ES2230687T3 - Copulacion de proteinas nomodificadas con polisacaridos derivados de haloacilo o de dihaloacilo para la preparacion de vacunas que incluyen proteinas-polisacaridos. - Google Patents
Copulacion de proteinas nomodificadas con polisacaridos derivados de haloacilo o de dihaloacilo para la preparacion de vacunas que incluyen proteinas-polisacaridos.Info
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Abstract
Un procedimiento para preparar un conjugado, y preferiblemente un conjugado proteína-polisacárido, que incluye funcionalizar un primer resto (por ejemplo, un polisacárido) con uno o más grupos haloacilo pendientes de él. Después, el primer resto funcionalizado se hace reaccionar con un segundo resto, preferiblemente una proteína no modificada o una proteína a la que no se han añadido grupos tiol, para formar un conjugado unido covalentemente. En esta invención se pueden utilizar diversos reactivos haloacilo diferentes. Por ejemplo, el reactivo haloacilo puede ser un éster activo, un anhídrido, un cloruro de haloacilo o un ácido haloacilo. Entre los reactivos haloacilo específicos que se pueden utilizar en la presente invención se incluyen N-succinimil-2,3-dibromopropionato y N-succinimidilyodoacetato. La invención se refiere también a los conjugados producidos según el procedimiento de la invención. Estos conjugados pueden utilizarse como inmunógenos o vacunas. Además, la invención se refiere también a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto administrando una vacuna fabricada según el procedimiento de esta invención.
Description
Copulación de proteínas no modificadas con
polisacáridos derivados de haloacilo o de dihaloacilo para la
preparación de vacunas que incluyen
proteínas-polisacáridos.
Las vacunas han sido muy eficaces al proteger a
la gente de una amplia variedad de enfermedades, ya estén causadas
por virus, bacterias, u hongos. La capacidad de las vacunas para
inducir una protección específica frente a una amplia variedad de
organismos patógenos resulta de su capacidad para estimular
respuestas de anticuerpos humorales específicas, así como
respuestas mediadas por células. Esta invención se refiere a un
procedimiento para preparar tales vacunas, y concretamente a un
procedimiento para elaborar productos conjugados que se utilizan en
vacunas e inmunógenos. La invención se refiere adicionalmente a
vacunas e inmunógenos producidos a partir de los productos
conjugados elaborados según la invención, así como al uso de estos
productos.
A menudo es muy deseable inducir respuestas
inmunes contra polisacáridos. Por ejemplo, los anticuerpos contra un
polisacárido capsular bacteriano pueden proporcionar protección
frente a esa bacteria. Muchos polisacáridos, sin embargo, son
escasamente inmunógenos, concretamente en lactantes y niños
pequeños. Además, tanto en niños como en adultos, no hay normalmente
efecto de refuerzo con inmunizaciones con polisacáridos repetidas, y
la clase de anticuerpo principal es la IgM. Estos rasgos son
característicos de los denominados antígenos "independientes de
las células T" ("IT").
En muchos casos, la inmunogenicidad de los
polisacáridos puede ser intensificada enlazando covalentemente
proteínas o péptidos que contienen epítopos de las células T o
haptenos al polisacárido. Otros ciertos haptenos, tales como
lípidos, ácidos grasos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas, también
son conocidos por intensificar la inmunogenicidad del polisacárido.
Como se describe en la solicitud de patente del "producto
conjugado dual" de Mond y Lees, la conjugación de una proteína a
un polisacárido puede intensificar la respuesta inmune a la proteína
así como al polisacárido. Ver la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.585.100. Este efecto también se describe en A. Lees, y col.,
"Enhanced Immunogenicity of Protein-Dextran
Conjugates: I. Rapid Stimulation of Enhanced Antibody Responses to
Poorly Immunogenic Molecules", Vaccine, Vol. 12, Núm. 13
(1994), págs. 1160-1166. En vista de este potencial
para mejorar la respuesta inmune contra los polisacáridos, existe la
necesidad en la técnica de métodos para enlazar covalentemente
proteínas u otros radicales a polisacáridos.
Idealmente, el procedimiento de enlazar
covalentemente proteínas (u otros radicales) a un polisacárido debe
ser realizado de manera que se mantenga la antigenicidad tanto del
componente polisacárido como proteico (u otros) y se minimice la
lesión de los epítopos necesarios para cada componente. Además, el
enlace debe ser estable. Por lo tanto, existe la necesidad de un
medio suave y lento para acoplar establemente proteínas, péptidos,
haptenos, u otros radicales a polisacáridos.
Se utilizan dos métodos principales para acoplar
moléculas entre sí. En el primer método, los medios de acoplamiento
suponen el entrecruzamiento de una proteína (o péptido u otro
radical) directamente con un polisacárido (o algún otro radical).
Algunas veces, sin embargo, es necesaria una molécula espaciadora
entre los radicales acoplados, para facilitar el procedimiento
químico y/o intensificar la respuesta inmune a la proteína y/o al
polisacárido. En cualquier método, normalmente es necesario activar
o funcionalizar el polisacárido antes de que ocurra el
entrecruzamiento. Algunos métodos de activación o funcionalización
de polisacáridos se describen en W.E. Dick, y col.,
"Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens: A Survey and
Consideration of Design and Preparation Factors", Conjugate
Vaccines (Eds. Cruse, y col.), Karger, Basel, 1989, Vol. 10,
pág. 48-114. Se describen métodos de activación
adicionales en R.W. Ellis, y col. (Editors), Development and
Clinical Uses of Haemophilus B Conjugate Vaccines, Marcel
Dekker, Nueva York (1994).
Un método preferido para activar polisacáridos se
describe en las solicitudes de patente de "CDAP"
(tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridina)
de Lees. Patente de los Estados Unidos Núm. 5.651.971; Patente de
los Estados Unidos Núm. 5.693.326; y Patente de los Estados Unidos
Núm. 08/482.666 (presentada el 7 de Junio de 1995). El uso de CDAP
también es descrito por Lees y col., en "Activation of Soluble
Polysaccharides with
1-Ciano-4-Dimethylamino
Pyridinium Tetrafluoroborate For Use in
Protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines and
Immunological Reagents", Vaccine, Vol. 14, Núm. 3 (1996),
pág. 190-198.
Se han conjugado proteínas no transformadas (o no
modificadas) con polisacáridos que contienen espaciadores de amina o
hidrazida utilizando entrecruzadores, tales como glutaraldehído o
carbodiimida. Estos métodos, sin embargo, son propensos a causar
agregación y homopolimerización, son difíciles de controlar, y es
probable que causen una modificación significativa de la proteína.
Estos efectos secundarios no son deseables generalmente.
En lugar de enlazar covalentemente proteínas y
polisacáridos por medio de un espaciador, se puede acoplar una
proteína a un polisacárido con un espaciador utilizando la química
de la heteroligadura. En este procedimiento, los componentes
proteico y polisacárido están funcionalizados cada uno con grupos
químicos, y después el grupo o los grupos de la proteína reaccionan
selectivamente con el grupo o los grupos funcionales del
polisacárido.
Un método de heteroligadura común para enlazar
proteínas y polisacáridos por medio de un espaciador es a través del
uso de un enlace tio-éter. Ver, por ejemplo, S. Marburg y col.,
Journal of the American Chemical Society, Vol.
108(1986), comenzando en la página 5282, y la Patente de los
Estados Unidos Núm. 4.695.624, expedida el 22 de Septiembre de 1987.
Típicamente en este esquema, el polisacárido es transformado con un
grupo electrófilo tal como un \alpha-haloácido,
v.g., un grupo yodoacetilo, la proteína es funcionalizada con grupos
tiol, y los dos son combinados. El grupo tiol ataca el carbono
\alpha del grupo haloácido y forma un enlace tio-éter.
Inman (Inman, J.K. Annals of the New York
Acad. Sci. Vol. 685:347-350 (1993) describen un
procedimiento para preparar inmunomoduladores de producto conjugado
macromoleculares en el que se emplean reactivos haloacetilados en
los cuales se conjuga dextrano yodoacetilado con una proteína
modificada con sulfhidrilo protegida con acetilo.
En otro método de heteroligadura conocido se
incluye la formación de disulfuros, como se describe en la Patente
de los Estados Unidos Núm. 5.204.098 de S.Z. Szu y col., fechada el
20 de Abril de 993. En este método la proteína es transformada con
tioles y el polisacárido con un disulfuro intercambiable (v.g., un
ditiopiridilo). Los tioles de la proteína experimentan un
intercambio de disulfuro y forman un producto conjugado con el
polisacárido.
Una desventaja de estos métodos de heteroligadura
es la necesidad de funcionalizar la proteína, lo que puede implicar
múltiples etapas. La proteína se debe hacer reaccionar con la marca
química, separar de los productos de reacción, y normalmente además
concentrar. Estas etapas pueden ser costosas y pueden dar como
resultado la pérdida de material proteico. Además, a menos que se
tenga cuidado, los tioles proteicos se pueden oxidar, causando
potencialmente la homopolimerización y el descenso de los
rendimientos de producto conjugado. Adicionalmente, no todos los
grupos funcionales asequibles de la proteína participan en el
procedimiento de entrecruzamiento, necesitándose la protección
terminal de estos grupos, introduciendo de este modo epítopos
posiblemente deletéreos adicionales. En el método del disulfuro
descrito antes, el enlace S-S es susceptible de
escisión.
Además, durante la heteroligadura, se sabe que
los \alpha-haloácidos no son perfectamente
selectivos hacia los tioles y pueden reaccionar con otros
nucleófilos encontrados en las proteínas, tales como las cadenas
laterales encontradas en la arginina, la histidina, la lisina, y la
metionina. También pueden reaccionar el extremo
\alpha-amino, tirosina, serina, ácido glutámico,
ácido aspártico, y treonina (ver Wilchek y col., "Haloacetyl
Derivatives", Methods in Enzimology, Vol. 46, (1977),
comenzando en la página 153. De ese modo, al preparar productos
conjugados en los que se desea un enlace tio-éter, se debe tener
cuidado de evitar las reacciones que implican estos otros grupos
(ver Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1996 Academic
Press.
Para ciertas situaciones, no obstante, se ha
demostrado que estas reacciones son útiles. Por ejemplo, se ha
encontrado que estos haloácidos son útiles en la carboximetilación
de proteínas (ver F.R.N. Gurd, ``Carboxymethylation, ``Methods of
Enzymology, Vol. 11 (1967), págs. 532-541 y en
el marcaje por afinidad de proteínas (ver Wilchek, y col.,
supra). El uso de péptidos marcados con yodoacetilo para
ciclar péptidos por medio de metioninas, lisinas, argininas, o
histidinas apropiadamente colocadas también ha sido descrita (ver
S.J. Wood, y col., ``Novel Cyclization Chemistry Especially Suited
for Biologically Derived, Unprotected Peptides, ``International
Journal of Peptide and Protein Research, Vol. 39 (1992), págs.
533-539.
Muchas de estas reacciones con haloacilo útiles
requieren que el grupo haloacilo esté apropiadamente situado con el
fin de que la reacción tenga éxito. Por supuesto, esta es la base
del marcaje por afinidad descrito por Wilchek y col. De un modo
similar, en el procedimiento de Wood, es esencial que el grupo
yodoacetilo esté cerca del aminoácido reactivo para que la ciclación
del péptido se produzca con un buen rendimiento.
Para el procedimiento de carboximetilación
descrito por Gurd, se requieren elevadas concentraciones de reactivo
de haloacilo. Además, solo se describe el uso de un reactivo de bajo
peso molecular (ácido yodoacético). El solicitante ha descubierto
que los polisacáridos funcionalizados con haloacilo reaccionan
fácilmente con aminas de bajo peso molecular a la temperatura
ambiente y a un pH casi neutro. En general, es mucho más difícil
hacer reaccionar macromoléculas de elevado peso molecular en
comparación con los compuestos de bajo peso molecular.
A pesar de los diversos métodos y reacciones de
acoplamiento y activación descritos en los diversos documentos
mencionados antes, existe la necesidad vigente en la técnica de
métodos mejorados para acoplar biológicamente moléculas relevantes
entre sí para producir vacunas.
En la Patente de los Estados Unidos Núm.
4.185.090 se describe la preparación de productos conjugados en los
que se conjugan un polisacárido haloacetilado de endotoxina
bacteriana y un antígeno proteico no modificado. Los productos
conjugados fueron preparados en un esfuerzo de incrementar la
respuesta de anticuerpos a la proteína, a la vez que reducían la
toxicidad hacia el lipopolisacárido libre. En la Patente de los
Estados Unidos Núm. 3.816.254 se describe un procedimiento para
obtener enzimas unidas a portadores insolubles en agua,
especialmente una preparación de acilasa de moho insoluble en agua,
en la cual se hace reaccionar acilasa de moho con un
haloacetil-polisacárido insoluble en agua.
Esta invención pretende proporcionar un método de
acoplamiento mejorado para producir productos conjugados para
vacunas e inmunógenos. Como se describe en esta solicitud, una
macromolécula polifuncional, tal como una proteína, puede reaccionar
con polisacáridos funcionalizados con haloacilo en condiciones
razonablemente suaves (v.g., alcalinidad moderada) para efectuar un
enlace covalente estableo de las dos moléculas.
Esta invención se refiere a un método para
preparar productos conjugados, y preferiblemente, productos
conjugados de proteína-polisacárido. En este método,
se funcionaliza un primer radical (v.g., un polisacárido) con uno o
más grupos haloacilo pendientes. Este primer radical funcionalizado
reacciona con un segundo radical (v.g., una proteína) para formar un
producto conjugado enlazado covalentemente (v.g., un producto
conjugado de proteína-polisacárido).
En las realizaciones preferidas de la invención,
el segundo radical no está modificado (v.g., una proteína no
modificada, tal como una proteína del toxoide del tétanos no
modificada) o no tiene grupos tiol añadidos (v.g., una proteína no
funcionalizada o transformada con grupos tiol).
Se pueden utilizar varios polisacáridos
diferentes como primer radical en el método de la invención, tal
como el polisacárido Pneumocócico de tipo 14
("Pn-14"), el antígeno Vi, y el
polisacárido de Neisseria meningitidis de tipo C ("PsC
de Neisseria").
Para producir el material del primer radical
funcionalizado en el procedimiento de la invención, se hace
reaccionar el primer radical con un reactivo que contiene haloacilo.
Se pueden utilizar varios reactivos de haloacilo diferentes sin
apartarse de la invención. Por ejemplo, el reactivo de haloacilo
puede ser un reactivo de éster activo de haloacilo o de éster activo
de \alpha,\beta-dihaloacilo. Adicionalmente, el
reactivo de haloacilo puede ser un anhídrido de haloacilo o un
anhídrido de \alpha,\beta-dihaloacilo. El
reactivo también puede ser un cloruro de haloacilo o un cloruro de
\alpha,\beta-dihaloacilo, así como un ácido de
haloacilo o un ácido de \alpha,\beta-dihalocilo.
Entre los ejemplos de los reactivos específicos que se pueden
utilizar en el procedimiento de la invención se incluyen
N-succinimidil-2,3-dibromopropionato
(un reactivo de éster activo de
\alpha,\beta-dihaloacilo) y yodoacetato de
N-succinimidilo (un reactivo de éster activo de
haloacilo). En una subclase preferida de reactivos de haloacilo se
incluyen reactivos de haloacetilo.
Los aspectos ventajosos de la invención serán más
completamente comprendidos y apreciados cuando se consideren junto
con la siguiente descripción detallada y las figuras adjuntas,
donde:
La Fig. 1A ilustra los reactivos de éster activo
de haloacilo que pueden ser utilizados en el método según la
invención;
La Fig. 1B ilustra los reactivos de anhídrido de
haloacilo que pueden ser utilizados en el método según la
invención;
La Fig. 1C ilustra los reactivos de cloruro de
haloacilo que pueden ser utilizados en el método según la invención;
y
La Fig. 1D ilustra los reactivos de ácido de
haloacilo que pueden ser utilizados en el método según la
invención.
Existe la necesidad en la técnica de métodos para
enlazar covalentemente proteínas u otros radicales a polisacáridos
manteniendo de ese modo la antigenicidad tanto del componente
polisacárido como proteico (u otros componentes) y de que la
conexión también sea estable. Así, se necesitan medios suaves y
lentos para acoplar establemente proteínas, péptidos, haptenos, u
otros radicales a polisacáridos.
El objeto de la presente invención era encontrar
un método para preparar un producto conjugado inmunogénico que
estimule la formación de anticuerpos contra el primer y segundo
radical constituyentes, donde el primer radical es un polisacárido,
y el segundo radical es una proteína.
El objeto se resuelve proporcionando un método
para preparar un producto conjugado inmunogénico, que comprende un
primer radical con uno o más grupos haloacilo pendientes; hacer
reaccionar el primer radical funcionalizado con un segundo radical
para formar un producto conjugado enlazado covalentemente; donde el
primer radical funcionalizado es un polisacárido, y el segundo
radical es una proteína no modificada o una proteína a la cual no se
han añadido uno o más grupos tiol; y donde el producto conjugado
inmunogénico estimula la formación de anticuerpos contra el primer y
el segundo radicales.
La invención se refiere a un método mejorado para
producir productos conjugados que puedan ser utilizados para vacunas
o inmunógenos. Los productos conjugados son inmunogénicos en los
sujetos a los que se administran, protegiendo de ese modo al sujeto
de enfermedades y dolencias causadas por diversos organismos
(organismos bacterianos, fúngicos, o virales). Para producir los
productos conjugados según la invención, se funcionaliza un primer
radical al menos con un grupo haloacilo pendiente y después se hace
reaccionar con un segundo radical. El grupo haloacilo puede ser un
grupo monohaloacilo o un grupo dihalocilo, y el halógeno puede ser,
por ejemplo, cloro, bromo, o yodo. Se prefieren los grupos
haloacetilo como subclase de reactivos de haloacilo para su uso en
el procedimiento de la invención.
Esta solicitud de patente demuestra que las
moléculas del primer radical (v.g., polisacáridos) que han sido
funcionalizadas con uno o más grupos haloacilo se pueden hacer
reaccionar con segundos radicales no transformados o no
funcionalizados (v.g., proteínas a las que no se han añadido grupos
tiol) para preparar productos conjugados. Tales productos conjugados
son adecuados para su uso como vacunas e inmunógenos. El
procedimiento de la invención también puede ser utilizado para
producir diversos reactivos inmunológicos, tales como polisacáridos
biotinilados.
En el término "primer radical", utilizado en
esta solicitud, se incluyen polisacáridos, oligosacáridos, y otros
carbohidratos. Entre los ejemplos específicos se incluyen dextrano,
dextrano carboxilado (tal como carboximetildextrano), polisacáridos
de bacterias biológicamente relevantes, tales como el polisacárido
de Neisseria meningitidis de tipo C, los polisacáridos
Pneumocócicos (tales como Pn14, Pn6, Pn19, y Pn23), el
polisacárido de Haemophilus influenzae ("PRP"), y el
oligosacárido PRP, así como sacarosa, lipopolisacárido, y
lipooligosacárido. Además, en esta solicitud, en el término
"segundo radical" se incluyen materiales que se van a enlazar
covalentemente al primer radical, incluyendo proteínas, péptidos,
haptenos, lipoproteínas, y similares. Entre los ejemplos específicos
se incluyen seralbúmina bovina ("BSA"), toxoide del tétanos,
toxoide de la difteria, toxoide pertussis, proteína Rib, intimina,
proteína gD, péptido LHRH, péptido consenso CFA/I (ver F.J. Cassels,
y col., Journal of Industrial Microbiology, 1996 Annual
Meeting for the Society of Industrial Microbiology), lipoOspA,
lipoD, PamCys, y monofosforolípido A. Aunque esta solicitud de
patente puede hacer referencia a "polisacáridos" o
"proteínas" cuando se describe generalmente la invención, los
expertos en la técnica reconocerán que se pueden utilizar otros
primeros y segundos radicales, tales como los descritos antes, sin
apartarse de la invención.
El procedimiento según la invención difiere de
los procedimientos descritos en los diversos documentos descritos en
la sección de antecedentes de esta solicitud. Por ejemplo, se
utilizan condiciones en el procedimiento de reacción de la invención
que no son generalmente deseables cuando se intentan formar
selectivamente enlaces tio-éter. En el procedimiento de la
invención, el pH puede ser alcalino (v.g., un pH mayor de 8), las
temperaturas pueden ser algo elevadas, y las concentraciones de los
componentes que van a ser acoplados pueden ser relativamente
elevadas. De hecho, a diferencia de los procedimientos para formar
enlaces tio-éter, se ha descubierto que el incremento de temperatura
aumenta significativamente el rendimiento de producto conjugado en
el procedimiento de la invención. En una realización de la
invención, la reacción de acoplamiento tiene lugar a una temperatura
que oscila de aproximadamente 15 a 60ºC, prefiriéndose de
aproximadamente 20 a 50ºC.
Al utilizar el procedimiento de la invención se
verifican numerosas ventajas. Por ejemplo, el procedimiento de la
invención permite el acoplamiento directo de moléculas del segundo
radical a moléculas del primer radical funcionalizadas con haloacilo
en condiciones de acoplamiento relativamente suaves. El grado de
reacción de acoplamiento en el procedimiento de la invención puede
ser fácilmente controlado por medio de cromatografía de líquidos de
alta resolución ("HPLC") utilizando mecanismos normalizados.
Quizás muy importantemente, cuando se utiliza el procedimiento de la
invención, no existe la necesidad de funcionalizar el segundo
radical (v.g., con grupos tiol) con el fin de que se produzca la
conjugación. Estos factores pueden reducir el coste de preparación
del producto conjugado y pueden ayudar a conservar epítopos
importantes, que pueden intensificar la respuesta inmune. Además, en
el procedimiento de la invención, el segundo radical es modificado
sólo si se conjuga con el primer radical. Esta carencia de
modificación del segundo radical no conjugado permite recuperar y
reutilizar los componentes del segundo radical (que no han
reaccionado) libres, si se desea. Esto puede ser importante, por
ejemplo, cuando el segundo radical es una proteína, debido a que la
proteína a menudo es el componente más valioso en el procedimiento
de la reacción de conjugación.
El grupo haloacilo es estable de manera que en
muchos casos el primer radical transformado (es decir, activado)
puede ser liofilizado y almacenado para su uso más tarde. Este rasgo
intensifica adicionalmente la utilidad del procedimiento según la
invención. Además, debido a que todos o esencialmente todos los
sitios reactivos del polisacárido (v.g., los sitios amina) son
funcionalizados en el procedimiento de la invención, el
entrecruzamiento intercatenario e intracatenario del polisacárido es
evitado cuando se utilizan reactivos bifuncionales (v.g.,
N-succinimidil-2,3-dibromo-propionato,
"SDBP").
Se encuentran disponibles muchos métodos para
preparar derivados haloacilados de polisacáridos. Algunos métodos
adecuados se describen, por ejemplo, en Hermanson, supra. Un
protocolo típico consiste en funcionalizar el polisacárido con
aminas (o hidrazidas) (v.g., con CDAP y hexanodiamina (o dihidrazida
adípica), como describen Lees, y col., en Vaccine, Vol. 14,
Núm. 3 (1996), págs. 190-198), seguido de reacción
con un reactivo de haloacilo, tal como el éster activo de un
haloacilo (v.g., yodoacetato de N-succinimidilo,
"SIA"). Las aminas o hidrazidas de polisacáridos también se
pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácido o cloruros de acilo
de reactivos haloacilados. Se pueden utilizar carbodiimida o sales
de uronio para acoplar ácidos haloacilados a polisacáridos
transformados con amina o hidrazida. Alternativamente, los
hidroxilos del polisacárido pueden ser marcados directamente
utilizando un cloruro de haloacilo. Cuando el polisacárido es
transformado de manera que semejante grupo haloacilo está anclado a
él, se dice que el grupo haloacilo es un "grupo haloacilo
pendiente".
Para ilustrar adicionalmente ejemplos de posibles
reactivos haloacilados para su uso en el procedimiento de la
invención, se requiere atención a las Figs. 1A a 1D. Por ejemplo, el
reactivo puede ser un éster activo, como se muestra en la Fig. 1A.
Los ésteres activos de N-hidroxisuccinimida son
particularmente preferidos. Adicionalmente, el reactivo puede ser
una sustancia anhídrida, como se ilustra en la Fig. 1B. El reactivo
haloacilado también puede ser un cloruro de haloacilo, cuyas
fórmulas generales se muestran en la Fig. 1C. En un posible reactivo
adicional se incluyen los ácidos de los compuestos haloacilados. Las
fórmulas de semejantes reactivos se ilustran en la Fig. 1D.
Como se muestra en las Figs. 1A a 1D, el reactivo
haloacilado puede incluir un único sustituyente halógeno (v.g., un
compuesto haloacetilado) o dos sustituyentes halógeno (v.g., un
compuesto \alpha,\beta-dihaloacilado). Un
ejemplo de reactivo haloacilado que contiene grupos halo en
configuración \alpha,\beta es SDBP (asequible de Pierce Chemical
Co.). Se ha informado que este reactivo reacciona con aminas para
formar una unión aziridina, no obstante, no se ha demostrado una
prueba de esta unión para productos conjugados macromoleculares. En
la experiencia de este solicitante, los compuestos amino de bajo
peso molecular, pero no las especies macromoleculares (v.g., las
proteínas), reaccionan fácilmente con el grupo dibromoacilado de los
polisacáridos. Como se observa en los siguientes ejemplos, los
rendimientos de producto conjugado son relativamente bajos a la
temperatura ambiente, pero aumentan significativamente elevando la
temperatura de reacción a aproximadamente 42ºC. Sin embargo, incluso
los productos conjugados producidos a temperaturas más bajas, con
razones de proteína a polisacárido relativamente bajas, pueden ser
inmunogénicos. Así, estos productos conjugados son útiles como
vacunas e inmunógenos según la invención.
En ciertos ejemplos, las proteínas son acopladas
a polisacáridos funcionalizados con haloacilo de elevado peso
molecular (> de aproximadamente 100 kDa). Puesto que generalmente
es más fácil conjugar especies de bajo peso molecular (v.g.,
proteínas, péptidos, o haptenos que tienen un peso molecular menor
de aproximadamente 100 kDa), cabría esperar que los polisacáridos,
oligosacáridos, y otros carbohidratos de bajo peso molecular fueran
incluso más fáciles de conjugar utilizando la química descrita.
Aunque el solicitante no desea estar ligado a
ninguna teoría química o mecanismo de reacción concreto, se da la
siguiente información como información antecedente adicional
referente a la invención. Se cree que las lisinas, que se encuentran
típicamente en el exterior de la proteínas, son los principales
aminoácidos nucleófilos de la proteína que reaccionan con el grupo
haloacilo del polisacárido funcionalizado. Las
\varepsilon-aminas de las lisinas tienen un pKa en
el intervalo de 9 a 10, que coincide con el descubrimiento de que un
pH en este intervalo, en el que el amino de la lisina estaría
desprotonado, conduce a buenos rendimientos de producto conjugado.
Si estuvieran implicadas la histidina (con un pKa de aproximadamente
6) o la metionina o la cisteína (aminoácidos con un tiol), cabría
esperar un buen acoplamiento a un pH mucho menor. Además, se debe
observar que el toxoide del tétanos utilizado no tenía tioles libres
detectables, por tanto no se formaban enlaces tio-éter. En el
trabajo realizado por el solicitante, se demostró que una proteína
de ensayo (BSA) que contenía aproximadamente 0,5 moles de tiol/mol
de proteína se acoplaría a pH neutro, pero si los tioles fueran
bloqueados, sería necesario un pH más alcalino y una temperatura
elevada para una buena conjugación.
La temperatura elevada puede servir para
incrementar la reactividad de los nucleófilos de la proteína con el
grupo haloacilo. También puede servir para "aflojar"
ligeramente la estructura de la proteína, incrementando de ese modo
la flexibilidad y aumentando el acceso a los grupos reactivos de la
proteína.
La invención se describirá con más detalle más
abajo en términos de los diversos ejemplos específicos. Estos
ejemplos específicos deben ser considerados una ilustración de la
invención, y no una limitación de la misma.
En este ejemplo, se preparó un producto conjugado
de toxoide del tétanos y Pn14 utilizando
N-succinimidil-2,3-dibromopropionato
("SDBP") como reactivo activador haloacilado para funcionalizar
el polisacárido.
Como primera etapa del procedimiento, se
transformó un polisacárido Pn14 con aminas. Para hacerlo, el Pn14,
obtenido de la American Tissue Culture Collection, fue
funcionalizado con aminas de la manera general descrita por Lees, y
col., Vaccine, Vol. 14, Núm. 3 (1996), pág.
190-198. Inicialmente, se solubilizaron 20 mg de
Pn14 durante la noche en 2 ml de agua. Después, se añadieron 60
\mul de CDAP, obtenido de Research Organics, a 100 mg/ml en
acetonitrilo. Treinta segundos más tarde, se añadieron 180 \mul de
trietilamina 0,2 M. A los 2,5 minutos, se añadió 1 ml de una
solución que contenía hexanodiamina 0,5 M en HEPES 0,75 M (ácido
N-hidroxietil-piperazino-N'-2-etanosulfónico)
y etilendiaminotetraacetato 5 mM ("EDTA") (proporcionando una
mezcla que tenía un pH de aproximadamente 7,3) a la mezcla de
CDAP/polisacárido. Después de reaccionar durante la noche a 4ºC, la
muestra fue sometida a diálisis exhaustivamente en solución salina.
La presencia de aminas libres fue determinada utilizando el análisis
del ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) descrito por Vidal y col.,
J. Immunol. Meth., Vol. 86 (1986), comenzando en la página
155. La presencia de Pn14 fue determinada utilizando el método de
análisis de Monsigny y col. (Anal. Chem., Vol. 175 (1988),
comenzando en la página 525 utilizando el Pn14 como patrón. Se
determinó que el polisacárido transformado resultante contenía una
proporción de 17,3 aminas por 100 kDa de Pn14.
En cuanto a la siguiente etapa, el Pn14
transformado con amina fue funcionalizado con grupos haloacilo para
producir Pn14 marcado con 2,3-dibromopropionato. Se
añadieron 50 \mul de una mezcla de HEPES 0,75 M y EDTA 5 mM (pH
7,3) a 2 mg del material de NH_{2}-Pn14 producido
antes en 0,53 ml de solución salina, con hielo. Se añadieron 1,5 mg
de SDBP (asequible de Pierce Chemical) en 50 \mul de
dimetilformamida ("DMF") mientras se mezclaba. Al cabo de una
hora, la muestra fue sometida a eliminación de la sal en dos
cartuchos P6 (asequible de BioRad®) en serie, equilibrada con
acetato de sodio 10 mM, NaCl 0,1 M, y EDTA 2 mM (pH 5), y
concentrada con un dispositivo Centricon 50® (asequible de Amicon®)
a aproximadamente 400 \mul. Este procedimiento produjo el
polisacárido Pn14 marcado.
El polisacárido Pn14 marcado con haloacilo fue
acoplado después a proteína del toxoide del tétanos no modificada.
En este procedimiento, se añadieron 2,2 mg de toxoide del tétanos
(obtenido de SmithKline Beecham de Rixensart, Bélgica) en 140 \mul
de solución salina tamponada con fosfato ("PBS") al
dibromopropionato-Pn14, seguido de la adición de 75
\mul de borato de sodio 0,1 M (pH 9,3). La solución fue incubada
durante 30 minutos a 37ºC y después durante la noche a la
temperatura ambiente, en la oscuridad. La mezcla se hizo pasar por
una columna de filtración en gel 1 x 50 cm S400HR (asequible de
Pharmacia), equilibrada con PBS. Las fracciones del volumen vacío
fueron reunidas y concentradas utilizando un dispositivo Macrosep®
50 (asequible de Filtron® Corporation) y filtradas a través de un
filtro Millex® HV.
El contenido en proteína de la mezcla de reacción
resultante fue determinado utilizando el análisis BioRad® con el
toxoide del tétanos como patrón. La cantidad de Pn14 fue determinada
utilizando el método de análisis de Monsigny y col., como se ha
descrito antes, con Pn14 como patrón. Se determinó que el producto
conjugado de proteína-polisacárido resultante
contenía 66 \mug/ml de toxoide del tétanos y 0,71 mg/ml de
Pn14.
Este material conjugado fue utilizado para
inmunizar ratones para determinar si se inducían respuestas inmunes
a la proteína y el polisacárido. Grupos de tres ratones Balb/C
fueron desangrados previamente e inyectados i.p. con 33 o 10 \mul
del producto conjugado, en un volumen de 100 \mul de solución
salina. En otro grupo los ratones fueron inyectados con solución
salina sola como control. Los ratones fueron desangrados el día 28,
y reforzados con 10,8 \mug de Pn14, como producto conjugado (1
\mug de TT y 10,8 \mug de Pn14). De nuevo los ratones fueron
desangrados 14 días más tarde. Los sueros recogidos el día 42 fueron
sometidos a ensayo en un análisis ELISA como sigue. Se recubrieron
placas para ELISA Nunc Maxisorb® con Pn14 o toxoide del tétanos a 1
\mug/ml en PBS. Los antisueros unidos, a una dilución 1:1.000,
fueron medidos utilizando IgG anti-ratón de conejo
específica de gamma conjugada con peroxidasa de rábano picante a una
dilución 1:4.000 en PBS/Tween®. Se utilizó TMB como sustrato. La
reacción de color fue sofocada a los 15 minutos. Las lecturas de
absorbancia del ELISA se tomaron a 430 nm.
La siguiente Tabla ilustra los datos de
inmunogenicidad obtenidos de los sueros recogidos el día 42.
| Dosis | Anti-Pn14^{*} | Anti-TT^{*} |
| 33 \mul | 1,431 | 1,844 |
| 10 \mul | 0,923 | 1,021 |
| salina | 0,297 | 0,260 |
^{*} lecturas de absorbancia del
ELISA tomadas a 430 nm.
Como resulta evidente a partir de la Tabla 1, los
títulos anti-Pn14 y anti-TT eran
notablemente superiores para las muestras con producto conjugado en
comparación con la muestra con control salino.
En este ejemplo, se conjugó toxoide del tétanos
con polisacárido del antígeno Vi. Primero, se preparó
polisacárido de Vi transformado con amina. Se mezclaron 3,4
ml de solución de antígeno Vi (a una concentración de 5 mg de
Vi/ml, obtenido de SmithKline Beecham) en 340 \mul de ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico 1 M
("MES") (pH 6). Después, se añadieron 68 \mul de
sulfo-N-hidroxisuccinimida 0,1 M y
90,4 mg de etilendiamina-2HCl. Se añadió
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
sólida ("EDC") a la mezcla de reacción hasta que la mezcla tuvo
una concentración de 10 mg EDC/ml. La reacción se dejó proseguir
durante cuatro horas a la temperatura ambiente, y después el
producto fue sometido a diálisis exhaustivamente en solución salina
y azida. Se determinó que el producto de reacción tenía 15,9
NH_{2}/100 kDa de Vi.
Después este material de Vi transformado
con amina fue yodoacetilado. Se añadieron 1,4 ml de
NH_{2}-Vi (a una concentración de 3,6 mg/ml) a 100 \mul
de una mezcla de HEPES 0,75 M y EDTA 0,5 M (pH=7,3), y 32 \mul de
yodoacetato de N-succinimidilo 1M ("SIA",
asequible de BioAffinity Systems). Al cabo de aproximadamente 2
horas, el polisacárido fue lavado diluyendo a 10 ml y después
concentrado a aproximadamente 200 \mul con un dispositivo de
ultrafiltración a presión con una membrana de 30 K (membrana
asequible de Filtron Omega®). La muestra fue separada y la membrana
lavada con borato de sodio 0,1 M (pH 9,3). El volumen final era de
760 \mul.
En este momento, el polisacárido de Vi
transformado con haloacilo fue conjugado con una proteína de toxoide
del tétanos no modificada. Se añadieron 300 \mul de toxoide del
tétanos (conteniendo 5 mg de toxoide del tétanos) en solución salina
a la solución de polisacárido, y la mezcla resultante fue incubada
en la oscuridad a 46ºC durante aproximadamente 22 horas. La reacción
fue sofocada añadiendo 20 \mul de mercaptoetanol 10 mM y se dejó
estar durante una hora. Se hicieron pasar 0,75 ml del producto de
reacción por una columna S400HR de 1 x 45 cm, y las fracciones de
elevado peso molecular fueron reunidas. El resto del material fue
sometido a diálisis en PBS.
Todo el material fue filtrado en condiciones
estériles con un dispositivo Millex® GV. Se determinó que la
fracción de elevado peso molecular, la Fracción H, contenía 0,71 mg
de TT/mg Vi. Esta Fracción H fue utilizada en un estudio de
inmunogenicidad en ratones. Se inmunizaron s.c. grupos de cuatro
ratones Balb/c con 5 \mug de Vi, sólo o en forma de
producto conjugado. Se administraron a los ratones inmunizaciones de
refuerzo el día 14 y se desangraron aproximadamente 14 días después.
Los sueros recogidos fueron sometidos a ensayo en un análisis ELISA.
Se recubrieron placas de ELISA Nunc Maxisorb® durante la noche con
antígeno Vi a 1 \mug/ml de tampón carbonato de sodio a pH
9. Los antisueros fueron sometidos a ensayo a diferentes diluciones
para determinar el título con un corte a 0,1 DO.
Se obtuvieron los siguientes datos de título
anti-Vi:
\vskip1.000000\baselineskip
| Inmunógeno | Título Anti-Vi | |
| TT-SIA-Vi | 1086 | |
| Vi | 119 |
A partir de esta Tabla, se puede observar
fácilmente que el título anti-Vi es superior para el producto
conjugado producido mediante el procedimiento de la invención (es
decir, el producto conjugado TT-SIA-Vi), en
comparación con el antígeno Vi inyectado solo.
En este Ejemplo, se produjo un producto conjugado
de toxoide del tétanos-PsC de Neisseria
utilizando SDBP como reactivo haloacilante. El PsC de
Neisseria (obtenido de SmithKline Beecham) fue solubilizado
durante la noche en agua a una concentración de 10 mg/ml. Se añadió
1 ml de MES 1 M (pH 6) a 5,5 ml de PsC, y después, se añadieron a
esta mezcla 307 mg de hexanodiamina-2HCl. Después de
eso, se añadieron también a la mezcla 7 mg de
sulfo-N-hidroxisuccinimida. El pH de
la mezcla de reacción resultante se midió a 5,75.
Después, se añadieron 500 \mul de EDC 0,5 M.
Tras reaccionar durante la noche a la temperatura ambiente, la
solución se sometió a diálisis en solución salina, seguido de
diafiltración sobre una membrana YM30 (asequible de Amicon®) y
eliminación de las sales sobre una columna P6DG de 2,5 x 12 cm
(asequible de BioRad®). El producto (NH_{2}-PsC)
fue concentrado a 6,1 ml y analizado en cuanto a las aminas libres
(mediante el método de Vidal y col., supra) y PsC (mediante
el método de Monsigny y col., supra)., con PsC como patrón.
Se determinó que el material de NH_{2}-PsC
resultante tenía una proporción de 7,5 aminas por 100 kDa del
polisacárido.
Este material de NH_{2}-PsC fue
haloacilado después. Se añadieron 100 \mul de una mezcla de HEPES
0,75 M y EDTA 5 mM a 1 ml del material de
NH_{2}-PsC (9,8 mg NH_{2}-PsC),
y se añadieron 100 \mul de SDBP 0,1 M (en DMF). Al cabo de dos
horas a 4ºC la solución se sometió a eliminación de las sales en una
columna P6DG de 1,5 x 15 cm (asequible de BioRad), y las fracciones
del volumen vacío fueron reunidas y concentradas a 350 \mul
utilizando un dispositivo Centricon 50 (asequible de Amicon®). Se
determinó que la concentración de PsC era de 18,2 mg/ml.
Se pipetearon 112 \mul del polisacárido
transformado (2 mg) en tubos de microcentrífuga, y se añadieron 1 o
2 mg de toxoide del tétanos (obtenido de SmithKline Beecham) a 16,8
mg/ml en solución salina. En el tiempo cero, se añadieron 50 \mul
de borato de sodio 0,1 M (pH 9,3) o borato de potasio (pH 10). Las
muestras fueron divididas e incubadas a la temperatura ambiente o a
42ºC y analizadas en los momentos indicados mediante HPLC. Se supone
que la cantidad de producto conjugado producido corresponde a la
absorbancia del volumen vacío del pico de elevado peso molecular. El
porcentaje de producto conjugado se calcula como el porcentaje de
absorbancia de UV para el pico de proteína conjugada, basándose en
la absorbancia de UV total de la proteína, medida mediante
HPLC.
HPLC.
Todas las muestras fueron incubadas después 24
horas más a 42ºC y analizadas de nuevo mediante HPLC. Se reunieron
los grupos A2, B1, y B2 y se sofocaron mediante la adición de 25
\mul de mercaptoetanol 10 mM durante 15 minutos. Cada reserva se
hizo pasar por una columna de filtración en gel S400HR (asequible de
Pharmacia), equilibrada con PBS, filtrada en condiciones estériles,
y analizada en cuanto al toxoide del tétanos y el
PsC.
PsC.
Los resultados del ensayo mediante HPLC se
muestran en la siguiente Tabla:
\newpage
A las 18 horas, 35 horas y 60 horas
aproximadamente, se analizaron alícuotas de 5 \mul mediante
cromatografía HPLC de exclusión por tamaños en una columna Beckman®
SEC G4000, KPO_{4} 0,1 M, pH 7,3, circulando a 1 ml/minuto. El
flujo fue controlado mediante la absorbancia de UV.
A partir de estos datos, se pueden realizar las
siguientes observaciones: (1) en todas las condiciones, el
acoplamiento aumentaba significativamente incrementando la
temperatura y el pH; (2) incluso tiempos de reacción prolongados
(hasta 35 horas) a la temperatura ambiente no eran tan eficaces al
promover el acoplamiento como la temperatura elevada; (3) la
eficacia del acoplamiento es superior a una razón proteína:Ps
inferior (0,5 vs 1 mg de TT/mg de Ps); y (4) se pueden obtener muy
buenos rendimientos a pH 9,3.
La posibilidad de utilizar la química según la
invención para preparar productos conjugados de baja proporción con
una buena eficacia de acoplamiento se ilustra en las Muestras A2 y
C2 en las que se utilizan 1,0 o 0,5 mg de TT/mg de PsC,
respectivamente. Se ha observado que la eficacia de acoplamiento es
superior a una proporción más baja de Muestra C2 (44% vs. 56%),
respectivamente. Las proporciones de proteína con respecto a PsC
estimadas en los productos conjugados resultantes son de 0,44 mg/mg
y 0,28 mg/mg, respectivamente. Por lo tanto, en la Muestra C2, se
necesita menos proteína para preparar producto conjugado a la vez
que todavía se obtienen buenos rendimientos de acoplamiento.
En este Ejemplo, se acopló proteína del toxoide
del tétanos a un polisacárido PsC de Neisseria utilizando SIA
como reactivo funcionalizador del polisacárido.
Primero, se preparó NH_{2}-PsC
de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 3. Se mezcló 1
ml del material de NH_{2}-PsC (a una concentración
de 9,8 mg/ml) con 100 \mul de una mezcla de HEPES 0,75 M y EDTA
0,5 mM (pH = 7,3) y con 100 \mul de SIA en DMF 0,1 M. Al cabo de
aproximadamente dos horas, la mezcla de reacción se sometió a
eliminación de las sales en una columna P6DG (asequible de
Pharmacia), equilibrada con acetato de sodio 10 mM y EDTA 2 mM (pH
5). Las fracciones que contenían el pico de polisacárido fueron
reunidas y concentradas utilizando un dispositivo Centricon® 50
(asequible de Amicon®), y se determinó que la concentración de PsC
de Neisseria resultante era de aproximadamente 10 mg/ml.
Se añadieron 400 \mul del material de
SIA-PsC preparado antes a 240 \mul de una solución
de toxoide del tétanos a una concentración de 16,8 mg/ml en solución
salina, y se añadieron 100 \mul de borato de sodio 0,1 M (pH 10).
La muestra fue incubada en la oscuridad durante 40 horas a 42ºC,
sofocada mediante la adición de 25 \mul de mercaptoetanol 10 mM
durante 30 minutos y fraccionada en una columna S400HR de 1 x 150 cm
equilibrada con solución salina. Las fracciones de elevado peso
molecular fueron reunidas, filtradas en condiciones estériles, y
analizadas en cuanto a la proteína y el polisacárido. Se determinó
que la proporción era de 0,28 mg de TT/mg de PsC.
Se obtuvieron los datos de inmunogenicidad de los
productos conjugados de los Ejemplos 3 y 4. Del Ejemplo 3, se
reunieron las Muestras A1, C1 y C2 y se fraccionaron, y este
material constituía la Muestra 5A para este Ejemplo. El producto
conjugado preparado en el Ejemplo 4 fue utilizado como Muestra 5B.
De esta manera, los productos conjugados producidos utilizando SDBP
como reactivo de funcionalización con haloacilo (Muestra 5A) pueden
ser comparados con los productos conjugados producidos utilizando
SIA (Ejemplo 5B).
Grupos de cuatro ratones Balb/c fueron
inmunizados con 10 \mug de PsC de Neisseria, ya sea solo
(en forma de una muestra de control) ya sea conjugado (Muestras 5A y
5B). Los ratones fueron reforzados con el mismo antígeno el día 14 y
sangrados 14 días más tarde. Los sueros fueron analizados en cuanto
a los anticuerpos contra PsC de Neisseria. Se determinó la
capacidad para proteger utilizando un análisis bactericida. Se
obtuvieron los siguientes resultados:
| Inmunógeno | Título anti-PsC | Título bactericida^{*} |
| Muestra 5A | 3019 | 1:320 |
| Muestra 5B | 4771 | 1:320 |
| Antisueros de referencia | 1:640 | |
| PsC solo | menos de 1:10 |
^{*} Realizado como describen Wong,
K.H., y col., Journal of Biological Standards, Vol.
5(1977), comenzando en la página 197.
A partir de estos datos, es evidente que los
productos conjugados producidos según la invención proporcionaban
excelentes respuestas de anticuerpos, incluyendo respuestas de
anticuerpos altamente funcionales que eran bactericidas, v.g.,
protectores.
En este Ejemplo, un oligosacárido es
funcionalizado con un grupo haloacilo pendiente y acoplado a una
proteína por medio de este grupo, que está localizado en un extremo
del oligosacárido. Generalmente, la hidrólisis y transformación con
aminas, como se describe más abajo, se logra según el método
descrito en Porro, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.153.312,
cuya patente se incorpora aquí en su totalidad como referencia.
El polisacárido Pneumocócico de tipo 14
("Pn14") es solubilizado a 5 mg/ml en ácido trifluoroacético
acuoso 0,5 M en una ampolla sellada y calentado a 70ºC durante tres
horas. Tras la neutralización, los oligosacáridos son fraccionados
sobre una columna de Sephadex® G25, equilibrada con NaCl 0,15 M. La
concentración de carbohidrato se determina utilizando el método de
Monsigny (descrito antes), y el número de extremos reductores se
determina utilizando ácido bicinconínico (asequible de Pierce
Chemical), utilizando galactosa como patrón. La razón de extremos
reductores con respecto al carbohidrato total permite estimar el
peso molecular de los oligosacáridos.
Para este Ejemplo se seleccionan oligosacáridos
con un peso molecular de aproximadamente 3.000 a 5.000 daltons.
Se acopla etilendiamina al extremo reductor del
oligosacárido utilizando la aminación reductiva. Se elaboran
soluciones de oligosacárido 0,5 M en etilendiamina a pH 5, y después
se añade cianoborohidruro de sodio sólido a una concentración final
de 50 mM. Después de dos días en la oscuridad a la temperatura
ambiente, los oligosacáridos marcados con amina son sometidos a
separación de las sales en una columna Sephadex® G10, equilibrada
con NaCl 20 mM. El material resultante se concentra mediante
perevaporación, en la oscuridad, a 25 mg/ml de carbohidrato. La
razón de aminas a carbohidrato se determina utilizando TNBS para
medir las aminas.
El oligosacárido transformado con amina es
yodoacetilado después. Se añade una mezcla de HEPES 0,75 M y EDTA
0,5 mM al NH_{2}-oligosacárido hasta que la
solución resultante es 0,1 M en HEPES y el pH se ajusta a 7,3. Se
añade un exceso molar de diez veces de SIA con respecto a las aminas
a partir de una solución de partida de SIA 0,1 M (en DMF), y la
reacción se deja continuar durante dos horas en la oscuridad. La
muestra se somete a eliminación de las sales de nuevo utilizando una
columna Sephadex® G10 y se perevapora en la oscuridad a una
concentración final de 25 mg/ml.
El oligosacárido yodoacetilado es combinado
después con el toxoide del tétanos de manera que haya un peso igual
de cada componente y la concentración final de cada uno sea de
aproximadamente 10 mg/ml. La mezcla se incuba en la oscuridad a
43ºC, y se controla el grado de conjugación mediante HPLC de
exclusión por tamaños utilizando un índice de refracción ("IR")
y un detector de UV. El incremento de la señal de IR para el pico de
proteína, así como el incremento en el peso molecular, indican el
acoplamiento del carbohidrato. Se espera que se haya producido una
conjugación suficiente en aproximadamente 24 horas. El oligosacárido
no conjugado se separa del producto conjugado mediante filtración en
gel en una columna S100HR (asequible de Pharmacia).
El material producto conjugado (un producto
conjugado de oligosacárido-proteína) puede ser
utilizado para la inmunización para inducir una respuesta inmune en
un sujeto.
Al describir la invención, el solicitante ha
expuesto ciertas teorías en un esfuerzo por describir cómo y porqué
la invención funciona de la manera en que funciona. Estas teorías se
exponen sólo con fines informativos. El solicitante no está ligado a
ningún mecanismo químico o físico específico o teorías de
funcionamiento.
Adicionalmente, el solicitante ha descrito
numerosos ejemplos y procedimientos para producir productos
conjugados según la invención. Si bien estos procedimientos pueden
ser optimizados adicionalmente (v.g., optimizando las condiciones de
pH durante el acoplamiento, los tiempos de reacción, las
temperaturas de reacción, etc.), semejante optimización de los
procedimientos y condiciones de reacción es una cuestión de
experimentación rutinaria.
Claims (10)
1. Un método para preparar un producto conjugado
inmunogénico, que comprende: funcionalizar un primer radical con uno
o más grupos haloacilo pendientes; hacer reaccionar el primer
radical funcionalizado con un segundo radical para formar un
producto conjugado unido covalentemente; donde el primer radical es
un polisacárido, y el segundo radical es una proteína no modificada
o una proteína a la cual no se han añadido uno o más grupos tiol; y
donde el producto conjugado inmunogénico estimula la formación de
anticuerpos contra el primer y el segundo radicales.
2. Un método según la reivindicación 1, donde el
primer radical es un miembro seleccionado del grupo formado por un
polisacárido Pneumocócico, el antígeno Vi, y el
polisacárido de Neisseria meningitidis de tipo C.
3. Un método según la reivindicación 2, donde el
primer radical es un polisacárido Pneumocócico de tipo 14
(PN-14).
4. Un método según la reivindicación 2, donde el
primer radical es el antígeno Vi.
5. Un método según la reivindicación 2, donde el
primer radical es el polisacárido de tipo C de Neisseria
meningitidis (Neisseria PsC).
6. Un método según la reivindicación 1, donde el
procedimiento de funcionalización se logra haciendo reaccionar el
primer radical con un reactivo que contiene haloacilo.
7. Un método según la reivindicación 6, donde el
reactivo que contiene haloacilo es un miembro seleccionado del grupo
formado por ésteres activos de compuestos haloacilados, anhídridos
de compuestos haloacilados, cloruros de haloacilo, compuestos ácidos
haloacilados, ésteres activos de compuestos
\alpha,\beta-dihaloacilados, anhídridos de
compuestos \alpha,\beta-dihaloacilados, cloruros
\alpha,\beta-dihaloacilados, y compuestos ácidos
\alpha,\beta-dihaloacilados.
8. Un método según la reivindicación 6, donde el
reactivo que contiene haloacilo es un reactivo que contiene
haloacetilo.
9. Un método según la reivindicación 1, donde en
el procedimiento de funcionalización se incluye hacer reaccionar el
primer radical con
N-succinimidil-2,3-dibromopropionato
(SDBP).
10. Un método según la reivindicación 1, donde en
el procedimiento de funcionalización se incluye hacer reaccionar el
primer radical con yodoacetato de N-succinimidilo
(SIA).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4237997P | 1997-04-24 | 1997-04-24 | |
| US42379P | 1997-04-24 |
Publications (1)
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