JP2537602B2 - 安定性タンパク質及びタンパク質の安定化法 - Google Patents

安定性タンパク質及びタンパク質の安定化法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチド，ポリペプチド及びタンパク質の
分類の物質とその生体内での安定化に関するものであ
る。
タンパク質と酵素は、その他のペプチドやポリペプチ
ドと同様に、動物及び人間の体内一般には酸，塩基，ア
ミダーゼ及び／またはエステラーゼを含む水溶液中で急
速に減成する傾向にある。このため、こうした物質は工
業，診断及び治療での使用が限られている。従来、これ
らの物質はポリマーに化学的に結合させることにより、
ある程度安定化させることができると報告されている
が、この結合は、反対に修飾したり或いは問題の物質の
所望の特性をそこないさえする傾向にあり、及び／また
は、偶然の有毒効果を生み出して修飾された物質を生物
学的に不適合なものとすることもある。更に、添加した
ポリマーは、動物或いは人間の体内で生物分解されない
こともあり、そのため例え結合物質が放出され意図した
効果をもたらしたとしても、毒性水準にまで達する場合
がある。
本発明は、動物或いは人間の体内での代謝及び減成に
対して耐性のある新規な修飾ペプチドの分類を提供する
ものであり、これは、ペプチドをコンドロイチンに化学
的に結合させることにより製造される。コンドロイチン
を使用する利点は、その分子が体全体に見られ、生物適
合性があり、種依存性がなく、かつ体内に導入した場合
に直接作用して、長期間もとの修飾されていないペプチ
ドの効果を生じるが、その際、加水分解，けん化脱アミ
ド化、また、その他の形のいわゆる“持続放出”不均等
化に介入しないペプチドとの結合生成物を生じるという
事実にある。
従って、本発明の目的は、ペプチド及びペプチド類似
物質を生体内で安定な修飾された形に変換することにあ
る。
本発明のもう一つの目的は、かかる物質を体内で持続
効果を有する形に変換することにある。
本発明のその他の目的及び先行技術に優る本発明の利
点は、本明細書中の説明から明確になるであろう。
あるタンパク質性物質の安定化については、アブラハ
ム・アブコウスキー及びフランク・ディビスが、著書
「薬剤としての酵素」、ホルセンバーグ及びロバーツ編
集、ニューヨーク：ジョンウィリー アンド サンズ
（1981年）［Abraham Abuchowski and Frank Davis,Enz
ymes As Drugs,Ed.,by Holcenberg and Roberts,New Yo
rk:John Wiley＆Sons（1981）］の“可溶性ポリマー−
酵素付加体”の章で検討している。
ダニシェフスキーとシスコビック「炭水化物研究」第
16巻199頁（1971年）は、グリコスアミノグリカンの構
造−機能関係を研究中に、あるアミノ酸のアミノ機能を
グリコスアミノグリカンのカルボキシル基に共有結合さ
せることができることを発見した。勿論、これは従来の
アミド化である。本発明の物質を作るのに同様の反応を
使用したものもあるが、ダニシェフスキーとシスコビッ
クは、本発明の結合薬剤を製造していないし、もしくは
その製造の可能性を示唆してはいない。
ミルら、米国特許第4,003,792号は、タンパク質が植
物源の酸性多糖類、特にアルギン酸，ペクチン酸，セル
ロース酸及びカラジーナンに結合し得ることを教示して
いる。かかる多糖類は植物炭水化物で、動物の血液や組
成とは相容れないものであり、本発明で使用するコンド
ロイチンとは化学的，生理学的に明らかに異なってい
る。
ヤナス及びバーク、米国特許第4,060,081号及び第4,0
59,572号は、ムコ多糖（基本的にはグリコスアミノグリ
カンと同一域を占めるはるかに古い用語）のイオン特性
をタンパク質のイオン的凝結或いは複合体形成に使用し
ている。例えば、人工皮膚製剤はコンドロイチン硫酸塩
とコラーゲンから調整される。
ワルトンら、ケミカルアブストラクト、98,380、1669
02u（1983）は、コンドロイチン硫酸塩が薬剤と結合し
て、コンドロイチンの酵素による或いはその他の減成に
続いて活性薬剤を放出する副薬剤を作り出すことができ
ることを開示している。ワルトンらの生成物と違って、
本発明の生成物は副薬剤ではない。反対に、我々のコン
ドロイチン−ペプチド化合物はそれ自体薬剤であり、ペ
プチドが事実上安定化して、その活性が重大に延長され
ることを除いてもとのペプチドと同じ効果を生じる。こ
の効果は、例えコンドロイチンの一部が生体内で減成
し、ペプチドと結合した分子量の低いコンドロイチンを
残すとしても達成される。
スノーデン、Biochemica et Bcophysica Acta,703,21
〜25（1982）は、コラーゲン原繊維がコンドロイチン硫
酸塩溶液中で安定化し、安定性はコンドロイチンの濃度
が大きいほど上昇することを見出した。しかし、化学的
結合は関係しておらず、溶液中のコラーゲンとコンドロ
イチンの物理的近接のみが関与していた。更に、例えコ
ラーゲン原繊維の安定化が治療上重要な操作であったと
しても、体内でそうした効果を生じさせるために充分な
コンドロイチン硫酸塩を注入することは、その情況では
実行不可能である。
ボクら「薬理学研究情報」14巻113〜120（1982）（Ph
armacological Research Communications,14,113〜120
（1982）は、スーパーオキシドジスムターゼ（“SOD"）
等のタンパク質に結合した合成ポリマー，ポリエチレン
グリコールを使用すると、その安定性が増し、その変性
或いは一般的消化を防ぐことができ、それにより循環中
の活性及び寿命が増加することを指摘した。しかし、合
成ポリマーであるポリエチレングリコールは動物或いは
人間の体に独特なものではなく、上記のかかる物質の一
般的欠点を有している。
バラノフら「実験生物学及び医薬報告」95巻、357〜3
59（1983）［Bulletin of Experimental Biology and M
edicine,95,357〜359（1983）］は、インシュノンを合
成ポリマー“ポリセネート”に結合させ、その生成物を
うさぎに経口投与して有望な成果を得た。当然のことな
がら“ポリセネート”は、天然ポリマーコンドロイチン
とは無関係である。
本発明によると、コンドロイチンを、以下により詳細
に定義するような広範な分類のペプチドの製薬的に活性
な物質と既知の方法で反応させ、生体内で安定かつ長期
間にわたりもとのペプチドの製薬活性を発揮するエステ
ル及び／またはそのアミド誘導体を製造する。
コンドロイチンの反復構造単位を以下に示す。
基本的コンドロイチン構造において、Ｑ及びＲは共に
水酸基である。コンドロイチンは、Ｑの水酸基が硫酸塩
となったコンドロイチン−４−スルフェート（C4S）及
びＲの水酸基が硫酸塩となったコンドロイチン−６−ス
ルフェート（C6S）という２つの形のどちらかの形で最
も一般的に存在する。本発明に関しては、いずれの形の
コンドロイチンも使用することができ、コンドロイチン
とペプチドは、主にアミドまたはエステル結合によって
共有結合し、広範な範囲の分子量（例えばおよそ5,000
〜100,000ダルトン）で、コンドロイチンを使用するこ
とができることに注目すべきである。安定性は、主にコ
ンドロイチンとペプチドの共有結合の後形成される架橋
結合によって増加すると考えられる。図面からわかるよ
うに、ペプチドの水酸基,OH、カルボキシル基,COOH、及
びアミン基,NH2とのエステル結合−COOY、或いはアミド
結合−CONHYによる共有結合（特にカルボキシル基,COOH
及び水酸基,OH）のために、コンドロイチンでは様々な
官能基が使用できる。
本発明は一般に、単純ペプチド，ポリペプチド，タン
パク質，タンパク質性ホルモン，酵素などを包含する
が、それらに限定されるものではないペプチド及びポリ
ペプチドの安定化に適用できる。これらの物質は、それ
らがアミド結合によって共に結合したアミノ酸鎖である
ということにおいて、基本的には全てペプチドである。
便宜上、ここではそうした物質の全てを言うのに“ペプ
チド”という語を総称的に使用する。尚、本明細書では
ペプチドの分類として、アミノ酸数（ｎ）が２〜10のも
のを単純（オリゴ）ペプチド、ｎが10〜100のものをポ
リペプチド、ｎが100以上のものをタンパク質と呼ぶ。
実施例には、スーパーオキシドジスムターゼ、インシュ
リン，インターフェロン，成長ホルモン，及びペルオキ
シダーゼがあるが、これらは全て代表的な不安定タンパ
ク質である。インターフェロンは、本発明に従って変更
態様にかえた物質の特に適切な例である。これは、遊離
した形で投与した場合に体内で急速に減成するので、不
活性化する前にその効果を発揮するために高い（往々に
して有毒な）投与量を注入しなければならない。しか
し、コンドロイチンと共有結合した場合、インターフェ
ロンはより低くかつより少ない投与量で有効に使用する
ことができる。その他の実施例的なペプチドには、アス
パラギナーゼ，グルタマーゼ，アルギナーゼ，アルギニ
ンデアミナーゼ，ソマトメジン,ACTH,FSH,LH,ソマトス
タチン，バソプレシン,RNアーゼ，エンドルフィン，エ
ンケファリン，及びヘキソサミニダーゼA,ヘキソサミニ
ダーゼB,アルファ−グルコシダーゼ，スフィンゴミエリ
ナーゼ，アリルスルフェターゼ等150以上の先天性代謝
病に関係した酵素がある。
コンドロイチンをペプチド出発原料と反応させて本発
明の新規な物質を得る反応は、関係する官能基によって
既知の方法で実施できる。
コンドロイチンとペプチドがそれぞれ水酸基，カルボ
キシル基を有している場合には、カルボジイミドを使っ
て両者を反応させることができ、或いは、カルボキシル
基を混合無水物に転換して水酸基と反応させることがで
きる。こうした手順及びそれに必要な条件は全て当業界
で古くから行なわれ周知である。コンドロイチンとペプ
チドがそれぞれカルボキシル基と水酸基を有している場
合も同様の手順を用いることができる。これらの場合の
生成物は全てエステルである。
コンドロイチンとペプチド物質がそれぞれ水酸基とア
ミノ基を有している場合（或いはその逆の場合）、水酸
基の活性化によるクロロフォルメート部分とのカルバメ
ート結合及びそれに続くアミノ機能との結合を通して反
応を進めることができる。この手順及び適切な反応条件
は当業界に周知な従来のものである。同様に、２つの水
酸基（コンドロイチン及びペプチド上の）の間にカルボ
ネート結合を形成させることもできる。
コンドロイチンとペプチド物質がカルボキシル基とア
ミノ基をそれぞれ有している場合（或いはその逆の場
合）、その反応は既知の手法を用いた既知の条件下での
従来のアミド形成の１つで、２つの分子間の水分子を除
去する。出発物質のどちらか或いは両方が２つ以上の官
能基を有している場合には、混合生成物の生成を避ける
ために反応を望まない基を保護することが望ましい。こ
れらは当業界で周知の技術である。
コンドロイチン−ペプチド生成物の活性及び安定性
は、多くの方法で変えることができる。例えば、コンド
ロイチンのペプチドに対する分子比を変えることによ
り、コンドロイチンの分子サイズを変えることにより
（通常は約5,000〜100,000ダルトンの分子量範囲で用い
られる）、及びコンドロイチン自身内の架橋結合度のほ
か、コンドロイチンとペプチドの架橋結合度を変えるこ
とにより。
コンドロイチンはあらゆる軟骨含有生物（鳥からサメ
まで）の他、あらゆる哺乳動物の体内に自然に見られる
物質であるので、これをペプチド，タンパク質，ホルモ
ン或いは酵素に化学結合しても、予期せぬ有毒効果を生
み出すことはない。コンドロイチンは完全な生物適合性
を持ち、また、体内で完全に生物分解できる（多くの合
成ポリマーやデキストランのような自然のものと違っ
て）ので、体内での形成には何の問題も起らない。
本発明の反応生成物は水或いは等張塩溶液に溶解する
ことにより、或いは生成物が難溶性の場合には水或いは
等張塩溶液に粉末にして懸濁することにより、都合よく
投薬用に調整される。後者の場合、生成物をジメチルス
ルホキシド，ジメチルホルムアミド等の適当な有機溶媒
に溶解し、水で希釈してコロイド状懸濁液を形成し、真
空放散或いは水透析を行なって有機溶媒を除去すること
も可能である。溶液或いは懸濁液は、患者への適切な注
入濃度としてミリリットル当たり約５〜500mgの生成物
を含んでいるのが適当であり、注入量は所望の薬剤適量
を提供するように選択するが、勿論、これは薬剤物質に
よっって違ってくる。
本発明のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）及び
インシュリンへの適用を説明する以下の実施例は、本発
明及びそれを実施することを予想した最善方法を充分に
説明するであろう。SODは分子量が約22,000ダルトンの
大きなタンパク質分子であるが、インシュリン分子は分
子量が約6,000ダルトンで比較的小さい。これらタンパ
ク質は共に体内では非常に不安定で、SOD半減期は約５
分、インシュリン（インシュリナーゼにより分解され
る）は約15分である。両者とも自然の形では経口投与で
効果を表わすことができない。SODとインシュリンは一
般のタンパク質を代表するものと考え、それらが分子
量，構造及び機能において相違しているため、本発明を
説明するのに選択したが、一方はホルモン（インシュリ
ン）であり、もう一方は酵素（SOD）である。そうした
多くの相違にも拘わらず、これらの物質は共にコンドロ
イチンとの化学結合によるタンパク質の安定化を有効に
説明する。
・実施例１ スーパーオキシドジスムターゼ 水1ml中5mgのスーパーオキシドジスムターゼ溶液に、
水1ml中5mgのコンドロイチン硫酸塩Ａ（シグマ ケミカ
ル）４及び６−スルフェートの混合液を加え、混合液を
pH4.75に調整した。水0.5ml中5mgの１−エチル−３（３
−ジメチルアミノポロピル）−カルボジイミドハイドロ
クロライド（ECD）を加え、混合液を室温で６時間撹拌
してから一晩水に透析した。溶離のためのpH7のリン酸
塩緩衝液を用い、クロマトグラフィーで混合液を更に精
製した。精製した生成物はコンドロイチンに結合したSO
Dを72％含んでいた。
タンパク質加水分解消化に対する安定性について、SO
D−コンドロイチン硫酸塩Ａをテストした。10mg/mlの生
成物を含む水溶液をpH7.8,23℃で50mcg/mlのトリプシン
で培養し、アリコートを時々取り出してSOD活性を決定
した。比較のためにSODだけを同様の条件下でトリプシ
ンで培養した。40分後、保護しなかったSODの僅かに約
８％と比較して、SOD−コンドロイチン生成物はおよそ8
8％が溶液中に残った。これは、８倍以上の安定性の相
違である。トリプシンは非常に特異的なプロテアーゼ
で、アルギニンとリシン残基でのみ分割することが知ら
れているので、はるかに活発なプロテアーゼであるペプ
シンを用い、ほぼ同様の手順で更にテストを行なった。
ペプシンの最適pHは約1.0〜1.5であることが知られてい
るので、pHを低く（3.5）維持した。試験したペプシン
の最低濃度でさえ、分解は非常に速かったが、保護しな
かったSODに比べ、コンドロイチンによりある程度保護
された。２分で後者は本質的に全て分解したが、前者は
３分で約５％が活性を持ったまま残った。
コンドロイチン−保護SODと、保護していないSODの生
体内安定性を比較するために、ネズミで試験を行なっ
た。ネズミに２つの製剤（10mg/ml）の１つを0.1ml腹膜
腔内に注射した。１時間後、血液標本をとり、血清をリ
ン酸塩緩衝液（5mM、pH7）中クロマトグラフィー（G-10
0）で分析した。溶離前の血清についての試験では、対
照集団で低水準のSODしか示さなかったため、血清調整
中に溶血を除外した。試験結果から、SOD−コンドロイ
チン製剤の僅かに0.5〜２％が１時間後に生体内で加水
分解したが、この時血清は対照のほぼ４倍のSODを含有
していたことがわかった。溶離液の高分子量分画（100,
000ダルトン以上）で、SOD活性のほぼ全部が見られた。
SOD−コンドロイチン製剤は腹膜腔内注射を行なうこと
ができ、循環器系へ入って生体内でタンパク質加水分解
減成を起こしがちな条件下で長時間にわたり行き残るこ
とができることが実験で実証された。
・実施例２ インシュリン コンドロイチン硫酸塩Ａナトリウム塩溶液（水0.5ml
中50mg）をインシュリン溶液（水2.5ml中50mg）と混合
し、混合溶液を1N塩酸でpH1.6に調整した。水0.5ml中50
mgの塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（EDC）を加えてpHを4.6に調整
し、混合液を室温で６時間撹拌した後、pHを7.0に調整
し、一晩水に透析して冷凍乾燥した。コンドロイチン−
インシュリン反応生成物の収率は理論の50％であった。
コンドロイチン−インシュリン反応生成物及び保護さ
れていない（遊離）インシュリンについて、そのタンパ
ク質加水分解減成の相対的感受性を測定するために比較
試験を行なった。この目的で、一般的な非特異的タンパ
ク質加水分解酵素であり、多くの部位で分割するという
理由からプロテアーゼＫを選択した。従って、保護イン
シュリンのタンパク質加水分解に対する感度について、
トリプシンやキモトリプシン等、少ない特異的分割部位
でのみインシュリン分子に作用するはるかに特異的なプ
ロテアーゼが与えるものより良好な認識が得られる。試
験の正確な条件は以下の通りである。
“遊離”インシュリンについては、1mgのインシュリ
ンを1.0mlのリン酸塩緩衝液,pH7.5に懸濁し、それに水1
ml当たり1mgの酵素を含むプロテアーゼＫ溶液10μｌを
加え、所望の時間露出した後、セファデックスG-50カラ
ムで溶液全体をクロマト分析し、タンパク質及びペプチ
ドの溶離を278nmでの吸収を観察することにより測定し
た。所望の露出時間各々について別の試験を行なった。
各試験におけるペプチドの正味損失は、ボイドボリュー
ム以外の全ての画分を集め、真空下でそれらを乾燥して
1.0mlの緩衝液に懸濁し、ビューレット法でペプチドを
分析することにより決定した。
コンドロイチン−インシュリン反応生成物についての
試験では、後者2mgを遊離インシュリン1mgと同等に使用
した。
上記試験の結果から、コンドロイチン−インシュリン
反応生成物は、タンパク質加水分解中の半減期で測定し
て、遊離インシュリンの約７倍も安定していることが証
明されたが、保護インシュリン半減期の105分に比べ、
遊離インシュリンは15分である。
上記の結果は、37℃水中培養中のコンドロイチン−保
護インシュリンの非酵素的減成について更に試験を行な
うことによって確証される傾向にある。12日後、僅かに
約22％のインシュリンが遊離した形で放出された。高度
に架橋結合したコンドロイチン製剤は、50,000gで0.5時
間遠心分離することにより部分的に回収されたが、何ら
混濁の徴候（即ち変性）を示さなかった。
血液グルコースの水準を下げた場合の結合及び遊離イ
ンシュリンの効力を比較するために動物研究を行なっ
た。平均体重20gの雌のCD-1スイス白ネズミを一晩絶食
させ、４つの集団に分けて使用した。インシュリンを皮
下注射し、血液標本（50μl,後眼縁部採血による）を0.
5,3,6及び24時間の間隔で採取した。遊離インシュリン
を1.4,2.8,5.7,11.4,22.8及び45.5μｇ投与し、コンド
ロイチン−インシュリン製剤は、46,96,121,151及び182
μｇ投与した。5.7μｇ以上の遊離インシュリンを投与
したネズミは30分で昏睡状態になり、また全てのレベル
で24時間までにグルコースレベルの重大な反発があっ
た。これに反して、コンドロイチン−インシュリン製剤
を投与したネズミで昏睡状態になったものはなく、それ
らの血液グルコースレベルは24時間後でも継続した抑制
を示し、従って、製剤の延長した生体内活性が実証され
た。
作用の持続についてコンドロイチン−インシュリン製
剤と、亜鉛との複合体であるために持続作用を有してい
るインシュリン製剤ウルトラレンテを比較するためにネ
ズミを使って同様の試験を行なったが、この製剤は遊離
インシュリンよりも長期間貯蔵の形で作用を維持するも
のである。２つの製剤についての試験は、同じ投与量
（5.7,11.4,22.8及び44.5μｇ）と同じ時間で行なっ
た。ウルトラレンテに関しては、全ての動物が45分後に
非常に不活発になるか、或いは昏睡状態になった。コン
ドロイチン−インシュリン製剤ではそうした効果は起ら
なかった。また、ウルトラレンテは、コンドロイチン−
インシュリン製剤とほぼ同様な良好なグルコース抑制を
達成することはなく、また、最高投与量の２つを除いた
全てで著しい反発効果が観察された。
上記の試験から、コンドロイチン−インシュリン製剤
は、遊離インシュリンやウルトラレンテインシュリンよ
り本質的に安全水準が高いことがわかる。更に、製剤の
タンパク質加水分解減成耐性によって、この製剤は好ま
しくは、腸溶性被膜によって胃の環境から保護する投薬
の形での経口投与の第１候補となる。
我々は、本発明を出発物質，プロセス段階，材料及び
条件を含む特別な実施態様、及び生成物の形状や公式に
関して説明したが、そうした事柄は単なる例証であっ
て、限定を意図するものでないことは理解されよう。上
記の記述及び添附した特許請求の範囲から多くの修正や
同等物を実行できることは当業者に容易に明らかであろ
う。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/62 Ａ６１Ｋ 37/26 Ｃ１２Ｎ 9/02 37/50

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】コンドロイチンが共有結合されており、そ
    のため非修飾物質に比較して生体内減成に対する安定性
    が増したことを特徴とする、ホルモン又は酵素から選択
    された化学修飾されたペプチド。
  2. 【請求項２】前記ホルモン又は酵素が単純ペプチドであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の化学修
    飾されたペプチド。
  3. 【請求項３】前記ホルモン又は酵素がポリペプチドであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の化学修
    飾されたペプチド。
  4. 【請求項４】前記ホルモンがタンパク質性ホルモンであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の化学修
    飾されたペプチド。
  5. 【請求項５】前記タンパク質性ホルモンがインシュリン
    であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の化
    学修飾されたペプチド。
  6. 【請求項６】前記ペプチドが酵素であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の化学修飾されたペプチ
    ド。
  7. 【請求項７】前記酵素がスーパーオキシドジスムターゼ
    であることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の化
    学修飾されたペプチド。
  8. 【請求項８】前記コンドロイチンがコンドロイチン−４
    −スルフェートであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の化学修飾されたペプチド。
  9. 【請求項９】前記コンドロイチンがコンドロイチン−６
    −スルフェートであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の化学修飾されたペプチド。
  10. 【請求項１０】前記コンドロイチンが約5,000〜約100,0
    00ダルトンの分子量を有することを特徴とする特許請求
    の範囲第１項記載の化学修飾されたペプチド。
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