JP2006527982A - 第VII因子または第VIIa因子のGlaドメイン変種 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、第VII因子(FVII)または第VIIa因子(FVIIa)ポリペプチドの新規のGlaドメイン変種、ならびに、治療、特に様々な凝固関連障害の治療のための、そのようなポリペプチド変種の使用に関する。
血液凝固は、最終的にフィブリン凝血が起こる様々な血液成分(または因子)の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般的に、「凝固カスケード」と呼ばれてきた事象に関与する血液成分は、プロ酵素またはチモーゲン、すなわち、活性化因子の作用によって活性型に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。これらの凝固因子の1つはFVIIである。
本発明の第一の局面は、配列番号:1に示すアミノ酸配列を有するヒト第VII因子(hFVII)またはヒト第VIIa因子(hFVIIa)に関連する1〜15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、34位に疎水性アミノ酸残基が置換により導入されている、第VII因子(FVII)または第VIIa因子(FVIIa)ポリペプチド変種に関する。
定義
本記載および特許請求の範囲の文脈において、以下の定義を適用する。
親ポリペプチドのGlaドメインに行われた改変は、結果として生じる分子に、リン脂質膜結合親和性の増加、FXをFXaに活性化する能力の増加、および/または凝血活性の増加を提供することが好ましい。本発明の変種はまた、組織因子結合親和性が減少しており、組織因子に結合したときの活性が減少している。
上記のように、本発明は、第一の局面において、hFVIIまたは hFVIIa(配列番号:1)に関連する1〜15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、34位に疎水性アミノ酸残基が置換により導入されているFVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。
上記のように、本発明は、第二の局面において、hFVIIまたは hFVIIa(配列番号:1)に関連する1〜15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列が36位にアミノ酸置換を含む、FVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。
上記のように、本発明は、第三の局面において、hFVIIまたは hFVIIa(配列番号:1)に関連する3〜15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列が、10位、32位におけるアミノ酸置換、ならびに74位、77位、および116位からなる群より選択される部位における少なくとも一つのさらなるアミノ酸置換を含む、FVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。
循環rhFVIIaの半減期は2.3時間であることが、「Summary Basis for Approval for NovoSeven(登録商標)」、FDA参照番号96-0597に報告されている。望ましい治療的または予防的効果を達成し維持するためには、比較的高用量で頻繁に投与する必要がある。その結果、適切な用量調節を得ることが困難となり、頻繁な静脈内投与を必要とすることから患者の生活様式が制限される。
本発明の好ましい態様において、糖部分に対する結合基、例えばグリコシル化部位、特にインビボグリコシル化部位、例えばインビボN-グリコシル化部位が、Glaドメイン外に位置する部位において導入および/または除去されており、好ましくは導入されている。
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換が含まれる。より好ましくは、
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換によって、インビボN-グリコシル化部位が導入される。さらにより好ましくは、T106N、A175T、I205T、V253N、T267N+S269T、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換、特にT106N、I205T、およびV253Nの一つ、二つまたは三つによってインビボN-グリコシル化部位が導入される。
からなる群より選択された置換が含まれる。より好ましくは、置換は
からなる群より選択され、さらにより好ましくはT106N+I205T、T106N+V253NおよびI205T+V253Nからなる群より選択される。
から選択される改変を含む。
本発明のさらなる態様において、FVIIまたはFVIIa変種は、上記の項に記載されている改変に加えて、例えば国際公開公報第02/22776号に記載されているものなどの、本ポリペプチドの内在性活性を増加させることが既知の変異を含んでもよい。
からなる群より選択される。
一般的に、本発明による結合型変種は、変種ポリペプチドの発現のために行われる条件下で適切な宿主細胞を培養する工程、および変種ポリペプチドを回収する工程によって生産してもよく、ここで、
a)変種ポリペプチドは少なくとも1つのN-またはO-グリコシル化部位を含み、かつ宿主細胞はインビボグリコシル化を行うことができる真核宿主細胞であり、および/または
b)変種ポリペプチドは、インビトロで非ポリペプチド部分との結合を受ける。
変種ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、天然または合成ホモポリマーまたはヘテロポリマーのような任意の適したポリマー分子であってもよく、典型的に分子量約500〜20,000 Daのような、分子量の範囲が約300〜100,000 Da、より好ましくは約500〜15,000 Daの範囲、さらにより好ましくは約3〜10 kDaの範囲のような約2〜12 kDaの範囲の分子である。本明細書において特定の分子量に関連して「約」という用語を用いる場合、「約」という用語は、通常、おおよその平均分子量を示し、所定のポリマー調製物において特定の分子量の分布が存在するという事実を反映する。
一つまたは複数のグリコシル化部位を含むFVII分子のインビボグリコシル化を達成するためには、変種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化する真核生物発現宿主に挿入されなければならない。発現宿主細胞は真菌(糸状菌または酵母)、昆虫または動物細胞から、またはトランスジェニック植物細胞から選択され得る。一つの態様において、宿主細胞は、CHO細胞、BHK細胞またはHEK細胞(たとえばHEK293細胞)などの哺乳類細胞、またはSF9細胞などの昆虫細胞、またはサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母細胞、または後に記載される任意の宿主細胞である。
セリンプロテアーゼ阻害剤の結合は、国際公開公報第96/12800号に記載される方法に従って行うことができる。
グリコシル化型であってもよい、本発明のポリペプチド変種は、当技術分野で周知の任意の適した方法によって産生してもよい。そのような方法には、ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列を構築する段階、および適した形質転換またはトランスフェクトした宿主において配列を発現させる段階が含まれる。好ましくは宿主細胞は、哺乳類細胞のようなγカルボキシル化宿主細胞である。しかし、本発明のポリペプチド変種は、あまり効率的ではないが、化学合成もしくは化学合成の組み合わせ、または化学合成と組み換えDNA技術の組み合わせによって産生してもよい。
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチド変種および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物、特に薬学的組成物に関する。
薬学的組成物の好ましい例は、非経口投与のためにデザインされた溶液、特に好ましくは水溶液である。多くの場合において、薬学的溶液製剤は、直ちに使用するために適用な液体型で提供されるが、そのような非経口製剤はまた凍結または凍結乾燥型で提供してもよい。前者の場合、組成物は使用前に融解しなければならない。凍結乾燥調製物は一般的にその液体対応物より安定であることが当業者によって認識されていることから、後者の型は、組成物に含まれる活性化合物の安定性を広く多様な保存条件で増強するために用いられる。そのような凍結乾燥調製物は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩液のような1つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤を加えることによって使用前に溶解する。
活性部位領域
活性部位領域を、触媒三構造(残基H193、D242、S344)における任意の原子から10Å以内に、少なくとも1つの原子を有する任意の残基として定義する。
タンパク質分解は、タンパク質分解が自己タンパク質分解である、米国特許第5,580,560号、実施例5に記載されるアッセイ法を用いて測定することができる。
ポリペプチド変種の分子量は、SDS-PAGE、ゲル濾過、ウェスタンブロット、マトリクス支援レーザー脱離質量分析、または平衡遠心、例えばLaemmli, U.K.、Nature Vol 227(1970)、pp.680〜85によるSDS-PAGEによって決定される。
リン脂質膜結合親和性は、Nelsestuen et al., Biochemistry, 1977; 30; 10819-10824に記載のとおり、または米国特許第6,017,882号の実施例1に記載されているとおりに決定してよい。
本アッセイは、Nelsestuenら、J. Biol. Chem. 2001、276:39285〜39381の39826頁に詳細に記述されている。
FVIIaおよびその変種の凝血活性を一段階アッセイにおいて測定し、凝血時間をトロンボトラックIV凝固計(Medinor)において記録した。第VII因子枯渇ヒト血漿(American Diagnostica)を再構築して、室温で15〜20分平衡化した。次に、血漿50 μlを凝固計のカップに移した。
FVIIaおよびその変種の凝血アッセイを一段階アッセイにおいて測定し、凝血時間をトロンボトラックIV凝固計(Medinor)において記録した。FVIIaまたはその変種100 μlを、10 mMグリシルグリシン、50 mM NaCl、37.5 mM CaCl2、pH 7.35を含む緩衝液において希釈して、反応カップに移した。10%0.13 Mクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として含む血液50 μlを加えて凝血反応を開始した。エクセルまたはPRISMソフトウェアを用いてデータを分析した。
変種が小さいペプチド基質を切断できるか否かは、発色基質S-2288(D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド)を用いて測定することができる。FVIIaをアッセイ緩衝液(50 mM Na-Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.1%BSA、1 U/mlヘパリン)において約10〜90 nMに希釈した。さらに、可溶性TF(sTF)をアッセイ緩衝液において50〜450 nMに希釈する。アッセイ緩衝液120 μlをFVIIa試料20 μlおよびsTF 20 μlと混合する。室温で軽く振とうさせながら5分間インキュベートしてから37℃で10分間インキュベートした後、S-2288基質を1 mMとなるように加えて反応を開始させ、405 nmでの吸光度をいくつかの時点で決定する。
FVII/FVIIa(または変種)濃度をELISAによって決定する。マイクロタイタープレートのウェルを、プロテアーゼドメインに対する抗体の2 μg/mlのPBS溶液を用いてコーティングした(100 μl/ウェル)。R.T(室温)で一晩コーティングした後、ウェルをTHT緩衝液(100 mM NaCl、50 mM Tris-塩酸、pH 7.2、0.05% Tween20)によって4回洗浄した。その後、1%カゼイン(100 mM NaCl、50 mM Tris-塩酸、pH 7.2を用いて2.5%保存液を希釈)200 μlをブロッキングのためにウェルに加える。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを空にして、試料100 μl(任意で希釈緩衝液(THT+0.1%カゼイン)において希釈)を加える。室温で1時間さらにインキュベーションした後、THT緩衝液でウェルを4回洗浄し、EGF様ドメインに対する100 μlのビオチン標識抗体(1 μg/ml)を添加する。さらに室温で1時間インキュベーションした後、THT緩衝液で4回洗浄し、100 μlのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(DAKO A/S、Glostrup、Denmark、10000倍希釈)を添加する。さらに室温で1時間インキュベーションした後、THT緩衝液で4回洗浄し、100 μlのTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、Kem-en-Tech A/S、Denmark)を添加する。暗室で室温で30分間インキュベーションした後、100 μlの1 M H2SO4を添加し、OD450nmを測定する。rhFVIIa(NovoSeven(登録商標))を用いて標準曲線を作製する。
ヒト血漿中のhFVIIa、rhFVIIa、またはFVIIa変種のトロンビン生成に対する効果は、Hemkerら(2000) Thromb Haemost 83:589-91の589ページに記載されているアッセイ法の改変版で試験される。簡単に説明すると、アッセイする分子(hFVIIa、rhFVIIa、または変種のいずれか)を、再脂質化組換え組織因子(例えばDade Behringのイノビン(Innovin))またはリン脂質(フォスファチジルコリンおよびフォスファチジルエタノールの比が8:2、またはフォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、およびフォスファチジルエタノールの比が4:2:4)のいずれかを含むFVII除去貧血小板血漿(PPP)と混合する。
表面プラズモン共鳴解析は、野生型第VIIa因子とその変種の可溶性組織因子に対する相対的結合を決定するために用いた。細胞外ドメインを含む組換え可溶性組織因子を、NHS/EDCカップリングを用いてBiacore CM5チップ上で270反応単位カップリングさせた。可溶性組織因子は、チップ表面と相互作用させるため、pH 4.5でカップリングさせた。
実施例1
Banner et al.、J Mol Biol、1996; 285:2089による可溶性組織因子との複合体におけるhFVIIaのX線構造を、本実施例のために使用する。この実施例の計算に関するさらなる情報は、国際公開公報第01/58935号を参照されたい。
部分的なASA計算を行った結果、それらの側鎖の25%より多くが表面に露出していることが決定された以下の残基が得られた:
(A1〜S45はGlaドメインに位置し、残りの位置はGlaドメイン外に位置する)。
活性部位結合裂領域の隆起を、N173、A175、K199、N200、N203、D289、R290、G291、A292、P321およびT370として、FVIIa構造1FAK.pdbの視覚的検査によって定義した。
哺乳類細胞におけるrhFVIIa発現の発現カセットの設計
rhFVIIa発現用の発現カセットは、国際公開公報第01/58935号の実施例2に記載されているように、設計およびクローニングした。
本発明の変種をコードする発現カセットの構築
置換されたコドンを有する変種FVIIオープンリーディングフレームを有する構築物を作製するために、標準的方法を用いて配列突出伸長(Sequence overhang extension : SOE) PCRを使用した。
CHO K1細胞におけるポリペプチド変種の発現
CHO K1細胞系(ATCC # CCL-61)を、MEMα、10% FCS(Gibco/BRL Cat # 10091)、P/Sおよび5 μg/mlのフィロキノンを用いたT-25フラスコ中に50%コンフルエントで播種して、コンフルエントとなるまで増殖させる。コンフルエントな単層細胞に、リポフェクトアミン2000物質(Life Technologies)を製造者の指示に従って使用して、5 μgの上記関連プラスミドをトランスフェクトさせる。トランスフェクションの24時間後、試料を採取して、例えばhFVIIのEGF1ドメインを認識するELISAなどを用いて、この試料を定量する。この時点で、安定したトランスフェクタントのプールを作製する目的で、関連した選択(例えば、ハイグロマイシンB)を細胞に適用してもよい。CHO K1細胞、およびプラスミド上の選択マーカーとしてハイグロマイシンB耐性遺伝子を使用する場合には、通常これは一週間以内に達成される。
ポリペプチド変種を安定して発現するCHO-K1細胞の作製
CHO-K1トランスフェクタントプールのバイアルを融解して、細胞を、25 mlのMEMα、10%FCS、フィロキノン(5 μg/ml)、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンを含む175 cm2組織フラスコに播種して、24時間増殖させる。細胞を回収して、希釈し、細胞密度1/2個〜1個/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに播種する。1週間増殖させた後、20〜100個の細胞のコロニーがウェルに存在し、1個のコロニーのみを含むウェルを標識する。さらに2週間後、1個のコロニーのみを含む全てのウェルにおける培地を、200 μlの新鮮な培地に交換する。24時間後、培地試料を採取して、例えばELISAによって分析する。高産生クローンを選択し、これをFVIIまたはその変種の大規模産生のために用いる。
ポリペプチド変種の精製および結果として生じた活性化
FVIIおよびFVII変種は以下のように精製する。技法は4℃で行う。大規模産生から回収した培養培地を、Millipore TFFシステムを用いて、30 kDaカットオフペリコンメンブレンを用いて限外濾過する。培地を濃縮した後、クエン酸塩を5 mMとなるように加えて、pHを8.6に調節する。必要であれば、伝導率を10 mS/cm未満に低下させる。その後、試料を、50 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.6によって平衡化したQ-セファロースカラムに適用する。100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.6によってカラムを洗浄してから150 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.6によって洗浄した後、FVIIを10 mM Tris、25 mM NaCl、35 mM CaCl2、pH 8.6を用いて溶出する。
実験結果−FX活性化活性
本発明の変種を「TF非依存性第X因子活性化アッセイ」に供し、以下の結果が得られた(結果は参照としてのP10Q+K32E変種の活性のパーセンテージで表される)。
実験結果−「全血アッセイ」における凝血活性
本発明の変種を「全血アッセイ」に供したところ、それらの凝血活性はrhFVIIaならびに[P10Q+K32E]rhFVIIaと比較して有意な増加(すなわち凝血時間の減少)を示すことが判明した。実験結果は図1および下記の表2に示す。
実験結果−「凝血アッセイ」における凝血活性
TF依存性凝血アッセイ(上記の材料と方法の項に記載されている「凝血アッセイ」)においてアッセイした場合、R36Eの置換を有する本発明の変種は、rhFVIIまたは他の本発明の変種と比較して、有意に凝血活性が減少することが明らかだった。下記の表3を参照。それにも関わらず、上記の実施例7に説明されているように、R36Eの置換を有する変種は「TF非依存性第X因子活性化アッセイ」において第X因子活性化活性が増加している。
実験結果−トロンボグラムアッセイにおけるトロンビン生成
リン脂質(PL)依存性および組織因子(TF)依存性トロンボグラムの両方を用いて(上記のトロンボグラムアッセイの記載を参照)、異なる変種タンパク質濃度におけるFVIIa変種の最大トロンビン生成率を決定した。最大トロンビン生成率(FU(蛍光単位)/sec2として表される)をpMで表した変種濃度の関数としてプロットすることによって、図2(最大組織因子依存性トロンビン生成率)および図3(最大リン脂質依存性トロンビン生成率)に示す結果が得られた。
実験結果−Biacoreアッセイにおける組織因子へのFVIIa結合
本発明の変種を、材料と方法の項に記載されているように、TFチップを用いたBiacoreシステム上での表面プラズモン共鳴によるアッセイに供したところ、以下の結果が得られた。
Claims (71)
- 配列番号:1に示すアミノ酸配列を有するヒト第VII因子(hFVII)またはヒト第VIIa因子(hFVIIa)に関連する1〜15個のアミノ酸改変を有し、(a)疎水性アミノ酸残基の34位における置換による導入、および(b)36位におけるアミノ酸置換から選択される少なくとも一つの改変を含む、第VII因子(FVII)または第VIIa因子(FVIIa)ポリペプチド変種。
- 34位に疎水性アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項1記載の変種。
- 置換がA34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34Y、およびA34Wからなる群より選択される、請求項2記載の変種。
- 置換がA34I、A34L、およびA34Vからなる群より選択される、請求項3記載の変種。
- 置換がA34Lである、請求項4記載の変種。
- 36位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の変種。
- 36位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項6記載の変種。
- 置換がR36Eである、請求項7記載の変種。
- A34L+R36Eの置換を含む、請求項8記載の変種。
- アミノ酸配列が36位におけるアミノ酸置換を含む、請求項1記載の変種。
- 36位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項10記載の変種。
- 置換がR36Dである、請求項11記載の変種。
- 置換がR36Eである、請求項11記載の変種。
- 34位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項記載の変種。
- 34位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項14記載の変種。
- 置換がA34Eである、請求項15記載の変種。
- A34E+R36Eの置換を含む、請求項16記載の変種。
- 10位および/または32位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の変種。
- K32Eの置換を含む、請求項18記載の変種。
- P10Qの置換を含む、請求項18記載の変種。
- P10Q+K32Eの置換を含む、請求項18記載の変種。
- P10Q+K32E+A34E+R36Eの置換を含む、請求項21記載の変種。
- P10Q+K32E+A34Lの置換を含む、請求項21記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+R36Eの置換を含む、請求項21記載の変種。
- 非ポリペプチド部分への結合基を含む少なくとも一つのアミノ酸残基が、Glaドメイン外に位置する部位に導入されている、請求項1〜24のいずれか一項記載の変種。
- 結合基がインビボグリコシル化部位である、請求項25記載の変種。
- グリコシル化部位が置換によって導入されたインビボN-グリコシル化部位である、請求項26記載の変種。
- インビボN-グリコシル化部位がA51N、G58N、T106N、K109N、G124N、K143N+N145T、A175T、I205S、I205T、V253N、T267N、T267N+S269T、S314N+K316S、S314N+K316T、R315N+V317S、R315N+V317T、K316N+G318S、K316N+G318T、G318N、D334N、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換により導入されている、請求項27記載の変種。
- T106N、I205T、およびV253Nからなる群より選択される少なくとも一つの置換を含む、請求項28記載の変種。
- P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+T106N+I205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+T106N+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+I205T+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。
- 3位と4位の間に少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入をさらに含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の変種。
- 3位と4位の間に一つのアミノ酸残基の挿入を含む、請求項39記載の変種。
- 3位と4位の間に疎水性アミノ酸残基が挿入されている、請求項39または40記載の変種。
- 挿入がA3AYである、請求項41記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36Eの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34Lの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36Eの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。
- 配列番号:1に関連する6位、7位、14位、16位、19位、20位、25位、26位、29位および35位において改変が行われていない、請求項1〜54のいずれか一項記載の変種。
- 変種が活性型である、請求項1〜55のいずれか一項記載の変種。
- 本明細書に開示されている「TF非依存性第X因子活性化アッセイ」においてアッセイされた場合に、活性型の変種のFX活性化活性とrhFVIIaのFX活性化活性の比率が少なくとも約5である、請求項1〜56のいずれか一項記載の変種。
- 請求項1〜57のいずれか一項に定義される変種をコードするヌクレオチド配列。
- 請求項58記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項58記載のヌクレオチド配列または請求項59記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- インビボグリコシル化が可能なγ-カルボキシル化細胞である、請求項60記載の宿主細胞。
- 請求項1〜57のいずれか一項に定義される変種および少なくとも一つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
- 請求項1〜57のいずれか一項に定義される変種、または請求項62に定義される組成物の、薬剤としての使用。
- 凝血形成が望ましい疾患または障害の治療用の薬剤を製造するための、請求項1〜57のいずれか一項に定義される変種の使用。
- 疾患または障害が、脳出血、外傷などの重度の制御不能な出血、移植または切除を受ける患者の出血、静脈瘤の出血、および血友病を含む、出血からなる群より選択される、請求項64記載の使用。
- 疾患または障害が外傷である、請求項65記載の使用。
- 疾患または障害が血友病である、請求項65記載の使用。
- 凝血形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、請求項1〜57のいずれか一項に定義されている変種または請求項62記載の組成物の有効量を、必要としている哺乳動物に投与する段階を含む方法。
- 疾患または障害が、脳出血、外傷などの重度の制御不能な出血、移植または切除を受ける患者の出血、静脈瘤の出血、および血友病を含む、出血からなる群より選択される、請求項68記載の方法。
- 疾患または障害が外傷である、請求項69記載の方法。
- 疾患または障害が血友病である、請求項69記載の方法。
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