DE69826851T2

DE69826851T2 - Kopplung unmodifizierter proteinen an haloacyl- oder dihaloacyl-derivatisierten polysacchariden zur herstellung von protein-polysaccharide impfstoffen

Info

Publication number: DE69826851T2
Application number: DE69826851T
Authority: DE
Inventors: Andrew C. Lees
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: EP0977588A2; AU7149198A; AU740784B2; WO1998047530A2; US6087328A; ES2230687T3; CA2288267A1; JP2002504096A; DE69826851D1; ATE278418T1; WO1998047530A3; EP0977588B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Vakzine haben sich als äußerst effektiv zum Schutz von Menschen gegen eine große Vielzahl von Erkrankungen erwiesen, egal ob diese durch Viren, Bakterien oder Pilze erzeugt wurden. Die Fähigkeit von Vakzinen spezifischen Schutz gegen einen solchen weiten Bereich von pathogenen Organismen zu induzieren, rührt von ihrer Fähigkeit her, spezifische humorale Antikörper-vermittelte Antworten zu stimulieren wie auch Zellvermittelte Antworten. Diese Erifindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen solcher Vakzine und insbesondere einen Prozess zum Herstellen von Konjugaten, die in Vakzinen und in Immunogenen verwendet werden. Die Erfindung betrifft des weiteren Vakzine und Immunogene hergestellt aus den Konjugaten, erzeugt gemäß der Erfindung, sowie die Verwendung dieser Produkte.
Es ist oft sehr wünschenswert, Immunantworten gegen Polysaccharide zu erzeugen. Beispielsweise können Antikörper gegen ein bakterielles kapsuläres Polysaccharid Schutz gegen das Bakterium bereitstellen. Viele Polysaccharide, jedoch sind nur schwach immunogen, insbesondere in Säuglingen und Kleinkindern. Des weiteren gibt es üblicherweise weder in Kindern noch in Erwachsenen einen Verstärkungs (Booster-) effekt für die wiederholten Polysaccharid-Immunosierungen und die prinzipielle Antikörperklasse ist IgM. Diese Eigenschaften sind alle charakteristisch für sogenannte "T-Zell unabhängige" ("TI") Antigene.
In vielen Fällen kann die Immunogenizität von Polysacchariden durch das kovalente Anbinden von Proteinen oder T-Zell Epitope enthaltenden Peptiden oder Haptenen an Polysaccharide verstärkt werden. Bestimmt weitere Komponenten wie zum Beispiel Lipide, Fettsäuren, Lipopolysaccharide und Lipoproteine sind auch bekannt, um die Immunogenizität des Polysaccharids zu steigern. Wie in der "dual konjugat" Patentanmeldung von Mond and Lees, kann die Konjugation des Proteins an ein Polysaccharid die Immunantwort auf das Protein wie auch auf das Polysaccharid verbessern. Siehe U.S. Patent Nr. 5,585,100. Dieser Effekt wird auch in A. Lees et al., "Enhanced Immunologenicity of Prote in-Dextran Konjugates: I. Rapid Stimulation of Enhanced Antibody Responses to Poorly Immunogenic Molecules," Vaccine, Band 12, Nr. 13 (1994) Seiten 1160–1166 beschrieben. Im Hinblick auf dieses Potential zur Verbesserung der Immunantwort gegen Polysaccharide besteht auf dem Gebiet ein Bedürfnis für Verfahren zum kovalenten Anbinden von Proteinen oder anderen Gruppen an Polysaccharide.
Idealerweise sollte das Verfahren des kovalenten Anbinden an Proteinen (oder anderen Gruppen) an Polysaccharide auf eine Art und Weise durchgeführt werden, so dass die Antigenizität sowohl der Polysaccharid- als auch der Protein- (oder weiterer) Komponenten erhalten bleibt, und dass der Schaden für notwendige Epitope einer Gegenkomponente minimiert wird. Des weiteren sollte die Verknüpfung stabil sein. Folglich besteht ein Bedürfnis für ein mildes und sorgsames Mittel zum stabilen Anbinden von Proteinen, Peptiden, Haptenen oder anderen Gruppen an Polysaccharide.
Zwei hauptsächliche Verfahren zum Anbinden von Molekülen aneinander werden verwendet. In dem ersten Verfahren bringt das Verfahren das Quervernetzen eines Proteins (oder Peptids oder einer anderen Gruppe) direkt an ein Polysaccharid (oder irgendeine andere Gruppe) mit sich. Manchmal wird jedoch ein linker Molekül zwischen den gekoppelten Gruppen benötigt, entweder, um das chemische Verfahren zu ermöglichen und/oder, die Immunantwort gegen das Protein und/oder das Polysaccharid zu steigern. In jedem Verfahren ist es üblicherweise notwendig, das Polysaccharid vor dem Auftreten des Quervernetzens zu aktivieren oder zu funktionalisieren. Einige Verfahren zum Aktivieren oder funktionalisieren von Polysacchariden werden in W. E. Dick, et al., "Glycokonjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens: A Survey and Consideration of Design and Preparation Factors, "Conjugate Vaccines (Eds. Cruse, et al.), Karger, Basel, 1989, Band 10, Seiten 48–114 beschrieben.
Weitere Aktivierungsverfahren werden in R. W. Ellis, et al., (Editors), Development and Clinicial Use of Haemophilus B Conjugate Vaccines, Marcel Dekker, New York (1994) beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Aktivieren von Polysacchariden wird in den "CDAP" (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat) Patentanmeldungen von Lees, U.S. Pa tentnummer 5,651,971; U.S. Patentnummer 5,693,326 und U.S. Patent-Anmeldungsnummer 08/482,666 (eingereicht am 07. 06. 1995), beschrieben.
Nicht derivatisierte (oder unmodifizierte) Proteine können an Polysaccharide konjugiert werden, die Amin- oder Hydrazid-Linker enthalten und zwar unter Verwendung von querverbrückenden Einheiten, wie z. B. Glutaraldehyd oder Carbodiimid. Diese Verfahren neigen jedoch dazu, Aggregation und Homopolymerisation zu erzeugen, sind schwer zu steuern und verursachen wahrscheinlich signifikante Modifikation des Proteins. Die Nebeneffekte sind im allgemeinen unerwünscht.
Anstelle des kovalenten Verknüpfens von Protein und Polysaccharid via Spacer kann ein Protein an ein Polysacchard mit einem Spacer gekoppelt werden unter Verwendung einer Heteroligationschemie. In diesem Verfahren werden die Proteine und die Polysaccharidkomponenten jeweils mit chemischen Gruppen funktionalisiert und dann werden die Gruppe(n) auf dem Protein selektiv mit der/den funktionelle(n) Gruppe(n) auf dem Polysaccharid zur Reaktion gebracht.
Ein allgemeines Verfahren zur Heteroligation zum Verknüpfen von Proteinen und Polysacchariden über ein Linker funktioniert über die Verwendung einer Thioether-Brücke. Siehe Beispiel S. Marburg et al., Journal of the American Chemical Society, Band 108 (1986), geginnend mit Seite 5282, und U.S. Patent Nr. 4.695,624, eingereicht am 22.09.1987. Typischerweise wird in diesem Schema das Polysaccharid mit einer elektrophilen Gruppe z. B. α-Haloacid, beispielsweise einer Iodacetylgruppe derivatisiert, das Protein wird mit Thiolgruppen funktionalisiert und die beiden werden kombiniert. Die Thiolgruppe greift das α-Kohlenstoffatom auf der Haloacidgruppe an und bildet eine Thioether-Brücke.
Ein Verfahren zum Herstellen eines makromolekularen Konjugatimmunomodulators wird von Inman (Inman, J. K., Annals of the New York Acad. Sci., Band 685: 347–350 (1993)) beschrieben, wobei Haloacetylreagentien eingesetzt werden, in welchen Iod-acetyliertes Dextran mit einem α-geschützten Sulfhydryl-modifiziertem Protein konjugiert wird Ein weiteres bekanntes Heteroligationsverfahren schließt die Ausbildung von Disulfiden ein, wie dies im U.S. Patent Nr. 5,204,098 von S. C. Szu et al., datiert 20.04.1993, be schrieben wird. In diesem Verfahren wird das Protein mit Thiolen derivatisiert und das Polysaccharid mit einem austauschbaren Disulfid (beispielsweise einem Dithiopyridyl). Thiole auf dem Protein werden einem Disulfidaustausch unterzogen und bilden ein Konjugat mit dem Polysaccharid aus.
Ein Nachteil dieser Heteroligationsverfahren besteht in der Notwendigkeit zum Funktionalisieren des Proteins, was viele Schritte involvieren kann. Das Protein wird mit dem chemischen Label zur Reaktion gebracht werden, von den Reaktionsprodukten abgetrennt werden und üblicherweise weiter aufkonzentriert werden. Diese Schritte können kostenintensiv sein und können im Verlust von Proteinmaterial resultieren. Des weiteren können, wenn nicht größte Sorgfalt angewandt wird, Proteinthiole oxidieren, was potentiell Homopolymerisation und Abnahme der Konjugatausbeute mit sich bringt. Des weiteren partizipieren nicht alle der verfügbaren funktionellen Gruppen auf dem Protein in dem Quervernetzungsprozess, was das Schützen dieser Gruppen notwendig macht, wodurch zusätzliche, möglicherweise schädliche Epitope eingeführt werden. In dem oben beschriebenen Disulfidverfahren kann die S-S Bindung leicht gespalten werden.
Des weiteren ist es bekannt, dass während der Heteroligation α-Halogensäuren nicht perfekt selektiv für Thiole sind und mit anderen Nukleophilen, die sich in Proteinen befinden, reagieren können, wie z. B. in Seitenketten gefunden auf Arginin, Histidin, Lysin und Methionin. Das α-Aminende, Tyrosin, Serin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Threonin können ebenfalls reagieren (siehe Wilchek et al., "Haloacetyl Derivates", Methods in Enzymology, Band 46 (1977), beginnend auf Seite 153).
In bestimmten Situationen haben sich diese Reaktionen jedoch als bedeutsam erwiesen. So wurde beispielsweise herausgefunden, dass Halogensäuren bedeutsam in der Carboxymethylierung von Proteinen sind (siehe F. R. N. Gurd, "Carboxymethylation", Methods of Enzymology, Band 11 (1967), Seiten 532–541) wie auch im Affinitätslabeln von Proteinen (siehe Wilchek, et al., supra). Die Verwendung von Iodoacetyl gelabelten Peptiden, um Peptide über geeignet positioniert Methionin, Lysin, Arginin oder Histidin zu zyklisieren, wurde ebenfalls beschrieben (siehe S. J. Wood, et al., "Novel Cyclization Chemistry Especially Suited for Biologically Derived, Unprotected Peptides", International Journal of Peptide and Protein Research, Band 39 (1992), Seiten 533–539).
Viele dieser bedeutsamen Haloacylreaktionen verlangen, dass die Haloacylgruppe geeignet positioniert wird, damit die Reaktion erfolgreich sein kann. Tatsächlich ist dies die Grundlage des Affinitätslabelns beschrieben von Wilchek et al. In ähnlicher Weise ist es im Prozess von Wood essentiell, dass Iodoacetylgruppe in der Nähe der reaktiven Aminosäure zur Peptidzyklisierung liegt, damit eine gute Ausbeute auftreten kann.
Für den Carboxymethylierungsprozess beschrieben von Gurd, werden hohe Konzentrationen von Haloacyl-Reagenz benötigt. Des weiteren wird die Verwendung von nur einem niedermolekularem Reagenz beschrieben (Iodoessigsäure). Der Anmelder hat herausgefunden, dass Haloacyl-funktionalisierte Polysaccharide in der Lage sind, mit niedermolekularen Aminen bei Raumtemperatur zu reagieren und in der Nähe des neutralen pHs. Im allgemeinen ist es schwieriger, hochmolekulare Makromoleküle zur Reaktion zu bringen, im Vergleich zu Verbindungen zu niederem Molekulargewicht.
Obwohl verschiedene Kopplungs- und Aktivierungsverfahren und Reaktionen in den verschieden oben erwähnten Dokumenten beschrieben wurden, besteht ein fortwährendes Bedürfnis auf diesem Gebiet für verbesserte Verfahren zum Koppeln von biologisch relevanten Molekülen aneinander, um Vakzine zu produzieren.
In U.S. Patent Nr. 4.185, 090 wird die Herstellung von Konjugaten beschrieben, in welchen ein bakterielles Endotoxin-haloacetyliertes Polysaccharid und ein unmodifiziertes Proteinantigen konjugiert werden. Die Konjugate werden dahingehend präpariert, dass sie die Antikörperantwort auf das Protein verstärken, während sie die Toxizität der freien Lipopolysaccharide vermindern sollen. U.S. Patent Nr. 3,816,254 offenbart ein Verfahren zum Erhalten von wasserunlöslichen Carrier-gebundenen Enzymen, im speziellen einer wasserunlösliche Schimmelpilzacylasepräparierung, wobei die Schimmelpilzacylase mit einem wasserunlöslichen Haloacetylpolysaccharid zur Reaktion gebracht wird.
Diese Erfindung will ein verbessertes Kopplungsverfahren zum Herstellen von Konjugaten für Vakzine und Immunogene bereitstellen. Wie in dieser Anmeldung beschrieben, können polyfunktional Makromoleküle, wie z. B. ein Protein, mit Haloacyl-funktionalisierten Polysacchariden unter vernünftig milden Bedingungen (beispielsweise moderater Basizität) reagieren, um eine stabil kovalente Verknüpfung der beiden Moleküle zu bewirken.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Konjugaten, insbesondere von Protein-Polysaccharid-Konjugaten). In diesem Verfahren wird eine erste Gruppe (beispielsweise ein Polysaccharid) mit einer oder mehreren daran anhängenden Haloacylgruppen funktionalisiert. Diese funktionalisierte erste Gruppe reagiert mit einer zweiten Gruppe (beispielsweise einem Protein), um ein kovalent verknüpftes Konjugat (beispielsweise ein Protein-Polysaccharid Konjugat) auszubilden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die zweite Gruppe unmodifiziert (beispielsweise unmodifiziertes Protein, wie z. B. unmodifiziertes Tetanustoxoid-Protein) oder es wurden noch keine Thiolgruppen hinzugefügt (beispielsweise ein Protein nicht funktionalisiert oder derivatisiert mit Thiolgruppen).
Verschiedene unterschiedliche Polysaccharide können verwendet werden als erste Gruppe in dem Verfahren der Erfindung, wie z. B. Pneumococcal Typ 14 Polysaccharid ("Pn14"), Vi Antigen, und Neisseria meningiditis Polysaccharid Typ C ("Neisseria PsC").
Um das Material der funktionalisierten ersten Gruppe in einem Verfahren der Erfindung zu erzeugen, wird das Material der ersten Gruppe mit einem Haloacyl-enthaltenen Reagenz umgesetzt. Verschiedene unterschiedliche Haloacylreagentien können verwendet werden, ohne dass von der Erfindung abgewichen wird. Beispielsweise kann das Haloacyl-Reagenz ein Haloacyl-aktiver Ester oder ein α,β Dihaloacyl-aktives Esterreagenz sein. Des weiteren kann das Haloacyl-Reagenz ein Haloacylanhydrid oder ein α,β Dihaloacylanhydrid sein. Das Reagenz kann auch ein Haloacylchlorid oder ein α,β Dihaloacylchlorid sein, wie auch eine Haloacylsäure oder ein α,β Dihaloacylsäure. Beispiele spezifischer Reagentien, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, schließen ein N-Succinimidyl-2,3-Dibromopropionat (ein α,β Dihaloacyl-aktives Esterreagenz) und N-Succinimidyl Iodoacetat (ein Haloacyl-aktives Esterreagenz). Eine bevorzugte Unterklasse der Haloacyl-Reagenzien schließt Haloacyl-Reagenzien mit ein.
Beschreibung der Zeichnungen
Die vorteilhaften Aspekte der Erfindung werden vollständiger verstanden und geschätzt werden, wenn sie in Verbindung mit der folgenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Figuren betrachtet werden, worin:
1A ein Haloacyl-aktives Esterreagenz illustrier, das in dem Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann;
1B ein Haloacylanhydrid-Reagenz illustriert, das im Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann;
1C eine Haloacylchlorid-Reagenz illustriert, das in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann; und
1D ein Haloacylsäure-Reagenz illustriert, das in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es besteht auf dem Gebiet ein Bedürfnis für Verfahren, die Proteine oder andere Gruppen kovalent an Polysaccharide binden und dabei die Antigenizität sowohl der Polysaccharidals auch der Protein- (oder anderen) Komponenten zu erhalten, wobei die Verknüpfung zugleich stabil sein sollte. Folglich werden milde und sorgsame Mittel zum stabilen Verbinden von Proteinen, Peptiden, Haptenen oder anderen Gruppen an Polysaccharide benötigt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zum Herstellen eines immunogenen Konjugates zu finden, welches die Ausbildung von Antikörpern sowohl gegen die erste als auch die zweite konstituierende Gruppe stimuliert, wobei die erste Gruppe ein Polysaccharid und die zweite Gruppe ein Protein ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen eines immunogenen Konjugats, umfassend eine erste Gruppe, mit einer oder mehreren anhängenden Haloacylgruppen; Reagieren der funktionalisierten ersten Gruppe mit einer zweiten Grup pe, um ein kovalent verknüpftes Konjugat auszubilden; wobei die erste Gruppe ein Polysaccharid und die zweite Gruppe ein unmodifiziertes Protein ist oder ein Protein, an welches ein oder mehrere Thiolgruppen nicht hinzugefügt wurden; und worin das immunogene Konjugat die Ausbildung durch Antikörper sowohl gegen die erste wie auch die zweite Gruppe stimuliert.
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Konjugaten, die für Vakzine oder Immunogene verwendet werden können. Die Konjugate sind immunogen in Individuen, welchen sie verabreicht werden, wobei das Individuum gegen Krankheiten und Beschwerden verursacht durch verschiedene Organismen geschützt wird (bakterielle, pilzartige oder virale Organismen). Um Konjugate gemäß der Erfindung bereit zu stellen, wird eine erste Gruppe funktionalisiert mit zumindest einer anhängenden Haloacylgruppe und dann mit einer zweiten Gruppe zur Reaktion gebracht. Die Haloacylgruppe kann eine Monohaloacylgruppe oder eine Dihaloacylgruppe sein und das halogen kann beispielsweise Chlor, Brom oder Iod sein. Haloacetylgruppen sind bevorzugt als eine Unterklasse der Haloacyl-Reagenzien zur Verwendung im Verfahren der Erfindung.
Diese Patentanmeldung demonstriert, dass Moleküle der ersten Gruppe (beispielsweise Polysaccharide), die mit einer oder mehreren Haloacylgruppen funktionalisiert wurden, mit underivatisierten oder unfunktionalisierten zweiten Gruppen (beispielsweise Proteine, zu denen keine Thiolgruppen hinzugefügt wurden) umgesetzt werden können, um Konjugate zu präparieren. Solche Konjugate sind bedeutsam zur Anwendung als Vakzine oder Immunogene. Das Verfahren der Erfindung kann auch verwendet werden, um verschiedene immunogene Reagenzien wie z. B. biotinylierte Polysaccharide herzustellen.
Die Bezeichnung "erste Gruppe", die in dieser Anmeldung verwendet wird, schließt Polysaccharide, Oligosaccharide und andere Kohlenhydrate ein. Spezielle Beispiele schließen Dextran, carboxyliertes Dextran (wie z. B. Carboxymethyldextran), die Polysaccharide von biologisch relevanten Bakterien, wie z. B. Neisseria meningiditis Polysaccharid Typ C, Pneumococcal Polysaccharid (wie z. B. Pn14, Pn6, Pn19 und Pn23), Haemophilus Influenzien ("PRP") Polysaccharid und PRP Oligosaccharid, wie auch Sucrose, Lipopolysaccharid und Lipooligosaccharid ein. Des weiteren schließt in dieser Anmeldung die Bezeichnung "zweite Gruppe" Materialien ein, die kovalent an die erste Gruppe geknüpft werden sollen, einschließend Proteine, Peptide, Haptene, Lipoproteine und dergleichen. Spezielle Beispiele schließen ein Bovinserumalbumin ("BSA"), Tetanustoxoid, Diphteriatoxoid, Pertussistoxoid, Rib-Protein, Intimin, gD-Protein, LHRH Peptid, CFA/I-Consensus-Peptide (siehe F. J. Cassels, et al., Journal of Industrial Microbiology, 1996 Annual Meeting for the Siciety of Industrial Microbiology), lipoOspA, lipoD, PamCys und Monophosphorolipid A ein. Obwohl diese Patentanmeldung auf "Polysaccharide" oder "Proteine" gerichtet sein mag, werden, wenn die Erfindung im allgemeinen beschrieben wird, die Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass andere erste und zweite Gruppen, wie z. B. oben beschrieben, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, verwendet werden können.
Das Verfahren gemäß der Erfindung unterscheidet sich von den Verfahren offenbart in verschiedenen Dokumenten im Hintergrundabschnitt dieser Erfindung. Beispielsweise werden Bedingungen in der Reaktionsprozedur der Erfindung verwendet, welche im allgemeinen nicht gewünscht sind, wenn selektiv Thioetherbindungen ausgebildet werden sollen. In dem Verfahren der Erfindung kann der pH alkalisch sein (beispielsweise pH > 8), die Temperatur en können etwas erhöht sein, und die Konzentration der Komponenten, die verknüpft werden sollen, kann relativ hoch sein. Tatsächlich wurde, anders als für Prozesse zum Ausbilden von Thioetherbindungen, gefunden, dass der Anstieg der Temperatur signifikant die Ausbeuten des Konjugatproduktes in dem Prozess der Erfindung verbessert. In einer Ausführungsform der Erfindung findet die Kopplungsreaktion bei einer Temperatur die von ungefähr 15–60°C reicht, wobei 20–50°C bevorzugt sind, statt.
Einige Vorteile werden in der Verwendung des Verfahrens der Erfindung realisiert. Beispielsweise ermöglicht das Verfahren der Erfindung das direkte Anbinden von Molekülen der zweiten Gruppe an Haloacyl-funktionalisierte Moleküle der ersten Gruppen unter relativ milden Kopplungsbedingungen. Das Ausmaß der Kopplungsreaktion im Verfahren der Erfindung kann über High-Performance-Liquid-Chromatography ("HPLC") verfolgt werden unter Verwendung von Standardtechniken. Vielleicht am wichtigsten ist, dass wenn der Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, keine Notwendigkeit besteht, die zweite Gruppe (beispielsweise mit Thiolgruppen) zu funktionalisieren, damit die Verknüpfung ausgebildet werden kann. Diese Faktoren können die Kosten zum Herstellen des Konjugats vermindern und können helfen, wichtige Epitope zu schützen, welche die Immunantwort verbessem können. Des weiteren wird in dem Verfahren der Erfindung die zweite Gruppe nur modifiziert, falls sie an die erste Gruppe gebunden ist. Diese nicht auftretende Modifikation der nicht-verbundenen zweiten Gruppe ermöglicht es, nicht reagier te Komponenten der zweiten Gruppe, falls gewünscht, zurück zu gewinnen und wieder zu verwerten. Dies kann wichtig sein, beispielsweise wenn die zweite Gruppe ein Protein ist, da das Protein oft die am meisten wertvolle Komponente in der Verknüpfungs-Reaktions-Prozedur ist.
Die Haloacylgruppe ist stabil, so dass in vielen Fällen die derivatisierte (d. h. aktivierte) erste Gruppe lyophilisiert und gelagert werden kann zur späteren Verwendung. Die Eigenschaft verbessert des weiteren die Bedeutung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Des weiteren wird, da alle oder essentiell alle der reaktiven Stellen eines Polysaccharides (beispielsweise Aminstellen) in dem Verfahren der Erfindung funktionalisiert werden, Quervernetzungen zwischen Ketten oder innerhalb von Ketten von Polysacchariden vermieden, wenn bifunktionelle Reagenzien (beispielsweise N-succinimidyl-2,3-dibromopropionat, "SDBP") verwendet werden.
Viele Verfahren sind verfügbar zum Herstellen von Haloacylderivaten von Polysacchariden. Einige geeignete Verfahren werden beispielsweise in Hermanson, supra, beschrieben. Ein typisches Protokoll ist, die Polysaccharide mit Aminen zu funktionalisieren (oder Hydraziden) (beispielsweise mit CDAP und Hexandiamin (oder Adipindihydrazid), wie dies in Lees et al., Vaccine, Band 14, Nr. 3 (1996), Seiten 190–198), beschrieben wird, gefolgt von einer Reaktion mit einem Haloacyl-Reagenz, wie z. B. dem aktiven Ester eines Haloacyls (beispielsweise N-succinimidyliodoacetat, "SIA"). Polysaccharidamine oder Hydrazide können auch mit Säureanhydriden oder Acylchloriden von Haloacyl-Reagenzien umgesetzt werden. Carbodiimide oder Uroniumsalze können verwendet werden, um Haloacylsäuren an Amin- oder Hydrazid-derivatisierte Polysaccharide zu binden. Alternativ können Polysaccharidhydroxylgruppen direkt unter Verwendung von Haloacylchlorid gelabelt werden. Wenn das Polysaccharid derivatisiert wird, so dass eine Haloacylgruppe daran angebunden wird, nennt man die Haloacylgruppe eine "anhängende Haloacylgruppe".
Um weiter Beispiele für mögliche Haloacyl-Reagenzien zur Anwendung in einem Verfahren der Erfindung zu illustrieren, sei die Aufmerksamkeit auf 1A bis 1D gelenkt. Beispielsweise kann das Reagenz ein aktiver Ester, wie in 1A gezeigt, sein. Aktive Ester von N-Hydroxysuccinimid sind insbesondere bevorzugt. Des weiteren kann das Reagenz ein anhydridisches Material, wie in 1B illustriert, sein. Das Haloacyl-Reagenz kann auch ein Haloacylchlorid sein, dessen allgemeine Formel in 1C ge zeigt ist. Eine weiteres mögliches Reagenz schließt Säuren von der Haloacyl-Verbindungen ein. Die Formeln für solche Reagenzien sind in 1D illustriert.
Wie in 1A bis 1D gezeigt, kann das Haloacyl-Reagenz einen einzelnen Halogensubstituenten (beispielsweise eine Haloacetylverbindung) oder zwei Halogensubstituenten (beispielsweise eine α,β DiHaloacyl-Verbindung) einschließen. Ein Beispiel eines Haloacyl-Reagenzes, das Halogengruppen in einer α,β Konfiguration enthält, ist SDBP (verfügbar von Pierce Chemical Co.). Von diesem Reagenz wurde berichtet, dass es mit Amin reagier, um Aziridinverknüpfungen auszubilden, jedoch wurde kein Nachweis dieser Verknüpfung für makromolekulare Konjugate demonstriert. Gemäß der Erfahrung des Anmelders reagieren niedermolekulare Aminverbindungen, jedoch nicht makromolekulare Spezies (Proteine), leicht mit Dibromoacylgruppen auf Polysaccariden. Wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich ist, sind Konjugatausbeuten relativ gering bei Raumtemperatur, jedoch signifikant erhöht bei Ansteigen der Reaktionstemperatur auf etwa 42°C. Sogar jedoch Konjugate, hergestellt bei niedrigen Temperaturen mit relativ geringen Verhältnissen von Protein zu Polysacchariden können immunogen sein. Folglich sind diese Konjugatprodukte bedeutsam als Vakzine und Immunogene gemäß der Erfindung.
In bestimmten Beispielen werden Proteine an hochmolekulare (> ungefähr 100 kDa) Haloacyl-funktionalisierte Polysaccharide gekoppelt. Da es im allgemeinen einfach ist, jede molekulare Spezies zu konjugieren (beispielsweise Protein, Peptide oder Haptene, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 100 kDa aufweisen), dürfte man erwarten, dass niedermolekulare Polysaccharide, Oligosaccharide oder andere Kohlenhydrate einfacher zu konjugieren sind unter Verwendung der beschriebenen Chemie.
Obwohl der Anmelder nicht wünscht, an irgend welche speziellen chemischen Theorien oder Reaktionsmechanismen gebunden zu sein, wird die folgende Information als zusätzliche Hintergrundinformation bezugnehmend auf die Erfindung gegeben. Es wird angenommen, dass Lysine, welche typischerweise auf der Außenseite von Proteinen gefunden werden, das prinzipielle Aminosäurenukleophil auf dem Protein darstellen, das mit der Haloacylgruppe auf dem funktionalisierten Polysaccharid reagiert. Die ε-Amine der Lysine weisen einen pKa in einer Größenordnung von 9–10 auf, was konsistent ist mit dem Auffinden, dass ein pH in diesem Bereich, wo das Lysinamin deprotoniert sein würde, zu einer guten Konjugatausbeute führte. Falls Histidin (mit einem pKa von etwa 6) oder sogar Methionin oder Cystein (Aminosäuren mit einem Thiol) involviert wären, würde gutes Koppen bei viel geringerem pH erwartet werden. Des weiteren würde festgehalten werden, dass Tetanustoxoid, das verwendet wurde, keine detektierbaren freien Thiole aufwies, so dass keine Thioether-Verknüpfungen ausgebildet werden. In der Arbeit durchgeführt vom Anmelder, wurde gezeigt, dass ein Testprotein (BSA), das etwa 0,5 mol Thiol/mol Protein enthielt, bei neutralem pH koppeln würde, jedoch falls Thiole geblockt wurden, war ein stärker alkalischer pH und eine erhöhte Temperatur für eine gute Verknüpfung notwendig.
Die erhöhte Temperatur kann auch dazu dienen, die Reaktivität der Nukleophile auf dem Protein für die Haloacylgruppe zu erhöhen. Sie mag auch dazu dienen, um leicht die Proteinstruktur "aufzulockern", wodurch die Flexibilität erhöht wird, und der Zugang zu reaktiven Gruppen auf dem Protein verbessert wird.
Die Erfindung beschreibt weiter unten weitere spezifische Beispiele. Diese spezifischen Beispiele sollen konstruiert werden, um die Erfindung zu illustrieren und nicht, um diese zu limitieren.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde ein Konjugat von Tatanustoxoid und Pn14 unter Verwendung von N-succinimidyl-2,3-dibromopropionat ("SDBP") als das Haloacyl-aktivierende Reagenz, um das Polysaccharid zu funktionalisieren, hergestellt.
Al ein erster Schritt in dem Prozess wurde Pn14 Polysaccharid mit Aminen derivatisiert. Um dies durchzuführen, wurde Pn14 erhalten von American Tissue Culture Collestion, mit Aminen in der allgemeinen Art und Weise funktionalisiert, wie von Lees, et al., Vaccine, Band 14, Nr. 3 (1996), Seiten 190–198 beschrieben wird. Anfangs wurden 20 mg von Pn14 über Nacht in 2 ml Wasser aufgelöst. Anschließend wurden 60 μl an CDAP, erhalten von Research Organics, in einer Konzentration von 100 mg/ml in Acetonitril hinzugefügt. Drei Sekunden später wurden 180 μl von 0,2 M Triethylamin hinzugefügt. Bei 2,5 min wurde eine Lösung enthaltend 0,5 M Hexandiamin in 0,75 M HEPES (N-Hydroxyethylpiperazin N'-2-ethansulfonsäure) und 5 mM Ethylendiamintetraacetat ("EDTA") (wodurch eine Mischung mit einem pH von ungefähr 7,3 bereitgestellt wurde) der CDAP/Polysaccharidmischung hinzugefügt. Nach einer Reaktion über Nacht bei 4°C wurde die Probe erschöpfend gegen Salz dialysiert. Die Gegenwart von freien Aminen würde unter Verwendung des Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS) Assays wie von Vidal et al., J. Immunol. Meth., Band 86 (1986) beschrieben, beginnend auf Seite 155, bestimmt.
Das Vorliegen von Pn14 wurde bestimmt unter Verwendung des Assay-Verfahrens von Monsigny et al., (Anal. Chem., Band 175 (1988), beginnend bei Seite 525), wobei Pn14 als Standard verwendet wurde. Es wurde bestimmt, dass das resultierende derivatisierte Polysaccharid ein Verhältnis von 17,3 Aminen pro 100 kDa Pn14 enthielt.
Als der nächste Schritt wurde das Amin-derivatisierte Pn14 mit Haloacylgruppen funktionalisiert, um ein Pn14 gelabelt mit 2,3 Dibromopropionat herzustellen. 50 μl einer Mischung von 0,75 M HEPES und 5 mM EDTA (pH 7,3) wurde zu 2 mg des oben produzierten NH₂-Pn14 Materials in 0,53 ml Salzlösung auf Eis hinzu gegeben. 1,5 mg an SDBP (erhältlich von Pierce Chemical) in 50 μl Dimethylformamid ("DMF") wurden während dem Mischen hinzu gegeben. Nach einer Stunde wurde die Probe entsalzt auf zwei P6 Kasetten (verfügbar von BioRad^®) in Serie, equilibriert mit 10 mM Natriumacetat, 0,1 M NaCl und 2 mM EDTA (pH 5) und mit einer Centrion^® 50 Einheit (erhältlich von Amicon^®) konzentriert auf etwa 400 μl. Diese Prozedur erzeugte das gelabelte Pn14 Polysaccharid.
Das Haloacyl-gelabelte Pn14 Polysaccharid wurde dann an unmodifiziertes Tetanustoxoid-Protein gekoppelt. In dieser Prozedur wurden 2,2 mg an Tetanustoxoid (erhalten vom SmithKline Beecham aus Rixensart, Belgien) in 140 μl an Phosphat-gepufferter Salzlösung ("PBS") zu dem Dibromopropionat-Pn14 hinzu gegeben, gefolgt von der Zugabe von 75 μl an 0,1 M Natriumborat (pH 9,3). Die Lösung wurde für 30 min bei 37°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Mischung wurde über eine 1 × 50 cm S400HR Gelfiltrationsäule (erhältlich von Pharmacia) passiert, mit PBS equilibriert. Die entleerten Volumenfraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung einer Makrosep^® 50 Einheit (erhältlich von Filtron^® Corporation) aufkonzentriert und durch einen Millex^® HV Filter filtriert.
Der Proteinanteil der resultierenden Reaktionsmischung wurde bestimmt unter Verwendung des BioRad^® Assays mit Tetanustoxoid als Standard. Die Menge an Pn14 wurde bestimmt unter Verwendung des Assayverfahrens von Monsigny et al., wie oben be schrieben, mit Pn14 als Standard. Es wurde bestimmt, dass das resultierende Protein-Polysaccharid Konjugat Produkt 66 μg/ml Tetanustoxoid und 0,71 mg/ml Pn14 enthielt.
Dieses Konjugatmaterial wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren, um zu bestimmen, ob Immunantworten auf das Protein und das Polysaccharid induziert wurden. Gruppen von drei Balb/C Mäusen wurden vorgeblutet und i. p. mit 33 bzw. 10 μl des Konjugats injiziert in einem Volumen von 100 μl Salzlösung. Die Mäuse in einer anderen Gruppe wurden nur mit Salzlösung als eine Kontrolle injiziert. Den Mäusen wurde am Tag 28 Blut abgenommen und die Gabe wurde mit 10,8 μg Pn14 an Konjugat (1 μg TT und 10,8 μg Pn14) verstärkt. Den Mäusen wurde erneut am Tag 14 Blut abgenommen. Die gesammelten Seren am Tag 42 wurden in einem ELISA-Assay wie folgt getestet. Nunc Maxisorb^® ELISA Platten wurden mit Pn14 oder Tetanustoxoid zu 1 μg/ml in PBS gecoated. Gebundene Antisera mit einer 1 : 1000 Verdünnung wurden gemessen unter Verwendung von Gamma-spezifischem Kaninchen-anti-Maus-IgG konjugiert mit Meerrettichperoxidase mit 1 : 4000 Verdünnung in PBS/Tween^®. TMB wurde als Substrat verwendet. Die Farbreaktion wurde nach 15 Minuten gequencht. Die ELISA Absorptionsauslesen wurden bei 430 nm vorgenommen.
Die folgende Tabelle illustriert die Immunogenizitäts-Daten erhalten von den Seren eingesammelt am Tag 42.
Tabelle 1
Die Seren wurden bei einer Verdünnung von 1 : 1000 für totale IgG Bindung an Pn14 und Tetanustoxoid unter Verwendung von ELISA hin überprüft
Wie aus der Tabelle 1 evident ist, waren die Anti-Pn14 und Anti-TT Titer merklich höher für die Konjugatproben im Vergleich zu den Salzlösung-Kontrollproben.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wurde Tetanustoxid mit einem Vi Antigen Polysaccharid konjugiert. Zunächst wurde ein Amin-derivatisiertes Vi Polysaccharid hergestellt. 3,4 ml von Vi Antigenlösung (zu einer Konzentration von 5 mg/Vi/ml, erhalten von SmithKline Beecham) wurden in 340 μl an 1 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure("MES") (pH 6) vermischt. Anschließend wurden 68 μl an 0,1 M Sulfo-N-hydroxysuccinimid um 90,4 mg Ethylendiamin-2HCl hinzu geben. Festes 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimin ("EDC") wurden zur Reaktionsmischung hinzu gegeben, bis die Mischung eine Konzentration von 10 mg EDC/ml aufwies. Die Reaktion lies man für 4 Stunden bei Raumtemperatur voranschreiten, und dann wurde das Produkt ausgiebig gegen Salz und Azid dialysiert. Es wurde bestimmt, dass das Reaktionsprodukt 15,9 NH₂/100 kDa an Vi aufwies.
Dieses Amin derivatisierte Vi Material wurde dann iodoacetyliert. 1,4 ml an NH₂-Vi (in einer Konzentration von 3,6 mg/ml) wurde zu 100 μl einer Mischung von 0,75 M HEPES und 0,5 mM EDTA (pH = 7,3) und 32 μl 0,1 M N-Succinimidyliodoacetat ("SIS", erhältlich von BioAffinity Systems) hinzu gegeben. Nach etwa 2 Stunden wurde das Polysaccharid gewaschen durch Verdünnung aus 10 ml und dann aufkonzentriert auf etwa 200 μl mit einer Druckultrafiltrationseinheit mit einer 30 K Membran (Membran erhältlich von Filtron Omega^®). Die Probe wurde entfernt und die Membran mit 0,1 M Natriumborat (pH 9,3) gewaschen. Das letztendliche Volumen war 760 μl.
Zu dieser Zeit wurde das Haloacyl-derivatisierte Vi Polysaccharid an ein unmodifiziertes Tetanustoxoid-Protein konjugiert. 300 μl an Tetanustoxoid (enthaltend 5 mg Tetanustoxoid) in Salzlösung wurden zur Polysaccharidlösung hinzu gegeben und die resultierende Mischung wurde in der Dunkelheit bei 46°C für 22 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 μl an 10 mM Mercaptoethanol gequencht und weiterhin für 1 Stunden stehen gelassen. 0,75 mL des Reaktionsproduktes wurden auf einer 1 × 45 cm S400HR Säule gelaufen und die hochmolekularen Fraktionen wurden gepoolt. Das verbleibende Material wurde in PBS dialysiert.
Das gesamte Material wurde steril mit einer Millex^® GV Einheit filtriert. Es wurde festgestellt, dass die hochmolekulare Fraktion, Fraktion H, 0,71 mg TT/mg Vi enthielt. Diese Fraktion H wurde in einer Immunogenizitäts-Untersuchung auf Mäuse verwendet. Gruppen von 4 Balb/c Mäusen wurden immunisiert s. c. mit 5 μg an Vi, entweder allein oder als ein Konjugat. Die Mäuse wurden Verstärkungsimmunisierungen am Tag 14 unterzogen und Blut wurde 14 Tage später abgezapft. Die gesammelten Seren wurden in einem ELISA Assay untersucht. Nunc Maxisorb^® ELISA Platten wurden über Nacht mit Vi bei 1 μg/ml in Natriumcarbonatpuffer bei pH 9 gecoated. Die Antiseren wurden bei verschiedenen Verdünnungen getestet, um Titer mit 0,1 OD cutoff zu bestimmen.
Die folgenden Anti-Vi-Titer-Daten wurden erhalten: Tabelle 2

Immunogen Anti-Vi Titer

TT-SIA-Vi 1086

Vi 119
Aus dieser Tabelle kann leicht ersehen werden, dass Anti-Vi Titer für das Konjugat erzeugt durch das Verfahren der Erfindung höher war (d. h. das TT-SIA-Vi Konjugat), im Vergleich zu Vi Antigen injiziert alleine.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde ein Tetanustoxoid-Neisseria PsC Konjugat erzeut unter Verwendung von SDBP als ein haloacylierendes Reagenz. Neisseria PsC (erhalten von SmithKline Beecham) wurde über Nacht in Wasser auf eine Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst. 1 ml von 1 M MES (pH 6) wurde zu 5,5 ml an PsC hinzu gegeben und anschließend wurden 307 mg Hexandiamin-2HCl zu dieser Mischung hinzugegeben. Anschließend wurden 7 mg Sulfo-N-hydroxysuccinimid auch zu dieser Mischung hinzu gegeben. Der pH der resultierenden Reaktionsmischung wurde zu 5,75 bestimmt.
Anschließend wurden 500 μl von 0,5 M EDC hinzugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung gegen Salzlösung dialysiert, gefolgt von einer Diafiltration auf einer YM30 Membran (verfügbar von Amicon^®) und von Entsalzen auf einer 2,5 × 12 cm P6DG Säule (erhältlich von BioRad^®). Das Produkt (NH₂-PsC) wurde auf 6,1 ml konzentriert und auf freie Amine untersucht (durch das Verfahren von Vidal et al., supra) sowie PsC (durch das Verfahren von Monsigny et al., supra), mit PsC als dem Standard. Es wurde bestimmt, dass das resultierende NH₂-PsC Material einen Anteil von 7,5 Aminen pro 100 kDa des Polysaccharids aufwies.
Dieses NH₂-PsC Material wurde dann haloacyliert. 100 μl einer Mischung von 0,75 M HEPES und 5 mM EDTA wurden zu 1 ml des NH₂-PsC Materials (9,8 mg NH₂-PsC) hinzugefügt und 100 μl 0,1 M SDBP (in DMF) wurden hinzugegeben. Nach zwei Stunden bei 4°C wurde die Lösung entsalzt auf einer 1,5 × 15 P6DG Säule (erhältlich von BioRad^®) und die entleerten Volumenfraktionen wurden gepoolt und auf 350 μl konzentriert unter Verwendung einer Centricon 50 Einheit (erhältlich von Amicon^®). Die PsC Konzentration wurde auf 18,2 mg/ml bestimmt.
112 μl des derivatisierten Polysaccharids (2 mg) wurden in Mikrozentrifugen-Gefäße pipetiert und 1 oder 2 mg an Tetanustoxoid (erhalten von SmithKline Beecham) zu 16,8 mg/ml in Salzlösung wurden hinzugegeben. Zum Zeitpunkt 0 wurden 50 μl 0,1 M Natriumborat (pH 9,3) oder Kaliumborat (pH 10) zugegeben. Die Proben wurden gesplittet und bei Raumtemperatur bei 42°C inkubiert und zu den angegebenen Zeiten durch HPLC getestet. Man nahm an, dass die Menge des erzeugten Konjugates mit dem Absorptionsgrad des entleerten Volumens des hochmolekularen Peaks korrespondierte. Der Prozentanteil des Konjugats wird als Prozentzanteil des UV Absorptionsgrads für den Peak des konjugierten Proteins, bezogen auf den gesamten Absorptionsgrad des Proteins, wie durch HPLC gemessen, berechnet.
Alle Proben wurden dann weitere 24 Stunden bei 42°C inkubiert und erneut durch HPLC getestet. Die Gruppen A2, B1 und B2 wurden gepoolt und durch die Zugabe von 25 μl von 10 mM Mercaptoethanol für 15 Minuten gequenched. Die Gruppen A1, C1 und C2 wurden gepoolt und durch die Zugabe von 25 μl zu 10 mM Mercaptoethanol für 15 Minuten gequenched. Jeder Pool wurde über eine S400HR Filtrationssäule (verfügbar von Pharmacia) passiert, mit PBS equilibriert, steril filtriert und auf Tetanustoxoid und PsC getestet.
Die HPLC Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle 3
Bei ungefähr 18 Stunden, 35 Stunden und 60 Stunden wurden 5 μl Aliquots durch HPLC-Größenausschluß-Chromatographie auf einer Beckmann^® SEC G4000 Säule geprüft, 0,1 M KPO4, pH 7,3, gelaufen bei 1 ml/min. Der Fluss wurde durch UV Absorbtion überwacht.
Aus diesen Daten können die folgenden Beobachtungen erstellt werden: (1) unter allen Bedingungen wurde das Koppeln signifikant durch Ansteigen der Temperatur und des pHs verbessert; (2) selbst wenn die Reaktionszeiten ausgedehnt wurden (bis zu 35 Std.) bei Raumtemperatur war dies nicht so effizient für das Vorantreiben der Kopplung wie bei der erhöhten Temperatur; (3) die Kopplungseffizienz ist höher bei einem geringeren Protein zu Ps Verhältnis (0,5 vs 1 mg TT/mg Ps); und (4) sehr gute Ausbeuten konnten bei pH 9,3 erzielt werden.
Die Fähigkeit, die Chemie gemäß der Erfindung zu verwenden, um Konjugate von niedrigem Verhältnis mit guter Kopplungseffizienz zu präparieren, sind in Proben A2 und C2 illustriert, in welchen 1,0 bzw. 0,5 mg TT/mg PsC verwendet werden. Man sieht, dass die Kopplungseffizienz höher ist bei einem geringeren Verhältnis von Probe C2 (44% vs 56%). Die geschätzten Protein-zu-PsC-Verhältnisse in den resultierenden Konjugaten sind 0,44 mg/mg bzw. 0,28 mg/mg. Folglich wird in der Probe C2 weniger Protein benötigt, um das Konjugat herzustellen, wobei gute Kopplungsausbeuten immer noch erhalten werden.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wurde das Tetanustoxoid-Protein an eine Serie PsC Polysaccharide unter Verwendung von SIA als das Polysaccharid-funktionalisierende Reagenz gekoppelt. Zuerst wurde NH₂-PsC in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. 1 ml des NH2-PsC Materials (in einer Konzentration von 9,8 mg/ml) wurde mit 100 μl einer Mischung von 0,75 M HEPES und 0,5 mM EDTA (pH = 7,3) vermischt und mit 100 μl von 0,1 M SIA in DMF. Nach ungefähr zwei Stunden wurde die Reaktionsmischung auf einer P6DG Säule entsalzt (verfügbar von Pharmacia), mit 10 mM Natriumacetat und 2 mM EDTA (pH 5) equilibriert. Die Fraktionen enthaltend den Polysaccharidpeak wurden gepoolt und unter Verwendung einer Centrion^® 50 Einheit (verfügbar von Amicon^®) konzentriert und die resultierende Neisseria PsC Konzentration wurde auf etwa 10 mg/ml bestimmt.
400 μl des SIA-PsC Materials wie oben hergestellt, wurden zu 240 μl einer Tetanustoxoidlösung bei einer Konzentration von 16,8 mg/ml in Salzlösung hinzugegeben und 100 μl von 0,1 M Natriumborat (pH 10) wurden hinzugefügt. Die Probe wurde in der Dunkelheit für 40 Stunden bei 42°C inkubiert, durch die Zugabe von 25 μl 10 mM Mercaptoethanol für 30 Minuten gequentscht und fraktioniert auf einer 1 × 50 cm S400HR Säule equilibriert mit Salzlösung. Die hoch molekularen Fraktionen wurden gepoolt, steril filtriert und auf Protein und Polysaccharid getestet. Das Verhältnis wurde als 0,28 mg TT/mg PsC bestimmt.
Beispiel 5
Die Immunogenititätsdaten der Konjugate der Beispiele 3 und 4 wurden erhalten. Aus Beispiel 3 wurden die Proben A1, C1 und C2 gepoolt und fraktioniert und dieses Material konsistuierte Probe 5A dieses Beispiels. Das Konjugat hergestellt in Beispiel 4 wurde als Probe 5B verwendet. Auf diese Art und Weise können Konjugate hergestellt werden, unter Verwendung von SDBP als einem Haloacyl-funktionalisierenden Reagenz (Probe 5A) mit Konjugaten hergestellt unter Verwendung von SIA (Probe 5B) verglichen werden.
Gruppen von vier Mäusen Balb/c wurden mit 10 μg an Neisseria PsC entweder allein (als eine Kontrollprobe) oder konjugiert (Proben 5A und 5B) immunisiert. Die Mäuse wurden mit dem gleichen Antigen verstärkend geimpft, und zwar am Tag 14 und Blut wurde 14 Tage später abgezapft. Die Seren wurden auf Antikörper gegen Neisseria PsC getestet. Die Fähigkeit zum Vermitteln von Schutz wurde bestimmt unter Verwendung eines bakterizidalen Assays. Die folgenden Testergebnisse wurden erhalten:
Tabelle 4
Aus diesen Daten ist evident, dass Konjugat erzeugt gemäß der Erfindung exzellente Antikörperantworten vermitteln, einschließend hochfunktionelle Antikörperantworten, welche bakterizidal, d. h. schutzvermittelnd, waren.
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird ein Oligosaccharid mit einer anhängenden Haloacylgruppe funktionalisiert und ein Protein über diese Gruppe angekoppelt, welches an einem Ende des Oligosaccharids lokalisiert ist. Im allgemeinen wird die Hydrolyse und Derivatisierung mit Aminen, wie unten beschrieben, gemäß dem Verfahren wie in Porro, U.S. Patent 5,153,312, welches zur Gänze hier durch Referenz eingeschlossen ist, realisiert.
Pneumococcal Typ 14 Polysaccharid ("Pn14") wird zu 5 mg/ml in 0,5 M wässriger Trifluoressigsäure ausgelöst und in einer versiegelten Ampulle bei 70°C für 3 Stunden erhitzt. Nach der Neutralisierung werden die Oligosaccharide fraktioniert auf einer Sephadex G25 Säule, equilibriert mit 0,15 M NaCl. Die Kohlenhydratkonzentration wird bestimmt unter Verwendung des Verfahrens von Monsigny (oben beschrieben) und die Anzahl der reduzierenden Enden wird bestimmt unter Verwendung von Bicinchonin-Säure (erhältlich von Pierce Chemical), wobei Galactose als der Standard verwendet wird. Das Verhältnis der reduzierenden Enden bezogen auf das gesamte Kohlehydrat ermöglicht es, das Molekulargewicht des Oligosaccharids abzuschätzen. Oligosaccharide mit einem Molekulargewicht von etwa 3000 bis 5000 Dalton werden für dieses Beispiel ausgewählt.
Ethylendiamin wird an das reduzierende Ende des Oligosachharids unter Verwendung von reduktiver Aminierung gekoppelt. Die Oligosaccharidlösungen werden auf 0,5 M in Ethylendiamin bei pH 5 eingestellt, und anschließend wird festes Natriumcyanoborhydrid auf eine endgültige Konzentration von 50 mM hinzugegeben. Nach 2 Tagen im Dunkeln bei Raumtemperatur werden die Amin-gelabelten Oligosaccharide auf einer Sephadex G10 Säule entsalzt, und mit 20 mM NaCl equilibriert. Das resultierende Material wird durch Pervaporation im Dunkeln auf 25 mg/ml Kohlenhydrat konzentriert. Das Verhältnis von Aminen zu Kohlenhydrat wird bestimmt unter Verwendung von TNBS, um die Amine zu messen.
Das Amin-derivatisierte Oligosaccharid wird dann iodoacetyliert. Eine Mischung von 0,75 M HEPES und 0,5 mM EDTA wird zum NH2-Oligosaccharid hinzugegeben, bis die resultierende Lösung 0,1 M in HEPES ist und der pH wird auf 7,3 eingestellt. Ein 10-fach molarer Überschuss an SIA zu Amin wird von einer 0,1 M Stamm SIA Lösung (in DMF) zugegeben und man lässt die Reaktion für 2 Stunden im Dunkeln voranschreiten. Die Probe wird wiederum entsalzt unter Verwendung einer Sephadex^® G10 Säule und im Dunkeln auf eine letztendliche Konzentration von 25 mg/ml pervaporiert.
Das iodoacetylierte Oligosaccharid wird dann mit Tetanustoxoid kombiniert, so dass ein gleiches Gewicht einer jeden Komponente und eine letztendliche Konzentration von jeweils ungefähr 10 mg/ml erreicht wird. Die Mischung wird im Dunkeln bei 43°C inkubiert und die Größenordnung der Konjugation wird durch Größenausschluss HPLC unter Verwendung eines refraktiven Index ("RI") überwacht sowie durch einen UV Detektor. Der Anstieg in dem R1 Signal des Proteinpeaks wie auch ein Anstieg des Molekulargewichts, deutet auf das Koppen des Kohlenhydrats hin. Man erwartet, dass hinreichende Konjugation in etwa 24 Stunden auftreten wird. Das unkonjugierte Oligosaccharid wird vom Konjugat per Gelfiltration auf einer S100HR Säule (verfügbar von Pharmacia) entfernt.
Das Konjugatmaterial (ein Oligosaccharid-Protein-Konjugat) kann zur Immunisierung verwendet werden, um eine immune Antwort in ein Subjekt zu induzieren.
Weitere Merkmale der Erfindung
Durch das Beschreiben der Erfindung hat der Anmelder bestimmte Theorien dargelegt, mit dem Ziel zu offenbaren, wie und warum die Erfindung in der Art und Weise arbeitet, in der sie arbeitet. Diese Theorien werden nur aus informativen Gründen dargelegt. Der Anmelder ist nicht durch irgend welche speziellen chemischen und physikalischen Mechanismen oder Theorien der Arbeitsweise gebunden.
Des weiteren hat der Anmelder mehrere Beispiele und Verfahren zum Herstellen von Konjugaten in Übereinstimmung mit der Erfindung beschrieben. Während diese Verfahren des weiteren optimiert werden können (beispielsweise Optimierung der pH-Bedingungen während des Koppelns, der Reaktionszeiten der Reaktionstemperaturen etc.) ist eine solche Optimierung des Prozesses der Reaktionsbedingungen ein Frage von Routineexperimenten.

Claims

Ein Verfahren zum Herstellen eines immunogenen Konjugates umfassend: Funktionalisierung einer ersten Gruppe mit einer oder mehreren anhängenden Haloacylgruppen; Reagieren der funktionalisierten ersten Gruppe mit einer zweiten Gruppe, um ein kovalent verknüpftes Konjugat auszubilden; wobei die erste Gruppe ein Polysaccharid ist und die zweite Gruppe ein unmodifiziertes Protein oder ein Protein ist, an welches weder eine noch mehrere Thiolgruppen addiert wurden, und wobei das immunogene Konjugat die Ausbildung von Antikörpern sowohl gegen die erste als auch die zweite Gruppe stimuliert.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die erste Gruppe ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pneumococcal Polysaccharid, Vi Antigen und Neisseria meningiditis Polysacchard Typ C ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die erste Gruppe ein Pneumococcal Typ 14 Polysacchararid (PN-14) ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die erste Gruppe ein Vi Antigen ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die erste Gruppe ein Neisseria meningiditis Polysaccharid Typ C (Neisseria PsC) ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Funktionalisierungsprozedur durch das Reagieren der ersten Gruppe mit einem Haloacyl enthaltenden Reagenz erreicht wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Haloacyl enthaltende Reagenz ein Mitglied ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus aktiven Estern von Haloacylverbindungen, Anhydriden von Haloacylverbindungen, Haloacylchloriden, Haloacylsäureverbindungen, aktiven Estern von α,β Dihaloacylverbindungen, An hydriden von α,β Dihaloacylverbindungen, α,β Dihaloacylchloriden, und α,β Dihaloacylsäureverbindungen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Haloacyl enthaltene Reagenz ein Haloacetyl enthaltendes Reagenz ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 worin die Funktionalisierungsprozedur das Reagieren der ersten Gruppe mit N-Succinimidyl-2,3-Dibromopropionat (SDBP) einschließt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Funktionalisierungsprozedur das Reagieren der ersten Gruppe mit N-Succinimidyliodoacetat (SIA) einschließt.