JPS59501360A - ヘモフイルス・インフルエンザｂ多糖類外毒素トキソイド抱合体ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類外毒素トキソイド抱合体ワクチン 発明の概要 本発明は、多糖類−ジフチリア・トキソイド抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　（ Ｐ　ＲＰ　−Ｄ　）　＋７クチンオヨヒ多糖類−破傷風トキソイド抱合体（ＰＲ Ｐ−Ｔ）ワクチンで例示される新規なヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍ ｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　ｂ多糖類−外毒素トキソイド、その 製造用の多糖類ハプテンおよびそれらの製法に関する。本発明は、加熱処理によ って分子の大きさを主として２００，０００および２，０００．０００ダルトン の間に調整し、はぼ等モル量のリボース、リビトールおよびリン酸塩からなり、 ついで、活性化剤、典型的には臭化シアンで活性化した純粋なヘモフィルス・イ ンフルエンザｂ多糖類を提供する。本明細書で述べる分子の大きさはゲル・パー ミエイション・クロマトグラフィーによるデキストラン・スタンダードに準拠し ている。該活性化された多糖類を外毒素トキソイド、好ましくはジフテリア・ト キソイドと均密に混合して抱合を行なう。好ましくは、該外毒素トキソイドはス ペーサーとして４〜８個の炭素の橋を用いて、例えは、ジフテリア・トキソイド （Ｄ−ＡＨ）のアジピン酸ヒドラジド誘導体のように誘導体化される。使用でき る別の誘導体化外毒素トキソイドには破傷風トキソイド（Ｔ−ＡＨ）が包含され る。該外毒素トキソイドは複数のＡＨ年単位結合している。

この方法を用いることにより、ヘモフィルス・インフルエンザｂからの多糖数に 対するＴ−細胞依存性応答をもたらす抱合体ワクチンが得られる。

かかる抱合体は幼児および若年の子供におけるヘモフィルス感染症の予防に使用 するのにことに有益である。

本発明はまた、ジフテリアや破傷風のような病気に対する免疫付与のため番ζ有 用な抱合体ワクチンを利用できるようにする。ヒトにおけるかかる抱合体の効力 は通常のジフテリアおよび破傷風トキソイド調製物のものより大きい。過剰の活 性化剤の注意深い調節および除去により、該方法はスペーサーを介して複数の外 毒素トキソイド分子が単一の多糖類分子に結合してなる、実質的に架橋もしくは 重合誘導体を含まない多糖類抱合体を与える。その式は一般的にＰＲＰ−Ｘｎと 表わすことができ、ここに、Ｘはトキソイド部分、ｎは２０以下の整数、典型的 な平均は７〜８である。（本明細書においては、整数ｎを用いることなく、ジフ テリア・トキソイド抱合体をＰＲＰ−Ｄと、破傷風抱合体をＰＮＰ−Ｔと称する 。） 図面の簡単な説明 第１図はへモフイルス・インフルエンザｂ莢膜多糖類の抗原性、すなわち、抗− ＰＲＰ応答を示す。この棒グラフは実施例Ｖの実験計画によるデータである。

発明の開示 安定な液素性免疫の発生は少なくとも２つの別々のリンパ細胞セットによる異物 の認識を必要とする。これらのセットは抗体形成細胞の前駆体であるＢＩＪンパ 細胞およびＢ−細胞の機能を調節するＴ−リンパ細胞である。数種の多糖類を含 め、いくつかの抗原はＢ−細胞を直接刺激して抗体を生じさせることができるが （Ｔ−非依存性抗原）、大部分の抗原（Ｔ−依存性）はＴ　ＩＪンパ細胞により 、Ｂ−細胞に与えられなければならない。本発明のワクチンの場合、ワクチンの 外毒素トキソイド部分がＴ−７胞系により認識される。

該蛋白はそれ自体の抗原性決定子と、共有結合したＰＲＰハプテンの両方を有し ているので、決定子の両方のセットがＴ−細胞によりＢ−細胞に与えられなけれ ばならない。この担体−ハプテン抱合体調製物の投与の結果はＰＲＰがＴ−依存 性免疫原として与えられることとなる。ＰＲＰのＴ−依存性授与が、もつとも危 険の大きい目標集団である幼児に保護免疫を誘導する。

したがって、本発明の抱合体ワクチンは小さな幼児において特に価値あるもので ある。かかる抱合体の女性への投与は、ワクチン抗原に対する高い割合のＩｇＧ 抗体を誘導し、これは妊娠の間に胎盤関門を通り、かくして、幼児に誕生から保 護を与える。

Ｔ−非依存性抗原はＢ−細胞を誘導して最終的に抗体分泌細胞（形質法）に分化 させ、一方、Ｔ−依存性応答は相当に、より複雑である。Ｔ−依存性刺激を受け た後、Ｂ−細胞群は抗体形成のみならず、増殖および熟成をも開始する。その結 果、ＰＲＰに対する抗体生成り一細胞数の増加と、ＰＲＰに対する第２回目の暴 露に応答できるＢ−細胞数の増加をもたらせる。くり返し免疫付与はさらにＰＲ Ｐ特異性Ｂ−細胞数の増加、したがって、高い抗体力価、増強応答をもたらせる 。要約すると、Ｔ−非依存性応答は感応性Ｂ−細胞の数によって制限されるが、 Ｔ−依存性応答は抗原感応性細胞の合計数の増加をもたらす。

本発明のＰＲＰ−外毒素トキソイド・ワクチンは実験動物においてＴ−依存性免 疫原として機能することが証明されている。ＰＲＰ　−Ｄの標準的投与で連続的 に免疫付与された一群のウサギは全て増強応答を示した。加えて、該抱合体に用 いた担体蛋白、例えは、ＰＲＰ−Ｄ用のジフテリア・トキソイドでの一次免疫付 与は、ＰＲＰ−外毒素トキソイド抱合体のＰＲＰ成分に対する最初の応答を増大 させることが示された。同様なＰＲＰ応答の増大は、抱合体に用いた以外の外毒 素トキソイドで初回免疫刺激を受けた動物では見られなかった。

本発明のワクチンはＰＲＰ−外毒素トキソイド・ハプテン−担体抱合体である。

かかるワクチンにおいては、該抗原性、かつ、弱い免疫原性のノλブテン分子（ ＰＲＰ　）がジフテリア（Ｄ）または破傷風トキソイド（Ｔ）のような高い免疫 原性担体分子（こ対する新規な抗原特異性を与える。

該調製物における担体として用いる精製ジフテリア・トキソイド（Ｄ）は、水溶 性カルボジイミド縮合法を用いて、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）のような ４〜８個の炭素のスペーサー分子の結合により修飾（誘導体化）された商業的外 毒素トキソイドである。

該修飾外毒素トキソイド、典型的にはアジピン酸ヒドラジド誘導体Ｘ−ＡＨは、 ついで、未反応のＡＤＨから分離される。これは可溶性物質で、実質的に架橋さ れておらず、このことはゲルクロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル 電気泳動によって測定されるような分子の大きさに実質的な増加がないことによ って証明される。

ヘモフィルス・インフルエンｆｂの莢膜外糖類ハ、認可された多糖類ワクチンに 用いられているような商業的す源から調製され、コンノート・ラボラドリース（ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手できる。しかし、該 多糖類は通常、カルシウム塩として精製されて、いるが、カルシウムイオンの使 用はさける。なぜなら、それらは抱合操作における炭酸塩緩衝剤の使用を妨害す るからである。ついで、該ハプテンに所望の寸法が得られるまで加熱することに より、該多糖類の分子の大きさを調整する。典型的には、該液体多糖類の１００ ℃における１５分間の加熱が、分子の２０％未満が２００．０００ダルトンより 小さい分子の大きさで、２０チ未満か２，０００，０００ダルトンより大きい分 子の大きさであることを保証するために充分である。この大きさ規制操作は適正 なＰＲＰ−ＤまたはＰＲＰ−Ｔ抱合体を得るために重要である。

かくして得られた、大きさを規制した多糖類を、ハロゲン化シアンまたは水素化 ホウ素ナトリウムのような該多糖類上に親電子基を生じさせる活性化剤で活性化 する。用いる典型的な活性化剤は臭化シアンである。

未反応の活性化剤は徹底的に除去する。なぜなら、実質的な残留かあると、それ が以後の反応混合物中で該蛋白の架橋を生じるからである。生じた架橋生成物は 多糖類をトラップし、ワクチンの収率を低下させ、本発明で得られる抱合体と化 学的性質および溶解度の異なる、分子の大きさのより大きい抱合体および本発明 のワクチンの所望の比率を欠くワクチンを生じさせる。

ついで、活性化したＰＲＰおよびＸ−ＡＨを合し、冷所で反応させる。該誘導体 化した外毒素トキソイド上のヒドラジド基のいくつかがＰＮＰ上の活性化部位と 反応し、共有結合を形成する。生成物は４〜８個の炭素の橋を介して誘導体化外 毒素トキソイドに共有結合したＰＮＰである。この反応生成物を、ゲル・パーミ エイション・クロマトグラフィーでいずれもの未反応蛋白および分子の大きさの 小さい混入物を除去して精製する。主要フラクションの典型的な分子の大きさは デキストラン・スタンダードに準拠して６７５，０００ダルトンである。相対的 な分子の大きさについての典型的な範囲は１４０，０００ダルトン〜４，５００ ，０００ダルトンである。

チメロサールのような保存剤を、チメロサールの場合、１：１０，０００の最終 濃度で加える。バルク濃縮物を０．２ミクロンのメンプラン・フィルター１１し て濾過し、冷所て保存する。

該ＰＲＰ−外毒素トキソイド抱合体生成物は耐熱性で水溶性である。架橋のない ことは、ゲル・パーミエイション・クロマトグラフィーにより、また、ポリアク リルアミドゲル電気泳動により測定されるごとく、分子の大きさに出発多糖類の それからの実質的な増加がないことにより証明される。熱安定性が長い製品寿命 および、たとえ望ましくない環境中でも安定な製品を保証する。

該反応は２工程として図式的に表わすことができる。

（１１Ｐ　ＲＰ　十ＣＮ　Ｂ　ｒ　−Ｐ　ＲＰ　”（２１Ｐ　ＲＰ”十ｎ　Ｘ　 −一→　ＰＲＰ（−Ｘ）ｎもし、該ハロゲン化シアンの除去が効率的に行なわれ なければ、活性化ＰＲＰと外毒素トキソイドの抱合でＰＲＰ（−Ｘ）ｎが形成す ルホかＥ、ｘ−ｘまタハ重複して結合した誘導体の形成、例えば、のような望ま しくない反応が起る。

皮下または筋注についてのＰＲＰ−外毒素トキソイド抱合体ワクチンの典型的な ヒトへの投与量はリボース１０μｇもしくは該抱合体生成物のほぼ４０μｇ相当 を含有する０、５−からなる。アンプル溶液は、保存剤としてチメロサールを用 い、該バルク濃縮物をリン酸塩緩衝食塩溶液で稀釈することにより調製される。

該生成物はヒトにおいて、該ＰＲＰおよび外毒素トキソイド成分の両方に対する 抗体形成を誘導する。

本発明をさらに詳細に説明するためにつぎの実施例を提供する。これらは本発明 をその精神または範囲において限定するものと理解されるべきものではない。

実施例Ｉ　ＰＲＰの調製 Ａ、生物 ヘモフィルス・インフルエンザｂの莢膜ポリリポノル・リビトール・リン酸塩（ ＰＮＰ）をそのイーガン（Ｅａｇａｎ）株から調製し１こ。培養菌をくり返し移 植し、凍結乾燥種菌を調製した。この凍結乾燥種菌がら、さらに１回移植を行な い湿潤作業用種菌を調製した（−６０℃で保存）。該湿潤作業用種菌から菌体の 醗酵器ロフトを調製した。

培養純度をっぎの基準によって判定する。

１、陰性ダラム染色特性 ２、ＮＡＤ（ジホスホピリジン・ヌクレオチド）およびヘミン（フェリヘムのウ ソ型夏結晶塩）含有寒天上で増殖、 ３、ＮＡＤまたはヘミン不含寒天上で増殖せず、および ４、特異抗血ｆｆｒ　（ｂ　ｆｆｌへモフィルス・インフルエンザｂ１ヘイラン ド・ラボラドリース（ＨｙｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）　ｌコヨ り凝集。

Ｂ、培養および培地 １１ 細菌を継代培養するため、すなわち、醗酵器の接種ζこ先立って、ＢＨＩ寒天（ １１！当り、３７ｐＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ　）、１５ｇバクト寒天（Ｄｉｆｃｏ） 、０．６−の１チＮ　Ａ　Ｄ　（Ｓｉｇｍａ　−Ｇｒａｄｅ　Ｉｎ　）　および ６−の０．２％ヘミ７　（Ｓｉｇｍａ　−Ｂｏｖｉｎｅ　Ｔｙｐｅ　１　）　） を用いた。寒天表面から洗い出した菌体（２０時間）を用いてヘモフィルス・イ ンフルエンザｂ　（Ｈｉｂ）　液体培地（１１！づつ）に接種する。これらの培 養物を盛とうしながら、該細菌がその増殖サイクルの対数期に達するまでインキ ュベートする。この時点で、培養物２Ｉ！を用いて醗酵器中の液体Ｈｉｂ培地４ ０Ｉ！薔こ接種し、８％ＵＣＯＮ　（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ潤滑剤）３０ ０ｒｎｌを加える。１６−１８時間後、醗酵器培養物は収集できるようになる。

Ｈｉｂ液体培地１０００−当りの組成は、酵母エキス透析物　５．０ｇ カサミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）　２２．５　ｇ二塩基性リン酸ナトリウム　１４．４ ９デキストロース　５．５９ｇ ヘミン　２０９ 水酸化アンモニウム（３０％）　０．１５３４ｒｎｌＮＡＤ　１％　０．６　ｒ ｎｌ 特表顯５９−５０１３６０　（５） である。

醗酵器の収集時、充当するダラム染色および培養法（前記Ａ１〜４参照）により 培養純度を測定する。培養物にカタブロン（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ ニウム）を最終濃度０．１％まで加える。３０分後、この時点で細菌はすでに不 活化され、固形相を遠心分離により集める。該湿潤ペーストをさらに加工するま で一７０℃で保存する。

Ｃ０多糖類の精製 つぎの方法を用い、ＰＲＰの抽出およびそれに続く精製を行なう。

１、洗浄剤からの解離 ペーストの湿潤重量１ｇにつき、０．４　Ｍ　ＮａＣ１１０−を加える。この懸 濁液を市販のブレングー中で３０秒間混合する。混合液を冷所（４℃）で１７， ０ＯＯＸｆにて１５分間遠心分離する。上澄液を集め、エタノールを濃度２５％ まで加える。ついで、この物質を、１７．０００Ｘｇ（４℃）で２時間遠心分離 し、上澄液をたくわえる。上澄液の４倍の容量のエタノールを加え、この物質番 −夜４℃に保持する。

２、核酸の除去 該物質を２，８００ｘｇ（４℃）で５分間遠心分離する。沈澱を集め、ペースト 抽出に最初に用いた容量の１／４てトリス−Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４緩衝液に再懸濁す る。蒸留水１１当りの該トリス緩衝液の組成はつぎのとおりである。

トリス−ヒドロキシメチルアミノ− メタン（Ｓｉｇｍａ）　６ｆ／ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０２４６■ チメｏサ−Ｊｌ／（Ｅｌａｎｃｏ　）　５０ｍ９ｐＨを濃塩酸で７０±０．２に 調整する。

最初の湿潤ペースト１００ｇ当り、デオキシリボヌクレアーゼｌ　１，５ｍｙ　 （Ｓｉｇｍａ　Ｄ−０８７６）およびリボヌクレアーゼ−Ａ　０．７５　’ｉ’ 　（Ｓｉｇｍａ　−ＴＹＰｅｌ−Ａｓ　、Ｒ−５５０３）を加える。この物質を 透析バッグに入れ、対トリスＭ　ｇ　Ｓ　０４緩衝液１８ｊ？で、３７℃で１８ 時間インキュベートする。

３、蛋白の除去 蛋白成分を除去するため、等容量のフェノール−酢酸塩溶液（フェノール４５４ ｇと合した１０％（Ｗ／Ｖ）酢酸ナトリウム１３５ｉ）の添加により、該物質℃ ）振とうし、１７，０００Ｘｆて１５分間遠心分離し、水性相を集める。さらに ２回フェノール抽出を行ない、最後の水性相を蒸留水に対して透析する。

この段階の物質がバルク液体莢膜多糖類（ＰＲＰ）を構成し、さらに加工（以下 のＤ参照）するまで−２０℃に保存する。

４、多糖類の品質の評価 バルクＰＲＰの品質は分取した液体試料の分析に基いて判定される。エタノール （４容）、ついで、Ｃａ　Ｃｌ　２　（最終濃度０．０２Ｍ）を加え、ＰＲＰを 沈澱させる。ＰＲＰを遠心分離により沈澱させ、真空下、デシケータで乾燥させ る。熱重量分析（ＴＧＡ　）を用いて水分含量を測定する。その後の分析は乾燥 重量基準で算出する。

許容される基準には、 （ａ）リボースの分析（オルシノール法）＝３０％以上、（ｂ）蛋白の分析（ロ ーリ−法）二１チより小、（Ｃ）核酸の分析（Ｕ、Ｖ、吸収）：１％より小、お よび（ｄ）特異免疫血清による沈降（反対免疫電気泳動法）が包含される。

加えて、分子の大きさを適当なゲル・パーミエイシ１５ ヨン・クロマトグラフィーで測定する。該多糖類をリムラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ） 溶解質テストおよびウサギ発熱原性テストにより内毒素について監視する。

典型的なロットはつぎの特性を有する。

（ａ）蛋白含量０．５％ （ｂ）核酸含量０３５％ （Ｃ）残余ウシ抗原ニラジオイムノアッセイ（こよす測定した場合、精製ＰＲＰ の該多糖類調製に用いたウシＲＮＡアーゼおよびＤＮＡアーゼによる汚染なし。

（ｄ）内毒素含量はリムラス・アメーバ様細胞−溶解質分析（ＬＡＬ）により測 定した：２００ｎＶ■ＰＲＰ （ｅ）　ＣＬ　−４Ｂ　セファロース上のＫｄ　：　０．３０゜０．３０の値は デキストラン・スタンダード（こ準拠して概略分子量Ｌｌ　２５，０００ｆこ対 応する。

Ｄ、多糖類（ＰＲＰ）試薬の調製 該多糖類はこのように液体として精製されるが、精製操作においてカルシウムは 使用しない。（従来の多糖類の精製はカルシウム塩を生じるが、カルシウムは以 下の抱合の間（こ用いる炭酸塩緩衝剤と結合でき、沈特表昭５９−５０１３ＧＯ （６）　Ａ 澱を生じる。） 該多糖類の大きさを、必要とする大きさの変化の程度に見合った時間、１００℃ で加熱することにより調整する。該多糖類の大きさは、空隙容量で２０％禾満か ＣＬ−４Ｂセフアロース・カラムから溶出し、２０チ未満か０．５より大きいＫ ｄて溶出するように調整する。

主要フラクションは２００，０００〜２，０００，０００ダルトンの分子の大き さを有する。

実施例ＩＩ　ＰＲＰの活性化 Ａ、この多糖類を、マグネチック・スターテを備えた反応容器中、水浴上で４℃ に冷却する。蒸留水中、２５キ／ｍｔ　（２０〜３０■／−の範囲）の濃度のＰ ＲＰの最初の容量を記録する。ついで、塩化ナトリウムを０．８５％の濃度まで 加える。

Ｂ、得られた該多糖類の塩化ナトリウムの溶液のｐＨを、ＩＮ水酸化ナトリウム の添加により１０．５〜１１．０に上昇させる。（より低いｐＨでは臭化シアン との反応が少なく、より高いｐＨては該多糖類か分解するので、この範囲を選択 する。

Ｃ８乾燥臭化シアンをｐＨ１０，５〜１１．０の０．００５　Ｎ重炭酸ナトリウ ム緩衝液に溶解し、直ちに（調製後、１０分以内）、０．４■／ｍｇＰＲＰの割 合で反応容器に加える。

Ｄ、混合液のｐＨを、水酸化すｌ−ＩＪウムの添加１こよりｐＨ１０，５〜１１ ．０に調整し、６分間維持する。

Ｅ、ついて、ＩＮＨｃ／てｐＨを６．０１こ下げる。（酸性ｐＨは臭化シアンに よって該多糖類上に生じさせた活性化部位を安定化させる。さらにｐＨの低下は ＰＲＰの加水分解をもたらせる。） ００等容量の、ｐＨ６，０の予め４℃に冷却した食塩水を加える。

Ｈ０該臭化ンアンー多多糖類台物を濃縮装置に移し、工程Ａで記録した最初の容 量まで濃縮する。

■、工程ＧおよびＨを合計１０回くり返す。かくして該多糖類濃度を２５ｍ’ｊ ／−に保持しなから、未消費の臭化シアンの約９９．９％を除去する。もし、臭 化シアンが除去されなければ、それは以下で使用するシフテリ゛ア外毒素トキソ イドと反応する。

実施例ｆｆ１Ｄ−ＡＨ指担体調製 Ａ、蒸留水中、商業的なジフテリア外毒素トキソイド（’Ｄ　）を、陽圧で撹拌 した濃縮器中、１０．０００ダルトン以上の分子を保持する膜上で２０〜４０■ ／ｍｔ、典型的には、３５キ／−に濃縮する。

Ｂ、アジピン酸ジヒドラジド（Ａ　Ｄ　Ｈ）　Ｂ　ｍｙ　／　ｒｑ蛋白および１ −エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）／ ’？ｉ白の乾燥混合物を効率的なスターテおよびｐＨの監視、制御の可能なｐＨ 探針を備えた反応容器に入れる。

Ｃ０ついて、ジフテリア外毒素トキソイドを反応容器に加え、反応体の割合をつ ぎのようにする。

ジフテリア外毒素トキソイド−３５ｍ９蛋白／−ＡＤＨ＝８．０ｍｆｌ／’？蛋 白 ＥＤＡＣ＝０．７５ｍ９７ｍｆｌ蛋白 （ＡＤＨおよびＥＤＡＣの順次添加の上、酢酸塩緩衝剤の使用は持続性の柔毛状 沈澱をもたらす。反応体はそれら自体で充分な緩衝能を有している。）Ｄ、ｐＨ を直ちに４．７に調整し、４．７±０．２に少なくとも２時間維持する。

１、化学反応の過程はｐＨ調節器のレコーダにより追跡できる。要すれは、該反 応は、ｐＨが少なくとも１５分間安定するまで、２時間以上続けることができる （すなわち、ｐＨ調節のためのＨ（、ｌ！添加なしに１５分間）。

２、消費したＨＣｌ！　の量を工程チェックとして記録する。

３、反応容器中の温度変化も監視する。

Ｅ０反応生成物を４℃にて、２回交換の最少１００容量の食塩水に対して、交換 ことに８時間透析する。

Ｆ、ついで、■程Ｅと同様な最少容世、時間および温度で２回交換のリン酸塩緩 衝食塩水（こ対して透析する。

Ｇ、生成物（Ｄ−ＡＨ）を陽圧装置および１０，０００分子量膜で２５ｍ９／− 蛋白に濃縮する。

Ｈｌこの濃縮物を滅菌濾過（０，２μ）し、４℃に保存する。

かかるＤ−ＡＨ指担体典型的ロフトの試料の分析は３８．３μｆ／ＡＤＨ／ＩＩ ｑＤＴの比率を示した。その試料のクロマトクラフィーはＣＬ−４Ｂセフアロー ス上のＫｄ　値０．７５を示した。これは蛋白スタンダードに準拠して概略分子 量１３９，０００に相当する。

実施例■　共有多糖類−ジフテリア・トキソイド抱合体（ＰＲＰ−Ｄ）の形成 Ａ、濃度２５ｍｇ／ｍｌの実施例■のジフテリア・トキソイド・アジピン酸ヒド ラジド担体（Ｄ　−Ａ　Ｈ）を、重炭酸ナトリウムで濃度０．５Ｍまで処理し、 ｐＨを８．５に調整する。（著しく低い塩濃度は、活性化多糖類を含有する最終 反応混合液中でゲル形成を起させる。）Ｂ、密封することのできる反応容器中に 、実施例■で得た洗浄ＰＲＰ溶液の等量を入れる。ｐＨは８．４〜８，６で安定 てなければならない。（もし、ＣＮ　Ｂ　ｒが除去されていなければ、ｐＨは急 速（こ低下し、多量の沈澱か形成する。この反応はたとえ、多糖類が存在しなく ても起る。結合による反応体の物理的外観には著しい変化かあってはならない。

） Ｃ６反応混合液を４℃で１５〜１８時間混転させる。

Ｄ、該抱合体を、リン酸塩緩衝食塩水中で平衡させたセファクリル−３００上で ゲル・パーミエイション・クロマトグラフィーによって精製し、未反応蛋白およ び分子の大きさ１４０，０００ダルトン未満の物質を除去する。（もし、出発多 糖類が少なすぎると、この方法で遊離蛋白から該抱合体を分離することはできな い。）Ｅ、精製した抱合体試料を、本実施例の以下の部分に記載する化学分析用 に分取する。

Ｆ、該精製抱合体に濃度１：１０．ＯＯＯまてチメロサールを加え、生成物を分 析まで４℃に保存する。

Ｇ、該生成物を０．２μ滅菌許過する。（もし、該多糖類か実施例Ｉ（ＤＪに記 載したような大きさに規制されていないと、すなわち、それが大きすぎると、得 られた抱合体は濾過できない。） 分析 実施例■のバルク濃縮物について行なったテストはつぎの結果を与えた。

ａ）リボース含量：１５６．５μｇ／、１（実施例ＶにおけるＰＲＰ値の計算に ついて、実験でめたリボース濃度に基く名目上の多糖類濃度を算出するために変 換係数２を用いる。）ｂ）蛋白含量＝３３０μｆ／／− Ｃ）リボース／蛋白比：０．４７（限界０２５〜１．０）ｄ）セファロースＣＬ −２Ｂ上でのクロマトグラフ分析は、単一ピークとして抱合体分子の均質な分布 を示すクロマトグラフの特色を示した。

ｅ）Ｋｄ（多糖類）：セファｏ　−スＣＬ　−４Ｂを用いて０．３６、ＣＬ−２ Ｂを用いて０．７７ＰＲＰについての各フラクションのリボース分析で測定した 。ＣＬ−４Ｂ上での０．３６の値はデキストラン°スタンダードに準拠して概略 分子の大きさ６７４．０００に相当する。

ｆ）Ｋｄ（ｉ白）　：ＣＬ−４Ｂヲ用いて０．３４、ＣＬ−２Ｂを用いて０．７ １ 蛋白についての各フラクションのローリ−分析によって測定した。ＣＬ−４Ｂ上 、ジフテリア外毒素トキソイドのＫｄ値の０７５から０．３４への変化は蛋白の 多糖類との抱合がクロマトグラフィー的にいずれもの原料からも異なった物質を 形成することを示す。

Ｖ遊離蛋白：５％未満 遊離蛋白はＰＲＰに結合しなかった誘導体化ジフテリア担体蛋白を意味する。こ れは、ジフテリア外毒素トキソイド試料の位置に溶出する蛋白の量を全溶出蛋白 に対比させることによって測定される。

ｈ）内毒素含量＝１μｆ／、１ 内毒素はリムラス・アメーバ様細胞−溶解質分析（ＬＡＬ）によって定量化した 。該内毒素含量はＰＮＰ−Ｄのヒト投与量１０μｇリボース当り、６４　ｎｆに 相当する。

ｉ）発熱原性： バルク濃縮物は、０．１５μｇリボース／　ｍｔ　／　ＫＳＩウサギ体重の体重 等価（ヒト）投与量を用いる非発熱原性についての米国基準に適合する。

ｊ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥル純度および多糖類と蛋白の間 の共有結合を支持する証拠を得るためにＰＡＣ，Ｅ分析を行なった。遊離担体は 柱状ゲル中の丁度半分、はぼカタラーゼ（分子量６０．０００）の位置にバンド を形成するが、該ＰＮＰ−〇抱合体はゲルに入ることができなかった（分子量３ ３０．０００のチログロブリンの位置の前）。ＰＲＰ−Ｄは原点のところで単一 の／＜ンドを示した。

ｋ）臭化シアン： ＰＮＰ−Ｄ抱合体調製前、第１工程で臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いるが、それ はその後、生成物から排除される。製法のいくつかの工程が（ＮＢｒ含量の減少 に寄与している。しかし、ゲル・）寸−ミエイジョン・クロマトグラフィーによ るワクチンの最終的精製が分子量１００，０００以下のいずれの汚染物をも除去 する。この精製が残った痕跡の遊離ＣＮ　Ｂ　ｒまたｆｌその分解生成物による 汚染を排除する。

り熱安定性： ＰＲＰ−Ｄ抱合体ワクチンの耐熱性につ０ての検討を行なった。該バルク物質を ４０倍に濃縮し、３−の試料３つを採取した。第１の試料を４℃の水浴で１６時 間保持し、第３の試料を１００℃の水浴中で３０分間加熱する。行なったテスト は蛋白およびリボース含量、セファロースＣＬ−４Ｂによるゲル・パーミエイシ ョン・クロマトグラフィーおよび５ＤＳ−多糖類ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）につ いててあった。

その結果は、前記のテスト（ａ）および（ｂ）における結果を比較して、リボー スまたは蛋白含量について試料間に何ら著しい変化がないことを示した。クロマ トグラフ分析は、条件がより厳しくなるにつれて、抱合体物質の分子の大きさが 少し減少することを示した。しかし、２５４　ｎｍでの吸収測定によるこれらの 試料の分別分所では、該物質は多糖類ピークに一致するただ１つのピークを維持 し、遊離蛋白ピークは全く現れず、この結果は前記の（ｄ）および（ｇ）の結果 に匹敵する。これは、蛋白と多糖類の間の結合は切断されないが、分子の大きさ の減少が鎖状多糖類の中の結合の切断によるもの゛であったことを示している。

これはさらに、これらの試料のＰＡＧＥ分析を前記（ｊ）に記載した結果と比較 することにより、たとえ洗浄剤（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下でも、いず れもの試料において遊離蛋白が検知できなかったことを示している。このことは 、誘導体化蛋白−多糖類共有結合および高温処理を通じてのその安定性を強く肯 定している。

実施例ＶＰＲＰ−Ｄ免疫原性テスト この実験は、担体依存性、担体特異性、増強効果およびＩｇクラスの変化によっ て証明されるようなＴ−細胞依存性を示すために設計された。この実験は２つの 部分＝１）一連の２回の注射による初回免疫刺激、２）　一連の２回の注射によ る攻撃、で行なった。

材料： １、ＰＲＰ−Ｄバルク濃縮物、実施例■２、破傷風トキソイド（Ｔ） ３、ジフテリア・トキソイド（Ｄ） ４、ヘモフィルス・インフルエンザｂ莢膜多糖類（ＰＲＰ　） ５、ＰＲＰ／Ｄ１２０μｇＰＲＰ（１０μｇリポース）および２０μｇＤ混合物 ６、ＰＲＰ／Ｄ−ＡＨ１２０μｇｐＲＰ（１０μｇリボース）および２０μ（ｊ Ｄ−ＡＨ混合物方法： 全ての免疫付与はアジュノくントなしに１ｒｎｌの容量で皮下投与した。ＰＲＰ を含有する全ての投与は１ｍ１．投与当り、リボース１０μｇに調整した。非抱 合外毒素トキソイド投与は１ｒｎ１．投与当り２０μｇ蛋白に調整した。免疫付 与には１４日日間下遅延する計画を用（また。

各免疫付与１０日後援血した。全調製物は０．０１％チメロサールを含有するリ ン酸塩緩衝食塩水中で稀釈した。各投与分を４つの投与〕くイアルとして調製し 、−２０℃で貯蔵した。各群においては３匹のウサギに免疫付与した。

血清学： 以下に示すように、抗−ＰＲＰ、抗−Ｄ−ＡＨ１抗−Ｄおよび抗−Ｔにつし）で 、血清を固相ラジオイムノアッセイ（５ＰＲＩＡ、）で分析した。抗体レベルは １４当りのＩｇＧおよびＩｇＭのマイクログラム数として定量化した。

実験計画： 群　−次　二次　血　清 ＰＲＰ　ＤＴ−ＡＨＤＴ　ＴＴ Ｉ　ＰＲＰ　ＰＲＰ　十 ２　Ｔ　ＰＲＰ−Ｄ　十　十　十　十 ３　Ｄ　ＰＲＰ−Ｄ　＋　十　−Ｆ　十４　ＰＲＰ／Ｄ　ＰＲＰ／Ｄ　＋　士 ５　ＰＲＰ／Ｄ−ＡＨＰＲＰ、４）−ＡＨ十　＋６　ＰＲＰ−Ｄ　ＰＲＰ−Ｄ　 ＋　士　士計画： ウサギを前採血し、各群、１４日ことに免疫付与した。各免疫付与１０日後に後 採血した。最初の２回の注射は一次免疫原で行ない、一方、第３および第４の注 射は二次免疫原で行なった。

抗−ＰＲＰ応答を第１図に示す。ウサギの６実験群（１群当り３匹）におけるヘ モフィルス・インフルエンザｂ莢膜多糖類に対するＩｇＧ抗体の平均レベルをグ ラフ的に表わしである。前記の実験計画に従って、各群をこの図上に表示しであ る。全てのウサギについて、前採血レベルは１μｆ／、、４未満であり、明確化 のため、この図には示しでいない。

塗りつぶしていない棒は一次免疫原による一連の２回の注射後のＩｇＧのレベル を表わしている。塗りつぶした棒は二次または攻撃免疫原による第３および第４ の注射後のＩｇＧレベルを示す。

ＩｇＧ応答はＰＲＰ−Ｄ抱合体ワクチンによる免疫付与後にのみ観察された。ジ フテリア・トキソイドで初回免疫刺激した群３のウサギはＰＲＰ−Ｄに対する応 答を促進したが、破傷風トキソイドの初回免疫刺激（群２）は効果がなかった。

破傷風トキソイド 実施例ＶＩＴ−ＡＨ担体の調製および共有結合の形成 多糖類−破傷風トキソイド抱合体（ＰＲＰ−Ｔ）実施例■の操作において、ジフ テリア・トキソイドの代シに商業的破傷風トキソイドを用いてそのアジピン酸ヒ ドラジド誘導体を製造する。

Ｔ−ＡＨ担体の典型的ロフトの試料の分析は５３．９μｇＡＤＨ／１ｎ９Ｔ　の 比を示した。この試料のクロマトグラフィーはＣＬ−４ＢセフアロースのＫｄ値 ０．６６を示した。これは蛋白スタンダードに準拠して概略分子量２２７．００ ０１こ対応する。

９ 実施例ＩＶに記載したＤ−ＡＨについての操作と同様な操作を用いて多糖類と、 破傷風トキソイドのアジピン酸ヒドラジド誘導体との抱合体を形成させる。

ＰＲＰ−Ｔの典型的なロットの分析は１４当り多糖類１４２６μｆおよび蛋白２ ６０μｆを示した。抱合体は可溶性で、０．２μフイルターで濾過できるもので あった。ＣＬ−４Ｂ上でクロマトグラフィーｌこ付した場合、該蛋白成分はｘｄ ｏ、３０、該多糖類成分はＫｄ　Ｏ，３７を示した。

第　１　表 抗−ＰＲＰ応答 ガμ札Ｕ已矛用２鮫二再財Ｖ！オ血船ワ７ｊニー後１８：鼎　Ｏ 後２０：１９０ 後３０　０ 後４０　０ 群！□前　０　００　０　８：財　Ｏ 後１００００　孔：１ｏ（兄：入。

後２００００１堵、ｏｏ　財：８８ 後３１藷　罷：Ｊ５０　０．　１１．ｉ・００、牙：９８後４７９ｊ↓３　’　 Ｍ１８了　０　０　１≧支８２　瞳氾前　８：８．０　°　Ｉｚ：厄　？：り。

　□預：詣後１８・イ、ｏ　ｏ　ｏ　ｙ：Ｈ９゜ 後”　０４ｉ：Ｌ　８：！！　０８：ｇ！　Ｏ後３１！、ｔ　１ｉ８ｆｆｉ８１ ８Ｗ　Ｏ８’ａ’！、　０、　後４伝：テ３８？：徨免：％　Ｏｈ：閉　Ｏ群Ａ −前　ｏ　ｏ　ｏ　ｐ２：尼　ＮＤ後１　０　ｈ９：８２ｇ：８Ｋ　’４９：’ １１後２０　０　マｇ：＆４Ｗｔ：孔 後３００２１３・ＯＯ（’ｌ：８ａ 後４０　０　囲９ｊ究　Ｏ 第１表（つづき） 後１０　０ 後２０　０ 後３０　０ 後４０　０ 群互前　０　０　０　０ 後１９：鉛１肘：♀００ 後２　ｉｊ：９３１８ｉ５・００？：形　０後３竪８．１８ｆｌ・００１：看　 Ｏ 後４ら９：９７９．！、・２０　ｇ：９５　０来１ｇＧおよびＩｇＭは血清１ｒ ｎｌ当りの抗体μｇ　として表示。全ての値は平均と標準誤差である。

来季　分析感度の以下のＩｇ　レベルには０の値を与えた。

分析範囲より高いレベルの場合、それには分析の上限に等しい値を与えた。

辛帯棄ＮＤ＝実施せず。

群１　群２　群３　群４　群５　群６ 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘモフィルス・インフルエンザｂからの多糖類に対するＴ−細胞依存性抗体 応答を生じさせることができ、ゲル・パーミエイション・クロマトグラフィーに よるデキストラン・スタンダードに準拠した分子の大きさが１４０，０００ダル トン以上、４，５００，０００ダルトン以下、リボース／蛋白比が０．２５と１ ．００の間であり、実質的にハロゲン化シアンを含まない溶液中、４〜８個の炭 素のジカルボン酸およびヒドラジドで誘導体化されたジフテリアまたは破傷風ト キソイドと、はぼ等モル量のリボース、リビトールおよびリン酸塩からなり、予 め、多糖類の６０％以上が、ゲル・パーミエインヨン・クロマトグラフィーによ るデキストラン・スタンダード真こ準拠した分子の大きさが２００，０００およ び２，０００，０００ダルトンの間に調整されるまで加熱して大きさを調整され ているハロゲン化シアン活性化莢膜ヘモフィルス・、インフルエンザｂ多糖類と 混合することにより調製された水溶性、耐熱性、共有多糖類−ジフテリアまたは 破傷風トキソイド抱合体。 ２、該ジカルボン酸かアジピン酸である前記第１項の抱合体。 ３、該トキソイドがジフテリア・トキソイドである前記第１項の抱合体。 ４、該トキソイドが破傷風トキソイドである前記第１項の抱合体。 ５、該ハロゲン化物が臭化物である前記第１項の抱合体。 ６、　（ａ）はぼ等モル量のリボース、リビトールおよびリン酸塩カラなるヘモ フィルス・インフルエンｆｂの莢膜多糖類を、ゲル・パーミエイション・クロマ トグラフィーによるデキストラン・スタンダードに準拠して、２０％未満が２０ ０，０００ダルトン未満の分子の大きさ、２０％未満が２，０００，０００ダル トンを超える分子の大きさになるまで加熱し、 （ｂ）得られた大きさを調製した多糖類を臭化シアンで活性化し、 （Ｃ）未反応の臭化シアンを実質的に全て除去し、ついで、 （ｄ）該活性化生成物を４〜８個の炭素のジカルボン酸ヒドラジド誘導体化外毒 素トキソイドと反応させること、 からなるヘモフィルス・インフルエンザｂからの多糖類に対するＴ−細胞依存性 抗体応答を生じさせることができ、分子の大きさがゲル・パーミエイション・ク ロマトグラフィーによるデキストラン・スタンダードに準拠して１４０，０００ 〜４，５００，０００ダルトンの間であり、リボース／蛋白比が０２５〜１．０ ０の間である水溶性、共有多糖類−ジフチリアまたは破傷風トキソイド抱合体の 製法。 ７、該ジカルボン酸かアジピン酸である前記第６項の製法。 ８、該トキソイドがジフテリア・トキソイドである前記第６項の製法。 ９、該トキソイドが破傷風トキソイドである前記第６項の製法。 １０、はぼ等モル量のリボース、リビトールおよびリン酸塩からなり、ゲル・パ ーミエイション・クロマトグラフィーによるデキストラン・スタンダードに準拠 して、２０％未満が分子の大きさ２００，０００ダルトン未満、２０％未満が分 子の大きさ２，０００，０００ダルトンを超えるまで加熱されてなる莢膜ヘモフ ィルス・インフルエンザｂ多糖類から調製された、実質的に蛋白および核酸を含 まないハプテン。 １１、該多糖類がす）　ＩＪウム塩として存在する前記第１０項のハプテン。