DE69922990T2

DE69922990T2 - Herstellungsverfahren von festphasekonjugateimpfstoffen

Info

Publication number: DE69922990T2
Application number: DE69922990T
Authority: DE
Inventors: Andrew Lees
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2019-10-30
Also published as: ATE285790T1; WO2000025812A2; AU763691B2; EP1124576A2; ES2237210T3; AU1457100A; DE69922990D1; JP2002528516A; CA2348063A1; WO2000025812A3; EP1124576B1; US6585973B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konjugatimpfstoffe. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Festphasen-Konjugatimpfstoffe.
Beschreibung des zugehörigen Standes der Technik
Beim Impfvorgang macht sich die ärztliche Wissenschaft die angeborene Fähigkeit des Körpers, sich selbst gegen eindringende Agenzien zu schützen, zunutze durch Immunisieren des Körpers mit Antigenen, welche die Krankheit nicht verursachen, aber die Bildung von Antikörpern stimulieren, welche vor der Krankheit schützen. Zum Beispiel werden tote Organismen injiziert, um vor bakteriellen Erkrankungen wie Typhus und Keuchhusten zu schützen, Toxine werden injiziert, um vor Tetanus und Botulismus zu schützen, und abgeschwächte Organismen werden injiziert, um vor Viruskrankheiten wie Poliomyelitis und Masern zu schützen.
Es ist jedoch nicht immer möglich, die Antikörperbildung nur durch Injizieren des fremden Agens zu stimulieren. Das Impfstoffpräparat muss immunogen sein, d. h. es muss eine Immunantwort auslösen können. Bestimmte Agenzien wie Tetanus-Toxoid sind von Natur aus immunogen und können ohne Modifizierung in Impfstoffen verabreicht werden. Andere wichtige Agenzien sind jedoch nicht immunogen und müssen in immunogene Moleküle umgewandelt werden, bevor sie eine Immunantwort auslösen können. Die Immunantwort ist eine komplexe Folge von Reaktionen, welche allgemein wie folgt beschrieben werden kann: (1) Das Antigen tritt in den Körper ein und trifft auf Antigen-präsentierende Zellen, welche das Antigen prozessieren und Fragmente des Antigens auf ihren Oberflächen zurückbehalten; (2) die auf den Antigen-präsentierenden Zellen zurückbehaltenen Antigenfragmente werden von T-Zellen erkannt, welche B-Zellen Unterstützung leisten; und (3) die B-Zellen werden dazu stimuliert, zu wachsen und sich in antikörperbildende Zellen zu teilen, welche einen Antikörper gegen das Antigen sezernieren.
Die meisten Antigene rufen nur mit Unterstützung durch die T-Zellen Antikörper hervor, und sie werden folglich als T-abhängig (TD) bezeichnet. Beispiele für solche T-abhängige Antigene sind Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid.
Einige Antigene, wie etwa Polysaccharide, können durch Antigen-präsentierende Zellen nicht richtig prozessiert werden und werden durch T-Zellen nicht erkannt. Diese Antigene erfordern keine T-Zellen-Unterstützung zum Hervorrufen der Antikörperbildung, sondern können B-Zellen direkt aktivieren und werden folglich als T-unabhängige Antigene (TI) bezeichnet. Zu solchen T-unabhängigen Antigenen gehören H. influenzae-Typ b-Polyribosyl-ribitol-phosphat und Pneumokokken-Kapselpolysaccharide.
Weitere Unterschiede zwischen T-unabhängigen und T-abhängigen Antigenen sind:

a) T-abhängige Antigene, aber nicht T-unabhängige Antigene, können eine Immunantwort vorbereiten ("primen"), so dass bei einem zweiten Kontakt mit dem gleichen Antigen eine Gedächtnisantwort erfolgt.
b) Die Affinität des Antikörpers für das Antigen erhöht sich im Laufe der Zeit nach einer Immunisierung mit T-abhängigen, aber nicht mit T-unabhängigen Antigenen.
c) T-abhängige Antigene stimulieren ein unreifes oder neonatales Immunsystem wirksamer als T-unabhängige Antigene.
d) T-abhängige Antigene stimulieren gewöhnlich IgM, IgG1, IgG2a und IgE-Antikörper, während T-unabhängige Antigene IgM, IgG1, IgG2b und IgG3-Antikörper stimulieren.

T-abhängige Antigene können primäre und sekundäre Antworten stimulieren, welche sowohl in erwachsenen als auch in neonatalen Immunsystemen langlebig sind, müssen aber häufig mit Adjuvantien verabreicht werden. Sehr kleine Proteine, wie Peptide, sind kaum immunogen, selbst wenn sie mit Adjuvantien verabreicht werden.
T-unabhängige Antigene wie Polysaccharide sind imstande, Immunantworten in Abwesenheit von Adjuvantien zu stimulieren, können aber keine starken oder länger andauernden Antikörperreaktionen stimulieren. Sie sind auch nicht imstande, ein unreifes oder B-Zell-defizientes Immunsystem zu stimulieren (Mond JJ., Immunological Reviews, 64: 99 (1982) (Mosier DE, et al., J. Immunol., 119: 1874 (1977). Was T-unabhängige Antigene anbelangt, ist es von entscheidender Bedeutung, Kindern eine schützende Immunität gegen solche Antigene zu verleihen, insbesondere gegen Polysaccharide wie H. influenzae und S. pneumoniae. Was T-abhängige Antigene anbelangt, ist es von entscheidender Bedeutung, Impfstoffe auf der Basis von synthetischen Peptiden zu entwickeln, welche die primären antigenen Determinanten von verschiedenen Pathogenen wiedergeben.
Eine Vorgehensweise zum Verstärken der Immunreaktion auf T-unabhängige Antigene umfasst das Konjugieren von Polysacchariden wie H. influenzae-PRP (Cruse JM, Lewis RE Jr. Hrsg., Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, Band 10, (1989)) oder Oligosaccharid-Antigenen (Anderson PW, et al., J. Immunol., 142: 2464, (1989)) an ein einzelnes T-abhängiges Antigen wie Tetanus- oder Diphtherie-Toxoid. Es wurde gezeigt, dass das Heranziehen der T-Zellen-Unterstützung auf diese Weise vielen Kindern, welche immunisiert worden sind, eine erhöhte Immunität verleiht.
Protein-Polysaccharid-Konjugatimpfstoffe stimulieren eine Anti-Polysaccharid-Antikörper-Antwort bei Kindern, welche ansonsten nicht imstande sind, auf das Polysaccharid allein zu reagieren.
Konjugatimpfstoffe sind wirksam, aber teuer herzustellen. Siehe Cruse. Ein Problem bei der Herstellung von Konjugatimpfstoffen ist das Entfernen des nichtkonjugierten Proteins von dem kovalent gebundenen Protein. Typischerweise erfolgt dies durch Größenausschluss-Gelfiltration und erfordert eine große und zweckorientierte Säule. Houen et al., zeigten, dass Peptide an Protein gekuppelt werden konnten, das an Festphasen-Aluminium-Adjuvantien adsorbiert war. Houen, G. et al., J. Immun. Meth., 206: 125 (1997). Außerdem stellten sie fest, dass die durch diese Festphasen-Konjugate induzierte Anti-Peptid-Antikörper-Antwort höher war als die durch Konjugate, die in Lösungsphase hergestellt wurden, induzierte Antikörper-Antwort. Die Synthese dieser Festpha sen-Konjugate war einfach, da nichtkonjugiertes Peptid und Reagenzien durch Zentrifugation der Festphasen-Komponenten entfernt werden konnten. Von Bedeutung ist, dass es nicht erforderlich war, das Konjugat von dem Festphasengerüst, auf dem das Immunogen synthetisiert wurde, zu entfernen, da die Festphase selbst das Adjuvans ist. Dies beseitigt einen wesentlichen Nachteil von anderen Festphasen-Syntheseansätzen. Aber Houen et al. befassten sich nicht mit Nicht-Peptid-Anwendungen, z. B. Kohlenhydraten.
WO-A-9700697 (Peetermans, J. et al.) beschreibt einen Impfstoff, der ein Polysaccharid-Konjugat-Antigen umfasst, welches auf Aluminiumphosphat adsorbiert ist. WO-A-9640239 (Jennings, H. et al.) beschreibt einen Impfstoff, in welchem ein chemisch modifiziertes Polysaccharid an einen Proteinträger konjugiert ist. WO-A-9830239 (Lees, A. et al.) beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines Protein-Polysaccharid-Konjugats, wobei Polysaccharid mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse oder Ultrafiltration entfernt wird.
Kossovsky erörtert "Antigenverabreichungsvehikel", die aus einem Diamant-Nanopartikel gebildet sind, welches mit Cellobiose, einem Disaccharid, überzogen ist, um eine "Kolloidoberfläche" zu bilden, welche ein Proteinantigen binden würde. Kossovsky et al., Bioconj. Chem., 6(5), Seiten 507–520 (1995). Das Antigenverabreichungsvehikel dient dazu, das Proteinantigen zu präsentieren, um "eine starke immunogene Antwort" auf das Proteinantigen hervorzurufen. Es ist nicht beabsichtigt und wäre in der Tat unerwünscht, eine immunogene Antwort auf das Disaccharid hervorzurufen, da Cellobiose eine Wiederholungseinheit von Cellulose ist, welche ein üblicher Lebensmittelzusatz ist.
Somit besteht im Stand der Technik ein Bedarf, die Herstellung von Festphasen-Zweiträger-Konjugatimpfstoffen, insbesondere das Entfernen von freiem Hapten, Protein und Polysaccharid zu vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Festphasen-Konjugatimpfstoffen bereitzustellen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren zum Reinigen eines Konjugatimpfstoffs bereitzustellen, der ein Kohlenhydrat enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Festphasen-Konjugatimpfstoffen bereitzustellen, die eine Aluminium-Festphase, ein Protein und ein Kohlenhydrat enthalten.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das im Bereitstellen eines verbesserten Verfahrens zum Herstellen eines Festphasen-Konjugatimpfstoffs, der ein Hapten enthält.
Weitere Aspekte der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt und gehen zum Teil aus der Beschreibung hervor oder können durch die praktische Durchführung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Aspekte der Erfindung werden realisiert und erzielt mittels der Elemente und Kombinationen, die in den beigefügten Ansprüchen speziell aufgezeigt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Herstellen von Festphasen-Konjugatimpfstoffen bereit, worin zunächst ein Protein an ein Festphasen-Adjuvans adsorbiert wird und anschließend ein Oligosaccharid oder Polysaccharid kovalent an das adsorbierte Protein gebunden wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein neues Verfahren bereit, worin ein Kohlenhydrat zuerst an ein Festphasen-Adjuvans adsorbiert wird und ein Protein anschließend an das adsorbierte Kohlenhydrat kovalent gebunden wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem noch ein Verfahren bereit, worin das Kohlenhydrat vor dem Kuppeln an das Protein aktiviert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem noch ein Verfahren zum Herstellen von Festphasen-Konjugatimpfstoffen bereit, worin ein Hapten an ein Protein gebunden ist.
Das einfache kostengünstige Verfahren vermeidet das Erfordernis einer Chromatographie und gestattet das schnelle Entfernen von nichtkonjugiertem Kohlenhydrat, von dem gezeigt wurde, dass es die Immunantwort hemmt.
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung sind nur beispielhaft und dienen zur Erläuterung und beschränken die beanspruchte Erfindung nicht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine grafische Darstellung der Auswirkungen einer Veränderung des Polysaccharid/Protein-Verhältnisses.
2(a) veranschaulicht den Schritt des Adsorbierens eins Proteins an ein Festphasen-Adjuvans, gefolgt von einer Zentrifugation, um das mit Festphasen-Adjuvans versehene Protein (solid phase adjuvanted protein) zu ergeben.
2(b) veranschaulicht den Schritt des Konjugierens von aktiviertem Polysaccharid an ein Festphasen-Protein, gefolgt von einer Zentrifugation zum Entfernen des überschüssigen aktivierten Polysaccharids, um einen Festphasen-Protein-Polysaccharid-Konjugatimpfstoff zu erhalten.
3 veranschaulicht drei Wege für die Herstellung eines Doppelkonjugatimpfstoffs.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Festphasen-Chemie, ein Verfahren, bei dem die chemische Reaktion an Molekülen erfolgt, die an makromolekulare Oberflächen gebunden sind, ist im Fachgebiet wohlbekannt. G. B. Fields & S. P. Colowick, Hrsg., "Solid Phase Peptide Synthesis", Med. Enzym., Band 289, Academic Press, 1997. In der Festphasen-Synthese werden durch einfache Waschschritte die Reagenzien leicht entfernt und das Produkt erhalten.
Bei der Herstellung vom Impfstoffen für menschliche Impfstoffe ist das Entfernen des Impfstoffprodukts von der festen Phase, welche typischerweise ein polymerer Träger ist, problematisch. Eine Lösung für dieses Problem ist, als die Festphase ein für Immunogene geeignetes Material wie etwa Aluminium-Adjuvantien zu verwenden. Aluminium-Adjuvantien sind die einzigen Adjuvantien, die für eine pädiatrische Verwendung zugelassen sind.
Die Anmelderin hat ein verbessertes Verfahren für die Synthese von Protein-Polysaccharid-Konjugatimpfstoffen entwickelt, bei dem Makromoleküle, genauer gesagt Polysaccharide, nicht Haptene, an das adsorbierte Protein kovalent gebunden werden. Da selbst Polysaccharide mit sehr hohem Molekulargewicht bei niedriger Geschwindigkeit kein Pellet bilden, wird das nichtkonjugierte Polysaccharid von dem adsorbierten Konjugat durch Zentrifugation leicht abgetrennt. Dies ergibt eine einfache und kostengünstige Lösung für das ansonsten schwierige Entfernen von nichtkonjugiertem Polysaccharid. Wie vorstehend beschrieben ist, braucht das nichtkonjugierte aber adsorbierte Protein möglicherweise nicht entfernt werden und kann in der Tat zum Verstärken der Antikörper-Antwort der Proteinkomponente günstig sein.
Derzeitige FDA-Bestimmungen erfordern nicht, dass das freie Protein aus Konjugatimpfstoffen entfernt wird, setzen aber die zulässige Menge an freiem Polysaccharid fest. Es wurde gezeigt, dass freies Polysaccharid, insbesondere wenn es mehr als 10% der Gesamtmenge beträgt, die humorale Immunantwort auf das konjugierte Polysaccharid hemmt. Peeters, C. et al., Vaccine, 10: 833, 1992. Es ist deshalb wichtig, dass die Menge an freiem Polysaccharid in dem Endprodukt minimiert wird. Das Entfernen des freien Polysaccharids durch Gelfiltration ist jedoch schwierig, insbesondere wenn das Polysaccharid ein hohes Molekulargewicht aufweist.
Das Festphasen-Kupplungsverfahren gestattet die Herstellung von Protein-Polysaccharid-Konjugaten mit ansonsten schwierigen Proteinen, welche entweder wenig löslich oder als konzentrierte Lösungen schwierig herzustellen sind. Für die Konjugation der meisten Makromoleküle ist es wichtig, eine hohe Konzentration der Komponenten zu haben. Das Festphasen-Verfahren macht dies mit ansonsten schwierigen Proteinen möglich, da das adsorbierte Protein leicht konzentriert werden kann. Zum Beispiel wurde das F-Protein (isoliert aus Respiratory Syncytial Virus) nicht leicht konzentriert und war nur in Detergens löslich. Bis jetzt ist das F-Protein nicht durch herkömmliche Mittel in einer verdünnten Detergenslösung an ein Polysaccharid gebunden worden. Es ist jedoch möglich, das F-Protein an Alhydrogel zu adsorbieren und anschließend Polysaccharid an das adsorbierte Protein kovalent zu binden.
Proteine adsorbieren an Aluminium-Adjuvantien sowohl über hydrophobe als auch über ionische Wechselwirkungen. Al-Shakhshir R. H. et al., Vaccine 13: 41, 1995. Die Bindung ist häufig in der Nähe des isoelektrischen Punktes des Proteins optimal. Aufgrund der gemischten Art der Wechselwirkung kann die Adsorption von Proteinen nicht mit Gewissheit vorhergesagt werden und optimale Bedingungen müssen experimentell bestimmt werden. Die Bindung ist manchmal reversibel. Somit ist es erforderlich, eine Chemie zu verwenden, welche keine Bedingungen einsetzt, welche das Protein desorbieren oder in welchen das Protein leicht an das Adjuvans readsorbiert werden kann.
Das Protein unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Zu Beispielen für geeignete Proteine gehören Virus-, Bakterien-, Parasiten-, Tier- und Pilzproteine oder Lipoproteine, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Protein Albumin (wie etwa Rinderserumalbumin), F-Protein, Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid oder Bakterienaußenmembranprotein, welche alle von biochemischen oder pharmazeutischen Lieferfirmen erhalten werden können oder durch Standardmethoden hergestellt werden können (Cruse, JM (Hrsg.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, Band 10 (1989). Andere geeignete Proteine sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannt.
Vorzugsweise ist das Kohlenhydrat ein Oligosaccharid oder Polysaccharid. Zu Beispielen für geeignete Kohlenhydrate gehören neutrale Polysaccharide wie Pneumokokken-Typ 14-Kapsel-Polysaccharid (Pn14) und Dextran, und geladene Polysaccharide wie Neisseria-PsC, Pneumokokken-Polysaccharid-Typ 6 (Pn6), sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Vorzugsweise ist das Kohlenhydrat aktiviert. Der Aktivator unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Zu Beispielen für geeignete Aktivatoren gehören CDAP (1-Cyano-4-dimethylaminopyridin-tetrafluoroborat) und Bromcyan, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Protein kann zu dem aktivierten Polysaccharid direkt zugegeben werden, was die chemische Verknüpfung der zwei Komponenten vereinfacht. Lees, A. et al., Vaccine, 14: 190, 1996; siehe auch US-Patent Nr. 5,651,971 und 5,693,326. Vorzugsweise ist der Aktivator CDAP. Verschiedene chemische Reaktionen gestatten die Kupplung von Proteinen an Kohlenhydrate entweder mit oder ohne einen Spacer.
Das Aluminium-Adjuvans unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Im Allgemeinen können Metallsalze verwendet werden, z. B. Aluminium- und Calciumsalze. Zu Beispielen für geeignete Aktivatoren gehören Alaun (Kaliumaluminiumsulfat), Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumoxohydroxid, Aluminiumhydroxyphosphat, Calciumphosphat, Cernitrat, Zinksulfat, kolloidales Eisenhydroxid und Calciumchlorid, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Mehrere Aluminium-Adjuvantien mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften sind im Handel erhältlich und für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Vorzugsweise ist das Adjuvans Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat. R. H. Al-Shekhshir, et al., Vaccine, Band 13, 41; (1995); R. K. Gupta et al., Vaccine, Band 11, 293 (1993), M. F. Powell, et al., "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, "Pharmaceutical Biotech, Band 6, Plenum Press (1995). Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) mit einem isoelektrischen Punkt (P_i) von 11 adsorbiert bereitwillig viele Proteine mit einem niedrigen P; wie Tetanus-Toxoid und BSA, aber nicht basische Proteine wie Lysozym. Adjuphos (Aluminiumphosphat) mit einem P_i von 5 bindet Lysozym, aber nicht BSA. Al-Shakhshir R. H. et al., Vaccine 13: 41, 1995. Der isoelektrische Punkt von Alhydrogel kann durch die Zugabe von Phosphat verringert werden, welches die negative Ladung des Adjuvans erhöht und die Adsorption von stärker basischen Proteinen gestattet. Rinella Jr. J. V., et al., Vaccine 14: 298, 1996.
Neutrale Polysaccharide wie Pneumokokken-Typ 14-Kapsel-Polysaccharid (Pn14) und Dextran werden nicht bereitwillig an Alhydrogel adsorbiert. Deshalb werden diese nichtkonjugierten Polysaccharide durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension der Festphase leicht von dem Konjugat entfernt.
Geladene Polysaccharide wie Pneumokokken-Polysaccharid Typ (Pn6) können an das Adjuvans adsorbiert werden. Für solche Polysaccharide ist es erforderlich, Bedingungen zu bestimmen, unter denen eine minimale Adsorption des freien Polysaccharids stattfindet.
Dies kann durch Verändern der Oberflächenladung des Festphasen-Adjuvans mit Phosphatanionen erfolgen, was den isoelektrischen Punkt des Adjuvans verringert. Rinella Jr. J. V. et al., Vaccine 14: 298, 1996, Chang M. et al., PDA J. Pharm. Sci Tech., 51: 25, 1997.
Ein weiteres mögliches Problem mit dem Festphasen-Verfahren ist, dass die Vernetzungsbedingungen sorgfältig kontrolliert werden müssen, um ein homogenes Produkt herzustellen. In Lösungsphase können hohe Vernetzungsgrade zu einem stärker viskosen, aber noch immer brauchbaren Produkt führen. In der festen Phase kann eine Übervernetzung zu einer Verklumpung führen, welche es schwierig macht, einheitliche Dosen zu verabreichen. Somit ist die Optimierung der Konjugationsbedingungen, z. B. des Grades der chemischen Aktivierung des Polysaccharids und der Konzentration des Proteins erforderlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Festphasen-Adjuvans-Methode verwendet, um ein Hapten-Protein-Polysaccharid-Konjugat zu synthetisieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Haptene an Protein-Polysaccharid-Konjugate mit hohem Molekulargewicht gekuppelt, um erhöhte Antikörper-Antworten auf alle drei Komponenten des Impfstoffs: Hapten, Protein und Polysaccharid zu stimulieren. Das Protein und Hapten werden in einer mehrwertigen Anordnung an dem Polysaccharid präsentiert, was zu einer verstärkten B-Zell-Aktivierung und folglich einer verstärkten Antikörpersekretion führt. Dies ist ein "Doppelkonjugatimpfstoff" insofern, als er aus Hapten-Protein-Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht besteht. Lees et al., Vaccine, 12: 1160, 1994; US-Patent Nr. 5,585,100.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können außerdem Bestandteile an eine oder mehrere der Protein- oder Polysaccharidkomponenten konjugiert werden. Eine solche Konjugation fördert erhöhte Antikörper-Antworten auf den Bestandteil. Methoden zum Konjugieren solcher Bestandteile sind dem Fachmann wohlbekannt, und zu ihnen gehören zum Teil eine Kupplung über verfügbare funktionelle Gruppen (wie Amino-, Carboxyl-, Thio- und Aldehydgruppen). Siehe S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking, CRC Press (1991) und Brenkeley et al., "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents", Bio conjugate Chemistry 3: 1 (Jan. 1992), G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). So wie der Begriff hier verwendet wird, ist ein Bestandteil eine beliebige Substanz, welche das Immunsystem entweder von selbst oder sobald sie gekuppelt ist, stimulieren kann. Zu Bestandteilen gehören Haptene, Antigene oder Kombinationen davon.
Haptene beziehen sich auf kleine organische Moleküle, z. B. Peptide, Phosphorylcholin und TNP, welche selbst nicht imstande sind, eine Antikörper-Antwort hervorzurufen, aber eine Antikörper-Antwort hervorrufen können, sobald sie an einen Träger gekuppelt sind. Ein Antigen ist ein beliebiges Molekül, welches unter den richtigen Umständen die Bildung von Antikörpern induzieren kann. Diese Haptene und Antigene können von Bakterien, Rickettsien, Pilzen, Viren, Parasiten, Arzneimitteln oder Chemikalien herrühren, sind aber nicht darauf beschränkt. Zu ihnen können z. B. kleine Moleküle wie Peptide, Oligosaccharide (z. B. das Polyribosyl-ribitol-phosphat von H. influenzae), Toxine, Endotoxin usw. gehören.
Die Festphasen-Adjuvans-Vorgehensweise eignet sich gut für die Herstellung von Doppelkonjugatimpfstoffen, da eine sequenzielle Konjugationschemie an dem adsorbierten Protein durchgeführt werden kann, und die Abtrennung der nicht umgesetzten Komponenten von dem adsorbierten Konjugat leicht zustande gebracht wird. Somit kann das adsorbierte Protein mit Hapten markiert werden, entweder bevor oder nachdem es an das Polysaccharid gekuppelt wird. Geladene Haptene können jedoch unspezifisch an einige Adjuvantien binden. Wie bei geladenen Polysacchariden kann dies durch Verändern der Oberflächenladung des Adjuvans oder durch Auswahl einer geeigneteren Festphase umgangen werden, wie ein Fachmann leicht feststellen kann. Ein Beispiel für ein Festphasen-Adjuvans ist ein Teilchen mit immunverstärkenden Eigenschaften.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Festphasen-Adjuvans zum Synthetisieren von Hapten-Protein-Polysaccharid-Konjugaten verwendet, wobei Antigene verwendet werden, von denen gezeigt wurde, dass sie wichtige schützende Epitope für S. pneumoniae enthalten.
Pneumokokken besitzen außer typspezifischen Kapsel-Polysacchariden eine Reihe von Antigenen, die der Spezies gemeinsam sind. Phosphorylcholin (PC) ist eine Hauptde terminante des C-Polysaccharids von Pneumokokken, und es wurde gezeigt, dass Antikörper gegen PC Mäuse vor einer experimentellen Pneumokokkeninfektion schützen. Wallick, S. et al., J. Immunol., 130: 2871, (1983); McDaniel L. S. et al., J. Immunol., 133: 3308, (1984).
Das Pneumokokken-Oberflächenprotein A (PspA) ist ein oberflächenexponierter Virulenzfaktor, von dem gezeigt wurde, dass er eine schützende Immunität gegen Pneumokokkensepsis bei Mäusen hervorruft und einen Schutz gegen Pneumokokken von verschiedenen Kapseltypen hervorrufen kann. Wu, H-Y et al., J. Infec. Dis., 175: 839, 1997.
Ein Impfstoff, welcher gemäß der Erfindung hergestellt wird, ist für die Behandlung eines Patienten durch Verabreichung einer immunstimulierenden Menge des Impfstoffs brauchbar. Ein Patient ist ein beliebiges Individuum, für welches die Behandlung nützlich sein kann, und schließt Säuger, vorzugsweise Menschen, Pferde, Kühe, Hunde und Katzen sowie Vögel, wie etwa Hühner, ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Eine immunstimulierende Menge bezieht sich auf die Menge an Impfstoff, welche die Immunantwort des Patienten für die Verhütung, Linderung oder Behandlung von Krankheiten stimulieren kann. Der Impfstoff der Erfindung kann auf einem beliebigem Weg verabreicht werden, wird aber vorzugsweise durch intravenöse, intramuskuläre und subkutane Injektionen verabreicht.
Der gemäß der Erfindung hergestellte Impfstoff kann auch in einem Verfahren zum Herstellen eines immuntherapeutischen Agens gegen Infektionen, die durch Bakterien, Viren, Parasiten, Pilze oder Chemikalien verursacht werden, durch Immunisieren eines Wirtes mit dem vorstehend beschriebenen Impfstoff verwendet werden, so dass der Donor Antikörper erzeugt, die gegen den Impfstoff gerichtet sind. Antikörper werden isoliert oder B-Zellen können erhalten werden, um sie später mit Myelomzellen zu fusionieren, um monoklonale Antikörper herzustellen. Das Verfahren zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern ist im Fachgebiet wohlbekannt, Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975), und durch Bezugnahme spezifisch in diese Anmeldung aufgenommen und bedarf hier keiner weiteren Beschreibung.
Das immuntherapeutische Agens bezieht sich auf eine Zusammensetzung von Antikörpern, welche gegen spezifische Immunogene gerichtet sind, zur Verwendung bei einer passiven Behandlung von Patienten. Ein Plasmadonor ist ein beliebiges Individuum, welchem ein Impfstoff zur Herstellung Antikörpern gegen die in dem Impfstoff enthaltenen Immunogene injiziert wird.
Der gemäß der Erfindung hergestellte Impfstoff kann auch in einem Verfahren zum Behandeln eines Patienten durch die Verabreichung einer schützenden Menge des immuntherapeutischen Agens verwendet werden. Eine solche Behandlung ist insofern passiv, als sie den Patienten nicht dazu bringt, Antikörper gegen ein Immunogen zu erzeugen, sondern stattdessen Antikörper verwendet, die von dem Plasmadonor gegen das Immunogen erzeugt wurden. Die Menge an therapeutischen Antikörpern ist schützend, wenn sie eine ausreichende Anzahl von Antikörpern aufweist, welche die durch das Immunogen verursachte Krankheit verhüten, lindern oder behandeln kann. Eine solche Menge kann von einem Fachmann bestimmt werden und variiert auf der Grundlage der Charakteristika des Patienten und des Krankheitsprofils.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines diagnostischen Reagenzes und/oder Forschungsreagenzes zum Nachweisen von Agentien, welche für Krankheiten, die z. B. durch Bakterien, Viren, Pilze, Parasiten oder Chemikalien verursacht werden, charakteristisch sind, durch Immunisieren eines Wirts mit einem Impfstoff, der vorstehend beschrieben ist, so dass der Wirt Antikörper (oder B-Zellen) gegen die Agentien erzeugt. Die Antikörper und/oder B-Zellen können wie vorstehend beschrieben isoliert werden. So wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich diagnostisches Reagenz auf eine Zusammensetzung von Antikörpern (polyklonal oder monoklonal), welche zum Nachweisen von Agentien verwendet werden können, welche für Krankheiten charakteristisch sind. So wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich Forschungsreagenz auf eine Zusammensetzung von Antikörpern (polyklonal oder monoklonal), welche im Labor verwendet werden kann.
METHODIK
Das Gesamtverfahren zum Herstellen eines Festphasen-Konjugats ist in 3 veranschaulicht.
Reagenzien
Pneumokokken-Typen 6B und 14 sind von der ATCC erhältlich. Tetanus-Toxoid ist von dem Statens Seruminstitute (Dänemark) erhältlich. Stabilisierte Aluminium-Adjuvantien, Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) und Adjuphos (Aluminiumphosphat) sind von Accurate Chemical (Westbury, NY) erhältlich. Das Phosphorylcholinanalog 6-(O-Phosphorylcholin)hydroxyhexansäure (PC-CO₂H), das durch das Verfahren von Spande hergestellt wurde, war ein Geschenk von J. Kenny (National Institute on Aging, NIH). Spande, T. F., J. Org. Chem., 45: 3081, (1980).
Rekombinantes Pneumokokken-Oberflächenprotein A (rPspA), bestehend aus den N-terminalen 290 Aminosäuren und einem 6xHis C-Terminus wurde in Hefezellen kultiviert, wie es von Wortham et al., Infect. Immun., 66: 1513, 1998 beschrieben ist. Nach einer anfänglichen Reinigung durch Ni-NTA-Chromatographie (Qiagen) kann das Protein durch Ionenaustauschchromatographie wie folgt weiter gereinigt werden: die Ni-NTA-Fraktion wird in 5 mM TrisHCl + 15 mM Tris dialysiert und auf eine Mono-Q-Säule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist, aufgegeben. Das Salz wird stufenweise auf 50 mM NaCl heraufgesetzt und das Protein während eines 50 mM-0,4 M NaCl-Gradienten eluiert. Der rPspA-Peak, bestimmt durch ELISA, wird gepoolt und durch Ultrafiltration auf 5 mg/ml konzentriert, in Salzlösung ausgetauscht und mit einem Millex GV 0,2 μ-Filter sterilfiltriert. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE bestätigt. Die Konzentration wird aus dem berechneten Extinktionskoeffizient von 7620 M^–1 bestimmt.
Adsorption von Proteinen an Festphasen-Adjuvantien
Das Standardverfahren für die Adsorption von Proteinen an Alhydrogel ist wie folgt, wie es allgemein in 2a veranschaulicht ist. BSA wurde an Alhydrogel adsorbiert, wie es von Houen et al., "Conjugation to Preadsorbed Preactivated Proteins and Efficient Generation of Antipeptide Antibodies", J. Immunol. Meth., 206: 125–134, (1997) allgemein beschrieben ist. BSA wurde zunächst an das Aluminium-Adjuvans, Alhydrogel durch Kombinieren von 4,2 ml BSA (50 mg/ml in Salzlösung) mit 23 ml Alhydrogel (1 : 2 Verdünnung in Salzlösung) adsorbiert und über Nacht durch Rotation in einem 50 ml-Röhrchen vorsichtig vermischt. Das adsorbierte Protein wurde dreimal durch Zentrifuga tion bei 3200 × g 10 Minuten gewaschen und in Salzlösung resuspendiert. Das am Ende erhaltene Pellet wurde in 10 ml Salzlösung + 0,02% Azid resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Das adsorbierte BSA wurde unter Verwendung des Micro-BCA-Assays (Pierce Chemical) mit löslichem BSA als Standard getestet. Es wurde festgestellt, dass > 95% des BSA sich an dem Festphasen-Adjuvans befand.
Tetanus-Toxoid (5 mg/ml) wurde in 10 mM MES, 0,15 M NaCl, pH 6 dialysiert. rPspA (5 mg/ml) wurde in 50 mM Natriumacetat, pH 5 dialysiert. Das Protein wurde mit 1% Alhydrogel vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Das Festphasen-Adjuvans-adsorbierte Protein wurde 15 Minuten in 1,5 ml-Röhrchen in einer Mikrozentrifuge bei 16000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde in 1 ml von 25 mM Natriumacetat, pH 5 resuspendiert, wobei ein Mikrohomogenisator (Kontes "Pellet Pestle") verwendet wurde, und rezentrifugiert. Die Waschschritte wurden zwei weitere Male wiederholt und das adsorbierte Protein in dem am Ende eingesetzten Puffer resuspendiert. Um die Dichte des adsorbierten Proteins zu verändern, können Verhältnisse von 0,25–5 mg Alhydrogel pro mg Protein verwendet werden. Bei 1 mg Protein/mg Alhydrogel waren > 90% des Proteins adsorbiert. Falls es erforderlich ist, kann der isoelektrische Punkt des Alhydrogels durch die Zugabe von begrenzten Mengen an Phosphat verringert werden, wie es von Rinella, Jr., J. V. et al., Vaccine 14: 298 (1996) beschrieben ist. Wenn sich Alhydrogel zur Verwendung beim Herstellen von Festphasen-Protein-Polysaccharid-Konjugaten mit negativ geladenen Polysacchariden, wie etwa Pn6, oder Konstrukten, die negativ geladene Haptene, wie etwa Phosphorylcholin, enthalten, als unbefriedigend erweist, kann das Protein an ein Festphasen-Aluminium-Adjuvans mit einem niedrigen isoelektrischen Punkt, z. B. Adjuphos, adsorbiert werden. Adjuphos-adsorbiertes Protein und Konjugate werden in einem 25 mM pH 9 Carbonatpuffer anstelle des mit Alhydrogel verwendeten 25 mM Natriumacetatpuffers resuspendiert.
Protein wurde unter Verwendung des BCA-Microassays (Pierce Chem. Co.) getestet. Durch Verwenden des Testproteins BSA und "Buchführen" über alle Fraktionen haben wir festgestellt, dass adsorbiertes Protein mit diesem Verfahren quantifiziert werden kann.
Polysaccharid wurde mit dem Resorcinol/Schwefelsäure-Verfahren von Monsigny et al., Anal. Biochem., 175: 525 (1988) getestet.
Allgemeines Verfahren für die CDAP-Aktivierung von Polysaccharid (2)
Pn14 wurde in einer Menge von 10 mg/ml in Wasser solubilisiert. CDAP (Research Organics) wurde in einer Menge von 100 mg/ml in Acetonitril hergestellt. Bei t = 0 wurde CDAP zu PS zugegeben. Nach 30 Sekunden wurde 0,2 M Triethylamin (TEA) zugegeben, um den pH auf 9,5 zu bringen. Der pH wurde bei 9–9,5 gehalten und nach 2,5 Minuten zu einer verwirbelten Lösung von Protein (entweder löslich oder adsorbiert) zugegeben. Festphasen-Konjugate wurden mit einem Mikrohomogenisator während der ersten Stunde regelmäßig vermischt. Nach einer Reaktion über Nacht wurde die Reaktion in der Lösung durch Zugeben von Ethanolamin bis auf 0,1 M und Inkubieren während einer Stunde angehalten. Lösungsphasen-Konjugate wurden durch Gelfiltration an einer S400HR-Säule (Pharmacia) verarbeitet, um nichtkonjugiertes Protein zu entfernen. Nichtkonjugiertes Polysaccharid wurde von Adjuvans-adsorbierten Proteinen entfernt, indem zuerst die Lösung auf eine Konzentration von 25 mM Natriumacetat gebracht wurde, der pH mit 1 N HCl auf 5 verringert wurde und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert wurde. Das Festphasen-Konjugat wurde wie beschrieben gewaschen. Um den Grad der Polysaccharid-Aktivierung zu verändern, wurden CDAP-Verhältnisse von 0,25–1 mg CDAP/mg PS getestet. Um die Kupplungsbedingungen zu verändern, wurde das adsorbierte Protein vor der Zugabe des CDAP-aktivierten PS in einer Konzentration von 5, 10 oder 20 mg/ml resuspendiert. CDAP-aktiviertes Pn14 kann an das Adjuvansadsorbierte PC-rPspA gebunden werden.
In allen vorstehenden Fällen wurde freies nichtkonjugiertes Hapten, Protein oder Polysaccharid durch Zentrifugation und Waschen des Alhydrogels, welches den Konjugatimpfstoff enthält, aus dem Endprodukt entfernt. Dies ist der hauptsächliche zeit- und kostensparende Schritt bei der Herstellung der Konjugatimpfstoffe, da keine Säulenchromatographie zum Entfernen von freiem Hapten, Protein oder Polysaccharid verwendet werden muss.
Immunisierungen
Das Folgende liefert ein Beispiel dafür, wie Immunisierungen in Mäusen durchgeführt werden können. Gruppen von 5 Balb/c-Mäusen werden an den Tagen 0 und 14 mit den verschiedenen Impfstoffkonstrukten in Dosen im Bereich von 0,01–10 μg subkutan immunisiert und 14 Tage später wird ihnen Blut entnommen. Um die Menge des Adjuvans zu optimieren, werden Immunogene mit zusätzlichem Alhydrogel in dem Bereich von 0–0,5 mg/Maus vermischt. Als ein Beispiel zum Optimieren der Menge von zusätzlichen Adjuvantien werden die Festphasen-Konjugatimmunogene mit Alhydrogel vermischt.
ELISA
Alle Immunassays werden unter Verwendung von Nunc Maxisorp-Stripwells (Nunc 469949) durchgeführt. Unter Verwendung von zuvor hergestellten Antiseren gegen Phosphorylcholin, PspA, Tetanus-Toxoid, Pn14 und Pn6B werden vorbereitende Versuche durchgeführt, um die optimale Konzentration des Beschichtungsantigens zu bestimmen. PC wird an BSA zur Verwendung als ELISA-Antigen gebunden, wobei das vorstehend beschriebene Verfahren verwendet wird. Für ELISA's werden 100 μl Antigenlösung in PBS (pH 7,4) in alle Vertiefungen bzw. Näpfe gegeben und die Platte mit einer Plattenabdichtung bedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden viermal mit 0,05% Tween-20 enthaltendem PBS (PBS-T) gewaschen, um ungebundenes Beschichtungsantigen zu entfernen. Serumproben werden an 6–7 Verdünnungen, die in PBS-T hergestellt werden, getestet. 100 μl von jeder Verdünnung werden in doppelte Vertiefungen auf der Antigen-beschichteten Platte gegeben. Negative Kontrollvertiefungen erhalten nur PBS-T. Positive Kontrollvertiefungen sind eingeschlossen. Zu Vergleichszwecken enthält jede ELISA die jüngsten Serumproben sowie die vorhergehenden Serumproben. Im Anschluss an die Zugabe der Serumproben wird die Platte 30–60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und die Vertiefungen werden wieder mit PBS-T gewaschen. Alle Vertiefungen erhalten 95 μl Kaninchen-Anti-Maus-IgG (gammaspezifisch) konjugiert an HRP. Die Platten werden wieder 30–60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit PBS-T gewaschen. 100 μl TMB-Substrat werden zu allen Vertiefungen zugegeben und die Platte im Dunkeln 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 80 μl der TMB-Stopplösung gestoppt und die Extinktionen werden bestimmt, wobei ein Molecular Devices Mikroplattenlesegerät mit einem 450 nm Filter verwendet wird. Die Titer werden unter Verwendung des SoftMax Programms berechnet. Die Spezifität von Anti-PC-Antikörpern wird bestä tigt durch Vorinkubation des Antikörpers mit 100 μg/ml Phosphorylcholin (Aldrich) und das Blockieren der Antikörperbindung an PC-BSA wird bestimmt.
In ausgewählten Fällen wird die schützende Aktivität der Seren unter Verwendung eines opsonischen Tests bestimmt. Fischer, GW et al., J. Infect. Dis., 169: 324 (1994). Dem Fachmann ist klar, dass die Methodik für die Herstellung von Festphasen-Polysaccharid-Konjugaten eine Optimierung für ein bestimmtes Konjugat wie etwa PC-PspA-Pn6 erfordern kann. Zum Beispiel kann es erforderlich sein, die Bedingungen zu modifizieren, um eine unspezifische Adsorption von PC und Pn6 zu verhindern. So kann, wenn eine Verringerung der positiven Ladung des Alhydrogels durch Adsorption von begrenzten Mengen an Phosphat die unspezifische Bindung nicht verhindert, oder wenn wir nicht imstande sind, PspA an geladenes Adjuphos zu adsorbieren, der isoelektrische Punkt des PspA durch gentechnisches Erzeugen eines Polylysin-Schwanzes am C-Terminus angehoben werden, um die Bindung des Proteins an Adjuphos zu fördern, welches einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 5 aufweist. Das negativ geladene Adjuphos sollte keine Anionen binden.
BEISPIELE
A. HERSTELLUNG VON FESTPHASEN-KONJUGATIMPFSTOFF
Diese Beispiele zeigen das Konjugationsverfahren an einer Festphasen-Matrix und untersuchen einige der Parameter, die für die Kupplung von Polysacchariden mit hohem Molekulargewicht (PS) an Festphasen-Adjuvans-adsorbiertes Protein wichtig sind. BSA wurde als ein repräsentatives Protein verwendet und wurde an das handelsübliche Festphasen-Aluminiumhydroxid-Adjuvans Alhydrogel adsorbiert, wie es von Houen, G. et al., J. Imm. Meth., 206: 125, 1997 beschrieben ist. Das Polysaccharid wurde mit 1-Cyano-4-dimethylaminopyridin-tetrafluoroborat (CDAP) aktiviert, wie es allgemein von Lees et al., Vaccine, 14: 190 (1996) beschrieben ist, und anschließend an das adsorbierte Protein gekuppelt, wie es nachstehend beschrieben ist.
BEISPIEL 1 Auswirkung der Polysaccharid-Aktivierung und des Kupplungs-pH's auf die Effizienz der Konjugation an Protein, das an einer festen Adjuvans-Matrix adsorbiert ist
S. pneumoniae-Polysaccharid-Typ 14 (Pn14) (3 mg mit einer Konzentration von 10 mg/ml) wurde mit 0,25, 0,5 oder 1 mg CDAP/mg Polysaccharid und einer 2× molaren Menge von Triethylamin (TEA) aktiviert und zu 3 mg BSA/Alhydrogel zugegeben, das in 100 μl von 0,1 M Natriumborat; pH 9,3 suspendiert war. Nach einer Inkubation über Nacht mit Vermischen wurden die Reaktionen in den Lösungen mit Ethanolamin angehalten und die Lösungen durch Zentrifugation gewaschen, um nichtkonjugiertes Polysaccharid zu entfernen. Das Protein wurde unter Verwendung des BCA-Microassays (Pierce Chemical Co.) getestet, und das Polysaccharid wurde mit dem Resorcinol/Schwefelsäure-Verfahren von Monsigny et al., Anal. Biochem., 175: 525 (1988) getestet. Wie in Tabelle 1 angegeben ist, war das Ausmaß der PS-Kupplung an das adsorbierte Protein umso größer, je größer die Menge des verwendeten CDAP war.
Die Reaktion wurde auch in einem HEPES-Puffer bei pH 7,3 durchgeführt. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war die Kupplungseffizienz des PS an das Protein bei pH 7,3 erheblich geringer.
Dieser Versuch zeigt, dass CDAP-aktivierte Polysaccharide mit dem Adjuvansadsorbierten Protein reagieren und dass der Grad der CDAP-Aktivierung und der pH der Kupplung das Ausmaß der Kupplungseffizienz auf eine ähnliche Weise wie in Lösungsphasen-Reaktionen beeinflussen. Lees, A. et al., Vaccine, 14: 190 (1996).
Tabelle 1. Auswirkung der Polysaccharid-Aktivierung und des Kupplungs-pH's auf die Proteinkonjugationseffizienz
BEISPIEL 2 Auswirkung der Veränderung des Polysaccharid/Protein-Einsatzmengen-Verhältnisses
BSA wurde an Alhydrogel adsorbiert und CDAP-aktiviertes Dextran wie vorstehend beschrieben hergestellt und zu dem adsorbierten Protein in den in 1 gezeigten Verhältnissen zugegeben. Wenn die Menge an Dextran bezogen auf BSA erhöht wurde, gab es eine Abnahme des Prozentsatzes von Dextran, welches konjugiert wurde, aber eine Gesamtzunahme der absoluten Menge an Dextran, welches konjugiert wurde (1). Dies zeigt, dass das Verhältnis von Polysaccharid zu Protein durch Verändern des PS/Protein-Einsatzmengen-Verhältnisses verändert werden kann.
BEISPIEL 3 Nichtkonjugiertes neutrales Polysaccharid wird nicht an Alhydrogel adsorbiert
3 mg Dextran oder CDAP-aktiviertes Dextran mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurden zu 3 mg Alhydrogel-adsorbiertem BSA mit einer Konzentration von 10 mg/ml in 5 mM Natriumborat, pH 9,3 gegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wurde der pH durch Zugeben von 1 M Natriumacetat auf 5 verringert. Das Festphasen-Material wurde zentrifugiert und dreimal in 1 ml 50 mM Natriumacetat (pH 5) resuspendiert.
Die Rückgewinnung von Protein und Polysaccharid wurde bestimmt. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, wurde sehr wenig, wenn überhaupt, Dextran an das Festphasen-Protein adsorbiert, sofern das Dextran nicht mit CDAP aktiviert war. Dieser Versuch zeigt auch die ausgezeichnete Rückgewinnung des Konjugats, welche durch die Festphasen-Methodik erhalten werden kann. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Pn14 erhalten.
Tabelle 2. Polysaccharid-Adsorption an Alhydrogel
BEISPIEL 4. Synthese eines Modell-Konjugatimpfstoffs an einer festen Matrix und Immunisierung von Mäusen
BSA wurde an Alhydrogel adsorbiert und gewaschen, wie es vorstehend in dem Abschnitt Methodik beschrieben ist. Pn14 wurde mit CDAP aktiviert (wie vorstehend in dem Abschnitt Methodik beschrieben) und zu dem BSA/Alhydrogel zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wurden die Reaktionen in den Proben angehalten und die Proben durch wiederholte Zentrifugation gewaschen, um freies PS zu entfernen. Kontrollen wurden hergestellt durch Vermischen von Pn14 mit Alhydrogel ("Alhy."), allein und mit adsorbiertem Protein, und durch Vermischen von CDAP-aktiviertem Pn14 mit Alhydrogel.
Gruppen von 4 Balb/c-Mäusen wurden an den Tagen 0, 14 und 18 mit 2,5 μg Pn14, entweder als durch Festphasen-Synthese hergestellte Konjugate oder wie in Tabelle 3 angegeben, subkutan immunisiert. Mäuse in der Konjugatgruppe erhielten 3 μg BSA. Nur-BSA-Gruppen erhielten 5 μg BSA. An Seren von einer Blutentnahme am Tag 42 wurde durch ELISA der Titer für IgG-Antikörper gegen Pn14 bestimmt.
Dieser Versuch zeigt, dass Anti-Polysaccharid-Antikörper unter Verwendung von Konjugaten induziert werden können, die unter Verwendung einer Festphasen-Vorgehensweise hergestellt sind. In Abwesenheit einer kovalenten Bindung des Polysaccharids an das Protein wurde kein Anti-Polysaccharid-Antikörper nachgewiesen. Die kovalente Bindung des Polysaccharids an das Protein erfolgt nur, wenn das Polysaccharid z. B. durch CDAP aktiviert worden ist. Dieser Versuch verglich nicht die Wirksamkeit von Konjugaten, die hergestellt wurden durch Festphasen-Verfahren gegenüber herkömmlichen Verfahren.
Tabelle 3. Immunisierung von Mäusen durch Festmatrix-Konjugatimpfstoff
B. ANTIKÖRPERINDUKTION
Es wurden Antigene verwendet, von denen gezeigt worden ist, dass sie schützende Antikörper für Streptococcus pneumoniae induzieren. Diese Beispiele induzieren einen schützenden Antikörper gegen S. pneumoniae mit hohem Titer unter Verwendung der vorgeschlagenen Impfstoffkomponenten Phosphorylcholin (PC) und Pneumokokken-Oberflächenprotein A (PspA).
BEISPIEL 5. Synthese eines klinisch relevanten Konjugatimpfstoffs unter Verwendung einer Festphasen-Adjuvans-Matrix
Das Fusionsprotein (RSV F-Protein) wurde aus in Hep-2-Zellen kultiviertem Respiratory Syncytial Virus aufgereinigt und an Alhydrogel adsorbiert. Das Alhydrogel-adsorbierte Protein wurde durch Zentrifugation gewaschen, um nicht adsorbiertes Protein zu entfernen, und an CDAP-aktiviertes Pn14 gekuppelt. Nichtkonjugiertes Pn14 wurde durch Zentrifugation entfernt. Gruppen von 4 Balb/c-Mäusen wurden an den Tagen 0 und 14 mit 2,0 μg des auf Alhydrogel hergestellten F-Protein-Pn14-Konjugats oder mit 2 μg an Alhydrogel adsorbiertem F-Protein plus 5 μg Pn14, gemeinsam vermischt mit dem Protein, subkutan immunisiert. Zusätzliches Alhydrogel wurde mit jedem Immunogen vermischt, so dass jede Maus insgesamt 0,1 mg Alhydrogel pro Immunisierung erhielt. Anti-F-Protein- und Anti-Pn14-ELISA-Titer wurden an gepoolten Seren von Mäusen bestimmt, denen am Tag 28 Blut entnommen wurde.
Pools der vorstehenden Seren wurden auf ihre Fähigkeit zur Verstärkung der Opsonosphagocytose getestet. Nur Seren von Mäusen, die mit dem konjugierten Pn14 immunisiert wurden, wiesen eine opsonophagocytische Aktivität auf. Dieser Versuch zeigt, dass der Konjugatimpfstoff, der unter Verwendung von an Pn14 konjugiertem RSV F-Protein unter Verwendung eines Festphasen-Systems hergestellt wurde, Antikörper mit hohem Titer sowohl gegen die PS-Komponente als auch gegen die Proteinkomponente induziert. Im Gegensatz dazu ergaben Mäuse, die mit dem Festphasen-F-Protein, ver mischt mit Pn14, immunisiert wurden, keinen Titer gegen das Polysaccharid. Ergebnisse sind Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4. Synthese eines klinisch relevanten Konjugatimpfstoffs unter Verwendung einer Festphasen-Adjuvans-Matrix
BEISPIEL 6. Induktion von Hochtiter-Anti-Phosphorylcholin (PC)-Antikörpern, welche schützend sind
Um zu untersuchen, ob wir einen Hochtiter- und schützenden Antikörper gegen PC induzieren konnten, konjugierten wir ein PC-Analog an Tetanus-Toxoid oder Pertussis-Toxoid (PC-TT, PC-PT), im Wesentlichen wie in dem Abschnitt Methoden beschrieben, und immunisierten DBA/2-Mäuse mit 5 μg Protein. Die Mäuse erhielten 14 Tage später eine Booster- bzw. Auffrischungsimpfung und von Seren vom Tag 28 wurde der Titer für IgG-Antikörper gegen PC bestimmt. Wie in Tabelle 5 ersichtlich, wurden die Mäuse stimuliert, Hochtiter-Anti-PC-Antikörper nach der Auffrischungsimmunisierung zu erzeugen. Alle Mäuse, denen TT- oder PT-Konjugate injiziert wurden, wiesen auch Hochtiter-Antikörper-Antworten auf das Trägermolekül auf (nicht gezeigt).
Tabelle 5. Induktion von Hochtiter-Anti-Phosphorylcholin (PC)-schützenden Antikörpern
Um zu bestimmen, ob der Anti-PC-Antikörper, der durch diese Immunogene induziert wurde, schützend war, wurden Mäusen 0,1 ml Testserum oder Kontrollserum injiziert. 24 Stunden später wurden die Mäuse mit 20000 Organismen des WU2-Stammes von S. pneumoniae infiziert. Während alle 5 Kontrollmäuse, die eine Injektion erhalten hatten, innerhalb von 72 Stunden starben, starb keine der Mäuse, welchen das Anti-PC-haltige Serum gegeben wurde. Dies zeigt, dass Hochtiter- und schützende Antikörper nach einer Konjugation von PC an klinisch relevante Träger erzeugt werden können.
BEISPIEL 7. Induktion von Antikörpern gegen multiple S. pneumoniae-Epitope
Um zu bestimmen, ob wir PC an ein anderes S. pneumoniae-schützendes Epitop konjugieren und Antikörper gegen beide Komponenten induzieren konnten, wurde ein PC-Analog an Pneumokokken-Oberflächenprotein A (PspA), wie in dem Abschnitt Methoden beschrieben, konjugiert und 5,0 μg wurden s. c in 5 DBA/2-Mäuse an den Tagen 0 und 14 injiziert. Den Mäusen wurde 14 Tage später Blut entnommen und von den Seren der Titer für IgG-Antikörper sowohl gegen PC als auch gegen PspA bestimmt. 5 μg Psp-A oder 5 μg PspA sind entweder löslich oder mit Alhydrogel vermischt. Die Daten in Tabelle 6 zeigen, dass wir Hochtiter-IgG-Antikörper sowohl gegen die PC-Komponente als auch gegen die PspA-Komponente des Impfstoffs induzieren können.
Tabelle 6. Induktion von Antikörpern gegen multiple S. pneumoniae-Epitope
BEISPIEL 8. Konjugate, die nichtkonjugiertes Protein enthalten, sind immunogen und protektiv
TT wurde Verwendung von CDAP an Pn14 konjugiert und das freie Protein durch Gelfiltration an einer S400HR-Säule entfernt. Ein weiteres Aliquot des gleichen Konjugats wurde nur dialysiert (Cutoff 14 kDa) und enthielt ungefähr 50% nichtkonjugiertes TT (bestimmt durch Größenausschluss-HPLC). Die Rückgewinnung des Polysaccharids war für die nur dialysierte Probe deutlich höher als für die gelfiltrierte Probe (> 95% gegenüber 37%). Gruppen von 4 Mäusen wurden mit jedem Präparat an den Tagen 0 und 14 immunisiert, und 14 Tage danach wurde Blut entnommen. Anti-IgG-Titer wurden durch ELISA bestimmt. Sowohl Anti-Protein- als auch Anti-PS-Antikörpertiter waren für die nur dialysierten Formulierungen höher.
Tabelle 7. Auswirkung von nichtkonjugiertem Protein
Die Daten legen nahe, dass homologes nichtkonjugiertes Protein, das mit konjugiertem Protein zugegen ist, die Immunantwort mehr stimuliert als Konjugate, aus denen das freie Protein entfernt worden ist. Somit ergibt die Anwesenheit von nichtkonjugiertem adsorbiertem Protein in den Festphasen-Protein-Polysaccharid-Immunogenen eine gegenüber der Immunantwort von herkömmlichen Präparaten erhöhte Immunantwort.
BEISPIEL 9. Immunogenität von TTPS-Konjugaten, die unter Verwendung von Festphasen-Adjuvans mit verschiedenen PS und Verknüpfungs-Chemien hergestellt werden
TT wurde an Alhydrogel adsorbiert und entweder an PN14 oder Neisseria PsC gekuppelt. Pn14 wurde mit CDAP aktiviert und unter Verwendung einer Thioether-Chemie oder Halogenacylkonjugation gekuppelt. Das Thioether-Chemieverfahren ist allgemein in Lees, Vaccine, 12: 1160 (1994) erörtert. Die Halogenacylkonjugation ist z. B. in Lees et al., Abstract for 11^th Int. Pathogen. Neisseria Conf., Nizza, Frankreich, Seite 161 (1998) beschrieben. Im Anschluss an die Konjugation wurde freies PS durch Zentrifugation entfernt und das Festphasen-Konjugat auf PS und TT getestet. Gruppen von 4 Balb/c-Mäusen wurden mit 5 μg konjugiertem PS, das die angegebene Menge an TT enthielt, am Tag 0 und 14 immunisiert, und 14 Tage später wurde ihnen Blut entnom men. Gepoolte Seren von der Blutentnahme am Tag 28 wurden durch ELISA auf das homologe PS und auf TT getestet.
Tabelle 8. Auswirkung einer Änderung von PS und Verknüpfungs-Chemie
Dies zeigt, dass sich das Verfahren für eine Reihe von verschiedenen Chemien, Proteinen und Polysacchariden eignet. Man beachte, dass das Halogenacyl/PsC-Konjugat eine hohe Anti-PsC-Antwort ergab, die mit Ergebnissen in Abwesenheit mit Lösungsphasen-TT-(Halogenacyl)-PsC-Konjugaten übereinstimmte. Man beachte, dass nichts unternommen wurde, um das Konjugationsprotokoll oder die Dosis zu optimieren. Der Zweck dieses Versuchs war, zu zeigen, dass unter Verwendung einer Reihe von Chemien Polysaccharide gekuppelt und zum Induzieren von Antikörpern verwendet konnten. Außerdem konnte kein Vergleich zwischen Anti-PsC und Pn14-Titern angestellt werden.
Die folgenden vier Beispiele zeigen die Herstellung von Doppelkonjugatimpfstoffen. Es kann weiterhin auf US-Patent Nr. 5,955,079 verwiesen werden.
BEISPIEL 10. Konjugieren von PS an Adjuvans-adsorbiertes Hapten-Protein (allgemein in 3(II) beschrieben)
Tetanus-Toxoid (TT) wurde wie vorstehend beschrieben an Alhydrogel adsorbiert und in einer Konzentration von 5 mg/ml in HEPES-Puffer (0,15 M HEPES, 2 mM EDTA, pH 7,3) resuspendiert. N-Hydroxysuccinimidyliodacetat (SIA) wurde von einer 0,1 M Stammlösung in Dimethylformamid in einem 10-fachen Molverhältnis von SIA zu TT zugegeben und im Dunkeln reagieren gelassen. Nach einer Stunde wurde das TT durch Zentrifugation mit HEPES-Puffer gewaschen, um nichtumgesetztes Reagenz zu entfernen. Das iod-acetylierte adsorbierte TT wurde in HEPES-Puffer in einer Konzentration von 10 mg/ml resuspendiert.
Ein von enterotoxigenem E. Coli abgeleitetes Konsensus-Peptid (FJ Cassels et al. J. Industrial Microbiology and Biotechnology 19: 66 (1997) (Sequenz: CVEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAG) wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in HEPES-Puffer + 10% Acetonitril solubilisiert. Der freie Thiolgehalt wurde unter Verwendung von Ellman's Reagenz bestimmt.
Peptid wird zu dem iod-acetylierten adsorbierten TT in einem Verhältnis von 10 mol freies Thiol pro mol TT zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wird die Lösung eine Stunde lang auf eine Konzentration von 0,2 mM Mercaptoethanol gebracht und anschließend durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in HEPES-Puffer gewaschen. Die Endkonzentration an TT beträgt 10 mg/ml.
Pn14 in einer Konzentration von 10 mg/ml wird mit CDAP aktiviert und an das adsorbierte Peptid/TT gekuppelt, wie es in anderen Beispielen beschrieben ist.
Alternativ wird Peptid an adsorbiertes Protein gekuppelt, wie es allgemein von Houen et al. beschrieben ist. PS wird an das adsorbierte Peptid-Protein gekuppelt, wie es in anderen Beispielen beschrieben ist.
BEISPIEL 11. Vor der Adsorption an Festphase hergestelltes Hapten-Protein (allgemein in 3(I) beschrieben)
TT wird in einer Konzentration von 5 mg/ml in HEPES-Puffer suspendiert und mit einem 10-fachen molaren Überschuss von SIA reagieren gelassen. Nach einer Stunde wird das Protein entsalzt und unter Verwendung eines Ultrafree 30-Geräts (Millipore) auf 10 mg/ml konzentriert. Peptid wird wie vorstehend hergestellt und zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht (ON reaction) wird die Reaktion in der Lösung mit 0,2 mM Mercaptoethanol eine Stunde lang angehalten. Nichtkonjugiertes Peptid wird durch Gelfiltration an einer S200HR-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit Salzlösung, entfernt. Die Peptid-TT-Fraktion wird auf 10 mg/ml konzentriert und an Alhydrogel adsorbiert.
Pn14 in einer Konzentration von 10 mg/ml wird mit CDAP aktiviert und an das adsorbierte Peptid/TT gekuppelt, wie es in anderen Beispielen beschrieben ist.
BEISPIEL 12. An adsorbiertes Protein-Ps gekuppeltes Hapten (allgemein in 3(III) beschrieben)
Pn14 wird an Alhydrogel-adsorbiertes TT wie beschrieben konjugiert. Das adsorbierte Pn14-Protein wird mit SIA iod-acetyliert, wie es vorstehend beschrieben ist. Das Peptid wird wie beschrieben hergestellt und zu dem iod-acetylierten Protein/Ps zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wird die Reaktion in der Lösung mit Mercaptoethanol angehalten und das nichtkonjugierte Peptid durch wiederholtes Waschen durch Zentrifugation entfernt.
BEISPIEL 13. Konjugation von Protein an adsorbiertes Polysaccharid
Bestimmte Ps adsorbieren gut an Alhydrogel, z. B. Neisseria meningiditis A. (Neiss PsA). Neiss PsA wird in einer Konzentration von 10 mg/ml in Wasser suspendiert und mit einem gleichen Gewicht von Alhydrogel vermischt. Nach einer Stunde wird nicht adsorbiertes Ps durch Waschen durch Zentrifugation entfernt und in einer Konzentration von 10 mg/ml in Salzlösung resuspendiert.
Das adsorbierte Ps wird mit CDAP aktiviert. 1 mg CDAP pro mg adsorbiertes Ps aus einer 100 mg/ml-Stammlösung von CDAP in Acetonitril. Nach 30 Sekunden wird der pH auf 9,5 angehoben und weitere 2 Minuten bei diesem pH gehalten, wobei TEA von einer 0,2 M-Stammlösung verwendet wird. Nach 2,5 min wird TT in einem Verhältnis von 1 mg TT/mg Ps zugegeben und der pH unmittelbar auf 9 eingestellt. Nach einer 3 Stunden-Reaktion wird nicht absorbiertes Protein durch Waschen/Zentrifugation entfernt. Wie in anderen Beispielen kann Hapten entweder vor oder nach dem Kuppeln an das adsorbierte Ps zu dem Protein zugegeben werden.
BEISPIEL 14: Festphasen-Intimin-Polysaccharid-Konjugate
Dieses Beispiel veranschaulicht die Adsorption eines Proteins an Alhydrogel und Adjuphos, Festphasen-Aluminium-Adjuvantien mit niedrigem und hohem isoelektrischen Punkt. Das Beispiel zeigt, dass Konjugate mit negativ geladenen Polysacchariden, welche an Alhydrogel adsorbieren, an einem Protein hergestellt werden können, das an Adjuphos adsorbiert ist. Die Konjugate induzierten eine Anti-Polysaccharid-Immunantwort in Mäusen.
Intimin ist ein bakterielles Protein, welches die Anhaftung an das Darmepithel fördert, und ist neben anderen ein Virulenzfaktor für EHEC O157:H7-Stämme. Intimin hat einen isoelektrischen Punkt von 9,35 und ist somit ein basisches Protein. Es wurde festgestellt, dass es sowohl an Alhydrogel als auch an Adjuphos gut adsorbiert.
A. Kovalente Bindung von Pneumokokken-Typ 14-Polysaccharid an an Alhydrogel adsorbiertes Intimin
Rekombinantes Intimin wurde aus E. Coli aufgereinigt (M. L. McKee and A. D. O'Brien, Infect. Immun., 64: 2225 (1996) und in 20 mM Natriumacetat, pH 5,8 dialysiert. 1,4 ml Intimin (~1 mg/ml) wurde mit 1,4 mg Alhydrogel vermischt. Nach 1 Stunde wurde das adsorbierte Material zentrifugiert und in einer Konzentration von 10 mg/ml in 20 mM HEPES, pH 8 resuspendiert. Pneumokokken-Typ 14-Polysaccharid (Pn14) wurde mit 1-Cyano-4-dimethylaminopyridin-tetrafluoroborat (CDAP) wie folgt aktiviert. Zu 2 mg Pn14 (10 mg/ml in Salzlösung) wurden 50 μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) zugegeben. Nach 30 Sekunden wurden 100 μl 0,2 M Triethylamin zugegeben. Nach 2,5 Minuten wurde das aktivierte Pn14 mit der Suspension von Intimin vermischt. Das Gemisch wurde 3 Stunden vorsichtig gerührt und anschließend über Nacht in 20 mM Natriumacetat, pH 5,8 dialysiert. Das nicht-adsorbierte Material wurde durch Zentrifugieren und zweimal Resuspendieren in dem gleichen Puffer entfernt. Das am Ende erhaltene Pellet wurde in 20 mM Natriumacetat zu einem Endvolumen von 0,64 ml resuspendiert. Unter Verwendung des BCA-Assays zum Bestimmen des adsorbierten Proteins und des Resorcinol/Schwefelsäure-Assays zum Bestimmen des Polysaccharids wurde festgestellt, dass 0,4 mg Pn14 pro mg Intimin vorhanden waren.
Wir stellten fest, dass Neisseria meningiditis-Polysaccharid A (PsA), ein negativ geladenes Polymer, an Alhydrogel, aber nicht an Adjuphos adsorbiert wurde.
1 mg PsA (10 mg/ml, Wasser) wurde mit 1 mg Adjuphos (5 mg/ml in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,3) vermischt. Nach 15 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur wurde nicht-adsorbiertes Material durch Zentrifugieren und zweimal Resuspendieren in dem gleichen Puffer entfernt. Unter Verwendung des Resorcinol/Schwefelsäure-Assays wurde festgestellt, dass weniger als 3% des Polysaccharids adsorbiert war. Wenn 1 mg PsA mit 1 mg Alhydrogel in 25 mM Natriumacetat, pH 5, inkubiert wurde und nicht-adsorbiertes Material durch Zentrifugieren und Resuspendieren in dem gleichen Puffer entfernt wurde, waren mehr als 25% des Polysaccharids an Alhydrogel adsorbiert. Deshalb wäre Adjuphos zum Herstellen von Festphasen-Konjugaten von negativ geladenem Kohlenhydrat geeignet, wie in dem nächsten Beispiel veranschaulicht ist.
B. Kovalente Bindung von Neisseria meningiditis-Polysaccharid A an an Adjuphos adsorbiertes Intimin
Eine Lösung von 1 ml rekombinantes Intimin (Extinktion bei 280 nm = 1,5) in 20 mM Natriumacetat, pH 5,8, wurde mit 2,5 mg Adjuphos (erhältlich von Accurate Scientific, NY) in dem gleichen Puffer vermischt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung zentrifugiert und zweimal in 20 mM Natriumacetat, pH 5,8 resuspendiert und schließlich in 100 μl des gleichen Puffers resuspendiert. Neisseria meningiditis-Polysaccharid A (PsA) wurde mit HCl bis zu ungefähr 25 kDa mittleres Molekulargewicht hydrolysiert und an seinem reduzierenden Ende mit Vinylsulfon derivatisiert, wie es allgemein in WO-A-97/41897 beschrieben ist. Überschüssiges Reagenz wurde fortdialysiert. 2,2 mg des Vinylsulfonaktivierten PsA in 0,9 ml wurde mit dem adsorbierten Intimin kombiniert und 100 μl 1 M Natriumcarbonat, pH 9, zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C im Dunkeln wurde nicht-adsorbiertes Material durch Zentrifugieren und Resuspendieren mit Salzlösung entfernt. Das am Ende erhaltene Pellet wurde in 0,5 ml 20 mM Natriumacetat, pH 5,8 resuspendiert. Unter Verwendung der vorstehenden Assays wurde festgestellt, dass die Suspension 0,2 mg PsA pro mg Intimin enthielt.
C. Immunogenität von Intimin-Polysaccharid-Konjugaten, die als Festphase auf Alhydrogel und Adjuphos hergestellt wurden
Zum Vergleich wurde Tetanus-Toxoid in Lösungsphasen-Reaktionen an Pn14 und PsA kovalent gebunden. Gruppen von 4 Balb/c-Mäusen werden mit 2,5 μg Polysaccharid an den Tagen 0 und 14 immunisiert. Den Mäusen wird am Tag 28 Blut entnommen und die Seren werden durch ELISA auf Anti-Polysaccharid-Antikörper getestet.
Antikörpertiter
Tabelle 9: Immunogenität von Intimin-Polysaccharid-Konjugaten
BEISPIEL 15. Aluminiumoxid-Nanopartikel
Eine Reihe von als Festphasen-Adjuvans dienenden Teilchen (solid phase adjuvanting particles) kann verwendet werden, um Festphasen-Protein-Polysaccharid-Konjugatimpfstoffe herzustellen. Frühere Beispiele haben Aluminiumhydroxid- und Aluminiumphosphat-Adjuvantien eingesetzt, insbesondere die handelsüblichen Produkte Alhydrogel bzw. Adjuphos. Die folgenden Beispiele beschreiben die Verwendung von anderen Teilchen.
Peptide wurden an funktionalisierte Aluminiumoxid-Nanopartikel (0,3 μm Durchmesser) kovalent gebunden und als Immunogene verwendet (Frey et al., Bioconjugate Chem., 8: 4204, (1997). Diese Aluminiumoxid-Nanopartikel sind stabil, einheitlich und gut charakterisiert. Anders als die Aluminiumhydroxid- und Phosphat-Adjuvantien "altern" sie nicht. Diese Eigenschaften könnten beim Herstellen von Impfstoffen von Vorteil sein. Aluminiumoxidteilchen (0,3 μ), die mit Chloracetylgruppen derivatisiert waren, waren ein Geschenk von Dr. F. A. Robey von den National Institutes of Health, Bethesda, MD. Ein Verfahren zu ihrer Herstellung ist allgemein beschrieben in Frey et al., Bioconjugate Chem., 8: 4204, (1997). Nicht-derivatisierte Aluminiumoxidteilchen wurden von Fluka (#06280) gekauft.
Tetanus-Toxoid (TT) wurde wie folgt an die Aluminiumoxidteilchen adsorbiert: Die Aluminiumoxidteilchen wurden in einer Konzentration von 2 g/ml in Wasser suspendiert, und es wurden 3 mg TT (14,5 mg/ml in 2 M NaCl) zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation wurde das nicht-adsorbierte Material durch Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser entfernt. 45 mg zusätzliches Aluminiumoxid wurde mit dem nicht-adsorbierten TT vermischt, und es wurde wie oben verarbeitet. Das gesamte adsorbierte TT wurde kombiniert und in 0,32 ml PBS resuspendiert. Durch den BCA-Assay wurde festgestellt, dass die Probe 1,8 mg TT enthielt. 3 mg Pn14 (10 mg/ml in Wasser) wurden durch die Zugabe von 30 μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) gefolgt von der 30 Sekunden später erfolgenden Zugabe von 60 μl 0,2 M Triethylamin aktiviert. Nach 2,5 Minuten wurde das aktivierte Pn14 zu dem an das Aluminiumoxid adsorbierten TT zugegeben. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 1 M Glycin, pH 8, angehalten und das nicht-adsorbierte Material durch Zentrifugation und Resuspendieren in Salzlösung entfernt. Das am Ende erhaltene Konjugat wurde in 1 ml Salzlösung resuspendiert und es wurde festgestellt, dass es 0,6 mg Pn14 pro mg TT enthielt.
Als eine Kontrolle wurde nicht-aktiviertes Pn14 mit dem an Aluminiumoxid adsorbierten TT vermischt und wie oben verarbeitet. Dieses Präparat wurde als das Scheinkonjugat bezeichnet und enthielt weniger als 0,3 mg Pn14/mg TT.
TT wurde wie folgt an Chloracetyl-derivatisierte Aluminiumoxid-Nanopartikel kovalent gebunden: Thiopropyl-dithiopyridyl-N-hydroxysuccinimid (8 μl einer 10 mM Stammlösung) wurde zu 2 mg TT (14,5 mg in 2 M NaCl + 25 MI 0,75 M HEPES, 10 mM EDTA, pH 7,3) zugegeben. Nach 2 Stunden wurden 30 μl 1 M Natriumacetat (pH 5) zusammen mit 9 μl 0,5 M Dithiothreitol zugegeben. Nach 30 min wurde die Lösung an einer P6DG-Säule (BioRad), äquilibriert mit 10 mM Natriumacetat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 5, entsalzt. Die Ausschlussvolumenfraktion wurde unter Verwendung eines Ultrafree 30-Geräts (Millipore) auf 230 μl konzentriert. Es wurde festgestellt, dass 3,7 mol Thiole pro mol TT vorhanden waren. Das Thiol-TT wurde zu einer Suspension von 50 mg des aktivier ten Aluminiumoxids, suspendiert in 20 μl 0,1 M EDTA + 50 μl 1 M HEPES, pH 8, zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht wurde das Harz dreimal durch Zentrifugation gewaschen und in PBS resuspendiert, wobei das Endvolumen 200 μl betrug. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 4 μl von 10 mM Mercaptoethanol angehalten. Nach 30 Minuten wurde das Harz erneut durch Zentrifugation gewaschen und in 0,2 mM PBS resuspendiert. Unter Verwendung des BCA-Assays wurde festgestellt, dass 0,59 mg TT mit dem Harz konjugiert waren. Pneumokokken-Typ 14-Polysaccharid wurde durch Zugeben von 10 μl einer 100 mg/ml Lösung von CDAP zu 100 μl einer 10 mg/ml Lösung von Pn14 mit CDAP aktiviert. 30 Sekunden später wurden 20 μl von 0,2 M Triethylamin zugegeben. Nach 2,54 min wurde das CDAP-aktivierte Pn14 zu der Lösung von TT, das kovalent an das Aluminiumoxid gebunden war, zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 μl von 1 M Glycin, pH 8, angehalten und durch Zentrifugation mit PBS gewaschen und in 0,2 ml PBS resuspendiert. Es wurde festgestellt, dass das Produkt 0,2 mg Pn14 pro mg TT enthielt.
Immunogenität von TT-P14-Konjugaten
Gruppen von 4 Balb/c-Mäusen wurden an den Tagen 0 und 14 mit 2,5 μg Pneumokokken-Polysaccharid, entweder allein oder konjugiert, immunisiert. Zum Vergleich ist ein Lösungsphasen-TT-Pn14-Konjugat mit inbegriffen. (Eine zweite Gruppe von Mäusen wurde entsprechend immunisiert. Der Titer von diesem Versuch ist in Klammern angegeben.)
Tabelle 10: Immunogenität von TT-P14-Konjugaten
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Aluminiumoxidharz verwendet werden kann, um Protein-Polysaccharid-Konjugate herzustellen. Sie legen auch nahe, dass eine kovalente Bindung des Proteins an das Harz einer Adsorption überlegen sein kann.
Die vorstehende schriftliche Beschreibung bezieht sich auf verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zahlreiche Änderungen und Modifikationen können darin vorgenommen werden, ohne von dem Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen, wie er in den folgenden Ansprüchen definiert ist.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Festphasen-Impfstoffs, umfassend die Schritte: a) Adsorbieren eines Proteins an ein Festphasen-Adjuvans b) kovalentes Binden eines Kohlenhydrats an das adsorbierte Protein, wobei sowohl das Protein als auch das Kohlenhydrat eine Immunantwort auslösen können c) Reinigen des Festphasen-Impfstoffs durch Zentrifugation, Absitzenlassen oder Filtrieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kohlenhydrat ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kohlenhydrat Pneumokokken-Typ 14-Kapsel-Polysaccharid (Pn14) oder Neisseria PsC ist.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem umfassend den Schritt des Aktivierens des Kohlenhydrats vor Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Aktivierungsschritt durch die Wirkung von 1-Cyano-4-dimethylaminopyridin-tetrafluoroborat (CDAP) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem umfassend den Schritt des Hinzufügens eines Haptens zu dem Protein vor oder nach Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein Virus-, Bakterien-, Parasiten-, Tier- oder Pilzprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein F-Protein, Pneumokokken-Oberflächenprotein A (PspA), Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, Bakterienaußenmembranprotein, Virusaußenmembranprotein oder Kombinationen davon ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligosaccharid oder Polysaccharid natürlich oder synthetisch ist.
Verfahren zum Herstellen eines Festphasen-Impfstoffs, umfassend die Schritte: a) Adsorbieren eines Kohlenhydrats an ein Festphasen-Adjuvans b) kovalentes Binden eines Proteins an das adsorbierte Kohlenhydrat, wobei sowohl das Protein als auch das Kohlenhydrat eine Immunantwort auslösen können c) Reinigen des Festphasen-Impfstoffs durch Zentrifugation, Absitzenlassen oder Filtrieren.