トロンボプラスチ
ンHS (Sigma)のいずれかを用いて血漿(第VIIa因子突然変異体の添加された段階
的な希釈液を含むものと含まないもの)中でプロトロンビン時間(PT)アッセイを
行った。アッセイは、製造業者の取扱説明書に従って行った。製造された最大濃
度でPT試薬を使用した以外に、PT試薬の種々の希釈液を用いてPTアッセイを行っ
た。全ての場合において、血塊形成時間を測定した。反復サンプルの平均および
標準偏差を記録した。
【０１００】 アクチンFS (Dade)もしくはAPTT試薬(Sigma)のいずれかを用いて血漿(第VIIa
因子突然変異体の添加された段階的な希釈液を含むものと含まないもの)中で活
性化部分トロンボプラスチン(aPTT)アッセイを行った。アクチンFS (Dade)に対
しては0.025M CaCl2 (Dade)を、APTT試薬(Sigma)に対しては0.02M CaCl2 (Dade)
を用いて凝血を開始させた。アッセイは、製造業者の取扱説明書に従って行った
。製造された最大濃度でaPTT試薬を使用した以外に、aPTT試薬の種々の希釈液を
用いてaPTTアッセイを行った。いずれの場合においても、血塊形成時間を測定し
た。反復サンプルの平均および標準偏差を報告した。
【０１０１】 様々な濃度のリン脂質ベシクル[PS/PCもしくはPS/PC/PEの比を変化させた(PE=
ホスファチジルエタノールアミン)]を血漿(第VIIa因子突然変異体の添加された
段階的な希釈液を含むものと含まないもの)に添加して、37℃において凝血アッ
セイを行った。20 mM CaCl2の添加により凝血を開始させた。標準的な緩衝液に
様々な試薬を添加した。全ての場合において、血塊形成時間を測定した。反復サ
ンプルの平均および標準偏差を記録した。
【０１０２】 製造業者の取扱説明書に従ってSTACLOT VIIa-rTFキット(Diagnostica Stago)
を用いて、特異的第VIIa因子凝血活性を血漿(第VIIa因子突然変異体を含むもの
と含まないもの)中で評価した。このキットは、活性型FVIIに対する定量的凝血
アッセイに基づくものである(Morrissey et al., 1993, Blood, 81(3):734-744)
。0.3 mLプローブを用いるFibroSystem fibrometer (BBL)およびSysmex CA-6000
Automated Coagulation Analyzer (Dade Behring)の両方を用いて凝血時間を測
定した。
【０１０３】実施例３ ラットにおける第VIIQ11E33因子の循環時間 ０時間において、ナトリウムネンブタールで麻酔したSprague Dawleyラット(3
25〜350g)２匹に、36μgの第VIIQ11E33因子を注射した。注射はカニューレがは
め込まれた頸静脈に行った。図７に示す時間毎に、手術によってカニューレを挿
入した頸動脈から血液を採取した。ヒト第VII因子欠損血漿にラット血漿の1：10
希釈物を1 μL加え、その凝血時間によって循環中の第VIIQ11E33因子の量を見積
もった。ウサギ脳トロンボプラスチン-HS(Sigma Chemical Co.)の1：100希釈物
を用いた。凝血は、実施例1に記載の手動チューブチルト法によって評価した。
第VIIQ11E33因子を注入する前の血漿中の第VII因子活性の量を測定し、ブランク
とみなして差し引いた。循環中の第VIIQ11E33因子の濃度は、log nMで与えられ
る。3番目の動物に手術を施し、カニューレは挿入しても第VIIQ11E33因子を注入
しない模擬実験を実施した。その動物内の第VII因子活性の量は、実験時間(100
分)を通して変化しなかった。実験の最後に動物は、過剰のナトリウムネンブタ
ールによって安楽死させた。
【０１０４】 ラットは、実験を通じて、凝血の形跡もなく正常のように見えた。つまり、第
VIIQ11E33因子は手術後のラットにおいてさえ、やたらに凝血を引き起こさなか
った。第VIIQ11E33因子の循環寿命は正常で(図７)、おおよそ40％のタンパク質
が約60分で消失し、残ったタンパク質はさらにゆっくりと消失した。これは、ラ
ットからウシのプロトロンビンが消失する速度に近い。( NelsestuenとSuttie,
1971, Biochem, Biophys. Res. Commun.,45: 198-203 )これは、機能アッセイの
循環半減期が20分〜45分である野生型組換え第VIIa因子よりも優れている。(Tho
msen,M.K.ら、1993, Thromb. Haemost., 70 : 458-464 )これは、第VIIQ11E33因
子が異常なタンパク質として認識されず、そのため、凝固活性によって急速に破
壊されなかったことを示した。第VIIQ11E33因子は正常なタンパク質として出し
、動物のなかで標準の循環寿命を有するといえる。
【０１０５】実施例４ 膜部位の亢進とプロテインCの活性 ウシおよびヒトのプロテインCは、ヒトタンパク質の膜親和力が約10倍高いに
も関わらず、それらのGLAドメイン(アミノ末端44残基)のアミノ酸は高度の相同
性を示す。ウシプロテインCは位置11にプロリンを含有するのに対し、ヒトプロ
テインCは位置11にヒスチジンを含有する。ウシプロテインCのプロリン-11をヒ
スチジンに置き換えることおよびヒトプロテインCにおけるその逆の変化の影響
を試験した。両事例ともに、プロリン-11を含有するタンパク質はより低い膜親
和力を示し、ウシプロテインCについては約10倍、そしてヒトプロテインCについ
ては5倍であった。位置11にプロリンを含有する活性型ヒトプロテインC(hAPC)は
野生型hAPCより、使用したアッセイによるが、2.4〜3.5倍低い活性を示した。ヒ
スチジン-11を含有するウシAPCは、野生型bAPCより15倍までの高い活性を提示し
た。これは、変異により膜接触および活性の両方を改善する能力を実証した。
【０１０６】プロテインCの突然変異誘発 全長ヒトプロテインC cDNAクローンは、ヨハン・ステンフロ博士(Dr. Johan S
tenflo, Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmo, Sweden)
より提供を受けた。ウシプロテインC cDNAクローンは、ドナルド・フォスター博
士(Dr. Donald Foster, ZymoGenetics, Inc., USA)より提供を受けた。GenBank
受託番号は、ウシプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2435, NID g1634
86、そしてヒトプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2059, NID g190322
である。
【０１０７】 部位特異的突然変異誘発をPCR法により実施した。ヒトプロテインCのヒスチジ
ン-11のプロリンへの変異誘発のために、次のオリゴヌクレオチドを合成した：A
、5'-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3'(ベクターpRc/CMV
中のヌクレオチド860-895に対応、配列番号７)pRc/CMVとプロテインCの間にHind
III部位を作るためである。B、5'-GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG
CTC CTC CAG GAA-3'(ヒトプロテインCのアミノ酸残基4-17に対応し、この配列の
第8残基は下線で示したようにヒトプロテインCの残基からウシプロテインCの残
基に変異を受けている、配列番号８)。
【０１０８】 ウシプロテインCのプロリン-11のヒスチジンへの突然変異誘発のために、次の
オリゴヌクレオチドを合成した：A、(上記のとおり)；C、5'-ACG CTC CAC GTT G
CC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3'(ウシプロテインCのアミノ酸残基4-15に対
応し、第6残基は下線でマークしたようにウシプロテインCの残基からヒトプロテ
インCの残基に変異を受けている、配列番号９)；D、5'-TTC CTA GAG GAG CTG CG
G CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3'(ウシプロテインCのアミノ酸残基4-15に対応し、
第7残基はウシプロテインCの残基からヒトプロテインCの残基に変異を受けてい
る；変異を受けたヌクレオチドは下線が引かれている、配列番号１０)；E、5'-G
CA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3'(ベクターpRc/CMV中のヌ
クレオチド984-1019に対応し、pRc/CMVとプロテインCの間にXba I部位を作る、
配列番号１１)。
【０１０９】 ヒトおよびウシプロテインC cDNAの両方を、発現ベクターpRc/CMVのHind III
およびXba I部位中にクローニングした。5'末端からアミノ酸-17までを含有する
ヒトプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAならびにプライマーAお
よびBを用いてPCR増幅した。PCR反応液の容積は100μlで、Tris-HClバッファー(
10mM Tris、25mM KCl、5mM (NH4)2SO4、および2mM MgSO4、pH 8.85)中に、鋳型D
NAの0.25μg、4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステルそれぞれの200
μM、各プライマーの0.5mMおよびPwo-DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)の
2.5Uを含有した。サンプルを、94℃で変性2分間、55℃でアニーリング2分間、お
よび72℃で伸長2分間からなるPCRの30サイクルにかけた。増幅後、該DNAを、1mM
EDTAを含有する40mM Tris-酢酸バッファー中で0.8%アガロースゲルに電気泳動
した。PCR産物をJETプラスミド・ミニプレップキット(JET Plasmid Miniprep-Ki
t, Saveen Biotech AB, Sweden)を用いて精製した。それぞれの変異を含有する
ヒトプロテインC cDNAをHind IIIおよびBsr BIによって切断し、これを、その後
、Hind III/Xba Iにより切断されかつBsr BIから3'末端までのヒトプロテインC
断片を含有するpRc/CMVベクター中にクローニングして、変異をもつヒトプロテ
インC全長cDNAを作製した。
【０１１０】 5'末端からアミノ酸-11までを含有するウシプロテインC cDNAを、無傷のヒト
プロテインC cDNAならびにプライマーAおよびCを用いてPCR増幅した。アミノ酸1
1から3'末端までのウシプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAなら
びにプライマーDおよびEを用いてPCR増幅した。これら２つのcDNA断片を鋳型と
して使って、変異アミノ酸を含有する全長ウシプロテインC cDNAをプライマーA
およびEを用いて増幅した。PCR反応条件は、hAPCに使ったものと同一であった。
各変異を含有するウシプロテインC cDNAを、Hind IIIおよびBsu 36Iで切断し、
得たHind III/Bsu36I断片を、Bsu 36Iから3'末端までの無傷のウシプロテインC
断片を含有するpRc/CMVベクター中にクローニングして、変異を含有する全長ウ
シプロテインC cDNAを作製した。トランスフェクションの前に全ての変異をDNA
配列決定により確認した。
【０１１１】細胞培養と発現 アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系293を、10%ウシ胎児血清
、2mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシンおよび
10 μg/mlビタミンK1を補給したDMEM培地中で増殖した。トランスフェクション
をリポフェクチン法を使って実施した(Felgner, P.L.ら, 1987, Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 84:7413-7417)。DNAの2μgを、2 mM L-グルタミン培養液を含有
するDMEM培地を用いて0.1mLに希釈した。リポフェクチン(1 mg/ml)の10μLを、2
mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地の100 μLに加えた。DNAとリポフェ
クチンを混合し、室温で10〜15分間放置した。細胞単層(5cmペトリディッシュ中
で25〜50%コンフルエンス)を2 mM L-グルタミン培養液を含むDMEM培地で２回洗
浄した。DNA/脂質混合物を、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地で1.8
mLに希釈し、細胞に加え、16時間インキュベートした。細胞に10%子ウシ血清を
含有する完全培地の2mLを補給し、さらに48〜72時間放置して回復させ、その後
、トリプシン処理し、選択培地(10%血清およびGeneticinの400 μg/mLを含有す
るDMEM)を容れた10cmディッシュ中に1：5でまいた(Yan, S.C.B.ら, 1990, Bio/T echnology 655-661)。Geneticin耐性コロニーが3〜5週間の選択の後に得られた
。それぞれのDNAトランスフェクションから24コロニーを拾い、コンフルエンス
まで増殖し、そして該培地を、モノクローナル抗体HPC4(ヒトプロテインCに対し
て)およびモノクローナル抗体BPC5(ウシプロテインCに対して)を使うドット-ブ
ロットアッセイにより、プロテインC発現についてスクリーニングした。大量の
タンパク質を産生するクローンを単離し、ビタミンK1の10 μg/mLの存在下でコ
ンフルエンスまで増殖した。
【０１１２】 ウシ組換プロテインCおよびその変異体の精製は先に開示された方法に基づき
、若干の修正を施した(Rezair, A.R.,およびEsmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem . , 267:26104-26109)。安定してトランスフェクトした細胞の無血清ならし培地(
conditioned serum-free medium)を5000rpmで、4℃、10分間遠心分離した。上清
を0.45μmの硝酸セルロース膜(Micro Filtration Systems,日本)を通して濾過し
た。EDTA(最終濃度、5mM)とPPACK(最終濃度、0.2μM)を239の細胞からのならし
培地に加え、その後、Millipore Con Sep LC100(Millipore, USA)を使い、室温
でPharmacia FFQ陰イオン交換カラムに通過させた。該タンパク質をCaCl2勾配(
出発溶液、20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7.4; 限定溶液、20 mM Tris-HCl/1
50 mM NaCl/30 mM CaCl2, pH 7.4)を用いて溶離した。透析およびChelex 100処
理によりCaCl2を除去した後、該タンパク質を第２FFQカラムに再吸収させ、その
後、NaCl勾配(出発溶液、20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7.4; 限定溶液、20
mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 7.4)を用いて溶離した。精製のこの時点で、野生
型および変異型組換ウシプロテインCは、SDS-PAGEにより確認したところ均一で
あった。
【０１１３】 野生型および変異型組換ヒトプロテインCの精製に使った第１カラムは、ウシ
プロテインCについて記載したものと同じであった。レゼールおよびエスモン(Re
zair and Esmon)が記載したクロマトグラフィー法に、ウシプロテインS精製の方
法として記載された若干の改良を施して使用した(Rezair, A.R.,およびEsmon, C
.T., 1992,前掲；He, Z.ら, , 1995, Eur. J. Biochem., 227:443-440)。陰イオ
ン交換クロマトグラフィーからのプロテインCを含有する画分をドット-プロット
により確認した。ポジティブの画分をプールし、Ca2+依存性抗体HPC-4を含有す
るアフィニティカラムにアプライした。該カラムは、5 mMベンズアミジン-HClお
よび2 mM CaCl2を含有する20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4で平衡化した
。アプライ後、カラムを1M NaClを含有する同じバッファーで洗浄した。その後
、プロテインCを、5 mMベンズアミジン-HClを含有する20 mM Tris-HCl, 150 mM
NaClおよび5 mM EDTA, pH 7.4を用いて溶離した。精製後、全てのヒトおよびウ
シ組換プロテインC調製物の純度をSDS-PAGEと続いて銀染色により評価した。タ
ンパク質をYM 10フィルター(Amicon)を使って濃縮し、その後、バッファー(50 m
M Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)に対して12時間透析し、-70℃で貯蔵した。
タンパク質濃度は280nmにおける吸収により測定した。
【０１１４】正常および変異型プロテインC分子と膜との結合 LUVおよびSUVを実施例１に記載した方法により調製した。VII因子について記
載したように、入射光に対し90°の光散乱を使ってタンパク質-膜結合を定量し
た(5mM カルシウムで、PS/PC、(25/75)の25 μg/mL、(0.05 M Trisバッファー-0
.1 M NaCl, pH 7.5))。
【０１１５】 位置11にヒスチジンを含有するウシプロテインCは、野生型タンパク質より約1
0倍高い親和力で膜と相互作用した。式２に合わせると、該データは、プロテイ
ンC‐H11に対して93080 nM、そして野生型プロテインCに対して9200950 nMのKD
値を得た(図8A)。親和力の差は、25℃で約1.4 kcal/molに相当した。実際、ウシ
プロテインC-H11の膜親和力は天然のヒトプロテインCのそれとほとんど同一であ
った(660 nM、図8B)。これは、プロリン11がヒトとウシタンパク質の間の膜結合
部位の違いの主たる根拠であることを示唆した。
【０１１６】 逆置換、すなわちヒトプロテインCのHis-11のプロリンによる置き換えは、膜
親和力を低下させる(図8B)。式２に合わせると、これらのデータは野生型ヒトプ
ロテインCに対して66090 nM、そしてヒトプロテインC-P11に対して3350110 nMの
KD値を得た。プロリン導入の影響は、ウシタンパク質におけるプロリンの影響よ
りごくわずか小さかった。
【０１１７】活性型プロテインCの活性に対するプロリン-11の影響 活性型プロテインCは、トロンビン切断により、野生型および変異タンパク質
の両方に同一の条件を使って作製することができる。各種のプロテインC調製物(
1 mg/mL)の約150μgを、ウシトロンビン(3 μg)と混合し、37℃で5時間インキュ
ベートした。反応産物を0.025 M Trisバッファー0.05 M NaClに希釈し、SP-Seph
adex C-50の1 mLカラムにアプライした。カラムを同じバッファー 1 mLで洗浄し
、通過物を活性型プロテインCとしてプールした。カラムにアプライしたタンパ
ク質の約65〜80%が回収された。APC活性を、25℃でS2366(0.1 mM)のタンパク質
分解(proteolysis)により決定した。調製物を、もっと大規模で得た標準調製物
と比較した。標準ヒトAPCはウォルター・キジェル博士(Dr. Walter Kisiel)から
提供を受けた。ウシタンパク質については、標準物はトロンビン活性型APCの大
規模調製物であった。ウシAPCの活性は、正常および変異タンパク質の全ての調
製物と一致した(±5%)。ウシAPCの２つの調製物を比較に使った。トロンビンか
ら作製したヒトAPCは、標準に対して55〜60%の活性があった。この研究で提示さ
れた濃度は、S2366に対する活性に基いており、標準の活性と関連させた。
【０１１８】 標準APTT試験は、ウシまたはヒト血漿および標準APTT試薬(Sigma Chemical Co
.)を、製造者の指示書に従って使用した。あるいは、リン脂質は高度に精製され
たリン脂質から形成された小胞の形で提供された。このアッセイにおいて、ウシ
血漿(0.1 mL)を、カオリン(0.05 M Trisバッファー、0.1 M NaCl、pH 7.5中に5
mg/mLの0.1 mL)またはエラギン酸(ellagic acid)(バッファー中に0.1 mM)のいず
れかで5分間、35℃でインキュベートした。凝固は、リン脂質を含有するバッフ
ァーの0.1 mLおよび示されたAPCの量を加えることにより開始し、その後、25 mM
塩化カルシウムの0.1 mLを加えた。全ての試薬は、0.05 M Trisバッファー、0.1
M NaCl、pH 7.5を含有する標準バッファー中で使った。該H11変異体の影響を再
現するには、平均で14倍高い濃度の野生型bAPCを要した。10 nM bAPC-H11での凝
固時間は120分より長かった。この血漿について、標準APTT試薬(Sigma Chemical
Co.)は、35℃で約61秒の凝血時間をあたえた。血塊形成に要する時間をマニュ
アルで記録した。リン脂質の量がアッセイの制限要素となり、示された血塊形成
時間を与えるように設計した。使ったリン脂質は、SUV(最終アッセイで45 μg/0
.4 mL、PS/PC、10/90)またはLUV(最終アッセイで120 μg/0.4 mL、PS/PC、25/75
)であった。
【０１１９】 活性型プロテインCの抗凝固活性を複数の方法で試験した。図9は、リン脂質を
限定して実施した、APTTアッセイに与える影響を示す。このアッセイ条件のもと
で、凝固時間は、リン脂質濃度とともにほぼ反比例関係で低下した。ウシAPC-H1
1と効果を等しくするために、約14倍量の野生型ウシAPCを必要とした。
【０１２０】 図9の研究の一部を、PS/PC(27/75, LUV)の膜に対して繰返した。再び、活性を
リン脂質により制限し、かつその濃度を360秒の制御血塊形成時間をあたえる様
に調節した(0.4 mLアッセイで25% PSの120 μg)。H11変異体と影響を等しくする
ために、約15倍量を超える野生型酵素を必要とした。最後に、標準APTT試薬(Sig
ma Chemical Co.、標準血塊形成時間502秒)を使った。凝固時間を2倍の1025秒に
するために、約10.00.7 nMの野生型酵素を必要とした。同じ影響は、2.20.1 nM
のウシAPC-H11により与えられた。標準アッセイでは、リン脂質は律速でなかっ
たので、膜親和力に与える影響は小さいと考えてよい。
【０１２１】 ヒトタンパク質の結果を図8Bに示す。凝固を野生型APCの程度にまで延長する
ために、プロリン-11を含有するヒトAPCを約2.5倍必要とした。プロリン-11導入
の影響が低いのは、ヒトタンパク質の膜親和力の差が小さいことを反映するので
あろう(図9B)。
【０１２２】第Va因子の不活性化 第Va因子不活性化をニコラスら(Nicolaesら, 1996, Thrombosis and Haemosta sis , 76:404-410)の方法によりアッセイした。簡単に説明すると、ウシタンパク
質については、ウシ血漿を、0.05 M Tris、0.1 M NaCl、1 mg/mLウシ血清アルブ
ミンおよび5 mMカルシウム、pH 7.5により1000倍に希釈した。第V因子を活性化
するために、リン脂質小胞(5 μg/0.24 mLアッセイ)および190 nMトロンビンの5
μLを加えた。37℃で10分間インキュベーションの後、APCを加え、インキュベ
ーションを6分間続けた。ウシプロトロンビン(最終濃度10 μMに)および第Xa因
子(最終濃度0.3 nM)を加えて、該反応物を37℃で1分間インキュベートした。こ
の活性化反応物の20μLサンプルを、S2288基質(60μM)を含有するバッファー(0.
05 M Tris, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5)の0.38ｍLに加えた。トロンビンの
量を405 nMの吸収の変化により定量した(ε=1.0*104 M-1s-1、トロンビン=100/s
に対するkcat)。ヒトタンパク質については、ヒトプロテインS-欠損血漿(Biopoo
l Canada, Inc.)を100倍希釈し、第Va因子をヒトトロンビンにより活性化し、そ
して産生した第Va因子をウシタンパク質に対して使用した試薬を用いてアッセイ
した。
【０１２３】 ウシAPC-H11は、第Va因子の不活性化において、野生型(図10A)より9.2倍活性
が高かった。膜結合(上記)に関して、ヒトタンパク質についてはプロリン-11の
影響はそれより小さく、野生型とP11変異体に対して引いた曲線間には平均2.4倍
の差があった(図10B)。同様な結果を正常なヒト血漿で得た。
【０１２４】実施例５ ビタミンＫ依存性タンパク質の膜接触部位に対する原型膜親和力の同 定 様々なヒトおよびウシプロテインC変異体ならびに他のビタミンＫ依存性ポリ
ペプチドを比較して、膜接触部位原型(membrane contact site archetype)を提
案するに至った。静電気原型は、結合カルシウムイオンにより作られたタンパク
質表面上の電気陽性コアからなり、タンパク質のアミノ酸からくる電気陰性電荷
のかさ(halo)により囲まれている。このタンパク質ファミリーのメンバーがこの
静電気パターンに接近しているほど、膜に対する親和力は高い。
【０１２５】 リン脂質小胞、野生型ウシプロテインC、タンパク質-膜相互作用研究、プロテ
インCの活性化および定量、ならびに活性分析は、実施例４に記載の通りであっ
た。
【０１２６】 組換え、変異型プロテインCを次の方法によって作製した。部位特異的突然変
異誘発は、PCR法で実施した。次のオリゴヌクレオチドを合成した；A、実施例４
に記載のとおり。F、5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3'
(ベクターpRc/CMV中のヌクレオチド984-1019に相当する、配列番号１１)、pRc/C
MVとプロテインCの間のXbaI部位を作る；G、5'-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT G
TC TTC GAA AAT CTC CCG AGC-3'(ウシプロテインCのアミノ酸残基40-27に対応し
、第8および第9アミノ酸は下線でマークしたようにQNからEDに変異されている、
配列番号１２)；H、5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3'(
ヒトプロテインCのアミノ酸残基38-27に対応し、第6および第7アミノ酸は下線で
示したようにQNからEDに変異されている、配列番号１３)、I、5'-GCC AAG GAA A
TT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3'(ヒトプロテインCのアミノ酸残基27-38
に対応し、この配列の第6および第7アミノ酸は下線で示したようにQNからEDに変
異されている、配列番号１４)；J、5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT T
TC CTT GGC-3'(ヒトプロテインCのアミノ酸残基38-27に対応し、この配列の第7
アミノ酸は下線で示したようにQからEに変異されている、配列番号１５)；Ｋ、5
'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG-3'(ヒトプロテインCのア
ミノ酸残基27-38に対応し、この配列の第6アミノ酸は下線で示したようにQからE
に変異されている、配列番号１６)。
【０１２７】 ウシおよびヒトプロテインC両方の全長cDNAを、ベクターpRc/CMVのHind IIIお
よびXba I部位中にクローニングした。ウシプロテインC変異体E33D34を取得する
ために、標的DNAのPCR増幅を次のように実施した。5'末端から位置40のアミノ酸
までを含有するウシプロテインC cDNAを、無傷のウシプロテインC cDNAならびに
プライマーAおよびCを用いて増幅した。PCR反応条件は、実施例３に記載のとお
りであった。サンプルを、94℃で変性2分間、55℃でアニーリング2分間、および
72℃で伸長2分間からなるPCRの30サイクルにかけた。増幅後、DNAを、1mM EDTA
を含有する40mM Tris-酢酸バッファー中で0.8%アガロースゲルを通して電気泳動
した。PCR産物をThe Geneclean IIIキット(BIO 101, Inc. USA)を用いて精製し
、それぞれの変異を含有するウシプロテインC cDNAのPCR断片をHind IIIおよびB
bs Iで切断した。Hind III/Bbs I断片およびヒトプロテインC断片(Bbs I-3'末端
)を、pRc/CMVベクターのHindIIおよびXba I部位中にクローニングして、変異を
もつ全長ウシプロテインC cDNAを作った。ウシプロテインC変異体H11 E33 D34を
同じ方法で作製したが、ウシプロテインC変異体H11をPCR反応の鋳型として使っ
た。
【０１２８】 5'末端からアミノ酸38までを含有するヒトプロテインC cDNAを、無傷のヒトプ
ロテインC cDNAならびにプライマーAおよびDを用いてPCR増幅した。アミノ酸27
から3'末端までのヒトプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAならび
にプライマーBおよびEを用いて増幅した。これらの２つのcDNA断片を鋳型として
使って、プライマーAおよびBを用いて、変異アミノ酸(E33 D34)を含有する全長
ウシプロテインC cDNAを増幅した。ヒトプロテインC変異体E33は次のステップに
より得た；5'末端からアミノ酸38までを含有するヒトプロテインC cDNAを、無傷
のヒトプロテインC cDNAならびにプライマーAおよびFを用いて増幅した。アミノ
酸27から3'末端までのヒトプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAな
らびにプライマーBおよびGを用いて増幅した。これらの２つのcDNA断片を鋳型と
して使って、プライマーAおよびBを用いて、変異アミノ酸(E33)を含有する全長
ウシプロテインC cDNAを増幅した。PCR混合物とプログラムは上に記載した通り
であった。それぞれの変異体を含有するヒトプロテインCのPCR産物をHind IIIお
よびSal Iで切断し、その後、該断片(Hind III - Sal I)を無傷のヒトプロテイ
ンC断片(Sal I - 3'末端)と一緒に、pRc/CMVベクターのHind IIIおよびXba I部
位中にクローニングして、それぞれの変異をもつ全長ヒトプロテインC cDNAを作
製した。位置12にグリシン残基を、E33D34変異とともに含むヒトプロテインCも
また作製した。トランスフェクションの前に、全ての変異体をDNA配列決定によ
って確認した。
【０１２９】 アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系293を、実施例４に記載
したように、培養し、トランスフェクトした。ウシおよびヒト組換えプロテイン
Cおよび変異体を、実施例４に記載のように、精製した。
【０１３０】 ビタミンＫ依存性タンパク質を、標準膜に対する親和力を基準として４グルー
プに分類した(表５)。ヒトプロテインC(hＣ、配列番号１)、ウシプロテインC(b
Ｃ、配列番号２)、ウシプロトロンビン(bPT、配列番号１７)、ウシ第X因子(bX、
配列番号１８)、およびヒト第VII因子(hVII、配列番号３)、ヒトプロテインZ(hZ
、配列番号２０)、およびウシプロテインZ(bZ、配列番号２１)を含む複数の関連
タンパク質のアミノ末端残基の配列を、参照のために掲げたが、ここで、XはGla
(γカルボキシグルタミン酸)またはGluである。
【０１３１】
【表５】 表５で、ビタミンＫ依存性ポリペプチド変異体は太字である。全電荷(残基１
〜34)は７個のカルシウムイオン(+14)およびアミノ末端(+1)を含む。
【０１３２】 プロテインZは、解離速度定数が他のタンパク質のものより100〜1000倍遅いこ
とに基づいてクラス1に割り当てた。もしプロテインZが通常の会合速度定数(約1
07 M-1s-1)を示せば、ＫDは約10-10Mとなる(M. Wei, G. J.ら, 1982, Biochemis try , 21:1949-1959)。後者の親和力はビタミンＫタンパク質にとって可能な最大
値であろう。プロテインZは、抗血液凝固治療のための、プロテインZ依存性プロ
テアーゼ阻害剤(ZPI)による第Xa因子の阻害に関する補因子としての候補物質で
ある。プロテインZとZPIを第Xa因子とともにインキュベートすると、第Xa因子の
血液凝固促進(procoagulant)活性が減少する。例えば、Hanら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 1998, 95:9250-9255を参照されたい。結合動力学(association ki
netics)の増強により、阻害速度が加速され、平衡に達したときの結合親和力が
増加する。プロテインZはGly-2を含有するが、これにより、他のタンパク質中に
結合されたカルシウムとAsn-2との相互作用が消滅すると考えられている。位置
２におけるグリシン残基の存在は、タンパク質のフォールディングを不安定化さ
せて結合動力学を低下させる。さらに、ウシプロテインZと比べて低いプロテイ
ンZの親和力により、位置34〜36において負電荷がより少なくなり得る(表５)。
【０１３３】 クラスIVタンパク質はクラスIIIと、非静電的手段により親和力を変化しうる
プロリン-11の存在する点で異なった。
【０１３４】 膜親和力と残基１〜34の実効負電荷の間に相対的に弱い相関であるが、残基５
、11、29、33および34だけを考えると優れた相関が見られる(表５)。後者のアミ
ノ酸はタンパク質の表面に位置している。複数のタンパク質をプロトロンビン構
造中へのアミノ酸置換によってモデル化し、その静電気ポテンシャルをデルフィ
プログラム(program DelPhi)によって計算した。ウシプロテインZの静電気ポテ
ンシャルに従いパターン化したスケッチを図11に示す。７、８、26、30、33、34
および11の電気陰性部位は電気陰性電荷のかさを作り、カルシウムライニングさ
れた細孔により作られる陽イオン性コアを囲んでいる(図11)。タンパク質構造が
この構造に近づくほど、膜に対する親和力が高くなる。親和力が最も高いタンパ
ク質には、アミノ酸35〜36にかけて広がる負電荷が見られる。この相関は、野生
型タンパク質、変異体および化学的に改変されたタンパク質から明らかである。
【０１３５】 他の構造のパターンは、他のタンパク質には存在しない電荷群を検証して外挿
することができる。例えば、ウシプロトロンビンのLys-11およびArg-10はその近
傍に高い電気的陽性領域を作り；プロテインCおよび第VII因子のGla-33の欠如は
これらのタンパク質領域により低い電気的陰性電場を作る。全ての場合で、最高
の親和力は、プロテインZについて示されるように電気的陰性タンパク質表面に
より完全に囲まれた電気的陽性コアをもつ構造に対応する。このパターンの例外
は、構造的影響により親和力を低下させうるPro-11およびユニークな無荷電残基
であるser-12を備えたタンパク質(ヒトプロテインC)である。
【０１３６】 さらに静電気分布についての原型の仮説を試験するために、部位特異的突然変
異誘発を使ってウシおよびヒトプロテインCのGln33Asn34を、Glu33Asp34で置き
換えた。Glu33はタンパク質プロセシング中にさらにGlaへ改変されるであろう。
これらの変化は、ウシプロテインCの静電気ポテンシャルを、ウシ第X因子のそれ
に変えた。変異タンパク質の膜親和力は、プロリン-11の存在によって第X因子の
それより低下することが予測された。実際、ウシプロテインC変異体は、ウシプ
ロトロンビンのそれと同様な膜親和力を与え(図12A)、ウシ第X因子のそれよりわ
ずかに低かった(表５)。
【０１３７】 さらに重要なのは、変異体に対するAPCによる凝血阻止は、野生型酵素に対す
るより大きかった(図12B、C)。実施例３からのウシプロテインCのP11H変異体に
対する結果を考慮すると、位置11,33および34のアミノ酸置換を変えることによ
り、それぞれ異なる膜親和力と活性をもつタンパク質のファミリーを作ることが
できるであろう。
【０１３８】 E33およびE33D34を含有するヒトプロテインC変異体は、膜結合親和力の小さな
増加をもたらした(図13a)。これらの変異体の活性は野生型酵素よりわずかに低
かった(図13b)。ウシプロテインCの変異体の結果は、ヒトタンパク質のE33D34変
異の不全(failure)が該タンパク質中のH11および／または他のユニークなアミノ
酸から起こりうることを示唆する。図14Aは、ウシプロテインCのH11変異体は野
生型タンパク質より約10倍高い親和力で、またE33D34変異体は約70倍の親和力で
膜に結合したこと、しかし三重変異体であるH11E33D34はH11変異体よりわずかに
良好であったことを示す。この関係はこれらの変異体から形成されるAPCの活性
に反映された(図14B)。この結果は、H11の存在が膜結合親和力に対するE33D34の
影響を低下させることを示した。
【０１３９】 これらの結果は、E33D34のみの導入は全てのタンパク質にとって最適とは限ら
ないことを示した。従って、E33D34を使いかつ最も増加した膜親和力を有するヒ
トプロテインCを作製するための他の変異が望ましいであろう。ウシタンパク質
についての結果は、ヒスチジン11がこの現象の主要原因であることを示唆した。
従って、E33D34変異とともに、ヒトプロテインC中のH11をグルタミンまたは他の
アミノ酸に変えることができる。親和力に影響を与えうる他のアミノ酸は、ヒト
プロテインCにとって全くユニークなアミノ酸である位置12のセリンである。こ
れらの更なる改変は増強した膜親和力をもつタンパク質を作るであろう。これら
の付加的な変化は膜親和力が増大したタンパク質を生成するはずである。ヒト活
性化プロテインCの、E33D34と組み合わせた、位置12におけるグリシン残基のセ
リンへの置換により、野生型活性化ヒトプロテインCヒトプロテインCよりも９倍
高い活性がもたらされる。G12E33D34変異体の活性を、30秒の対照血塊形成時間
と普通のヒト血漿を使用する希釈トロンボプラスチンアッセイにより測定した。
【０１４０】 静電気原型を、ヒトおよびウシ第X因子の比較によっても試験した。ヒト第X因
子中にリシン-11が存在すると、ウシ第X因子より低い親和力を有するであろうこ
とが示唆された。この予測は、図15に示した結果により支持された。
【０１４１】 今までの研究は、ウシおよびヒトプロトロンビン断片1のトリニトロベンゼン
スルホン酸(TNBS)改変は、膜親和力に相対的に小さい影響(0から5倍)を与えるこ
とを示してきた(Weber, D.J.ら, 1992, J. Biol. Chem., 267:4564-4569; Welsc
h, D.J.ら, 1988, Biochemistry, 27:4933-4938)。該反応に使われた条件はアミ
ノ末端の誘導体化、すなわち膜親和力低下と結びつく変化をもたらした(Welsch,
D.J.およびNelsestuen, G.L., 1988, Biochemistry, 27:4939-4945)。アミノ末
端を保護するカルシウムの存在下でのタンパク質改変は天然の断片1より遥かに
高い膜との親和力をもつTNBS改変タンパク質をもたらした。
【０１４２】 プロテインZが原型を構成するという示唆は、解離速度定数に基づきかつ正常
な会合速度はＫD=10-10Mであろうということに基づいた。この値に到達しうるか
は定かではない。不適当なタンパク質折りたたみ(folding)によりプロテインZの
会合速度が遅くなり、低い膜結合コンフォメーション濃度を生じることは可能で
ある。もし条件を変更してタンパク質折りたたみを改善することができれば、プ
ロテインZの会合速度は改善されるであろう。実際、プロテインZの会合速度定数
は、pHの変更により改善された。この観察の根拠は、アミノ末端(pH 7.5で+1)が
カルシウムイオン2および3に近接して位置するプロトロンビン構造の異常な特徴
と関係しているのであろう。アミノ末端の+1電荷は、図11のCa-1の丁度上のわず
かな電気的陽性領域に原因がある。Caとアミノ末端の間の電荷反撥がタンパク質
折りたたみを不安定化し、低い折りたたみ安定性をもつタンパク質にとって深刻
な問題となりうるであろう。
【０１４３】 表６は、さらに原型モデルを支持する。ストロンチウムイオン1および8(プロ
トロンビンのSr X線結晶構造で見出されるカルシウム1および余分の二価金属イ
オンに対応する)からのイオン性基の距離の間の関係を示す。該パターンは、イ
オン性基がこれらの金属イオンに近いほど、その膜親和力に対する影響は高くな
ることを示唆する。例外は、電気的陽性コアの電荷に寄与するArg-16である。他
の全ての部位では、高い親和力は電気的陰性電荷と相関がある。この相関はまた
、GLA残基にも適用される。
【０１４４】
【表６】 図15Cの結果は、プロテインZに対する会合速度が、アミノ末端が無電荷となる
pH9で実質的に改善されたことを示す。これらのデータから得たpH9における速度
定数は、pH7.5におけるより約12倍高かった(図15C)。
【０１４５】実施例６ - 改変型第VII因子の親和力を評価するための競合アッセイ : 再構築
した組織因子(Innovin, Dade)および膜を用いて、野生型およびVIIaQ11E33の凝
血活性を評価した。飽和量の第VIIa因子を使用した(約0.7μl Innovin/0.15 ml
アッセイ液)。第VIIa因子およびInnovinは、血漿の含まれていない緩衝液(6.7mM
CaCl2、50 mM Tris、pH 7.5、100 mM NaCl)中に112.5μlの量で添加した。15分
後、37.5μlの第VII因子欠損血漿を添加し、凝血時間を記録した。VIIaQ11E33の
組織因子依存性活性は、この方法でアッセイした場合、野生型のタンパク質の活
性と類似したものであった。第VII因子欠損血漿の使用はin vivoの条件を満たし
ていないので、膜結合組織因子に対する改変型の第VII因子の相対的親和力は、
競合タンパク質の存在下で評価した。特に、競合タンパク質として活性部位改変
型第VIIa因子を使用し、多量に存在させた(2 nM)。評価する改変型の第VII因子
は、組織因子の濃度を超える濃度で使用した。そのような条件下では、すべての
タンパク質の遊離タンパク質濃度は、添加した全タンパク質にほぼ等しいもので
あった。全タンパク質から結合タンパク質を差し引いて遊離タンパク質濃度を得
る場合、補正は少ない。競合アッセイによれば、因子VIIaQ11E33は、野生型第VI
Ia因子よりも41倍有効であった。
【０１４６】実施例７ - 第VII因子、プロテインＳ、および他のビタミンＫ依存性ポリペプチ ドの増強された膜結合親和力および活性 : プロテインＳ(GenBank受託番号M5785
3 J02917)は、高親和性膜結合タンパク質であるとともにAPCの作用に対する補因
子である。プロテインＳの欠損は、血栓症の強力な指標であり、このタンパク質
のレベルが低いかまたは血栓症の危険性が増大した患者に用いることが可能であ
る。例えば、Dahlback, Blood, 1995, 85:607-614および米国特許第5,258,288号
を参照されたい。
【０１４７】 アミノ酸５もしくは９の置換により、プロテインＳの膜結合親和力および活性
を増強することができる。プロテインＳの残基９はトレオニン残基であるが、ほ
とんどのビタミンＫ依存性タンパク質はこの位置に疎水性残基を含む。例えば、
McDonald et al., Biochemistry, 1997, 36: 5120-5127を参照されたい。ヒトプ
ロテインＣ中の類似の残基(ロイシン残基)をグルタミンで置換したところ、すな
わち、疎水性から親水性への置換を行ったところ、活性が著しく低下した。例え
ば、Christiansen et al., 1995, Biochemistry, 34: 10376-10382を参照された
い。従って、ビタミンＫ依存性タンパク質による膜会合における位置８の重要性
について混乱があった。
【０１４８】 先に記載のQ11E33突然変異体と組み合わせてアミノ酸９にトレオニン置換を含
むヒト第VII因子がATG Laboratories, Inc.により調製され、先の実施例4に記載
したように、ヒト腎細胞系293中にトランスフェクトするための適切なベクター
の形態で提供された。
【０１４９】 市販のキットを用いて、突然変異第VII因子をコードする核酸配列を含むベク
ターをヒト腎細胞系293中にトランスフェクトした。細胞を増殖させ、そしてプ
ロテインＣのところで説明したように、市販品のモノクロナール抗体を用いて、
高レベルの第VII因子抗原を提供するコロニーをドットブロットアッセイによっ
て選択した。また、実施例6に記載の競合アッセイを用いて、凝血アッセイによ
り調製培地中の第VII因子の量を測定した。一般的には、凝血が開始される前に
、組織因子とのインキュベーションにより第VII因子を第VIIa因子に変換した。
同量のVIIa-Q11E33およびVIIa-T9Q11E33をアッセイに使用した。第VII因子ポリ
ペプチドを適切な量の膜会合組織因子(Innovine, Dade)と混合した。活性部位改
変型第VIIa因子(FFR-VIIa)を添加し(0〜3.5 nM)、6.7mM CaCl2、50 mM Tris、pH
7.5、および100 mM NaClを含有する緩衝液112.5μL中で60分間にわたり反応を
平衡化させた。最後に、第VII因子欠損血漿を添加し、血塊の形成に必要な時間
を測定した。添加した阻害剤の関数として凝血時間を調べることにより、有効性
を決定した。ヒト第VIIa因子-T9Q11E33は、競合結合親和力の著しい低下を示し
た。従って、この位置においてトレオニン残基は最適ではなかった。プロテイン
Ｓのタンパク質9にロイシン残基を導入すれば、多くの条件下でプロテインＳの
膜親和力および活性が増強されるはずである。
【０１５０】 実質的に最適でない残基が存在しているにもかかわらず、プロテインＳの膜親
和力が大きい原因は、その構造の他の部分にあると思われる。すなわち、プロテ
インＳには、「第２のジスルフィドループ」もしくはトロンビン感受性領域(成
熟ポリペプチドの残基46〜75)として知られる配列領域が含まれている。プロト
ロンビンにも、より短い形態で第２のジスルフィドループが含まれている。プロ
トロンビンもしくはプロテインＳ中のループがタンパク質分解開裂すると、膜親
和力は低下する。Schwalbe et al., J. Biol. Chem., 1989, 264: 20288-20296
を参照されたい。開裂には、プロテインＳの作用に負の制御を提供することによ
るプロテインＳ活性の調節が関与している可能性がある。第２のジスルフィドル
ープは、残基46〜75が残基1〜45上に折り畳まれて最適結合部位を形成するよう
に、最適膜結合部位を生成する働きをする可能性がある。プロテインＳの単離さ
れた残基1〜45は、カルシウム依存的に膜に会合しない。これは、カルシウム依
存的に膜に結合するプロトロンビンの残基1〜41もしくは1〜38、第X因子の残基1
〜44、プロテインＣの残基1〜41、またはプロテインＺの残基1〜45とは異なる。
この場合、無傷のプロテインＳが大きな親和力を有するにもかかわらず、プロテ
インＳの単離された残基1〜45 GLAドメインに関する結果から、この無傷のタン
パク質はGLAドメインでの親和力が実質的に低下していることが示唆される。
【０１５１】 タンパク質分解は、この役割に関して第２のジスルフィドループの適切な機能
を阻害し、生成するプロテインＳは、その膜親和力が残基1〜45のアミノ酸から
予測される膜親和力に近づくので、活性の低下を示す。従って、Leu9および他の
変化(以下を参照されたい)を導入することにより膜親和力を増強すれば、もはや
タンパク質分解によりダウンレギュレートされることもなくしかもより有効な抗
凝血剤になるプロテインＳが得られるであろう。
【０１５２】 ほとんどのビタミンＫ依存性タンパク質の保存残基は、位置５にある。プロテ
インＳおよびプロテインＺの双方においてロイシンがこの位置に見いだされる。
プロテインＣ、第X因子および第VII因子、ならびにプロトロンビンは、対応する
位置に別の疎水性残基であるフェニルアラニンを含んでいる。第IX因子は、他の
タンパク質とは大きく異なり、残基5にリシンを含んでいる。この保存されない
残基と第IX因子の膜親和力との間には明らかな関連は見られず、位置５の役割は
不明瞭である。
【０１５３】 ヒトプロテインＣの位置５にグルタミン残基を置換したところ、膜に対する類
似した親和力および類似したカルシウム力価を示す凝血活性の低下したタンパク
質が得られた。第VII因子(Q11E33突然変異体が含む)の位置５のフェニルアラニ
ン残基へのロイシン残基の置換を上述した方法で行った。生成物L5Q11E33の活性
は、上記の活性部位改変型第VIIa因子(0〜3.2nM)を用いる競合法によりアッセイ
した場合、Q11E33突然変異体の活性のわずか33%にすぎなかった。従って、プロ
テインＳの活性は、例えば、位置５にフェニルアラニン残基を置換することによ
り改良することができる。第VII因子でF5K置換を行った場合にも、実施例6に記
載の競合アッセイにより測定した場合、活性が野生型の第VII因子の活性の33%で
あるタンパク質が得られた。第IX因子の膜結合親和力は、K5E突然変異により増
強することができる。第VII因子でP11Q置換を行ったところ正の影響が現れたが
、Q11Eのさらなる変化(この位置をプロテインＺの場合と同じようにする)を導入
してもさらなる影響は現れなかった。すなわち、P11QおよびP11Eはいずれも、野
生型よりも良好であったが、相互の間には差異は見られなかった。従って、それ
ぞれの残基の置換の影響はタンパク質ごとに異なる。しかしながら、適切な置換
を組み合わせることにより、これらの残基の普遍的な重要性が解明される。
【０１５４】 以上に概説した手順により、第VIIa因子分子を産生した。この突然変異体には
、Q11E33突然変異が含まれるとともに、R29FおよびD34F突然変異(Q11F29E33F34)
も含まれていた。この突然変異体は、実施例６に記載の競合アッセイにより測定
した場合、Q11E33突然変異体単独の場合の2.5倍の活性を有していた。従って、
タンパク質中の重要なカルボキシル基の機能を最大化するためには、記載の重要
な部位でアミノ酸残基を正しく組み合わせることが必要である。これらの部位に
おける最適な組み合わせには、陰イオン性残基だけでなく、中性残基および疎水
性残基が含まれていてもよい。
【０１５５】 位置35の重要性は、A35Iをさらに含むように第VII因子突然変異体Q11E33F34を
改変することにより示される。こうして得られた突然変異体Q11E33F34I35の活性
は、実施例６に記載の競合アッセイにより評価した場合、Q11E33F34突然変異体
の活性の60%であった。他の突然変異体Q11E33I34F35を産生したところ、Q11E33F
34I35突然変異体と類似の活性を呈した。これらの結果から示唆されるように、
位置35により大きな疎水性基を存在させることは望ましくない。
【０１５６】 Q11E33F34突然変異体の安定性は、Q11E33突然変異体の安定性よりも75%減少し
た。安定性が減少した結果、培地から得られる収量が低下した。安定性の低下は
、タンパク質分解に起因するものと思われる。Gla残基はタンパク質分解を防止
するので、最大の活性を有するタンパク質の安定性を増大させるためには、位置
35をGlaに改変することが必要であると考えられる。A35E突然変異の導入により
、Q11E33F34突然変異体の安定性を増大させることが可能である。
【０１５７】 位置36の重要性は、Q11E33第VII因子突然変異体にE36D突然変異を追加するこ
とにより示された。こうして得られた突然変異体Q11E33D36の活性は、実施例６
に記載の競合アッセイでQ11E33突然変異体の活性の70%であった。
【０１５８】 位置34〜36の改変は、野生型のタンパク質がN34V35D36を含むヒトプロテイン
Ｃに最大の影響を及ぼすと思われる。F34X35E36（式中、Xは、タンパク質分解消
化に耐性を示すアミノ酸である。）を導入することにより、ヒトプロテインＣの
膜結合親和力を増強することが可能である。
【０１５９】実施例８ - アミノ酸４への残基の挿入 : チロシン残基を含む第VII因子がATG L
aboratries, Inc.により調製され、実施例６に記載の競合アッセイにより調べら
れた。５mMカルシウム中のInnovin (20ml)と共にインキュベートすることにより
第VII因子を活性化した。最小凝血時間28秒を得るのに十分な量(約0.7μl)のInn
ovinを含有するサンプルを緩衝液に移した。第VII因子欠損血漿を添加し、凝血
時間を記録した。最大の活性に達するまで(通常、＜30分)、種々の時間でサンプ
ルをアッセイした。凝血時間を30秒にするのに必要な調製培地中での第VII因子
の量を求めた。この培地/Innovin比は、ほぼ第VIIa因子/組織因子の比1:1に相当
する。活性化の後、凝血時間19秒を得るのに十分な培地/Innovinのサンプル(約
４μlのInnovin)を、カルシウムおよびBSA (1g/L)を含有する緩衝液で112.5μl
に希釈した。種々の量の活性部位改変型第VIIa因子(DEGR-VIIa)を添加し、平衡
に達するまで、典型的には37℃で60分間、インキュベートした。ヒト第VII因子
欠損血漿を添加し(37.5μl)、凝血時間を測定した。野生型の第VIIa因子を含有
する培地で行った類似の実験と結果を比較した。競合置換アッセイから得られた
結果によれば、位置４にチロシン残基の挿入を含むヒト第VII因子の活性は、こ
の残基の欠失した類似の第VII因子分子の活性の２倍であった。
【０１６０】 有益な突然変異を組み合わせて、位置４に挿入されたチロシン残基を含む第VI
I因子突然変異体Q11E33F34を産生した。この突然変異体の活性は、上述した競合
アッセイで第VII因子Q11E33突然変異体の活性の５倍を示した。全体として、こ
の突然変異体の活性は、実施例６に記載の競合アッセイで野生型の第VIIa因子の
活性の160倍である。この結果から分かるように、それぞれの残基の利点は、残
基を組み合わせて存在させると加成性を示す。
【０１６１】実施例９ - 活性型プロテインＣ(APC)によるヒト血液の抗凝血 : Clot Signatur
e Analyzer (CSA)装置(Xylum Company, Scarsdale, NY)を用いてQ11G12E33D34突
然変異体に対する野生型APCの相対的効力を試験した。アッセイの１つでは、こ
の装置は、新たに採取した(＜２分)非抗凝血性血液を、コラーゲン表面を有する
繊維の入った管に通す。血流の圧力(mmHg)は、循環系の圧力と同程度である。血
液中の血小板はコラーゲンに結合して活性化され、凝血を助長する。この装置は
、図16に示されているように、管の出口の圧力を検出する。血塊が形成されると
管の出口の圧力が低下し、半反応点が「コラーゲン誘導血栓形成」(CITF)時間と
して記述される。添加剤のない場合、ヒト被験者に対するCITF時間は、5.0分で
あった(図16A)。図16の値からバックグラウンド時間を差し引いてCITF時間を求
める。30 nM野生型APCを血液に添加した場合、平均CITF時間は、同じ被験者に対
して6.5分(５回の測定)であった(図16B)。6 nM突然変異体APC(Q11G12E33D34)を
用いた場合、平均CITF時間は、５回の測定(図16C)に基づいて15.5分であり、3 n
Mの同じ突然変異型APCを用いた場合、５回の測定に基づいて9.5分であった。従
って、リン脂質源として活性化ヒト血小板膜を用いて、流動圧力下で全ヒト血液
中における血塊形成の阻止を行う場合、突然変異型APCは、野生型APCの少なくと
も10倍有効であった。さらにもう一つの実験において、アスピリン２錠を摂取し
た被験者でCITFを評価したところ、突然変異型APCと野生型APCとのさらに大きな
差異が観測された。より低い膜活性は、突然変異体のより大きな影響と関連付け
ることが可能である。
【０１６２】 この結果は、先に本明細書中で説明したハンドチルト(hand tilt)アッセイ手
順を用いるin vitro凝血試験の結果と異なっていた。APTT試験に対する標準的な
条件および全試薬を用いた場合(製造業者Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
1998から入手した物質および該製造業者により記述された手順)、突然変異型タ
ンパク質は、野生型タンパク質のわずか1.5倍の活性を示したにすぎなかった。
しかしながら、APTTアッセイには、高レベルのリン脂質が含まれているとともに
、突然変異型タンパク質と野生型タンパク質との差異を最小にする条件が含まれ
ている。繰り返すことになるが、これらの結果から、本発明により産生された突
然変異型タンパク質の利点を特徴付けるうえでアッセイ条件が重要であり、また
低いリン脂質濃度は血小板により提供される生物学的膜に特有のものであること
が示唆される。
【０１６３】 ２名の血友病患者由来の血液に及ぼす凝血促進タンパク質の影響を、CSAで試
験した。第１の血友病患者に対するCITFは、13.2分であり、図16で抗凝血性血液
に対して示したのと同様に、断続的な折点を呈し(圧力の増加を伴う)、血塊は不
安定であった。第２のサンプルでは、分析前に、60 nM野生型第VIIa因子を血液
に添加した。この用量は治療レベルに相関する。CITF時間(9.7分)は短くなり、
血塊はより安定であった。第３のサンプルでは、60 nM第VIIa因子Q11E33を使用
した。CITF時間(3.7分)は正常者の範囲を下回り、血塊は安定であった。第２の
血友病患者も同様な応答を示した。
【０１６４】 CSAは、血液凝固を助長する生物学的膜を利用するので、重要なアッセイを提
供する。生物学的膜を利用する他のアッセイについても調べた。Hemochron Jr.
Signature Whole Blood Microcoaguation Systemにより提供されるアッセイは、
臨床状況下で凝血を試験するための一般的なツールである。カセットに全血を採
取し、凝血に達する時間を測定する。このシステムを用いた場合、活性型プロテ
インＣのQ11G12E33D34突然変異体は、野生型ヒト活性型プロテインＣの５〜10倍
活性であった。この活性は、多くの他のアッセイにおける突然変異体の利点を反
映するものである。
【０１６５】実施例１０ - 改変型ポリペプチドのカルボキシル化状態 : マイルドなキモトリ
プシン消化(1:500、プロテアーゼ:基質タンパク質、pH 7.5、37℃、3時間)によ
り無傷のタンパク質からGLAドメインを放出させた後、ビタミンＫ依存性ポリペ
プチドのGLAドメインのカルボキシル化をMALDI-TOF質量分析により評価した。キ
モトリプシンは、ビタミンＫ依存性タンパク質の残基40〜45付近を優先的に開裂
させて、GLAドメインを放出する。このドメインは単離して調べることができる
。C18逆相ゲル上に吸着させることによりペプチドを脱塩し、そして0.1%トリフ
ルオロ酢酸中の75%アセトニトリルを用いて溶出させた。この分析の結果、野生
型の組換え第VIIa因子(NOVO Nordisk)が予想したよりも１個少ないGla残基を有
することが分かった。キモトリプシン消化から生じた主要な産物は、1〜40ペプ
チドであり、完全にカルボキシル化された1〜40ペプチドに対する理論値(理論値
=5190.4質量単位)よりもカルボキシル基が約１個(44質量単位)少ない5145.6質量
単位のM+1イオンを与えた。血漿由来の第VIIa因子をEnzyme Research Laborator
iesから購入した。1〜40ペプチドに対するM+1イオンは5189.8質量単位であり、
これは完全にカルボキシル化されたGlaドメインに等しかった。残基1〜32に相当
するNOVO組換えVIIa産物に対する第２イオンが観測された。このペプチドに対す
るM+1イオンは、4184.6質量単位であり、これは完全にカルボキシル化された1〜
32ペプチドに対する理論値(理論値=4185.3質量単位)に等しかった。従って、組
換え野生型第VIIa因子は、厳格に低カルボキシル化が起こり、このほとんどすべ
てが位置36で発現される。この結果とは対照的に、第VII因子のQ11E33突然変異
体は、ほぼ等しい存在量で5312.8および5269.0のM+1イオンを与えた。この完全
にカルボキシル化されたペプチドに対するM+1は5311.4である。第２ピークは、
カルボキシル基が１個少ない(-44質量単位)ペプチドに対応する。この結果から
分かるように、Q11E33突然変異を導入することにより、組織培養生産の後、完全
にカルボキシル化されたGlaドメインが生成された。Q11E33突然変異体の利点は
、位置36のより完全なカルボキシル化によって生じるものと思われる。全体とし
て、最適Glaドメインを有するタンパク質を産生するには、組織培養において完
全カルボキシル化を促進する残基の選択が必要である。これに関して、位置33〜
36の残基を適切に選択することが重要であると思われる。
【０１６６】他の実施態様 本発明はその詳細な説明と関連づけて記載されているが、以上の記載は説明す
ることを意図したものであり、添付した請求の範囲により規定される本発明の範
囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の請求の範囲
内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 野生型VIIa(白丸)、VIIQ11E33(黒丸)およびウシ第Ｘ因子(黒三角)の膜への結
合を、標準偏差と共に、示す。
【図２】 VIIQ11E33の自己活性化を示す。破線はリン脂質の非存在下での活性を示す。
【図３】 第VIIa因子による第Ｘ因子の活性化を示す。濃度0.06nMの場合の野生型第VIIa
因子(白丸)およびVIIaQ11E33(黒丸)の結果を示す。
【図４】 可溶性の組織因子を含むVIIaおよびVIIaQ11E33によるヒト血漿の凝固を示す。
【図５】 第VII因子チモーゲンおよび通常の組織因子による血漿の凝固を示す。
【図６】 活性部位改変型第VIIaQ11E33因子(DEGR-VIIaQ11E33)による血塊形成の阻止を
示す。
【図７】 ラットにおける第VIIQ11E33因子の循環時間を示す。
【図８】 通常のタンパク質および改変型のタンパク質による膜相互作用を示す。パネル
Ａは野生型ウシプロテインC(白丸)およびウシプロテインC-H11(黒丸)と小胞との
相互作用を示す。パネルＢは野生型ヒトプロテインC(白丸)およびヒトプロテイ
ンC-P11(黒丸)と膜との相互作用を示す。両ケースにおいて、破線は、添加した
タンパク質の全部が膜に結合したときの結果を示す。
【図９】 凝固時間に及ぼす活性型プロテインCの影響を示す。パネルＡには、ウシ血漿
の凝固時間の３回の測定値の平均および標準偏差を、野生型ウシAPC(白丸)およ
びbAPC-H11(黒丸)について示してある。パネルＢには、ヒト血漿の凝固時間の３
回の測定値の平均および標準偏差を、野生型ヒト(白丸)およびヒトAPC-P11(黒丸
)について示してある。
【図１０】 ウシおよびヒトAPCによる第Va因子の不活性化を示す。パネルＡは、野生型ウ
シAPC(白丸)およびウシAPC-H11(黒丸)による第Va因子の不活性化を示す。パネル
Ｂは、野生型ヒトAPC(白丸)およびヒトAPC-H11(黒丸)によるプロテインＳ欠損血
漿中のヒト第Va因子の不活性化を示す。
【図１１】 プロテインＺの静電的分布を示す。垂直線は電気陽性領域を表し、水平線は電
気陰性領域を表す。
【図１２】 種々のプロテインCの膜結合および活性を示す。パネルＡは、野生型プロテイ
ンC(白丸)、P11H変異型のプロテインC(黒四角)、Q33E,N34D変異型(黒丸)および
ウシプロトロンビン(白四角)による膜結合を示す。パネルＢは、これらの変異型
による血液凝固の阻止を示す。パネルＣは、第Va因子の不活性化を示す。
【図１３】 ヒトプロテインC変異型の膜結合および活性を比較したものである。パネルＡ
は、野生型(白丸)、E33(白三角)およびE33D34(黒丸)の膜結合を比較したもので
ある。パネルＢは、野生型(白三角)、E33(白丸)およびE33D34(黒丸)を用いて凝
固時間を比較したものである。
【図１４】 ウシプロテインCの野生型(白四角)、H11(黒丸)、E33D34(白三角)および三重H1
1E33D34変異型(白丸)を用いて膜結合(パネルＡ)ならびに凝固阻止(パネルＢ)を
比較したものである。
【図１５】 種々のビタミンＫ依存性タンパク質の膜相互作用特性を示す。パネルＡは、ヒ
ト(黒丸)およびウシ(白丸)の第Ｘ因子の膜相互作用を比較したものである。パネ
ルＢは、正常なウシプロトロンビン断片１(白丸)、カルシウムの非存在下でTNBS
により改変した断片１(黒丸)および25mMのカルシウムの存在下でTNBSにより改変
した断片１(黒四角)による膜相互作用を示す。パネルＣは、pH９(黒丸)およびpH
7.5(白丸)におけるプロテインＺの小胞への結合率を示す。
【図１６】 図16A〜16Cは、普通の血液(A)、30nMの野生型APCを含む血液、および６nMのQ1
1G12E33D34 APCを含む血液(C)についての、コラーゲン誘導性血栓形成(CITF)の
血塊所見分析器のレポートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/465 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 GA13 HA01 HA04 HA15 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 CE13 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 CA53 CA59 DC10 DC14 DC16 MA13 MA17 MA23 MA24 MA28 MA35 MA37 MA43 MA52 MA59 MA66 MA67 NA14 ZA532 ZA542 ZC412 4H045 AA10 BA10 CA40 DA55 DA65 EA23 EA24 EA50 FA50 FA74 GA26

Claims (75)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、
    該ポリペプチドの膜結合親和力と活性を増強する改変型のGLAドメインを含んで
    なるビタミンＫ依存性ポリペプチドであって、該改変型のGLAドメインが少なく
    とも１個のアミノ酸置換を有し、該ポリペプチドが血塊形成を阻害する、上記ポ
    リペプチド。
  2. 【請求項２】 前記アミノ酸置換がアミノ酸５、９、11、12、29、33、34、
    35または36にある、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 前記アミノ酸置換がアミノ酸５、９、35または36にある、請
    求項１記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 前記アミノ酸置換がアミノ酸11または12にある、請求項１記
    載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 前記アミノ酸置換がアミノ酸29または33にある、請求項１記
    載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 前記アミノ酸置換がアミノ酸34、35または36にある、請求項
    １記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチドがプロテインCまたは活性型プロテインCを
    含む、請求項１記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記アミノ酸置換がアミノ酸12にグリシン残基を含む、請求
    項７記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 前記アミノ酸置換がアミノ酸33にグルタミン酸残基を含む、
    請求項７記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸33にグルタミン酸残基
    を含む、請求項８記載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸35にアスパラギン酸ま
    たはグルタミン酸残基を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸36にグルタミン酸残基
    を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸11にグルタミンまたは
    グルタミン酸残基を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸29にフェニルアラニン
    残基を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸34にアスパラギン酸、
    グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシン残基を含む、請
    求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドが活性部位改変型第VIIa因子を含む、請
    求項１に記載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドがアミノ酸33にグルタミン酸残基を含む
    、請求項１６に記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 前記アミノ酸置換がアミノ酸11にグルタミン残基を、アミ
    ノ酸33にグルタミン酸残基を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸34にフェニルアラニン
    、ロイシンまたはイソロイシン残基を含む、請求項１７または１８に記載のポリ
    ペプチド。
  20. 【請求項２０】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸35にアスパラギン酸ま
    たはグルタミン酸残基を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペ
    プチド。
  21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドがプロテインＳである、請求項１に記載
    のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 前記アミノ酸置換がアミノ酸９にイソロイシン、ロイシン
    、バリンまたはフェニルアラニン残基を含む、請求項２１に記載のポリペプチド
    。
  23. 【請求項２３】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸34にフェニルアラニン
    、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基を、アミノ
    酸35にアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含む、請求項２２に記載のポリ
    ペプチド。
  24. 【請求項２４】 前記アミノ酸置換がアミノ酸５にフェニルアラニン残基を
    含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 前記ポリペプチドがさらにトロンビン感受性ループ中に置
    換を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 前記トロンビン感受性ループ中の置換がアミノ酸49、60ま
    たは70のいずれかにおける置換である、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドが活性部位改変型第IXa因子である、請
    求項１に記載のポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 前記アミノ酸置換がアミノ酸29にフェニルアラニン残基を
    含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 前記アミノ酸置換がアミノ酸５にフェニルアラニン残基を
    含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 前記アミノ酸置換がアミノ酸34にフェニルアラニン、ロイ
    シンまたはイソロイシン残基を、アミノ酸35にアスパラギン酸またはグルタミン
    酸残基を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 前記ビタミンＫ依存性ポリペプチドがさらに、不活性化さ
    れた切断部位を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 前記ポリペプチドが第VII因子を含む、請求項３１に記載
    のポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 前記不活性化切断部位がアミノ酸152にアラニン残基の置
    換を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 前記ポリペプチドが活性部位改変型第Xa因子である、請求
    項１に記載のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 前記アミノ酸置換がアミノ酸11にグルタミン残基を含む、
    請求項３３に記載のポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 前記アミノ酸置換がアミノ酸34にフェニルアラニン、ロイ
    シンまたはイソロイシン残基を、アミノ酸35にアスパラギン酸またはグルタミン
    酸残基を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 前記ポリペプチドがプロテインＺである、請求項１に記載
    のポリペプチド。
  38. 【請求項３８】 前記アミノ酸置換がアミノ酸34にフェニルアラニン、ロイ
    シンもしくはイソロイシン残基を、またはアミノ酸35にアスパラギン酸もしくは
    グルタミン酸残基を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて
    、該ポリペプチドの膜結合親和力と活性を増強する改変型のGLAドメインを含ん
    でなるビタミンＫ依存性ポリペプチドであって、該改変型のGLAドメインがアミ
    ノ酸４において少なくとも１個のアミノ酸挿入を有する、上記ポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 前記ポリペプチドが、第VII因子または第VIIa因子、プロ
    テインCまたは活性化プロテインC、第X因子または第Xa因子、およびプロテインS
    からなる群より選択される、請求項３９に記載のポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 前記ポリペプチドが、第VII因子、第VIIa因子、プロテイ
    ンCまたは活性化プロテインCである、請求項３９に記載のポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 前記アミノ酸挿入がチロシン残基を含む、請求項４１に記
    載のポリペプチド。
  43. 【請求項４３】 製薬上許容される担体および有効な量のビタミンＫ依存性
    ポリペプチドを含有する医薬組成物であって、該ビタミンＫ依存性ポリペプチド
    が、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの
    膜結合親和力と活性を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のG
    LAドメインが少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、該ビタミンＫ依存性ポリペ
    プチドが血塊形成を阻害する、上記医薬組成物。
  44. 【請求項４４】 前記ポリペプチドがプロテインCまたは活性化プロテインC
    である、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 【請求項４５】 前記アミノ酸置換がアミノ酸12にグリシン残基を含む、請
    求項４４に記載の医薬組成物。
  46. 【請求項４６】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸33にグルタミン酸残基
    を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 【請求項４７】 前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸34にフェニルアラニン
    、ロイシン、またはイソロイシン残基を含み、アミノ酸35または36にアスパラギ
    ン酸またはグルタミン酸残基を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  48. 【請求項４８】 前記ポリペプチドが活性部位改変型第VIIa因子である、請
    求項４３に記載の医薬組成物。
  49. 【請求項４９】 前記アミノ酸置換がアミノ酸11にグルタミン残基を含み、
    アミノ酸33にグルタミン酸残基を含み、アミノ酸34にフェニルアラニン、ロイシ
    ン、またはイソロイシン残基を含み、アミノ酸35にアスパラギン酸またはグルタ
    ミン酸残基を含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 【請求項５０】 前記ポリペプチドがプロテインSまたは活性部位改変型第I
    Xa因子である、請求項４３に記載の医薬組成物。
  51. 【請求項５１】 前記組成物がさらに抗凝固物質を含む、請求項４３に記載
    の医薬組成物。
  52. 【請求項５２】 ビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する哺乳動物宿主細
    胞であって、該ビタミンＫ依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタミンＫ依
    存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力と活性を増強する改
    変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインが少なくとも１個のア
    ミノ酸置換を有し、該ポリペプチドが血塊形成を阻害する、上記宿主細胞。
  53. 【請求項５３】 哺乳動物において血塊の形成を低減させるのに有効な量の
    ビタミンＫ依存性ポリペプチドを投与することを含む哺乳動物における血塊形成
    の低減方法であって、該ビタミンＫ依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタ
    ミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力と活性を増
    強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインが少なくとも
    １個のアミノ酸置換を有するものである、上記方法。
  54. 【請求項５４】 前記ポリペプチドがプロテインCもしくは活性化プロテイ
    ンC、活性部位改変型第VIIa因子、活性部位改変型第IXa因子またはプロテインS
    である、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 膜結合親和力と活性が増大されたビタミンＫ依存性ポリペ
    プチドの同定方法であって、下記の工程： (a) 該ビタミンＫ依存性ポリペプチドのGLAドメインを、該GLAドメイン中の少
    なくとも１個のアミノ酸置換を含めて改変する工程、 (b) 該改変型GLAドメインを有する該ビタミンＫ依存性ポリペプチドの膜結合
    親和力および活性をモニターする工程、および、 (c) 該改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの膜結合親和力および活性が対応
    する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて増大した場合には、該改変型
    ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性が増大したとして同定する工程、 を含んでなる方法。
  56. 【請求項５６】 前記アミノ酸置換が、アミノ酸５、９、11、12、29、33、
    34、35または36における置換である、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが血塊形成を増
    加する、請求項５５に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが血塊形成を阻
    害する、請求項５５に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 対応する天然型第VII因子または第IX因子ポリペプチドと
    比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力と活性を増大する改変型のGLAドメイン
    を含んでなる第VII因子または第IX因子ポリペプチドであって、該改変型のGLAド
    メインが残基11、29、34または35において少なくとも１個のアミノ酸置換を含む
    ポリペプチド。
  60. 【請求項６０】 前記ポリペプチドが第VII因子または第VIIa因子を含む、
    請求項５９に記載のポリペプチド。
  61. 【請求項６１】 アミノ酸11でグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸
    またはアスパラギン残基が置換された、請求項６０に記載のポリペプチド。
  62. 【請求項６２】 アミノ酸11でグルタミン残基が置換された、請求項６０に
    記載のポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 アミノ酸29でグルタミン酸またはフェニルアラニン残基が
    置換された、請求項５９または６０に記載のポリペプチド。
  64. 【請求項６４】 前記改変型ドメインがさらにアミノ酸33にアミノ酸置換を
    含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
  65. 【請求項６５】 アミノ酸33でグルタミン酸残基が置換された、請求項６４
    に記載のポリペプチド。
  66. 【請求項６６】 前記改変型のGLAドメインがさらにアミノ酸33にグルタミ
    ン酸残基の置換を含む、請求項６１または６３に記載のポリペプチド。
  67. 【請求項６７】 前記改変型GLAドメインがさらにアミノ酸34または35に少
    なくとも１個の疎水性残基を含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
  68. 【請求項６８】 前記改変型GLAドメインがさらにアミノ酸34にフェニルア
    ラニン、ロイシンまたはイソロイシン残基を含み、アミノ酸35にアスパラギン酸
    またはグルタミン酸残基を含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
  69. 【請求項６９】 前記ポリペプチドが第IX因子または第IXa因子を含む、請
    求項５９に記載のポリペプチド。
  70. 【請求項７０】 製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成
    を増加させるのに有効な量の第VII因子または第IX因子ポリペプチドを含有する
    医薬組成物であって、該第VII因子または第IX因子ポリペプチドが、対応する天
    然型第VII因子または第IX因子ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合
    親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインが
    少なくとも１個のアミノ酸置換を残基11、20、34または35に有するものである、
    上記医薬組成物。
  71. 【請求項７１】 前記ポリペプチドがさらにアミノ酸33にアミノ酸置換を含
    む、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 【請求項７２】 前記医薬組成物がさらに可溶性組織因子を含む、請求項７
    ０に記載の医薬組成物。
  73. 【請求項７３】 哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有効な量の
    第VII因子または第IX因子ポリペプチドを投与することを含む哺乳動物における
    血塊形成の増加方法であって、該第VII因子または第IX因子ポリペプチドが、対
    応する天然型第VII因子または第IX因子ポリペプチドと比べて、該ポリペプチド
    の膜結合親和力と活性を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型
    のGLAドメインが少なくとも１個のアミノ酸置換を残基11、20、34または35に有
    するものである、上記方法。
  74. 【請求項７４】 患者に請求項７３に記載の医薬組成物を投与することを含
    む、患者の出血性障害の治療方法。
  75. 【請求項７５】 請求項１または５９に記載のポリペプチドをコードする核
    酸配列を有する、単離された核酸分子。
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