DK161013B

DK161013B - Fremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat samt hapten, i det vaesentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK161013B
Application number: DK093584A
Authority: DK
Inventors: K Gordon Lance
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1982-07-06
Filing date: 1984-02-23
Publication date: 1991-05-21
Also published as: EP0098581B1; JPH0347253B2; ZA834939B; AU1822783A; DK161013C; FI79024C; ES8500745A1; FI840874A; KR880001098B1; EP0098581A2; AU561978B2; DK93584D0; JPS59501360A; IL69165A; DE3363505D1; NZ204771A; DK93584A; EP0098581A3; JPH05262668A; IE831574L

Description

DK 161013 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat, der er i stand til at frembringe T-celle-afhængig antistofreaktion mod polysaccharid fra Hae-5 mophilus influenzae b, med en molekylvægt mellem 140.000 og 4.500.000 Dalton og med et ribose/protein-forhold mellem 0,25 og 1,0, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man a) opvarmer et kapsulært polysaccharid af Haemophilus 10 influenzae b bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og phosphat, indtil mere end 60% af poly-saccharidet har en molekylvægt mellem 200.000 Dalton og 2.000. 000 Dalton, b) aktiverer det fremkomne størrelsesregulerede poly-15 saccharid med cyanogenbromid, c) fjerner i det væsentlige alt uomsat cyanogenbromid, og d) omsætter det aktiverede produkt med et adipinsyre-hydrazid derivatiseret diphtheriatoxoid.

20 Opfindelsen angår også et hapten, i det væsentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved den nævnte fremgangsmåde, og dette hapten er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ud fra kapsulært Haemophilus influenzae b-polysaccharid, bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære 25 mængder ribose, ribitol og phosphat, ved opvarmning, indtil mindre end 20% af polysaccharidet har en molekylvægt under 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylvægt over 2.000. 000 Dalton med dekstranstandard som reference ved gelpermeeringschromatograf i.

30 Polysaccharidet er fortrinsvis til stede som natrium salt.

Det aktiverede polysaccharid blandes grundigt med et exotoxoid, diphtheria-toxoid, til udvirkning af konjugation. Exotoxoidet derivatiseres ved som afstandsstykke at anvende 35 en bro på 4-8 C-atomer, nemlig med adipinsyre-hydrazidderi-

DK 161013 B

2 vatet af diphtheria-toxoid (D-AH). Exotoxoidet er knyttet til adskillige AH-enheder.

Ved hjælp af denne metode fås der en konjugatvaccine, der fremkalder en T-celle-afhængig reaktion mod polysacchari-5 det fra Haemophilus influenzae b.

Et sådant konjugat er særlig værdifuldt til anvendelse ved forebyggelse af Haemophilus-infektioner hos børn og spædbørn.

Schneerson et al. omtaler i New Developments with 10 Human and Veterinary Vaccines, Progr. Clin. Res., 77-94 (1980) fremkaldelsen af forøget immunogenitet af Haemophilus influenzae (Hib) kapsulært polysaccharid ved subcutan injektion af en saltopløsning af Hib-polysaccharid covalent bundet til proteinkonjugater. Der fremstilles adipinsyre-hydrazid-15 derivater af albumin, hæmocyanin og diphtheria-toxin.

Schneerson et al. omtaler i artiklen Protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines, side 265-272 (1982) anvendelsen af flere proteiner, herunder diphtheria-toxin, til fremstilling af konjugater med forskellige bakterielle kapsulære polysaccha-20 rider til anvendelse som "T-celle-afhængige" antigener til subcutan saltopløsningsinjektion i laboratoriedyr. Ca. 85% af proteinet omdannes til konjugatet, og ca. 30% af poly-saccharidet bindes i det tomme volumen efter passage af konjugatet gennem en 4B Sepharose®-søjle. Cyanogenbromid-25 aktivering af Hib-polysaccharidet og adipinsyre-dihydrazid-derivatisering af proteinet anvendes.

Schneerson et al. angiver i Bacterial Capsular Polysaccharide Conjugates i L. Weinstein og B.N. Fields (ed.), Seminars in Infections Disease, Vol. 4, Bacterial Vaccines, 30 New York, 311-321 (1982), en metode til covalent binding af Hib-kapsulært polysaccharid til proteiner til forøgelse af polysaccharidets immunogenitet. AH-derivater af BSA, HSA, diphteria-toxin og hæmocyanin anvendes som bærerproteiner.

I Journal of Exp. Med. 152. 361-376 (1980) beskrives 35 en metode til covalent binding af Haemophilus influenzae type b - kapsulært polysaccharid til flere proteiner, idet

DK 161013 B

3 der anvendes adipinsyre-dihydrazid som afstandsstykke mellem det kapsulære polysaccharid og bærerproteinet.

Ifølge de ovennævnte artikler anvendes der i intet tilfælde toxoider, og der er ikke tale om anvendelsen af et 5 trin til regulering af haptenets molekylvægt, undgåelse af anvendelsen af calcium, fjernelse af overskud af cyanogen-halogenid til undgåelse af excessiv tværbinding og et udbytte på 70-100% baseret på udgangspolysaccharid. Den fra artiklerne kendte teknik afviger således væsentligt fra den fore-10 liggende opfindelse, såvel med hensyn til udøvelsen deraf som med hensyn til resultatet.

Schneerson et al. har ifølge Prog. Allergy 32, 144-178 (1982) undersøgt fremstillingen og virkningen af vaccine sammensat af polysaccharid covalent bundet til et "T-celle-15 afhængigt" bærerprotein. Adipinsyre-hydrazidderivaterne af diphteria-toxiner eller tetanus-toxoid blev covalent omsat med cyanogenbromid-behandlet Hib-polysaccharid, og produktet blev dialyseret, ledt gennem en 4B Sepharose®-søjle, steril-filtreret og opbevaret som en steril saltopløsning.

20 Chu et al. beskriver i Infection and Immunity, 245- 256 (1983) fremstillingen af konjugater ved kobling af AH-derivater af Hib-polysaccharider med tetanus-toxoid eller hæmocyanin. Polysaccharidet aktiveres med CNBr, omsættes med AH og dialyseres, efterfulgt af gelfiltrering og fryse-25 tørring. AH-polysaccharidderivatet og proteinet kobles derefter. Udbyttet af Hib-tetanus-toxoid-konjugater er 62%, når reaktanterne udgør 30 mg/ml.

Forfatterne til de to sidstnævnte artikler omtaler intet trin til regulering af haptenets molekylvægt og ej 30 heller undgåelsen af anvendelsen af calcium eller fjernelse af overskud af cyanogenhalogenid til undgåelse af excessiv tværbinding. Den teknik, der er beskrevet i disse artikler, afviger således betydeligt fra den foreliggende opfindelse, såvel med hensyn til udøvelsen deraf som med hensyn til det 35 opnåede resultat.

DK 161013 B

4

Der kan således på basis af den foreliggende opfindelse opnås en konjugatvaccine, der er anvendelig til immunisering mod sygdommen diphtheria. Virkningsstyrken hos mennesker af sådanne konjugater er større end den, der er 5 opnåelig med de kendte diphteriapræparater. Fremgangsmåden giver ved omhyggelig kontrol og fjernelse af overskydende aktivator et polysaccharidkonjugat opbygget af adskillige exotoxoidmolekyler knyttet til enkelte polysaccharidmolekyler forbundet gennem et afstandsstykke og i det væsentlige uden 10 tværbundne eller polymere derivater. Formlen kan generelt gengives som PRP “xm hvor PRP er polysacchar idet, og X er den toxoide molekyldel, og n er et helt tal under 20, idet et typisk gennemsnit er 7-8. (Diphtheria-toxoid-konjugatet omtales her som PRP-D, uden brug af tallet n).

15 På tegningen vises immunogeniteten af Haemophilus influenzae b-kapsulært polysaccharid, dvs. anti-PRP-reak-tionen. Dette søjlediagram viser de data, der er opnået ifølge tabel I til slut i beskrivelsen (fra eksempel 5).

Udviklingen af stabil humoral immunitet kræver gen-20 kendelse af fremmedstoffer mod mindst to separate sæt lymfocyter. Disse sæt er B-lymfocyterne, der er forstadier for antistof-dannende celler, og T-lymfocyterne, der modulerer B-cellernes funktion. Medens nogle antigener, herunder flere polysaccharider, er i stand til direkte at stimulere B-celler 25 til produktion af antistoffer (T-uafhængige antigener), skal de fleste antigener (T-afhængige) præsenteres for B-cellen af en T-lymfocyt. Med hensyn til de her omhandlede vacciner genkendes den exotoxoide del af vaccinen af T-cel-lesystemet. Eftersom proteinet bærer både sine egne antigene 30 determinanter og det covalent bundne hapten, bør begge sæt determinanter præsenteres af T-celler for B-cellerne. Resultatet af indgivelsen af dette bærer-hapten-konjugatpræparat er, at PRP præsenteres som et T-afhængigt immunogen. En T-afhængig præsentation af PRP medfører protektiv immunitet 35 hos børn og spædbørn, den del af befolkningen, der er udsat

DK 161013 B

5 for den største risiko. Konjugatvaccinen har derfor særlig værdi til småbørn.

Indgivelse af et sådant konjugat til kvinder medfører en høj andel af IgG-antistoffer mod vaccineantigenerne, som 5 gennemtrænger placentabarrieren under svangerskab, og yder således spædbarnet beskyttelse fra fødslen.

T-uafhængige antigener får B-celler til terminalt at differentiere i antistof-afsondrende celler (plasmaceller), medens T-afhængige reaktioner er betydeligt mere komplekse.

10 Efter modtagelsen af en T-afhængig stimulus indgår B-cel-lebestanden ikke blot i antistof produktionen, men også i proliferation og i modning. Herved fremkommer en stigning i antallet af B-celler, der fremstiller antistoffer mod PRP, og en forøgelse af antallet af B-celler, der er i stand til 15 at reagere på en udsættelse nr. 2 for PRP. Gentagen immunisering resulterer i yderligere stigninger af antallet af PRP-specifikke B-celler og derfor højere antistoftitere, en booster-reaktion. Kort sagt, medens T-uafhængige reaktioner er begrænset af antallet af reaktionsdygtige B-celler, resul-20 terer T-afhængige reaktioner i en stigning af det samlede antal antigen-reaktive celler.

Den her omhandlede PRP-exotoxoid-vaccine har vist sig at fungere som et T-afhængigt immunogen hos laboratoriedyr. Alle dyr i en gruppe af kaniner immuniseret serievis 25 med en standarddosis PRP-D udviser booster-reaktioner. Desuden viser primære immuniseringer med bærerproteiner, der anvendes i konjugatet, f.eks. diphtheria-toxoid til prp-d, sig at forøge begyndelsesreaktionen på PRP-komponenten i PRP-exotoxoid-konjugatet. En lignende forøgelse af PRP-reak-30 tion iagttages ikke hos dyr, der er præpareret med et exo-toxoid, der er forskelligt fra det, der anvendes i konjugatet.

Den omhandlede vaccine er et PRP-exotoxoid-hapten--bærer-konjugat. I sådanne vacciner bidrager det antigene, 35 men svagt immunogene haptenmolekyle (PRP) til en ny antigen-

DK 161013 B

6 specificitet over for stærkt immunogene bærermolekyler, såsom diphtheria-(D)-toxoid.

Det rensede diphtheria-toxoid (D), der anvendes som bærer ved fremstillingen, er et i handelen værende exotoxoid, 5 der er modificeret (derivatiseret) ved tilknytning af et 4- 8-C-atom-af standsmolekyle, nemlig adipinsyre-dihydrazid (ADH), ved hjælp af vandopløseligt carbodiimid-kondensations-metoden. Det modificerede exotoxoid, adipinsyre-hydrazidderi-vatet X-AH, befries derpå for uomsat ADH. Dette er et oplø-10 seligt produkt, der i det væsentlige er uden tværbinding, hvilket bekræftes ved udeblivelse af en væsentlig stigning i molekylstørrelse, bestemt ved gelchromatografi og poly-acrylamidgel-elektroforese.

Haemophilus influenzae b's kapsulære polysaccharid 15 fremstilles ud fra kilder, der fås i handelen, således som de anvendes til autoriserede polysaccharidvacciner og fås hos Connaught Laboratories. Medens polysaccharidet imidlertid konventionelt er renset som et calciumsalt, skal anvendelsen af calciumioner undgås, fordi de griber ind i anvendelsen 20 af carbonatpuffer ved konjugationsproceduren. Polysacchari-dets molekylstørrelse justeres derpå ved opvarmning, til den ønskede dimension for haptenet er nået. Typisk er opvarmning af det flydende polysaccharid i 15 minutter ved 100°C tilstrækkeligt til at sikre, at mindre end 20% af 25 molekylerne har en molekylstørrelse, der er mindre end 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylstørrelse på over 2.000.000 Dalton. Denne tilpasningsoperation er vigtig for at opnå et rigtigt PRP-D-konjugat.

Det størrelsesjusterede polysaccharid, der således 30 fås, aktiveres med en aktivator for at skabe en elektrofil gruppe på polysaccharidet, såsom et cyanogenhalogenid eller natriumborhydrid. En typisk aktivator, der anvendes, er cyanogenbromid. Uomsat aktivator fjernes fuldstændigt, fordi en væsentlig rest bevirker tværbinding af proteinet i den 35 følgende reaktionsblanding. Det fremkomne tværbundne produkt indfanger polysaccharid, idet der fås et lavere udbytte af

DK 161013 B

7 vaccine og et konjugat med større molekyIstørrelse, der afviger med hensyn til kemiske egenskaber og opløselighed fra det ifølge opfindelsen fremstillede konjugat, og en vaccine, der ikke har den ønskede andel af den her omhandlede 5 vaccine.

Det aktiverede PRP og X-AH kombineres derpå og får lov at reagere i kulden. Nogle af hydrazidgrupperne på det derivatiserede exotoxoid reagerer med de aktiverede steder på PRP til dannelse af covalente bindinger. Produktet er 10 PRP-covalent bundet til derivatiseret exotoxoid via en 4-8 C-atom-bro. Dette reaktionsprodukt renses ved gelpermeerings-chromatografi for at fjerne eventuelt uomsat protein og forureninger med ringe molekylstørrelse. Den typiske mole-kylstørrelse for hovedfraktionen er ca. 675.000 Dalton i 15 relation til en dekstranstandard. Et typisk interval for relativ molekylstørrelse er 140.000 Dalton til 4.500.000 Dalton.

Et konserveringsmiddel, såsom "Thimerosal", tilsættes; når det drejer sig om "Thimerosal", i en slutkoncentration 20 på 1:10.000. Hovedkoncentratet filtreres gennem et 0,2/xm membranfilter og opbevares koldt.

PRP-exotoxoid-konjugationsproduktet er varmemodstands-dygtigt og vandopløseligt. Manglen på tværbinding konstateres ved udeblivelsen af en væsentlig stigning i molekylstørrel-25 sen i forhold til udgangspolysaccharidets, bestemt ved gel-permeeringschromatografi og ved polyacrylamid-gelelektrofo-rese. Varmestabiliteten sikrer lang lagerholdbarhed og et stabilt produkt selv under ugunstige klimaforhold.

Reaktionen kan gengives skematisk i to trin: 30 (1) PRP + CNBr -» PRP* (2) PRP* + nX -» PRP(-X)n

Hvis fjernelsen af cyanogenhalogenidet ikke udføres effektivt, opstår der foruden konjugationen af det aktiverede PRP og exotoxoid til dannelse af PRP(-X)n sådanne uønskede 35 reaktioner som f.eks. dannelse af X-X eller flere forbundne derivater, f.eks.

DK 161013 B

8

PRP* + CNBr -i nX + XX-PRP-X

X-X-PRP

5 En typisk dosis PRP-exotoxoidkonjugatvaccine til mennesker til subcutan eller intradermal injektion består af 0,5 ml, der indeholder 10 mikrogram ribose eller et tilnærmelsesvis ækvivalent til 40 mikrogram af konjugatproduk-tet. Der fremstilles ampulopløsninger ved fortynding af 10 hovedkoncentratet med -phosphatpufret saltvandsopløsning, idet der anvendes "Thimerosal" som konserveringsmiddel.

Produktet fremkalder antistofdannelse hos mennesker over for både PRP- og exotoxoid-komponenten.

Opfindelsen vil i det følgende bliver forklaret ved 15 hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af PRP

A. Organisme. Kapsulært polyribosylribitolphosphat (PRP) af Haemophilus influenza b fremstilles ud fra Eagan-20 stammen. Kulturen overføres gentagne gange, og der fremstilles lyophiliseret podemateriale. Fra dette lyophiliserede podemateriale foretages en yderligere overføring for at fremstille vådarbejdende podemateriale (opbevares v. -60°C).

Der fremstilles gæringsanlægportioner af bakterieceller ud 25 fra det vådarbejdende podemateriale.

Dyrkningsrenhed bestemmes efter følgende kriterier: 1. Gram-negative farvekarakteristika.

2. Vækst på agar indeholdende NAD (diphosphopyridin-nucleotid) og hæmin (okse type I krystallinsk 30 salt af ferrihæm).

3. Manglende evne til at gro på agar uden NAD eller hæmin.

4. Agglutination ved specifikke antisera (type b Haemophilus influenza b, Hyland Laboratories).

35 B. Dyrkning og medier. Til subdyrkning af bakterien, dvs. forud for inokulering af en gæringsbeholder, anvendes BHI-Agar (pr. liter: 37 g BHI Difco, 15 g Bacto Agar Difco,

DK 161013 B

9 0,6 ml 1%'s NAD Sigma-kvalitet III og 6 ml 0,2%'s hæmin (Sigma-okse, type 1). Celler (20 timer) vasket fra en agaroverflade anvendes til at inokulere Haemophilus influenza b (Hib) flydende medie (1 liter alikvote mængder); disse 5 kulturer inkuberes under rystning, indtil bakterien når den logaritmiske fase i sin vækstcyklus. På dette tidspunkt anvendes 2 liter kultur til at inokulere hver 40 liter flydende Hib-medier i en gæringsbeholder, og der tilsættes 300 ml 8%'s "UCON" (Union Carbide smøremiddel). Efter 16-18 10 timer er kulturen i gæringsbeholderen parat til høst.

Sammensætningen af Hib-flydende medier pr. 1000 ml er: Gærekstraktdialysat, Difco 5,0 g

Casaminosyrer, Difco 22,5 g 15 Natriumphosphat, dibasisk 12,4 g

Dekstrose 5,59 g Hæmin 20,0 g

Ammoniumhydroxid (30%) 0,1534 ml NAD 1% 0,6 ml 20 Når en gæringsbeholder høstes, bestemmes kulturren heden ved passende Gram-farvning og dyrkningsteknik (se A. 1-4 ovenfor). Der tilsættes "Cetavlon" (hexadecyltrimethyl-ammoniumbromid) til kulturen indtil en slutkoncentration på 0,1%. Efter 30 minutter, når bakterierne er blevet inak-25 tiveret, opsamles den faste pasta ved centrifugering. Den våde pasta opbevares ved -70°C indtil videre forarbejdning.

C. Renset polvsaccharid. Ekstraktion og efterfølgende rensning af PRP udføres ved hjælp af følgende procedure: 1. Dissocierinc ud fra detergent.

30 For hvert g af pastaens vådvægt tilsættes 10 ml 0,4 molær NaCl. Suspensionen blandes i en blandemaskine, som fås i handelen, i 30 sekunder. Blandingen centrifugeres i 15 minutter ved 17.000 G i kulde (4°C). Den ovenpå flydende væske opsamles, og der tilsættes ethanol indtil en koncentra-35 tion på 25%. Dette materiale centrifugeres derpå i 2 timer ved 17.000 G (4°C), og den ovenpå flydende væske gemmes.

10

DK 161013 B

Der tilsættes ethanol i et volumen, der er fire gange så stort som den ovenpå flydende væskes, og materialet holdes natten over ved 4°C.

2. Fjernelse af nucleinsvrer.

5 Materialet centrifugeres i 5 minutter ved 2800 G

(4°C). Sedimentet opsamles og gensuspenderes i tris-MgS04-puffer med en fjerdedel af det volumen, der oprindeligt anvendtes til at ekstrahere pastaen. Sammensætningen af Tris-pufferen er som følger pr. liter destilleret vand: 10 Tris-hydroxymethylåminomethan (Sigma) 6 g

MgS04.7 Η20 246 mg "Thimerosal" (Elanco) 50 mg pH justeres til 7,0 ± 0,2 med koncentreret saltsyre. Deoxyribonuclease I 1,5 mg (Sigma D-0876) og ribonu-15 clease-A 0,75 mg (Sigma type 1-AS, R-5503) pr. 100 g oprindelig våd pasta tilsættes. Materialet anbringes i en dialysepose og inkuberes i 18 timer ved 37°C mod 18 liter tris--MgS04-puffer.

3. Fjernelse af proteiner 20 Materialet oparbejdes yderligere for at fjerne pro- teinbestanddele ved, at der tilsættes et lige så stort volumen phenol/acetatopløsning (135 ml 10%'s (vægt/vol.) natriumacetat kombineret med 454 g phenol) . Derpå rystes materialet i 30 minutter (4°C), centrifugeres i 15 minutter ved 17.000 25 G, og den vandige fase opsamles. Der foretages to yderligere phenolekstraktioner efterfulgt af dialyse af den sidste vandige fase mod destilleret vand.

På dette statium mdgør materialet den flydende kap-sulære polysaccharidmasse og opbevares ved -20°C, indtil 30 yderligere oparbejdning finder sted (afsnit D nedenfor).

4. Bedømmelse af polvsaccharidets kvalitet.

Kvaliteten af PRP-massen bedømmes på basis af en analyse af en flydende prøve, der udtages. Der tilsættes 4 volumendele ethanol, derpå CaCl2 til en slutkoncentration 35 på 0,02 molær, og der udfældes PRP. PRP sedimenteres ved centrifugering og tørres under vakuum over et tørremiddel.

DK 161013 B

11

En termogravimetr isk analyse (TGA) anvendes til bestemmelse af fugtighedsindholdet. Yderligere analyser beregnes på tørvægtbasis.

Kriterierne for godkendelse omfatter: 5 (a) Analyse for ribose (Orcinolmetode): over 30%.

(b) Analyse for protein (Lowry's metode): under 1%.

(c) Analyse for nucleinsyrer (U.V. absorbens): under 1%.

(d) Fældning med specifikke immunsera (modimmunelek- 10 troforesemetode).

Desuden bestemmes molekylstørrelsen ved passende gelpermeeringschromatografi. Polysaccharidet overvåges for endotoxin ved hjælp af Limulus-lysatprøve og ved feberfremkaldende prøve på kaniner.

15 En typisk portion har følgende karakteristika: (a) Proteinindhold 0,5%.

(b) Indhold af nucleinsyre 0,35%.

(c) Residualokseantigener: ingen forurening af det rensede PRP med okse RNA-ase og DNA-ase, der 20 anvendes til fremstilling af polysaccharidet som målt ved radioimmunanalyse.

(d) Endotoxinindhold måles ved hjælp af Limulus amoe-bocyt/lysat-analyse (LAL): 200 ng/mg PRP.

(e) Kd på CL-4B-"Sepharosen®: 0,40. En værdi på 0,30 25 svarer til en tilnærmelsesvis molekylvægt på 1.125.000 i forhold til dekstranstandarder.

D. Fremstilling af polysaccharid(PRP)reagens. Polysaccharidet renses således som en væske, men der anvendes ikke calcium ved rensningsproceduren. (Gængs polysaccharid-30 rensning giver et calciumsalt, men calcium kan kombinere med carbonatpufferen, der anvendes nedenfor, under konjugation, så at der dannes et bundfald).

Polysaccharidets størrelse justeres ved opvarmning ved 100°C i et tidsrum, der er proportionalt med graden af 35 den nødvendige størrelsesændring. Polysaccharidets størrelse justeres, så at mindre end 20% eluerer fra en CL-4B "Sepha- 12

DK 161013 B

rose"®-kolonne i mel lemrums voluminet, og mindre end 20% eluerer med et Kd på over 0,5. Hovedfraktionen har en mole-kylstørrelse på 200.000 til 2.000.000 Dalton.

Eksempel 2

5 Aktivering af PRP

A. Polysaccharidet afkøles på isbad til 4°C i en reaktionsbeholder udstyret med magnetisk omrører. PRP's begyndelses volumen ved en koncentration på 25 mg/ml (20-30 mg/ml-interval) i destilleret vand noteres. Derpå tilsættes 10 natriumchlorid til en koncentration på 0,85%.

B. pH i den fremkomne opløsning af polysaccharidets natriumsalt hæves til 10,5-11,0 ved tilsætning af IN natriumhydroxid . (Dette interval vælges, fordi ved lavere pH sker der mindre reaktion med cyanogenbromid, og ved højere pH

15 nedbrydes polysaccharidet).

C. Tørt cyanogenbromid opløses i 0,005 N natriumbicar-bonatpuffer med pH 10,5-11,0 og sættes straks (inden for 10 minutter efter fremstillingen) til reaktionsbeholderen i et forhold på 0,4 mg/mg PRP.

20 D. Blandingens pH justeres til og holdes ved 10,5- 11,0 i 6 minutter ved tilsætning af natriumhydroxid.

E. pH sænkes derpå til 6,0 med IN HC1. (Surt pH stabiliserer de aktiverede steder, der er dannet på polysaccharidet med cyanogenbromid. Yderligere sænkning af pH resulterer 25 i hydrolyse af PRP).

G. Der tilsættes et lige så stort volumen saltvandsopløsning, pH 6,0, i forvejen afkølet til 4°C.

H. Cyanogenbromid/polysaccharidblandingen overføres til et inddampningsapparat og inddampes til det oprindelige 30 volumen i trin A.

I. Trin G og H gentages ialt 10 gange. Således fjernes ca. 99,9% af det uforbrugte cyanogenbromid, medens polysac-charidkoncentrationen holdes på 25 mg/ml. Hvis cyanogenbro-midet ikke fjernes, reagerer det med diphtheria-exotoxoidet, 35 der anvendes nedenfor.

13

DK 161013 B

Eksempel 3

Fremstilling af D-AH-bærer A. I handelen værende diphtheria-exotoxoid (D) i destilleret vand inddampes til 20-40 mg/ml, typisk 35 mg/ml, 5 over en membran, der tilbageholder molekyler på over 10.000 Dalton, i en omrørt fordamper med positivt tryk.

B. En tør blanding af 8 mg adipinsyre-dihydrazid (ADH) pr. mg protein og 0,75 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid (EDAC) pr. mg protein anbringes i en 10 reaktionsbeholder udstyret med en effektiv omrører og en pH-sonde, der tillader overvågning og regulering af pH.

C. Derpå tilsættes diphtheria-exotoxoidet til reaktionsbeholderen, så at forholdet mellem reaktanterne bliver diphtheria exotoxoid = 35 mg protein/ml 15 ADH =8,0 mg/mg protein EDAC = 0,75 mg/mg protein (Anvendelsen af acetatpuffer på tilsætningen af først ADH og derpå EDAC resulterer i et vedvarende fnugget bundfald. Reaktanterne har tilstrækkelig pufringskapacitet i 20 sig selv).

D. pH justeres straks til 4,7 og holdes på 4,7±0,2 i mindst 2 timer.

1. Forløbet af den kemiske reaktion kan følges på pH-kontrollens registrator. Om nødvendigt får 25 reaktionen lov at forløbe i mere end 2 timer, indtil pH har været stabilt i mindst 15 minutter (dvs. 15 minutter, uden at det er nødvendigt at tilsætte HC1 til regulering af pH).

2. Den forbrugte mængde HC1 noteres som kontrol 30 af processen.

3. Temperaturændringer i reaktionsbeholderen overvåges ligeledes.

E. Reaktionsproduktet dialyseres ved 4°C mod to ændringer af saltvandsopløsning, et minimum på 100 volumen- 35 dele og 8 timer pr. ændring.

DK 161013 B

14 F. Produktet dialyseres derpå mod to ændringer af phosphatpufret saltvandsopløsning, minimumvolumen, tid og temperatur som i trin E.

G. Produktet (D-AH) inddampes tilbage til 25 mg/ml 5 protein med et apparat med positivt tryk og en 10.000 molekylvægt-membran .

H. Koncentratet filtreres sterilt (0,2 μ) og opbevares ved 4°C.

Analyse af en prøve af en typisk portion af en sådan 10 D-AH-bærer viser et forhold på 38,3 mikrogram ADH/mg D. Chromatografi af den samme prøve viser en Kd-værdi på CL-4B ,,Sepharose,,® på 0,75, hvilket svarer til en tilnærmelsesvis molekylvægt på 139.000 i forhold til proteinstandarder.

Eksempel 4 15 Dannelse af det covalente polysaccharid/diphtheria-toxoid--koniuaat (ΡΚΡ-ΡΪ A. Diphtheria-toxoid-adipinsyre-hydrazidbæreren (D-AH) i eksempel 3 behandles ved en koncentration på 25 mg/ml med natriumbicarbonat til en koncentration på 0,5 molær, og 20 pH justeres til 8,5. (Udtalt lavere saltkoncentrationer resulterer i dannelsen af en gel i den endelige reaktionsblanding med aktiveret polysaccharid).

B. I reaktionsbeholderen, der kan tillukkes, tilsættes en lige så stor mængde af den vaskede PRP-opløsning, der 25 blev fremstillet i eksempel 2, og pH skal ligge stabilt på 8,4-8,6. (Hvis CNBr ikke er fjernet, vil pH hurtigt glide nedad, og der vil dannes et rigeligt bundfald. Denne reaktion indtræffer, selv når der ikke er polysaccharid til stede.

Der må ikke forekomme en klar ændring af reaktanternes fysis- 3 0 ke udseende efter kombinationen).

C. Reaktionsblandingen omtumles i 15-18 timer ved 4°C.

D. Konjugatet renses ved gelpermeeringschromatografi på "Sephacry1"®-3 0 0 i ligevægt i phosphatpufret saltvandsopløsning for at fjerne uomsat protein og materiale med en 35 molekylstørrelse under 140.000 Dalton. (Hvis udgangspoly-

DK 161013B

15 saccharidet har for ringe størrelse, vil det ikke være muligt at adskille konjugatet fra frit protein på denne måde).

E. Prøver af det rensede konjugat udtages til kemisk analyse, der beskrives i det følgende afsnit af det forelig- 5 gende eksempel.

F. Der tilsættes "Thimerosal" til det rensede konjugat indtil en koncentration på 1:10.000, og produktet opbevares ved 4°C, indtil det analyseres.

G. Produktet filtreres 0,2 μ sterilt. (Hvis polysac-10 charidet ikke er størrelsesjusteret som beskrevet i eksempel 1(D), dvs. hvis det er for stort, kan det fremstillede konjugat ikke filtreres).

Analyse

Der udføres prøver på koncentratmassen i eksempel 4, 15 og disse giver følgende resultater: a) Riboseindhold: 156,5 mikrogram/ml.

(Til beregning af PRP-værdien i eksempel 5 anvendes en omregningsfaktor på 2 til udregning af en nominel poly-saccharidkoncentration baseret på den empirisk bestemte 20 ribosekoncentration).

b) Proteinindhold: 330 mikrogram/ml.

c) Ribose/protein-forhold: 0,47 (grænser 0,25-1,0).

d) Chromatografisk analyse på "Sepharose"® CL-2B giver en chromatografisk profil, der viser homogen fordeling 25 af konjugatmolekyler som en enkelt spids.

e) Kd (polysaccharid): 0,36 med "Sepharose"® C1-4B, 0,77 med C1-2B.

Bestemt ved hjælp af individuel fraktionsriboseanalyse med hensyn til PRP. En værdi på 0,36 på C1-4B svarer til en 30 tilnærmelsesvis molekylstørrelse på 674.000 i forhold til dekstranstandarder.

f) Kd (protein): 0,34 med C1-4B, 0,71 med C1-2B.

Bestemt ved individuel Lowry fraktionsanalyse med hensyn til protein. Ændringen i diphteria-exotoxoidets Kd-35 værdi fra 0,75 til 0,34 på C1-4B viser, at proteins konjuga-

DK 161013 B

16 tion med polysaccharid danner et molekyle, der er chromato-grafisk forskelligt fra begge råmaterialer.

g) Frit protein: mindre end 5%.

Frit protein repræsenterer derivatiseret diphtheria-5 bærerprotein, der ikke er blevet bundet til PRP. Det bestemmes ved at sammenligne den mængde protein, der eluerer i en diphtheria-exotoxoid-prøves stilling i forhold til det totale eluerede protein.

h) Endotoxinindhold: 1 ^g/ml.

10 Endotoxin mængdebestemmes ved Limulus Amøbocyt/lysat- analyse (LAL). Endotoxinindholdet beløber sig til 64 ng pr, 10 nq ribose dosis PRP-D til mennesker.

i) Pyrogenicitet: Koncentratmassen opfylder USA-stan-darder for ikke-pyrogenicitet, når der anvendes en vægtæk- 15 vivalent (til mennesker) dosis på 0,15 ^g ribose pr. ml pr. kg legemsvægt af kanin.

j) Polyacrylamid-gel-elektroforese (PAGE): PAGE-analyse foretages for at få yderligere bevis på renhed og covalent binding mellem polysaccharid og protein.

20 Medens fri bærer bindes lige over halvvejen i gelsøjlen, omtrent ved katalases stilling (molekylvægt 60.000), er PRP-D-konjugatet ikke i stand til at komme ind i gelen (før thyroglobulins stilling, molekylvægt 330.000). PRP-D udviser et enkelt bånd ved begyndelsen.

25 k) Cyanogenbromid:

Medens der anvendes cyanogenbromid (CNBr) i de første trin før fremstillingen af et PRP-D-konjugat, udelukkes det derefter fra produktet. Flere trin i fremgangsmåden bidrager til reduktion af CNBr-indholdet. Imidlertid fjerner den 30 endelige rensning af vaccinen ved hjælp af gelpermeerings-chromatografi enhver forurening under molekylvægt 100.000. Denne rensning udelukker forurening med residualspormængder af frit CNBr eller dettes nedbrydningsprodukter.

1) Varmestabilitet: En undersøgelse af PRP-D-kon- 35 jugatets varmemodstandsevne foretages. Materialemassen inddampes 40 fold, og der udtages 3 prøver på hver 3 ml. Den

DK 161013B

17 første holdes i et 4°C varmt bad i 16 timer, og den tredje opvarmes i et 100°C varmt vandbad i 30 minutter. Prøverne udføres med hensyn til protein- og riboseindhold, gelper-meeringschromatografi med "Sepharose"® C1-4B og SDS-polysac-5 charid-gelelektroforese (PAGE).

Resultaterne viser ingen afgørende ændring i ribose-eller proteinindhold mellem prøverne sammenlignet med resultaterne af prøverne a) og b) ovenfor. De chromatografiske analyser viser en mindre nedgang i konjugatmaterialets mole-10 kylstørrelse, efterhånden som betingelserne gøres strengere. Imidlertid bibeholder materialet efter fraktioneret analyse af disse prøver ved at måle absorbens ved 254 nm kun én spids, der falder sammen med polysaccharidspidsen, og der kommer ingen spidser for frit protein; resultaterne kan såle-15 des sammenlignes med dem for prøverne d) og g) ovenfor. Dette viser, at bindingen mellem proteinet og polysaccharidet ikke brydes, men nedgangen i molekylstørrelse skyldes brydningen af bindingerne i det lineære polysaccharid. Dette påvises yderligere ved sammenligning af PAGE-analyse af 20 disse prøver med resultaterne, der er beskrevet under j) ovenfor. Frit protein kunne ikke påvises i nogen af prøverne, selv ikke i nærvær af et detergent (natriumdodecylsulfat). Dette bekræfter stærkt den derivatiserede protein/polysac-charidbindings covalens og dens stabilitet under behandlingen 25 ved høj temperatur.

Eksempel 5 PRP-D-immunogenicitetsafprøvning

Dette forsøg er udformet for at vise T-celle-afhængig-heden, som den kommer til udtryk: i bærerafhængighed, bærer-30 specificitet, booster-virkning og ændringen af Ig-klasse. Dette forsøg udføres i to dele: 1) en indledende forberedelsesrække på to injektioner, 2) en påvirkningsrække på to injektioner.

Materialer: 35 1. PRP-D koncentratmasse, eksempel 4.

2. Tetanus-toxoid (T).

DK 161013 B

18 3. Diphtheria toxoid (D).

4. H. influenza b kapsulært polysaccharid (PRP).

5. PRP/D en blanding af 20 øg PRP (10 øg ribose) og 20 øg D.

5 6. PRP/D-AH, en blanding af 20 øg PRP (10 øg ribose) og 20 øg D-AH.

Fremgangsmåde:

Alle immuniseringer indgives subcutant uden hjælpestof i voluminer på 1 ml. Alle doser, der indeholder PRP, justeres 10 til 10 øg ribose pr. 1 ml dosis. Ukonjugerede exotoxoiddoser justeres til 20 øg protein pr. 1 ml dosis. En rotationsplan anvendes med immuniseringer med 14 dages mellemrum. Hver immunisering efterfølges af en blodaftapning 10 dage senere.

Alle præparater fortyndes i phosphatpufret saltvandsopløs-15 ning, der indeholder 0,01% "Thimerosal". Alikvote mængder fremstilles som ampuller med 4 doser og opbevares ved -20°C.

I hver gruppe immuniseres tre kaniner.

Serologi;

Sera analyseres ved hjælp af fast-fase radioimmunana-20 lyse (SPRIA) med hensyn til anti-PRP, anti-D-AH, anti-D og anti-T som anført. Antistofniveauerne mængdeangives i mikrogram IgG og IgM pr. ml.

Protokol: _SPRIA_ 25 Gruppe Primær_Sekundær_PRP D-AH D_T_ 1 PRP PRP + 2 T PRP-D + + + ' + 3 D PRP-D + + + + 4 PRP/D PRP/D + + 30 5 PRP/D-AH PRP/D-AH + + 6 PRP-D PRP-D + + +

Plan;

Kaniner tappes for blod i forvejen og immuniseres efter gruppe hver 14. dag. Hver immunisering efterfølges af 35 en eftertapning af blod 10 dage senere. De første to injektioner foretages med det primære immunogen, medens den tredje og fjerde injektion foretages med det sekundære immunogen.

DK 161013 B

19

Anti-PRP-reaktion vises på tegningen. IgG-antistofs gennemsnitsniveau over for Haemophilus influenza b kapsulært polysaccharid i de 6 forsøgsgrupper kaniner (tre dyr i hver gruppe) er vist grafisk. Grupperne er i denne figur mærket 5 ifølge ovenstående protokol. De i forvejen af tappede niveauer er under 1 jug/ml for alle kaniner og er af hensyn til tydeligheden ikke vist på tegningen. Angivelsen "PO" (forkortelse af "Post·· i tabel I) refererer til det respons, der fås efter den med et tal angivne injektion ("POl" = respons 10 efter injektion nr. 1 etc.).

Åbne kolonner viser IgG-niveauet efter to efter hinanden følgende injektioner med det primære immunogen. De udfyldte kolonner viser IgG-niveauerne efter den tredje og den fjerde injektion, som foretages med de sekundære eller 15 påvirkningsimmunogenerne.

IgG-reaktioner ses kun efter immunisering med PRP-D--konjugatvaccinen, jfr. gruppe 2, 3 og 6 på tegningen. Præparering af kaninerne i gruppe 3 med diphtheria-toxoid frem-skynder reaktionen på PRP-D, medens præparering med tetanus 20 toxoid (gruppe 2) ikke har nogen virkning.

De grupper, der er angivet i den følgende tabel I, er de samme som de, der er angivet i den ovennævnte protokol.

DK 161013 B

20

Tabel I

ANTI-PRP-RESPONS

Fastfase-radioimmunoafprøvning for IaM oa IaG

PRP Difteri-toxoid Tetanus-toxoid

5 IaG* IaM IaG IaM IaG IaM

Gruppe 1

Præ 0.0# 0 IG IG

Post 1 0.33 0 10 ±0.58

Post 2 0.8 0 ±1.39

Post 300 Post 40 0 15 Gruppe 2

Præ 0 0 0 0 0.5 0 ±0.87

Post 1 0 0 0 0 25.1 113.1 ±15.10 ±129.54 20 Post 20 0 0 0 112.00 44.60 ±0 ±36.90

Post 3 4.82 26.3 0 0 112.00 8.50 ±2.59 ±45.55 0 0 ±0 ±14.72

Post 4 36.1 74.57 0 0 151.60 2.00 25 ±17.43 ±28.81 ±52.64 ±3.46

Gruppe 3

Præ 0.2 0 0 27.07 0.8 65.00 ±0.35 ±46.88 ±1.39 ±112.58

Post 1 0.2 0 0 0 0.8 0 30 ±0.35 ±1.39

Post 2 0 14.6 6.47 0 0.67 0 ±25.29 ±5.98 ±0.59

Post 3 19.4 130.33 10.63 0 0.37 0 ±13.4 ±89.49 ±8.08 ±0.65 35 Post 4 74.2 82.63 29.03 0 1.30 0 ±76.73 ±5.16 ±26.59 ±2.25.

DK 161013 B

21

Tabel I (fortsat)

ANTI-PRP-RESPONS

Fastfase-radioimmunoafprøvning for igM oa IqG

PRP Difteri-toxoid Tetanus-toxoid

5 IaG* IaM IqG IqM IqG IqM

Gruppe 4

Præ 0 0 0 2.77 IG

±18.85 10 Post 1 0 15.6 2.67 30.87 ±27.02 ±0.85 ±27,14

Post 2 0 0 37.2 26.2 ±10.94 ±24.30

Post 300 210.00 19,63 15 ±0 ±17.06

Post 400 298.27 0 ±207.70

Gruppe 5

Præ 0 0 IG

20 Post 100 Post 200 Post 30 0

Post 40 0

Gruppe 6 25 Præ 0 0 0 0

Post 1 6.23 135.00 0 0 +2.56 +81.41

Post 2 54.2 182.00 0.93 0 ±14.73 ±0 ±1.62 30 Post 3 57.6 182.00 3.05 0 ±22.91 ±0 ±4.31

Post 4 39.6 91.20 5.95 0 ±25.17 ±0 ±8.41 * IgG og IgM udtrykkes som μg antistof pr. ml serum. Alle 35 værdier er middelværdier og standardfejl.

# Ig-niveauer under sensitiviteten for prøven angives med værdien 0 (overalt).

Hvis der er niveauer højere end området for prøven, gives denne en værdi lig den øvre grænse for prøven.

40 IG = Ikke gennemført.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat, der er i stand til at frembringe T-celle-afhængig antistof-5 reaktion mod polysaccharid fra Haemophilus influenzae b, med en molekylvægt mellem 140.000 og 4.500.000 Dalton og med et ribose/protein-forhold mellem 0,25 og 1,0, kendetegnet ved, at man a) opvarmer et kapsulært polysaccharid af Haemophilus 10 influenzae b bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og phosphat, indtil mere end 60% af polysac-charidet har en molekylvægt mellem 200.000 Dalton og 2.000.000 Dalton, b) aktiverer det fremkomne størrelsesregulerede poly-15 saccharid med cyanogenbromid, c) fjerner i det væsentlige alt uomsat cyanogenbromid, og d) omsætter det aktiverede produkt med et adipinsyre--hydrazid-derivatiseret diphtheriatoxoid.

2. Hapten, i det væsentlige frit for protein og nucle- insyre, til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er fremstillet ud fra kapsulært Haemophilus influenzae b-polysaccharid, bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og 25 phosphat, ved opvarmning, indtil mindre end 20% af polysac-charidet har en molekylvægt under 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylvægt over 2.000.000 Dalton med deks-transtandard som reference ved gelpermeeringschromatografi.

3. Hapten ifølge krav 2, kendetegnet ved, 30 at polysaccharidet er til stede som natriumsalt.