JP2011135881A - 改変型ビタミンk依存性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】膜結合親和力が増強されたビタミンK依存性ポリペプチド。ビタミンK依存性ポリペプチドのγ−カルボキシグルタミン酸(GLA)ドメイン内の改変は該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する。改変されたビタミンK依存性ポリペプチドは増強された活性を有し、抗凝血剤、前凝血剤(pro-coagulant)としてまたはビタミンK依存性タンパク質を利用するその他の機能のために使用することができる。例えば、改良された第VII因子分子は必要とされるVIIaの投与量、相対的投与回数を低減させることにより、かつ/または欠損状態のより有効な治療を可能にする質的変化をもたらす。これらのポリペプチドは哺乳動物における血塊形成の調節に使用することができる。
【選択図】なし
Description
一つの態様において本発明は、対応する天然型のビタミンK依存性ポリペプチドと比較して膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含むビタミンK依存性ポリペプチドを特徴とする。ビタミンK依存性ポリペプチドの活性もまた増大され得る。ビタミンK依存性ポリペプチドは、それらの生合成過程において、ビタミンKを利用してタンパク質前躯体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化するタンパク質群である。GLAドメインはポリペプチドのN末端領域において、典型的にはアミノ酸1からアミノ酸45付近に9〜13のγ−カルボキシグルタミン酸残基を含む。ビタミンK依存性ポリペプチドの例としては、プロテインZ、プロテインS、第X因子、第II因子(プロトロンビン)、第IX因子、プロテインC、第VII因子およびGas6がある。本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸位置は、第IX因子に従って番号を付けた。プロテインS、プロテインC、第X因子、第VII因子およびヒトプロトロンビンのいずれもアミノ酸が1つ少ない(第4位)ので、それらの番号付けを調整しなければならない。例として、ウシプロテインCの事実上の第10位はプロリンであるが、容易に比較するために本明細書においては全体にわたってアミノ酸11と番号を付ける。本明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる語は、アミノ酸長または翻訳後修飾に拘わらず、任意のアミノ酸鎖のことである。本明細書においてアミノ酸は標準の3文字または1文字略号により表記している。
本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、標準的な方法で調製することができる。本明細書中で使用する場合、「単離された」とは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドをコードする遺伝子の一部分もしくは全部に相当する配列を指すが、この配列は、哺乳動物ゲノム中の野生型遺伝子の片側もしくは両側に通常フランキングしている配列が含まれていないものである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、組換えDNA分子であってもよいが、ただし、天然に存在するゲノム中で組換えDNA分子のすぐ隣にフランキングして通常見いだされる核酸配列の一方は除去されるかもしくは存在しないことが前提となる。従って、単離されたポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、他の配列から独立して個別の分子として存在するDNA(例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されたcDNA断片もしくはゲノムDNA断片)、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス)、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAが挙げられる。このほかに、単離されたポリヌクレオチドとして、ハイブリッドポリヌクレオチドもしくは融合ポリヌクレオチドの一部分である組換えDNA分子を挙げることができる。
本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現ベクターのような核酸構築物中にライゲートして、この発現ベクターで細菌宿主細胞もしくは真核宿主細胞を形質転換することにより産生することができる。一般的には、核酸構築物は、ビタミンK依存性ポリペプチドをコードする核酸配列に機能しうる形で連結された調節配列を含んでいる。調節配列は、典型的には遺伝子産物をコードしていないが、その代わりに核酸配列の発現に影響を及ぼす。本明細書中で使用する場合、「機能しうる形で連結された」とは、核酸配列の発現を可能にするように調節配列が核酸配列に結合されていることを意味する。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、もしくは誘導性エレメントを挙げることができる。
本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊形成を阻止するのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を特徴とする。このビタミンK依存性ポリペプチドは、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの膜結合親和力を増強する少なくとも1個のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入を有する改変型GLAドメインを含むものである。いくつかの実施形態では、ビタミンK依存性ポリペプチドの活性も増強される。医薬組成物に含まれる有用な改変型ビタミンK依存性ポリペプチドとしては、限定されるものではないが、先に記載したように、プロテインCもしくはAPC、活性部位改変型APC、活性部位改変型第VIIa因子、活性部位改変型第IXa因子、活性部位改変型第Xa因子、またはプロテインSを挙げることができる。医薬組成物はまた、アスピリン、ワルファリン、またはヘパリンのような抗凝血剤を含有してもよい。
実施例1 膜親和力と活性の増強された第VII因子
ヒト血液凝固第VII因子の膜結合親和力は、部位直接的な突然変異誘発によって増強され得ることが見出された。P11Q,K33E変異体〔本明細書中では、第VIIQ11E33因子または、変異型第VII因子という(配列番号30)〕の性質が特徴づけられた。膜親和力は、野生型タンパク質に対して約20倍増強された。変異体による自己活性化は、野生型第VII因子に比べて、少なくとも100倍増強された。活性型のVIIQ11E33( VIIaQ11E33とする )は、第X因子に対して約10倍高い活性を示した。正常血漿中の可溶性組織因子存在下でのVIIaQ11E33の凝血活性は、野生型VIIaの活性より約10倍高かった。正常な組織因子(トロンボプラスチン‐HSの1:100希釈物として供給)存在下における、チモーゲン、VIIQ11E33の凝血活性は、野生型第VII因子に比べて20倍高かった。活性が増強される程度は諸条件に左右され、凝血刺激が低い条件下でVIIQ11E33は特に活性であった。
変異型第VII因子を、野生型第VII因子cDNA(GenBank受け入れ番号M13232, NID g182799)から作製した(Petersenら、1990,Biochemistry 29 : 3451-3457)。 P11Q変異(アミノ酸11のプロリン残基のグルタミン残基への変換)とK33E変異(アミノ酸33のリシン残基のグルタミン酸残基への変換)を、PCR法で、野生型第VII因子cDNAに誘導した。(Valletteら、1989, Nucreic Acid Res. 17:723-733)。この工程において、変異診断用XmaIII制限酵素部位が排除された。4つのPCRプライマーを、M13232の2つの変異フラグメント(一方は位置221〜301のMluIからBglIIまで、他方は位置302〜787のBglIIをからSstIIまで)の合成を開始するために設計した。これらのプライマーを用いて、標準のPCRサイクル条件(GENEAMP, Perkin Elmer)において、フラグメントの合成を開始した。その際鋳型として1 ngの野生型第VII因子cDNAを用いた。得られたフラグメントをゲル精製し、MluIとBglII、またはBglIIとSstIIで消化した。そして、2つの精製したフラグメントを発現ベクター Zem219b(対応する野生型配列を、MluI-SstIIフラグメンとして取り除いてある)中の第VIII因子cDNAに結合した(Petersenら、1990, 前掲)。変異したフラグメントの全体の配列決定を行って、P11QとK33Eの置換を確認し、PCRに誘導されるその他の配列変化の可能性を排除した。
ベビーハムスター腎(BHK)細胞を、10%のウシ胎児血清とペニシリンストレプトマイシンを補ったダルベッコ改良イーグル培地に増殖させた。サブコンフルエントな細胞を、製造業者の薦めにより、リポフェクトアミン(lipofectAMINE; Gibco BRL )を用いて第VII因子発現プラスミドでトランスフェクトした。2日間、あらかじめトランスフェクトした後、細胞をトリプシンで処理し、1μMのメトトレキセート(MTX)を含む選択培地に希釈した。安定にトランスフェクトされたBHK細胞を、続いて、ペニシリンストレプトマイシン、5μg/mLのビタミンK1、そして1μMのMTXを補った血清を含まないダルベッコ改良イーグル培地で培養し、ならし培地を回収した。ならし培地は、Affi-Gel 10に結合したカルシウム依存性モノクロナール抗体(CaFVII22)を含む免疫アフィニティーカラムに2度アプライした(Nagasakiら、1991, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。 最終的に精製された第VIIQ11E33因子は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において、単一のバンドとして泳動し、調製物中には、第VIIa因子の形跡はなかった。純粋なVII(P11Q,K33E)変異体は1400〜2800 第VII因子units/mgを示した。
活性型第VIIaQ11E33因子は、VIIQ11E33を第Xa因子で開裂することによって生成した( 重量比1:100、37℃で1時間インキュベーション)。または、第VIIaQ11E33因子は、7μMのVIIQ11E33と0.7μMのsTFとリン脂質〔ホスファチジルセリン/ホスファチジルコリン(PS/PC), 25/75, タンパク質1gあたり0.1 g〕の混合物中で、自己活性化により得られた(37℃,20 分)。
リン脂質の調製、タンパク質−膜結合のアッセイと測定はNelsestuenとLimによって開示された方法で実施した(1977, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。大きな単ラメラ小胞(LUV)と小さな単ラメラ小胞(SUV)は、以前に開示された方法で調製した(Hope, M.J.ら、Bilchem. Biophys. Acta., 812 : 55-65 ; Huang, C., 1969, Biochemistry, 8 : 344-352)。 高純度のホスファチジルセリン(ウシ脳)と卵ホスファチジルコリン(Sigma Chemical Co.)をクロロホルム中で混合した。溶媒は、窒素ガス流で取り除いた。乾燥させたリン脂質をバッファー中で懸濁させた。SUVは、超音波処理とゲル濾過によって作製し、一方、LUVは凍結−融解と押出しによって作製した。リン脂質の濃度は、リン:リン脂質重量比を25と仮定して、有機リン酸アッセイにより決定した。
I2 / I1 = (M2/M1)2 (δn/δc2/δn/δc1)2 (式 1)
リン脂質とタンパク質の濃度がわかっていれば、結合したタンパク質 [P*PL] と遊離のタンパク質 [P] の濃度を見積もることができる。これらの値を、小胞のタンパク質結合能の最大値 [P*PLmax](すべてのタンパク質に関して1.0 g/gであると仮定する)とともに用いることにより、式 2の関係から、タンパク質と膜の相互作用の平衡定数が得られる。式 2において、全ての濃度は、モルタンパク質またはタンパク質結合部位として表されている。
KD = [P] [P*PLmax-P*PL] / [P*PL] (式 2)
結合を、5 mMのカルシウムで評価し、M2/M1の比で表した。
Kd = [Proteinfree] [Binding sitesfree] / [Proteinbound] (式 3)
[Binding sitesfree]は、 M2/M1の最大値を1.0と仮定し、式4の関係から見積もった(すなわち、[Binding sitestotal] = [Phospholipidweight conc./ProteinMW])。これは、このファミリーに属する種々のタンパク質にみられる共通の値である(McDonaldら、1997, 前掲)。
[Binding sitesfree] = [Binding sitestotal] - [Proteinbound] (式 4)
これらの仮定およびタンパク質:リン脂質比0.37であるときのデータを用いると、解離定数(Kd)の値はウシ第X因子については0.7μM、野生型第VII因子については5.5μM、VIIQ11E33については0.23μMであった。これより、第VIIQ11E33因子の膜結合力は野生型第VII因子に比べ大幅に増強されたことが明らかとなり、ビタミンK依存性タンパク質の中で最も高い膜結合力を持つもののひとつであるといえる。
凝血の最初のステップは、第VII因子の活性化を必要とする。VIIの自己活性化を、100 nMのsTF〔 Walter Kisiel博士から入手した高純度の組換え産物(Fiore ら、1994, J.Biol.Chem., 269: 143-149)〕、36 nMのVIIQ11E33および PS/PC (25/75, 22μg/mL)を含む溶液中で行った。0.15 mmの基質 S-2288(Kabi社)を加えて、p-ニトロフェニルホスフェート生成物の放出速度を405 nMにおける吸光度変化によって評価することにより、VIIaQ11E33の活性を様々な時間的間隔において評価した。VIIQ11E33調製物におけるの初期の活性は、十分に活性のあるVIIaQ11E33の活性の4%にも満たなかった。
ln[VIIa]t = ln[VIIa]0 + kcat*y*t (式 5)
ln[VIIa]tは時間tにおける第VIIa因子の濃度、kcatは第VIIa因子がVIIに作用するときの触媒速度定数、そしてyはVIIa部位の飽和率である。野生型第VIIa因子について、この関係および1 μMのsTFから、0.0045/sのkcatおよび7*103M-1s-1のkcat/Km 比が得られた(Fioreら、1994, 前掲)。 VIIQ11E33酵素については、自己活性化が速く(図2)、kcatの下限を見積もることしかできなかった。これは、第VIIa因子の約25秒の倍化時間から得られた〔kcat = (ln2)/t1/2〕。得られた値(kcatmin=0.03/s)と、この反応における基質濃度(3.6*10-8 M)およびy=1.0とする仮定から、kcat / [S] = 8 * 105 M-1 s-1の値が得られた。この値は、実際のVIIaQ11E33のkcat/Kmの値よりもかなり低いものであるといえる。しかし、Fioreら(1994、前掲)によって見積もれらた野生型VIIa/sTF因子のkcat/Kmの値よりは、約100倍大きいものであった。従って、凝血の活性化ステップにおいては、VIIaQ11E33酵素と基質第VIIQ11E33因子の組合せは、野生型タンパク質よりも優れていた。これは、最低限の凝血条件において、VIIQ11E33が野生型タンパク質よりも優れていることを示唆していた。
ひとたび生成されると、第VIIa因子は、第X因子か第IX因子のいずれかを活性化する。ウシ第X因子(0.1μM)の第VIIa因子による活性化を、pH 7.5の50 mM Tris HClバッファー〔100 mMのNaCl、5 mMのカルシウム、様々な量のリン脂質 (PS/PC, 25/75)、1 mg/mLのウシ血清アルブミンを含む〕中22.5℃で行った。第VIIa因子( 0.06 nMのVIIaQ11E33または0.6 nMの野生型VIIa )をゼロ時間に加え、1分、3分および5分時点におけるXaの活性を測定した。反応混合物のうちの一定量(0.2mL)を10 mMのEDTAおよび第Xa因子に対する色原体基質である0.4 mMのS-2222(Kabi社)を含むバッファー(0.2 mL)と混合した。とした。405 nmにおける吸光度の変化をBeckman DU8 分光光度計で測定した。生成した第Xa因子の量は、p-ニトロフェニルホスフェートの反応生成物の吸光係数(1 * 104 M-1 cm-1)およびこのアッセイ条件下での精製ウシXaによる基質加水分解の速度(33/sec)より算出した。
図3は、野生型第VIIa因子(白丸)とVIIaQ11E33(黒丸)が精製系において第X因子を活性化する能力を比較したものである。この反応においても、再び、VIIaQ11E33の方が野生型第VIIa因子よりもずっと優れていた。この差は、リン脂質の濃度が低いときに最大になり、リン脂質が1 mlあたり200 μgのときは2倍にまで低減した。高い膜濃度では高い割合で野生型VIIaの膜への結合が引き起こされるという事実からも、このような結果は予想された。さらにまた、VIIaQ11E33の増強された機能は、リン脂質が少ない条件下で最も顕著であった。
凝血アッセイを、血塊の形成を検出するため、ハンドチルト法(hand tilt method)を用いて37℃において行った。ヒト血漿(0.1 mL)は、37℃で1分間、平衡化させた。様々な試薬を0.1 mL容の標準バッファー中に加えた。可溶性組織因子(50 nM)とリン脂質(PS/PC, 10/90, 75 μg/mL)を第VIIa因子と共に血漿に加えた。なお、第VIIa因子の濃度は、図4に示すとおりである(0.1〜32 nM)。最後に0.1 mLの25 mM CaCl2を加え反応を開始させた。血塊が形成される時間を測定した。ほとんどの場合複数回数測定した試料の平均値と標準偏差を記録した。
正常な組織因子によって促進される凝血はカルシウムを含む標準ウサギ脳トロンボプラスチン-HS(HSは高感度を意味する)(Sigma Chemical Co.)でアッセイした。この混合物は、リン脂質と膜結合型組織因子の両方を含む。ウサギ脳トロンボプラスチン-HSをバッファーで1:100に希釈し、VII(10 nMの第VII因子を含む正常ヒト血漿の形で添加)およびVIIQ11E33(純粋なタンパク質として添加)のアッセイに用いた。トロンボプラスチン(0.2 mL)を血漿(0.1 mL)に加えて反応を開始させ、血塊を形成するのに要する時間を測定した。また、製造元が示したように十分な濃度のトロンボプラスチンを用いてアッセイを行った。
標準的な凝血アッセイは正常なヒト血清とバッファーに1:10で希釈したヒトトロンボプラスチンを用いて行った。第VIIaQ11E33因子の活性部位をSorenson, B.B.ら、(1997,前掲)が記載するように、DEGRで改変した。前掲)。図6はカルシウムバッファー中、血漿を加える前に15秒間トロンボプラスチンと共にでインキュベートしたDEGR-VIIaQ11E33(0〜4 nm)の凝血時間を示す。血塊を形成する時間は、ハンドチルト法(hand tilt method)で評価した。凝血時間は、約1 nMのDEGR-VIIaQ11E33でおよそ45秒だった。活性部位改変型第VIIa因子Q11E33は抗血液凝固活性が増大していた。
0時間において、ナトリウムネンブタールで麻酔したSprague Dawleyラット(325〜350g)2匹に、36μgの第VIIQ11E33因子を注射した。注射はカニューレがはめ込まれた頸静脈に行った。図7に示す時間毎に、手術によってカニューレを挿入した頸動脈から血液を採取した。ヒト第VII因子欠損血漿にラット血漿の1:10希釈物を1 μL加え、その凝血時間によって循環中の第VIIQ11E33因子の量を見積もった。ウサギ脳トロンボプラスチン-HS(Sigma Chemical Co.)の1:100希釈物を用いた。凝血は、実施例1に記載の手動チューブチルト法によって評価した。第VIIQ11E33因子を注入する前の血漿中の第VII因子活性の量を測定し、ブランクとみなして差し引いた。循環中の第VIIQ11E33因子の濃度は、log nMで与えられる。3番目の動物に手術を施し、カニューレは挿入しても第VIIQ11E33因子を注入しない模擬実験を実施した。その動物内の第VII因子活性の量は、実験時間(100分)を通して変化しなかった。実験の最後に動物は、過剰のナトリウムネンブタールによって安楽死させた。
ウシおよびヒトのプロテインCは、ヒトタンパク質の膜親和力が約10倍高いにも関わらず、それらのGLAドメイン(アミノ末端44残基)のアミノ酸は高度の相同性を示す。ウシプロテインCは位置11にプロリンを含有するのに対し、ヒトプロテインCは位置11にヒスチジンを含有する。ウシプロテインCのプロリン-11をヒスチジンに置き換えることおよびヒトプロテインCにおけるその逆の変化の影響を試験した。両事例ともに、プロリン-11を含有するタンパク質はより低い膜親和力を示し、ウシプロテインCについては約10倍、そしてヒトプロテインCについては5倍であった。位置11にプロリンを含有する活性型ヒトプロテインC(hAPC)は野生型hAPCより、使用したアッセイによるが、2.4〜3.5倍低い活性を示した。ヒスチジン-11を含有するウシAPCは、野生型bAPCより15倍までの高い活性を提示した。これは、変異により膜接触および活性の両方を改善する能力を実証した。
プロテインCの突然変異誘発
全長ヒトプロテインC cDNAクローンは、ヨハン・ステンフロ博士(Dr. Johan Stenflo, Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmo, Sweden)より提供を受けた。ウシプロテインC cDNAクローンは、ドナルド・フォスター博士(Dr. Donald Foster, ZymoGenetics, Inc., USA)より提供を受けた。GenBank受託番号は、ウシプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2435, NID g163486、そしてヒトプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2059, NID g190322である。
アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系293を、10%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシンおよび10 μg/mlビタミンK1を補給したDMEM培地中で増殖した。トランスフェクションをリポフェクチン法を使って実施した(Felgner, P.L.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417)。DNAの2μgを、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地を用いて0.1mLに希釈した。リポフェクチン(1 mg/ml)の10μLを、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地の100 μLに加えた。DNAとリポフェクチンを混合し、室温で10〜15分間放置した。細胞単層(5cmペトリディッシュ中で25〜50%コンフルエンス)を2 mM L-グルタミン培養液を含むDMEM培地で2回洗浄した。DNA/脂質混合物を、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地で1.8 mLに希釈し、細胞に加え、16時間インキュベートした。細胞に10%子ウシ血清を含有する完全培地の2mLを補給し、さらに48〜72時間放置して回復させ、その後、トリプシン処理し、選択培地(10%血清およびGeneticinの400 μg/mLを含有するDMEM)を容れた10cmディッシュ中に1:5でまいた(Yan, S.C.B.ら, 1990, Bio/Technology 655-661)。Geneticin耐性コロニーが3〜5週間の選択の後に得られた。それぞれのDNAトランスフェクションから24コロニーを拾い、コンフルエンスまで増殖し、そして該培地を、モノクローナル抗体HPC4(ヒトプロテインCに対して)およびモノクローナル抗体BPC5(ウシプロテインCに対して)を使うドット-ブロットアッセイにより、プロテインC発現についてスクリーニングした。大量のタンパク質を産生するクローンを単離し、ビタミンK1の10 μg/mLの存在下でコンフルエンスまで増殖した。
LUVおよびSUVを実施例1に記載した方法により調製した。VII因子について記載したように、入射光に対し90°の光散乱を使ってタンパク質-膜結合を定量した(5mM カルシウムで、PS/PC、(25/75)の25 μg/mL、(0.05 M Trisバッファー-0.1 M NaCl, pH 7.5))。
活性型プロテインCは、トロンビン切断により、野生型および変異タンパク質の両方に同一の条件を使って作製することができる。各種のプロテインC調製物(1 mg/mL)の約150μgを、ウシトロンビン(3 μg)と混合し、37℃で5時間インキュベートした。反応産物を0.025 M Trisバッファー0.05 M NaClに希釈し、SP-Sephadex C-50の1 mLカラムにアプライした。カラムを同じバッファー 1 mLで洗浄し、通過物を活性型プロテインCとしてプールした。カラムにアプライしたタンパク質の約65〜80%が回収された。APC活性を、25℃でS2366(0.1 mM)のタンパク質分解(proteolysis)により決定した。調製物を、もっと大規模で得た標準調製物と比較した。標準ヒトAPCはウォルター・キジェル博士(Dr. Walter Kisiel)から提供を受けた。ウシタンパク質については、標準物はトロンビン活性型APCの大規模調製物であった。ウシAPCの活性は、正常および変異タンパク質の全ての調製物と一致した(±5%)。ウシAPCの2つの調製物を比較に使った。トロンビンから作製したヒトAPCは、標準に対して55〜60%の活性があった。この研究で提示された濃度は、S2366に対する活性に基いており、標準の活性と関連させた。
第Va因子不活性化をニコラスら(Nicolaesら, 1996, Thrombosis and Haemostasis, 76:404-410)の方法によりアッセイした。簡単に説明すると、ウシタンパク質については、ウシ血漿を、0.05 M Tris、0.1 M NaCl、1 mg/mLウシ血清アルブミンおよび5 mMカルシウム、pH 7.5により1000倍に希釈した。第V因子を活性化するために、リン脂質小胞(5 μg/0.24 mLアッセイ)および190 nMトロンビンの5 μLを加えた。37℃で10分間インキュベーションの後、APCを加え、インキュベーションを6分間続けた。ウシプロトロンビン(最終濃度10 μMに)および第Xa因子(最終濃度0.3 nM)を加えて、該反応物を37℃で1分間インキュベートした。この活性化反応物の20μLサンプルを、S2288基質(60μM)を含有するバッファー(0.05 M Tris, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5)の0.38mLに加えた。トロンビンの量を405 nMの吸収の変化により定量した(ε=1.0*104 M-1s-1、トロンビン=100/sに対するkcat)。ヒトタンパク質については、ヒトプロテインS-欠損血漿(Biopool Canada, Inc.)を100倍希釈し、第Va因子をヒトトロンビンにより活性化し、そして産生した第Va因子をウシタンパク質に対して使用した試薬を用いてアッセイした。
様々なヒトおよびウシプロテインC変異体ならびに他のビタミンK依存性ポリペプチドを比較して、膜接触部位原型(membrane contact site archetype)を提案するに至った。静電気原型は、結合カルシウムイオンにより作られたタンパク質表面上の電気陽性コアからなり、タンパク質のアミノ酸からくる電気陰性電荷のかさ(halo)により囲まれている。このタンパク質ファミリーのメンバーがこの静電気パターンに接近しているほど、膜に対する親和力は高い。
本発明はその詳細な説明と関連づけて記載されているが、以上の記載は説明することを意図したものであり、添付した請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の請求の範囲内である。
Claims (16)
- 対応する天然型の第VIIa因子ポリペプチドと比較して、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなる第VIIa因子ポリペプチドであって、
該改変型のGLAドメインが
a)位置11におけるアミノ酸置換、
b)位置29におけるアミノ酸置換、
c)位置33におけるアミノ酸置換、および
d)位置34におけるアミノ酸置換
を含み、かつ
第VIIa因子ポリペプチドのアミノ酸位置は、第IX因子に従って番号付けられる
上記ポリペプチド。 - 前記改変型のGLAドメインが位置4に挿入されたチロシン残基をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記改変型のGLAドメインが位置35に置換された疎水性アミノ酸残基またはグルタミン酸残基をさらに含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記疎水性アミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシン残基である、請求項3に記載のポリペプチド。
- グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギン残基が位置11で置換されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- グルタミン酸残基が位置33で置換されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 疎水性アミノ酸残基が位置34で置換されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 疎水性アミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシン残基である、請求項7に記載のポリペプチド。
- フェニルアラニンまたはグルタミン酸残基が位置29で置換されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む単離された核酸。
- 請求項10に記載の塩基配列を含む発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 薬剤として使用するための請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 凝血障害治療用凝固促進剤の製造のための請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 前記凝血障害が、血友病A、血友病Bまたは肝臓病である、請求項15に記載の使用。
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