JPS62142122A - ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチン - Google Patents
ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチンInfo
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- JPS62142122A JPS62142122A JP28178185A JP28178185A JPS62142122A JP S62142122 A JPS62142122 A JP S62142122A JP 28178185 A JP28178185 A JP 28178185A JP 28178185 A JP28178185 A JP 28178185A JP S62142122 A JPS62142122 A JP S62142122A
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- hbsag
- polysaccharide
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- complex
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔利用分野〕
本発明はＢ型肝炎ウィルス表面抗原（以下ＨＢｓＡｇと
いう）と多糖類との複合体、その製造法および複合体か
らなるＢ型肝炎ワクチンに関する。
いう）と多糖類との複合体、その製造法および複合体か
らなるＢ型肝炎ワクチンに関する。
Ｂ型肝炎ワクチンはＨＢｓＡｇ陽性のキャリアー血液か
らＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理などの
不活化操作を行った後、ＨＢｓＡｇの免疫原性を高める
ために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えたもの
として開発、実用化された。
らＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理などの
不活化操作を行った後、ＨＢｓＡｇの免疫原性を高める
ために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えたもの
として開発、実用化された。
しかし、Ｂ型肝炎ワクチンの生産についてはいくつかの
問題点がある。第１はＨＢｓＡｇの原材料をキャリアー
の血液に依存していることから、ワクチンの供給が制約
されるということ、第２は、キャリアーの血液中には少
量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）が含ま
れることから、唯一の感染しえる動物であるチンパンジ
ーを用いての安全試験が必要になるということである。
問題点がある。第１はＨＢｓＡｇの原材料をキャリアー
の血液に依存していることから、ワクチンの供給が制約
されるということ、第２は、キャリアーの血液中には少
量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）が含ま
れることから、唯一の感染しえる動物であるチンパンジ
ーを用いての安全試験が必要になるということである。
このようなワクチンの生産上の難点を克服する方法とし
て、遺伝子操作の技術が導入された。
て、遺伝子操作の技術が導入された。
組換えＤＮＡ技術は異種のＤＮＡを、ファージまたはプ
ラスミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で
開始された。そしてＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定
、ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同定
、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生
へと発展していった。
ラスミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で
開始された。そしてＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定
、ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同定
、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生
へと発展していった。
こうして、遺伝子操作の技術により、ＨＢｓＡｇを大量
に得、それを高度精製することによりワクチンとする方
法が確立されつつある。
に得、それを高度精製することによりワクチンとする方
法が確立されつつある。
ところで、ワクチンの効力を高める方法としては、ＨＢ
ｓＡｇの高度精製が検討されてきたにすぎず、いまだ明
確に結論づけられてはいない、従うで、本発明の目的は
、力価の高いＢ型肝炎ワクチンを提供することである。
ｓＡｇの高度精製が検討されてきたにすぎず、いまだ明
確に結論づけられてはいない、従うで、本発明の目的は
、力価の高いＢ型肝炎ワクチンを提供することである。
今回、本発明者らは、Ｂ型肝炎ワクチンの効力の増強を
検討した結果、ＨＢｓＡｇを多ｗＭ類を介して重合させ
ることにより、所期の目的を達成できることを見出して
、本発明を完成した。即ち、本発明は、Ｂ型肝炎ウィル
ス表面抗原と多糖類とを結合してなるＢ型肝炎ウィルス
表面抗原複合体、その製造法およびＢ型肝炎ウィルス表
面抗原複合体からなるＢ型肝炎ワクチンに関する。
検討した結果、ＨＢｓＡｇを多ｗＭ類を介して重合させ
ることにより、所期の目的を達成できることを見出して
、本発明を完成した。即ち、本発明は、Ｂ型肝炎ウィル
ス表面抗原と多糖類とを結合してなるＢ型肝炎ウィルス
表面抗原複合体、その製造法およびＢ型肝炎ウィルス表
面抗原複合体からなるＢ型肝炎ワクチンに関する。
本発明において用いられるＨＢｓＡｇとしては、血漿由
来、あるいは遺伝子工学由来のものが用いられる。
来、あるいは遺伝子工学由来のものが用いられる。
このうち、血漿由来の場合は、ＨＢｓＡｇ陽性の血漿よ
り精製されたものであれば、特に限定されない。
り精製されたものであれば、特に限定されない。
その精製方法としては、既知の方法、または、それに準
する方法に従えばよく、例えば特開昭５９−１０１４２
６号明細書などに記載されている。
する方法に従えばよく、例えば特開昭５９−１０１４２
６号明細書などに記載されている。
また、遺伝子工学の由来の場合、遺伝子操作を経てＨＢ
ｓＡｇを発現した菌体からＨＢｓＡｇを抽出、要すれば
精製したものであれば特に限定されない。
ｓＡｇを発現した菌体からＨＢｓＡｇを抽出、要すれば
精製したものであれば特に限定されない。
菌体は特に限定されるものではなく、たとえば大腸菌、
酵母、枯草菌などが例示される。
酵母、枯草菌などが例示される。
遺伝子操作によってＨＢｓＡｇ産生菌を産生させる方法
、抽出法、さらには精製法は、既知の方２ 法またはそ
れに準する方法に従えばよい。
、抽出法、さらには精製法は、既知の方２ 法またはそ
れに準する方法に従えばよい。
かかる方法としては、例えば、大腸菌を使用する方法と
しては特開昭５５−１０４８８７号明細書に、また酵母
を使用する方法としては特開昭５９−４８０８２号明細
書に、更にＨＢｓＡｇ抽出・精製法に関しては特開昭５
９−１０１４２６号及び特願昭５９−１１５１８９号明
細書にその開示がある。
しては特開昭５５−１０４８８７号明細書に、また酵母
を使用する方法としては特開昭５９−４８０８２号明細
書に、更にＨＢｓＡｇ抽出・精製法に関しては特開昭５
９−１０１４２６号及び特願昭５９−１１５１８９号明
細書にその開示がある。
一方、多糖類としては、分子量１０００〜１０万程度の
ものであることが好ましく、生理学的に許容される塩の
形態であってもよい、多糖類の具体例としては、例えば
、デキストラン、セルロース、ハイドロキシエチルセル
ロース、アガロース、デンプン、コンドロイチン硫酸、
アルギン酸またはその生理学的に許容される塩などが挙
げられる。ＨＢｓＡｇと多ｌｌｌ類との結合に際しては
、両者が直接的に結合していてもよく、また他の分子を
介して間接的に結合していてもよい。
ものであることが好ましく、生理学的に許容される塩の
形態であってもよい、多糖類の具体例としては、例えば
、デキストラン、セルロース、ハイドロキシエチルセル
ロース、アガロース、デンプン、コンドロイチン硫酸、
アルギン酸またはその生理学的に許容される塩などが挙
げられる。ＨＢｓＡｇと多ｌｌｌ類との結合に際しては
、両者が直接的に結合していてもよく、また他の分子を
介して間接的に結合していてもよい。
複合体の製法はまず多ｔＩ類の活性化を行い、次いでＨ
ＢｓＡｇと活性化多ＩＪ！類を直接又は炭素数１〜３の
鎖状分子を仲介として結合させる。多糖類の活性化は公
知の方法を利用することができ、例えば共有結合法（ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、） ２５１゜１０８１、１９７
６年〕、多１９ｉ類のアルドヘキソピラノース環の開裂
法（プロシーディンゲス オブ ナショナル アカデミ
−オプ サイエンス（Ｐｒｏｃ。
ＢｓＡｇと活性化多ＩＪ！類を直接又は炭素数１〜３の
鎖状分子を仲介として結合させる。多糖類の活性化は公
知の方法を利用することができ、例えば共有結合法（ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、） ２５１゜１０８１、１９７
６年〕、多１９ｉ類のアルドヘキソピラノース環の開裂
法（プロシーディンゲス オブ ナショナル アカデミ
−オプ サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、 ７３．
２１２８．１９７６年〕、二官能性化合物結合法〔プロ
シーデインダス オブ ナショナル アカデミ−オブ
サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、） Ｕ Ｓ Ａ、 ７３，２１２８．１９７６年
〕等がある。
２１２８．１９７６年〕、二官能性化合物結合法〔プロ
シーデインダス オブ ナショナル アカデミ−オブ
サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、） Ｕ Ｓ Ａ、 ７３，２１２８．１９７６年
〕等がある。
共有結合法は、通常、多＄）！類１■に対してシアンブ
ロマイドを０．０５〜１曙の割合で添加し、そのｐＨを
約９〜１１．５に調整して室温で約２〜１０分間反応さ
せることによって行われる。反応終了後過剰のハロゲン
化物を除去し、得られた活性北条ＩＪ［にＨＢｓＡｇを
接触させる。ＨＢ Ｓ Ａｇと活性化多糖類の結合反応
はＨＢｓＡｇ１００重量部に対して゛活性化多糖類２０
〜２０００重量部の割合で混合し、ｐｌ＋を７．２〜１
１に調整し、温度３〜２５℃で０．５〜４８時間接触さ
せる。これらの活性化および結合の反応式は次の通りで
ある。
ロマイドを０．０５〜１曙の割合で添加し、そのｐＨを
約９〜１１．５に調整して室温で約２〜１０分間反応さ
せることによって行われる。反応終了後過剰のハロゲン
化物を除去し、得られた活性北条ＩＪ［にＨＢｓＡｇを
接触させる。ＨＢ Ｓ Ａｇと活性化多糖類の結合反応
はＨＢｓＡｇ１００重量部に対して゛活性化多糖類２０
〜２０００重量部の割合で混合し、ｐｌ＋を７．２〜１
１に調整し、温度３〜２５℃で０．５〜４８時間接触さ
せる。これらの活性化および結合の反応式は次の通りで
ある。
（多糖類）
（式中、ＮＨ２−ＰはＨＢｓＡｇを示す）アルドヘキソ
ースピラノース環の開裂法は、通常酸化剤として、たと
えば過ヨウ素酸ナトリウムを用い、多糖類１■に対して
約０．０１−１．０■の酸化剤を添加し、５〜２０時間
処理することによって行われる。反応の終了後過剰の添
加物を除去し、得られた活性化多糖類にＨＢ Ｓ Ａｇ
とを反応させる。ＨＢｓＡｇと活性化多糖類との反応は
通常、ＨＢｓＡｇｌＯＯ重量部に対して活性化多糖類２
０〜２０００重量部を反応させることによって行われる
。この際、ＨＢｓＡｇは水溶液として、また活性化多糖
類！類はリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）溶液として反応に
供される。かくして得られた化合物を還元することによ
って目的物とする複合体が得られるが、この際、還元剤
としては、たとえば水素化ホウ素金属塩が使用され、特
に好ましくは水素化ホウ素による還元の前に水素化シア
ンホウ素金属塩にて還元する。水素化ホウ素金属塩およ
び水素化シアンホウ素金属塩としては各々アルカリ金属
塩（たとえば、ナトリウム塩）が好ましいものとして例
示される。当該還元は、通常θ〜３０℃、好ましくは４
℃にて６〜１２時間攪拌することによって行われる。こ
れらの反応式は次の通りである。
ースピラノース環の開裂法は、通常酸化剤として、たと
えば過ヨウ素酸ナトリウムを用い、多糖類１■に対して
約０．０１−１．０■の酸化剤を添加し、５〜２０時間
処理することによって行われる。反応の終了後過剰の添
加物を除去し、得られた活性化多糖類にＨＢ Ｓ Ａｇ
とを反応させる。ＨＢｓＡｇと活性化多糖類との反応は
通常、ＨＢｓＡｇｌＯＯ重量部に対して活性化多糖類２
０〜２０００重量部を反応させることによって行われる
。この際、ＨＢｓＡｇは水溶液として、また活性化多糖
類！類はリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）溶液として反応に
供される。かくして得られた化合物を還元することによ
って目的物とする複合体が得られるが、この際、還元剤
としては、たとえば水素化ホウ素金属塩が使用され、特
に好ましくは水素化ホウ素による還元の前に水素化シア
ンホウ素金属塩にて還元する。水素化ホウ素金属塩およ
び水素化シアンホウ素金属塩としては各々アルカリ金属
塩（たとえば、ナトリウム塩）が好ましいものとして例
示される。当該還元は、通常θ〜３０℃、好ましくは４
℃にて６〜１２時間攪拌することによって行われる。こ
れらの反応式は次の通りである。
Ｃｌ−０１１ＣｕｔＯＣＨＯＣｕｔ−０１１（多糖類）
（式中、ＮＨ，−ＰはＨＢｓＡｇを示す）二官能性化合
物結合法は、たとえばシアンブロマイドで多Ｗ［を活性
化し、この活性化多糖類に二官能性化合物にたとえばジ
アミノエタンを結合させて炭素数１〜３の鎖状分子を生
成し、さらにブロムアセチルプロミドを結合させたのち
、ＨＢｓＡｇと反応させる。ＨＢｓＡｇと活性化多糖類
の結合反応はＨＢｓＡｇ１００重量部に対して活性化多
糖類２０〜２０００重景部の割合で混合し、ｐ１１７．
２〜１１に８周整し、温度３〜２５°Ｃで０．５〜４８
時間行われる。これらの活性化および結合反応式は次の
通りである。
物結合法は、たとえばシアンブロマイドで多Ｗ［を活性
化し、この活性化多糖類に二官能性化合物にたとえばジ
アミノエタンを結合させて炭素数１〜３の鎖状分子を生
成し、さらにブロムアセチルプロミドを結合させたのち
、ＨＢｓＡｇと反応させる。ＨＢｓＡｇと活性化多糖類
の結合反応はＨＢｓＡｇ１００重量部に対して活性化多
糖類２０〜２０００重景部の割合で混合し、ｐ１１７．
２〜１１に８周整し、温度３〜２５°Ｃで０．５〜４８
時間行われる。これらの活性化および結合反応式は次の
通りである。
（以下余白、次頁に続く）
（多零唐類）
（式中、ＮＨ，−ＰはＨＢ３Ａｇを示す）かくして得ら
れたＨＢｓＡｇ−多糖類複合体は、公知のゲル濾過法、
分子篩刑法、イオン交換法により回収・精製されるが、
ゲル濾過法で分画した場合はＨＢ ｓ Ａ ｇ−多糖類
複合体と未結合の多糖類がきわめて明瞭な差異を持って
挙動することから、目的とする複合体の回収が容易に行
いうる。
れたＨＢｓＡｇ−多糖類複合体は、公知のゲル濾過法、
分子篩刑法、イオン交換法により回収・精製されるが、
ゲル濾過法で分画した場合はＨＢ ｓ Ａ ｇ−多糖類
複合体と未結合の多糖類がきわめて明瞭な差異を持って
挙動することから、目的とする複合体の回収が容易に行
いうる。
このＨＢ ｓ Ａ ｇ−多ＩＪ！類複合体は分子量１０
０万〜５００万、ＨＢ ｓ Ａ ｇと多糖類のモル比ｌ
；１〜１：３０である。
０万〜５００万、ＨＢ ｓ Ａ ｇと多糖類のモル比ｌ
；１〜１：３０である。
本発明のＨＢｓＡｇ−多Ｉ＋！ ［複合体は医薬品、（
特にＢ型肝炎ワクチン）、診断試薬等として有用である
。即ち、除菌濾過および加熱処理等を行った後背注し、
ＨＢＳＡｇ−多ｖＩｉ類複合体製剤を得る。必要に応じ
、凍結乾燥することもできる。
特にＢ型肝炎ワクチン）、診断試薬等として有用である
。即ち、除菌濾過および加熱処理等を行った後背注し、
ＨＢＳＡｇ−多ｖＩｉ類複合体製剤を得る。必要に応じ
、凍結乾燥することもできる。
また、この本発明ワクチンは好適にはマンニット、乳糖
、グリシンなど、この分野で既知の賦形剤が添加される
。
、グリシンなど、この分野で既知の賦形剤が添加される
。
本発明ワクチンは、その免疫能を高めるために、免疫補
助剤に吸着させて使用することが好ましい。
助剤に吸着させて使用することが好ましい。
免疫補助剤としては水酸化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウムなどが用いられる。
ウムなどが用いられる。
なお、本発明ワクチンは、筋肉、皮下等に（好ましくは
皮下）非経口投与される。その投与量は年齢、体重等に
よって異なるが、通常１回１〜１０イ程度である。
皮下）非経口投与される。その投与量は年齢、体重等に
よって異なるが、通常１回１〜１０イ程度である。
本発明のワクチンは、ワクチンとしての効力が従来の製
品に比べて改善されており、少量でも有効なことが確認
されている。
品に比べて改善されており、少量でも有効なことが確認
されている。
また本発明のワクチンは、Ｂ型肝炎の感染性がなく、ま
た人血漿成分を含まないので極めて安全である。
た人血漿成分を含まないので極めて安全である。
本発明の詳細な説明するために、実施例および実験例を
挙げるが、本発明はこれらによって何等限定されるもの
ではない。
挙げるが、本発明はこれらによって何等限定されるもの
ではない。
実施例１
特開昭５９−４８０８２号により遺伝子組換え技術を用
いて酵母にＨＢｓＡｇを産生せしめ、抽出・精製を行っ
た。
いて酵母にＨＢｓＡｇを産生せしめ、抽出・精製を行っ
た。
デキストラン（分子量１万）１００■ヲ０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム１０−に溶解した後、臭化シアン３０■をシア
ン化メタン０．５−に溶解した液を滴下して室温にて５
分Ｂ攪拌した。この間、１Ｍ水酸化ナトリウム液を用い
て反応液のｐＨを１０．５に保ち、デキストランの活性
化反応を行った。その後、濃塩酸にてｐＨを８．５に下
げて反応を停止させ、反応混合物をセファデックスＧ−
２５カラムにてゲル濾過し、未反応物を除去して、活性
化デキストラン液を得た。
トリウム１０−に溶解した後、臭化シアン３０■をシア
ン化メタン０．５−に溶解した液を滴下して室温にて５
分Ｂ攪拌した。この間、１Ｍ水酸化ナトリウム液を用い
て反応液のｐＨを１０．５に保ち、デキストランの活性
化反応を行った。その後、濃塩酸にてｐＨを８．５に下
げて反応を停止させ、反応混合物をセファデックスＧ−
２５カラムにてゲル濾過し、未反応物を除去して、活性
化デキストラン液を得た。
次に、精製ＨＢｓＡｇｌＯ■を活性化デキストラン液に
加えて溶解し、室温にて一夜緩く攪拌しながら反応を行
った。終了後、反応液をセファデックスＧ−２００のカ
ラムにてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体
画分と未反応のデキストランとを分別した。さらにこの
複合体画分を等張化リン酸緩衝液で透析を行った。
加えて溶解し、室温にて一夜緩く攪拌しながら反応を行
った。終了後、反応液をセファデックスＧ−２００のカ
ラムにてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体
画分と未反応のデキストランとを分別した。さらにこの
複合体画分を等張化リン酸緩衝液で透析を行った。
こうして得たＨＢＳ Ａｇ−デキストラン複合体画分９
１１ｆを除菌濾過して、滅菌した水酸化アルミニウムと
混合し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体製剤（ワクチ
ン）を得た。
１１ｆを除菌濾過して、滅菌した水酸化アルミニウムと
混合し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体製剤（ワクチ
ン）を得た。
実施例２
デキストラン（分子量１万）Ｉｇを秤取し、これに蒸留
水２０ｍｊを加え溶解させ、３５０■の過ヨウ素酸ナト
リウムを蒸留水５ｍＺに溶解させたものを添加し、室温
で暗所にて３０分間攪拌した。
水２０ｍｊを加え溶解させ、３５０■の過ヨウ素酸ナト
リウムを蒸留水５ｍＺに溶解させたものを添加し、室温
で暗所にて３０分間攪拌した。
攪拌後、４Ｍの水酸化ナトリウム溶液で中和し、水で充
分透析した。透析後、凍結乾燥した。次に実施例１で用
いた酵母由来ＨＢｓＡｇｌＯ■を含有する水溶液４ａｎ
ｌに上記の活性化デキストラン２８■を０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させたものを加え、さらに水
素化シアノホウ素ナトリウムを１．２２曙添加し、４℃
にて１８時間攪拌した。
分透析した。透析後、凍結乾燥した。次に実施例１で用
いた酵母由来ＨＢｓＡｇｌＯ■を含有する水溶液４ａｎ
ｌに上記の活性化デキストラン２８■を０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させたものを加え、さらに水
素化シアノホウ素ナトリウムを１．２２曙添加し、４℃
にて１８時間攪拌した。
攪拌後、水素化ホウ素ナトリウムを３．３■を０１１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させたものを加え、４℃
にて１８時間攪拌した。ＰＲ拌後、上記緩衝液にて透析
した。得られた反応混合物をセファデックスＧ−２００
のカラムにかけてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇと上記デキス
トランの複合体と未反応のデキストランとを分別する。
リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させたものを加え、４℃
にて１８時間攪拌した。ＰＲ拌後、上記緩衝液にて透析
した。得られた反応混合物をセファデックスＧ−２００
のカラムにかけてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇと上記デキス
トランの複合体と未反応のデキストランとを分別する。
分別して得られた複合体画分を集め、除菌濾過を行い、
分注し、凍結乾燥してＨＢ ｓ）、 ｇ−デキストラン
複合体の製剤を得た。
分注し、凍結乾燥してＨＢ ｓ）、 ｇ−デキストラン
複合体の製剤を得た。
実施例３
デキストラン（分子ｆｆ１１万）Ｉｇに蒸留水４９ｍ１
を加えて溶かし、これに臭化シアン１５０■をシアン化
メタン１． ｓ ＠Ｚに溶かした液を滴加して十分に撹
拌する。この間１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐ、１１０．
２〜１０．５に維持する０反応開始より５分経過後に濃
塩酸にてｐＨ２，２に下げ、ジアミノエタン２−を加え
てｐＨ９，５に上げ、ＰＨ９，５に保って４℃で一夜静
置する。この後蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
てアミンエチルアミノデキストランを得た。次にこれを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）２５ｍｌに溶解
し、ブロムアセチルプロミドｌ ｍｌを滴下し、約２時
間ＬＭ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に保ったのち蒸留
水で透析し、凍結乾燥して活性化デキストラン末を得る
。その５ｈｇを０．１ Ｍ炭酸緩衝液（ｐｔ１９．５
） ０．４ ｍｌに溶かし、実施例１で用いた酵母由来
ＨＢｓＡｇ５ＬＩｇを加え、約５℃にて５０時間静置し
て結合反応を行った。
を加えて溶かし、これに臭化シアン１５０■をシアン化
メタン１． ｓ ＠Ｚに溶かした液を滴加して十分に撹
拌する。この間１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐ、１１０．
２〜１０．５に維持する０反応開始より５分経過後に濃
塩酸にてｐＨ２，２に下げ、ジアミノエタン２−を加え
てｐＨ９，５に上げ、ＰＨ９，５に保って４℃で一夜静
置する。この後蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
てアミンエチルアミノデキストランを得た。次にこれを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）２５ｍｌに溶解
し、ブロムアセチルプロミドｌ ｍｌを滴下し、約２時
間ＬＭ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に保ったのち蒸留
水で透析し、凍結乾燥して活性化デキストラン末を得る
。その５ｈｇを０．１ Ｍ炭酸緩衝液（ｐｔ１９．５
） ０．４ ｍｌに溶かし、実施例１で用いた酵母由来
ＨＢｓＡｇ５ＬＩｇを加え、約５℃にて５０時間静置し
て結合反応を行った。
次いで反応混合物をセファデックスＧ−２００のカラム
にかけてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体
画分を得た。
にかけてゲル濾過し、ＨＢｓＡｇ−デキストラン複合体
画分を得た。
実施例４
特開昭５９−１０１４２６号により調製した血漿由来の
ＨＢｓＡｇを用いた。
ＨＢｓＡｇを用いた。
デキストラン（分子量１万）の代わりに、アルギン酸ナ
トリウム（分子量４万）を用いる以外は実施例１に準じ
て行い、ＨＢｓＡｇ−アルギン酸ナトリウム複合体３ｍ
ｇを得て、ワクチンとして製剤化した。
トリウム（分子量４万）を用いる以外は実施例１に準じ
て行い、ＨＢｓＡｇ−アルギン酸ナトリウム複合体３ｍ
ｇを得て、ワクチンとして製剤化した。
実施例５
デキストラン（分子、１１万）の代わりに、コンドロイ
チン硫酸（分子量４万）を用いる以外は実施例１に準じ
て行い、ＨＢｓＡｇ−コンドロイチン硫酸複合体８ｍｇ
を得た上で、ワクチンとして製剤化した。
チン硫酸（分子量４万）を用いる以外は実施例１に準じ
て行い、ＨＢｓＡｇ−コンドロイチン硫酸複合体８ｍｇ
を得た上で、ワクチンとして製剤化した。
各実施例で得られた複合体の平均分子量と構成モル比は
第１表の通りであった。
第１表の通りであった。
なお、平均分子量はゲル濾過法より、モル比は吸光法（
ＨＢｓＡｇは２８０ｎｍ、多＄１）は４９０ｎａ＋）よ
り求めた。
ＨＢｓＡｇは２８０ｎｍ、多＄１）は４９０ｎａ＋）よ
り求めた。
（以下余白、次頁に続く）
実験例
本発明の複合体と、ＨＢＳＡｇそのもののワクチンとし
ての効力を比較した。
ての効力を比較した。
実施例１により得られた複合体をＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系
雌性マウス（生後約５退会）に投与した。投与量は、Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇとして０．２５〜４ ｐｇに相当する量
であった。投与後、５週目に血清中のＨＢｓ抗体価を測
定した。抗体価は受身赤血球凝集反応法により測定した
。
雌性マウス（生後約５退会）に投与した。投与量は、Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇとして０．２５〜４ ｐｇに相当する量
であった。投与後、５週目に血清中のＨＢｓ抗体価を測
定した。抗体価は受身赤血球凝集反応法により測定した
。
対照は実施例１で用いたＨＢＳＡｇを用いた。
結果は第２表および第１図に示す通りであった。
（以下余白、次頁に続く）
本発明複合体投与群では、０．２５ ｐｇでも金側に抗
体の産生が認められたが、ＨＢｓＡｇ投与群では０゜５
ＰＫ以上で抗体の産生が認められた。ＨＢｓＡｇの投与
量と抗体価との関係より、抗体価１：８を産生せしめる
のに必要なＨＢｓＡｇ投与量を求め、両群を比較すると
、複合体投与群はＨＢｓＡｇ投与群の約４分の１量、す
なわちワクチンとしての力価は多ｔＪ！［と結合させる
ことにより４倍に上昇することが判った。
体の産生が認められたが、ＨＢｓＡｇ投与群では０゜５
ＰＫ以上で抗体の産生が認められた。ＨＢｓＡｇの投与
量と抗体価との関係より、抗体価１：８を産生せしめる
のに必要なＨＢｓＡｇ投与量を求め、両群を比較すると
、複合体投与群はＨＢｓＡｇ投与群の約４分の１量、す
なわちワクチンとしての力価は多ｔＪ！［と結合させる
ことにより４倍に上昇することが判った。
第１図は実験例の結果をグラフに示したものである。○
は本発明による複合体を投与したもの、・はＨＢｓＡｇ
を投与したものである。 第１図 ０．２５ ０．５ ＋、０ ２．０
４刀１糧（阿）
は本発明による複合体を投与したもの、・はＨＢｓＡｇ
を投与したものである。 第１図 ０．２５ ０．５ ＋、０ ２．０
４刀１糧（阿）
Claims (6)
- （１）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原と多糖類とを結合して
なるＢ型肝炎ウィルス表面抗原複合体。 - （２）多糖類がデキストラン、セルロース、ハイドロキ
シエチルセルロース、アガロース、デンプン、コンドロ
イチン硫酸もしくはアルギン酸またはその生理学的に許
容される塩である特許請求の範囲第（１）項記載のＢ型
肝炎ウィルス表面抗原複合体。 - （３）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原と多糖類を結合させる
ことを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表面抗原複合体の製
造法。 - （４）多糖類がデキストラン、セルロース、ハイドロキ
シエチルセルロース、アガロース、デンプン、コンドロ
イチン硫酸もしくはアルギン酸またはその生理学的に許
容される塩である特許請求の範囲第（３）項記載のＢ型
肝炎ウィルス表面抗原複合体の製造法。 - （５）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原と多糖類を結合したＢ
型肝炎ウィルス表面抗原複合体からなるＢ型肝炎ワクチ
ン。 - （６）多糖類がデキストラン、セルロース、ハイドロキ
シエチルセルロース、アガロース、デンプン、コンドロ
イチン硫酸もしくはアルギン酸またはその生理学的に許
容される塩である特許請求の範囲第（５）項記載のＢ型
肝炎ワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28178185A JPS62142122A (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28178185A JPS62142122A (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62142122A true JPS62142122A (ja) | 1987-06-25 |
Family
ID=17643883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28178185A Pending JPS62142122A (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | ＨＢｓＡｇ複合体、その製造法およびＨＢワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62142122A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62255435A (ja) * | 1984-12-06 | 1987-11-07 | バイオリリース テクノロジース インコーポレイテッド | 安定性タンパク質及びタンパク質の安定化法 |
| EP0322742A2 (de) * | 1987-12-24 | 1989-07-05 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung einer haptenisierten Polysaccharidmatrix |
| EP0326111A2 (en) * | 1988-01-29 | 1989-08-02 | New York Blood Center, Inc. | Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant |
-
1985
- 1985-12-13 JP JP28178185A patent/JPS62142122A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62255435A (ja) * | 1984-12-06 | 1987-11-07 | バイオリリース テクノロジース インコーポレイテッド | 安定性タンパク質及びタンパク質の安定化法 |
| JP2537602B2 (ja) * | 1984-12-06 | 1996-09-25 | バイオリリース テクノロジース インコーポレイテッド | 安定性タンパク質及びタンパク質の安定化法 |
| EP0322742A2 (de) * | 1987-12-24 | 1989-07-05 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung einer haptenisierten Polysaccharidmatrix |
| US5045535A (en) * | 1987-12-24 | 1991-09-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method, apparatus and a composition for a polysaccharide-containing matrix having covalently bound haptens |
| EP0322742B1 (de) * | 1987-12-24 | 1994-03-09 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung einer haptenisierten Polysaccharidmatrix |
| EP0326111A2 (en) * | 1988-01-29 | 1989-08-02 | New York Blood Center, Inc. | Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant |
| EP0326111A3 (en) * | 1988-01-29 | 1989-12-27 | New York Blood Center, Inc. | Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant |
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