DE69528074T2

DE69528074T2 - Chitosan induzierte verstärkung

Info

Publication number: DE69528074T2
Application number: DE69528074T
Authority: DE
Inventors: Balbir Bhogal; Kuang Hsu; S. Podolski; Gurpreet Singh
Original assignee: Zonagen Inc
Current assignee: Repros Therapeutics Inc
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-25
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2015-09-26
Also published as: WO1996009805A2; DK0789590T3; CA2200550A1; PT789590E; ATE223235T1; EP0789590B1; WO1996009805A3; AU688603B2; JP3365635B2; JP2001509774A; EP0789590A2; ES2182914T3; AU3683095A; DE69528074D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Zusammensetzungen zur Verstärkung einer Immunreaktion in einem Tier, auf Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen und zur Verwendung der Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer Immunreaktion in einem Tier. Spezifischer stellt die Erfindung Adjuvantien bereit, die im Wesentlichen aus einer Kombination aus Chitosan mit einem chelatierten Metall bestehen, Immunogene, die im Wesentlichen aus einem Antigen in Kombination mit dem Adjuvans bestehen, Verfahren zur Herstellung des Adjuvans oder des Immungens, sowie die Verwendung des Immungens bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung der Immunreaktion in einem Tier.

Hintergrund der Erfindung

Kürzlich erfolgte biotechnologische Fortschritte haben die Identifikation von Komponenten in komplexen Antigenen erleichtert, was Anlass zur Hoffnung gibt, dass die Entwicklung von sicheren und praktischen Impfstoffen erfolgreich sein wird. Oftmals sind diese isolierten und ausgewählten Komponenten jedoch nicht so immunogen wie die vollständigen und komplexen Antigene, von denen sie herrühren. Um eine Immunreaktion auf das nur schwach antigene Immunogen in einem Empfängertier zu verstärken, werden häufig Adjuvantien zusammen mit dem Immungen verabreicht. Trotz der allgemein herrschenden Akzeptanz für diese Adjuvantien ist die Anzahl an solchen, die auch zur Verwendung beim Menschen geeignet sind, beschränkt.
Idealerweise sollte ein Adjuvans eine lang anhaltende Expression von funktionell aktiven Antikörpern verstärken, zellvermittelte Immunität (CMI) auslösen und die Produktion von Memory-T- und β-Lymphozyten mit hoher spezifischer Immunreaktivität gegen ein eindringendes Antigen verbessern. Zusätzlich zur Bereitstellung der Verteidigung gegen die unmittelbare Bedrohung durch ein fremdes Antigen sollten diese Reaktionen Schutz gegen das zukünftige Aufeinandertreffen des Wirts mit einem spezifischen Antigen bieten. Noch wichtiger ist aber die Fähigkeit eines Adjuvans, die Immunreaktion mit einem Minimum an toxischen Nebenwirkungen zu verstärken. Aus diesem Grund wird die Wirksamkeit eines Adjuvans hinsichtlich dessen beschrieben, wie es positive (verstärkte Immunität) und negative (Toxizität) Einflüsse ausbalanciert.
Gesteuerte Immunisierung zum Zwecke der Antikörperproduktion durch B-Zellen hängt von unzähligen Faktoren, sowohl des Antigens selbst als auch des immunisierten Tieres ab. Je weiter das Antigen oder seine Quelle in seiner Entwicklung vom befallenen Wirt entfernt ist, desto effektiver ist im Allgemeinen die durch das Antigen ausgelöste Immunreaktion. Antigene, die von weitschichtig verwandten Spezies abstammen, sind in der Auslösung einer Antikörperproduktion aufgrund der Tatsache, dass das Immunsystem des Wirts nicht fähig ist, klar zwischen den fremden Antigenen und den endogenen Antigenen zu unterscheiden, weniger kompetent. Zusätzlich dazu sind auch die Dosierung des Antigens, die Reinheit des Antigens sowie die Häufigkeit, mit der das Antigen verabreicht wird, Faktoren, die nicht unwesentlich zum resultierenden Antikörper-Titer und zur Spezifität der sich ergebenden Antikörper beitragen. Andere Faktoren umfassen die Form oder Komplexität des Antigens und wie das Antigen verabreicht wird. Schließlich tragen sowohl die genetische Zusammensetzung als auch der physiologische Gesamtzustand des immunisierten Tiers dazu bei, in welchem Ausmaß sich eine Immunreaktion aufbaut. Von diesen Faktoren wird die Form oder Komplexität des Antigens direkt durch Immunisierung mit einem Adjuvans beeinflusst.
Gegenwärtig ist man davon überzeugt, dass Adjuvantien die Wirkung haben, dass sie die Immunreaktion durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen verstärken. In einem Mechanismus stimuliert das Adjuvans direkt eine der beiden Subpopulationen von CD4&spplus;-Helfer-T-Zellen mit der Bezeichnung TH1 und TH2 [(Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7, 145-173 (1989)]. Helfer-T-Zellen sind für die Reaktionen der B- Zellen-Antikörper auf die meisten Antigen erforderlich. In einer geeigneten Immunreaktion wird ein Antigen eingefangen und von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC), d. h. zirkulierenden oder Gewebe-Makrophagen, verarbeitet und auf der Oberfläche der APC in Verbindung mit einem Haupt-Histokompatibilitäts-(MHC-) Molekül der Klasse II präsentiert. In dieser Form kann das Antigen mit Rezeptoren auf der Oberfläche der Helfer-T-Zellen in Wechselwirkung stehen, wodurch die jeweiligen Subpopulationen der Zellen aktiviert werden, um eine beliebige Anzahl von Zytokinen zu exprimieren und zu sekretieren. Die Art der Zytokin-Produktion hängt von der aktivierten Untergruppe der Helfer-T-Zellen ab, wobei das Resultat davon teilweise durch die Wahl des Adjuvans moduliert werden kann. So wurde beispielsweise von Alaun, einem Alauniniumsalz-Adjuvans, das für die klinische Verwendung bei Menschen zugelassen ist, berichtet, dass es selektiv TH2-Zellen in Mäusen aktiviert [Grun und Maurer, Cell. Immunol. 121, 134-145)1989)], während Vollständiges Freundsches Adjuvans (FCA), eine Emulsion aus Mineralöl mit abgetöteten Mycobakterien (Freund et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 37, 509 (1937)] vorzugsweise TH1-Mauszellen aktiviert [Grund und Maurer, Cell. Immunol. 121, 134-145 (1989)].
Ein anderer Mechanismus, durch den die Immunreaktion verstärkt wird, umfasst die direkte Stimulierung der B-Zellen durch beispielsweise das Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien [Gery et al., J. Immunol. 108, 1088 (1972)]. Es wurde auch gezeigt, dass LPS die Sekretion von Interferon-γ (INF-γ) stimuliert [Tomai und Johnson, J. Biol. Resp. Med. 8, 625-643 (1989)], was sowohl die Verbreitung von TH2-Zellen behindert als auch die Differenzierung von TH1-Zellen stimuliert [Gajewski et al., J. Immunol. 1432, 15-22 (1989); Gajewski et al., J. Immunol. 146, 1750-1758 (1991)]. Der Mechanismus, durch welche LPS die Immunreaktion verstärkt, erfolgt somit durch direkte Stimulierung der 8-Zellen und somit durch indirekte Regulierung sowohl der TH1- als auch TH2-Zellpopulationen.
Andere Arten der Immunverstärkung wurden auch für andere Adjuvantien beschrieben. Ölemulsionen (d. h. Vollständiges Freundsches Adjuvans [FCA], Unvollständiges Freundsches Adjuvans [FIA] und Liposomen wirken durch Depotbildung wie dies Alaun tut, wodurch eine langsame Freisetzung des Antigens ermöglicht wird. Die langsame Antigen-Freisetzung erlaubt einen längeren Kontakt des Antigens mit dem Immunsystem und auch eine Anfangsimmunisierung mit einer Antigen-Dosierung, die, wenn sie auf einmal verabreicht wird, gewöhnlich kontraproduktiv zur Antikörperbildung wirkt. Es wurde zu einem früheren Zeitpunkt bereits berichtet, dass, während eine hohe Anfangsdosierung des Antigens dazu führt, dass ein höherer unmittelbarer Antikörper-Titer gebildet wird, das Ansteigen des Antikörper-Titers und die Erhöhung der Antikörper-Spezifität als Funktion der Zeit nicht so stark sind, wie dies mit niedrigeren, aber häufiger verabreichten Antikörper-Dosierungen beobachtet wurde [Siskind, G., Pharm. Rev. 25, 319-324 (1973)]. Aus diesem Grund modulieren Adjuvantien, die die Präsentation eines Antigens gegenüber dem Immunsystem steuern, zusätzlich zur Änderung von Form oder Komplexität des Antigens auch noch dessen Dosierung.
Bis dato erwies sich nur ein einziges Adjuvans, Alaun [AlK(SO&sub4;)&sub2;·H&sub2;O], als ausreichend nichttoxisch, um eine Verabreichung an Menschen zuzulassen. Alaun wirkt nicht nur durch Aktivierung der TH2-Zellen, Depotbildung und langsame Freisetzung des Antigens nach Immunisierung [Edelman, Rev. Infect. Dis. 2, 370-383 (1980); Warren et al., Ann. Rev. Immunol. 4, 369-388 (1986)], sondern auch mittels Granulom-Bildung durch Anziehung immunkompetenter Zellen [White et al., J. Exp. Med. 102, 73-82 (1955)] und Aktivierung des Komplements [Ramanathan et al., Immunol. 37, 881-888 (1979)]. Alaun ist jedoch nicht völlig ohne negative Nebenerscheinungen, wozu Rötung der Haut, subkutane Knöllchen, Hyperempfindlichkeit auf Berührung und Granulomentzündung zählen. Andere Adjuvantien, die außerhalb des Bereichs der Anwendung für Menschen verwendet werden, stehen ebenfalls im Mittelpunkt von Forschungsinteressen, die danach trachten, akzeptable Alternativen für die Verwendung beim Menschen zu entwickeln. In den oben erwähnten Ölemulsionen (d. h. FCA und FIA) sind beispielsweise bakterielle Produkte (z. B. LPS, Cholera-Toxin, mycobakterielle Komponenten und vollständiges getötetes Corynebacterium parvum, Corynebacterium granulosum und Bordetella pertussis, Liposomen, immunstimulierende Komplexe (ISCOMs)) und in der Natur vorkommende woe auch derivatisierte Polysaccharide anderer bakterieller Quellen umfasst.
Die immunverstärkende Fähigkeit der Polysaccharide war währen der letzten Jahre von großem wissenschaftlichen Interesse, da diese Verbindungen in der Natur häufig vorkommen, wie z. B. als Strukturkomponenten in den Zellwänden von Bakterien sowie den Exoskeletten von Insekten und Krustentieren. Das aus gewissen gramnegativen Bakterien isolierte Lipopolysaccharid (LPS) ist ein solches Polysaccharid, wenngleich die Adjuvans-Eigenschaften von LPS hauptsächlich von der Lipid-A-Region des Moleküls herrühren und nicht vom o-spezifischen Polysaccharid oder den Kern-Oligosaccharid- Regionen des Moleküls. LPS, das sowohl humorale [Johnson et al.,]. Exp. Med. 103, 225-246 (1956)] als auch zellvermittelte Immunität [Ohta et al., Immunobiology 53, 827 (1984)] verstärkt, verfügt über zahlreiche biologische Aktivitäten, ist aber aufgrund seiner ihm eigenen Toxizität für eine Verwendung beim Menschen nicht geeignet, siehe Gupta et al., Vaccine 11, 291-306 (1993). Somit wurde verstärktes Augenmerk auf andere Polysaccharide gelegt, darunter u. a. Chitosan.
Chitosan [β-(1-4)-2-Amino-2-desoxy-D-glucari) ist ein Derivat von Chitin und wurde in biomedizinischen Anwendungen teilweise aufgrund seiner biologischen Abbaubarkeit durch Lysozym und niedrige Toxizität beim Menschen häufig eingesetzt. Dieselben Merkmale haben zu einem gesteigerten Interesse an Chitosan als immunverstärkendes Mittel geführt. So offenbarten etwa Matuhashi et al. im US-Patent Nr. 4.372.883 die Konjugation von löslichen Polysacchariden, einschließlich Chitosan, mit normalerweise toxischen Antigenen, wobei die Konjugation das Antigen entgiftet und somit seine Verwendung als Immunogen ermöglicht. Matuhashi et al. sprachen jedoch die Verwendung von unlöslichen Formen des Chitosan nicht an, auch verglichen sich nicht den resultierenden Serum-Antikörper-Titer mit jenem, der durch die Immunisierung mit anderen bekannten Adjuvantien erzielt wurde.
Ebenso offenbarten Suzuki et al. im US-Patent Nr. 4.971.956 die Verwendung von wasserlöslichen Chitosan-Oligomeren als therapeutische Mittel zur Behandlung von bakteriellen und Pilzinfektionen sowie zur Behandlung von Tumoren. Suzuki et al. diskutierten die Schwierigkeit dabei, Chitosan so zu modifizieren, dass dieses eine geeignete wasserlösliche Form bildet, wobei offenbart wurde, dass wasserlösliche Formen für eine therapeutische Anwendung unpraktisch sind. Zusätzlich dazu offenbaren Suzuki et al. die Konjugation eines Antigens an Chitosan für eine verbesserte Immunreaktion nicht.
Mitsuhashi et al. offenbarten im US-Patent Nr. 4.814.169 die Verwendung von menschlichem Protein, das an lösliche Polysaccharide konjugiert ist, einschließlich Chitosan, um Antikörper gegen menschliches Protein in nicht-menschlichen Tieren zu erzeugen. Die Verabreichung einer Lösung aus menschlichem Protein und Polysaccharid erfolgte mittels einer intravenösen, intraperitonealen oder subkutanen Injektion. Andere Wege, wie z. B. orale und rektale Verabreichung, wurden in der Offenbarung nicht angesprochen.
Nishimura et al. [Vaccine 2, 93-99 (1984)] berichteten von den immunologischen Merkmalen der Chitin-Derivate hinsichtlich Aktivierung der peritonealen Makrophagen in vivo, Unterdrückung von Tumorwachstum bei Mäusen sowie Schutz gegen bakterielle Infektionen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass sowohl Chitin als auch Chitosan nur ineffizient die Resistenz des Wirts gegen Tumorzellen oder Bakterien stimulierten, dass aber Chitosan in mäßigem Ausmaß zytotoxische Makrophagen induzierte. Ergebnisse mit modifiziertem, entacetyliertem Chitosan, das in einer wässrigen Umgebung ein Gel bildet, zeigte wirksamer eine Aktivierung von Makrophagen, Unterdrückung von Tumorwachstum und Stimulierung der Resistenz gegen bakterielle Infektionen.
Marcinkiewicz et al. [Arch. Immunol. Ther. Exp. 39, 127-132 (1991)] untersuchten die Immunadjuvans-Aktivität von wasserlöslichem Chitosan und berichteten von einer Verbesserung der T-abhängigen humoralen Reaktion, aber nur von einer moderaten Verstärkung der T-unabhängigen humoralen Reaktion. Die verbesserte humorale Reaktion wurde mit Chitosan bei Dosierungen von 100 mg/kg detektiert, wobei die Verabreichung intravenös oder intraperitoneal erfolgte. Subkutane oder orale Verabreichung wurde als unwirksam bezeichnet. Zusätzlich dazu schlagen Marcinkiewicz et al. keine Konjugation eines Antigens an ein unlösliches Chitosan vor, mit der Begründung, dass Chitosan "in derselben Reaktion resultierte, unabhängig von der Verabreichungsstelle, die entweder gemeinsam mit oder getrennt vom Antigen erfolgte".
Hinsichtlich der Tatsache, dass nur ein existierendes Adjuvans für die Verwendung bei Menschen zugelassen wurde, besteht aus diesem Grund in der Technik ein Bedarf daran, neue und weniger toxische Adjuvantien für eine mögliche Verwendung beim Menschen bereitzustellen. Verbesserte Adjuvantien lassen die Produktion von effektiveren Impfstoffen zu und verbessern auch die Produktion von monoklonalen Antikörpern mit therapeutischem Potential.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Adjuvans bereit, das im Wesentlichen aus einer Kombination aus Chitosan mit einem chelatierten Metallion besteht. Das Metallion kann beispielsweise Eisen oder ein Übergangsmetall wie Kupfer, Nickel oder Zink sein.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung des Adjuvans in einem Verfahren zur Verstärkung einer Immunreaktion bereit, umfassend die Stufen des Konjugierens eines Antigens an das Chitosan-Adjuvans und des Verabreichens des Protein/Adjuvans-Konjugats an ein Tier. Die Immunreaktion ist durch einen schnellen Klassenwechsel von der IgM- zur IgG-Produktion gekennzeichnet. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antigene, umfassend Antigene in der Form von Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Glykoproteinen oder Kombinationen davon. Das Chitosan-Adjuvans kann löslich oder unlöslich sein; wobei das unlösliche Adjuvans entweder gelartig oder teilchenförmig ist. Die Konjugation des Antigens kann mittels chemischer Vernetzung, ionischer Wechselwirkung, physikalischer Interkalierung, hydrophilen Wechselwirkungen oder kovalenter Modifikation bewirkt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Vernetzung eines Antigens mit dem Adjuvans erfolgt unter Verwendung von Glutaraldehyd. Wird Glutaraldehyd zur Vernetzung verwendet, kann das sich ergebende Antigen/Adjuvans-Immunogen entweder teilchenförmig oder gelartig sein, abhängig vom Grad der Vernetzung. Das Verhältnis von Antigen zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, liegt aber vorzugsweise im Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10, wobei alle Verhältnisse das Gewicht des Antigens zum Nassgewicht von Chitosan darstellen. Ein alternatives bevorzugtes Verhältnis liegt bei 10 : 1. Das Antigen kann an das jeweilige Chitosan-Adjuvans auf der Außenfläche des Teilchens oder auf einer Innenfläche des Teilchens konjugiert werden, oder die Konjugation ist eine Kombination von sowohl innerer als auch äußerer Konjugation. Das Antigen/Adjuvans-Konjugat kann dem Tier oral, intranasal, intravaginal, intrarektal oder mittels intraperitonealer, intravenöser oder subkutaner Injektion verabreicht werden; die Verabreichung kann einen einzelnen Weg oder eine Vielzahl von Wegen umfassen. Das Antigen/Adjuvans-Konjugat kann allein oder in Kombination mit einer beliebigen Anzahl anderer Adjuvantien verabreicht werden. Die Immunisierung kann eine einzelne Verabreichung oder mehrere Verabreichungen umfassen.
Als Immunogen wird auch ein Immunogen bereitgestellt, das im Wesentlichen aus Chitosan mit einem chelatierten Metallion und einem Antigen besteht. Das Antigen kann Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Glykoproteine oder Kombinationen davon umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Protein-Antigene können in der Natur vorkommend sein oder rekombinant. Das Antigen kann an das Adjuvans über eine kovalente Bindung konjugiert sein. Eine bevorzugte kovalente Bindung erfolgt über die Vernetzung mit Glutaraldehyd. Das sich ergebende vernetzte Immunogen kann teilchenförmig oder gelartig sein, abhängig vom Grad der Vernetzung. Das Antigen kann auch mit dem Adjuvans durch ionische Wechselwirkung kombiniert werden. Wenn das Antigen beispielsweise ein rekombinantes Protein ist, das eine Polyhistidin- (Poly-HIS-) Aminosäuresequenz umfasst, kann die Poly-HIS-Region mit dem chelatierten Metallion wechselwirken. Ist das Antigen ein Protein, kann die Poly-HIS-Aminosäuresequenz am Carboxy- oder Aminoterminus positioniert sein oder an einer internen Region des Proteins, die die in der Natur vorkommende Tertiär- oder Quarternärstruktur des Proteins nicht nennenswert verändert.
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans bereitgestellt, das die Stufen des Herstellens einer Chitosanlösung, des Chelatierens eines Metallions an das Chitosan, um einen Metall/Chitosan-Komplex zu erzeugen, und des Isolierens des Metall/Chitosan-Komplexes umfasst. Es werden auch Verfahren verstanden, die ein Metallion umfassen, das beispielsweise Eisen oder ein Übergangsmetall, wie z. B. Kupfer, Zink oder Nickel, sein kann.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Immunogens bereit, umfassend die Stufen des Herstellens einer Chitosan-Lösung, des Chelatierens eines Metallions an das Chitosan, um einen Metall/Chitosan-Komplex zu erzeugen, sowie des Kombinierens eines Antigens mit dem Metall/Chitosan-Komplex. Das Metallion im Immunogen kann Eisen oder ein Übergangsmetall wie Kupfer, Nickel oder Zink umfassen, ist aber keineswegs darauf beschränkt. Das Antigen kann ein Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Glykoprotein oder eine Kombination davon sein, ist aber ebenfalls nicht darauf beschränkt. Das Protein-Antigen kann in der Natur vorkommen oder rekombinant sein. Das Antigen kann in einer kovalenten Bindung mit dem Adjuvans kombiniert sein. Eine bevorzugte kovalente Bindung erfolgt mittels Vernetzung. Das bevorzugte Vernetzungsmittel ist Glutaraldehyd. Das sich ergebende vernetzte Immunogen kann teilchenförmig oder gelartig sein, abhängig vom Grad der Vernetzung. Alternativ dazu kann das Antigen über Ionen-Wechselwirkung mit dem Adjuvans kombiniert sein. Eine bevorzugte Ionen-Wechselwirkung wird über ein rekombinantes Protein-Antigen bewirkt, das eine Poly-HIS-Aminosäuresequenz umfasst, die mit dem chelatierten Metallion in Wechselwirkung steht. Die Poly-HIS-Sequenz auf dem Protein-Antigen kann entweder am Carboxy- oder am Aminoterminus des Proteins lokalisiert werden. Alternativ dazu kann die Poly-HIS-Region an einer inneren Region des Proteins lokalisiert werden, die die Tertiär- oder Quarternärstruktur des in der Natur vorkommenden Proteins nicht nennenswert verändert. Das sich daraus ergebende Immunogen kann verabreicht werden.
Von der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines Immunogens bereitgestellt, das die Stufen des Herstellens einer Chitosan-Lösung, des Kombinierens eines Antigens mit dem Chitosan, um einen Antigen/Chitosan-Komplex auszubilden, sowie des Chelatierens eines Metallions an den Antigen/Chitosan-Komplex umfasst. Das Metall im Immunogen kann Eisen oder ein Übergangsmetall wie Kupfer, Nickel oder Zink sein, ist aber keineswegs darauf beschränkt. Im bevorzugten Verfahren ist das Antigen kovalent mit dem Chitosan mittels Vernetzung verbunden. Das bevorzugte Mittel, um die Vernetzung zu bewirken, ist Glutaraldehyd. Das Antigen kann ein Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Glykoprotein oder eine Kombination davon sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Ist das Antigen ein Protein, so kann es entweder natürlich oder rekombinant sein.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunreaktion bereit, umfassend die Stufen des Vermischens eines Antigens mit einem Chitosan-Adjuvans der Erfindung und des Verabreichens der Suspension an ein Tier. Die Immunreaktion ist durch einen raschen Klassenwechsel von der IgM- zur IgG-Produktion gekennzeichnet. Das Verhältnis von Antigen zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, vorzugsweise jedoch in einem Bereich von 10 : 1 bis 1 : 10. Das Chitosan-Adjuvans kann löslich oder unlöslich sein; wobei das unlösliche Adjuvans teilchenförmig oder gelartig ist. Die Antigen/Adjuvans-Suspension kann dem Tier oral, intranasal, intravaginal oder mittels intraperitonealer, intravenöser oder subkutaner Injektion verabreicht werden; die Verabreichung kann einen einzelnen Weg oder eine Vielzahl von Wegen umfassen. Das Antigen/Adjuvans-Gemisch kann allein oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verabreicht werden. Die Immunisierung kann eine einzelne Verabreichung oder mehrere Verabreichungen umfassen.
Als weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunreaktion bereit, umfassend die Stufen des Bildens eines Adjuvans, das im Wesentlichen aus Chitosan und einem chelatierten Metallion besteht, um einen Metall/Chitosan-Komplex zu bilden, des Kombinierens eines Antigens mit dem Metall/Chitosan-Komplex, um ein Immunogen zu bilden, und des Verabreichens des Immunogens an ein Tier. Die Metallionen-Komponente des Immunogens kann Eisen oder ein Übergangsmetall wie Kupfer, Nickel oder Zink sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Antigen-Komponente des Immungens kann ein Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder eine Kombination davon sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Gewichtsverhältnis von Antigen zu Chitosan kann 100 : 1 bis 1 : 100 betragen. Eine bevorzugtes Verhältnis liegt bei 10 : 1, bestimmt durch das Gewicht des Antigens zum Nassgewicht des Metall/Chitosan-Komplexes. Das Antigen kann kovalent an den Metall/Chitosan-Komplex gebunden sein; wobei das bevorzugte Verfahren zur kovalenten Bindung über Vernetzung erfolgt. Ein bevorzugtes Vernetzungsmittel ist Glutaraldehyd, und das sich ergebende vernetzte Immungen kann teilchenförmig oder gelartig sein, abhängig vom Grad der Vernetzung. Alternativ dazu kann das Antigen mit dem Adjuvans über eine Ionen-Wechselwirkung verbunden sein. Ein bevorzugtes Bindungsverfahren mittels Ionen-Wechselwirkung ist die Verwendung eines rekombinanten Protein-Antigens, das eine Poly-HIS-Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Poly-HIS-Sequenz fähig ist, mit dem chelatierten Metallion in Wechselwirkung zu stehen. Die Poly-HIS-Region des Proteins kann carboxy- oder aminoterminal zum Protein liegen, oder sie kann im Inneren des Proteins liegen, so dass sie die natürlich vorkommende Tertiär- oder Quarternärstruktur des Proteins nicht nennenswert verändert. Das Immunogen kann dem Tier oral, intranasal, intravaginal, intrarektal oder mittels intraperitonealer, intravenöser oder subkutaner Injektion verabreicht werden; die Verabreichung kann einen einzelnen Weg oder eine Vielzahl von Wegen umfassen. Die Immunogen-Suspension kann allein oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verabreicht werden. Die Immunisierung kann eine einzelne Verabreichung oder mehrere Verabreichungen umfassen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die, wenn sie einem Tier verabreicht wird, eine Immunreaktion verstärkt, wobei die Zusammensetzung ein Konjugat aus einem Protein und einem Chitosan-Adjuvans der Erfindung umfasst. Die Chitosan-Komponente kann löslich oder unlöslich sein, wobei das unlösliche Adjuvans gelartig oder teilchenförmig ist, abhängig vom Verfahren, mit welchem das Antigen mit dem Adjuvans kombiniert wurde. Die Konjugation kann durch chemische Vernetzung, ionische Wechselwirkung, physikalische Interkalierung oder kovalente Bindung bewirkt werden. Das Verhältnis von Protein zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, liegt aber vorzugsweise in einem Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10. Die sich ergebende Zusammensetzung ist für eine orale, intranasale, intravaginale, intrarektale Verabreichung oder eine Verabreichung mittels intraperitonealer, intravenöser oder subkutaner Injektion geeignet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die, wenn sie einem Tier verabreicht wird, eine Immunreaktion verstärkt, wobei die Zusammensetzung eine Suspension eines Proteins und eines Chitosan-Adjuvans der Erfindung umfasst. Das Verhältnis von Protein zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, liegt aber vorzugsweise in einem Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10. Die sich ergebende Zusammensetzung ist für eine orale, intranasale, intravaginale, intrarektale Verabreichung oder eine Verabreichung mittels intraperitonealer, intravenöser oder subkutaner Injektion geeignet.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung bereitgestellt, die eine Immunreaktion verstärkt, worin ein Antigen mit einem Chitosan-Adjuvans konjugiert wird, wobei das sich ergebende Konjugat danach geeignet ist, an ein Tier verabreicht zu werden. Die Konjugation kann durch chemische Vernetzung, Ionen-Wechselwirkung, physikalische Interkalierung oder kovalente Bindung bewirkt werden. Das Verhältnis von Protein zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, liegt aber vorzugsweise in einem Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung bereitgestellt, die eine Immunreaktion verstärkt, in welcher ein Antigen mit einem Chitosan-Adjuvans vermischt wird, um eine Suspension zu bilden, die nachfolgend an ein Tier verabreicht werden kann. Das Verhältnis von Protein zu Chitosan kann in einem Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegen, liegt aber vorzugsweise in einem Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10.

Beschreibung der Zeichnungen

Zahlreiche andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind nach Lektüre der nachfolgenden Beschreibung erkennbar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele mit Bezug auf ein Verfahren zur Immunverstärkung veranschaulicht, das ein Protein/Adjuvans-Konjugat oder eine Protein/Adjuvans-Suspension verwendet, sowie auf Verfahren zur Herstellung des Konjugats und/oder der Suspension. Insbesondere beschreibt Beispiel 1 eine allgemeine Immunisierungsvorschrift. Beispiel 2 bezieht sich auf einen enzymgebundenen Immunosorptionstest (ELISA), die in allen Messungen verwendet wurde, um die Serum-Antikörper-Titer zu bestimmen. Beispiel 3 bezieht sich auf die Herstellung eines Adjuvans aus einem Metall/Chitosan-Komplex. Beispiel 4 betrifft die Immunverstärkung mit Hilfe eines Zona pellucida-Schweineproteins an, das mit verschiedenen Metall/Chitosan-Adjuvantien kombiniert wurde. Beispiel 5 zeigt die Verwendung eines Zink/Chitosan-Adjuvans mit einem anderen Zona pellucida-Schweineprotein. Beispiel 6 beschreibt die Herstellung eines Eisen/Chitosan-Adjuvans. Beispiel 7 spricht die Palmitylierung eines Metall/Chitosan-Komplexes an. Beispiel 8 beschreibt die Immunreaktion mit und ohne Palmitylierung des Metall/Chitosan-Komplexes.

Beispiel 1

Immunisierungsvorschrift

Sofern in den Beispielen nicht anders angegeben wurde durchwegs die folgende Immunisierungsvorschrift angewendet.
Mäuse wurden im Allgemeinen mit verschiedenen Mengen eines Antigens in einem 100 ul-Volumen mittel intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Injektion mit dem gewünschten rekombinanten Protein, das mit dem Metall-Chitosan einen Komplex bildet, immunisiert. Vor der Anfangsimmunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen, um Kontrollserum zu erhalten. Nach der Anfangsimmunisierung wurde den Tieren in wöchentlichen Abständen Blut abgenommen, und es wurde der Antigen-Titer mittels ELISA, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Alle Tiere wurden mit einer Injektion, die mit dem Anfangsimmunogen identisch ist, drei bis vier Wochen nach der Anfangsimmunisierung aufgefrischt.

Beispiel 2

Enzymgebundener Immunosorptionstest (ELISA)

Die Beurteilung des Ausmaßes, mit welchem Chitosan in Kombination mit einem Antigen dazu fähig ist, eine Immunreaktion zu verstärken, erfolgte unter Verwendung von enzymgebundenem Immunosorptionstest (ElISA), wie eer in der Technik allgemein bekannt ist. Die folgende Arbeitsvorschrift wurde angewendet.
Flachboden-Testplatten aus Polyvinylchlorid mit 96 Näpfen (Falcon # 3912) wurden über Nacht bei 4ºC mit Antigen (50 ul/Napf bei 5-10 ug/ml) in einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,6 beschichtet. Die Platten wurden mit PBS, die 0,5% Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat (Tween 80) (Mallinckrodt Specialty Chemical Company, Paris, KY, USA) (PBS-T) enthielt, gewaschen und danach mit PBS-T, die 2% Trockenmagermilch (PBS-NFDM) enthielt, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet, um nichtspezifische Bindung zu hemmen. Nachdem drei Mal mit PBS-T gewaschen wurde, wurden 50 ul einer Probe oder eines Kontrollserums, das in PBS-T verdünnt war, jedem Napf zugegeben, und anschließend wurden die Platten abgedeckt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden geleert, drei Mal mit PBS-T gewaschen, und danach wurden 50 ul einer 1 : 1000 Verdünnung eines biotinmarkierten Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (einschließlich sowohl schwerer als auch leichter Polypeptidketten) (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) oder eines biotinmarkierten Ziegen-Anti-Mäuse-IgM (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) in PBS-T jedem Napfzugesetzt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS-T und 50 jA PBS-T, die den Meerrettichperoxidase-konjugierten Avidin-Biotin-Komplex eines Vectastain-ABC-Sets (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) enthielten, gewaschen. Das Enzymsubstrat waren 50 jA von 400 ug/ml o-Phenylendiamin (Sigma). Die Platten wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur 20 Minuten lang entwickeln gelassen. Die optische Dichte (OD) bei 450 nm wurde auf einem Dynatec Laboratories MR 700 (Chantilly; VA, USA) unter Verwendung von Wasser als Vergleichswert abgelesen.

Beispiel 3

Herstellung von Metall/Chitosan-Komplexen, die entweder Zink, Kupfer oder Nickel enthalten

Vorangegangenen Beobachtungen bei der Reinigung von Poly-HIS-markierten Zona pellucida- (ZP-) Proteinen unter Verwendung von Nickel- (Ni-) Sepharose-Chromatographie zufolge binden sich Spermien leicht an die Ni-immobilisierten ZP-Proteine, wie ein Vergleich mit der Bindung zeigt, die bei ZP-Proteinen detektiert wurde, die auf anderen Affinitätssäulen immobilisiert wurden. Diese Beobachtung ist von besonderem Interesse, da die ZP-Proteine eine sehr wichtige Rolle in der Bindung von Spermien an Eizellen spielen. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Poly-HIS-markierten ZP-Proteine fähig sind, eine natürlichere Konformation beizubehalten, wenn sie in diesem Verfahren immobilisiert werden. In Kombination mit einer früheren Beobachtung, dass Chitin über die Fähigkeit verfügt, Übergangsmetallionen zu chelatieren, führte diese Beobachtung dazu, dass die mögliche Verwendung eines Metall/Chitosan-Chelats zur Bindung eines Poly-HIS-markierten Antigens und seiner Verwendung als Immunverstärker genau untersucht wurde. Geht man davon aus, dass Übergangsmetallione im Allgemeinen toxisch sind, so wurden einige verschiedene Ionen anfänglich darauf getestet, die Metall/Chitosan-Komplexe herzustellen.
Um Adjuvantien aus Chitosan/Metall-Komplexen herzustellen, die entweder Zink, Kupfer oder Nickel enthalten, wurde eine 2% Chitosanlösung anfänglich hergestellt, indem 2 g Chitosan (CTC Organics, Atlanta, GA, USA) in 100 ml einer 2% Essigsäure gelöst wurden, wobei nachfolgend die sich ergebende Lösung mittels Autoklaven sterilisiert wurde. Alternativ dazu kann die Chitosanlösung auch hergestellt werden, indem 2 g in 100 ml 0,5 M Natriumacetat mit einem pH von 4, 5 gelöst werden. Eine Zinkacetat-, Nickelsulfat- oder Kupfersulfatlösung wurde in entionisiertem Wasser mit einer Molarität zwischen 0,001 und 0,2 M hergestellt und sterilfiltriert. Die 2% Chitosanlösung wurde 1 : 1 unter Verwendung von entionisiertem Wasser verdünnt, und 4 ml der sich ergebenden 1% Chitosanlösung wurden 10 ml der gewünschten Metallsalzlösung zugesetzt. Die sich ergebende Suspension wurde mit einem Tumbler 2 bis 4 Stunden lang bei Raumtemperatur durchmischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Branson-Beschallers 250 3 bis 5 Minuten lang beschallt, und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 12,0 bis 12,5 mit 10 N NaOH während der Beschallung eingestellt. Wurde das Zinksalz verwendet, so bildet sich ein Niederschlag aus einem weißen Komplex, wurde Kupfersalz verwendet, war der Komplex blau. Nach der Beschallung wurde das Gemisch mit 2.000 U/min (1000 · g) 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde zwei Mal mit PBS, pH 7,2 gewaschen, nach jedem Waschen zentrifugiert, das Nassgewicht des Pellets bestimmt und das Metall-Chitosan-Komplex- Pellet in 8 M Harnstoff resuspendiert, der pH-Wert betrug dabei 7,8 bis 8,0. Die Metall/Chitosan-Komplexe wurden entweder unmittelbar an ein Antigen gebunden oder entweder in 8 M Harnstoff oder PBS bei Raumtemperatur gelagert. Die gelagerten Metall/Chitosan-Komplexe zeigten sich bis zu 6 Monate lang stabil, wenn sie in diesem Verfahren gelagert wurden.
Die Antigene wurden mit dem Metall/Chitosan-Komplex in einem der zwei alternativen Verfahren verbunden. Im ersten Verfahren wurden die Proteine mit dem Metall/Chitosan-Komplex vernetzt, indem Glutaraldehyd, wie zuvor in Beispiel 13 und dem folgenden Beispiel beschrieben, verwendet wurde. In einem anderen Verfahren, das in diesem Beispiel beschrieben ist, enthielten rekombinante Proteine eine C-terminale Poly-Histidin-Region, um die Reinigung zu erleichtern und eine Verbindung des Proteins mit der Metallkomponente des Metall/Chitosan-Komplexes zu ermöglichen. Diese Verfahren wird nachfolgend beschrieben.
Rekombinante Proteine, die so modifiziert wurden, dass sie 6 Histidine (Poly-HIS) umfassen, wurden entweder in Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder CHO-Zellen exprimiert und unter Anwendung von Ni-Sepharose- oder Kobalt-(Co-) Sepharose-Chromatographie gereinigt, wobei diese beiden Verfahren in der Technik allgemein bekannt sind. Das rekombinante Protein wurde in 8 M Harnstoff äquilibriert und mit dem Chitosan/Metall- Komplex in einem Kunststoffröhrchen 1 bis 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Protein/Metall/Chitosan-Komplex mittels Zentrifugation 10 Minuten lang bei 1000 · g pelletiert, und die Menge des komplexgebundenen Proteins wurde durch Bestimmung der Proteinkonzentration im Überstand nach der Zentrifugation und durch Subtraktion der Menge, die anfänglich der Bindungsreaktion zugesetzt wurde, bestimmt. Im Allgemeinen belief sich das resultierende Verhältnis "mg Antigen" : "mg Nassgewicht Metall/Chitosan" auf durchschnittlich 10 : 1. Das Pellet wurde zwei Mal mit PBS gewaschen, in PBS resuspendiert und die Konzentration auf 1 mg Antigen/ml Puffer eingestellt.
Die spezifische Verwendung sowie die Ergebnisse der Verwendung von Antigen/Zink/Chitosan als Immunogen werden in den nachfolgenden Beispielen 4 und 5 beschrieben.

Beispiel 4

Immunreaktion auf rekombinantes Zona pellucida-Schweineprotein B (Pig-b), das mit mit entweder Nickel, Kupfer oder Zink komplexiertem Chitosan einen Komplex bildet

Rekombinantes Zona pellucida-Schweineprotein Pig-b, das in Bakterien exprimiert wird, wurde entweder mit Nickel/Chitosan, Kupfer/Chitosan oder Zink/Chitosan, wie zuvor in Beispiel 3 beschrieben, komplexiert. Einzelnen Mäusegruppen wurden intraperitoneal entweder 5, 25, 100 oder 250 ug Protein/Maus im Falle von Nickel/Chitosan und Zink/Chitosan bzw. entweder 5 oder 25 ug Protein/Maus im Falle von Kupfer/Chitosan immunisiert. Jede Gruppe erhielt an Tag 21 nach der Anfangsimmunisierung mit derselben Menge von Antigen und Metall/Chitosan eine Auffrischungsimmunisierung. Den Mäusen wurde an den Tagen 8, 21, 28 und 49 nach der ersten Immunisierung Blut abgenommen, und der Serum-Titer wurde mittels ELISA, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Die Serum-Titer, die gegen bakteriell exprimiertes Zona pellucida-Pig-b und gesamtes, wärmesolubilisiertes, natives Pig-Zona bestimmt wurden, sind in den Tabellen 1 bzw. 2 dargestellt. Tabelle 1 Serum-Titer, der mittels ELISA unter Verwendung von rekombinantem Pig-C bestimmt wurde
*ND - Dosierung nicht durchgeführt Tabelle 2 Serum-Titer, der mittels ELISA unter Verwendung von gesamtem, hitzedenaturiertem Zona pellucida-Protein bestimmt wurde
*ND - Dosierung nicht durchgeführt

Beispiel 5

Immunisierung mit bakteriell exprimiertem Zona pellucida-Pig-C-Protein, das mit Zink/Chitosan komplexiert wurde

Balb/c-Mäuse wurden mit bakteriell exprimiertem Zona pellucida-Schweineprotein C (Pig-C) immunisiert und gemäß folgender Arbeitsvorschrift mit Zink/Chitosan komplexiert.
Das Pig-C-Antigen wurde anfänglich in E. coli exprimiert und daraus gereinigt, danach wurde es mit Zink-Chitosan komplexiert, das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden war. Den Mäusen wurden intraperitoneal mit 100 ug Antigen/Maus (Gruppe I) immunisiert. In einer Kontrollgruppe (Gruppe II) wurden die Mäuse mit 100 ug/Maus mit gereinigtem Protein allein immunisiert, und in einer weiteren Kontrollgruppe (Gruppe III) wurden die Mäuse mit Pig-C-Protein immunisiert, das mit ausgefälltem Zinkacetat nach derselben Vorschrift wie in Beispiel 3 zur Herstellung von Zink/Chitosan verbunden worden war, nur dass hier 1% Chitosan nicht der Lösung zugesetzt wurde. Die Mäuse wurde an Tag 21 mit Pig-C-Antigen mit 100 ug/Maus aufgefrischt, was mit Zink/Chitosan genauso komplexiert worden war wie bei der Herstellung der Anfangsimmunisierung. Den Mäusen wurden an den Tagen 21, 28 und 49 mittels retroorbitaler Punktur Blut abgenommen, und die Serum-Titer wurden mittels ELISA gemessen, wie dies bereits in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Ergebnisse dessen sind in Tabelle 3 aufgelistet.
An Tag 2 belief sich der Serum-Titer in Gruppe 1 durchschnittlich auf 64k, im Vergleich zu Titern von weniger als 250 für die Gruppe II und 1k für die Gruppe III. Nach einer Auffrischungsimmunisierung an Tag 21 nach der Anfangsimmunisierung fand man heraus, dass die Serum-Titer, die von am Tag 28 erfolgten Blutabnahmen bestimmt wurden, für die Gruppe I mehr als 64k betrugen und 4k sowohl für die Gruppe II als auch die Gruppe III. Diese Daten beweisen, dass weder das Antigen allein noch die Metall- Antigen-Komponenten des Adjuvans für die beobachtete Immunreaktion verantwortlich sind, sondern dass die Immunreaktion vielmehr den geeigneten Antigen/Metall/Chitosan-Komplex erfordert, um rasch eine Immunreaktion zu stimulieren, die lange Zeit anhält. Tabelle 3 Vergleich der Immunreaktion unter Verwendung von Antigen/Metall/Chitosan, Antigen oder Antigen/Metall

Beispiel 6

Herstellung von Chitosan/Metall-Komplexen, die Eisen enthalten

Zur Herstellung einem Immunogens aus einem Eisen/Chitosan-Komplex wurden 4 g Eisenammoniumcitrat in 10 ml destilliertem Wasser mit 100 ul 11,6 N HCl gelöst. 4 ml einer 1º/0 Chitosanlösung, die wie zuvor hergestellt worden war, wurden beschallt, und 200 ul der Eisenammoniumcitratlösung wurden während des Beschallens hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde zentrifugiert, und das Pellet, das den Eisen/Chitosan- Komplex enthielt, wurde einmal in entionisiertem Wasser gewaschen. Rekombinante Proteine, die so modifiziert waren, dass sie 6 Histidin-Reste umfassten, wurden wie zuvor an den Eisen/Chitosankomplex gekoppelt, außer dass nicht 8 M Harnstoff zugesetzt wurde. Alternativ wurde das Antigen in Zusammenhang mit Proteinen wie Eialbumin oder bakteriellen/viralen Proteinen, die keine Poly-Histidin-Sequenz umfassen, an den Eisen/Chitosan-Komplex nach einem der nachfolgend beschriebenen Verfahren gekoppelt.
In einem ersten Verfahren wurde der Eisen/Chitosan-Komplex wie zuvor beschrieben hergestellt. Eine Proteinlösung in PBS mit einem pH von 7,4 wurde zugesetzt, und die sich ergebende Suspension wurde gewirbelt, um ein einheitliches Gemisch zu erhalten. Eine 25% Glutaraldehydlösung wurde 1 : 4 mit PBS verdünnt und zu einem Antigen/Chitosan-Gemisch in einem Volumen von 20 ul pro ml des Antigen/Chitosan-Gemisches zugesetzt. Die sich ergebende Suspension wurde auf einem Tumbler zumindest 4 Stunden lang vermischt. Danach wurden 100 ul 1 M Glycin in PBS zugesetzt, um das nicht umgesetzte Glutaraldehyd zu neutralisieren, und die Inkubation wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Gemisch wurde daraufhin 10 Minuten lang bei 1000 · g zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde zwei Mal mit PBS gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurde das Pellet in einer Antigenkonzentration von 1 mg/ml in PBS resuspendiert und unmittelbar danach dazu verwendet, Tiere zu immunisieren.
In einer alternativen Arbeitsvorschrift wurde 1% Chitosan, das wie zuvor beschrieben hergestellt und nicht mit Eisen komplexiert wurde, einem gewünschten Protein zugesetzt, und dieses Gemisch wurde vorsichtig geschüttelt, um ein einheitliches Gemisch zu erhalten. Wie bereits zuvor beschrieben wurde eine 25% Glutaraldehydlösung 1 : 4 mit PBS verdünnt und zu einem Antigen/Chitosan-Gemisch in einem Volumen von 20 ul pro ml Antigen/Chitosan-Gemisch hinzugefügt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur etwa 2 bis 6 Stunden lang inkubiert, um Glutaraldehyd-induzierte Vernetzung zu ermöglichen, wonach das Gemisch zu einem Gel wurde. Das lose vernetzte Material war im Allgemeinen klar, fließfähig und erschien unter dem Mikroskop nicht teilchenförmig. Dieses Material wurde 2 bis 3 Minuten lang beschallt, während 400 ul einer 4 g/ml Eisenammoniumcitratlösung zugesetzt wurden, wodurch die Bildung von feinen gelblich-braunen Teilchen induziert wurde, in welchen das Antigen eingeschlossen war. Die Antigen/Eisen/Chitosan-Teilchen wurden mittels Zentrifugation 10 Minuten lang bei 1000 · g pelletiert, und dieses Pellet wurde in einer Antigenkonzentration von etwa 1 mg/ml resuspendiert. Diese Lösung wurde verwendet, um Mäuse laut der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsvorschrift zu immunisieren.

Beispiel 7

Herstellung von palmityliertem Eisen/Chitosan

In Anbetracht früher Berichte bezüglich immunstimulierender Komplexe (ISCOMs), von denen gezeigt worden war, dass sie einen höheren Titer induzieren, wenn der Komplex palmityliert wird, wurde das folgende Verfahren durchgeführt, um den Antigen/Metall/Chitosan-Komplex vor der Immunisierung zu modifizieren.
Protein-Antigen wurde nach einem der oben beschriebenen Verfahren in Eisen/Chitosan-Teilchen inkorporiert, und Palmitinsäure-Gruppen wurden nach folgendem Verfahren hinzugefügt. 20 mg Palmitinsäureanhydrid wurden in 1 ml Triethylamin gelöst und die Lösung einer Protein/Metall/Chitosan-Komplex-Lösung in einem Anteil von 10 ul Palmitinsäureanhydrid pro mg Antigen in der Eisen/Chitosan-Komplex-Lösung zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde durch leichtes Antippen vermischt und bei Raumtemperatur zumindest 2 Stunden lang absetzen gelassen, bevor das Präparat verdünnt und für immunisierungen verwendet wurde.

Beispiel 8

Immunisierung mit Pig-C, das in Eisen/Chitosan-Teilchen aufgenommen ist, mit und ohne Palmitylierung

Gereinigtes Zona pellucida-Pig-C-Protein, das in E. coli exprimiert worden war, wurde auf Eisen/Chitosan-Teilchen wie folgt inkorporiert. 10 ml 1% Chitosanlösung in 2% Essigsäure wurden 2 bis 3 Minuten lang beschallt, während kontinuierlich 400 ul 0,4 g/mg Eisenammoniumcitratlösung zugesetzt wurden. Die sich ergebenden Eisen/Chitosan- Teilchen wurde mittels Zentrifugation pelletiert, und das Pellet wurde zwei Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Eine Lösung, die Pig-C-Protein enthielt, das in E. coli exprimiert worden war, wurde auf einen pH-Wert von 7,8 mit PBS eingestellt und mit Eisen/Chitosan-Teilchen inkubiert. Die Inkubation wurde über Nacht laufen gelassen, wobei mit einem Zumbler durchmischt wurde. Nach der Inkubation wurden die Antigen/Metall/Chitosan-Teilchen mittels Zentrifugation bei 1000 · g 10 Minuten lang pelletiert, danach wurde die Proteinkonzentration im Überstand nach dem Bradford-Verfahren gemessen, das in der Technik allgemein bekannt ist. Das Endverhältnis von Antigen zu Metall/Chitosan wurde mit 3,7 mg gebundenem Pig-C-Protein pro Gramm Nassgewicht Eisen/Chitosan bestimmt. Vor der Verwendung als Immunogen wurde das Pig-C- Eisen auf eine Konzentration von 1 mg Antigen/ml eingestellt.
Um palmityliertes Pig-C/Eisen/Chitosan-Immunogen herzustellen, wurden die wie zuvor beschrieben hergestellten Teilchen in 8 M Harnstoff inkubiert. Eine Lösung von 20 mg Palmitinsäureanhydrid in 1 ml Triethylamin wurde hergestellt, und 10 ul der Lösung wurden zu 1 mg Äquivalent (Protein-) Pig-C/Eisen/Chitosan zugesetzt. Das Gemisch wurde leicht gerührt und bei Raumtemperatur zumindest 2 Stunden lange inkubieren gelassen, bevor es als Immunogen verwendet wurde.
Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal entweder Pig-C, das in Eisen/Chitosan-Teilchen inkorporiert war, oder palmitylierten Pig-C/Eisen/Chitosan-Teilchen immunisiert. Einzelne Mäusegruppen wurden anfänglich mit 100 ug Protein immunisiert, und jede Gruppe wurde an Tag 22 nach der Anfangsimmunisierung mit identischen Dosierungen und Präparaten aufgefrischt. Den Mäusen wurde an den Tagen 7, 14, 22, 42, 56 und 63 nach der Anfangsimmunisierung Blut abgenommen, und die Serumantikörper-Titer gegen rekombinantes Pig-C-Protein wurden mittels ELISA bestimmt. Ein Vergleich der Serum- Titer gegen Pig-C in beiden Gruppen ist in Tabelle 4 zusammengefasst.
Die Serum-Titer waren in der Primärreaktion vergleichbar, aber nach einer Auffrischungsimmunisierung war der Serum-Titer in der Gruppe von Mäusen, denen palmityliertes Antigen injiziert wurde, bedeutend höher (> 128k) als der Titer der nicht palmitylierten Gruppe (64k). Tabelle 4 Auswirkung von Palmitylierung auf Metall/Chitosan-Immunverstärkung

Claims

1. Adjuvans, das im Wesentlichen aus einer Kombination aus Chitosan und einem chelatierten Metall besteht.

2. Adjuvans nach Anspruch 1, worin das chelatierte Metall ein Übergangsmetall ist.

3. Adjuvans nach Anspruch 2, worin das Übergangsmetall Kupfer, Zink oder Nickel ist.

4. Adjuvans nach Anspruch 2, worin das chelatierte Metall Eisen ist.

5. Immunogen, das im Wesentlichen aus einem Antigen in Kombination mit einem Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 4 besteht.

6. Immunogen nach Anspruch 5, worin das Antigen kovalent mit dem Adjuvans vernetzt ist.

7. Immunogen nach Anspruch 6, worin das Vernetzen unter Einsatz von Glutaraldehyd erfolgt ist.

8. Immunogen nach Anspruch 6 oder 7, das teilchenförmig ist.

9. Immunogen nach Anspruch 6 oder 7, das gelatineartig ist.

10. Immunogen nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin das Antigen ein Protein ist.

11. Immunogen nach Anspruch 10, worin das Protein eine Polyhistidin-Aminosäuresequenz umfasst.

12. Immunogen nach Anspruch 11, worin die Polyhistidin-Aminosäuresequenz an den Carboxylterminus des Proteins gebunden ist.

13. Immunogen nach Anspruch 11, worin die Polyhistidin-Aminosäuresequenz an den Aminoterminus des Proteins gebunden ist.

14. Immunogen nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Protein an das Adjuvans durch Wechselwirkung der Polyhistidin-Aminosäuresequenz mit dem chelatierten Metall gebunden ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das die Herstellung einer Chitosan-Lösung und das Chelatieren eines Metallions an das Chitosan zur Bildung eines Metall/Chitosan-Komplexes umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 15, das weiters das Isolieren des Metall/Chitosan-Komplexes umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, das weiters das Kombinieren eines Antigens mit dem Metall/Chitosan-Komplex zur Bildung eines Immunogens umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, das weiters das Kombinieren eines Antigens mit dem Chitosan in der Lösung vor dem Chelatieren des Metallions an das Chitosan zur Bildung eines Immunogens umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin das Immunogen ein Immunogen nach einem der Ansprüche 5 bis 14 ist.

20. Verwendung eines Antigens in Kombination mit einem Adjuvans, das im Wesentlichen aus einer Kombination aus Chitosan und einem chelatierten Metall besteht, zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Tier, um eine Immunreaktion zu verstärken, die durch eine rasche Umstellung der Immunglobulin-Klassen-Produktion von IgM auf IgG gekennzeichnet ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, worin das Antigen an das Chitosan konjugiert ist.

22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, worin das Chitosan ein unlösliches Teilchenmaterial ist.

23. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zur intrarektalen Verabreichung dient.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin das Medikament zur intraperitonealen Injektion dient.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin das Medikament zur subkutanen Injektion dient.

26. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Antigen und Chitosan im Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 liegt.

27. Verwendung nach Anspruch 26, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Antigen und Chitosan im Bereich von 1 : 4 bis 1 : 10 liegt.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 27, worin das chelatierte Metall ein Übergangsmetall ist.

29. Verwendung nach Anspruch 28, worin das Übergangsmetall Kupfer, Zink oder Nickel ist.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 27, worin das chelatierte Metall Eisen ist.