JP2001511162A

JP2001511162A - 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体

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Publication number: JP2001511162A
Application number: JP53358498A
Authority: JP
Inventors: デルオステン，クラウスボン; ルドロッゲン，エルウィン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1997-02-06
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 2001-08-07
Also published as: AU5749598A; WO1998035026A1; US6623950B1; CA2279986A1; EP1017794A1; US20050079593A1; US6245901B1; CN1246891A; AU740207B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリペプチド表面に高分子を結合させるために付加され／または除去された１つ以上の付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体、本発明のポリペプチド−ポリマー結合体の調製方法、免疫原性とアレルギー原性を低下させることを目的とした当該結合体の応用、ならびに当該結合体を含む組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体発明の分野本発明は、ポリペプチドの３Ｄ構造の表面に高分子を結合させるために付加され／または除去された１つ以上の付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体 (conjugate)、本発明のポリペプチド−ポリマー結合体の調製方法、免疫原性とアレルギー原性を低下させることを目的とした当該結合体の応用、ならびに当該結合体を含む組成物に関する。発明の背景特定の生理効果を得るために循環系において、酵素などのポリペプチドを利用することは医学分野では公知である。さらに、洗濯、衣服の脱色、ヒトのケア、コンタクトレンズ洗浄、食品および餌の調製といった工業分野では、酵素は機能的成分として使用されている。医薬品と工業的応用との大きな重要な違いの一つは、後者の応用（即ち、工業的応用）ではポリペプチド（酵素が多い）は体内の循環系に入れることを目的としていないことである。特定のポリペプチド及び酵素は十分な安定性を持たず、また特定条件下−投与経路に依存し−では免疫応答、典型的にはＩｇＧ及び／又はＩｇＥ反応を引き起こすことがある。今日一般には、酵素の様なポリペプチドに高分子を結合すると、ポリペプチドの安定性は改善され、免疫反応は低下させられると認識されている。この免疫反応の低下は、抗体形成を導く免疫反応に関わるポリペプチド表面のエピトープが、結合した高分子により被覆された結果であると信じられている。高分子をポリペプチドに結合させる技術は当業界において周知である。第一の好適な商業化技術の一つは１９７０年代初期に記載され、例えば米国特許番号4,179,337に開示されている。当該特許はポリエチレングリセロール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）が結合した酵素やペプチドホルモンの様な、非免疫性ポリペプチドに関する。ポリペプチドの少なくとも１５％で生理活性が維持されている。英国（ＧＢ）特許番号1,183,257（Crookら）は、トリアジン環を介したポリサッカライドへの酵素の結合の化学を記載している。さらに、酵素−重合体結合体の酵素活性を保つための技術も当業界において公知である。 WO93/15189（Veroneseら）は蛋白分解酵素を高分子化阻害剤を結合し、ポリエチレングリコール修飾された蛋白分解酵素の活性を維持する方法に関する。該結合体は医療応用を目的としている。ポリペプチドへの高分子の結合には、ポリペプチドとその基質との間の相互作用への干渉によりポリペプチドの活性が低下させる作用があることが多い。欧州特許番号183503(Beecham Group PLC)は、可逆的結合基により少なくとも１つの水溶性重合体を、医薬品として有用な蛋白に結合した結合体を提供することで、上記概念の開発を開示している。欧州特許番号471,125（Kanebo）は、温度安定性と保存安定性を改良するために、トリアジン環を介して親プロテアーゼ（商標名EsperaseRの枯草菌（Bacillu s）蛋白質分解酵素）にポリサッカライドを結合させることから成るスキンケア製品を開示している。用いた結合技術はまた上記ドイツ特許番号1,183,257（Crookら）にも開示されている。日本特許番号3083908は、ＰＥＧ、デンプン、セルロース等の水溶性基質を１つ以上により変更された、モルモット肝臓由来のトランスグルタミナーゼを含む皮膚用化粧品材料を開示している。該変更は、高分子を活性化し、それを酵素に結合することにより実施される。該組成体は皮膚に対し穏やかであると記載されている。しかし、ポリペプチドと酵素に高分子を結合することは必ずしも容易ではない。さらに、さらにより免疫原性や／あるいはアレルギー原性を低くしたポリペプチド−高分子結合体が求められている。発明の要約本発明の目的は、工業応用と医薬品応用に好適な改良されたポリペプチド−高分子結合体を供給することである。本発明において“改良されたポリペプチド−高分子結合体”とは、ヒトや動物に於ける免疫反応を低下し、そして／または改善された安定性を有する結合体を意味する。以下記載する如く、免疫反応は免疫経路に依存する。本発明者は、高分子に結合されるべき親ポリペプチドの表面に、１つ以上の付着基を加え、そして／または除去することで免疫原性および／またはアレルギー原性の少ない、酵素のようなポリペプチドを作ることができることを見いだした。循環系（即ち血流）に医用ポリペプチドを直接導入する場合、主にＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ抗体を形成する免疫反応が起こる危険性がある。これに対し、機能性成分、例えば界面活性剤の様な工業用ポリペプチドは循環系への使用を目的としていない。工業用ポリペプチドに関連する潜在的な危険性は、主にＩｇＥ抗体形成の形で現れるアレルギー反応を起こす吸入である。従って、工業用ポリペプチドとの関連では、ポリペプチドの吸入および気管内や鼻孔内提示を原因とする、呼吸性アレルギー原性の潜在的危険がある。医用ポリペプチドに関連した主要な潜在的危険は、皮内、静脈内、または皮下でのポリペプチドの提示による免疫原性である。 “免疫原性”低下させること、及び“呼吸アレルギー原性”を低下させることは、その暴露経路が異なり、またその免疫メカニズムも大きく異なるため、２つの大きく異なる問題であると理解されている。本発明の中に於ける“免疫原性”とは、臨床条件下に於けるアレルギー性接触皮膚炎を指し、また皮膚に接触しそれを通過する化学物質に対する、細胞介在性遅延型免疫反応である。この細胞介在反応はまた遅延型接触過敏症とも呼ばれる（GellおよびCombsの組織損傷に於ける免疫メカニズムの分類に拠るＩＶ型反応）。 “アレルギー原性”または“呼吸アレルギー原性”とは、例えばポリペプチドの吸入に続く即時型アナフィラキシー反応（GellおよびCombsによるＩ型抗体介在反応）である。本発明によれば、実質的に保持された残留活性を有する、免疫反応が低下し、そして／または安定性が改良されたポリペプチドを提供することができる。アレルギー性反応(allergic response)と免疫系性反応（immunogenic respons e）をまとめて、少なくとも本発明明細書では“免疫反応(immune response)”と呼ぶ。本発明の第一の観点は、ａ）対応する親ペプチド上の利用可能な付着基の数に比較し、ポリペプチドの表面上の付着基の数を増加する形に変更されたポリペプチドと結合した１つ以上の追加高分子、および／または、ｂ）対応する親ペプチド上の利用可能な付着基の数に比較し、ポリペプチド上の機能部位にある、またはその近傍にある付着基の数を減らす形に変更されたポリペプチドに結合した１個、またはそれより少い高分子、を有するポリペプチド−高分子結合体に関する。 “親ポリペプチド”とは、高分子に結合し変更されるポリペプチドを指す。親ポリペプチドは天然に産生する（または野生型）ポリペプチド、または好適な方法により調製されたその変形体(variant)でもよい。例えば、親ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠損もしくは末端切除、または天然産生ポリペプチドのアミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸残基の付加、または挿入により変更された天然ポリペプチドの変形体でもよい。本発明に於ける“好適な付着基”とは、問題の高分子に結合しうるポリペプチド表面のアミノ酸残基群を意味する。好適な付着基はリジン残基のアミノ基およびＮ−末端アミノ基である。高分子はまた表面に位置するポリペプチド鎖の中のアミノ酸残基のカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）に結合してもよい。カルボン酸付着基はアスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボン酸およびＣ末端のＣＯＯＨ−基であることができる。 “機能部位”とは、触媒活性のごときポリペプチドの性能に必須であることが知られている任意のアミノ酸残基及び／又はコファクターを意味し、例えば、セリンプロテアーゼ中の触媒トライアド残基であるヒスチジン、アスパラギン酸及びセリン、あるいはアースロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosus)パーオキシダーゼのごときパーオキシダーゼ中のヘム基並びに遺伝及び近位のヒスチジンである。本発明の第２の観点は、次の工程より成る改良されたポリペプチド−高分子結合体の製造方法に関する。ａ）注目の親ポリペプチドの３Ｄ構造の表面上にあるアミノ酸残基を特定し、ｂ）変異させるべき当該親ポリペプチドの当該３Ｄ構造の表面上の標的アミノ酸残基を選択し、ｃ）ｉ）好適な付着基を有するアミノ酸により、工程ｂ）で選択した１つ以上のアミノ酸を置換し、または挿入し、そして／または、ｉｉ）機能部位のまたはその近傍にある工程ｂ）で選択した１つ以上のアミノ酸を置換しまたは欠損させ、ｄ）高分子を変異したポリペプチドに結合させる。本発明はまた発明の結合体の利用並びに医薬品の免疫原性および工業製品のアレルギー原性を低下するための発明の方法に関する。最後に、本発明は、本発明の結合体と、工業製品や医薬品で使用されているその他の成分を含んで成る組成物に関する。図の簡単な説明図１はｉ）コントロール、ｉｉ）非修飾リパーゼ変形体、ｉｉｉ）リパーゼ変形体−ＳＰＥＧにより５週間免疫感作した後の抗リパーゼ血清抗体レベルを示す。（Ｘ：ｌｏｇ（希釈血清）；光学密度（４９０／６２０）。発明の詳細な説明工業および医薬品への応用に好適な改良されたポリペプチド−高分子結合体を提供することが本発明の目的である。医薬品応用および工業応用に利用されるポリペプチドも各種様々であるが、本発明の原理を親ポリペプチド（例えば、酵素、ホルモンペプチド等）それぞれの型に特異的に合わせることができるだろう。本発明の発明者は、対応する親ペプチドから調製した結合体に比べて、免疫反応が低い改良されたポリペプチド−高分子結合体を提供した。本発明者らは、親ペプチドの表面に１つ以上の付着基を加えることで、酵素の様なポリペプチドの免疫原性および／またはアレルギー原性を小さくできるだろうことを見いだした。さらに、発明者らは、機能部位の、またはその近傍の付着基を除くことで、維持された残留機能活性をより高くできるだろうことも見いだした。本発明の第１の観点は、ａ）対応する親ペプチド上に存在する利用可能な付着基の数に比較し、ポリペプチドの表面上の付着基の数を増加する形で変更されたポリペプチドと結合した１つ以上の追加高分子、および／または、ｂ）対応する親ペプチド上の利用可能な付着基の数に比較し、ポリペプチドの機能部位にある、またはその近傍にある付着基の数を減らす形に変更されたポリペプチドに結合した１つ、またはそれより少数の高分子、を有する、変更されたポリペプチド−高分子結合体に関する。付着基が加えられ、そして／または除去されるかは、その親ポリペプチドに拠る。ａ）付着基の付加親ポリペプチドの表面にある付着基が少ない場合には、このポリペプチドにさらに付着基を加える必要があるだろう。親ポリペプチドの表面にある１個以上のアミノ酸を置換し、または挿入して１つ以上の付着基を付加し、対応する親ポリペプチドに比べ付着可能な高分子数を増やす。一般に、付着した高分子の数が増加した結合体は、結合した高分子の数が少ない対応する結合体に比べ免疫反応が低いことが知られている。ポリペプチド表面に存在する任意の利用可能なアミノ酸、特に酵素の活性部位の様な機能部位またはその近傍でないアミノ酸は、原則として追加付着基をもたらす置換および／または挿入の対象となる。以下詳細に記述する如く、追加の結合高分子の位置は免疫反応の低下、およびポリペプチド自体の維持された残留機能活性に関しても重要である。本発明の典型的な結合体は、対応する親ポリペプチドを基本に調製された結合体の高分子数に比べて、ポリペプチド表面に結合した追加の高分子の数が１個ないし２５個、好ましくは１個ないし１０個多い。しかし、追加される付着基の最適数は（少なくとも部分的には）、結合した高分子により覆われる親ポリペプチドの表面積（即ち、分子量）に依存しており、また当然親ポリペプチド上に既に存在している付着基の数にも依存している。ｂ）付着基の除去酵素、または基質等と相互作用して機能を発揮する他のポリペプチドでは、付着基が機能部位（即ち、酵素の活性部位）そのもの、またはその近傍に結合する場合には、ポリペプチドとその基質等の間の相互作用によりポリペプチドへの高分子の結合は妨げられる。その結果として活性は低下するだろう。活性部位、またはその近傍に１つ以上の高分子を持つ酵素では、残留酵素活性の実質的な消失が予測できる。従って本発明によれば、問題の親酵素を基本として調製された対応する結合体に比べて残留酵素活性の割合が高く維持される結合体を構築できるだろう。該構築は活性部位そのもの、またはその近傍にある付着基を置換しそして／または欠損させ、これにより触媒クレフト(cleft)中での基質の接近性を改善し、基質親和性を上昇せしめることで実施できる。本発明の酵素−高分子結合体は、典型的には対応する親ポリペプチドを基本に調製された結合体の高分子数に比べて、活性部位そのもの、または近接部位に結合した高分子の数が１個ないし２５個、好ましくは１個ないし１０個少ない。以下に示す如く、機能部位“そのもの、または近接する”とは、機能部位の５オングストローム、好ましくは８オングストローム、特に好ましくは１０オングストローム以内に結合する高分子がないことを意味する。ポリペプチドの機能部位そのもの、または近接する付着基の除去は、ポリペプチド表面の別部分への付着基の付加と有利に組み合わせることができるだろう。この様にして、付着基の総数を一定、増加あるいは減少させることができるだろう。しかし、改善後の全付着基の位置は、免疫反応の低下および／または維持された残留活性より確認される。改善後の安定性もまた同様にして確認できるだろう。付着基の数一般に、付着基の数はポリペプチドの分子量および／または表面積とバンラスをとならければならない。ポリペプチドが重いほど、より多くの高分子をポリペプチドに結合し、抗体形成を司るエピトープを十分に被覆することができる。従って、親ポリペプチドが比較的軽い（例えば１ないし３５ｋＤａ）の場合には、結合した（機能部位以外）高分子の総数を合計４から２０の間で増加せしめることは有益だろう。親ポリペプチド分子が重い場合、たとえば３５ないし６０ｋＤａの場合には、結合した高分子（機能部位以外）の数を７ないし４０以上に増やすと有益であろう。発明者らにより好適と考えられる、注目のポリペプチドの分子量（Ｍｗ）と結合した高分子の比を下記表１に示す。免疫反応低下対維持された残留酵素活性特に酵素の場合、酵素活性が、基質と酵素の構造の中のクレフトに存在することが多い活性部位との相互作用に関連することから、他の多くのポリペプチドと比べ、免疫反応を低下させることと実質的な残留酵素活性を維持することは矛盾する。いずれかの理論に限定されるわけではないが、酵素−高分子結合体の酵素活性の消失は、特に触媒クレフトへ大きなそして／または重い高分子が作用した結果の基質の立体障害形成による、活性部位への基質の到達妨害の結果起こると考えられている。また、この消失は、少なくとも部分的には、高分子の結合により発生したストレスを原因とする酵素の３Ｄ構造の有害な微小構造変化によって起こるだろう。維持される残留活性発明のポリペプチド−高分子結合体は実質的に維持された機能活性を有する。本発明に於ける“実質的”に維持された機能活性とは、対応する親ポリペプチドを基本に調製された結合体の活性との比較で、少なくとも２０％から３０％、好ましくは３０％から４０％、より好ましくは４０％から６０％、さらに好ましくは６０％から８０％、さらにより好ましくは８０％から約１００％までの活性として定義される。機能部位そのもの、またはその近傍に高分子が結合していない本発明のポリペプチド−高分子結合体の場合、その残留活性は修飾された（即ち高分子が結合した）親ポリペプチド結合体との比較で、１００％またはそれに極めて近い値までになるだろう。親ポリペプチドが付着基を機能部位から離れた場合、その活性は修飾された（即ち高分子が結合した）親ポリペプチド結合体に比べて１００％以上になるだろう。結合した高分子の位置最適に低下した免疫反応（即ち、免疫性ならびにアレルギー性反応）を得るためには、注目のポリペプチド表面に結合した高分子は相互に好適な距離をあけ存在しなければならない。本発明の好適な態様では、親ポリペプチドは高分子がポリペプチド表面に広範囲に分布する様な形に変更される。注目のポリペプチドが酵素活性を有する場合、活性部位の領域そのもの、またはその近傍に結合する高分子は可能な限り少なく、特に０であることが好ましい。本発明に於いては“ポリペプチド表面に広範囲に分布する”とは、高分子が表面の様々な部分、好ましくは機能部位から離れた面の全て、またはほぼ全てを被覆する様に利用可能な付着基が位置し、エピトープが被覆されることで免疫系または抗体により認識されなくなることを意味する。典型的な抗体−ポリペプチド相互作用域は、Sheriffら（1987）、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 84，p．8075-8079記載の如く５００平方オングストロームの範囲をカバーする。５００平方オングストロームとは２５オングストローム×２０オングストロームの長方形、または半径１２．６オングストロームの円の面積に相当する。従って、問題のポリペプチドに対するエピトープへの抗体結合を阻止するには、２個の付着基間の最大距離がおよそ１０オングストロームであることが好ましい。従って、既に存在する付着基から１０オングストローム以上離れて位置するアミノ酸残基は好適は標的残基である。ポリペプチド上の２つ以上の付着基が相互に極めて近接して位置する場合、多くの場合１個の高分子だけが結合することになるだろう。機能活性の消失を最小にするためには、機能部位そのもの、またはその近傍へ高分子を結合させないことが好ましい。機能部位への大きな高分子の接近を妨害は望ましくないことから、当該距離は、少なくともその一部は、結合する高分子の大きさに依存する。従って、大きな高分子ほど機能部位から結合した高分子までの距離は長くなければならない。問題のポリペプチドの実質的機能活性を維持するためには、付着基はその機能部位から結合しない状態で、５オングストローム、好ましくは８オングストローム、とくに好ましくは１０オングストローム以内に位置している必要があり、従って変異により有益に除去または変異してもよい。通常、機能残基は、結合高分子の標的に成り得る場合でも、変異／除去されない。当該例の場合、多様な付着基を含む結合化学を選択することが有益だろう。さらに、免疫系に認識され得る既知エピトープにまたはその様な部位に接近してポリマー分子が結合しているポリペプチドを提供するために、本発明によればそのような部位の変異も有利である。エピトープの位置が不明な場合、複数または多数の高分子をポリペプチドに結合させることは有益である。上記の如く、当該付着基は表面に広範囲に分布していることが好ましい。付着基リジン残基のアミノ基の様なイオン化基は実質的に全てポリペプチド表面に位置する（例えばThomas E．Creighton，(1993)、“白質”（Prtoeins）、W．H．F reemanand Company，New Yorkを参照）。従って、変更された、または親ポリペプチド上にある容易に接近可能な接着基（例えばアミノ基）の数は、一般にはポリペプチドの一次構造にあるリジン残基の数にＮ−末端アミノ基の数を加えた数と考えられる。アミノ基への高分子の結合の化学は極めて単純であり、当業界で確立している。従って、免疫原性および／またはアレルギー原性が低下した、そして／または安定性および／または維持された機能活性が改良された結合体を得るためには、注目の親ペプチドに／からリジン残基（即ち付着基）を付加／除去することが好ましい。高分子はポリペプチド表面にあるアミノ酸残基のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）にも結合できる。従って、カルボキシル基を付着基と利用すれば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の付加および／または除去も本発明に好適となるだろう。 −ＳＨ基の様な、その他の付着基を利用する場合は、これら付着基も同様の方法にて付加し／または除去されるだろう。ポリペプチドの３Ｄ構造への影響は通常あまり大きくないことから、アミノ酸残基の置換は挿入よりも好ましい。好適な置換は保存的置換である。付着基の数が増加する場合、置換は機能部位（酵素の活性部位）から５オングストローム、好ましくは８オングストローム、特に好ましくは１０オングストローム離れた位置で行うことが有益だろう。追加のアミノ付着基を得るための好適な保存的置換の１例は、アルギニンからリジンへの置換である。追加のカルボキシル基を得るための保存的置換の例は、アスパラギンからアスパラギン酸／グルタミン酸、またはグルタミンからアスパラギン酸／グルタミン酸への置換である。付着基を除去するためには、リジン残基をアルギニン等で置換してもよい。親ポリペプチド本発明によれば、“ポリペプチド”という語は医薬品または工業応用のための蛋白質、ペプチドおよび／または酵素を含む。典型的には、注目のポリペプチドは約１〜１００ｋＤａ、しばしば１５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲の分子量を持つ。医薬品ポリペプチド “医薬品ポリペプチド”とは、ヒトおよび／または動物の体の循環系に導入したときに、生理学的に活性であるペプチドホルモンの様な、ペプチド、蛋白質および／または酵素を含むポリペプチドとして定義される。医薬品ポリペプチドは循環系に導入されると、強い免疫原性を示す。本発明が意味する“医薬品ポリペプチド”の例にはインシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リラクシン、インターフェロン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）とプロラクチンがある。工業用ポリペプチド工業応用に利用されるポリペプチドは酵素活性を有することが多い。工業用ポリペプチド（例えば酵素）は（医薬品ポリペプチドとは異なり）体の循環系内に導入することを目的としていない。工業用組成物中の成分および／または石鹸や化粧品を含む個人用ケア用品の様な製品の成分として利用される酵素の様な工業用ポリペプチドがヒトや動物の体の循環系に直接接触することは、ほとんど起こり得ないことである。なぜなら、酵素（あるいはその様な酵素を含む製品）を血流内に注入（または同等の方法）することはないからである。従って、工業用ポリペプチドの場合の潜在的危険は、気道を通してのポリペプチド吸入の結果としての呼吸アレルギー（即ち、ＩｇＥ反応）である。本発明による“工業用ポリペプチド”とは、ヒトおよび／または動物の体の循環器への導入を目的としないペプチド、蛋白質および／または酵素などのポリペプチドと定義される。この様なポリペプチドの例は、石鹸、家庭用製品、農薬、化粧品や洗面用化粧品を含むスキンケア製品の様な個人向けケア製品、口腔および歯科医薬品、衣料加工用配合体、硬面洗浄用配合体、そして食物および餌等の製造用配合体の様な製品に使用されるポリペプチド、特に酵素である。酵素活性酵素活性を有する医薬品または工業用ポリペプチドは、ラッカーゼやスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の様な酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１，“酵素命名法”(Enzyme Nomenclature，(1992),Academic Press，Inc.)；トランスグルタミナーゼ（TGases）の様な転移酵素（Ｅ．Ｃ．２）；プロテアーゼ、特にサブチリシン、と脂肪分解酵素の様な加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３）；蛋白ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の様なイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５）を含む上記酵素群のいずれかに属することが多い。加水分解酵素蛋白質分解酵素考えられる蛋白質分解酵素には、ペプシンの様なアスパラギン酸プロテアーゼ、パパインの様なシステインプロテアーゼ、サブチリシンの様なセリンプロテアーゼまたはNeutrase^Rの様なメタロプロテアーゼが含まれる。親プロテーゼの具体例としては、PD498（WO93/24623およびSEQ ID NO．2）、S avinase^R(von der Ostenら、(1993)，Journal of Biotechnology，28，p．55+， SEQ ID NO 3)、プロテイナーゼＫ（Gunkelら、(1989)，Eur．J．Biochem，179， p．185-194）プロテイナーゼＲ(Samalら、(1990)，Mol．Microbiol，4，p．1789 -1792)、プロテイナーゼＴ（Samalら、(1989)，Gene，85，p．329-333）、サブチリシンDY(Betzelら、(1993)，Arch．Biophys，302，no．2，p．499-502)，Lio n Y(JP 04197182-A)，Rennilase^R（Novo Nordisk A/Sより入手可能）、JA16(WO 92/17576)、アルカラーゼ^R（天然ズブチルシンカールスベルグ変種）(von der Ostenら、(1993)，Jounral of Biotechnology，28，p．55+)が含まれる。脂肪分解酵素考え得る脂肪分解酵素には、例えばEP 258 068およびEP 305 216（下記SEQ ID NO 6を参照のこと）に記載されているフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lan uginosa)リパーゼ、EP238 023に記載のフミコーラ・インソレンス(Humicola ins olens)リパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、アブシジア・sp(Absidia sp.)脂肪分解酵素(WO 96/13578)、例えばEP 214 761）に記載のキャンディダ・アンタークチカ(C．antarctica)リパーゼＡまたはＢであるキャンディダ・アンタークチカ(C．antarctica)リパーゼの様なキャンディダ(Ca ndida)リパーゼ、例えばEP 218 272記載のシュードモナス・アルカリゲネス(P． alcaligenes)リパーゼ、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（P．pseudoa lcaligenes）リパーゼのごときシュードモナス（Pseudmonas）リパーゼ、EP 331 376に記載のシュードモナス・セパシア（P．cepacia）リパーゼ、WO 95/14783 に記載のシュードモナス・sp(Pseudomonas sp.)リパーゼ、例えばバシルス・スブチリス(B．subtilis)リパーゼ(Dartoisら、（1993）Biochemica et Biophysic a)、バシルス・ステアロサーモフィルス(B．stearothermophilus)リパーゼ（JP 64/744992）およびバシルス・プミルス（B．pumilus）リパーゼ(WO 91/16422)の様なバシルス（Bacillus）リパーゼがある。その他のタイプの脂肪分解酵素には、WO 88/09367記載のシュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)由来のクチナーゼ、またはフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）（例えばWO 90/09446記載）由来のクチナーゼが含まれる。酸化還元酵素ラッカーゼ考え得るラッカーゼにはポリポルス・ピニシッス(Polyporus pinisitus)ラッカーゼ(WO 96/00290)、ミセリオフトラ（Myceliophthora）ラッカーゼ(WO 95/33 836)、シタリジウム（Schytalidium）ラッカーゼ（WO 95/338337）およびピリクラリア・オリゼー（Pyricularia oryzae）ラッカーゼ（Sigmaより入手可能）が含まれる。パーオキシダーゼ考え得るパーオキシダーゼにはＢ．プミルス（B．pumilus）パーオキシダーゼ (WO 91/05858)、ミソコッカッセー(Mysococcaceae)パーオキシダーゼ(WO 95/119 64)、コプリヌム・シネリウス(Coprinus cinereus)(WO 95/10602)およびアースロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosus)パーオキシダーゼ（Kunishimaら(199 4)，J．Mol．Biol．235，p．331-334）が含まれる。トランスフェラーゼトランスグルタミナーゼ好適なトランスフェラーゼは、WO 96/06931（Novo Nordisk A/S）およびWO 96 /22366(Novo Nordisk A/S)開示のトランスグルタミナーゼを含む。イソメラーゼ蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ好適な蛋白質ジスルフィドイソメラーゼにはWO 95/01425(Novo Nordisk A/S) 記載のPDIsが含まれるが、もとよりこれに限定されない。高分子ポリペプチドに結合する高分子には、ポリオール（即ち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（即ちポリ−ＮＨ２）とポリカルボキシル酸（即ち、ポリ−ＣＯＯＨ）の様な天然ならびに合成ホモポリマー、さらにヘテロポリマー、即ち例えばヒドロキシル基とアミン基の様に１種類以上の結合基を含むポリマーの何れでも良い。好適な高分子の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）やポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ＰＥＧ−ギルシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分枝型ＰＥＧｓ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−リンゴ酸無水物、ポリスチレン−コ−リンゴ酸無水物、カルボキメチル−デキストランを含むデキストラン、ヘパリン、相同アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースやヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース、キトサン加水分解物、ヒドロキシエチル−デンプンとヒドロキシプロピル−デンプンの様なデンプン、グリコーゲン、アガロースとその誘導体、ガーゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラゲニン、ペクチン、アルギン酸加水分解物と生体高分子が含まれる。好適な高分子は、ポリエチレングリコール（（ｍ）ＰＥＧ）の様な無毒の高分子で、酵素表面上の付着基への共有結合に必要な化学が比較的単純であるものである。一般には、デキストラン、プルラン等のポリサッカライドに比べて架橋結合可能な反応基が少ないことから、ポリエチレンオキサイドのようなポリアルキレンオキサド（ＰＡＯ）や、ＰＥＧ、特にｍＰＥＧの様な高分子が好適である。上記高分子は全て本発明に利用できるが、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を利用することが有益である。それはメトキシエチレングリコールが酵素と結合できる反応端を１つしか持たないからである。即ち、架橋結合のリスクが少ない。さらに、それにより生成物が均一になり、高分子と酵素との反応の制御が容易になる。酵素変形体の調製結合する酵素変形体は幾つかの好適方法により構築できるだろう。多くの方法が当業者に公知である。例えば本発明による酵素変形体は例えばWO 89/06279(No vo Nordisk A/S)，EP 130,756(Genetech)，EP 479,870(Novo Nordisk A/S)，EP 214,435(Henkel)，WO 87/04461(Amgen)，WO 87/05050(Genex)，EP出願番号87303 761(Genetech)，EP 260,105(Gnencor)，WO 88/06624(Gist-Brocades NV)，WO 88 /07578(Genenteh)，WO 88/08028(Genex)，WO 88/08033(Amgen)，WO 88/08164(Ge nex)，Thomasら（1985）Nature，318375-376；Thomasら（1987）J．Mol．Biol. ，193，803-813；RusselとFersht（1987）Nature 328 496-500記載の同一材料と方法を用いて作成できる。部位指定変異の誘発変異誘発の前に、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を好適なベクターにクローン化しなければならない。特定の部位での変異誘発の方法を以下示す。まずポリペプチドをコードする遺伝子をクローン化し、それから変異を所望する部位を特定し、基の残基の内置換するものを決め、合成オリゴヌクレオチドを使ってこれら変異を導入する。これらオリゴヌクレオチドには所望の変異部位を挟むヌクレオチド配列が含まれる；変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成時に挿入される。好適は方法では、Kammannら（1989 ）Nucleic Acids Research 17(13)，5405とSarkar G．およびSommer，S．S．（1 990）：Biotechniques 8，404-407に記載の、ＤＯＥ−ＰＣＲ変異誘発法を用いて部位指定変異を誘発する。高分子の活性化注目のポリペプチドに結合させる高分子が活性型でない場合、適当な方法によりそれを活性化しなければならない。また、本発明によれば高分子はリンカーによりポリペプチドに結合されることも想定される。好適なリンカーは当業者に公知である。高分子を活性化するため、ならびにポリペプチドを結合するための方法および化学は文献によく記載されている。不溶性高分子の活性化により利用さえる方法には、ブロモシアン、過ヨウ素酸塩、グルタールアルデヒド、２エポキシド、エピクロロヒドリジン、ジヴィニルスルフォン、カルボジイミド、スルフォニルハロゲン化物、トリクロロトリアジン等による官能基の活性化を含む（R．F．Tayl or，（1991）“蛋白質固相化、基礎と応用（Protein immobilisation．Fundamen tal and applications）”，Marcel Dekker，N．Y．；S．s．Wong，（1992）、 “蛋白質結合と架橋の化学(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinki ng)”、CRC Press，Boca Raton；G．T．Hermansonら、(1993)、“固相化アフィニティーリガンド法（Immobilized Affinity Ligand Techniques）”、Academic Press，N．Y．を参照のこと）。しかし、不溶性高分子の活性化に関する方法の幾つか、例えば過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、スルフォニルハロゲン化物、ジビニルスルフォン、カルボジイミド等は可溶性高分子の活性化にも利用できる。高分子上にある官能基、アミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキル、アルデヒド、またはスルフィドリルと、蛋白質上に選択された付着基については、通常はｉ）高分子を活性化し、ｉｉ）結合させ、そしてｉｉｉ）残存活性基をブロックする工程より成る活性化と結合の化学を考慮しながら選択しなければならない。以下、簡単に好適な高分子活性化の方法を幾つか記載する。しかし、他の方法も利用できると理解される。ポリペプチドの遊離酸への高分子の結合はジイミドや例えばアミノ−ＰＥＧまたはヒドラジノ−ＰＥＧ(Pollakら、(1976)，K．Amr．Chem．Soc.，98，289-291 )またはジアゾ酢酸塩／アミド（Wongら、（1992）“蛋白質結合と架橋の化学(Ch emistry of Protein Conjyugation and Crosslinking)，CRC Press）の助けにより実施できるだろう。ヒドロキシ基への高分子の結合は、水中にて実施せねばならないことから極めて困難であることが多い。通常、ヒドロキシル基との反応より加水分解を選ぶ。遊離スルフヒドリル基との高分子の結合はマレイミドまたはオルト−ピリジルジスルフィドの様な特異基により実施できる。ビニルフルフォン（米国特許番号5, 414,135,(1995)，Snowら）もフルフヒドリル基を好むが、その選択度は他記載例に同じではない。ポリペプチド鎖の中の接近可能なアルギニン残基は、２個のビシナルカルボニル基から成る基の標的となる。求電子性に活性化したＰＥＧのリジンのアミノ基への結合を含む方法も有益である。アルコールの通常離脱基の多くがアミノ結合を形成する。例えば、トレシレートの様なアルキルスルフォン酸塩（ Nilssonら、(1984)，Methods in Enzymology第104巻、Jacoby，W．B，編、Acade mic Press：Orlando，P．56-66；Nilssonら、(1987)，Methods in Enzymology第 135巻、Mosbach，K，編、Academic Press：Orlando，pp．65-79；Scoutenら、(1 987)，Methods in Enzymology第135巻、Mosbach，K，編、Academic Press：Orla ndo，P．79-84；Crosslandら、(1971)，J．Amr．Chem．Soc．1971，93，pp．421 7-4219)，mesylates（Harris，(1985)，supra；Harrisら，(1984)，J．Polym．S ci．Polym．Chem．Ed．22，pp 341-352）、トシレートの様なアリルスルフォン酸塩、そしてパラ−ニトロベンゼンスルフォン酸塩が使用できる。例えば塩化トレシルの様な有機塩化スルフォニルは数多くの高分子、例えばＰＥＧの、ヒドロキシ基を効率的に良好な離脱基（スルフォン酸塩）に変換し、これがポリペプチド中にあるアミノ基の様な求核基と反応すれば、高分子とポリペプチドとの間に安定した結合を形成できる。高い結合率に加え、反応条件も一般に穏やか（変性を避けるために中性もしくは多少アルカリ側ｐＨ、で活性の消失はないかほとんど無い）であり、ポリペプチドに対する比破壊条件も満たしている。トシレートはメシレートより活性であるが、より不安定でもありＰＥＧ、ジオキサン、そしてスルフォン酸に分解する（Alipsky，(1995)，Bioconhugate Chem ，6，150-165）。エポキシドもまたアミノ結合形成に利用されるが、上記基に比べて反応性は低い。ＰＥＧをフォスジェンでクロロフォルム塩に変換すると、リジンと結合可能なカルバミルエステルとなる。これは、クロリンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド (米国特許番号5,133,614，（1992）；zalipskyら、（1992）Biotechnol．Appl． Biochem.，15．p．100-114；Monfardiniら、(1995)，Bioconjugate Chem.，213 ，pp 309-31 9)、パラにトロフェノール、DMAP(欧州特許番号632 082 A1,(1993)，Looze，Y.) 等での置換に様々な形で利用できる。誘導体は通常クロロフォルムエステルを所望の離脱基を反応させて作られる。これらの基は全てペプチドに対するカルバミル酸エステル結合を生じる。さらにイソシアネートおよびイソチオシアネートは、それぞれ尿素およびチオ尿素の生成に利用できる。アミドは上記と同一の離脱基を環状イミド冠（米国特許番号5,349,001(1994) ，Greenwaldら）を用いて得ることがでｋりいる。これら化合物の反応性は極めて高いが、速やかに加水分解を起こす。無水コハク酸との反応から得られるＰＥＧコハク酸塩も利用できる。それにより構成されるエステル基により結合体はより加水分解に感受性となる（米国特許番号5,122,614，(1992)，Zalipsky）。この期はＮ−ヒロドキシスクシンイミドで活性化できる。さらに特殊なリンカーを導入できる。最も古い例は塩化シアヌル酸（Abuchows kiら、(1977)，J．Biol．Chem.，252．3578-3581；米国特許番号4,179,337，(19 79)，Davisら；Shaferら、(1986)，J．Polym．Sci．Polym．Chem．編、24，375- 378。芳香族アミンのへのＰＥＧの結合をジアゾ化することで、その場（in situ）でペプチドと反応できる反応性の高いジアゾニウム塩が生成される。アミド結合もまた、ＰＥＧのアザラクトン誘導体を反応させて得ることができ（米国特許番号5,321,095，(1994)，Greenwald，R．B.）、追加のアミド結合を誘導する。リジンを多く含まないペプチドもあるので、１つのリジンに１つ以上のＰＥＧを結合することは有益である。これは例えば１，３−ジアミノ−２−プロパノールを利用し実施できる。ＰＥＧもまたカルバミルエステル結合を介してアミノ基と結合できる（WO 95/11924，Greenwaldら）。リジン残基も主鎖として利用できる。実施例に利用される結合法はWO 90/13590（Enzon）記載のＮ−スクシンイミジル炭酸結合法である。改良された結合体の製造方法以下の工程より成る、改良されたポリペプチド−高分子結合体の製造方法を提供することも本発明の目的の一つである：ａ）注目の親ポリペプチドの３Ｄ構造の表面に位置するアミノ酸残基を特定し、ｂ）当該親ポリペプチドの当該３Ｄ構造の表面にあり変異を起こすべき標的アミノ酸を選択し、ｃ）ｉ）前記工程ｂ）で選択された１つ以上のアミノ酸残基を好適な付着基を有するアミノ酸で置換、またはそれを挿入し、そして／または、ｉｉ）前記工程ｂ）で選択された機能部位そのもの、またはそれに近接する１つ以上のアミノ酸残基を置換し、または除去し、ｄ）変異したポリペプチドに高分子を結合させる。工程ａ）親ポリペプチドの表面に位置するアミノ酸残基の特定３次元構造（３Ｄ−構造）発明の方法を実施するためには、注目の親ポリペプチドの３次元構造が必要である。この構造は例えばＸ−線構造、ＮＭＲ構造またはモデル構築構造でよい。 Brookhaven DatabankはＸ−線−およびＮＭＲ−構造の情報源である。モデル構築構造は、注目のポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性を有する相同ポリペプチドの３Ｄ−構造が１つ以上存在すれば、当業者による作成は可能である。モデル構造の構築に利用できるソフトウエアーパッケージが幾つかある。１例はBiosymのHomology 95.0パッケージである。モデル構造の構築に必要な典型的な作業は次の通りである：存在する３Ｄ−構造に会わせた相同配列の並びかえ、構造的に保存された領域（ＳＣＲｓ）の特定し、対応するＳＣＲｓを見つけ、構造データベースで可変域と置き換えられる構造断片／ループを検索し、これら領域に対応し割付を行い、そしてエネルギー状態が最少となるような構造上の微調整を行う。既知の３Ｄ−構造に比べて大きな挿入（３残基以上）体を含む領域はモデルと大きく異なることが知られており、構造の推定には注意が必要である。問題のポリペプチドの３Ｄ−構造を、または既知構造体との相同性に基づいた構造モデルを得たら、この構造は以下の方法の微調整に必須の前提条件となる。工程ｂ）変異の標的となるアミノ酸残基の選択本発明によれば、変異を起こす標的アミノ酸残基は、遊離アミノ基（−ＮＨ₂ ）または遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の様な付着基をポリペプチド表面上に追加しもしくは減少し、そして／またはポリペプチド表面上のエピトープをより完全かつ広範囲に覆うために選択される。保存的置換保存的な置換はポリペプチド構造への変異の影響が限定されることから、ポリペプチド中では該保存的置換を行うことが好ましい。アミノ基を加える場合にはアルギニをリジンに置換して実施でき、両残基はともに正に荷電しているが遊離アミノ基を持つリジンのみが付着基として好適である。カルボキシル酸基を付加する場合の保存的置換は、例えばアスパラギンをアスパラギン酸またはグルタミンをグルタミン酸への置換であろう。これらの残基はカルボキシル基が酸性残基だけに存在すること以外、大きさ、形とも互いに似ている。例えば活性部位そのもの、またはそれに近接した付着基の数を減らす場合、リジンはアルギニンに置換でき、などである。どのアミノ酸を置換するかは原則的には利用する化学結合法による。非−保存的置換変異は保存性の低い／保存的でない標的アミノ酸残基に対しても実施できる。この様な変異は、保存的置換により得ることができるものに比べ、より完全かつ広範囲なポリペプチド表面の被覆を得るのに好適である。本発明の方法をまず一般的な形で記述し、ついで具体的な実施例により記述する。なお以下の用語を使用する。付着基：高分子に結合できる残基、例えばリジン（アミノ基）またはアスパラギン酸／グルタミン酸（カルボキシル基）。Ｎ−またはＣ−末端アミノ基／カルボキシル基が関係する場合には、これも含める。変異残基：変異を起こされるべき残基、例えばアルギニンまたはアスパラギン／グルタミン。必須触媒残基：触媒機能に必須であることが知られている残基、例えばセリンプロテアーゼの触媒トライアド。溶媒露出残基（溶媒に露出された残基）：モジュールHomology 95.0の中のBIO SYM/INSIGHTアルゴリズムに従った場合、少なくとも５％が露出されている残基として定義される。コマンドの順番は次の通りである： Homology→ProStat→Access＿Surf→Solv＿Radiusl．4：Heavy atoms only；Rad ii source VdW；出力：機能域；極性ソース：デフォルト。filename＿area．tab ファイルを作成。注意：このプログラムを適切に作動させるためには全ての水分子を最初に構造から除かねばならない。例えば次の様になる：・・続く１．最も近接する付着基から１０オングストローム以上離れた残基と必須触媒残基から少なくとも８オングストローム離れた残基を特定する。この残基のサブセットはＲＥＳＴと呼ばれ、付着残基置換への保存的変異残基の一次域である。２．サブセットＲＥＳＴの周り０〜５オングストロームの領域内に存在するが、必須触媒残基からは少なくとも８オングストローム離れている残基を特定する。この残基サブセットはＳＵＢ５Ｂと呼ばれる。これは付着残基置換への保存的変異残基の二次域であり、ＳＵＢ５Ｂ内の付着基に結合するリガンドはＲＥＳＴ域まで分布し、エピトープ認識を妨害する可能性がある。３．付着残基導入の潜在変異領域としてＲＥＳＴおよびＳＵＢ５Ｂ内の溶媒露出変異残基を特定する。４．BIOSYM/INSIGHTの生体高分子モジュールを使い上記３で特定した残基を置換する。５．上記１〜２を繰り返し、サブセットＲＥＳＴｘを作る。このサブセットには最寄りの付着残基から１０オングストローム以上離れた残基および、必須触媒残基から少なくとも８オングストロームの位置にある残基が含まれる。６．RESTxの溶媒露出残基を特定する。付着残基を導入する低／非保存的変異のための潜在的部位がある。工程Ｃ）アミノ酸残基の置換、挿入または削除工程Ｃ）で実施される変異は部位指定変異誘発法の様な当業者公知の標準技術により実施できる（Sambrookら(1989)，Sambrookら、Molecular Cloning．A Lab oratory Manual，Cold Spring Harbor，NU．を参照のこと。核酸置換の一般記事は例えばFordら、1991、蛋白質発現と精製（Protein Expr ession and Purification 2，p．95-107）に見ることができる。工程ｄ）修飾された親酵素への高分子の結合本発明のポリペプチド−高分子結合体は上記技術を含む当業者公知の結合法により製造できる。注目のポリペプチドへの高分子の結合ポリペプチドに結合する高分子が活性化されていない場合には、これを好適な方法により活性化する必要がある。高分子はリンカーによりポリペプチドに結合できる。好適なリンカーは当業者に公知である。高分子の活性化ならびにポリペプチドの結合のために方法と化学は文献に詳しく記述されている。不溶性高分子の活性化に通常用いる方法にはに高分子を活性化するため、ならびにポリペプチドを結合するための方法と化学は文献によく記載されている。不溶性高分子の活性化により利用さえる方法には、ブロモシアン、過ヨウ素酸塩、グルタールアルデヒド、２エポキシド、エピクロロヒドリジン、ジヴィニルスルフォン、カルボジイミド、スルフォニルハロゲン化物、トリクロロトリアジン等による官能基の活性化を含む（R．F．Taylor，（1991）“蛋白質固相化。基礎と応用（Protein immobilisation．Fundamental and applications）”，Marcel Dekker，N．Y．；S．s.Wong，（1992）、“蛋白質結合と架橋の化学(Chemistry of Prote in Conjugation and Crosslinking)” 、CRC Press，Boca Raton；G．T．Hermansonら、(1993)、“固相化アフィニティーリガンド法（Immobilized Affinity Ligand Techniques）”、Academic Press ，N．Y．を参照のこと）。しかし、不溶性高分子の活性化に関する方法の幾つか、例えば過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、スルフォニルハロゲン化物、ジビニルスルフォン、カルボジイミド等は可溶性高分子の活性化にも利用できる。高分子上にある官能基、アミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキル、アルデヒド、またはスルフィドリルと、蛋白質上に選択された付着基については、通常はｉ）高分子を活性化し、ｉｉ）結合させ、そしてｉｉｉ）残存活性基をブロックする工程より成る活性化と結合の化学を考慮しながら選択しなければならない。以下、簡単に好適な高分子活性化の方法を幾つか記載する。しかし、他の方法も利用できると理解される。ポリペプチドの遊離酸への高分子の結合はジイミドや例えばアミノ−ＰＥＧまたはヒドラジノ−PEG(Pollakら、(1976)，K．Amr．Chem．Soc.，98，289-291)またはジアゾ酢酸塩／アミド(Wongら、（1992）“蛋白質結合と架橋の化学（Chemi stry of Protein Conjyug ation and Crosslinking）”、CRC Press)の助けにより実施できるだろう。ヒドロキシ基への高分子の結合は、水中にて実施せねばならないことから極めて困難であることが多い。通常、ヒドロキシル基との反応より加水分解を選ぶ。遊離スルフヒドリル基との高分子の結合はマレイミドまたはオルト−ピリジルジスルフィドの様な特異基により実施できる。ビニルフルフォン（米国特許番号5, 414,135,(1995)，Snowら）もフルフヒドリル基を好むが、その選択度は他記載例に同じではない。ポリペプチド鎖の中の接近可能なアルギニン残基は、２個ビシナルカルボニル基から成る基の標的となる。求電子性に活性化したＰＥＧのリジンのアミノ基への結合を含む方法も有益である。アルコールの通常離脱基の多くがアミノ結合を形成する。例えば、トレシレートの様なアルキルスルフォン酸塩(Nilssonら、(1984)，Methods in Enzymol ogy第104巻、Jacoby，W．B，編、Academic Press：Orlando，P．56-66；Nilsson ら、(1987)，Methods in Enzymology第135巻、Mosbach，K，編、Academic Press ：Orlando，pp．65-79；Scoutenら、(1987)，Methods in Enzymology第135巻、M osbach，K，編、Academic Press：Orl ando，P．79-84；Crosslandら、(1971)，J．Amr．Chem．Soc．1971，93，pp．42 17-4219)，mesylates（Harris，(1985)，supra；Harrisら、(1984)，J．Polym． Sci．Polym．Chem．Ed．22，pp 341-352）、トシレートの様なアリルスルフォン酸塩、そしてパラ−ニトロベンゼンスルフォン酸塩が使用できる。例えば塩化トレシルの様な有機塩化スルフォニルは数多くの高分子、例えばＰＥＧの、ヒドロキシ基を効率的に良好な離脱基（スルフォン酸塩）に変換し、これがポリペプチド中にあるアミノ基の様な求核基と反応すれば、高分子とポリペプチドとの間に安定した結合を形成できる。高い結合率に加え、反応条件も一般に穏やか（変性を避けるために中性もしくは多少アルカリ側ｐＨ、で活性の消失はないかほとんど無い）であり、ポリペプチドに対する比破壊条件も満たしている。トシレートはメシレートより活性であるが、より不安定でもありＰＥＧ、ジオキサン、そしてスルフォン酸に分解する（Alipsky，(1995)，Bioconhugate Chem ，6，150-165）。エポキシドもまたアミノ結合形成に利用されるが、上記基に比べて反応性は低い。ＰＥＧをフォスジェンでクロロフォルム塩に変換すると、リジンと結合可能なカルバミルエステルとなる。これは、クロリンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド (米国特許番号5,133,614，（1992）；zalipskyら、（1992）Biotechnol．Appl． Biochem.，15．p．100-114；Monfardiniら、(1995)，Bioconjugate Chem.，213 ，pp 309-319)、パラにトロフェノール、DMAP(欧州特許番号632 082 A1，(1993) ，Looze，Y.)等での置換に様々な形で利用できる。誘導体は通常クロロフォルムエステルを所望の離脱基を反応させて作られる。これらの基は全てペプチドに対するカルバミル酸エステル結合を生じる。さらにイソシアネートやイソチオシアネートは、それぞれ尿素とチオ尿素の生成に利用できる。アミドは上記と同一の離脱基を環状イミド冠（米国特許番号5,349,001(1994) ，Greenwaldら）を用いて得ることがでｋりいる。これら化合物の反応性は極めて高いが、速やかに加水分解を起こす。無水コハク酸との反応から得られるＰＥＧコハク酸塩も利用できる。それにより構成されるエステル基により結合体はより加水分解に感受性となる（米国特許番号5,122,614，(1992)，Zalipsky）。この期はＮ−ヒロドキシスクシンイミドで活性化できる。さらに特殊なリンカーを導入できる。最も古い例は塩化シアヌル酸（Abuchows kiら、(1977)，J．Biol．Chem.，252．3578-3581；米国特許番号4,179,337，(19 79)，Davisら；Shaferら、(1986)，J．Polym．Sci．Polym．Chem．編、24，375- 378。芳香族アミンのへのＰＥＧの結合をジアゾ化することで、その場（in situ）でペプチドと反応できる反応性の高いジアゾニウム塩が生成される。アミド結合もまた、ＰＥＧのアザラクトン誘導体を反応させて得ることができ（米国特許番号5,321,095，(1994)，Greenwald，R．B.）、追加のアミド結合を誘導する。リジンを多く含まないペプチドもあることから、１つのリジンに１つ以上のＰＥＧを結合することは有益である。これは例えば１，３−ジアミノ−２−プロパノールを利用し実施できる。ＰＥＧｓもまたカルバミルエステル結合を介してアミノ基と結合できる（WO 9 5/11924，Greenwaldら）。リジン残基も主鎖として利用できる。付着基の付加ＰＤ４９８変形体−ＳＰＥＧ結合体の具体例プロテアーゼの具体例は親PD498（WO/93/24623および配列番号２）である。親 PD498は分子量２９ｋＤａである。リジンおよびアルギニン残基の位置は次の通りである。発明者らは表面のどの親ＰＤ４９８部位が追加の付着基の導入に好適であるか調べた。Ａ．親ＰＤ４９８のアルギニンからリジンへの好適な保存的置換はＲ５１Ｋ、Ｒ６２Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１６９Ｋ、Ｒ２５０Ｋ、Ｒ２８Ｋ、Ｒ１９０Ｋのいずれでもよい。Ｂ．親ＰＤ４９８の好適な非保存的置換はＰ６Ｋ，Ｙ７Ｋ，Ｓ９Ｋ，Ａ１０Ｋ，Ｙ１１Ｋ，Ｑ１２Ｋ，Ｄ４３Ｋ，Ｙ４４Ｋ，Ｎ４５Ｋ，Ｎ６５Ｋ，Ｇ８７Ｋ，１８８Ｋ，Ｎ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｋ．Ｎ２１６Ｋ，Ｎ２１７Ｋ，Ｇ２１８Ｋ，Ｙ２１９Ｋ，Ｓ２２０Ｋ，Ｙ２２１Ｋ、Ｇ２６２Ｋのいずれでもよい。活性部位そのもの、またはその近傍にリジン残基は無いため、付着基の除去の必要はない。ＰＤ４９８変形体−ＳＰＥＧ結合体は上記ＰＤ４９８変種を出発材料とし、高分子を酵素のアミノ基に結合する当業者公知のいずれかの方法により調製できる。具体例を以下記載する。付着基の除去ＢＰＮ’変形体−ＳＰＥＧ結合体の具体例活性部位に付着基を持つプロテアーゼの具体例は、１１の付着基（およびＮ− 末端のアミノ基）を持つＢＰＮ’である：ＢＰＮ’の分子量は２８ｋＤａである。リジンとアルギニン残基の位置は次の通りである。活性部位０〜５オングストローム以内に位置するリジン残基は本発明により有益に除去できる。特に、Ｋ４９Ｒ置換により実施できる。ＢＰＮ’変形体−ＳＰＥＧ結合体は上記のＢＰＮ’変形体を出発材料とし、酵素のアミノ基に高分子を結合させる当業者公知のいずれかの技術により調整できる。付着基の付加および除去 SaviaseR-SPEG 結合体の具体例実施例２に記載の如く、親Savinase^R（von der Ostenら、（1993），Journal of Biotechnology，28，ｐ55+および配列番号３）は、本発明により表面へ複数のアミノ付着基を加えることができ、活性部位の近傍のアミノ付着基を除去できる。親Savinase^Rでは、次の置換のいずれかが変異導入部位である：Ｒ１０Ｋ、Ｒ１９Ｋ，Ｒ４５Ｋ，Ｒ１４５Ｋ，Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１８６ＫとＲ２４７Ｋ。置換Ｋ９４Ｒは、活性部位に近接した高分子の付着を阻止するに好適な変異とされる。 Sainase^R変形体−ＳＰＥＧ結合体は、上記のSavinase^R変種を出発材料とし、酵素のアミノ基に高分子を結合させる当業者公知のいずれかの結合技術により調整できる。付着基の付加フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ変形体−ＳＰＥＧ結合体の具体例親フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）DSM 4109リパーゼ（配列番号６）を置換主鎖として用いて免疫原性を下げたリパーゼ変種の具体例を以下に列記する。修飾されていない親フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼはＮ−末端ＮＨ₂基を含め８個の付着基を持ち、分子量や約２９ｋＤａである。Ａ．親リパーゼに於けるアルギニンからリジンへの好適な保存的置換はＲ１３３Ｋ，Ｒ１３９Ｋ，Ｒ１６０Ｋ、Ｒ１７９Ｋ、Ｒ２０９Ｋ、Ｒ１１８ＫとＲ１２５Ｋのいずれでも良い。親リパーゼに於ける好適な非保存的置換は以下のいずれでも良いＡ１８Ｋ，Ｇ３１Ｋ，Ｔ３２Ｋ，Ｎ３３Ｋ，Ｇ３８Ｋ，Ａ４０Ｋ，Ｄ４８Ｋ，Ｔ５０Ｋ，Ｅ５６Ｋ，Ｄ５７Ｋ，Ｓ５８Ｋ、Ｇ５９Ｋ、Ｖ６０Ｋ、Ｇ６１Ｋ、Ｄ６２Ｋ，Ｔ６４Ｋ，Ｌ７８Ｋ，Ｎ８８Ｋ，Ｇ９１Ｋ，Ｎ９２Ｋ，Ｌ９３Ｋ，Ｓ１０５Ｋ，Ｇ１０６Ｋ、Ｖ１２０Ｋ，Ｐ１３６Ｋ，Ｇ２２５Ｋ、Ｌ２２７Ｋ、Ｖ２２８Ｋ、Ｐ２２９Ｋ，Ｐ２５０Ｋ，Ｆ２６２Ｋ。フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼに於けるさらに好適な非保存的置換は：Ｅ８７ＫとＤ２５４Ｋを含む。リパーゼ変形体−ＳＰＥＧ結合体は、上記のリパーゼ変種を出発材料とし、酵素のアミノ基に高分子を結合させる当業者公知のいずれかの結合技術により調整できる。下記実施例１２では、Ｅ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ置換を有するフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変形体とS-PEG 15,000との結合体が、対応する親無修飾酵素に比べてＢａｌｂ／Ｃマウスに於ける免疫反応が低下することが示される。免疫原性およびアレルギー原性 “免疫原性”とは“抗原性”や“アレルギー原性”に比べ広義のことばであり、異物の存在に対する免疫系の反応を表している。当該異物は惹起する免疫反応に応じて免疫系、抗原およびアレルゲンと呼ばれる。 “免疫源”とは、動物やヒトの循環器系に導入されると免疫反応を刺激し免疫グロブリンの形成をもたらす物質として定義できる。 “抗原”とは、それが非自己分子として認識された時、それ自体で抗体を産生できる物質である。さらに“アレルゲン”とは、アレルギー性感作またはＩｇＥによるアレルギー性反応を起こすことができる抗原として定義できる（ヒトにおける、ならびに動物における相同の効果を持つ分子）。免疫原性の評価免疫原性の確認は、皮下投与により免疫原を動物の循環系に導入し、その反応を対応する親ポリペプチドの反応と比較し実施できる。本発明によるヒトおよび動物の体の“循環系”とは、主に心臓と血管よりなる系を意味する。心臓は血管系の血流維持のために必要なエネルギーを提供する。循環系は動物の輸送系として機能し、血液はＯ₂、栄養物、ホルモンやその他細胞制御に重要な物質を組織に運搬する。さらに、血液は組織からＣＯ₂を除去して肺に運び、また残りの物質を例えば腎臓に運ぶ。さらに、血液は体温制御や、免疫系を含む防御メカニズムにとっても重要である。ポリペプチドの免疫原能を評価するための、インビトロ（in vitro）動物モデルが幾つかある。これらのモデルの幾つかはヒトでのハザードを評価するために好適な基礎を提供する。好適なモデルにはマウスモデルが含まれる。このモデルはＢａｌｂ／ｃマウスに皮下に変更したポリペプチドと変更していないポリペプチドを投与し、ＩｇＧ反応の形で免疫反応を評価しようとするものである。また、免疫能を評価するための別の動物モデルも利用できる。本発明に於ける“免疫原性が低下した”ポリペプチドとは、循環系に導入したときに対応する親ポリペプチドと比較して、産生抗体量、例えばヒトでの免疫グロブリンや、特定の動物において免疫反応を誘導でき、同等の効果を持つ分子の量が有意に減少するものを意味する。Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、ＩｇＧ反応がポリペプチドの免疫原性の良好な指標となる。アレルギー原性の評価アレルギー原性の評価は気管内（気管の中に）に投与された親酵素の効果と、それに対応する本発明により変更された酵素の効果を比較する吸引試験により行うことができる。酵素のアレルギー原性を評価するためにインビボ(in vivo)動物モデルが幾つかある。これらモデルの幾つかはヒトに於けるハザード評価のための好適な基礎を提供する。好適なモデルにはモルモットモデルとマウスモデルが含まれる。これらモデルは、事前に感作された動物に誘導される誘因反応作用体として呼吸アレルゲンを同定するものである。これらのモデルによれば、検証対象のアレルゲンは気管を通して動物内に導入される。モルモットの好適な株はDunkin Hartley株で、ヒトと異なりアレルギー反応に関連してＩｇＥ抗体を産生しない。しかし、これら動物は別のタイプの抗体、ＩｇＧ１ＡとＩｇＧ１Ｂを産生し（Prento，ATLA，19，-8-14，1991参照）、これら抗体が酵素を含む吸引ポリペプチドに対するアレルギー反応に関与している。従って、Dunkin Hartley動物モデルを利用する場合には、ＩｇＧ１ＡとＩｇＧ１Ｂの相対量がアレルギー原性のレベル値である。Ｂａｌｂ／ｃマウス株は気管内暴露に好適である。Ｂａｌｂ／ｃマウスはアレルギー反応としてＩｇＥを産生する。モルモットとマウスに於ける呼吸アレルゲンの評価の詳細はKimberら、(1996) ，Fundametal and Applied Toxicology，33，p．1-10に記載されている。ラット、ウサギ等のその他の動物モデルも比較試験に使用できる。組成物本発明は、本発明のポリペプチド−高分子結合体を含む組成物に関する。本組成体は医薬品または工業組成物である。本組成物はさらに別のポリペプチド、蛋白質、または酵素と／または固形石鹸を含む洗剤、家庭用品、農薬、スキンケア組成体を含む個人用ケア製品、コンタクトレンズ洗浄剤を含む線上組成体、口腔ならびに皮膚用医薬品、衣服処理用組成体、例えばパン製造の様な食品製造用組成物や資料等に通常使用されている成分を含むこともできる。ポリペプチド−高分子結合体の利用本発明はまた、ポリペプチドの免疫反応を低減することを目的とした本発明の方法の利用にも関する。本発明のポリペプチド−高分子結合体を使い、洗濯洗剤、ディスク洗浄や機器表面洗浄用洗剤といった洗剤の様な工業製品や食物または飼料製品のアレルギー原性を低下させることも、本発明の目的の一つである。材料および方法材料酵素： PD498：WO 93/24623に示すサブチリシン型プロテアーゼ。ＰＤ４９８の配列を配列番号１と２に示す。 Savinase^R（Novo Nordisk A/Sより入手可能）フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ：Novo Nordiskよりlipolase^Rとして入手可能であり、EP305，216に詳細記載されている。ＤＮＡおよび蛋白質の配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。株バシルス・スブチリス(B．subtilis)３０９および１４７はバシルス・レンタス(Bacillus lentus)の変種であり、ＮＣＩＢの寄託されＮＣＩＢ受付番号10309と10147が付与されており、ここに参照され採用されている米国特許番号3,723,250に記載されている。大腸菌（E．coli）MC 1000（M．J．CasadabanおよびS．N．Cohen（1980）；J ．Mol．Biol．136 179-207）は通常の方法により作成されたｒ−、ｍ＋であり、米国特許出願番号039,298にも記載されている。ベクター pPD498：PD498プロテアーゼをコードする野生型遺伝子（配列番号２）を含む大腸菌(E．coli)−バシルス・スブチリス(B．subtilis)シャトルベクター（米国特許番号5,621,089、第6，2，1，6節に記載）。同一ベクターは大腸菌(E．coli) での変異誘発、およびバシルス・スブチリス(B．subtilis)での発現にも用いられる。一般的分子生物学的方法特記ない限り、ＤＮＡ操作と形質転換については分子生物学での標準的方法を用いて実施した（Sambrookら（1989）Molecular cloning：A laboratory manual ，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F．M．ら、（ eds.）“分子生物の最新プロトコール（Current protocols in Molecular Biolo gy）”．John Wiley and Sons，1995；Harwood，C．R.，and Cutting，S．M．（ eds）“枯草菌の分子生物学的方法(Molecular Biological Methods for Bacillu s”．John Wiley and Sons，1990)。ＤＮＡ操作のための酵素は販売会社の仕様に従い実施した。材料、化学薬品と液西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗−ラット−Ｉｇ（Dako，DK， P162，＃031；希釈率１：１０００）マウス抗−ラットＩｇＥ（Serotec MCA193；希釈率１：２００）ラット抗−ラットＩｇＥ（Serotec MCA419；希釈率１：１００）ビオチン−標識マウス抗−ラットＩｇＧ１モノクロナール抗体（Zymed 03-9 140；希釈率１：１０００）ビオチン−標識マウス抗−マウスＩｇＧ１モノクロナール抗体（Serotec MC A336B；希釈率１：１０００）ストレプトアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼ（Kirkegard & Perry 14-3 0-00；希釈率１：１０００）。 CovaLink NH2プレート（Nunc、カタログ番号459439）塩化シアヌル酸（Aldrich）アセトン（Merck）ラット抗−マウスＩｇＧ１、ビオチン（SeroTec、カタログ番号MCA336B）ストレプトアビジン、パーオキシダーゼ（ＫＰＬ）オルト−フェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）（Kem-en-Tec）過酸化水素、３０％（Merck） Tween20（Merck）スキムミルク粉（Difco）硫酸（Merck）緩衝液と溶液：炭酸緩衝液（0.1M，pH10（１リッター）Na₂CO₃ 10.60ｇＰＢＳ（pH7.2(１リッター)） NaCl 8.00ｇ KC1 0.20ｇ K₂HPO₄ 1.04ｇ KH₂PO₄ 0.32ｇ洗浄緩衝液ＰＢＳ、0.05％（ｖ／ｖ）Tween20 ブロッキング緩衝液ＰＢＳ、２％（wt／ｖ）スキムミルク粉希釈緩衝液ＰＢＳ、0.05％（ｖ／ｖ）Tween20，0.5％（wt／ｖ）スキムミルク粉クエン酸緩衝液（0.1M，pH5.0-5.2（１リッター））クエン酸ナトリウム 20.60ｇクエン酸 6.30ｇ CovaLink プレートの活性化・１０ｍｇ塩化シアヌル酸／ｍｌアセトンのストック液を新たに作成する。・使用直前に、攪拌しながら塩化シアヌル酸ストック液をＰＢＳで最終濃度１，ｇ／ｍｌまで希釈する。・１００μｌの希釈液をCovaLinkNH２プレートの各ウエルに加え、室温で５分間反応させる。・ＰＢＳで３回洗浄する。・あらたに調製した活性化プレートを５０℃で３０分間乾燥させる。・各プレートをシーリングテープで素早くシールする。・前活性化プレートはプラスチックバック内では室温で３週間保存可能である。硼酸ナトリウム、硼砂（Sigma）３，３−ジメチルグルタール酸（Sigma）Ｃａｌ₂（Sigma）塩化トレシル（２，２，２−トリフルオロエタンスルフォニルクロライド）（Fluka）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Fluka）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Fluka製品番号56480）フォスゲン（Fluka製品番号79380）ラクトース（Merck 7656）ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）Sigmaよりスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラ−ニトロアニリド（Suc-AAPF-pNP）Sigma no．S-7388、分子量624.9g／mole。発色基質：ＯＰＤ：ｏ−フェニレン−ジアミン、（Kemetecカタログ番号4260）試験動物 Dunkin Hartleyモルモット(Charles River，DEより）雌Galb／ｃマウス（約２０ｇ）、Bomholdtgaard，Ry，Denmarkより購入。装置： XCEL II（Novex） HPLCリーダー（UVmax，Molecular Devices） HPLC（Waters） PFLC（Pharmacia） Superdex−75カラム、Mono−Ｑ、Mono−Ｓ、Pharmacia，SWより。 SLT：SLT LabInstrumetnsよりフォトメーターサイズ排除型クロマトグラフ（Spherogel TSK-G2000 SW）サイズ排除型クロマトグラフ（Superdex 200，Pharmacia，SW）アミコンセルＤＮＡ操作用酵素特にことわらない限り、ＤＮＡ操作の使用する全ての酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ当はNew England Biolabs．Incより得た。方法ＩｇＧ１陽性モルモットを決めるためのELISA操作 ELISAマクロタイタープレートをウサギ抗−ＰＤ４９８の炭酸緩衝液１：１８０００でコートし、４℃で一晩反応させる。翌日、プレートを２％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、PBS Tween20で３回洗浄する。１μｇ／ｍｌのＰＤ４９８をプレートに加えて、１時間反応させ、PBS Tween20で３回洗浄する。全てのモルモットのサンプルとコントロールについて、２μｌの血清と９８μ ｌのＰＢＳをELISAプレートに加えて１時間反応し、PBS Tween20で３回洗浄した。次に、ヤギ抗−モルモットＩｇＧ１（１：４０００、ＰＢＳ緩衝液中（Nordic Immunology 44-682））をプレートに加え、１時間反応し、PBS Tween20で洗浄した。アルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗−ヤギを１：８０００(Sigma A4187) を加え、１時間反応させ、PBS Tween20で２回とジエタノールアミン緩衝液で１回洗浄した。ｐ−ニトロフェニルリン酸を用いて標識アルカリフォスファターゼを３０分、３７℃、または適当な色がでるまで発色させる。停止液（ＥＤＴＡを含むＫ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₃緩衝液（ｐＨ１０））で反応を止め、ELISAリーダーにて４０５／６５０のＯＤを測定した。全てのELISAプレートには二重盲検サンプルを加えた。陽性血清と陰性血清の値は、盲検サンプルの平均値に標準偏差の２倍の値を加えた値として計算した。この場合の正確性は９５％である。分子量の決定蛋白質は４〜２０％の勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル(Novex)を用いた標準法による電気泳動で分離した。蛋白質は銀染色により検出した。分子量はNove xより入手したMark−12^R広域分子量の移動度に対し測定した。プロテアーゼ活性 Suc-Ala-Ala-Pro-pNa による解析：プロテアーゼでペプチドとｐ−ニトロアニリン間の結合を切断し、４０５ｎｍ吸収波長を持つ可視黄色を得る。緩衝液：例えばBritton and Robinson緩衝液ｐＨ８．３基質：１００ｍｇ su c-AAPF-pNaを１ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。これから１００μｌを取り、１０ｍｌのBrittoon and Robinson緩衝液に加え希釈する。基質とプロテアーゼ液を混合し、４−５ｎｍの吸収を時間の関数とＡＢＳ405 ｎｍ／分として測定する。温度はコントロールする（プロテアーゼにより２０− ２５℃）。これをサンプル中のプロテアーゼ活性値とする。蛋白質分解活性本発明による蛋白質分解活性とは、Kilo NOVOプロテアーゼ単位（KNPU）で表現される蛋白質分解活性である。本活性は標準酵素（SAVINASE＿）に対し決定され、その決定は標準条件、即ち５０℃、ｐＨ８．３、反応時間９分、測定時間３分、における蛋白質分解酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）の消化に基づく。ここに参照され含まれるフォルダーAF 220／１はNovo Nordisk A/S，Denmark に要求すれば入手できる。１ＧＵは１グリシン単位であり、標準条件下、４０℃、基質であるＮ−アセチルカゼインと１５分間反応した時に、１mmoleのグリシンに等しい量のＮＨ２− 基を生じる蛋白質分解酵素活性として定義される。酵素活性は、Journal of American Oil Chemists Society，Rothgeb，T．M.， Goodlander，B．D.，Garrison，P．H.，およびSmith，L．A.，(1988)に記載の可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトロフェノールとの反応に基づくＰＮＡアッセーでも測定できる。ＰＤ４９８変形体の発酵バシルス・スブチリス(B．subtilis)のＰＤ４９８変種の発酵は、１００ｍｌのＢＰＸ培養液を含む５００ｍｌのバッフル型エーレンマイヤーフラスコ中、回転シェイキングテーブル上、３０℃で５日間行った。例えば２リッターのブロスを処理するためには、２０個のエーレンマイヤーフラスコで同時に発酵させる。培養液：ＢＰＸ：組成（１リッター当たり）ポテトデンプン１００ｇ粉砕大麦５０ｇ大豆粉２０ｇＮａ₂ＨＰＯ₄×１２Ｈ₂Ｏ９ｇプルロニック０．１ｇカゼインナトリウム１０ｇ培養液中のデンプンはα−アミラーゼで溶解し、この培養液を１２０℃、４５分間加熱し滅菌する。滅菌後、０．１ＭまでのＮａＨＣＯ₃で培養液のｐＨを９に合わせる。ＰＤ４９８変形体の精製およそ１．６リッターのＰＤ４９８変形体発酵ブロスを１リッターのビーカーで５０００ｒｐｍ、３５分間遠心分離する。上清を１０％酢酸でｐＨ７．０に調製し、Sitz Supra S100フィルタープレートで濾過する。濾液をAmicon CH2A UF ユニットを装着したAmicon SIY10 UF遠心分離器でおよそ４００ｍｌまで濃縮する。ＵＦ濃縮液は室温でBacitracinアフィニティーカラムに室温、ｐＨ７に吸着させる前に、遠心分離、濾過する。ＰＤ４９８変形体はバシトラシン（Bacitrac in）カラムより、０．０１ジメ−チル−グルタール酸、０．１Ｍ硼酸と０，００２Ｍ塩化カルシウムでｐＨ７に調製された２５％２−プロパノールと１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で室温下に溶出される。バシトラシン精製工程よりプロテアーゼ活性分画を集め、０．０１ジメチルグルタール酸、０．１Ｍ硼酸と０．００２Ｍ塩化カルシウムを含む、ｐＨ６に調製された緩衝液で平衡化した７５０ｍｌのSephadex G25カラム（直径５ｃｍ）にかける。 Sephadex G25カラムからの蛋白質分解活性分画を一つに集め、０．０１Ｍジメチルグルタール酸、０．１Ｍ硼酸と０．００２Ｍ塩化カルシウムを含む、ｐＨ６に調製された緩衝液で平衡化した１５０ｍｌのCM Sephadex CL 6Bカラム（直径５ｃｍ）にかける。同緩衝液１リッター中に０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの直線勾配を用いてプロテアーゼを溶出する。CM Sepharoseカラムから得たプロテアーゼ含有分画を一つに集め、２μフィルターを通し濾過する。 Balb ／ｃマウスIgG ELISAの手順：・抗原を炭酸緩衝液で１ｍｇ／ｍｌまで希釈する。・各ウエルに１００ｍｌを加える。・プレートを一晩４℃でコートする。・各ウエルを２００ｍｌのブロッキング緩衝液で室温、１時間反応させ、非特異的吸着をブロックする。・プレートを３００ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄する。・未知のマウス血清を、典型的には１０×、２０×および４０×またはそれ以上に希釈緩衝液で希釈する。・各ウエルに１００ｍｌを加える。・室温で１時間反応する。・洗浄緩衝液で３回洗浄し、未結合物質を除く。・ストレプトアビジンを希釈緩衝液で１０００×に希釈する。・３００ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、未結合物質を除く。・ＯＰＤ（０．６ｍｇ／ｍｌ）およびＨ₂Ｏ₂（０．４ｍｌ／ｍｌ）をクエン酸緩衝液に溶解する。・１００ｍｌを各ウエルに加える。・室温、１０分間反応する。・１００ｍｌのＨ₂ＳＯ₄を加えて、反応を停止する。・プレートをリファレンスを６２０ｎｍにとりながら４９２ｎｍで測定した。マウスの免疫感作 Balb／ｃ（２０グラム）に、当業者公知の標準的方法により変更した、または変更していない問題のポリペプチドを皮下注射し、１０回（１４日間隔）免疫感作した。実施例実施例１．アミノ付着基（−ＮＨ₂）の付加のためのＰＤ４９８に於ける好適な置換親ＰＤ４９８の３Ｄ構造を、Thermitase^R（２tec．pdb）との配列同一性５９％に基づき上記に従いモデル化した。ＰＤ４９８の配列は（配列番号２参照）。ＰＤ４９８の残基番号、１〜２８０を準用した。 Insight（BIOSYM）で行ったコマンドを、以下のコマンドファイルmakeKzone． bclとmakeKzone2.bclに示す。保存的置換：コメント：ライン１−８：サブセットALLZONEはリジンまたはＮ−末端の遊離アミノ基の１０オングストローム以内、もしくは残基３９，７２および２６６の触媒トライアド残基の８オングストローム以内にある残基として定義される。ライン１０：サブセットRESTはALLZONEに含まれない残基として定義される。ライン１７−２０：サブセットSUB5Bは、触媒残基の８オングストローム以内にある残基を除く、REST周辺の５オングストロームのシェル内にある残基として定義される。ライン２３−２４：RESTはArg62およびArg169を、SUB5BはArg51，Arg121およびArg250を含む。ACTSITEはArg103を含むが、位置１０３は必須触媒残基から８オングストローム以内に存在することから、従ってこれに該当しない。カラーコードは：（２５０，０，２５５）＝マゼンタ、（２５５，２５５，０）黄色、（２５０，０，０）赤、そして（２５５，２５５，２５５）＝白。置換Ｒ５１Ｋ，Ｒ６２Ｋ，Ｒ１２１Ｋ，Ｒ１６９ＫおよびＲ２５０Ｋは親ＰＤ４９８では変異導入好適位置とされている。以下第２節で残基を置換し、さらに解析を進めた：非保存的置換：コメント：ライン１−１５：サブセットRESTとSUB5B内の溶媒に露出したアルギニンはリジンに置換される。溶媒の到達能はアルギニン置換後に再計算する。ライン１６−２３：サブセットALLZONExはリジン（置換後）またはＮ−末端上の遊離アミノ基の１０オングストローム以内、または残基３９，７２，と２２６の触媒３組残基の８オングストローム以内のいすれかに存在する残基として定義される。ライン２４−２６：サブセットRESTxは、ALLZONEx内に含まれない残基、即ち、まだエピトープとして寄与する可能性のある残基として定義される。ＲＥＳＴｘ中の残基の内、以下が＞５％露出したものである（下表参照）：６−７，９− １２，４３−４５，６５，８７−８８，２０９，２１１，２１６−２２１，２６２。次の突然変異が親ＰＤ４９８内に提示されている：Ｐ６Ｋ、Ｙ７Ｋ、Ｓ９Ｋ、Ａ１０Ｋ，Ｙ１１Ｋ，Ｑ１２Ｋ，Ｄ４３Ｋ，Ｙ４４Ｋ，Ｎ４５Ｋ，Ｎ６５Ｋ、Ｇ８７Ｋ、１８８Ｋ，Ｎ２０９Ｋ，Ａ２１１Ｋ，Ｎ２１６Ｋ，Ｎ２１７Ｋ、Ｇ２１８Ｋ、Ｙ２１９Ｋ、Ｓ２２０Ｋ，Ｙ２２１Ｋ，Ｇ２６２Ｋ。実施例１関連テータ：ＰＤ４９８モデルの溶媒到達能データ：＃ＰＤ４９８モデル金曜日１１月２９日１０：２４：４８ＭＥＴ１９９６＃残基域実施例２．アミノ付着基（−ＮＨ₂）の付加のためのSavinase^Rに於ける好適な置換 Savinase^Rの既知Ｘ−線構造を用いて、付加できる好適なアミノ付着基の位置を見いだした(Betzelら、(1992)，J．Mol．Biol．233，p．427-445)。 Savinase^Rの3D構造は、Brookhaven DataBank内で１svn．pbdとして利用できる。関連するサブチリシンは1st3．pdbとして利用できる。 Savinase^Rの配列を配列番号３に示す。使用した配列の番号付けはサブチリシンBPN'のものであり、Savinase^RはPBN'と比べると次の位置が欠損している：３６，５６，１５８−１５９および１６３−１６４。活性部位残基（機能部位）はＤ３２、Ｈ６４，とＳ２２１である。 Insight（BIOSYM）で行ったコマンドを、以下のコマンドファイルmakeKzone． bclとmakeKzone2．bclに示す。保存的置換：コメント： Savinase^Rの場合、RESTはアルギニンArg10，Arg170およびArg186を含み、SUB5 BはArg19，Arg45，Arg145およびArg247を含む。これらの残基はいずれも溶媒に露出している。置換Ｒ１０Ｋ，Ｒ１９Ｋ，Ｒ４５Ｋ，Ｒ１４５Ｋ，Ｒ１７９Ｋ、Ｒ１８６ＫとＲ２４７ＫがSavinase^Rに於ける本発明の範囲の変異誘導部位と特定された。残基は下記第２節で置換され、さらに解析された。サブセットACTSITEはLys94を含む。置換Ｋ９４Ｒは活性部位に近接する付着基としてリジンを除去する変異である。非−保存的置換：コメント：ＲＥＳＴｘの残基の中で＞５％露出しているものは次の通りである（下表参照）：５，１４，２２，３８−４０，４２，７５−７６，８２，８６，１０３−１０５，１０８，１３３−１３５，１３７，１４０，１７３，２０４，２０６，２１１−２１３，２１５−２１６，２６９。以下の変異はSavinase^Rでは露出されている：ＰｅＫ，Ｐ１４Ｋ，Ｔ２２Ｋ，Ｔ３８Ｋ，Ｈ３９Ｋ，Ｐ４０Ｋ，Ｌ４２Ｋ、Ｌ７５Ｋ、Ｎ７６Ｋ、Ｌ８２Ｋ、Ｐ８６Ｋ、Ｓ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｓ１０５Ｋ、Ａ１０８Ｋ、Ａ１３３Ｋ，Ｔ１３４Ｋ，Ｌ１３５Ｋ，Ｑ１３７Ｋ，Ｎ１４０Ｋ、Ｎ１７３Ｋ，Ｎ２０４Ｋ，Ｑ２０６Ｋ、Ｇ２１１Ｋ，Ｓ２１２Ｋ，Ｔ２１３Ｋ，Ａ２１５Ｋ，Ｓ２１６Ｋ、Ｎ２６９Ｋ。実施例関連データ： SAVINASEI^Rの溶媒到達能データ：＃ＰＤ４９８モデル金曜日１１月２９日１０：２４：４８ＭＥＴ１９９６＃残基域実施例３．カルボキシル酸着基（−ＣＯＯＨ）の付加のためのＰＤ４９８に於ける好適な置換カルボキシル付着基の付加に好適な位置（アスパラギン酸とグルタミン酸）は次のとおりであった。実施例１記載の方法に従った。Insight(BIOSYM)で行ったコマンドを、以下のコマンドファイルmakeDEzone．bclとmakeDEzone2．bclに示す。保存的置換：コメント：サブセットRESTはGln33およびAsn245を含み、SUB5BはGln12，Gln126，Asn209 ，G1n242，Asn246，Gln258およびAsn266を含み、これらは全て溶媒に露出している。置換Ｑ１２ＥまたはＱ１２Ｄ、Ｑ３３ＥまたはＱ３３Ｄ、Ｑ１２６ＥまたはＱ１２６Ｄ、Ｎ２０９ＤまたはＮ２０９Ｅ、Ｑ２４２ＥまたはＱ２４２Ｄ、Ｎ２４５ＤまたはＮ２４５Ｅ、Ｎ２４６ＤまたはＮ２４６Ｅ、Ｑ２４８ＥまたはＱ２４８ＤとＮ２６６ＤまたはＮ２６６Ｅは、ＰＤ４９８における本発明の範囲の変異誘導に好適な部位と同定される。残基は以下２において置換され、さらに解析された：非−保存的置換：コメント：サブセットRESTxは２つの残基、Ａ２３３とＧ２３４だけを含み、これらは溶媒に露出されない。表面を完全に防御するに、これ以上他の変異は必要ない。しかし、ＰＤ４９８の活性部位への到達を保証するために、活性部位内にある反応性カルボキシル基の幾つかを除去する必要があるだろう。サブセットＡＣＴＳＩＴＥ内の酸性残基は、Ｄ３９、Ｄ５８、Ｄ６８とＤ１０６である。このうち後者２残基のみが溶媒に暴露しており、Ｄ３９は機能残基である。変異Ｄ６８Ｎ，Ｄ６８Ｑ，Ｄ１０６ＮとＤ１０６Ｑは本発明によれば好適である。実施例３関連データ： PD498MODELの溶媒到達能に関するデータ：上記実施例１参照。実施例４．カルボキシル酸付着基（−ＣＯＯＨ）付加のためのアースロミセス・ラモサス(Arthromyecs ramosus)パーオキシダーゼ内の好適な置換非−加水分解酵素であるアースロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosus)パーオキシダーゼ内のカルボキシル付着基（アスパラギン酸とグルタミン酸）の付加に好適な位置を以下の如くに見つけた。このオキシド−還元酵素の３Ｄ構造は、Brookhaven DataBank内でlarp．pbdとして利用できる。このＡ．ラモサス（A．ramosus）パーオキシダーゼは３４４個のアミノ酸残基を含む。先頭の８個の残基：ＱＧＰＧＧＧＧはＸ−線構造には認められず、またＮ１４３はグリコシル化されている。実施例１記載の方法を用いた：アースロミセス・ラモサス(Arthromyecs ramosus)パーオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．７）のアミノ酸配列は配列番号４に示す。 Insight（BIOSYM）で行ったコマンドを、以下のコマンドファイルmakeDEzone ．bclとmakeDezone2．bclに示す。Ｃ末端残基はＰ３４４であり、ＡＣＴＳＩＴＥはヘム基と、それに配位する２つのヒスチジン（Ｈ５６とＨ１８４、）により規定される。保存的置換：コメント：サブセットRESTはGln70を含み、SUB5BはGln34，Asn128，Asn30３を含み、これらは全て溶媒に露出している。置換Ｑ３４ＥまたはＱ３４Ｄ、Ｑ７０ＥまたはＱ７０Ｄ、Ｎ１２８ＤまたはＮ１２８ＥとＮ３０３ＤまたはＮ３０３Ｅは、Ａ．ラモサス（A．ramosus）パーオキシダーゼにおける本発明の範囲の変異誘導に好適な部位と特定される。残基は以下に置換し、さらに解析された：非−保存的置換：コメント：サブセットRESTxは４つの残基、Ｓ９，Ｓ３３４、Ｇ３３５とＰ３３６だけを含み、これらは全て＞５％の溶媒露出である。Ａ．ラモサス（A．ramosus）パーオキシダーゼでは変異Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｅ、Ｓ３３４Ｄ、Ｓ３３４Ｅ、Ｇ３３５Ｄ、Ｇ３３５Ｅ、Ｐ３３６ＤとＰ３３６Ｅが提言されている。サブセットACTSITE内の酸性残基は：Ｅ４４、Ｄ５７、Ｄ７７、Ｅ８７、Ｅ１７６、Ｄ１７９、Ｅ１９０、Ｄ２０２、Ｄ２０９、Ｄ２４６およびＰ３４４のＮ−末端のカルボキシル酸である。これらの内、のうちＥ４４、Ｄ７７、Ｅ１７６、Ｄ１７９、Ｅ１９０、Ｄ２０９、Ｄ２４６およびＰ３４４のＮ−末端のカルボキシル酸のみが溶媒に暴露している。変異に好適な部位はＥ４４Ｑ、Ｄ７７Ｎ、Ｅ１７６Ｑ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１９０Ｑ、Ｄ２０９ＮおよびＤ２４６Ｎである。Ｄ２４６Ｎがヘム結合に重要であることから、Ｄ２４６ＤおよびＤ２４６Ｅの変異は危険である。Ｎ−末端の８個の残基は構造内に現れないことから、上記計算に含めていない。これら８個の残基、ＱＧＰＧＧＧＧ、でカルボキシル基を持つものはない。この領域に付着できるようになる考え得る変異としては次のものが提言されている：Ｑ１Ｅ、Ｑ１Ｄ、Ｇ２Ｅ、Ｇ２Ｄ、Ｐ３Ｅ、Ｐ３Ｄ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｄ、Ｇ５Ｅ、Ｇ５Ｄ、Ｇ６Ｅ、Ｇ６Ｄ、Ｇ７Ｅ、Ｇ７Ｄ、Ｇ８Ｅ、Ｇ８Ｄ。実施例４関連データ：Ａ．ラモサス（A．ramosus）パーオキシダーゼの溶媒到達能データ（注意、先頭８残基はＸ−線構造から消失しているので、到達能リストに印刷された残基番号は、他所に用いた残基番号よりも８小さい。実施例５．Ｎ−スクシンイミジルカーボネートによるｍＰＥＧの活性化 mPEG15,000をトルエン（４ｍｌ／ｇのｍＰＥＧ）に懸濁し、２０％を正常圧下に蒸留して飛ばし、反応物を共沸的に乾燥した。液が３０℃まで冷えたらジクロロメタン(乾燥１mg／ｇmPEG)を加え、フォスゲンの入ったトルエン（1.93Ｍ５ mole／mole）を加え、混以合液を室温で一晩攪拌した。この混合液を蒸発して乾燥し、所望生成物を蝋状の塊として得た。蒸発後、ジクロロメタンとトルエン（１：２、乾燥３ｍｌ／ｇｍＰＥＧ）を加えて、白色固形物を再溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２mole／mole mPEG)を固形の形で加え、次いでトリエチルアミン(1.1mole／m ole mPEG)を加えた。この混合液を３時間攪拌すると、最初は不透明であったものが透明になり、そして最後に少量の沈殿を生じた。この混合液を蒸発して乾燥し、加温濾過して塩と不溶性微量物を取り除き、酢酸エチル（１０ｍｌ）より再結晶化した。１６時間ゆっくりと室温に冷却してブランク液を除き、ついで一晩冷蔵庫内に置いた。白色沈殿を濾過し、少量の冷酢酸エチルで洗浄、乾燥して収率９８％を得た。ＮＭＲは活性化８０〜９０％、５ｏ／oo（ｗ／ｗ）HNEt₃Clを示した。mPEG15,000の¹Ｈ−NMR（CDCL₃）d1.42t(Ｉ＝4.8CH₃iHNEt₃Cl)、2.84（Ｉ＝3.7スクシンイミド）、3.1dq(Ｉ＝3.4CH₂iHNEt₃Cl)、3.38s（Ｉ＝2.7CH₃iOM e)、3.4o^*dd（Ｉ＝4.5ｏ／ｏｏ、¹³Ｃサテライト）、3.64bs（Ｉ＝1364主ピーク）、3.89＊dd（Ｉ＝4.8ｏ／oo、¹³Ｃサテライト）、4.47dd（Ｉ＝1.8、PEG中のＣＨ₂）。デシケーター内、２２℃、４ヶ月保存後変化は認められなかった。実施例６．Ｎ−スクシンイミジルカーボネートによるmPEG5,000の活性化Ｎ−スクシンイミジルカーボネートによるmPEG5,000の活性化は、実施例５記載の如くに実施した。実施例７．ＰＤ４９８変形体の構築と発現ＰＤ４９８部位指向変種をSarkarら、（1990）：BioTechniques ８：404-407 記載の“マキシ−オリゴヌクレオチド−ＰＣＲ”法を用いて構築した。鋳型プラスミドはシャトルベクターｐＰＤ４９８またはＰＤ４９８プロテアーゼ遺伝子の変種を含むその類縁体である。次のＰＤ４９８変形体を構築し、発現して精製した。Ａ：Ｒ２８ＫＢ：Ｒ６２ＫＣ：Ｒ１６９ＫＤ：Ｒ２８Ｋ＋Ｒ６２ＫＥ：Ｒ２８Ｋ＋Ｒ１６９ＫＦ：Ｒ６２Ｋ＋Ｒ１６９ＫＧ：Ｒ２８Ｋ＋Ｒ６９Ｋ＋Ｒ１６９Ｋ変形体の構築Ｒ２８Ｋ置換を導入するため、配列：GGG ATG TAA CCAAGG GAA GCA GCA CTC A AA CG（配列番号７）を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstEIIとBglII消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はStyl消化により見つけ、合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ６２Ｋ置換を導入するために、配列：CGA CTTTAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC （配列番号８）を有する合成オリゴヌクレドを用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgL II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はClarl消化により見つけ、合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ１６９Ｋ置換を導入するために、配列：CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC（配列番号９）を有する合成オリゴヌクレドを用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgL II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はRsa Ｉ消化により見つけ、合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ２８ＫとＲ６２Ｋ置換を同時に導入するために、配列：GGG ATG TAA CCA AG G GAA GCA GCA CTC AAA CG（配列番号７）と配列：CGA CTT TAT CGA TAA GGA CA A TAA CCC（配列番号８）を有する合成オリゴヌクレオチドを同時に用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgL II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はStylＩとClarl消化により見つけ、合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ２８ＫとＲ１６９Ｋ置換を同時に導入するために、配列：GGG ATG TAA CCA AGG GAA GCA GCA CTC AAA CG（配列番号８）と配列：CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC（配列番号８）を有する合成オリゴヌクレドを同時に用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgl II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はStylＩと消化とRsa Ｉ部位のないことから見つけた。この変種は合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ６２ＫとＲ１６９Ｋ置換を同時に導入するために、配列：CGA CTT TAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC（配列番号８）と配列：CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC（配列番号９）を有する合成オリゴヌクレドを同時に用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgl II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はClarl消化とRsa Ｉ部位のないことから見つけた。この変種は合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。Ｒ２８Ｋ、Ｒ６２ＫとＲ１６９Ｋ置換を同時に導入するために、配列：GGG AT G TAA CCA AGG GAA GCA GCA CTC AAA CG（配列番号７）、配列：CGA CTT TAT CG A TAA GGA CAA TAA CCC（配列番号８）と配列：CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA A CC AGC（配列番号９）を有する合成オリゴヌクレドを同時に用いた。７６９ｂｐのＰＣＲ断片を、BstE IIとBgl II消化により調製したｐＰＤ４９８プラスミド何に連結した。陽性変種はStyIとClarl消化、そしてRsaＩ部位のないことから見つけた。この変種は合計７６９ｂｐの挿入体のＤＮＡ配列解析により確認した。ＰＤ４９８変形体の発酵、発現および精製上記のＰＤ４９８変種を有するベクターを大腸菌(E．coli)培養体から精製し、バシルス・スブチリス(B．subtilis)の中に形質転換し、上記“材料と方法” の節に記載した如くに変種を発酵、発現、精製した。実施例７．３置換型ＰＤ４９８変形体と活性化mPEG5,000の結合３置換型ＰＤ４９８変種（即ちＲ２８Ｋ＋Ｒ６２Ｋ＋Ｒ１６９Ｋ置換変種）２００ｍｇを５０ｍｍ硼酸ナトリウム、ｐＨ１０存在下に、Ｎ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG5,000（実施例２に従い調製）１．８ｇを、最終用量２０ｍｌで反応させた。反応は室温でマグネチックスターラーを用いて行った。反応時間は１時間であった。最終濃度５ｍＭのジメチルグルタール酸、１ｍＭＣａＣｌ₂と５０ｍＭ硼酸、ｐＨ５．０になるようにＤＭＧ緩衝液を加えて、反応を停止した。得た誘導体の分子量は約１２０ｋＤａであり、モル酵素当たり約１６モルのｍＰＥＧが結合したことになる。親酵素に比べ、残余活性はペプチド基質（スクシニル−Ala-Ala-Pro-Phe−ｐ −ニトロアニリド）に対してほぼ１００％であった。実施例８．モルモットに於けるＰＤ４９８変種−SPEG5,000のアレルギー原性試験 Dunkin Hartleyモルモットを１．０μｇのPD498-SPEG5,000と１．０μｇの変更変種PD498-SPEG5,000を気管内投与した。試験期間中、免疫感作したDunkin Hartleyモルモットから得た血清を特異的Ig G₁ELISA（上記）で試験し、上記分子が免疫反応系を活性化し、アレルギー反応を示す特異的ＩｇＧ₁反応を起こすか調べた。 Dunkin HartleyモルモットＩｇＧ₁レベルを１０週間の試験期間中観察した。実施例９．アミノ付着基（−ＮＨ₂）の付加に好適なフミコーラ・ラヌギノーサ( Humicola lanuginosa)リパーゼに於ける置換フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ（配列番号６）の３Ｄ構造は、Brookhaven DataBank内で１tib．pbdとして利用できる。このリパーゼは２６９アミノ酸より成る。実施例１記載の方法に従った。Ｈ．ラヌギノーサ(H．lanuginosa)リパーゼの配列を以下のＨ．ラヌギノーサ(H．lanuginosa)リパーゼの溶媒到達能データー覧表に示す。Ｈ．ラヌギノーサ(H．lanuginosa)残基番号を用い（１−２６９）ると、活性部位残基（機能部位）はＳ１４６，Ｓ２０１とＨ２５８である。Ｈ．ラヌギノーサ（H．lanuginosa）リパーゼについてはシノニムＴＩＢを使用した。 Insight(BIOSYM)で行ったコマンドを、以下のコマンドファイルmakeKzone．bc lとmakeKzone2．bclに示す。保存的置換：コメント：Ｈ．ラヌギノーサ(H．lanuginosa)（＝ＴＩＢ）場合、RESTはアルギニンArg13 3，Arg139，Arg160，Arg179およびArg209を含み、SUB5BはArg118およびR125を含む。これらの残基はいずれも溶媒に露出している。置換Ｒ１３３Ｋ，Ｒ１３９Ｋ，Ｒ１６０Ｋ，Ｒ１７９Ｋ，Ｒ２０９Ｋ、Ｒ１１８ＫおよびＲ１２５ＫがＴＩＢに於ける本発明の範囲の変異誘導部位に特定された。これら残基は下記第２節で置換され、さらに解析された。サブセットＡＣＴＳＩＴＥはリジンを含まない。非−保存的置換：コメント： RESTxの残基の中で＞５％露出しているものは次の通りである（下表参照）：１８、３１−３３，３６、３８、４０，４８、５０、５６−６２、６４、７８、８８、９１−９３、１０４−１０６、１２０、１３６、２２５、２２７−２２９、２５０、、２６２、２６８。この内３つはジスルフィド結合に含まれるシステインであり、従って構造上の理由から変異させる残基から除外した。Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼについては、次の変異が提言されている。Ａ１８Ｋ，Ｇ３１Ｋ，Ｔ３２Ｋ，Ｎ３３Ｋ、Ｇ３８Ｋ，Ａ４０Ｋ，Ｄ４８Ｋ、Ｔ５０Ｋ、Ｅ５６Ｋ、Ｅ５７Ｋ、Ｓ５８Ｋ、Ｇ５９Ｋ、Ｖ６０Ｋ、Ｇ６１Ｋ、Ｄ６２Ｋ、Ｔ６４Ｋ、Ｌ７８Ｋ、Ｎ８８Ｋ，Ｇ９１Ｋ，Ｎ９２Ｋ、Ｌ９３Ｋ，Ｓ１０５Ｋ，Ｇ１０６Ｋ、Ｖ１２０Ｋ，Ｐ１３６Ｋ，Ｇ２２５Ｋ、Ｌ２２７Ｋ，Ｖ２２８Ｋ，Ｐ２２９Ｋ，Ｐ２５０Ｋ，Ｆ２６２Ｋ。実施例２関連データ：実施例１０．リパーゼ変形体Ｅ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋの提供フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変種Ｅ８７Ｋ＋Ｓ２５４ＫをWO92/05249記載の如く構築、発現、精製した。実施例１１．リパーゼ−Ｓ−PEG15,000結合体リパーゼ変種Ｅ８７Ｋ＋Ｓ２５４Ｋ−ＳＰＥＧを、酵素を実施例１０記載のフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変種（Ｅ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ）に、そして高分子をmPEG15,000である以外は実施例７記載の様に調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに於けるリパーゼ変種（Ｄ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ）のＩｇＧ ₁ としての免疫原性 Balb／ｃマウスを以下の様に皮下注射し免疫感作した：ｉ）５０μｌの０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌ液（コントロール群、マウス８匹）（コントロール）、ｉｉ）２５μｇのフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変種（Ｅ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ）を含む５０μｌの０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌ液（１群、マウス８匹）（未変化リパーゼ変種）、ｉｉｉ）位置Ｄ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋが置換され、Ｎ−スクシニルイミジルカーボネートで活性化したmPEG15,000に結合したフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicol a lanuginosa)リパーゼ変種と（Ｅ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ）を含む５０μｌの０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌ液（２群、マウス８匹）（リパーゼ−SEPGl5,000 ）。各バッチの蛋白量は光学密度測定より測定した。血液サンプル（２００μｌ）を免疫感作１週後に目より採取したが、しかし免疫感作後のその前には行わなかった。血清は血液を凝固させ、遠心分離して得た。ＩｇＧ₁反応は、上記の様にBalb／ｃマウスIgG₁ELISAをい用いて決定した。結果：フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)変種に対する検出可能な液性反応の惹起には５週間の免疫感作が必要であった。結合体（即ちリパーゼ−SP EG15,000）により惹起された抗体力価は９６０から１９２０の間であり、未変更ＨＬ８２−リポラーゼ（左図）により惹起される抗体力価３８４０に比べて２から４倍低いに過ぎなかった。試験の結果は図１に示す。当業者には明らかなように、前記開示に照らし本発明の精神と範囲から解離することなく本発明の実際において多くの変更と改良が可能である。従って、本発明の範囲は、以下のクレームにより規定される物質に鑑み解釈されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｎ 9/20 9/48 9/48 9/90 9/90 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）対応する親ポリペプチドに存在する付着基の数に比較し、その表面の付着基の数が増加する様式で修飾されたポリペプチドに結合した１つ以上の追加の高分子、および／またはｂ）対応する親ポリペプチドに存在する付着基の数に比較し、その官能部位そのもの、またはその近傍にある付着基の数が減少する様に修飾されたポリペプチドに結合する１つ以上の追加の高分子、を有するポリペプチド−高分子結合体。２．対応する親酵素から調製した結合体の高分子数に比べて、ポリペプチドの表面に結合した高分子数がさらに１〜２５、好ましくは１〜１０多い請求項１に記載の結合体。３．追加された付着基がリジン残基の形のアミノ基であるか、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の形のカルボキシル基である請求項１または２に記載の結合体。４．追加された付着基が、アルギニンからリジンへの置換の様にアミノ酸残基の保存的置換により調製される請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。５．追加される付着基が、アスパラギンからアスパラギン酸／グルタミン酸またはグルタミンからアスパラギン酸／グルタミン酸置換の様なアミノ酸の保存的置換により調製される請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。６．付加された付着基が機能部位から５オングストローム以上、好ましくは８オングストローム以上、特に好ましくは１０オングストローム以上離れて位置する請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合体。７．対応する親ポリペプチドを基に調製された結合体の高分子数に比べて、ポリペプチドの機能部位そのもの、またはその近傍に結合した高分子数が１〜２５、好ましくは１〜１０少ない請求項１に記載の結合体。８．除去された付着基がリジン残基の形のアミノ基であるか、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の形のカルボキシル基である請求項７に記載の結合体。９．除去された付着基が、リジンからアルギニン置換の様なアミノ酸基の保存的置換により調製される請求項７又は８に記載の結合体。１０．除去される付着基が、アスパラギン酸／グルタミン酸からアスパラギンまたはアスパラギン酸／グルタミン酸からグルタミンへの置換の様なカルボキシル基の保存的置換により調製される請求項７又は８に記載の結合体。１１．除去された付着基が機能部位から５オングストローム以上、好ましくは８オングストローム以上、特に好ましくは１０オングストローム以上離れて位置する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結合体。１２．付着基が広範囲に分布している請求項１〜１１のいずれか１項に記載の結合体。１３．結合体の親ポリペプチド部分の分子量が１〜１００ｋＤａ、好ましくは１５〜１００ｋＤａである請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結合体。１４．結合体の親ポリペプチド部分の分子量が１〜３５ｋＤａである請求項１３に記載の結合体。１５．親ポリペプチドが、ラッカーゼまたはスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）のごとき酸化還元酵素、プロテアーゼ、特にサブチリシンまたは脂肪分解酵素などの加水分解酵素、トランスグルタミナーゼ（TGases）のごときトランスフェラーゼ、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）のごときイソメラーゼのグループより選択された酵素である請求項１４に記載の結合体。１６．親酵素がPD498，Savinase^R，BPN'、プロテイナーゼＫ、プロエイナーゼ^R ，スブチリシンＤＹ、Lion Y、Rennilase^R、ＪＡ１６、Alalase^RまたはLipolas e^Rの様なフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼである請求項１５に記載の結合体。１７．結合体の酵素部分が以下の置換を１つ以上持つＰＤ４９８変形体である請求項１６に記載の結合体：Ｒ５１Ｋ、Ｒ６２Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１６９Ｋ、Ｒ２５０Ｋ，Ｒ２８Ｋ、Ｒ１９０Ｋ、Ｐ６Ｋ、Ｙ７Ｋ、Ｓ９Ｋ、Ａ１０Ｋ、Ｙ１１Ｋ、Ｑ１２Ｋ、Ｄ４３Ｋ、Ｙ４４Ｋ、Ｎ４５Ｋ，Ｎ６５Ｋ、Ｇ８７Ｋ、１８８Ｋ、Ｎ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｋ、Ｎ２１６Ｋ、Ｎ２１７Ｋ、Ｇ２１８Ｋ、Ｙ２１９Ｋ、Ｓ２２０Ｋ、Ｙ２１１Ｋ、Ｇ２６２Ｋ。１８．以下の変異の１つを持つ請求項１７に記載の結合体：Ｒ２８Ｋ＋Ｒ６２Ｋ、Ｒ２８Ｋ＋Ｒ１６９Ｋ、Ｒ６２Ｋ＋Ｒ１６９Ｋ、Ｒ２８Ｋ＋Ｒ６９Ｋ＋Ｒ１６９Ｋ。１９．結合体の酵素部分が以下の置換を１つ以上持つSavinase^R変形体である請求項１６に記載の結合体：Ｒ１０Ｋ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ４５Ｋ、Ｒ１４５Ｋ、Ｒ１７０Ｋ，Ｒ１８６Ｋ、Ｒ２４７Ｋ、Ｋ９４Ｒ，Ｐ５Ｋ、Ｐ１４Ｋ、Ｔ２２Ｋ、Ｔ３８Ｋ、Ｈ３９Ｋ、Ｐ４０Ｋ、Ｌ４２Ｋ、Ｌ７５Ｋ、Ｎ７６Ｋ、Ｌ８２Ｋ、Ｐ８６Ｋ、Ｓ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｓ１０５Ｋ、Ａ１０８Ｋ、Ａ１３３Ｋ、Ｔ１３４Ｋ、Ｌ１３５Ｋ、Ｑ１３７Ｋ、Ｎ１４０Ｋ、Ｎ１７３Ｋ、Ｎ２０４Ｋ、Ｑ２０６Ｋ、Ｇ２１１Ｋ、Ｓ２１２Ｋ、Ｔ２１３Ｋ、Ａ２１５Ｋ、Ｓ２１６Ｋ、Ｎ２６９Ｋ。２０．結合体の酵素部分が以下の置換を１つ以上持つフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変形体である請求項１６の結合体：Ｒ１３３Ｋ，Ｒ１３９Ｋ，Ｒ１６０Ｋ，Ｒ１７９Ｋ，Ｒ２０９Ｋ、Ｒ１１８Ｋ、Ｒ１２５Ｋ、Ａ１８Ｋ，Ｇ３１Ｋ，Ｔ３２Ｋ，Ｎ３３Ｋ、Ｇ３８Ｋ，Ａ４０Ｋ，Ｄ４８Ｋ、Ｔ５０Ｋ、Ｅ５６Ｋ、Ｅ５７Ｋ、Ｓ５８Ｋ、Ｇ５９Ｋ、Ｖ６０Ｋ、Ｇ６１Ｋ、Ｄ６２Ｋ、Ｔ６４Ｋ、Ｌ７８Ｋ、Ｅ８７Ｋ、Ｎ８８Ｋ，Ｇ９１Ｋ，Ｎ９２Ｋ、Ｌ９３Ｋ，Ｓ１０５Ｋ，Ｇ１０６Ｋ、Ｖ１２０Ｋ，Ｐ１３６Ｋ，Ｇ２２５Ｋ、Ｌ２２７Ｋ，Ｖ２２８Ｋ，Ｐ２２９Ｋ，Ｐ２５０Ｋ，Ｄ２５４Ｋ、Ｆ２６２Ｋ。２１．次のＥ８７Ｋ＋Ｄ２５４Ｋ変異を持つ請求項２０に記載の結合体。２２．ポリペプチドに結合した高分子の分子量が１〜６０ｋＤａ、特に１〜３５ｋＤａであり、特に３〜２５ｋＤａである請求項１〜２１のいずれか１項に記載の結合体。２３．高分子が、分枝型ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸、ポリ−（ビニルピロリドン）およびポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、またはカルボキメチル−デキストランのごときデキストラン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのごときセルロース、キトサン加水分解物、ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプンの様なデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、ガーゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラゲニン、ペクチン、アルギン酸のごとき天然高分子、からなる天然または合成ホモ−およびヘテロ高分子よりなる群から選択される請求項２２に記載の結合体。２４．次の工程を含んで成る改良型ポリペプチドの製造方法：ａ）注目の親ポリペプヂドの３Ｄ構造の表面に位置するアミン酸残基を同定し、ｂ）変異を起こすべき該親ポリペプチドの該３Ｄ構造の表面にある標的アミノ酸残基を選択し、ｃ）ｉ）前記工程ｂ）で選択した１つ以上のアミノ酸残基を、好適な付着基を持つアミノ酸残基で置換しもしくはそれを挿入し、そして／またはｉｉ）工程ｂ）で選択した１つ以上のアミノ酸で機能部位そのもの、まはたその近傍を置換し、または削除し、ｄ）変異したポリペプチドに高分子を結合させる。２５．前記工程ａ）に言及されるポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基の同定を、注目の親ポリペプチドの３Ｄ構造をコンピューター解析することで実施する請求項２４に記載の方法。２６．前記工程ｂ）が親ポリペプチド表面のアルギニンまたはリジン残基を選択することを含む請求項２４に記載の方法。２７．前記工程ｂ）で同定した１つ以上のアルギニン残基を工程ｃ）でリジン残基により置換する請求項２４に記載の方法。２８．置換されたアルギニン残基が機能部位より５オングストローム以上、好ましくは８オングストローム以上、特に１０オングストローム以上離れている請求項２７に記載の方法。２９．前記工程ｃ）で調製したポリペプチドが高分子と結合する請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。３０．工業製品のアレルギー原性を下げるための請求項１〜２３のいずれか１項に記載の結合体の利用。３１．医薬品の免疫原性を下げるための請求項１〜２３のいずれか１項に記載の結合体の利用。３２．請求項１〜２３のいずれか１項に記載の結合体と、工業製品に利用されるその他の構成成分を含んでなる組成物。３３．工業製品が洗濯用、皿洗い用、または機器表面洗浄用の洗剤、または食品もしくは餌である請求項３２に記載の組成物。３４．請求項１〜２２のいずれか１項に記載の結合体と、スキンケア製品に利用されるその他の成分を含んで成る請求項３２に記載の組成物。３５．請求項１〜２３のいずれか１項に記載の結合体と、医薬品に利用されるその他の成分とを含んで成る請求項３２に記載の組成物。