KR880001098B1

KR880001098B1 - 헤모필루스 인플루엔재 b 다당류 엑소톡소이드 배합체 왁진의 제조방법

Info

Publication number: KR880001098B1
Application number: KR1019830003069A
Authority: KR
Inventors: 고르던 랜스
Original assignee: 콘노트 러보러토리즈, 인코포레이티드; 데이비드 윌리암스
Priority date: 1982-07-06
Filing date: 1983-07-05
Publication date: 1988-06-29
Also published as: AU561978B2; IE831574L; NZ204771A; FI79024C; DE3363505D1; WO1984000300A1; CA1210695A; DK161013B; ES523905A0; ES8500745A1; JPH0347253B2; DK93584A; US4496538A; EP0098581A2; JPS59501360A; ZA834939B; EP0098581A3; FI79024B; FI840874A; FI840874A0

Abstract

내용 없음.

Description

헤모필루스 인플루엔재 B 다당류 엑소톡소이드 배합체 왁진의 제조방법

첨부도면은헤모필루스 인플루엔재B 캡슐형 다당류의 면역성, 즉 항 -PRP반응을 보인 것으로서, 막대그래프는 실시예 5의 공정 성적표에 따른 자료를 나타낸 것이다.

본 발명은 다당류-디프테리아 톡소이드 배합체(PRP-D)왁진 및 다당류-파상풍 톡소이드 배합체(PRP-T)왁진으로 예시되는 신규헤모필루스 인플루엔재B 다당류-엑소톡소이드(Haemophilus ininfluenzae B polysaccharide-exotoxoid), 이것을 제조하는데 사용되는 다당류 합텐류 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 거의 등량의 리보스, 리비톨 및 포스페이트로 구성되며, 열처리에 의하여 200,000 내지 2,000,000달톤 사이의 분자크기로 조절되고, 그 다음 활성제(전형적으로 시아노겐 브로마이드)로 활성화시킨 순수 헤모 필루스 인플루엔재 B 다당류를 제공하여 준다.

본 명세서에서 언급된 분자크기는 겔 투과 크로마토그래피에 본의한 덱스트란 표준과 관계가 있다. 활성화 다당류는 엑소톡소이다, 바람직하기로는 디프테리아 톡소이드와 혼합되어 배합체를 형성한다.

바람직하기로는 엑소톡소이드는 스페이서로서 4-8개의 탄소 브리지를 사용함으로서 유도된다.

예를 들면 디프테리아 톡소이드(D-AH)의 아디핀산 하이드라지드 유도체. 사용될 수 있는 다른 유도된 엑소톡소이드류에는 파상풍 톡소이드(T-AH)가 포함된다. 엑소토이드는 복합 AH단위에 부착된다.

상기 방법을 사용함으로서 헤모피루스 인플루엔재 B로 부터 다당류에 T-세포 종속반응을 유도하는 배합체 왁진이 얻어진다. 그와 같은 배합체는 유아 및 어린이에 있어서 헤모피루스 감염의 예방에 사용하기에 특히 유용하다.

또한 본 발명은 디프테리아 및 파상풍 같은 질병에 대한 면역에 유용한 배합체 왁진을 이용가능하게 한다. 그와 같은 배합체의 인간에 있어서의 효능은 종래의 디프테리아 및 파상풍 톡소이드 제제보다 크다. 과잉의 활성제를 주의깊게 조절 및 제거함으로서 상기 방법은 스페이서를 통하여 연결되며 사실상 가교 또는 중합체 유동체가 없는 다당류의 단일 분자에 부착되는 엑소톡소이드의 복합 분자로 구성된 다당류 배합체를 제고하여 준다. 그 일반식은 일반적으로 PRP-Xn으로 나타낼 수 있는데, 여기에서 X는 톡소이드 부분이고, n은 20이하의 정수로서 평균 7-8이다.

본 명세서에서 디프테리아 톡소이드 배합체는 정수n를 사용함이 없이 PRP-D로서 칭하여지며, 파상풍 배합체는 정수 n를 사용함이 없이 PRP-T로서 칭하여진다. 안정한 액소성 면역의 발생에는 최소한 두개의 분리된 세트의 임파구에 의한 인식을 필요로 한다. 이들 세트는 항체 형성세포의 전구물질 인 B-임파구, 및 B-세포의 기능을 조절하는 T-임파구이다.

몇몇 다당류를 포함하는 어떤 항원은 B-세포를 직접 자극하여 항체(T-독립항원)를 생성할 수 있는 반면에, 대부분의 항원(T-종속)은 T-임파구에 의하여 B-세포에 나타나야만 한다.

본 발명의 왁진의 경우, 왁진의 엑소톡소이드 부분은 T-세포계에 의하여 인식된다. 단백질은 그 자신의 항원성 결정인자 및 공유결합 PRP합텐을 갖고 있기 때문에, 양 결정 인자는 T-세포에 의하여 B-세포에 나타나야만 한다. 이 담체-합텐의 공급결과는 PRP가 T-종속 면역원으로서 존재한다는 것이다. PRP의 T-종속 존재는 유아에 있어서 예방 면역을 유발시킨다. 따라서 본 발명의 배합체 왁진은 유아에 특히 유용하다. 여성에 그와 같은 배합체를 투여하면 왁진 항원에 대하여 높은 비율의 IgG항체를 유발시키며, 이것은 임신중 태반관문을 침투하여 태아에 대하여 예방을 부여한다.

T-독립 항원은 B-세포를 유발하여 항체 분비세포(혈장세포)로 분화하는 반면에, T-종속 반응은 상당히 복잡하다.

T-종속 자극을 받은 후, B-세포집단은 항체 생산뿐만 아니라 증식 및 성숙을 시작한다.

그 결과 PRP에 대하여 항체를 만드는 B-세포의 수가 증가하고 또 PRP에 대하여 제2노출에 반응할 수 있는 B-세포의 수가 증가한다. 반복면역은 PRP특정 B-세포의 수를 더욱 증가시키며, 따라서 항체 역가, 부우스터 반응이 높아진다.

요약하면, T-독립반응은 반응성 B-세포의 수에 의하여 제한되는 반면, T-종속 반응은 항원 반응성 세포의 총수를 증가시킨다.

본 발명의 PRP-엑소톡소이드 왁진은 실험 동물에서 T-종속 면역원으로서 작용하는 것으로 나타났다. PRP-D의 표준 투여량으로 연속 면역시킨 일군의 토끼에 있어서 모든 동물은 부우스터 반응을 보여주었다.

이외에, 배합체 예컨대 PRP-D에 대하여 디프테이라 톡소이드에 사용된 캐리어 단백질로의 1차 면역은 PRP-엑소톡소이드 배합체의 PRP성분에 대하여 초기 반응을 증가시키는 것으로 나타났다.

PRP반응의 유사한 증가는 배합체에 사용된 것 이외의 엑소톡소이드를 주입한 동물에서는 나타나지 않았다.

본 발명의 왁진은 PRP-엑소톡소이드 합텐-캐리어 배합체이다. 이러한 왁진에 있어서, 항원성이지만 면역성이 약한 합텐 분자(PRP)는 새로운 항원 특성을 디프테리아(D) 또는 파상풍 톡소이드(T)같은 고도의 면역성 캐리어 분자에 부여한다. 제조시 캐리어로서 사용되는 정제 디프테리아 톡소이드(D)는 수용성 카보디이미드 축합 방법을 사용하여 아디핀산 디하이드라지드(ADH) 같은 4-8개의 탄소 스페이서 분자의 부착에 의하여 변성된 상업적 엑소톡소이다. 변성된 엑소톡소이드, 전형적으로 아디핀산 하이드라지드 유도체X-AH는 미반응 ADH로 부터 유리된다.

이것은 사실상 가교가 없는 수용성 생물로서, 겔 크로마토그래피 및 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동에 의하여 측정된 바와 같이 분자크기의 증가의 결핍에 의하여 증명된다. 헤모필루스 인플루엔재 B의 캡슐형 다당류는 허가된 다당류 왁진에 사용되는 것과 같은 상업적 공급원으로 부터 제조되며, 코나트 라보러토리스(Connaught Laboratories)로 부터 얻을 수 있다.

그러나 다당류는 통상적으로 칼슘으로서 정제될 때, 칼슘이온의 사용은 피하는 바, 그 이유는 칼슘이온이 배합과정에서 탄산염 완충제의 사용을 방해하기 때문이다. 그 다음 다당류의 분자크기는 합텐에 대한 소망하는 치수가 얻어질 때까지 가열에 의하여 조절된다.

전형적으로, 액체 다당류를 100℃에서 15분 동안 가열하면 분자의 20%이하가 200,000달톤이하의 분자크기를 갖게하고 분자 크기의 20%이하가 2,000,000달톤 이상의 분자크기를 갖게 하는데 충분하다.

이와 같은 크기로 하는 조작은 적당한 PRP-D 또는 PRP-T배합체를 얻는데 중요하다.

이와 같은 크기로된 다당류를 활성화제로 활성화 하여 시아노겐 할라이드 또는 나트륨 보로하이드라이드 같은 다당류에 대한 친전자군을 생성한다. 사용되는 대표적인 활성화재는 시아노겐 브로마이드이다. 미반응활성화제는 전부 제거시키는데, 그 이유는 잔사가 존재 하는 경우 다음 반응 혼합물에서 단백질의 가교를 일으키기 때문이다.

얻어지는 가교 생성물은 다당류를 포획하여 왁진의 수율을 저하시키고 화학적 성질 및 생성되는 배합체의 용해도가 상이한 고분자의 배합체를 생성하며 본 발명의 왁진의 필요로 하는 부분이 결핍된 왁진을 생성한다.

그 다음 활성화된 PRP 및 X-AH를 결합하여 냉온에서 방치하여 반응시킨다. 유도된 엑소톡소이드에 대한 몇몇 하이드라지드 군을 PRP에 대한 활성부위와 반응시켜 공유결합을 형성한다. 생성물은 4-8개의 탄소브리지를 통하여 유도된 엑소톡소이드에 공유 결합된 PRP이다. 이 반응 생성물을 겔 투과 크로마토그래피에 의하여 정제하여 미반응 단백질 및 저분자의 크기의 오염불질을 제거한다. 주요 유분의 대표적인 분자 크기는 덱스트란 표준에 대하여 약 675,000달톤이다. 상대적인 분자 크기에 대한 전형적인 범위는 140,000-4,500,000달톤이다. 디메로살같은 방부제가 최종농도에 대하여 1:10,000의 비율로 첨가된다. 농축물은 0.2미크론의 막여과기를 통하여 여과한 다음 냉온에서 저장한다. PRP엑소톡소이드 배합생성물은 내열성이고 수용성이다. 가교의 겔핍은 겔 투과 크로마토그래피 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정한 바와 같이 출발 다당류의 증가로 부터 분자크기의 사실상의 증가 결핍에 의하여 증명된다. 열 안정성은 저장 수명을 길게하며, 심지어 바람직하지 않는 기후에서 생성물이 안정되게한다.

반응은 다음과 같은 두 단계로 나타낼 수 있다.

(1) PRP + CNBr→PRP^*

(2)PRP^*+ nX→PRP(-X)n

시아노겐 할라이드의 제거가 효율적으로 수행되지 않는 경우 활성 PRP 및 엑소톡사이드의 배합이 일어나 PRP(-X)n, 예컨대 X-X 또는 복합가교 유도체,

예컨대

의 형성과 같은 바람직하지 않은 반응을 형성한다.

피하주사 또는 피내주사에 있어서 PRP-엑소톡소이드 배합체 왁진의 대표적인 인간투여량은 10마이크로그램의 리보스를 함유하는 0.5ml 또는 거의 동량의 배합체 생성물 40마이크로 그램으로 구성된다.

앰플용액은 방부제로서 티메로살을 사용하여 농축액을 인산염 완충 염류용액으로 희석시켜 제조한다. 생성물은 인간에 있어서 PRP 및 엑소톡소이드 성분에 대하여 항체 형성을 유발한다.

본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

PRP의 제조

(A). 유기물

헤모필루스 인플루엔제 B의 캡슐형 리비톨 포스페이드(PRP)를 에간균주(Eagan strain)로 부터 제조하였다. 배양균을 반복하여 옮겨 동결건조 종자를 마련하였다. 상기 동결건조종자로 부터 습식 작업 종자(-60℃에 저장)를 얻기 위하여 한번 더 옮겼다.

박테리아 세포의 발효기 로트를 습식작업종자로 부터 제조하였다. 배양균의 순도를 다음과 같은 기준에 의하여 측정하였다.

1. 네거티브 그램 착색 특성

2. NAD(디포스포피리딘 뉴클레오티드) 및 헤민, (페르헤메의 보빈형 1결정성 염)을 함유하는 한천상에서의 성장.

3. NAD 또는 헤민이 없는 한천에서의 성장결핍.

4. 특정 항혈청(B형 헤모 필루스 인플루엔재 B, 하일랜드 레보라토리스)에 의한 응집.

(B). 배양 및 배지

박테리아를 2차 배양하기 위하여 즉 발효기의 선행 접종을 위하여, BHI 한천[1ℓ당, 37g의 BHI 디프코, 15g의 박토한천 디프코, 0.6ml의 1% NAD시그마-등급 III 및 6ml의 0.2% 헤민(시그마-보빈형 1)]을 이용하였다.

한천표면으로 부터 세척한 세포(20시간)을 헤모필루스 인플루엔재 B(Hib) 액체배지(1ℓ)를 접종하는데 사용하였다. 이들 배양균을 박테리아가 그의 성장사이클의 로그상에 도달할 때까지 진탕하면서 접종하였다.

이때 2ℓ의 배양균을 사용하여 발효기에서 각 40ℓ의 액체 Hib 배지를 접종하였으며, 300ml의 UCON(유니온카바이드윤활제)를 가했다. 16-18시간후 발효기 배양균을 수확할 준비를 하였다. 1000ml단 Hib액체 배지의 조성은 다음과 같았다. 즉

효모 추출 투석물, 디프코... 5.0g

카사미노산, 디프코..............................22.5g

인산나트륨, 이염기성...........................14.4g

댁스트로스..........................................5.59g

헤민....................................................20g

수산화암모늄(30%).......................0.1534ml

NAD 1%............................................0.6ml

발효기를 수확했을 때, 배양균 순도를 적당한 그램 염색 및 배양기술(상기(A)의 1-4참조)에 의하여 측정하였다. 세타브론(헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드)을 배양균에 가하여 최종농도를 0.1%로 하였따.

30분 후, 박티리아가 비활성화되었으며, 고체 페이스트를 원심 분리에 의하여 수집하였다. 젖은 페이스트를 더 처리할 때까지 -70℃에서 저장하였다.

(C) 정제된 다당류

PRP의 수출 및 연속 정제는 다음과 같은 공정을 사용하여 수행하였다. 즉

1. 세정제로 부터 분리

페이스트이 각 그램 수분 중량에 대하여, 10ml의 0.4M NaCl을 가했다. 현탄액을 30초 동안 시판 혼합기에서 혼합하였다. 혼합물을 17,000Xg(4℃)에서 15분 동안 원심분리하였다. 상징 액을 수집하고, 에탄올을 가하여 농도를 25%로 하였다. 그 다음 이혼합물을 17,000Xg(4℃)에서 2시간 동안 원심 분리한 다음 상징액을 모았다. 상징액의 용적의 4배로 에탄올을 가하여 온합물을 4℃에서 철야 방치하였다.

2. 헥산의 제거

혼합물을 2800Xg(4℃)에서 5분동안 원심 분리하였다. 침전물을 모아 페이스트를 추출하는데 최초 사용된 용적의 1/4의 트리스 -MgSO₄완충액에서 재현탁시켰다. 트리스 완충액의 조성은 증류수 1ℓ에 대하여 다음과 같았다.

트리스-하이드록시메틸 아미노-메탄(시그마)..........6g

MgSO₄·7H₂O.................................................246g

테메로살(엘란코).............................................50mg

PH를 농염산으로 7.0±0.2로 조절하였다. 최초의 수분 페이스트 100당 데옥시리보뉴클레아제 I(1.5mg)(시그마 D-0876) 및 리보뉴클레아제-A(0.75mg)(시그마-형 1-AS, R-5503)를 가했다. 이것을 투석용 자루(bag)에 넣고 37℃에서 18시간 동안 18ℓ의 트리스-MgSO₄완충액에 접종하였다.

3. 단백질의 제거

상기 물질을 등량의 페놀-아세테이트 용액(45g의 페놀과 혼합된 135ml의 10%(W/V)나트륨 아세테이트)을 가하여 단백질 성분을 제거하기 위하여 더욱 처리하였다. 그 다음 상기 물질을 30분(4℃)동안 진탕하고, 17,000Xg에서 15분 동안 원심분리한 다음 수성상을 수집하였다. 두 부분의 추가적인 페놀 추출물을 처리한 다음 증류수에 대하여 마지말 수성상을 투석하였다. 이 단계에서 물질을 용적 액체 캡슐형 다당류(PRP)로 구성되며 더 처리(하기 D 부분 참조)할 때 까지 -20℃에서 저장 하였다.

4. 다당류의 품질을 평가

용적 PRP의 품질을 제거되는 액체 시료의 분석에 기준하여 판단하였다. 에탄올을 가한 다음(4 용적), CaCl₂(최종농도 0.02M)을 가하여 PRP를 침전시켰다. PRP를 원심분리에 의하여 침전시킨 다음 진공하에 건조기에서 건조시켰다.

열중력계 분석(TGA)를 사용하여 수분 함량을 측정하였다. 더우기 분석은 건조 중량을 기준하여 계산하였다. 허용 기준에는 다음과 같은 것이 포함된다. 즉

(a). 리보스의 분석(오르시놀 방법)...........30%이상

(b). 단백질 분석(로우리 방법)...................1%이하

(c). 핵산의 분석(U.V 흡착).......................1%이하

(d). 특정 면역혈청으로 침전(역 면역 전기 영동방법)

이외에, 분자 크기는 적당한 겔 투과 크로마토그래피에 의하여 측정하였다. 다당류는 리뮬러서 리세이트 시험 및 쥐의 발열성 시험에 의하여 내독소에 대하여 모니터 되었다. 전형적인 로트는 다음과 같은특성을 갖는다.

(a). 단백질 함량 0.5%

(b). 핵산함량 0.35%

(c). 소의 잔류 항원 : 방사선 면역 분석에 의하여 측정한 바와 같이 다당류의 제조에 사용된 소의 RNA-아제 및 DNA-아제의 의해 정제된 PRP의 오염없음.

(d). 내독소 함량은 리세이트(Lysate)에 대한 리뮬러스 아메보사이트(Limulus Amoebocyte)분석(LAL)에 의하여 측정하였다 ; 200mg/mg PRP.

(e). CL-4B 세파로스에 의한 Kd : 0.30. 0.30이란 값은 덱스트란 표준에 대하여 약 1,125,000의 분자량에 해당한다.

(D) 다당류(PRP)시약의 제조.

따라서 다당류를 액체로서 정제하였으나 정제공정에 칼슘은 사용하지 않았다. (통상의 다당류 정제는 칼슘염을 생성하나, 칼슘은 배합중 아래에 사용된 탄산염 완충액과 결합하여 침전물을 형성할 수 있다.) 다당류의 크기는 필요로 하는 크기 변화의 정도에 비례하는 시간동안 100℃에서 가열하여 조절하였다. 다당류의 크기는 20%이하가 공극용량으로 CL-4B 세파로스 컬럼으로 부터 용리되고, 20% 이하가 0.5이상의 Kd로 용리되도록 조절하였다. 주요 유분은 200,000-2,000,000 달톤의 분자크기를 가졌다.

[실시예 2]

PRP 활성화

(A). 다당류를 교반 기가 설치된 반응용기에서 빙욕에서 4℃까지 냉각시켰다. 증류수에서 25mg/ml(20-30mg/ml범위)의 농도로 PRP의 초기 용적이 기록되었다. 그 다음 염화나트륨을 가하여 농도를 0.85%로 하였다.

(B). 다당류의 나트륨 염의 용액의 PH를 1N 수산화나트륨을 첨가하여 10.5-11.0까지 상승시켰다. (이 범위는 낮은 PH에서 시아노겐 브로마이드와 반응이 적게 일어나고, 높은 PH에서 다당류가 파괴되기 때문에 선택된다.)

(C). 건조 시아노겐 브로마이드를 PH 10.5-11.0의 0.005N 중탄산 나트륨 완충액에 용해시킨 다음 즉시(제조 10분 이내) 0.4 mg/mg PRP의 비율로 반응 용기에 첨가하였다.

(D). 혼합물의 PH를 수산화나트륨을 가하여 6분동안 10.5-11.0으로 조절하고 유지하였다.

(E). 그다음 PH를 1N HCl을 사용하여 6.0까지 저하시켰다.(산 PH는 시아노겐 브로마이드에 의해 다당류에 생성된 활성 부위를 안정화 시킨다. PH를 더욱 저하시키면 PRP의 가수분해가 일어난다.)

(F). 등량의 염류를 가했다.(PH 6.0, 4℃까지 사전 냉각시킨 것).

(G). 시아노겐 브로마이드-다당류 혼합물을 농축기에 보내 단계(A)에서 기록된 초기 용량까지 농축시켰다.

(H). 단계(F) 및 (G)를 총 10회 반복하였다. 따라서 소비되지 않은 시아노겐 브로마이드의 약 99.9%가 제거된 반면에, 다당류 농도는 25mg/ml로 유지되었다. 시아노겐 브로마이드가 제거되지 않는 경우, 이것은 아래 사용된 디프테리아 엑소톡소이드와 반응한다.

[실시예 3]

D-AH 케리어의 제조

(A). 증류수의 상업적 디프테리아 엑소톡소이드(D)를 양압으로 교반된 농축기에서 10,000달톤이상의 분자를 유지하는 막에서 20-40mg/ml, 전형적으로 35mg/ml로 농축시켰다.

(B). mg 단백질 당 8mg의 아디핀 산 디하이드라지드(ADH) 및 mg 단백질 당 0.75mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필) 카보디이미드(EDAC)의 건조혼합물을 교반기 및 PH 탐침이 설치된 반응 용기에 넣고 모니터 하면서 PH를 조절하였다.

(C). 그 다음 디프테리아 엑소톡소이드를 반응 용기에 가하여 다음과 같은 반응 물질의 비율로 만들었다.

즉

디프테리아 엑소톡소이드 =35mg 단백질/ml

ADH =8.0mg/mg 단백질

EDAC =0.75mg/mg단백질

(ADH와 EDAC의 연속 첨가시 아세테이트 완충액을 사용하면 섬모의 침전이 계속일어난다. 반응 물질은 그자신 충분한 완충능을 갖고 있다.)

(D). PH를 즉시 4.7로 조절하여 최소 2시간 동안 4.7±0.2로 유지하였다.

1. 화학 반응 과정은 PH조절기의 기록계에 따를 수 있다. 필요한 경우, 반응을 PH가 최소한 2분동안 안정할 때까지 2시간 이상 방치하였다.(즉, PH를 조절하기 위하여HCl의 첨가를 필요로 하지 않는 15분)

2. 소비된 HCl의 양은 공정 체크로서 기록되었다.

3. 또한 반응 용기의 온도 변화를 모니터 하였다.

(E). 반응 생성물을 두개의 염류 교체, 최소 100 용량 및 변화 당 8시간에 대하여 4℃에서 투석하였다.

(F). 그 다음 단계(E)에 대하여 한 것처럼 두개의 인산염 완충 염류를 교체, 최소용량, 시간 및 온도에 대하여 투석하였다.

(G). 생성물을 양압장치 및 10,000MW막을 사용하여 25gm/ml 단백질로 농축시켰다.

(H). 농축액을 무균 여과(0.2μ)한 다음 4℃에서 저장하였다.

그와 같은 D-AH 캐리어의 전형적인 로트의 시료를 분석한 결과 38.3 마이크로그램 ADH/mg DT의 비율을 보여주었다. 시료를 크로마트그래피한 결과 단백질 표준에 대하여 거의 139,000의 분자량에 해당하는 0.75의 CL-4B 세파로스의 Kd 값을 보여주었다.

[실시예 4]

공유 결합 다당류-디프테리아 톡소이드 배합체(PRP-D의 형성

(A). 일반식 3의 디프테리아 톡소이드 아디핀산 하이드라지드 캐리어(D-AH)(25mg/ml의 농도)를 중탄산 나트륨으로 처리하여 농도를 0.5M로 하고 PH를 8.5로 조절하였다. (상당히 낮은 염 농도는 활성 다당류와의 최종 반응 혼합물에서 겔을 형성한다.)

(B). 봉함할 수 있는 용기에, 실시예 2에서 생성된 등량의 세척한 PRP용액을 가했으며, PH는 8.4-8.6에서 안정하였다. (CNBr가 제거되지 않는 경우, PH는 신속하게 저하될 것이며, 많은 침전물이 형성되게 된다. 이 반응은 심지어 다당류의 부재하에서 도 일어난다.

(C). 반응 혼합물을 4℃에서 15-18시간 동안 뒤섞었다.

(D). 배합체를 인산염 완충 염류에서 평형시킨 세파크릴 -300에서 겔 투과 크로마토그래피에 의하여 정제하여 미반응 단백질 및 140,000달톤 이하의 분자 크기를 갖는 물질을 제거하였다.(출발 다당류가 너무 작은 경우 이 방법에서 유리 단백질로 부터 배합제를 분리할 수 없게 된다.)

(E). 상기 정제된 배합체의 시료를 본 실시예에서 하술한 화학분석용으로 제거하였다.

(F). 티메로살을 정제된 배합체에 가한 다음(농도 : 1 : 10,000), 생성물을 분석할 때 까지 4℃에서 저장하였다.

(G). 생성물을 0.2 미크론 멸균여과하였다.(다당류가 실시예 1(D)에 기술한 바와 같은 크기로 되지 않는 경우, 즉 다당류가 지나치게 큰 경우, 얻어진 배합체는 여과할 수 없게 된다.)

분석

실시예 4의 용적 농축물에 대하여 수행한 시험결과는 다음과 같았다.

(a). 리보스 함량 : 156 마이크로그램/ml. (실시예 5에서 PRP값의 계산을 위하여, 2의 전환 인자가 실험적으로 측정한 리보스 농도를 기준하여 공칭 다당류 농도를 계산하는데 사용되었다.)

(b). 단백질 함량 : 330 마이크로그램/ml

(c). 리보스/단백질 비율 : 0.47(한계 0.25-1.0)

(d). 세피로스 CL-2B에 대한 크로마토그래피 분석결과 단일 피이크로서 배합체 분자의 균일한 분포를 보여주는 크로마토그래피 단면을 나타냈다.

(e). Kd(다당류) : 세파로스 CL-4B 사용시 0.36, 세파로스 CL-2B 사용시 0.77PRP에 대하여 개별 유분 리보스 분석에 의하여 측정하였다. CL-4B에 대한 0.36의 값은 댁스트란 표준에 대하여 거의 674,000의 분자크기에 해당한다.

(f). Kd(단백질) : CL-4B사용시 0.34, CL-2B사용시 0.71 단백질에 대하여 개별 유분 로우리(Lowry)분석에 의하여 측정 하였다. CL-4B에 대한 0.75-0.34의 디프테리아 엑소톡소이드의 Kd값의 변화는 원료로 부터 크로마토그래피적으로 상이한 분자를 형성하는 다당류와 단백질의 배합임을 보여주는 것이다.

(g). 유리 단백질 : 5%이하 유리 단백질은 PRP에 결합하지 않는 유도된 디프테리아캐리어 단백질을 의미한다. 이것은 총 용리된 단백질에 대하여 디프테리아 엑소톡소이드 시료의 위치에서 용리하는 단백질의 양을 비교하여 측정하였다.

(h). 내독소함량 : 1마이크로그램/ml 내독소는 LAL에 의하여 정량하였다. 엔도톡신 함량은 PRP -D의 10㎍ 리보스 인간 투여량 당 64mg에 해당한다.

(i). 발열성 : 용적 농축액은 토끼의 체중 kg에 대하여 1ℓ당 0.15㎍ 리보스의 중량 등가(인간) 투여량을 사용하는 비-발열성에 대한 미국 표준과 부합한다.

(j). 폴리아크릴 겔 전기영동(PAGE) : PAGE분석은 순도 및 다당류와 단백질 사이의 공유 결합의 지지 증거를 얻기 위하여 수행 했다. 유리 캐리어는 거의 카탈라제(60,000 MW)의 위치에서 로드(rod)겔의 중간을 지나 결합되는 반면에, PRP-D 배합체는 겔(티 로글로블린의 위치 앞, 330,000 MW)에 들어갈 수 없었다. PRP -D는 기시점에서 단일 밴드를 보여주었다.

(k). 시아노겐 브로마이드 : 시아노겐 브로마이드(CNBr)는 PRP -D 배합체 제조전에 제1단계에서 사용한 반면에, 생성물로 부터 연속 배제하였다. 여러단계의 공정은 CNBr 함량 감소에 기여하였다. 그러나, 겔 투과 크로마토그래피에 왁진의 최종 정제는 100,000 MW 아하로 오염 물질을 제거한다. 이 정제는 유리 CNBr의 잔존 미량물질 또는 그의 감성 생성물의 오염을 배제한다.

(1). 열 안정성 : PRP-D 배합체 왁진의 열저항에 대한 조사를 행하였다. 용적 물질을 40배 농축시킨 다음 3ml 시료 3개를 취하였다. 제1의 시료는 16시간 동안 4℃의 수욕에서 방치하고, 제3의 시료는 30분 동안 100℃ 수욕에서 가열하였다. 수행된 시험은 단백질과 리보스 함량, 세파로스 CL-4B로의 겔 투과 크로마토그래피, 및 SDS-다당류 겔 전기영동(PAGE)에 대한 것이었다.

그 결과는 상기 시험(a) 및 (b)의 결과와 비교하여 시료사이에 리보스 또는 단백질 함량의 상당한 변화가 나타나지 않음을 보여주었다. 크로마토그래피 분석결과 조건이 점점 가혹해 졌을 때 배합체 물질의 분자 크기에 적은 감소가 나타났다.

그러나 245mm 흡수 측정에 의하여 이들 시료의 유분 분석시, 다당류 피이크와 일치하는 하나의 피이크 만이 상기 물질에 유지되었으며, 유리 단백질 피이크는 나타나지 않았다.

따라서 그결과를 상기(d) 및 (g)의 결과와 비교할 수 있었다. 이것은 단백질과 다당류 사이의 결합이 파괴되지 않았으나 분자 크기의 감소가 선상 다당류내의 결합의 파괴에 기인하였음을 증명하는 것이다.

또한 이것은 이들 시료의 PAGE 분석을 상기(j)에서 기술한 결과와 비교함으로서 증명되었으며, 유리 단백질은 심지어 세정제(나트륨 도데실 설페이트)의 존재하에서 어느 시료에서도 검출할 수 없었다.

이것은 유도된 단백질-다당류 결합의 공유 및 고온 처리를 통한 그의 안정성을 강력히 확인하여 주는 것이다.

[실시예 5]

PRP -D 면역성 시험

이 실험은 캐리어 종속상태, 캐리어 특성, 부우스터 효과, 및 Ig류의 변화에 의하여 입증되는 바와 같이 T-세포 종속상태를 알기 위하여 의도한 것이였다. 이 실험은 다음의 두 부분으로 실시하였다. 즉

1). 두 주사액의 초기 주요 속발.

2). 두 주사액의 공격 속발.

물질 :

1. PRP -D 용적 농축액, 실시예 4

2. 파상풍 톡소이드(T)

3. 디프테리아 톡소이드(D)

4. 헤모필루스 인플루엔제 B 캡슐형 다당류(PRP)

5. PRP/D, 20mg PRP (10g 리보스) 및 20μg D의 혼합물.

6. PRP/D-AH, 20㎍ 단백질로 조제하였다.

방법 :

모든 면역은 보조약 없이 1m 용량으로 피하투여 하였다. PRP를 함유하는 모든 용량은 1m 용량에 대하여 10g 리보스로 조절하였다. 배합되지 않은 엑소톡소이드 용량은 1m 용량에 대하여 20μg단백질로 조절하였다.

14일 간격으로 면역을 실시하는 순환 스케주울을 사용하였다. 간 면역은 출혈 10일 후에 하였다. 모든 제제를 0.01%의 티메로살을 함유하는 인산염 완충 염류에서 희석시켰다.

분취량을 4개의 용량 바이얼(Vial)로서 제조한 다음 -20℃에서 저장하였다. 각 그룹에서 3마리의 토끼를 면역시켰다.

혈청반응 :

혈청을 고상 방사선 면역 분석(SPRIA)에 의하여 항-PRP, 항-D-AH, 항-D, 및 항-T에 대하여 분석하였다. 항체 수준은 ml당 마이크로그램 IgG 및 IgM으로서 정량하였다.

공정성적표

조사표(Schedule) :

토끼를 미리 출혈시켜 14일 마다 그룹에 따라서 면역시켰다. 각 면역은 출혈 10일 후 하였다.

첫번째 두 주사액은 1차 면역원으로 제조하였으며, 세번째와 네번째 주사액은 2차 면역원으로 제조하였다. 항-PRP 반응은 첨부 도면에 설명되어있다.

토끼의 여섯개의 실험 그룹(그룹당 세마리의 토끼)에서 헤모필루스 인플루엔재 B에 대해 IgG의 평균수준은 그래프식으로 설명되어있다.

그룹은 상기공정 성적표에 따라 첨부 도면에 분류되어있다. 사전 출혈 수준은 모든 토끼에 대하여 ml당 1㎍이하였으며 명료화를 위하여 첨부 도면에 표시하지 않았다. 개방된 막대는 1차 면역원으로 두개의 연속 주사후의 IgG의 수준을 나타낸다. 중실(中實) 막대는 1차 또는 공격 면역원으로 제3 및 제4의 주사후의 IgG 수준을 나타낸다. IgG 반응은 다만 PRP -D 배합체 왁진으로 면역한 후 나타났다. 디프테리라 톡소이드로 그룹 3의 토끼에 주입시 PRP에 대한 반응을 촉진시킨 반면에, 파상풍 톡소이드(그룹 2)를 주입시 효과가 나타나지 않았다.

[실시예 6]

T-AH의 제조 및 공유 결합 다당류-파상풍 톡소이드 배합체(PRP-T)의 형성

실시예 3의 공정에서, 시판 파상풍 톡소이드를 디프테리아 톡소이드 대신 사용하여 아디핀산 하이드라지드유도체를 제조하였다. 대표적인 T-AH 캐리어 로트의 시료의 분석은 53.9 마이트로그램 ADH/mg T를 보여주었다.

상기 시료의 크로마토그래피를 행한 결과 단백질 표준에 대하여 거의 227,000의 분자량에 해당하는 0.66의 CL-4B 세파로스의 Kd값을 보여주었다. 파상풍 톡소이드의 아디핀산 하이드라지드 유도체와 다당류 배합체는 실시예 5에 기술한 바와 같이 D-AH에 대하여 동일한 공정을 사용하여 제조하였다.

대표적인 PRP - T의 로트의 분석결과 ml당 142.6마이트로그램의 다당류 및 260 마이크로그램의 단백질을 보여주었다. 배합체는 수용성이였으며 0.2 미크론으로 여과할 수 있었다. CL-4B에 대하여 크로마토그래프한 결과 단백질 성분은 0.30의 Kd를 보여주었으며 다당류 성분은 0.37의 Kd를 보여 주었다.

[표 1]

항-PRP 반응

IgM 및 IgG에 대한 고상 방사선 면역 분석

PRP 디프테리아폭소이드 파상풍 톡소이드

* IgG 및 IgM은 혈청의 ml당 ㎍ 항체로서 나타낸 것이다.

모든 값은 평균 및 표준 오차이다.

＃ 분석의 감수성 이하의 Ig 수준은 제로(0)의 값을 부여하였다. 만약 수준이 분석 범위 이상인 경우 이것은 분석의 상한선에 대응하는 갓을 부여하였다.

% ND = 실시하지 않았음.

Claims

헤모필루스 인플루엔재B로 부터 다당류에 대하여 T-세표 종속 항체 반응을 일으킬 수 있는, 겔 투과 크로마토그래피에 의해 덱스트란 표준을 기준하여 14000,000-4,500,000 달톤의 분자크기와 0.25-1.00의 리보스/단백질 비율을 갖는 수용성 공유 결합 다당류-디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 배합체를 제조하는 방법에 있어서, (a). 거의 동량의 리보스, 리비톨 및 로스페이트로 구성되는헤모필루스 인플루엔재B의 캡슐형 다당류를 겔 투과 크로카토그래피에 의해 덱스트란 표준을 기준하여 20% 이하가 200,000 달톤 이하의 분자크기를 가지며 20% 이하가 2,000,000달톤이상의 분자크기를 가질 때까지 가열하고, (b). 얻어진 크기의 다당류를 시아노겐 브로마이드로 활성화하고, (c). 사실상 모든 미반응 시아노겐 브로마이드를 제거하고, (d). 활성화된 생성물을 4-8개의 탄소 디카복실산 하이드라지드 유도 엑소톡소이드와 반응시키는 것을 특징으로 하는 수용성 공유결합 다당류-디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 배합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 디카복실산이 아디핀산인 것을 특징으로 하는 수용성 공유결합 다당류-디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 배합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 톡소이드가 티프테리아 톡소이드인 것을 특징으로 하는 수용성 공유결합 다당류-디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 배합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 톡소이드가 파상풍 톡소이드인 것을 특징으로 하는 수용성 공유결합 다당류-디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 배합체의 제조방법.