JPH10504524A

JPH10504524A - 合成ワクチンの開発に好適な免疫学的構築物において担体として使用されるペプチド類

Info

Publication number: JPH10504524A
Application number: JP7530530A
Authority: JP
Inventors: アール．コーヘン，イルン; フリドキン，マティチャフ; コネンヴァイスマン，ステファニー
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1998-05-06
Also published as: EP0760671B1; DE69534382D1; AU2602795A; ATE302016T1; AU684369B2; IL109790A0; WO1995031994A1; EP0760671A1; DE69534382T2; CA2191202A1; EP0760671A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫原性の低い抗原（例えば、ペプチド、タンパク質および多糖体）と、該抗原の免疫原性を実質的に増強することができる、大腸菌ｈｓｐ６５の配列（ＧｒｏＥＬ）に由来するＴ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体と、の結合体に関する。本発明による適当なペプチドはＰｅｐ２７８ｅであり、これは大腸菌ｈｓｐ６５分子の位置４３７−４５３に対応する。

Description

【発明の詳細な説明】合成ワクチンの開発に好適な免疫学的構築物において担体として使用されるペプチド類発明の分野大腸菌の熱ショックタンパク質65（ここでは以後ＧｒｏＥＬと称する）のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド、およびマウス主要組織適合性遺伝子結合体（ＭＨＣ）分子のある領域に関連して認識され得るこのペプチドの類似体について記載する。このペプチドおよび類似体は、このペプチドと、関心のある病原体から誘導される天然のまたは合成のハプテンと、からなる免疫結合体の調製において、合成担体として使用することができる。発明の背景病原性微生物（細菌、ウイルスおよび寄生体）がもたらす感染に対する免疫化は、一般的に、病原性微生物またはその有害作用を中和することができる感染防御免疫応答を刺激するために、天然の抗原（弱毒化または死滅微生物）または病原体の一部（例えば無毒化微生物生産物）を個体に接種することによって達成される。天然抗原物質の利用性の限界、すなわち病原性物質の取り扱いに伴う危険性および保存の問題が、サブユニットワクチンの開発への関心を刺激した。それにもかかわらず単離された防御性エピトープは低免疫原性という特性を有することが多い。細菌の炭水化物莢膜はこうした被覆物の一例である。これらはＴ細胞によって簡単には認識されず、したがってこれらの抗原に対する免疫応答ではＴ細胞補助、Ｔ細胞記憶、IgＧクラススウィッチおよび親和性成熟がなされない。この免疫応答は不十分であり、炭水化物莢膜で覆われた細菌の感染に対する抵抗性は、細菌炭水化物でのワクチン接種によって簡単には獲得されない。ペプチドエピトープもまた、Ｔ細胞エピトープの不在および遺伝的に制限された免疫応答のため、低免疫原性の場合がある。現在、多くの抗原は、抗体を産生するためのＢ細胞を誘導するためにＴ細胞の補助を必要とすることがよく知られている。Ｂ細胞特異性抗原に対する“ヘルパー”またはＴ細胞決定因子との結合は、連結Ｂ細胞エピトープに対する体液性免疫応答を誘導することが示された。タンパク質担体への多糖類の連結が免疫原性を増大させるという、Avery & Goebelの発見（1929）は、最近ヒト用のワクチンの製造に利用されている。ヒトにおいてもゲッ歯類においても、これらの結合体は免疫記憶を表すことによってＴ細胞依存性抗原に類似する行動をとる。結合体多糖類ワクチンとタンパク質担体−ハプテン系には類似性がある。こうして、莢膜多糖類（ＣＰＳ）のみでは出来ないのに、ＣＰＳ結合体は乳児における防御性レベルのＣＰＳ抗体を誘導することができる。純粋多糖体に比較した結合体の優位な免疫原性は、ゲッ歯類における担体−ハプテン系が示しているように、おそらく担体特異的Ｔ細胞の補助によるものと考えられる。多くの場合、Ｔ細胞依存性抗原は破傷風トキソイド、コレラトキシンまたはジフテリアトキソイドなどの大きな免疫原性担体タンパク質に連結されてきた。しかし、破傷風トキソイドについて報告されているように、投与量の制限と担体自体に対する感作の危険がある上に、刺激性および抑制性Ｔ細胞エピトープを有する、高分子量担体分子に対する免疫応答がうまく予測しえない。レシピエントが未修飾タンパク質であらかじめ免疫感作されている場合、その担体タンパク質に連結されたハプテンに対する抗体の応答もまた抑制されることが示されている。この現象は担体誘導エピトープ抑制と称されており、多数のハプテン−タンパク質結合体において生じることが最近報告された（Herzenberg & Tokuhisa,1982）。多数の強い感染性生物に対する作用力がより高い結合体ワクチンの開発がやはり重要であるので、必要なＴ細胞エピトープを提供する、より好適な担体分子を探索する努力がなされてきた。厳密に規定された免疫特性を有する特定のペプチドにより定義される、普遍的免疫原性Ｔ細胞エピトープが、このような代替分子の新世代を代表するものとなり得る。この目的のために、従来各種のＴ細胞エピトープが使用されてきた。しかし、宿主が予防接種後に病原体に遭遇した時に強い記憶応答を引き出すため、Ｔ細胞担体エピトープは特異的Ｂ細胞エピトープとともに存在する必要がある。この事実は、各病原体それぞれについて異なるＴ細胞担体を使用する必要があることを示唆している。この目的に利用できるペプチドの好適な供給源は、免疫系によって十分認識される高存在量のタンパク質であると考えられる。自己に密接に関連するものおよび系統的に関連性が小さいものを含めて、広範囲の各種タンパク質を使用した研究によると、多数のＴ細胞は２，３の免疫優位性(immunodominant)エピトープに集中し、少数のものが他の副次的(subdominant )決定基に応答することが示された。Ｔ細胞による決定因子利用のこの区別は、利用し得るＭＨＣ分子に対する親和性の差異、Ｔ細胞レパートリーの多様性、ＭＨＣ−結合部位に関する内部競合およびプロセシングにおける微妙な差異を含む要因が組み合わされることによって生じると考えられる（Babittら、1985；Kapp lerら、1987；Brettら、1988）。熱ショックタンパク質（hsp）のファミリーに属するタンパク質が多くの病原体の主要な抗原であるという証拠が集まりつつある（Youngら、1988）。hspは突然の温度上昇を受けた細胞によって産生されることについて最初に記載され、その後このように命名された。hspは20kD，60kD，65-68kD，70kD，90kD，110kDおよびその他の各種分子量のタンパク質を含んでいる。hspは酸化性損傷、栄養の減少および細胞内病原体の感染を含む多くの各種環境攻撃によってすべての細胞中に誘導されることが現在明らかになっている。hsp応答は細胞をその他の点では不利な状態のもとで生き残ることを可能にする。細胞ストレスはhspの合成を増大させるが、多くのhspは構成的に発現されており、正常の細胞機能において重要な役割をも演じている。hsp応答は原核および真核生物界全体に普遍的であり、そしてhspは最もよく保存された分子の部類に属する。 hspファミリーに属するタンパク質の代表的なメンバーである、hsp65は主要な抗原であると考えられる。その理由は、多くの各種細菌による感染または免疫感作がこのhsp65分子に特異的な抗体およびＴ細胞を誘導するからである（Youngら、1988）。マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis ）で免疫感作されたマウスにおいて、この細菌に応答するすべてのＴ細胞の中の 20％がhsp65 特異性である。興味深いことに、臨床上の疾病の兆候を何ら示さない正常で健康な個体においても、hsp65への反応性を有するＴ細胞が同定されている（Munkら、1988）。 Lussowら（1990）は、マウスを生存マイコバクテリウム・ツベルクロシスvar. bovis（ＢＣＧ）で初回感作し、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）と結合した反復マラリア合成ペプチド（ＮＡＮＰ）₄₀で免疫感作したところ、抗ペプチドIgＧ抗体の高い、そして長期にわたる抗体価が誘導されたことを示した。その後、Lu ssowら（1991）は、マイコバクテリアhsp65および大腸菌hsp65（GroEL）が、事前にＢＣＧで初回感作したマウスにおいて、反復マラリア合成ペプチド（ＮＡＮＰ）₄₀に対するIgＧの高い、そして長期にわたる抗体価を誘導するための、担体分子として作用することを報告した。マイコバクテリアまたは大腸菌のhspと結合したマラリアペプチドは、アジュバントが存在しなくても、抗ペプチド抗体が誘導された。 Barriosら（1992）は、事前のＢＣＧ初回感作をせずに、70kD hspと結合したペプチドまたはオリゴ糖で免疫感作したマウスが、高力価のIgＧ抗体を産生したことを示している。この抗ペプチド抗体応答は少なくとも１年間持続した。アジュバントを含まない70kD hspの担体の効果はＴ細胞依存性であった。なぜならば、無胸腺nu/nuマウスにおいては、抗ペプチドおよび抗70kD IgＧ抗体のいずれも誘導されなかったからである。65kDまたは70kD hspでのマウスの事前の免疫感作は、アジュバントなしでhsp-ペプチド結合体で免疫感作した後の抗ペプチドIgＧ抗体の誘導に対して何らネガティブな作用を示さなかった。さらに、65kD hspでの事前免疫感作は、抗（ＮＡＮＰ）₄₀抗体の誘導に関して、ＢＣＧの代わりに有効な初回感作をすることができた。結合ペプチドに対するマイコバクテリアhsp6 5およびhsp70の担体効果はヒトを除く霊長類においても示された（Perrautら、1 993）。細菌hsp65タンパク質の配列内のＴ細胞エピトープのいくつかが免疫優位性を示し、免疫記憶を誘導することができるのに対して、その他は特定の免疫認識を発現しないかまたは自己免疫疾患の誘導に関与するものと仮定することができる。各種ＭＨＣ分子に結合する機能的に異なるＴ細胞エピトープを識別することによって、Ｔ細胞依存性抗原の担体分子の、安全で明確で強力な代替品として適格な普遍的免疫原性ペプチドを同定することができると考えられる。同一出願人のイスラエル特許出願No.102687には、免疫原性が低い分子に結合した、ヒトhsp65の特定のＴ細胞エピトープおよびその類似体について記載されている。上記の引用文献のいずれにも、免疫原性が低い分子に結合した、大腸菌のhsp6 5(GroEL)配列から誘導された特定のＴ細胞エピトープについては記載されていない。発明の要約低免疫原性抗原分子の免疫原性を増強し、それによってこれらを免疫感作のための好適な抗原に変化させるための方法を提供することが本発明の１つの目的である。この目的のため、本発明は、低免疫原性抗原と、大腸菌hsp65(GroEL)から誘導されたＴ細胞エピトープを構成成する合成ペプチド担体またはその類似体との結合体を提供する。このペプチドまたは類似体は低免疫原性抗原の免疫原性を実質的に増強することができるものである。 GroELから誘導され、Ｔ細胞エピトープを構成し、低免疫原性抗原の免疫原性を実質的に増強することができるペプチドまたはその類似体であればどれでも本発明において使用することができる。ここで278eとして記載される、本発明のために好適なペプチドは、GroEL分子の437-453位置に相当し、以下の配列を有している。低免疫原性抗原分子は、例えば、ＨＩＶウイルスまたはマラリア抗原から誘導されたペプチドなどのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、若しくはヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzas）タイプｂ、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカスＢ群、大腸菌タイプK1、チフス菌(Salmonella typhi)のようなサルモネラなどに由来する爽膜多糖体などの多糖体である。担体ペプチドは低免疫原性抗原分子に直接またはスペーサーを介して共有結合で結合される。本発明はさらに、本発明の結合体または低免疫原性抗原と好適なペプチド担体との混合物を含むワクチンに関する。別の態様において、本発明は哺乳類宿主の免疫感作方法に関する。これは、宿主に本発明の結合体の有効量を投与するか、または低免疫原性抗原とGroEL配列から誘導されたＴ細胞エピトープを構成するペプチド担体またはその類似体の有効量を同時投与することを含むものである。このペプチドまたはその類似体は低免疫原性抗原の免疫原性を実質的に増強することができるものである。図面の簡単な説明図１は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化した278エピトープ20μgでBALB/cマウスを免疫感作した後の、278エピトープである278e，278m，および278coxに対する、リンパ節の増殖を示すものである。図２ａ−ｃは、ＩＦＡ中で乳化した278e 20μgでB10 RIIIマウス(2a)，B10.BR マウス(2b)，およびB10.Sマウス(2c)を免疫感作した後の、278eおよび対照ペプチドAcR 259-271に対する、リンパ節の増殖を示すものである。図３は、278相同体に結合したViフラグメント 2μgまたはViフラグメント単独 2μgでBALB/cマウスを免疫感作した後の、ペプチド278e，278m,およびAcR259-27 1に対する、リンパ節の増殖を示すものである。図４は、278相同体に結合したViフラグメント20μgまたはViフラグメント単独 2μgでBALB/cマウスを免疫感作した後の、ペプチド278e，278m,およびAcR259-27 1に対する、リンパ節の増殖を示すものである。図５は、Viフラグメント単独またはViフラグメント−結合体278h-Vi，278m-Vi ,および278e-ViによってBALB/cマウス中に誘導された血清抗-Vi IgＧ抗体の応答を示すものである。各群に注入された多糖体の量は2μgである。初回および二次免疫応答を図示する。結果を血清希釈度1：100で示す。発明の詳細な説明本発明による好ましい結合体は、図式１に示すように、ペプチド２７８ｅと、細菌の多糖体、例えばＣ₃位置において様々にＯ−アセチル化されたポリ−α− （１−４）ＧａｌＮＡｃの線状ホモポリマーであるチフス菌（Salmonella typhi ）の莢膜多糖（ＣＰＳ）Ｖｉ（以後ＶｉまたはＶｉフラグメントと言う）、とを共有結合させることにより形成される。天然のＶｉ分子は約３×１０³ｋＤ（Ｖｉ）の分子量を有する。Ｖｉフラグメント（約４５ｋＤ）は超音波切断により調製できるが、超音波処理はそのモノマー単位の構造を変えることがなく、比較的均質な多糖を生成させる(Stone & Szu，1988)。Ｖｉ／Ｖｉフラグメントのみでは、他のＣＰＳと同様に、再接種したときに哺乳動物（ヒトまたは動物）において追加免疫（ブースター）応答を誘導することがないが、ＧｒｏＥＬ由来の適当なペプチドまたはその類似体に結合させた本発明の結合体として、またはこのようなペプチドまたは類似体との混合物として提供されるときは、その免疫原性が増強される。Ｖｉ−ペプチド結合体の再接種は、主にＩｇＧイソタイプにより提示される抗Ｖｉ抗体レベルの上昇（追加免疫効果）をもたらす。本発明のペプチド２７８ｅは上記の特許出願第102687号に記載されるペプチド２７８ｈおよび２７８ｍとは明らかに異なるものである。ペプチド２７８ｅは高度に荷電された疎水性の分子である。すなわち、１７の構成アミノ酸のうち５個は生理学的ｐＨにおいて（３個が陰イオンに、そして２個が陽イオンに）イオン化されている。５個のアミノ酸残基は疎水性である。さらに、３個の残基はアミド化されており、実質的な水素結合を行うことが可能である。このペプチドはさらに、陰に荷電した極性Ｎ末端ドメイン、荷電した極性Ｃ末端ドメインおよび高度に疎水性のコアを有するものとして特性付けられる。２７８ｅは活性を保持させつつ修飾することができる。しかしながら、活性を保つためには、その全体的な構造特性を維持すべきである。それゆえ、２、３および１６位はＥまたはＤのどちらかによって占められ、そして９および１３位はＫまたはＲのどちらかによって占められる。９位と１３位における電荷の保存（陽電荷から陰電荷またはその逆）は活性ペプチドをもたらすだろう。水素結合を形成するアミノ酸、好ましくはＮおよびＱが１位と４位を占めるべきである。６、８、１０、１２および１５位における疎水性は、天然のアミノ酸、例えばＩ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＦ、あるいは非天然のアミノ酸、例えばノルロイシン（Ｎｌｅ）またはノルバリン（Ｎｖａ）といった疎水性アミノ酸を組み込むことによって維持すべきである。本発明において「類似体」という用語は、それらが免疫原性の低い抗原分子の免疫原性を実質的に増強する能力を持ち合わせるかぎり、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸残基ないし配列の置換、欠失または付加により得られたペプチドを指すものである。類似体は、ペプチド２７８ｅの場合には、このペプチド分子の電気的性質および疎水性の少なくとも７０％、好ましくは９０〜１００％が保存されているようなペプチドである。これらのペプチドは本節において上述した教示に従うことにより得られる。本発明によるペプチドは全部が光学的に活性なＬ体またはＤ体のアミノ酸残基を有するか、または一部のアミノ酸残基がＬ体で、他のアミノ酸残基がＤ体である。「免疫原性の低い抗原分子の免疫原性を実質的に増強する」とは、該抗原に対する抗体のレベルの上昇を誘導することと、主にＩｇＧイソタイプの該抗体を提示することの両方を意味する。ペプチド担体は抗原分子に直接またはスペーサーを介して結合させることができる。ペプチドとＶｉまたはＶｉフラグメントとの直接結合は以下の図式１に示してあるが、この場合は次の結合体が後述する方法１により得られる。スペーサーは式−Ｏ−Ｒ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−をもつことができ、従って、ＶｉまたはＶｉフラグメントのカルボキシル基とそれぞれエステルまたはアミドを形成し、そしてペプチドの末端アミノ基とペプチド結合を形成する。また、スペーサーは式−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ₂−をもつこともでき、上記各式中、Ｒは飽和または不飽和の炭化水素鎖であり、場合により１個以上の芳香族基によりまたはＯ、Ｓ、Ｎなどのヘテロ原子により置換および／または介在されていてもよい。好ましくは、Ｒはε−アミノカプロン酸の残基のような３〜１６個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素鎖である。次式：〔式中、Ａｃはアセチルであり、ＡＣはε−アミノカプロン酸の残基であり、Ｐｅｐはペプチド担体２７８ｅまたはその類似体の残基であり、そして糖残基はチフス菌のＶｉ莢膜多糖体（ＶｉまたはＶｉフラグメント）の反復単位を表す〕で表される結合体は図式１に示す方法２により製造することができ、以下に詳述する。スペーサーが−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ₂−である結合体は、−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−基の還元により、または−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ₂−Ｘ（ここでＸはハライドのような適当な離脱基である）によるペプチドのアミノ末端のアルキル化により得られる。さらに、本発明は本発明の結合体を含むワクチンに関する。こうしたワクチンはヒトおよび動物のために適当なビヒクルとともに適当な任意の経路で、例えば経口的にまたは皮下経路で投与することができる。本発明について以下の非限定的実施例により説明する。実施例実施例においては、以下の材料および方法を使用する。材料および方法ａ．材料：すべての溶媒および化学物質は分析級のもので、特に明記しない限り、Aldrich,U.S.A.より入手した。ｂ．ペプチド合成：自動合成装置（Applied Biosystem model 430A;Germany ）により、t-ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）戦略のためのこの会社のプロトコルを使用して、ペプチド278eを製造した（Kentら、1984）。以下の対照ペプチドを合成した：ヒトhsp65分子の458-474 位置に相当するペプチド278h、マウス hsp65分子の458-474位置に対応するペプチド278m、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetti）hsp65タンパク質の437-453位置に対応するペプチド278cox。これらの対照ペプチドは下記の配列を有している。さらに別の対照ペプチド、AcR259-271はマウスのアセチルコリン受容体のα− 鎖の259-271位置に対応し、以下の配列を有する。このペプチドはH-2d半数体のＭＨＣクラスII分子に関係して、Ｔ細胞によって認識される。ｃ．逆相ＨＰＬＣ：分析用ＨＰＬＣカラムRP18（Merck,Darmstadt,Germany ）を使用し、SP8733可変波長検出器を装備したSP8750液体クロマトグラフィーシステムを利用して、0.1％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水−アセトニトリル勾配によって、製造されたペプチドの純度を評価した。流出液を220 nmにおけるＵＶ吸収によってモニターした。ＨＰＬＣ級のアセトニトリルはMerck（D armstadt,Germany）より購入した。アミノ酸分析機によって、ペプチドをさらに分析した。ｄ．Vi：シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii）WR7011 から精製したVi（J.B.RobbinsおよびS.C.Szu,National Institute of Health,Be thesda,U.S.A.の好意で寄贈された）は、それぞれ１％未満のタンパク質、核酸、およびリポ多糖体を含有していた。Viの分子サイズは３×10³kDと評価された。超音波処理によって約45 kDのViフラグメントを製造したが、これはDominiqu ｅSchultz（Pasteur-Merieux,France）の好意で提供された。ｅ．Vi およびViフラグメントとペプチドとの結合方法１（図式１参照）：スペーサーを介さないVi／Viフラグメントとペプチドとの結合。Vi／Viフラグメント１部とペプチド１部を最少量の２回蒸留水（ddw ）に溶解し、水溶性カルボジイミド（CDI;1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩）２部の存在下でｐＨ６、室温（RT）において12時間インキュベートした。反応混合物を透析した後、アミノ酸分析によって結合体中のペプチド密度を定量し、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）によって構築物の糖含有量を評価した。方法２（図式２参照）：溶液中でスペーサーによってペプチド鎖を伸長した後のVi／Viフラグメントとペプチドとの結合。N-ヒドロキシスクシンイミドによってt-Boc-ε-アミノカプロン酸（t-Boc-AC）のカルボキシル官能基を活性化するため、最少量のジオキサン（Merck,Germany）中でt-Boc-AC 1mmol をN-ヒドロキシスクシンイミド1.15mmolと混合した；ジオキサンに溶解したN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）1.15mmolを添加し、３時間後、反応混合物を濾過し、ジオキサンで洗浄した。目的のペプチド0.1mmolを少量のddwに溶解し、ＫＨＣＯ₃（Merck）0.2mmolと混合した。t-B0C-ACのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルのジオキサン溶液と調製したペプチド溶液を混合し、激しく撹拌しながら１時間反応させた。その後、反応混合物をddw（10ml）で希釈し、冷却し、そして1N ＫＨＳＯ₄溶液で酸性化した。生成物を酢酸エチルで抽出した。この有機溶液をddwで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発乾固した。生成物をＰ₂Ｏ₅上で２時間乾燥し、ＴＦＡ 4-5mlに溶解し、10分間反応させた後、液体を30℃で真空中で蒸発させた。化合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で２回洗浄し、Ｐ₂Ｏ₅上で2-3時間乾燥する前に液体を蒸発させた。続いて、ペプチド-AC生成物をddwに溶解し、ｐＨを８に調整した。Vi／ViフラグメントのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（特許出願No.102687の手法２の記載にしたがって調製）５m gを添加した。数時間インキュベートした後、生成したVi-AC-ペプチド結合体をd dwに対して透析した。結合体のペプチド密度をアミノ酸分析によって評価した。ｆ．免疫感作：2-3ヵ月令の異種系統に属する雌マウスを、Vi／Viフラグメント単独またはVi／Viフラグメント−結合体を４週間の間隔で２回皮下注射（sc ）によって免疫感作した。抗原の注入量は実験毎に変更し、これを図中に示す。使用したアジュバントはすべての場合においてＩＦＡである。各実験群からのマウスは各注入12日後に採血した。ｇ．血清学：未処理のまたは結合Viによってマウス中に誘発されたVi／Viフラグメント抗体値を酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量した。負に荷電した多糖体は固相ＥＬＩＳＡにおいて普通使用されるポリスチレンにあまりよく付着しないので、非特異的結合がほとんどない固相表面にVi／ Viフラグメントをコーティングするために、正に荷電したメチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。詳細に述べると、Vi 0.5mgをＰＢＳ1mlに溶解し、室温で１時間撹拌した。メチル化ＢＳＡ（Sigma）10mgをＨ₂Ｏ1mlに懸濁させ、得られた溶液を０.８μmフィルターで濾過した。コーティング溶液を製造するため、溶解多糖体1mlをメチル化ＢＳＡ溶液50μlとともに室温で20分撹拌し、その後ＰＢＳ中に1：20に希釈した。Nunclon delta Siマイクロウェルプレートに、１ウェルあたりコーティング溶液100μl（2.5μg Vi／ウェル）で室温において３時間かけてコーティングした。プレートを0.33％ Brij35(Sigma)を含有するＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳおよび1％乾燥スキムミルクの溶液で、37℃において２時間かけてブロックした。洗浄後、希釈した未知の血清および希釈した標準血清（希釈用緩衝液はＰＢＳ中1％スキムミルクおよび0.33％Brij35を含有する）の100μlアリコートを添加し、プレートを37℃で１時間インキュベートした。対照および試験血清はプレート上に２回ずつ適用した。非結合抗体を洗浄によって除去し、プレートに、試験血清の場合はヤギ抗マウスIgＧFab₂-アルカリホスファターゼ結合体（Sigma）、標準血清の場合はウサギ抗ウマIgＧ Fab₂酵素結合体の１：5000希釈物を添加した（100μl／ウェル）。37℃ で２時間インキュベート後、プレートを洗浄し、ジエタノールアミン−Ｈ₂ＯｐＨ9.8中0.6mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェート（Sigma）を含有する基質溶液 100μｌを添加することによって、結合している抗体を可視化した。20分後、１ウェルあたり5N ＮａＯＨ 10μlの添加によって、酵素反応を停止させた。405 n mにおいて光学密度を読み取った。ホルマリン固定チフス菌 Ty2（J.B.Robbins およびS.C.Szu,NIH,Maryland,U.S.A.の好意により寄贈された）の複数回の静脈注射によって、Vi抗体550mg／mlを含有する抗Vi標準血清Burro 260を調製した。得られた結果を405nmで読み取った光学密度で表す。ｈ．ペプチド免疫感作後のリンパ節増殖指定のマウス系統のマウス３匹のグループに、ＩＦＡ／ＰＢＳ 0.2ml中で乳化したペプチド20μgを足蹠皮下免疫感作した（0.1ml／foot）。10日後、排出リンパ節を取り出した。免疫感作マウスのリンパ節細胞（ＬＮＣ）（5×10⁶／ウェル）を各種抗原の存在下で培養した。培養物を、丸底マイクロタイタープレート（ Falcon）中の1％同系正常マウス血清を含有する、2mMグルタミン、非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、100mg/ml ストレプトマイシン、5×10⁵M β−メルカプトエタノール（Fluka AG,Buchs,Switzerland）を補充した Eagles培地200μl中に入れた。4-5日のインキュベート後、³Ｈ-チミジン（5Ci/mmolを0.5mCi,Nuclear Research Center,Negev,Israel）を添加した。16 時間後、細胞を回収し放射能をカウントした。結果を１分間のカウント（cpm）または刺激指数（SI）として表す。SIは試験培養物（抗原を含むもの）の平均cp mと対照培養物（抗原を含まないもの）の平均cpmの比として定義された。実施例実施例１．Vi −ペプチド結合体の調製上記のように、Vi／Viフラグメントとペプチド278eおよび対照ペプチドとの結合体を調製した。 Vi−ペプチド結合体の組成を表１に要約する。表１に表れた結果は糖単量体あたりのペプチドのモル比は多様であることを示している。糖−ペプチド結合体として、１マウスあたりのペプチド注入用量が0.8-2.2μgのものが最も効果的だった。実施例２．主要組織適合性遺伝子結合体（ＭＨＣ）バックグラウンドを各種変化させた異系統マウスにおける、ペプチド278eに対するリンパ節細胞の増殖２．１．遊離担体ペプチドでの免疫感作後のリンパ節増殖。ペプチド278eがマウスＭＨＣの各種アレルに関して免疫系によって認識されるかどうかを試験するため、本出願の“材料および方法”に記載したように、2-3 ヵ月令の雌マウス（１グループについて３匹）にＩＦＡ中で乳化した遊離ペプチド278e 20μgを皮下注射し、ペプチド278eおよび対照ペプチドに対するリンパ節細胞の特異的増殖を行なわせた。図１に示されるように、ペプチド278eを接種したBALB/c(H-2d)マウスのＬＮＣは、このペプチド278eに対して明白な特異的増殖応答を示したが、対照ペプチド 278mおよび278coxに対しては何ら増殖が生じなかった。したがって、ペプチド27 8eに初回感作したＬＮＣはマウスhsp65の配列から誘導された相同性自己ペプチド278mとは交叉反応しない。図２ａ−ｃは、ペプチド278eが３種の類遺伝子系統B10マウスにおいても認識されたことを示している。B10.RIIIマウス(H-2ⁱ)（図２ａ）、B10.BRマウス(H-2^k ）（図２ｂ）およびB10.Sマウス(H-2^s)（図２ｃ）のＬＮＣは、指定のペプチド濃度において、対照ペプチドAcR259-271に対してよりもペプチド278eに対して明らかに高い増殖応答を示した。２．２．Viフラグメントと結合したペプチド278eでの免疫感作後の、ペプチド278eに対するリンパ節増殖。ペプチド278eの多糖体Vi−フラグメントへの結合によってその抗原構造が変化するかどうかを分析するため、糖−ペプチド結合体での免疫感作後、ペプチドのみに対するＬＮＣの応答を試験した。図３および図４は、糖−ペプチド結合体として、Viフラグメント2μg／マウス（図３）またはViフラグメント20μg／マウス（図４）（これに含まれるペプチド注入量については、表１参照）で免疫感作したとき、BALB/cマウス中でViフラグメント-278eによって誘発されたＬＮＣは非結合ペプチドを認識することを明白に示している。実施例３．ペプチド278eと結合したViフラグメントの抗原性 Viフラグメントと結合したペプチド278eがこのＴ細胞依存症抗原に対する免疫応答を増強するかどうかを試験するため、BALB/cマウス5匹に糖−ペプチド結合体を接種した後、糖に対する免疫応答を検討した。図５は、Viフラグメントに共有結合によって連結されたペプチド278eがこの糖に特異的なIgＧ抗体の生成を実質的に増強し得ることを明白に示している。この結合体を２回投与したマウスの免疫感作は強い追加免疫効果を示し、これによって、この糖に特異的な免疫応答にＴ細胞が関与していることが示された。非結合多糖を接種したBALB/cマウスは無視し得る程の特異的抗体しか誘導しなかった。Viフラグメント-278eによって誘導された免疫応答は、ペプチド278hおよび278mに結合した糖によって誘発されたものと比較される。上記の実験は、ペプチド278eがマウスＭＨＣ分子の広範囲のアレルに関連して認識され、低免疫原性分子に対する増強された免疫応答を誘導するための担体エピトープとして使用し得ることの証拠を示している。この証拠を以下に要約する。（i）遺伝的ＭＨＣバックグラウンドを変えたマウス系統の初回感作ＬＮＣは、特異的増殖応答を示したので、ペプチド278eを認識することができた。（ii）in vitroリンパ節増殖検定において、多糖体に結合した278eで初回感作したＬＮＣが非結合ペプチドをも認識することができたので、Viフラグメントに結合したペプチド278eはその抗原性構造が変化しなかった。（iii）Viフラグメントの免疫原性は、ペプチド278eに結合した結合体として免疫系に提示されるとき、増強される。ペプチド278eで初回感作したＬＮＣがマウスの相同ペプチド278mと交叉結合しなかったという事実は、担体エピトープとして使用したペプチド278eはおそらく自己の成分に対する免疫応答を誘導しないであろうということを示している。ペプチド278eに対する免疫応答はマウスにおいて遺伝的に制限されないようであるので、この合成ペプチドおよびその類似体は、各種病原体に対する防御性免疫を提供するための免疫結合体を製造するための普遍的な担体として使用することができ、そして合成ワクチンの開発用として好適である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コネンヴァイスマン，ステファニーイスラエル国 65214 テルアビブマーゼストリート 29番地ビー.

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫原性の低い抗原と、該抗原の免疫原性を実質的に増強することができる、大腸菌ｈｓｐ６５の配列（ＧＲＯＥＬ）に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体と、の結合体。２．合成ペプチドまたは類似体が免疫原性の低い抗原に共有結合で結合されている、請求項１に記載の結合体。３．免疫原性の低い抗原がペプチド、タンパク質または多糖体である、請求項１または２に記載の結合体。４．免疫原性の低いペプチドがＨＩＶウイルスまたはマラリア抗原に由来するものである、請求項３に記載の結合体。５．免疫原性の低い多糖体が細菌の多糖体である、請求項３に記載の結合体。６．本明細書中でＰｅｐ２７８ｅと呼ばれる合成ペプチド担体が大腸菌ｈｓｐ６５分子の位置４３７−４５３に対応し、次の配列：を有する、請求項１に記載の結合体。７．合成ペプチド担体または類似体が免疫原性の低い抗原分子に直接結合されている、請求項１に記載の結合体。８．免疫原性の低い抗原分子が細菌の多糖体である、請求項７に記載の結合体。９．細菌の多糖体がチフス菌（Salmonella typhi）の莢膜多糖（ＣＰＳ）である、請求項８に記載の結合体。 10．合成ペプチド担体または類似体が−Ｏ−Ｒ−ＣＯ−、−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−、 −ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−、−Ｏ−Ｒ−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ₂−（ここでＲは場合により１個以上の芳香族基によりまたはＮ、ＯもしくはＳから選ばれるヘテロ原子により置換および／または介在されていてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖である）から選ばれるスペーサーを介して免疫原性の低い抗原分子に結合されている、請求項１に記載の結合体。 11．Ｒが３〜１６個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素鎖である、請求項10に記載の結合体。 12．Ｒがε−アミノカプロン酸の残基である、請求項11に記載の結合体。 13．式：〔式中、Ａｃはアセチルであり、ＡＣはε−アミノカプロン酸の残基であり、Ｐｅｐはペプチド担体２７８ｅの残基であり、そして糖残基はチフス菌のＶｉ莢膜多糖体の反復単位を表す〕で表される、請求項12に記載の結合体。 14．Ｔ依存性抗原に特徴的な免疫応答をもたらすＴリンパ球ヘルパー効果を生み出すことができる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の結合体。 15．再接種したとき、免疫原性の低い抗原分子に対する抗体のレベルを増加させる追加免疫応答を誘導する、請求項１〜13のいずれか１つに記載の結合体。 16．主にＩｇＧイソタイプの抗体を誘導する、請求項15に記載の結合体。 17．請求項１に記載の結合体を含むワクチン。 18．免疫原性の低い抗原分子を、該抗原分子の免疫原性を実質的に増強することができる、大腸菌ｈｓｐ６５の配列に由来するＴ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体に、結合させることを含んでなる、免疫原性の低い抗原分子の免疫原性を増強する方法。 19．免疫原性の低い抗原分子を、該抗原分子の免疫原性を実質的に増強することができる、大腸菌ｈｓｐ６５の配列に由来するＴ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体と、混合することを含んでなる、免疫原性の低い抗原分子の免疫原性を増強する方法。 20．細菌の多糖体の免疫原性を増強するための、請求項18または19に記載の方法。 21．哺乳動物宿主に、有効量の請求項１の結合体を投与することを含んでなる、哺乳動物宿主の免疫感作法。 22．哺乳動物宿主に、有効量の免疫原性の低い抗原分子と、該抗原分子の免疫原性を実質的に増強することができる、大腸菌ｈｓｐ６５の配列に由来するＴ細胞エピトープを構成する有効量の合成ペプチド担体またはその類似体と、を同時投与することを含んでなる、哺乳動物宿主の免疫感作法。