JPH05262668A - ヘモフィルス・インフルエンザｂ多糖類外毒素トキソイド抱合体ワクチン用ハプテン - Google Patents

ヘモフィルス・インフルエンザｂ多糖類外毒素トキソイド抱合体ワクチン用ハプテン

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JPH05262668A
JPH05262668A JP3056227A JP5622791A JPH05262668A JP H05262668 A JPH05262668 A JP H05262668A JP 3056227 A JP3056227 A JP 3056227A JP 5622791 A JP5622791 A JP 5622791A JP H05262668 A JPH05262668 A JP H05262668A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 幼児および若年の子供におけるヘモフィルス
感染症の予防に有用なワクチンの多糖類−トキソイド抱
合体製造用ハプテンを提供する。 【構成】 ほぼ等モル量のリボース、リビトールおよび
リン酸塩からなり、２０％未満が分子の大きさ２００,
０００ダルトン未満、２０％未満が分子の大きさ２,０
００,０００ダルトンを越えるまで加熱されてなるハロ
ゲン化シアン活性化莢膜ヘモフィルス・インフルエンザ
Ｂ多糖類から調製された、実質的に蛋白および核酸を含
まないハプテン。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の概要】本発明は、多糖類−ジフテリア・トキソ
イド抱合体(conjugate)(ＰＲＰ−Ｄ)ワクチンおよび多
糖類−破傷風トキソイド抱合体(ＰＲＰ−Ｔ)ワクチンで
例示される新規なヘモフィルス・インフルエンザ(Ｈaem
ophilus influenzae)Ｂ多糖類−外毒素トキソイド製造
用の多糖類ハプテンに関する。該多糖類は、加熱処理に
よって分子の大きさを主として２００,０００および２,
０００,０００ダルトンの間に調整し、ほぼ等モル量の
リボース、リビトールおよびリン酸塩からなり、つい
で、活性化剤、典型的には臭化シアンで活性化した純粋
なヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類である。本明
細書で述べる分子の大きさはゲル・パーミエイション・
クロマトグラフィーによるデキストラン・スタンダード
に準拠している。該活性化された多糖類を外毒素トキソ
イド、好ましくはジフテリア・トキソイドと均密に混合
して抱合を行なう。好ましくは、該外毒素トキソイドは
スペーサーとして４〜８個の炭素の橋を用いて、例え
ば、ジフテリア・トキソイド(Ｄ−ＡＨ)のアジピン酸ヒ
ドラジド誘導体のように誘導体化される。使用できる別
の誘導体化外毒素トキソイドには破傷風トキソイド(Ｔ
−ＡＨ)が包含される。該外毒素トキソイドは複数のＡ
Ｈ単位と結合している。
【０００２】この方法を用いることにより、ヘモフィル
ス・インフルエンザＢからの多糖類に対するＴ−細胞依
存性応答をもたらす抱合体ワクチンが得られる。
【０００３】かかる抱合体は幼児および若年の子供にお
けるヘモフィルス感染症の予防に使用するのにことに有
益である。
【０００４】本発明によれば、ジフテリアや破傷風のよ
うな病気に対する免疫付与のために有用な抱合体ワクチ
ンを利用できるようにする。ヒトにおけるかかる抱合体
の効力は通常のジフテリアおよび破傷風トキソイド調製
物のものより大きい。過剰の活性化剤の注意深い調節お
よび除去により、該方法はスペーサーを介して複数の外
毒素トキソイド分子が単一の多糖類分子に結合してな
る、実質的に架橋もしくは重合誘導体を含まない多糖類
抱合体を与える。その式は一般的にＰＲＰ−Ｘnと表わ
すことができ、ここに、Ｘはトキソイド部分、ｎは２０
以下の整数、典型的な平均は７〜８である。(本明細書
においては、整数ｎを用いることなく、ジフテリア・ト
キソイド抱合体をＰＲＰ−Ｄと、破傷風抱合体をＰＲＰ
−Ｔと称する。)
【０００５】
【発明の開示】安定な液素性免疫の発生は少なくとも２
つの別々のリンパ細胞セットによる異物の認識を必要と
する。これらのセットは抗体形成細胞の前駆体であるＢ
−リンパ細胞およびＢ−細胞の機能を調節するＴ−リン
パ細胞である。数種の多糖類を含め、いくつかの抗原は
Ｂ−細胞を直接刺激して抗体を生じさせることができる
が(Ｔ−非依存性抗原)、大部分の抗原(Ｔ−依存性)はＴ
−リンパ細胞により、Ｂ−細胞に与えられなければなら
ない。本発明のハプテンから得られるワクチンの場合、
ワクチンの外毒素トキソイド部分がＴ−細胞系により認
識される。該蛋白はそれ自体の抗原性決定子と、共有結
合したＰＲＰハプテンの両方を有しているので、決定子
の両方のセットがＴ−細胞によりＢ−細胞に与えられな
ければならない。この担体−ハプテン抱合体調製物の投
与の結果はＰＲＰがＴ−依存性免疫原として与えられる
こととなる。ＰＲＰのＴ−依存性授与が、もっとも危険
の大きい目標集団である幼児に保護免疫を誘導する。し
たがって、該抱合体ワクチンは小さな幼児において特に
価値あるものである。かかる抱合体の女性への投与は、
ワクチン抗原に対する高い割合のＩgＧ抗体を誘導し、
これは妊娠の間に胎盤関門を通り、かくして、幼児に誕
生から保護を与える。
【０００６】Ｔ−非依存性抗原はＢ−細胞を誘導して最
終的に抗体分泌細胞(形質球)に分化させ、一方、Ｔ−依
存性応答は相当に、より複雑である。Ｔ−依存性刺激を
受けた後、Ｂ−細胞群は抗体形成のみならず、増殖およ
び熟成をも開始する。その結果、ＰＲＰに対する抗体生
成Ｂ−細胞数の増加と、ＰＲＰに対する第２回目の暴露
に応答できるＢ−細胞数の増加をもたらせる。くり返し
免疫付与はさらにＰＲＰ特異性Ｂ−細胞数の増加、した
がって、高い抗体力価、増強応答をもたらせる。要約す
ると、Ｔ−非依存性応答は感応性Ｂ−細胞の数によって
制限されるが、Ｔ−依存性応答は抗原感応性細胞の合計
数の増加をもたらす。
【０００７】該ＰＲＰ−外毒素トキソイド・ワクチンは
実験動物においてＴ−依存性免疫原として機能すること
が証明されている。ＰＲＰ−Ｄの標準的投与で連続的に
免疫付与された一群のウサギは全て増強応答を示した。
加えて、該抱合体に用いた担体蛋白、例えば、ＰＲＰ−
Ｄ用のジフテリア・トキソイドでの一次免疫付与は、Ｐ
ＲＰ−外毒素トキソイド抱合体のＰＲＰ成分に対する最
初の応答を増大させることが示された。同様なＰＲＰ応
答の増大は、抱合体に用いた以外の外毒素トキソイドで
初回免疫刺激を受けた動物では見られなかった。
【０００８】該ワクチンはＰＲＰ−外毒素トキソイド・
ハプテン−担体抱合体である。かかるワクチンにおいて
は、該抗原性、かつ、弱い免疫原性のハプテン分子(Ｐ
ＲＰ)がジフテリア(Ｄ)または破傷風トキソイド(Ｔ)の
ような高い免疫原性担体分子に対する新規な抗原特異性
を与える。
【０００９】該調製物における担体として用いる精製ジ
フテリア・トキソイド(Ｄ)は、水溶性カルボジイミド縮
合法を用いて、アジピン酸ジヒドラジド(ＡＤＨ)のよう
な４〜８個の炭素のスペーサー分子の結合により修飾
(誘導体化)された商業的外毒素トキソイドである。該修
飾外毒素トキソイド、典型的にはアジピン酸ヒドラジド
誘導体Ｘ−ＡＨは、ついで、未反応のＡＤＨから分離さ
れる。これは可溶性物質で、実質的に架橋されておら
ず、このことはゲルクロマトグラフィーおよびポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって測定されるような分子
の大きさに実質的な増加がないことによって証明され
る。
【００１０】ヘモフィルス・インフルエンザＢの莢膜多
糖類は、認可された多糖類ワクチンに用いられているよ
うな商業的な源から調製され、コンノート・ラボラトリ
ース(Ｃonnaught Ｌaboratories)から入手できる。しか
し、該多糖類は通常、カルシウム塩として精製されてい
るが、カルシウムイオンの使用はさける。なぜなら、そ
れらは抱合操作における炭酸塩緩衝剤の使用を妨害する
からである。ついで、該ハプテンに所望の寸法が得られ
るまで加熱することにより、該多糖類の分子の大きさを
調整する。典型的には、該液体多糖類の１００℃におけ
る１５分間の加熱が、分子の２０％未満が２００,００
０ダルトンより小さい分子の大きさで、２０％未満が
２,０００,０００ダルトンより大きい分子の大きさであ
ることを保証するために充分である。この大きさ規制操
作は適正なＰＲＰ−ＤまたはＰＲＰ−Ｔ抱合体を得るた
めに重要である。
【００１１】かくして得られた、大きさを規制した多糖
類を、ハロゲン化シアンまたは水素化ホウ素ナトリウム
のような該多糖類上に親電子基を生じさせる活性化剤で
活性化する。用いる典型的な活性化剤は臭化シアンであ
る。未反応の活性化剤は徹底的に除去する。なぜなら、
実質的な残留があると、それが以後の反応混合物中で該
蛋白の架橋を生じるからである。生じた架橋生成物は多
糖類をトラップし、ワクチンの収率を低下させ、本発明
で得られる抱合体と化学的性質および溶解度の異なる、
分子の大きさのより大きい抱合体および該ワクチンの所
望の比率を欠くワクチンを生じさせる。
【００１２】ついで、活性化したＰＲＰおよびＸ−ＡＨ
を合し、冷所で反応させる。該誘導体化した外毒素トキ
ソイド上のヒドラジド基のいくつかがＰＲＰ上の活性化
部位と反応し、共有結合を形成する。生成物は４〜８個
の炭素の橋を介して誘導体化外毒素トキソイドに共有結
合したＰＲＰである。この反応生成物を、ゲル・パーミ
エイション・クロマトグラフィーでいずれもの未反応蛋
白および分子の大きさの小さい混入物を除去して精製す
る。主要フラクションの典型的な分子の大きさはデキス
トラン・スタンダードに準拠して６７５,０００ダルト
ンである。相対的な分子の大きさについての典型的な範
囲は１４０,０００ダルトン〜４,５００,０００ダルト
ンである。
【００１３】チメロサールのような保存剤を、チメロサ
ールの場合、１:１０,０００の最終濃度で加える。バル
ク濃縮物を０．２ミクロンのメンブラン・フイルターを
通して濾過し、冷所で保存する。
【００１４】該ＰＲＰ−外毒素トキソイド抱合体生成物
は耐熱性で水溶性である。架橋のないことは、ゲル・パ
ーミエイション・クロマトグラフィーにより、また、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により測定されるごと
く、分子の大きさに出発多糖類のそれからの実質的な増
加がないことにより証明される。熱安定性が長い製品寿
命および、たとえ望ましくない環境中でも安定な製品を
保証する。
【００１５】該反応は２工程として図式的に表わすこと
ができる。 (１)ＰＲＰ＋ＣＮＢr → ＰＲＰ＊ (２)ＰＲＰ＊＋ｎＸ → ＰＲＰ(−Ｘ）n
【００１６】もし、該ハロゲン化シアンの除去が効率的
に行なわれなければ、活性化ＰＲＰと外毒素トキソイド
の抱合でＰＲＰ(−Ｘ）nが形成するほかに、Ｘ−Ｘまた
は重複して結合した誘導体の形成、例えば、
【化１】 のような望ましくない反応が起る。
【００１７】皮下または皮内注射についてのＰＲＰ−外
毒素トキソイド抱合体ワクチンの典型的なヒトへの投与
量はリボース１０μgもしくは該抱合体生成物のほぼ４
０μg相当を含有する０．５mlからなる。アンプル溶液
は、保存剤としてチメロサールを用い、該バルク濃縮物
をリン酸塩緩衝食塩溶液で希釈することにより調製され
る。
【００１８】該生成物はヒトにおいて、該ＰＲＰおよび
外毒素トキソイド成分の両方に対する抗体形成を誘導す
る。本発明をさらに詳細に説明するためにつぎの実施例
を提供する。これらは本発明をその精神または範囲にお
いて限定するものと理解されるべきものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１ ＰＲＰの調製 Ａ．生物 ヘモフィルス・インフルエンザＢの莢膜ポリリボシル・
リビトール・リン酸塩(ＰＲＰ)をそのイーガン(Ｅagan)
株から調製した。培養菌をくり返し移植し、凍結乾燥種
菌を調製した。この凍結乾燥種菌から、さらに１回移植
を行ない湿潤作業用種菌を調製した(−６０℃で保存)。
該湿潤作業用種菌から菌体の醗酵器ロットを調製した。
【００２０】培養純度をつぎの基準によって判定する。 １．陰性グラム染色特性 ２．ＮＡＤ(ジホスホピリジン・ヌクレオチド)およびヘ
ミン(フェリヘムのウシ型Ｉ結晶塩)含有寒天上で増殖、 ３．ＮＡＤまたはヘミン不含寒天上で増殖せず、および ４．特異抗血清(Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ
Ｂ、ヘイランド・ラボラトリース(Ｈyland Ｌaboratori
es))により凝集。
【００２１】Ｂ．培養および培地 細菌を継代培養するため、すなわち、醗酵器の接種に先
立って、ＢＨＩ寒天(１リットル当り、３７ｇＢＨＩ(Ｄ
ifco)、１５ｇバクト寒天(Ｄifco)、０.６mlの１％ＮＡ
Ｄ(Ｓigma−ＧradeＩＩＩ)および６mlの０.２％ヘミン
(Ｓigma−Ｂovine Ｔype１))を用いた。寒天表面から洗
い出した菌体(２０時間)を用いてヘモフィルス・インフ
ルエンザＢ(Ｈib)液体培地(１リットルづつ)に接種す
る。これらの培養物を振盪しながら、該細菌がその増殖
サイクルの対数期に達するまでインキュベートする。こ
の時点で、培養物２lを用いて醗酵器中の液体Ｈib培地
４０リットルに接種し、８％ＵＣＯＮ(Ｕnion Ｃarbide
潤滑剤)３００mlを加える。１６〜１８時間後、醗酵器
培養物は収集できるようになる。
【００２２】 Ｈib液体培地１０００ml当りの組成は、 酵母エキス透析物 ５.０ｇ カサミノ酸(Ｄifco) ２２.５ｇ 二塩基性リン酸ナトリウム １４.４ｇ デキストロース ５.５９ｇ ヘミン ２０ｇ 水酸化アンモニウム(３０％) ０.１５３４ml ＮＡＤ １％ ０.６ml である。
【００２３】醗酵器の収集時、充当するグラム染色およ
び培養法(前記Ａ１〜４参照)により培養純度を測定す
る。培養物にカタブロン(臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウム)を最終濃度０.１％まで加える。３０分
後、この時点で細菌はすでに不活化され、固形相を遠心
分離により集める。該湿潤ペーストをさらに加工するま
で−７０℃で保存する。
【００２４】Ｃ．多糖類の精製 つぎの方法を用い、ＰＲＰの抽出およびそれに続く精製
を行なう。 １．洗浄剤からの解離 ペーストの湿潤重量１ｇにつき、０.４Ｍ ＮaＣl１０m
lを加える。この懸濁液を市販のブレンダー中で３０秒
間混合する。混合液を冷所(４℃)で１７,０００×ｇに
て１５分間遠心分離する。上澄液を集め、エタノールを
濃度２５％まで加える。ついで、この物質を、１７,０
００×ｇ(４℃)で２時間遠心分離し、上澄液をたくわえ
る。上澄液の４倍の容量のエタノールを加え、この物質
を一夜４℃に保持する。
【００２５】２．核酸の除去 該物質を２,８００×ｇ(４℃)で５分間遠心分離する。
沈澱を集め、ペースト抽出に最初に用いた容量の１／４
でトリス−ＭgＳＯ4緩衝液に再懸濁する。蒸留水１リッ
トル当りの該トリス緩衝液の組成はつぎのとおりであ
る。 トリス−ヒドロキシメチルアミノ−メタン(Ｓigma) ６ｇ ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２４６mg チメロサール(Ｅlanco) ５０mg pＨを濃塩酸で７.０±０.２に調整する。
【００２６】最初の湿潤ペースト１００ｇ当り、デオキ
シリボヌクレアーゼＩ １.５mg(ＳigmaＤ−０８７６)
およびリボヌクレアーゼ−Ａ０.７５mg(Ｓigma−Ｔype
１−ＡＳ,Ｒ−５５０３)を加える。この物質を透析バッ
グに入れ、対トリスＭgＳＯ4緩衝液１８リットルで、３
７℃で１８時間インキュベートする。
【００２７】３．蛋白の除去 蛋白成分を除去するため、等容量のフェノール−酢酸塩
溶液(フェノール４５４ｇと合した１０％(w／v)酢酸ナ
トリウム１３５ml)の添加により、該物質をさらに加工
する。ついで、この物質を３０分間(４℃)振盪し、１
７,０００×ｇで１５分間遠心分離し、水性相を集め
る。さらに２回フェノール抽出を行ない、最後の水性相
を蒸留水に対して透析する。
【００２８】この段階の物質がバルク液体莢膜多糖類
(ＰＲＰ)を構成し、さらに加工(以下のＤ参照)するまで
−２０℃に保存する。
【００２９】４．多糖類の品質の評価 バルクＰＲＰの品質は分取した液体試料の分析に基づい
て判定される。エタノール(４容)、ついで、ＣaＣl2(最
終濃度０.０２Ｍ)を加え、ＰＲＰを沈澱させる。ＰＲＰ
を遠心分離により沈澱させ、真空下、デシケータで乾燥
させる。熱重量分析(ＴＧＡ)を用いて水分含量を測定す
る。その後の分析は乾燥重量基準で算出する。
【００３０】許容される基準には、 (a)リボースの分析(オルシノール法):３０％以上、 (b)蛋白の分析(ローリー法):１％より小、 (c)核酸の分析(Ｕ．Ｖ．吸収):１％より小、および (d)特異免疫血清による沈降(反対免疫電気泳動法) が包含される。
【００３１】加えて、分子の大きさを適当なゲル・パー
ミエイション・クロマトグラフィーで測定する。該多糖
類をリムラス(Ｌimulus)溶解質テストおよびウサギ発熱
原性テストにより内毒素について監視する。
【００３２】典型的なロットはつぎの特性を有する。 (a)蛋白含量０.５％ (b)核酸含量０.３５％ (c)残余ウシ抗原:ラジオイムノアッセイにより測定した
場合、精製ＰＲＰの該多糖類調製に用いたウシＰＮＡア
ーゼおよびＤＮＡアーゼによる汚染なし。 (d)内毒素含量はリムラス・アメーバ様細胞−溶解質分
析(ＬＡＬ)により測定した:２００ng／mgＰＲＰ (e)ＣＬ−４Ｂセファロース上のＫd:０.３０。０.３０
の値はデキストラン・スタンダードに準拠して概略分子
量１,１２５,０００に対応する。
【００３３】Ｄ．多糖類(ＰＲＰ)試薬の調製 該多糖類はこのように液体として精製されるが、精製操
作においてカルシウムは使用しない。(従来の多糖類の
精製はカルシウム塩を生じるが、カルシウムは以下の抱
合の間に用いる炭酸塩緩衝剤と結合でき、沈澱を生じ
る。)
【００３４】該多糖類の大きさを、必要とする大きさの
変化の程度に見合った時間、１００℃で加熱することに
より調整する。該多糖類の大きさは、空隙容量で２０％
未満がＣＬ−４Ｂセファロース・カラムから溶出し、２
０％未満が０.５より大きいＫdで溶出するように調整す
る。主要フラクションは２００,０００〜２,０００,０
００ダルトンの分子の大きさを有する。
【００３５】参考例１ ＰＲＰの活性化 Ａ．この多糖類を、マグネチック・スターラを備えた反
応容器中、氷浴上で４℃に冷却する。蒸留水中、２５mg
／ml(２０〜３０mg／mlの範囲)の濃度のＰＲＰの最初の
容量を記録する。ついで、塩化ナトリウムを０.８５％
の濃度まで加える。
【００３６】Ｂ．得られた該多糖類の塩化ナトリウムの
溶液のpＨを、１Ｎ水酸化ナトリウムの添加により１０.
５〜１１.０に上昇させる。(より低いpＨでは臭化シア
ンとの反応が少なく、より高いpＨでは該多糖類が分解
するので、この範囲を選択する。）
【００３７】Ｃ．乾燥臭化シアンをpＨ１０.５〜１１.
０の０.００５Ｎ重炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し、直
ちに(調製後、１０分以内)、０.４mg／mgＰＲＰの割合
で反応容器に加える。
【００３８】Ｄ．混合液のpＨを、水酸化ナトリウムの
添加によりpＨ１０.５〜１１.０に調整し、６分間維持
する。
【００３９】Ｅ．ついで、１Ｎ ＨＣlでpＨを６.０に
下げる。(酸性pＨは臭化シアンによって該多糖類上に生
じさせた活性化部位を安定化させる。さらにpＨの低下
はＰＲＰの加水分解をもたらせる。)
【００４０】Ｇ．等容量の、pＨ６.０の予め４℃に冷却
した食塩水を加える。
【００４１】Ｈ．該臭化シアン−多糖類混合物を濃縮装
置に移し、工程Ａで記録した最初の容量まで濃縮する。
【００４２】Ｉ．工程ＧおよびＨを合計１０回くり返
す。かくして該多糖類濃度を２５mg／mlに保持しなが
ら、未消費の臭化シアンの約９９.９％を除去する。も
し、臭化シアンが除去されなければ、それは以下で使用
するジフテリア外毒素トキソイドと反応する。
【００４３】参考例２ Ｄ−ＡＨ担体の調製 Ａ．蒸留水中、商業的なジフテリア外毒素トキソイド
(Ｄ)を、陽圧で撹拌した濃縮器中、１０,０００ダルト
ン以上の分子を保持する膜上で２０〜４０mg／ml、典型
的には、３５mg／mlに濃縮する。
【００４４】Ｂ．アジピン酸ジヒドラジド(ＡＤＨ)８mg
／mg蛋白および１−エチル−３−(３−ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド(ＥＤＡＣ)／mg蛋白の乾燥混
合物を効率的なスターラおよびpＨの監視、制御の可能
なpＨ探針を備えた反応容器に入れる。
【００４５】Ｃ．ついで、ジフテリア外毒素トキソイド
を反応容器に加え、反応体の割合をつぎのようにする。 ジフテリア外毒素トキソイド＝３５mg蛋白／ml ＡＤＨ＝８.０mg／mg蛋白 ＥＤＡＣ＝０.７５mg／mg蛋白 (ＡＤＨおよびＥＤＡＣの順次添加の上、酢酸塩緩衝剤
の使用は持続性の柔毛状沈澱をもたらす。反応体はそれ
ら自体で充分な緩衝能を有している。)
【００４６】Ｄ．pＨを直ちに４.７に調整し、４.７±
０.２に少なくとも２時間維持する。 １．化学反応の過程はpＨ調節器のレコーダにより追跡
できる。要すれば、該反応は、pＨが少なくとも１５分
間安定するまで、２時間以上続けることができる(すな
わち、pＨ調節のためのＨＣl添加なしに１５分間)。 ２．消費したＨＣlの量を工程チェックとして記録す
る。 ３．反応容器中の温度変化も監視する。
【００４７】Ｅ．反応生成物を４℃にて、２回交換の最
少１００容量の食塩水に対して、交換ごとに８時間透析
する。
【００４８】Ｆ．ついで、工程Ｅと同様な最少容量、時
間および温度で２回交換のリン酸塩緩衝食塩水に対して
透析する。
【００４９】Ｇ．生成物(Ｄ−ＡＨ)を陽圧装置および１
０,０００分子量膜で２５mg／ml蛋白に濃縮する。
【００５０】Ｈ．この濃縮物を滅菌濾過(０.２μ)し、
４℃に保存する。
【００５１】かかるＤ−ＡＨ担体の典型的ロットの試料
の分析は３８.３μgＡＤＨ／mgＤＴの比率を示した。そ
の試料のクロマトグラフィーはＣＬ−４Ｂセファロース
上のＫd値０.７５を示した。これは蛋白スタンダードに
準拠して概略分子量１３９,０００に相当する。
【００５２】参考例３ 共有多糖類−ジフテリア・ト
キソイド抱合体(ＰＲＰ−Ｄ)の形成 Ａ．濃度２５mg／mlの参考例２のジフテリア・トキソイ
ド・アジピン酸ヒドラジド担体(Ｄ−ＡＨ)を、重炭酸ナ
トリウムで濃度０．５Ｍまで処理し、pＨを８．５に調
整する。(著しく低い塩濃度は、活性化多糖類を含有す
る最終反応混合液中でゲル形成を起させる。)
【００５３】Ｂ．密封することのできる反応容器中に、
参考例１で得た洗浄ＰＲＰ溶液の等量を入れる。pＨは
８.４〜８.６で安定でなければならない。(もし、ＣＮ
Ｂrが除去されていなければ、pＨは急速に低下し、多量
の沈澱が形成する。この反応はたとえ、多糖類が存在し
なくても起る。結合による反応体の物理的外観には著し
い変化があってはならない。)
【００５４】Ｃ．反応混合液を４℃で１５〜１８時間混
転させる。
【００５５】Ｄ．該抱合体を、リン酸塩緩衝食塩水中で
平衡させたセファクリル−３００上でゲル・パーミエイ
ション・クロマトグラフィーによって精製し、未反応蛋
白および分子の大きさ１４０,０００ダルトン未満の物
質を除去する。(もし、出発多糖類が少なすぎると、こ
の方法で遊離蛋白から該抱合体を分離することはできな
い。)
【００５６】Ｅ．精製した抱合体試料を、本参考例の以
下の部分に記載する化学分析用に分取する。
【００５７】Ｆ．該精製抱合体に濃度１:１０,０００ま
でチメロサールを加え、生成物を分析まで４℃に保存す
る。
【００５８】Ｇ．該生成物を０．２μ滅菌濾過する。
(もし、該多糖類が実施例１(Ｄ)に記載したような大き
さに規制されていないと、すなわち、それが大きすぎる
と、得られた抱合体は濾過できない。)
【００５９】分析 参考例３のバルク濃縮物について行なったテストはつぎ
の結果を与えた。 a)リボース含量:１５６.５μg／ml (参考例４におけるＰＲＰ値の計算について、実験で求
めたリボース濃度に基づく名目上の多糖類濃度を算出す
るために変換係数２を用いる。)
【００６０】b)蛋白含量:３３０μg／ml c)リボース／蛋白比:０．４７(限界０.２５〜１.０) d)セファロースＣＬ−２Ｂ上でのクロマトグラフ分析
は、単一ピークとして抱合体分子の均質な分布を示すク
ロマトグラフの特色を示した。
【００６１】e)Ｋd(多糖類):セファロースＣＬ−４Ｂを
用いて０．３６、ＣＬ−２Ｂを用いて０．７７ ＰＲＰについての各フラクションのリボース分析で測定
した。ＣＬ−４Ｂ上での０．３６の値はデキストラン・
スタンダードに準拠して概略分子の大きさ６７４,００
０に相当する。
【００６２】f)Ｋd(蛋白):ＣＬ−４Ｂを用いて０.３
４、ＣＬ−２Ｂを用いて０.７１ 蛋白についての各フラクションのローリー分析によって
測定した。ＣＬ−４Ｂ上、ジフテリア外毒素トキソイド
のＫd値の０.７５から０.３４への変化は蛋白の多糖類
との抱合がクロマトグラフィー的にいずれもの原料から
も異なった物質を形成することを示す。
【００６３】g)遊離蛋白:５％未満 遊離蛋白はＰＲＰに結合しなかった誘導体化ジフテリア
担体蛋白を意味する。これは、ジフテリア外毒素トキソ
イド試料の位置に溶出する蛋白の量を全溶出蛋白に対比
させることによって測定される。
【００６４】h)内毒素含量:１μg／ml 内毒素はリムラス・アメーバ様細胞−溶解質分析(ＬＡ
Ｌ)によって定量化した。該内毒素含量はＰＲＰ−Ｄの
ヒト投与量１０μgリボース当り、６４ngに相当する。
【００６５】i)発熱原性:バルク濃縮物は、０．１５μg
リボース／ml／kgウサギ体重の体重等価(ヒト)投与量を
用いる非発熱原性についての米国基準に適合する。
【００６６】j)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡ
ＧＥ):純度および多糖類と蛋白の間の共有結合を支持す
る証拠を得るためにＰＡＧＥ分析を行なった。遊離担体
は柱状ゲル中の丁度半分、ほぼカタラーゼ(分子量６０,
０００)の位置にバンドを形成するが、該ＰＲＰ−Ｄ抱
合体はゲルに入ることができなかった(分子量３３０,０
００のチログロブリンの位置の前)。ＰＲＰ−Ｄは原点
のところで単一のバンドを示した。
【００６７】k)臭化シアン:ＰＲＰ−Ｄ抱合体調製前、
第１工程で臭化シアン(ＣＮＢr)を用いるが、それはそ
の後、精製物から排除される。製法のいくつかの工程が
ＣＮＢr含量の減少に寄与している。しかし、ゲル・パ
ーミエイション・クロマトグラフィーによるワクチンの
最終的精製が分子量１００,０００以下のいずれの汚染
物をも除去する。この精製が残った痕跡の遊離ＣＮＢr
またはその分解生成物による汚染を排除する。
【００６８】l)熱安定性:ＰＲＰ−Ｄ抱合体ワクチンの
耐熱性についての検討を行なった。該バルク物質を４０
倍に濃縮し、３mlの試料３つを採取した。第１の試料を
４℃の水浴で１６時間保持し、第３の試料を１００℃の
水浴中で３０分間加熱する。行なったテストは蛋白およ
びリボース含量、セファロースＣＬ−４Ｂによるゲル・
パーミエイション・クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−
多糖類ゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)についてであった。
【００６９】その結果は、前記のテスト(a)および(b)に
おける結果を比較して、リボースまたは蛋白含量につい
て試料間に何ら著しい変化がないことを示した。クロマ
トグラフ分析は、条件がより厳しくなるにつれて、抱合
体物質の分子の大きさが少し減少することを示した。し
かし、２５４nmでの吸収測定によるこれらの試料の分別
分析では、該物質は多糖類ピークに一致するただ１つの
ピークを維持し、遊離蛋白ピークは全く現れず、この結
果は前記の(d)および(g)の結果に匹敵する。これは、蛋
白と多糖類の間の結合は切断されないが、分子の大きさ
の減少が鎖状多糖類の中の結合の切断によるものであっ
たことを示している。これはさらに、これらの試料のＰ
ＡＧＥ分析を前記(j)に記載した結果と比較することに
より、たとえ洗浄剤(ドデシル硫酸ナトリウム)の存在下
でも、いずれもの試料において遊離蛋白が検知できなか
ったことを示している。このことは、誘導体化蛋白−多
糖類共有結合および高温処理を通じてのその安定性を強
く肯定している。
【００７０】参考例４ ＰＲＰ−Ｄ免疫原性テスト この実験は、担体依存性、担体特異性、増強効果および
Ｉgクラスの変化によって証明されるようなＴ−細胞依
存性を示すために設計された。この実験は２つの部分:
１)一連の２回の注射による初回免疫刺激、２)一連の２
回の注射による攻撃、で行なった。
【００７１】材料: １．ＰＲＰ−Ｄバルク濃縮物、参考例３ ２．破傷風トキソイド(Ｔ) ３．ジフテリア・トキソイド(Ｄ) ４．ヘモフィルス・インフルエンザＢ莢膜多糖類(ＰＲ
Ｐ) ５．ＰＲＰ／Ｄ、２０μgＰＲＰ(１０μgリボース)およ
び２０μgＤ混合物 ６．ＰＲＰ／Ｄ−ＡＨ、２０μgＰＲＰ(１０μgリボー
ス)および２０μgＤ−ＡＨ混合物
【００７２】方法:全ての免疫付与はアジュバントなし
に１mlの容量で皮下投与した。ＰＲＰを含有する全ての
投与は１ml投与当り、リボース１０μgに調整した。非
抱合外毒素トキソイド投与は１ml投与当り２０μg蛋白
に調整した。免疫付与には１４日間隙で巡回する計画を
用いた。各免疫付与１０日後採取した。全調製物は０.
０１％チメロサールを含有するリン酸塩緩衝食塩水中で
稀釈した。各投与分を４つの投与バイアルとして調製
し、−２０℃で貯蔵した。、各群においては３匹のウサ
ギに免疫付与した。
【００７３】血清学:以下に示すように、抗−ＰＲＰ、
抗−Ｄ−ＡＨ、抗−Ｄおよび抗−Ｔについて、血清を固
相ラジオイムノアッセイ(ＳＰＲＩＡ)で分析した。抗体
レベルは１ml当りのＩgＧおよびＩgＭのマイクログラム
数として定量化した。
【００７４】 実験計画: 群 一次 二次 血 清 ＰＲＰ ＤＴ−ＡＨ ＤＴ ＴＴ １ ＰＲＰ ＰＲＰ ＋ ２ Ｔ ＰＲＰ−Ｄ ＋ ＋ ＋ ＋ ３ Ｄ ＰＲＰ−Ｄ ＋ ＋ ＋ ＋ ４ ＰＲＰ／Ｄ ＰＲＰ／Ｄ ＋ ＋ ５ ＰＲＰ／Ｄ−ＡＨ ＰＲＰ／Ｄ−ＡＨ ＋ ＋ ６ ＰＲＰ−Ｄ ＰＲＰ−Ｄ ＋ ＋ ＋
【００７５】計画:ウサギを前採血し、各群、１４日ご
とに免疫付与した。各免疫付与１０日後に後採血した。
最初の２回の注射は一次免疫原で行ない、一方、第３お
よび第４の注射は二次免疫原で行なった。
【００７６】抗−ＰＲＰ応答を図１に示す。ウサギの６
実験群(１群当り３匹)におけるヘモフィルス・インフル
エンザＢ莢膜多糖類に対するＩgＧ抗体の平均レベルを
グラフ的に表わしてある。前記の実験計画に従って、各
群をこの図上に表示してある。全てのウサギについて、
前採血レベルは１μg／ml未満であり、明確化のため、
この図には示していない。
【００７７】塗りつぶしていない棒は一次免疫原による
一連の２回の注射後のＩgＧのレベルを表わしている。
塗りつぶした棒は二次または攻撃免疫原による第３およ
び第４の注射後のＩgＧレベルを示す。
【００７８】ＩgＧ応答はＰＲＰ−Ｄ抱合体ワクチンに
よる免疫付与後にのみ観察された。ジフテリア・トキソ
イドで初回免疫刺激した群３のウサギはＰＲＰ−Ｄに対
する応答を促進したが、破傷風トキソイドの初回免疫刺
激(群２)は効果がなかった。
【００７９】破傷風トキソイド 参考例５ Ｔ−ＡＨ担体の調製および共有結合の形成 多糖類−破傷風トキソイド抱合体(ＰＲＰ−Ｔ) 参考例２の操作において、ジフテリア・トキソイドの代
わりに商業的破傷風トキソイドを用いてそのアジピン酸
ヒドラジド誘導体を製造する。
【００８０】Ｔ−ＡＨ担体の典型的ロットの試料の分析
は５３.９μgＡＤＨ／mgＴの比を示した。この試料のク
ロマトグラフィーはＣＬ−４ＢセファロースのＫd値０.
６６を示した。これは蛋白スタンダードに準拠して概略
分子量２２７,０００に対応する。
【００８１】参考例３に記載したＤ−ＡＨについての操
作と同様な操作を用いて多糖類と、破傷風トキソイドの
アジピン酸ヒドラジド誘導体との抱合体を形成させる。
【００８２】ＰＲＰ−Ｔの典型的なロットの分析は１ml
当り多糖類１４２.６μgおよび蛋白２６０μgを示し
た。抱合体は可溶性で、０.２μフィルターで濾過でき
るものであった。ＣＬ−４Ｂ上でクロマトグラフィーに
付した場合、該蛋白成分はＫd０.３０、該多糖類成分は
Ｋd０.３７を示した。
【００８３】 第１表 抗−ＰＲＰ応答 ＩgＭおよびＩgＨについての固相ラジオイムノアッセイ ＰＲＰ ジフテリア・トキソイド 破傷風トキソイド ＩgＧ* ＩgＭ ＩgＧ : ＩgＭ ＩgＧ : ＩgＭ 群１前 0.0** 0 ND*** ND 後１ 0.33 0 0.58 0 後２ 0.8 0 1.39 後３ 0 0 後４ 0 0 群２前 0 0 0 0 0.5 0 0.87 後１ 0 0 0 0 25.1 113.1 15.10 129.54 後２ 0 0 0 0 112.00 44.60 0 36.90 後３ 4.82 26.3 0 0 112.00 8.50 2.59 45.55 0 14.72 後４ 36.1 74.57 0 0 151.60 2.00 17.43 28.81 52.64 3.46 群３前 0.2 0 0 27.07 0.8 65.00 0.35 46.88 1.39 112.58 後１ 0.2 0 0 0 0.8 0 0.35 1.39 後２ 0 14.6 6.47 0 0.67 0 25.29 5.98 0.59 後３ 19.4 130.33 10.63 0 0.37 0 13.4 89.49 8.08 0.65 後４ 74.2 82.63 29.03 0 1.30 0 76.73 5.16 26.59 2.25 群４前 0 0 0 21.77 ND 18.85 後１ 0 15.6 2.67 30.87 27.02 0.85 27.14 後２ 0 0 37.2 26.2 10.94 24.30 後３ 0 0 210.00 19.63 0 17.06 後４ 0 0 298.27 0 207.70 群５前 0 0 ND 後１ 0 0 後２ 0 0 後３ 0 0 後４ 0 0 群６前 0 0 0 0 後１ 6.23 135.00 0 0 2.56 81.41 後２ 54.2 182.00 0.93 0 14.73 0 1.62 後３ 57.6 182.00 3.05 0 22.91 0 4.31 後４ 39.6 91.20 5.95 0 25.17 0 8.41 * ＩgＧおよびＩgＭは血清１ml当りの抗体μgとし
て表示。全ての値は平均と標準誤差である。 ** 分析感度の以下のＩg レベルには０の値を与え
た。分析範囲より高いレベルの場合、それには分析の上
限に等しい値を与えた。 ***ＮＤ＝実施せず。
【図面の簡単な説明】
【図１】 参考例４の実験によるヘモフィルス・インフ
ルエンザＢ莢膜多糖類の抗原性を示す棒グラフである。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ほぼ等モル量のリボース、リビトールお
    よびリン酸塩からなり、ゲル・パーミエイション・クロ
    マトグラフィーによるデキストラン・スタンダードに準
    拠して、２０％未満が分子の大きさ２００,０００ダル
    トン未満、２０％未満が分子の大きさ２,０００,０００
    ダルトンを越えるまで加熱されてなる莢膜ヘモフィルス
    ・インフルエンザＢ多糖類から調製された、実質的に蛋
    白および核酸を含まないハプテン。
  2. 【請求項２】 該多糖類がナトリウム塩として存在する
    請求項１記載のハプテン。
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