DE69534382T2

DE69534382T2 - Peptide, verwendet als träger in immunogenen konstrukten, die in der entwicklung synthetischer impfstoffe geeignet sind

Info

Publication number: DE69534382T2
Application number: DE69534382T
Authority: DE
Inventors: Irun R. Cohen; Matityahu Fridkin; Stephanie Konen-Waisman
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2015-05-25
Also published as: WO1995031994A1; EP0760671A1; AU684369B2; ATE302016T1; CA2191202A1; EP0760671B1; IL109790A0; JPH10504524A; AU2602795A; EP0760671A4; DE69534382D1

Description

Gebiet der Erfindung
Ein synthetisches Peptid mit einer Aminosäuresequenz wird beschrieben, die jener eines T-Zellepitops des Hitzeschockproteins 65 von E. coli (im Folgenden GroEL) und seiner Analogen entspricht und im Zusammenhang mit einer Anzahl von Maus Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Molekülen erkannt werden kann. Das Peptid oder seine Analoge können als künstliche bzw. synthetische Träger bei der Zubereitung von immunogenen Konjugaten verwendet werden, die aus den Peptiden und einem natürlichen oder künstlichen Hapten bestehen, das von einem phatogenen Agens von Interesse abgeleitet ist.
Hintergrund der Erfindung
Eine Immunisierung gegenüber einer durch einen phatogenen Mikroorganismus (Bakterien, Viren und Parasiten) verursachte Infektion wird im Allgemeinen durch Injizieren des natürlichen Antigens (geschwächter oder abgetöteter Mikroorganismus) oder Teilen des infektiösen Agens (beispielsweise entgiftete mikrobielle Produkte) in ein Individuum erreicht, um eine schützende Immunantwort zu stimulieren, die die phatogene Mikrobe oder ihre schädlichen Auswirkungen neutralisieren kann.
Eine begrenzte Verfügbarkeit der natürlichen antigenen Substanz, beteiligte Risken bei der Handhabung von phatogenem Material, ebenso wie Schwierigkeiten bei der Lagerung haben das Interesse zur Entwicklung von Untereinheit-Impfstoffen stimuliert. Isolierte schützende Epitope sind nichtsdestotrotz häufig durch ihre schwache Immunogenität bzw. Immunogenizität gekennzeichnet. Die Kohlenhydrat-Kapseln von Bakterien sind ein Beispiel solcher Hüllen: Sie werden von T-Zellen nicht leicht erkannt, wodurch die Immunantwort auf diese Antigene einer T-Zellen-Hilfe, eines T-Zellen-Gedächtnis, IgG Klassen-Wechsels und Affinitätsreifung beraubt ist. Eine derartige Immunantwort ist ineffizient und ein Widerstand gegenüber einer Infektion durch mit Kohlenhydrat-Kapseln umhüllten Bakterien wird durch eine Impfung mit bakteriellen Kohlenhydraten nicht einfach erzielt. Auch Peptid epitope können schwach immunogen sein, wobei die Abwesenheit eines T-Zellepitops und die genetisch eingeschränkte Immunantwort den Grund darstellen.
Es ist momentan sehr gut bekannt, dass die meisten Antigene eine T-Zellen Hilfe benötigen, um B-Zellen zur Herstellung von Antikörpern zu induzieren. Von einem Konjugieren einer "Helfer" oder T-Zellen Determinante an ein B-Zellen spezifisches Antigen wurde gezeigt die Körperflüssigkeiten betreffende (humoral) Immunantworten bzw. Immunreaktionen auf die verbundenen B-Zellepitope zu induzieren. Die Entdeckung von Avery & Goebel (1929, das ein Verbinden von Polysacchariden an Proteinträger eine Immunogenität erhöht wurde, neulich zur Herstellung von Impfstoffen zum Gebrauch beim Menschen verwendet. Sowohl in Menschen als auch Nagern verhalten sich diese Konjugate durch Vorweisen eines immunologischen Gedächtnisses wie T-Zell-abhängige Antigene. Es bestehen Ähnlichkeiten zwischen Konjugat Polysaccharid Impfstoffen und Protein Träger-Hapten Systemen. Daher können die kapselförmigen Polysaccharid (CPS) Konjugate schützende Niveaus von CPS Antikörpern in Kindern erzeugen, wohingegen CPS alleine nicht. Es ist möglich, dass die überlegene Immunogenität von Konjugaten verglichen zu denen von reinen Polysacchariden aufgrund der Hilfe von Träger spezifischen T-Zellen beruht, wie es in dem Träger-Hapten System in Nagern gezeigt wurde.
In den meisten Fällen wurden T-Zellen unabhängige (T-ind) Antigene mit großen immunogenen Trägerproteinen, wie beispielsweise dem Tetanus-Toxoid, Choleratoxin oder Diphtherie-Toxoid verbunden. Neben Dosierungsbegrenzungen und dem Risiko einer Sensibilisierung dem Träger selbst gegenüber, wie für das Tetanus-Toxoid berichtet, ist die immunologische Antwort auf Trägermoleküle mit hohem Molekulargewicht, die sowohl stimulatorische als auch suppressive T-Zellepitope beherbergen, nichtsdestotrotz nicht sehr vorhersagbar. Es wurde gezeigt, dass die Antikörper Antwort auf ein Hapten verbunden mit einem Trägerprotein ebenso inhibiert werden kann, wenn der Empfänger zuvor mit dem nicht-modifizierten Protein immunisiert wurde. Dieses Phänomen wurde Träger induzierte Epitopsupression genannt und wurde neulich gezeigt mit einer Anzahl von Hapten-Protein Konjugaten (Herzenberg & Tokuhisa, 1982) aufzutreten. Da die Entwicklung von wirksameren Konjugat Impfstoffen gegen eine große Anzahl von äußerst infektiösen Organismen immer noch wichtig ist, wurden Anstrengungen unternommen neue geeignetere Trägermoleküle zu suchen, die die benötigten T-Zellepitope bereitstellen. Allgegenwärtige immunogene T-Zellepitope, die durch spezifische Peptide mit scharf umrissenen immunologischen Eigenschaften festgelegt sind, könnten eine neue Generation von derartigen alternativen Molekülen darstellen. T-Zellepitope verschiedener Arten wurden zu diesem Zweck zuvor verwendet. Um jedoch eine starke Gedächtnis-Antwort hervorzurufen, wenn der Wirt dem infektiösen Agens nach der Impfung begegnet, sollte das T-Zellen Trägerepitop zusammen mit dem spezifischen B-Zellepitop vorliegen. Diese Tatsache würde scheinbar verlangen, dass ein unterschiedlicher T-Zellen Träger für jedes infektiöse Agens verwendet wird. Reichlich vorhandene Proteine, die gut vom Immunsystem erkannt werden, könnten eine geeignete Quelle für diesem Zweck dienende Peptide darstellen.
Studien unter Verwendung einer großen Vielzahl von Proteinen, sowohl von jenen mit enger Ähnlichkeit zu sich selbst als auch jene mit phylogenetisch entfernter Ähnlichkeit, haben gezeigt, dass die Mehrheit der T-Zellen auf wenige immunodominate Epitope zielen mit einer Minderheit, die auf andere subdominante Determinanten reagiert. Diese Hierarchie einer Determinanten-Verwendung von T-Zellen könnte aus einer Kombination von Faktoren entstehen, die unterschiedliche Affinitäten für die verfügbaren MHC Moleküle, die Verschiedenheit des T-Zell Repertoires, innere Konkurrenz für MHC Bindestellen und genaue Unterschiede bei der Prozessierung (Babitt et al., 1985; Kappler et al., 1987; Brett et al., 1988) umfassen.
Hinweise häufen sich, dass zu der Familie von Hitzeschockproteinen (hsp's) gehörende Proteine Hauptantigene von vielen Phatogenen (Young et al., 1988) darstellen. Hsp's wurden zuerst beschrieben und später aufgrund ihrer Herstellung durch Zellen benannt, die plötzlichen Temperaturerhöhungen ausgesetzt wurden. Die hsp's umfassen Proteine von verschiedenem Molekulargewicht, einschließlich 20 kD, 60 kD, 65–68 kD, 70 kD, 90 kD, 110 kD und andere. Es ist jetzt klar, dass hsp's in allen Zellen durch viele verschiedene umweltbedingte Insulte, einschließlich oxidativer Verletzung, Nährstoffmangel und Infektion mit intrazellulären Phatogenen, induziert werden; wobei die hsp Antwort der Zelle ermöglicht unter andernfalls ungünstigen Bedingungen zu überleben. Obgleich zellulärer Stress die Synthese von hsp's erhöht, werden viele hsp's ebenfalls konstitutiv exprimiert und spielen eine wichtige Rolle bei einer gewöhnlichen Zellfunktion. Die hsp Antwort ist überall in den pro- und eukaryotischen Reichen allgegenwärtig und hsp's gehören zu einigen der am meist konservierten Moleküle.
Hsp65 als charakteristisches Mitglied der zu der hsp Familie gehörenden Proteine kann als ein dominantes Antigen betrachtet werden, da eine Infektion oder Immunisierung mit vielen verschiedenen Bakterien Antikörper und für das hsp65 Molekül (Young et al., 1988) spezifische T-Zellen induziert. In mit Mycobakterium tuberculosis immunisierten Mäusen sind 20% aller auf das Bakterium antwortenden T-Zellen spezifisch für hsp65. T-Zellen mit Reaktivität auf hsp65 wurden interessanterweise ebenso in gewöhnlichen gesunden Individuen identifiziert, die kein klinisches Anzeichen einer Krankheit (Munk et al., 1988) aufweisen.
Lussow et al. (1990) zeigte, dass ein Injizieren bzw. Vorbereiten von Mäusen mit lebendem Mycobakterium tuberculosis var.bovis (BCG) und Immunisierung mit dem repetitiven Malaria synthetischen Peptid (NANP)₄₀, das an gereinigtes Proteinderivat (PPD) konjugiert ist, zu Induktion von hohen und lang-anhaltenden Titern von Anti-Peptid IgG Antikörpern führte. Später berichtete Lussow et al. (1991), dass das mycobakterielle hsp65 ebenso wie das hsp65 von E. coli (GroEL) als Trägermoleküle in Mäusen wirkten, denen zuvor BCG injiziert wurde, um hohe und lang andauernde Titer von IgG gegen das repetitive Malaria synthetische Peptid (NANP)₄₀ zu induzieren. Anti-Peptid Antikörper wurden induziert, wenn das an das mycobakterielle oder E. coli hsp konjugierte Malariapeptid in der Abwesenheit von irgendwelchen Hilfsmitteln verabreicht wurde.
Barrios et al. (1992) haben gezeigt, dass Mäuse, die mit an das 70 kD hsp konjugierten Peptiden oder Oligosacchariden immunisiert wurden, hohe Titer von IgG Antikörpern in der Abwesenheit irgendeiner vorhergehenden Injektion von BCG erzeugten. Der Anti-Peptid Antikörper Antwort bestand für mindestens 1 Jahr. Dieser Hilfsmittel freie Trägereffekt des 70 kD hsp war T-Zell abhängig, da weder Anti-Peptid noch Anti-70 kD IgG Antikörper in athymischen nu/nu Mäusen induziert wurden. Eine vorhergehende Immunisierung mit dem 65 kD oder 70 kD hsp hatte keine negative Auswirkung auf die Induktion von Anti-Peptid Antikörpern nach Immunisierung mit hsp-Peptid Konjugaten in der Abwesenheit von Hilfsmitteln. Eine Vor-Immunisierung mit dem 65 kD hsp könnte darüber hinaus BCG bei einer Bereitstellung einer effektiven Injektion für die Induktion von Anti-(NANP)₄₀ Antikörpern ersetzen. Der Trägereffekt von mycobakteriellem hsp65 und hsp70 für konjugierte Peptide wurde ebenso in nicht-menschlichen Primaten (Perraut et al., 1993) gezeigt.
Es kann angenommen werden, das einige T-Zellepitope in der Sequenz des bakteriellen hsp65 Proteins eine Immundominanz zeigen und in der Lage sind ein immunologisches Gedächtnis zu induzieren, wohingegen andere keine bevorrechtigte immunologische Erkennung exprimieren oder in die Induktion von Autoimmunerkrankungen einbezogen sind. Ein Unterscheiden zwischen funktionell verschiedenen T-Zellepitopen, die an mehrere verschiedenen MHC Moleküle binden, kann zur Identifizierung von allgemeinen immunogenen Peptiden führen, die als sichere, bestimmte und wirksame Alternativen für Trägermoleküle von T-ind Antigenen befähigt sein können.
Die israelische Patentanmeldung 102687 derselben Anmelder beschreibt spezifische T-Zellepitope von menschlichem hsp65 und Analogen davon, die an schwach immunogene Moleküle konjugiert sind.
Keine der vorstehend erwähnten Quellen beschreibt spezifische T-Zellepitope, die aus der Sequenz von hsp65 von E. coli (GroEL) abgeleitet und an schwach immunogene Moleküle konjugiert sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens die Immunogenität von schwach immunogenen Antigenmolekülen zu erhöhen, wodurch sie zu geeigneten Antigene für eine Immunisierung umgewandelt werden.
Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung Konjugate eines schwach immunogenen Antigens und eines synthetischen Peptidträgers bereit, der ein aus der Sequenz von E. coli hsp65 (GroEL) Pep278e oder ein Analog davon abgeleitetes T-Zellepitop darstellt, wobei mindestens 70% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität von Pep278e konserviert sind und wobei das Peptid oder Analog die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich bzw. maßgeblich erhöhen können.
Irgendein Peptid oder Analog davon, die vom ein T-Zellepitop darstellendes GroEL Pep278e Peptid abgeleitet sind und die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich erhöhen können, können in der Erfindung verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Peptid, hierin als 278e bezeichnet, entspricht den Positionen 437–453 des GroE1 Moleküls und weist die Sequenz auf:
Das schwach immunogene Antigenmolekül kann ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein, beispielsweise ein vom HIV-Virus oder vom Malariaantigen abgeleitetes Peptid, oder ein bakterielles Polysaccharid, beispielsweise Kapselpolysaccharide von Haemophilus influenza Typ b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Gruppe B Streptokokken, E. coli Typ K1, Salomonella, wie beispielsweise Salmonella typhi, usw., sein.
Das Trägerpeptid ist an das schwach immunogene Antigen entweder unmittelbar oder über einen Spacer kovalent gebunden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Impfstoffe bzw. Schutzstoffe, die ein erfindungsgemäßes Konjugat oder eine Mischung aus dem schwach immunogenen Antigen und dem geeigneten Peptidträger umfassen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Immunisierungsverfahren eines Säuger-Wirts, welches eine Verabreichung einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Konjugats oder Co-Verabreichung effektiver Mengen eines schwach immunogenen Antigenmoleküls und eines synthetischen Peptidträgers, der ein aus der Sequenz des GroEL Pep278e Peptids oder eines Analogen davon abgeleitetes T-Zellepitop darstellt, an den Wirt umfasst, wobei das Peptid oder Analog die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich erhöhen können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt Lymphknoten Proliferation an die 278 Epitope 278e, 278m und 278cox nach Immunisierung von BALB/C Mäusen mit 20 μg 278 Epitop, das in unvollständigem Freund's Hilfsmittel (IFA) emulgiert wurde.
Die 2a–c zeigen Lymphknoten Proliferation an 278e und an das Kontrollpeptid ACR 259–271 nach Immunisierung von B10RIII Mäusen (2a), B10.BR Mäusen (2b) und B10.S Mäusen (2c) mit in IFA emulgiertem 20 μg 278e.
Die 3 zeigt Lymphknoten Proliferation an die Peptide 278e, 278m und AcR259–271 nach Immunisierung von BALB/c Mäusen mit 2 μg Vi-Fragmenten, die an 278 Homolog konjugiert wurden, oder mit 2 μg Vi-Fragment allein.
Die 4 zeigt Lymphknotenproliferation an die Peptide 278e, 278m und AcR259–271 nach Immunisierung von BALB/C Mäusen mit 20 μg Vi-Fragmenten, die an 278 Homolog konjugiert wurden, oder mit 2 μg Vi-Fragment allein.
Die 5 zeigt die Serum anti-Vi IgG Antikörperantwort, die durch Vi-Fragmente allein oder Vi-Fragment-Konjugate 278h-Vi, 278m-Vi und 278e-Vi in BALB/C Mäusen induziert wurde. Die injizierte Polysaccharidmenge betrug in jeder Gruppe 2 μg. Primäre und sekundäre Immunantworten sind dargestellt. Ergebnisse werden bei einer Serumverdünnung von 1:100 gezeigt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Bevorzugte erfindungsgemäße Konjugate werden durch kovalentes Binden des Peptids 278e mit einem bakteriellen Polysaccharid, beispielsweise des Kapselpolysaccharids (CPS) Vi von Salmonella typhi, nachstehend als Vi oder Vi-Fragmente bezeichnet, einem linearen Homopolymer von an der C₃-Position unterschiedlich O-acetyliertem Poly-α-(1–4)GalNAc, wie in Schema 1 gezeigt, gebildet. Das native Vi Molekül weist ein Molekulargewicht von ungefähr 3 × 10³ kD (Vi) auf. Vi-Fragmente (ungefähr 45 kD) werden durch Teilung bzw. Spaltung mit Ultraschall erzeugt, welche die Struktur seiner Monomereinheiten nicht ändert und welche ein verhältnismäßig homogenes Polysaccharid (Stone & Szu, 1988) erzeugt. Vi/Vi-Fragmente allein, wie andere CPSs, lösen nicht eine verstärkte Antwort (booster response) in Säugern, weder in Tieren noch in Menschen, bei wiederholter Injektion aus, wobei allerdings seine/ihre Immunogenität erhöht ist, wenn als ein erfindungsgemäßes Konjugat verbunden mit einem von GroEL oder einem Analog davon abgeleiteten geeigneten Peptid oder in einer Mischung mit einem solchen Peptid oder Analog dargeboten. Wiederholte Injektion des Vi-Peptid Konjugats induziert eine Zunahme bei dem Niveau von anti-Vi Antikörpern (Verstärkungseffekt), die hauptsächlich durch den IgG Isotypen verkörpert werden.
Das erfindungsgemäße Peptid 278e ist von den Peptiden 278h und 278m der vorstehend erwähnten israelischen Patentanmeldung 102687 eindeutig verschieden.
278e N E D Q N V G I K V A L R A M E A
278h N E D Q K I G I E I I K R T L K I
278m N E D Q K I G I E I I K R A L K I
Das Peptid 278e ist ein hochgeladenes und hydrophobes Molekül. Daher sind 5 von 17 einzelnen Aminosäuren (3 negativ und 2 positiv) bei einem physiologischen pH ionisiert. Fünf Aminosäurereste sind hydrophob. 3 Reste sind darüber hinaus amidiert und können eine wesentliche Wasserstoffbrückenbindung bilden. Das Peptid ist weiterhin durch Besitz einer polaren negativ geladenen N-terminalen Domäne, einer polar geladenen C-terminalen Domäne und eines hoch hydrophoben Kern gekennzeichnet. 278e kann modifiziert werden, während die Aktivität beibehalten wird. Um jedoch die Aktivität beizubehalten, sollten die gesamten strukturellen Eigenschaften beibehalten werden. Daher können die Positionen 2, 3 und 16 entweder durch entweder E oder D und die Positionen 9 und 13 durch entweder K oder R besetzt werden. Konservierung der Ladung an den Positionen 9 und 13 (positiv zu negativ oder umgekehrt) wird zu aktiven Peptiden führen. Eine Wasserstoffbrücken bildende Aminosäure, vorzugsweise N und Q, sollten die Positionen 1 und 4 besetzen.
Hydrophobizität an den Positionen 6, 8, 10, 12 und 15 sollte durch Einfügen von hydrophoben Aminosäuren, natürlichen wie beispielsweise I, L, V, M oder F oder nicht-natürlichen wie beispielsweise Norleucin (Nle) oder Norvalin (Nva), beibehalten werden.
Der Begriff "Analoge" in der vorliegenden Erfindung betrifft Pep278e Peptide, die durch Ersetzen, Beseitigen oder Zufügen von Aminosäureresten zu der Sequenz des T-Zellepitops erhalten werden, so lange wie sie die Immunogenität von schwach immunogenen Antigenmolekülen wesentlich erhöhen können. Analoge sind im Fall des Peptids 278e derartige Peptide, dass mindestens 70%, vorzugsweise 90–100%, der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität des Peptidmoleküls konserviert werden. Diese Peptide können gemäß den Anweisungen in dem hierin vorstehenden Abschnitt erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können alle die optisch aktiven Aminosäurereste in L oder D Form aufweisen, oder einige der Aminosäurereste sind in L und andere sind in D Form.
Mit einem "wesentlichen" Erhöhen der Immunogenität eines schwach immunogenen Antigenmoleküls wird ein Umfassen sowohl von der Induktion einer Zunahme bei dem Niveau von Antikörpern gegen das Antigen als auch das Darbieten der Antikörper hauptsächlich im IgG Isotyp gemeint.
Der Peptidträger kann mit dem Antigenmolekül unmittelbar oder durch einen Spacer verbunden sein.
Eine unmittelbare Verbindung zwischen dem Peptid und Vi oder Vi-Fragmenten ist in Schema 1 hierin gezeigt, worin das Konjugat
durch das Verfahren 1, wie nachstehend beschrieben, erhalten wird.
Der Spacer kann die Formel -O-R-CO oder -NH-R-CO aufweisen und daher jeweils einen Ester oder ein Amid mit der Carboxylgruppe des Vi oder der Vi-Fragmente und eine Peptidbindung mit der terminalen Aminogruppe des Peptids bilden; oder -NH-R-CH₂-, wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette darstellt, die wahlweise durch ein oder mehrere aromatische Radikale oder durch Heteroatome, wie beispielsweise O, S oder N, substituiert und/oder unterbrochen ist. R ist vorzugsweise eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette, die 3–16 Kohlenstoffatome, wie beispielsweise den Rest von ε-Aminocapronsäure, enthält.
Schema 1:
Das Konjugat mit der Formel:
worin Ac Acetyl ist, AC den Rest von ε-Aminocapronsäure darstellt, Pep den Rest des Peptidträgers 278e oder eines Analogen davon darstellt und der Saccharidrest eine wiederholende Einheit des Vi Kapselpolysaccharids (Vi oder vi-Fragmente) von Salmonella typhi darstellt, können gemäß dem Verfahren 2 hergestellt werden, das in Schema 1 gezeigt und nachstehend detailliert beschrieben wird.
Die Konjugate, worin der Spacer -NH-R-CH₂- ist, werden durch Reduktion von -NH-R-CO- Gruppen oder durch Alkylierung cm des Peptid Aminoterminus mit -NH-R-CH₂-X erhalten, wenn X eine geeignete Abgangsgruppe wie beispielsweise ein Halogenid darstellt.
Die Erfindung betrifft weiterhin Impfstoffe, die ein erfindungsgemäßes Konjugat umfassen. Diese Impfstoffe können über irgendeine geeignete Route, beispielsweise oral oder über die subkutane Route in für menschliche und tierärztliche Zwecke geeigneten Vehikeln, verabreicht werden.
Die Erfindung wird jetzt durch die nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele beschrieben werden:
Beispiele
In den Beispielen werden die nachstehenden Materialien und Methoden verwendet werden.
Materialien & Methoden

a. Materialien: Alle Lösungsmittel und Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden von Aldrich, U.S.A., es sei denn dass anders erwähnt, bezogen.
b. Peptidsynthese: Das Peptid 278e wurde mit einem automatisierten Synthesizer (Applied Biosystem Modell 430A, Deutschland) unter Verwendung der Betriebsprotokolle für ein t-Butyloxycarbonyl (BOC) Strategie (Kent et al., 1984) hergestellt.

Die nachstehenden Kontrollpeptide wurden synthetisiert:
Peptid 278h, das den Positionen 458–474 des menschlichen hsp65 Moleküls entspricht, 278m, das den Positionen 458–474 des hsp65 der Maus entspricht, und 278cox, das den Positionen 437–453 des Coxiella burnetti hsp65 Proteins entspricht, wobei die Kontrollpeptide die nachstehend beschriebenen Sequenzen aufweisen:
Ein weiteres Kontrollpeptid, AcR259–271 entspricht den Positionen 259–271 der Acetylcholin-Rezeptor α-Kette der Maus und weist die Sequenz auf
V I V E L I P S T S S A V
Dieses Peptid wird von T-Zellen im Zusammenhang mit MHC Klasse II Molekülen des H-2d Haplotyps erkannt.

c. Umgekehrte-Phasen-HPLC: Die Reinheit der Peptidprodukte wurde unter Verwendung der analytischen HPLC Säule RP18 (Merck, Darmstadt, Deutschland) unter Einsatz des SP8750n Flüssig-Chromatographiesystems, das mit einem SP8733 Detektor veränderlicher Wellenlänge ausgestattet ist, in 0.1% Trifluoressigsäure (TFA) enthaltendem Wasser-Acetonitril Gradienten beurteilt bzw. abgeschätzt. Die Abflüsse wurden durch UV Absorption bei 220 nm überwacht. Acetonitril mit HPLC Qualität wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Peptide wurden weiterhin durch Aminosäureanalyse analysiert.
d. Vi: Das von Citrobacter freundii WR7011 (freundlicherweise von J. B. Robbins und S. C. Szu geschenkt, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A.) enthielt < 1% (jedes) Proteins, Nukleinsäure und Lipopolysaccharids. Die molekulare Größe des Vi wurde auf 3 × 10³ kD beurteilt. Die Vi-Fragmente von ungefähr 45 kD wurden durch Beschallung mit Ultraschall hergestellt und wurden freundlicherweise von Dominique Schulz (Pasteur-Merieux, Frankreich) zur Verfügung gestellt.
e. Verbinden von Vi und Vi-Fragmenten mit einem Peptid: Verfahren 1 (siehe Schema 1) Konjugation von Vi/Vi-Fragmenten und Peptid ohne einen Spacer. Ein Teil des Vi/Vi-Fragments und ein Teil des Peptids wurden in einem Minimalvolumen von doppelt destilliertem Wasser (ddw) gelöst und 12 Stunden bei Raumtemperatur (RT) und pH6 in der Gegenwart von zwei Teilen wasserlöslichem Carbodiimid (CDI; 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid Hydrochlorid) inkubiert. Nach Dialyse der Reaktionsmischung wurde die Peptiddichte in dem Konjugat durch Aminosäureanalyse bestimmt und der Zuckergehalt des Konstrukts mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) beurteilt. Verfahren 2 (siehe Schema 1) Verbinden von Vi/Vi-Fragmenten und Peptid, gefolgt von Verlängerung der Peptidkette durch einen Spacer in Lösung. Um die Carboxyl-Funktion der tBoc-ε-Aminocapronsäure (t-Boc-AC) mit N-Hydroxysuccinimid zu aktivieren, wurden 1 mmol t-Boc-AC mit 1,15 mmol N-Hydroxysuccinimid in einem Minimalvolumen von Dioxan (Merck, Deutschland) gemischt; 1,15 mmol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), gelöst in Dioxan, wurde zugegeben und nach 3 Stunden wurde die Reaktionsmischung filtriert und mit Dioxan gewaschen. 0,1 mmol des gewünschten Peptids wurden in einer kleinen Menge ddw gelöst und mit 0,2 mmol KHCO₃ (Merck) gemischt. Die Lösung, in Dioxan, des N-Hydroxysuccinimidesters von t-BocAC und der bereiteten Peptidlösung wurden gemischt und 1 Stunde unter starkem Mischen zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit ddw (10 ml) verdünnt, gekühlt und mit 1 N KHSO₄ Lösung angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Lösung wurde mit ddw gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne evaporiert. Nach Trocknen des Produkts für 2 Stunden über P₂O₅, seinem Lösen mit 4–5 ml TFA und 10 Minuten reagieren lassen, wurde die Flüssigkeit im Vakuum bei 30°C evaporiert. Die Verbindung wurde zweimal mit CH₂Cl₂ gewaschen und das Fluid evaporiert, bevor über P₂O₅ für 2–3 Stunden getrocknet wurde. Anschließend wurde das Peptid-AC Produkt in ddw gelöst und der pH auf 8 eingestellt. Fünf mg N-Hydoxysuccinimidester (hergestellt wie in Verfahren 2 der israelischen Patentanmeldung 102687 beschrieben) des/der Vi/Vi-Fragmente wurden hinzugegeben. Nach mehreren Stunden Inkubation wurde das entstehende Vi-AC-Peptid Konjugat gegen ddw dialysiert. Die Peptiddichte in dem Konjugat wurde mittels Aminosäureanalyse beurteilt.
f. Immunisierung: Weibliche Mäuse, zu verschiedenen Stämmen gehörend, 2–3 Monate alt, wurden subkutan (sc) zweimal, im Abstand von 4 Wochen, mit Vi/Vi-Fragment allein oder dem Vi/Vi-Fragment-Konjugat immunisiert. Die injizierte Menge an Antigen war von Versuch zu Versuch verschieden und wird in den Fig. angezeigt. Das verwendete Hilfsmittel war in allen Fällen IFA. Mäuse von jeder Versuchsgruppe wurden 12 Tage nach jeder Injektion geblutet.
g. Serologie: Mit nativem oder konjugiertem Vi in Mäusen erzeugte Vi/Vi-Fragment Antikörper Niveaus wurden durch einen enzymgebundenen Immunoassay (ELISA) nachgewiesen. Da negativ geladene Polysaccharide an das bei der Festphasen ELISA gewöhnlich verwendete Polystyrol nicht gut haften, wurde positiv geladenes methyliertes Rinder-Serumalbumin (BSA) verwendet, um Vi/Vi-Fragmente auf der festen Oberfläche mit sehr geringem nicht-spezifischen Binden zu beschichten. Im Einzelnen wurden 0,5 mg Vi in 1 ml PBS gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Zehn mg methyliertes BSA (Sigma) wurden in 1 ml H₂O gelöst und die erhaltene Lösung wurden durch einen 0,8 μm Filter filtriert. Um die Beschichtungslösung herzustellen wurde 1 ml gelöstes Polysaccharid mit 50 μl der methylierten BSA Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 1:20 in PBS verdünnt. Nuclon Delta Si Microwell Platten wurden 3 Stunden bei 37°C mit 100 μl Beschichtungslösung pro Vertiefung (2,5 μg Vi/Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden fünfmal mit PBS gewaschen, das 0,33% Brij35 (Sigma) enthält, und mit einer Lösung von PBS und 1% getrockneter Magermilch für 2 Stunden bei 37°C blockiert. Nach dem Waschen, wurden 100 μl Aliquots von verdünnten unbekannten Sera und von verdünntem Standartserum (Verdünnungspuffer, der 1% Magermilch und 0,33% Brij35 in PBS enthält) hinzugegeben und die Platten wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Referenz und Testsera wurden auf die Platten in doppelter Ausfertigung aufgebracht. Die nicht-gebundenen Antikörper wurden durch Waschen entfernt und eine 1:5000 Verdünnung von Ziegen Anti-Maus IgG Fab₂-alkalische Phosphatase Konjugat (Sigma), im Fall der Testsera, und Hasen Anti-Pferd IgG Fab₂-Enzymkonjugat, im Fall des Standartserums, zu den Platten (100 μl/Vertiefung) hinzugegeben. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37°C, wurden die Platten gewaschen und der gebundene Antikörper durch die Zugabe von 100 μl Substratlösung sichtbar gemacht, die 0,6 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma) in Diethanolamin-H₂O pH 9.8 enthält. Die Enzymreaktion wurde 20 Minuten später durch die Zugabe von 10 μl 5 N NaOH pro Vertiefung gestoppt. Optische Dichten wurden bei 405 nm gelesen. Das anti-Vi Standartserum Burro 260, das 550 mg Vi Antikörper/ml enthält, wurde durch mehrfache intravenöse Injektionen von Formalin-fixiertem Salmonella typhi Ty2 (freundlicherweise von J. B. Robbins und S. C. Szu geschenkt, NIH, Bethesda, Maryland, U.S.A.) hergestellt. Die erzielten Ergebnisse wurden als optische Dichte, gelesen bei 405 nm, ausgedrückt.
h. Lymphknoten Proliferation nach Peptid-Immunisierung: Gruppen von 3 Mäusen des bezeichneten Mäusestammes wurden in die Fußballen mit 20 μg Peptid sc immunisiert, das in 0,2 ml IFA/PBS (0,1 ml/Fuß) emulgiert ist. Dränage Lymphknoten wurden 10 Tage später entnommen Lymphknotenzellen (LNC) der immunisierten Maus (5 × 10⁶/Vertiefung) wurden in der Anwesenheit von verschiedenen Antigenen kultiviert. Kulturen wurden in 200 μl Eagles Medium in Mikrotiterplatten mit runden Böden (Falcon) bereitet, das mit 2 mM Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 1% gen-identisches gewöhnliches Mausserum enthaltendes 5 × 10⁵ M β-Mercaptoethanol (Fluka AG, Buchs, Schweiz) ergänzt wurde. Nach vier–fünf Tagen Inkubation wurde ³H-Thymidin (0,5 mCi von 5 Ci/mmol, Nuclear Research Center, Negev, Israel) hinzugefügt. Sechzehn Stunden später wurden die Zellen geerntet und die Radioaktivität gezählt. Ergebnisse sind als Zahlen (counts) pro Minute (cpm) oder als Stimulierungsindizes (SI) ausgedrückt. Der SI wurde als das Verhältnis von dem durchschnittlichen cpm der Testkulturen (mit Antigen) und dem durchschnittlichen cpm von Kontrollkulturen (ohne Antigen) festgelegt.

Beispiele
Beispiel 1: Zubereitung der Vi-Peptid Konjugate
Konjugate von Vi/Vi-Fragmenten mit Peptid 278e und den Kontrollpeptiden wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Die Zusammensetzung der Vi-Peptid Konjugate ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das molare Verhältnis an Peptid pro Zuckermonomer veränderlich war. Es zeigte sich, dass Peptiddosen von 0,8–2,2 μg, die pro Maus als Zucker-Peptid Konjugat injiziert wurden, am effektivsten waren.
Beispiel 2: Lymphknoten Zell Proliferation an Peptid 278e in verschiedenen Mausstämmen mit verschiedenem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Hintergrund.
2.1. Lymphknoten Proliferation nach Immunisierung mit freiem Trägerpeptid. Um zu überprüfen, ob das Peptid 278e durch das Immunsystem im Zusammenhang mit verschiedenen Allelen des MHC der Maus erkannt werden kann, wurden 2–3 Monate alten weiblichen Mäusen (3 Tiere pro Gruppe) 20 μg freies Peptid 278e sc injiziert, das wie hierin in Material & Methoden und spezifischer Proliferation von Lymphknotenzellen an das Peptid 278e und Kontrollpeptide beschrieben emulgiert war.
LNCs von BALB/c (H-2d) Mäusen, die mit dem Peptid 278e geimpft waren, zeigten, wie in 1 gezeigt, eindeutig spezifische proliferative Antworten auf das letztere, wohingegen keine Proliferation bei dem Kontrollpeptid 278m und 278cox auftrat. Mit dem Peptid 278e bereitete LNCs zeigen daher keine Kreuzreaktion mit dem homologen Selbst-Peptid 278m, das aus der Sequenz des hsp65 der Maus abgeleitet ist.
Die 2a–c zeigen, dass das Peptid 278e ebenso in den drei verschiedenen gengleichen B10 Mausstämmen erkannt wurde. LNCs von B10.RIII Mäusen (H-2^r) (2a), B10.BR Mäuse (H-2^k) (2b) und B10.S Mäuse (H-2s) (2c) zeigten signifikant höhere proliferative Antworten auf das Peptid 278e in den angegebenen Peptidkonzentrationen als auf das Kontrollpeptid AcR259–271.
2.2. Lymphknoten Zell Proliferation an das Peptid 278e nach Immunisierung mit dem an Vi-Fragmente konjugiertem Peptid 278e. Um zu überprüfen, ob ein Binden des Peptids 278e an die Polysaccharid Vi-Fragmente seine antigene Struktur ändert, wurde die LNC Antwort auf das Peptid allein nach Immunisierung mit dem Zucker-Peptid Konjugat getestet. Die 3 und 4 zeigen vernehmlich, dass durch Vi-Fragmente-278e in BALB/c Mäusen ausgelöste LNCs das nicht-konjugierte Peptid erkennen können, wenn mit 2 μg Vi-Fragmenten/Maus (3) oder 20 μg Vi-Fragmenten/Maus (4) als Zucker-Peptid Konjugat (für die zugehörige injizierte Peptidmenge siehe Tabelle 1) immunisiert wurde.
Tabelle 1
Beispiel 3. Antigenizität von an das Peptid 278e konjugierten Vi-Fragmenten.
Um zu untersuchen, ob das an Vi-Fragmente konjugierte Peptid 278e die Immunantwort auf dieses T-ind Antigen erhöhen kann, wurde die Immunantwort auf den Zucker nach Injektion von fünf BALB/c Mäusen mit dem Zucker-Peptid-Konjugat untersucht. Die 5 zeigt eindeutig, dass das an Vi-Fragmente kovalent gebundene Peptid 278e die Zucker-spezifische IgG Antikörpererzeugung wesentlich erhöhen kann. Immunisieren der Mäuse mit einer zweiten Dosis des Konjugats führte zu einem stärkeren Verstärkungseffekt, der die Beteiligung von T-Zellen in die Zucker-spezifische Immunantwort anzeigt. Injizieren von BALB/c Mäusen mit dem nicht-konjugierten Polysaccharid induzierte nur unerhebliche Niveaus an spezifischen Antikörpern. Die durch Vi-Fragmente-278e induzierte Immunantwort wird mit jener verglichen, die durch den an das Peptid 278h und 278m konjugierten Zucker ausgelöst wird.
Die vorstehenden Versuche bieten einen Beleg, dass das Peptid 278e in Zusammenhang mit einer großen Auswahl an Allelen von MHC Molekülen der Maus erkannt werden kann und als Trägerepitop zum Induzieren von erhöhten Immunreaktionen auf schwach immunogene Moleküle verwendet werden kann. Dieser Beleg kann wie nachstehend zusammengefasst werden:

(i) Bereitete LNCs von Mausstämmen mit verschiedenem genetischen MHC-Hintergrund konnten des Peptid 278e durch Aufweisen spezifischer proliferativer Antworten erkennen.
(ii) Konjugieren des Peptids 278e an Vi-Fragmente änderte seine antigene Struktur nicht, da LNCs, die mit an das Polysaccharid verbundenen LNCs bereit waren, immer noch das nicht-gebundene Peptid in einem in-vitro Lymphknoten Proliferationsassay erkennen konnten.
(iii) Die Immunogenität der Vi-Fragmente wurde erhöht, wenn dem Immunsystem als ein an das Peptid 278e verbundenes Konjugat dargeboten.

Die Tatsache, dass LNCs, die mit dem Peptid 278e bereitet waren, mit dem homologen Peptid 278m der Maus keine Kreuzreaktion aufwiesen, zeigt, dass das als Trägerepitop verwendete Peptid 278e wahrscheinlich keine gegen eigene Bestandteile gerichtete Immunantworten induzieren wird.
Da die Immunreaktion auf das Peptid 278e nicht auf Mäuse genetisch eingeschränkt zu sein scheint, könnten dieses synthetische Peptid und Analoge davon als allgemeingültige Träger zur Herstellung von immunogenen Konjugaten verwendet werden, um eine schützende Immunität gegen verschiedene phatogene Wirkstoffe bereitzustellen, und können für die Entwicklung von künstlichen Impfstoffen geeignet sein.
Referenzen

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Claims

Konjugat eines schwach immunogenen Antigens und eines synthetischen Peptidträgers, welcher ein T-Zellepitop darstellt, das von der Sequenz von E. coli hsp65 (GROEL), die hierin Pep278e genannt wird, welche den Positionen 437–453 des E. coli hsp65-Moleküls entspricht, abgeleitet ist, oder ein Analog desselben, wobei zumindest 70% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität von Pep278e bewahrt bleiben, wobei das Peptid oder das analog desselben in der Lage ist, die Immunogenizität des schwach immunogenen Antigens maßgeblich zu vergrößern.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der synthetische Peptidträger oder das Analog kσvalent am schwach immunogenen Antigen gebunden ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das schwach immunogene Antigen ein Peptid, ein Protein oder ein Polysaccharid ist.
Konjugat gemäß Anspruch 3, wobei das schwach immunogene Antigen ein aus HIV-Virus oder aus Malaria-Antigen erhaltenes Peptid ist.
Konjugat gemäß Anspruch 3, wobei das schwach immunogene Antigen ein bakterielles Polysaccharid ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der synthetische Peptidträger, der hier als Pep278e bezeichnet wird, oder ein Analog von Pep278e den Positionen 437–453 des E. coli hsp65-Moleküls entspricht, welches die Sequenz aufweist:
in dem der Rest N⁴³⁷ entweder N oder Q ist; der Rest E⁴³⁹ entweder E oder D ist; der Rest D⁴³⁹ entweder D oder E ist; der Rest E⁴³⁷ entweder E oder D ist; der Rest Q⁴⁴⁰ entweder Q oder N ist; der Rest K⁴⁴⁵ entweder K oder R ist; der Rest V⁴⁴² I, L, V, M, F, Norleucin (Nle) oder Norvalin (Nva) ist; der Rest I⁴⁴⁴ I, L, v, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest v⁴⁴⁶ I, L, V, M, P, Nle oder Nva ist; der Rest L⁴⁴⁸ L, I, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest R⁴⁴⁹ entweder R oder K ist; und der Rest M⁴⁵¹ M, I, V, L, F, Nle oder Nva ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der synthetische Peptidträger oder sein Analog direkt an das schwach immogene Antigenmolekül gebunden ist.
Konjugat gemäß Anspruch 7, wobei das schwach immunogene Antigenmolekül ein bakterielles Polysaccharid ist.
Konjugat gemäß Anspruch 8, wobei das bakterielle Polysaccharid das Kapsel-Polysaccharid (CPB) Vi aus Salmonella typhi ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der synthetische Peptidträger oder sein Analog mit dem schwach immunogenen Antigenmolekül durch einen Abstandhalter verknüpft ist, der ausgewählt ist aus -O-R-CO-, NH-R-CO-, NH-R-NH, O-R-NH- oder -NH-R-CH₂-, wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette ist.
Konjugat gemäß Anspruch 10, wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette ist, die durch eine oder mehrere aromatische Reste substituiert und/oder unterbrochen ist.
Konjugat gemäß Anspruch 10, wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette ist, die durch ein oder mehrere aus N, O oder S ausgewählte Heteroatome substituiert und/oder unterbrochen ist.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 10 bis 12, wobei R eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette ist, die 3–16 Kohlenstoffatome enthält.
Konjugat gemäß Anspruch 13, wobei R der Rest der ε-Aminocapronsäure ist.
Konjugat gemäß Anspruch 16 der Formel
wobei Ac Acetyl ist, AC der Rest der ε-Aminocapronsäure ist, Pep der Rest des Peptidträgers Pep278e ist und der Saccharidrest eine Wiederholungseinheit des Vi-Kapselpolysaccharids von Salmonella typhi repräsentiert.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, das in der Lage ist, einen T Lymphozytenhelfereffekt zu erzeugen, der zu einer für T-abhängige Antigene charakteristischen Immunantwort führt.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, das bei Reinjektion eine Boosterreaktion hervorruft, die zu einem Anstieg der Menge von Antikörpern gegen das schwach immunogene Antigenmolekül führt.
Konjugat gemäß Anspruch 17, welches Antikörper hauptsächlich des IgG-Isotyps induziert.
Vakzin, umfassend ein Konjugat, wie in Anspruch 1 beansprucht.
Verfahren zum Verstärkern der Immunogenizität eines schwach immunogenen Antigenmoleküls, welches sein verbinden mit einem synthetischen Peptidträger umfasst, der ein T-Zellepitop darstellt, das von der Sequenz von E. coli hsp65, hier als Pep278e bezeichnet, welches den Positionen 437–453 des E. coli hsp55-Moleküls entspricht, abgeleitet ist, oder ein Analog desselben, wobei zumindest 70% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität von Pep278e bewahrt sind, wobei das Peptid oder Analog in der Lage ist, die Immunogenizität des schwach immunogenen Antigenmoleküle maßgeblich zu vergrößern.
Verfahren zum Verstärken der Immunogenizität eines schwach immunogenen Antigenmoleküle, welches sein Mischen mit einem synthetischen Peptidträger umfasst, der ein T-Zellepitop darstellt, das von der Sequenz von E. coli hsp65, hier als Pep278e bezeichnet, welches den Positionen 437–453 des E. coli hsp65-Moleküls entspricht, abgeleitet ist, oder ein Analog desselben, wobei zumindest 70% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität von Pep278e bewahrt sind, wobei das Peptid oder Analog in der Lage ist, die Immunogenizität des schwach immunogenen Antigenmoleküls maßgeblich zu vergrößern.
Verfahren gemäß Anspruch 20 oder 21 zum Verstärken der Immunogenizität von bakteriellen Polysacchariden.
Verwendung eines Konjugats gemäß einem der vorstehenden Ansprüche für die Herstellung eines Vakzins zur Immunisierung eines Säugerwirts.
Verwendung eines synthetischen Peptidträgers, der ein T-Zellepitop darstellt, das von der Sequenz von E. coli hsp65, die hier als Pep278e bezeichnet wird, welche den Positionen 437–453 des E. coli hsp65-Moleküls entspricht, abgeleitet ist, oder ein Analog desselben, bei der Herstellung eines Medikamentes, welches das Peptid oder Analog und ein schwach immunogenes Antigenmolekül bei der Immunisierung eines Säugerwirts umfasst, wobei zumindest 70% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität von Pep278e bewahrt sind, wobei das Peptid oder Analog in der Lage ist, die Immunogenizität des schwach immunogenen Antigens maßgeblich zu verstärken.
Verwendung eines synthetischen Peptidträgers gemäß Anspruch 6 in der Herstellung eines Medikaments, welches das Peptid oder Analog und ein schwach immunogenes Antigenmolekül bei der Immunisierung eines Säugerwirts umfasst, wobei das Peptid oder Analog in der Lage ist, die Immunogenizität des schwach immunogenen Antigens maßgeblich zu verstärken.