ES2166097T5 - Glicoconjugados de neisseria meningitidis de serogrupo b y procedimientos para usarlos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A NUEVOS GLUCOCONJUGADOS DEL GRUPO SEROLOGICO B DE LA NEISSERIA MENINGITIDIS. MAS CONCRETAMENTE, LA INVENCION PERTENECE A GLUCOCONJUGADOS FORMADOS A PARTIR DE UN DERIVADO DE OLISACARIDO CAPSULAR DEL SEROGRUPO B DE LA NEISSERIA MENINGITIDIS (DERIVADO MENBOS) EN EL QUE GRUPOS N - ACETILO DEL RESIDUO DE ACIDO SIALICO SON SUSTITUIDOS POR GRUPOS N - ACILO. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A FORMULACIONES DE VACUNAS QUE CONTIENEN LOS GLUCOCONJUGADOS, PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR LAS FORMULACIONES DE VACUNAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EL USO DE DICHAS FORMULACIONES PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR EL GRUPO SEROLOGICO B DE LA NEISSERIA MENINGITIDIS O DE LA E. COLI K1, EN UN SUJETO MAMIFERO.

Description

Glicoconjugados de Neisseria meningitidis de serogrupo B y procedimientos para usarlos.

Antecedentes de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere en general a glicoconjugados de Neisseria meningitidis de serogrupo B. Más particularmente, la invención se refiere a glicoconjugados formados a partir de un derivado de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis de serogrupo B (derivado de OS MenB) en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se han sustituido por grupos N-acilo C_{3}-C_{8}, y a procedimientos para preparar y usar estos glicoconjugados.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis es un agente causante de la meningitis y sepsis bacteriana. Los meningococos se dividen en grupos serológicos basados en las características inmunológicas de los antígenos de la pared celular y capsular. Entre los grupos serológicos que se reconocen actualmente se incluyen A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E. Se han purificado los polisacáridos responsables de la especificidad de los serogrupos de varios de estos grupos, incluyendo A, B, C, D, W-135 e Y.

El serogrupo B de N. meningitidis ("MenB") da cuenta de aproximadamente 50 por ciento de la meningitis bacteriana en bebés y niños que viven en EE.UU. y Europa. El organismo también produce sepsis fatal en adultos jóvenes. En adolescentes, se ha encontrado que las vacunas de MenB que constan de vesículas de proteína de membrana externa (OMP) protegen en aproximadamente 50%. Sin embargo, no se ha observado protección en bebés y niños, los grupos de edades con mayor riesgo de enfermedad. Adicionalmente, las vacunas de OMP son específicas de serotipo y subtipo, y las cepas de MenB dominantes están sujetas a variación tanto geográfica como temporal, limitando la utilidad de dichas vacunas.

Se han desarrollado vacunas basadas en polisacáridos capsulares eficaces frente a la enfermedad meningocócica producida por los serogrupos A, C, Y y W135. Sin embargo, intentos similares para desarrollar una vacuna de polisacárido de MenB han fracasado, debido a la pobre inmunogenicidad del polisacárido capsular de MenB (denominado aquí "PS MenB"). El PS MenB es un homopolímero del ácido N-acetil(\alpha2\rightarrow8)neuramínico. Escherichia coli K1 tiene el polisacárido capsular idéntico. Los anticuerpos estimulados por el PS MenB reaccionan de forma cruzada con poli(ácido siálico) (PSA) del huésped. El PSA es expresado abundantemente en tejidos fetales y de recién nacidos, especialmente en moléculas de adhesión celular neurales ("NCAM") encontrada en tejidos del cerebro. El PSA también se encuentra en menor cantidad en tejidos adultos que incluyen el riñón, corazón y nervio olfativo. Por lo tanto, la mayoría de los anticuerpos anti-PS MenB también son autoanticuerpos. Por lo tanto, dichos anticuerpos tienen el potencial de afectar adversamente al desarrollo fetal, o conducir a la enfermedad autoinmune. Véase Jennings, H.J. y col. en "Avances en Ciencias de la Vida: Poli(ácido siálico): de los microbios al hombre" ("Advances in Life Sciences: Polysialic Acid: from Microbes to Man"), Roth, J. y col., Eds Birkhaeuser Verlag, Basel, Suiza, 1993, páginas 25 a 38.

Se han preparado derivados de PS MenB en un intento de sortear la pobre inmunogenicidad del PS MenB. Por ejemplo, se han descrito derivados de PS MenB sustituidos con N-acilo C_{4}-C_{8}. Véase, la Publicación EP nº 504.202 B, de Jennings y col. Igualmente, la patente de EE.UU. nº 4.727.136 de Jennings y col, describe una molécula de PS MenB N-propionilado, denominada aquí "PS NPr-MenB". Se describió que ratones inmunizados con glicoconjugados de PS NPr-MenB estimulaban altas concentraciones de anticuerpos IgG. Jennings y col. (1986) J. Immunol. 137:1708. En conejos, se produjeron dos poblaciones distintas de anticuerpos usando el derivado, supuestamente asociadas con dos epítopos distintos, uno compartido con PS MenB y otro sin compartir. Se encontró actividad antibacteriana en la población de anticuerpos que no reaccionó de forma cruzada con el PS MenB. Jennings y col. (1987) J. Exp. Med. 165:1207. La identidad del(los) epítopo(s) de la superficie bacteriana que reacciona(n) con los anticuerpos protectores estimulados por este conjugado, sigue siendo desconocida.

Aunque los derivados de PS MenB antes descritos son capaces de estimular una respuesta anti-PS MenB significativa, los anticuerpos de respuesta todavía incluyen una proporción significativa de moléculas que reaccionan de forma cruzada con los restos del poli(ácido siálico) en el tejido del huésped, y por lo tanto son autorreactivas. Por lo tanto, hasta la fecha, ningún enfoque con respecto al desarrollo de la vacuna de MenB ha tenido éxito para proporcionar una vacuna eficaz y segura contra la MenB. De acuerdo con esto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar inmunogenes de MenB que se puedan usar en formulaciones de vacunas, en las que los inmunogenes no estimulen la producción de anticuerpos en animales inmunizados que reaccionen de forma cruzada con tejidos del huésped y así se puedan usar en la prevención o tratamiento de la enfermedad de MenB.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una preparación sustancialmente homogénea de fragmentos de derivado de oligosacárido de MenB (OS MenB), y glicoconjugados preparados a partir de estos fragmentos, proporciona inmunogenes altamente eficaces para usar en preparaciones de vacunas anti-MenB. Los anticuerpos estimulados en animales inmunizados por estos fragmentos de derivados de OS MenB sustancialmente no reaccionan de forma cruzada con tejidos del huésped, como se determina usando varios ensayos de unión aquí descritos, y por lo tanto no son autorreactivos. Puesto que los presentes fragmentos de OS MenB no estimulan la formación de moléculas autorreactivas, proporcionan un componente de vacuna seguro y eficaz para usar para prevenir la enfermedad de MenB y E. Coli K1.

De acuerdo con esto, en una realización, el objeto de la invención se dirige a un glicoconjugado que comprende un derivado de OS MenB que tiene grupos N-acetilo en los restos ácido siálico sustituidos por grupos N-acilo C_{3}-C_{8}, en el que el derivado de OS MenB está unido covalentemente a una molécula vehículo y tiene un grado medio de polimerización (Dp) de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.

En otra realización, el objeto de la invención se dirige a un glicoconjugado que comprende un derivado de OS MenB que tienen grupos N-acetilo en restos ácido siálico sustituidos por grupos N-propionilo, en el que el derivado de Os MenB está unido covalentemente a una proteína vehículo de toxoide de tétano y tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

Todavía en otra realización, la invención se dirige a un procedimiento para preparar un glicoconjugado que comprende:

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de OS MenB, en los que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se han sustituido por grupos N-acilo C_{3}-C_{8};

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de OS MenB de la población de (a), en el que los derivados de OS MenB tienen un Dp medio de aproximadamente 10 a 20;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de OS MenB activados en un solo extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de Os MenB activados en el extremo a una molécula vehículo para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB que consta de restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

Todavía en otra realización, la invención se dirige a un procedimiento para producir un glicoconjugado que comprende:

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de OS MenB en los que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se han sustituido por grupos N-propionilo;

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de Os MenB de la población de (a), en el que los derivados de OS MenB tienen un Dp medio de aproximadamente 12 a 18;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de Os MenB activados en un solo extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de OS MenB activados en el extremo, a una molécula vehículo de toxoide de tétano para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB/toxoide de tétano, que comprende restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

Todavía en otras realizaciones, el objeto de la invención se refiere a glicoconjugados preparados por estos procedimientos, a composiciones de vacunas que comprenden los glicoconjugados en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y a procedimientos para formar las composiciones de vacunas.

En otra realización, el objeto de la invención se dirige a un procedimiento para prevenir o tratar la enfermedad de MenB y/o E. coli K1 en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones de vacunas anteriores.

Estas y otras realizaciones de la presente invención se le ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica en vista de esta descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa el glicoconjugado basado en derivados de OS NPr-MenB, CONJ-1, preparado en la práctica de la invención.

La Figura 2 representa el glicoconjugado basado en derivados de OS NPr-MenB, CONJ-2, preparado en la práctica de la invención.

La Figura 3 representa el glicoconjugado basado en derivados de OS NPr-MenB, CONJ-3, preparado en la práctica de la invención.

La Figura 4 representa el glicoconjugado basado en derivados de OS NPr-MenB, CONJ-4, preparado en la práctica de la invención.

La Figura 5 representa cromatogramas tomados durante la preparación de un glicoconjugado de PS NPr-MenB//
CRM_{197} de control antes y después de la unión covalente de los sacáridos a la proteína vehículo descrito en el Ejemplo 2.

La Figura 6 representa los resultados de ELISA descrito en el Ejemplo 3 que evalúa la producción de una respuesta de anticuerpos anti-PS-NPr-MenB IgG en animales inmunizados con una composición de vacuna que contiene los glicoconjugados de control.

La Figura 7 representa los resultados de ELISA descrito en el Ejemplo 4 que evalúa las subclases de IgG de la respuesta de anticuerpos estimulada por una composición de vacuna de glicoconjugado de control.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención usará, salvo que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de DNA recombinante dentro de la técnica. Dichas técnicas son explicadas completamente en la bibliografía, Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol I & II (D. Glover, ed); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds, 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Handbook of Experimental Immunology, vol I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds, 1986, Blackwell Scientific Publications).

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referencias plurales salvo que el contenido indique claramente otra cosa.

I. Definiciones

Para describir la presente invención, se usarán los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica a continuación.

Tal como se usa aquí, un "derivado de PS MenB" se refiere a una molécula obtenida por la modificación química del polisacárido capsular natural de MenB. Dichos derivados de PS MenB incluyen, pero no están limitados, moléculas de PS MenB que han sido modificadas por la sustitución de los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico de la molécula natural por grupos acilo C_{3}-C_{8} adecuados, en los que la expresión "grupo acilo" engloba cualquier molécula aromática o alifática lineal, ramificada acilada. Un derivado de PS MenB particularmente preferido para usar aquí comprende la sustitución de grupos N-acetilo por grupos N-propionilo del PS MenB natural (denominado aquí PS NPr-MenB). En la técnica se conocen procedimientos para sintetizar derivados de PS MenB sustituidos con N-acilo, incluyendo PS NPr-MenB, y se describen por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.727.136 de Jennings y col, y Publicación EP nº 504.202 B, también de Jennings y col.

Un "antígeno" se define aquí para que incluya cualquier sustancia que se pueda unir específicamente a una molécula de anticuerpo. Un "inmunogen" es un antígeno que es capaz de iniciar la activación de linfocitos dando como resultado una repuesta inmunitaria específica del antígeno. Dicha activación generalmente da como resultado el desarrollo de una respuesta inmunitaria segregada mediada por anticuerpo y/o celular frente al inmunogen. Normalmente, dicha respuesta incluye, pero no se limita, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases inmunológicas, tales como IgA, IgD, IgE, IgG o IgM; la proliferación de linfocitos B y T; el suministro de señales de activación, crecimiento y diferenciación a células inmunológicas; expansión de poblaciones de células T ayudadoras, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta. Por lo tanto los inmunogenes incluyen cualquier molécula que contenga uno o más determinantes antigénicos (por ejemplo, epítopos) que estimularán un sistema inmunológico del huésped para iniciar dicha respuesta específica del antígeno.

Por "epítopo" se entiende un sitio en un antígeno al cual responden células B y células T específicas. El término también se usa de forma intercambiable con "determinante antigénico" o "sitio del determinante antigénico". Un epítopo péptido puede constar de 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única del epítopo. Generalmente, un epítopo consta de al menos 5 de dichos aminoácidos, y más usualmente, consta de al menos 8-10 de dichos aminoácidos. Se conocen en la técnica procedimientos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos, e incluyen por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de los epítopos en una proteína dada se lleva a cabo fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998 (procedimiento general para sintetizar péptidos rápidamente, para determinar la localización de los epítopos inmunogénicos en un antígeno dado); Patente de EE.UU. nº 4.708.871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopos de antígenos); y Geysen y col. (1986) Molecular Immunology 23:709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar con un simple inmunoensayo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

Un "epítopo de MenB único" se define aquí como un epítopo presente en una bacteria de MenB, en la que los anticuerpos dirigidos al epítopo son capaces de unirse específicamente a MenB y no reaccionar de forma cruzada, o reaccionar mínimamente de forma cruzada, con los restos ácido siálico presentes en la superficie del tejido del huésped. Lo inmunogenes que contienen uno o más "epítopos de MenB únicos" son útiles en vacunas para prevenir la enfermedad de MenB, y tampoco estimulan respuesta autoinmune, o suponen un riesgo mínimo de estimular respuesta autoinmune.

Por "sujeto mamífero" se entiende cualquier miembro de la clase Mammalia, incluyendo, sin límites, seres humanos y otros primates, incluyendo dichos primates no humanos como chimpancés y otras especies de monos y simios; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; y animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayos. El término no indica una edad o sexo particular. Por lo tanto, se pretende cubrir tanto los individuos adultos como los recién nacidos, así como fetos, machos o hembras.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Como se ha explicado antes, el polisacárido capsular natural de MenB, denominado aquí "PS MenB", es poco inmunogénico en seres humanos y animales de experimentación. Además, el PS MenB natural estimula la producción de anticuerpos y, por lo tanto, puede ser inadecuado para usar en composiciones de vacunas. Por lo tanto, la presente invención usa inmunogenes derivados de OS MenB que se han seleccionado basándose en su capacidad para estimular la formación de anticuerpos que presentan actividad funcional frente a bacterias de MenB, en los que dicha actividad funcional es importante para conferir protección frente a la enfermedad de MenB. Los inmunogenes también se seleccionan basándose en que estimulen una respuesta inmunitaria que tenga actividad autoinmune mínima o sustancialmente indetectable determinada usando los ensayos aquí descritos.

Más particularmente, los derivados de PS MenB se prepararon para usar como materia prima para producir inmunogenes derivados de OS MenB. Los derivados de PS MenB generalmente comprende sustituciones de los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico de la molécula natural por grupos acilo C_{3}-C_{8}. Los derivados de PS MenB particularmente preferidos comprenden la sustitución de los grupos N-acetilo por grupos N-propionilo del PS MenB natural y se denominan aquí "PS NPr-MenB". Dichos derivados y procedimientos para sintetizarlos se describen por ejemplo en la patente de EE.UU. nº 4.727.136 y publicación EP nº 504.202 B, ambas de Jennings y col.

Los derivados de acilo C_{3}-C_{8} se pueden preparar primero por N-desacilación de MenB natural (obtenido por ejemplo de cultivos de N. meningitidis) en presencia de una base fuerte para eliminar cuantitativamente los grupos N-acetilo y proporcionar un grupo amina reactivo en la parte de los restos ácido siálico de la molécula. Después, los polisacáridos de MenB desacetilados se N-acilan. Por ejemplo, en el caso del PS NPr-MenB, la molécula desacetilada se N-propionila usando una fuente de grupos propionilo tales como anhídrido propiónico o cloruro de propionilo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.727.136 de Jennings y col. La extensión de la N-acilación se puede determinar usando, por ejemplo, espectroscopía de RMN. En general, las condiciones de reacción se seleccionan de forma que la extensión de la N-acilación es al menos aproximadamente 80%.

Así se obtiene una población heterogénea de derivados de PS MenB de alto peso molecular. Procedimientos previos han usado dichos derivados de alto peso molecular heterogéneos para preparar glicoconjugados, en los que los derivados se someten a oxidación con peryodato controlada para crear grupos aldehídos terminales en el extremo no reductor para la conjugación (mediante el grupo aldehído en el extremo no reductor del polisacárido) a una proteína vehículo. Sin embargo, en la práctica de la presente invención, los derivados de polisacárido de MenB N-acilado antes descritos se fragmentan y después se fraccionan por tamaños para proporcionar una población sustancialmente homogénea de fragmentos de oligosacáridos de MenB de "tamaño" intermedio para usar para preparar glicoconjugados.

Con el fin de proporcionar glicoconjugados basados en derivado de OS MenB N-acilado C_{3}-C_{8} con configuraciones estructurales controladas y bien definidas, se preparan oligosacáridos de MenB N-acilados de tamaño intermedio para tener tamaños de restos de sacáridos sustancialmente homogéneos. Los glicoconjugados formados a partir de estas moléculas cribadas se espera que presenten un comportamiento inmunológico más consistente que las preparaciones heterogéneas. Específicamente, una preparación de PS MenB N-acilada, que tiene restos ácido siálico sustancialmente 100% N-acilados, determinado, por ejemplo, por análisis de RMN, se puede fragmentar en condiciones ácidas suaves para proporcionar una población de moléculas de oligosacárido de tamaños variables. Los productos fragmentados se fraccionan por tamaño, usando por ejemplo, técnicas cromatográficas estándar combinadas con, por ejemplo, gradientes salinos progresivos, para proporcionar fracciones de moléculas de MenB N-aciladas de tamaños homogéneos. Se seleccionan para posterior uso aquí, las fracciones que contienen oligosacáridos de tamaño intermedio, por ejemplo, un Dp medio de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, preferiblemente de 10 a aproximadamente 20, y más particularmente de aproximadamente 12 a aproximadamente 18. Estos oligómeros N-acilados cribados que tienen una longitud intermedia son suficientemente pequeños para funcionar como un hapteno dependiente de células T, y son todavía suficientemente grandes para expresar epítopos conformacionales
relevantes.

Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de fragmentos de derivados de PS MenB calibrados, las moléculas se pueden conjugar con una molécula vehículo adecuada para proporcionar glicoconjugados. En lo sucesivo se describen vehículos adecuados. Particularmente, se pueden formar preparaciones de glicoconjugado que tienen configuraciones estructurales controladas y bien definidas a partir de oligosacáridos de MenB N-acilados de tamaño intermedio para proporcionar inmunogenes de oligosacárido de MenB N-acilado que tienen inmunogenicidad superior.

Por lo tanto, en una realización de la invención, un grupo de glicoconjugados de OS MenB N-acilados C_{3}-C_{8}, uno de cuyos ejemplos se denomina aquí "CONJ-1", se puede preparar como sigue. Fracciones de oligosacáridos de tamaño intermedio que tienen un Dp de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, y preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, se activan químicamente en el extremo, en su extremo no reductor y se conjugan a proteínas vehículo por una técnica de aminación reductora para proporcionar glicoconjugados CONJ-1. El glicoconjugado resultante se describe en la Figura 1, en la que los fragmentos de oligosacáridos 2 se muestran covalentemente unidos por sus extremos no reductores 4 a una proteína vehículo 6 para proporcionar un glicoconjugado, indicado de forma general en 8. La conjugación con éxito se puede determinar usando, por ejemplo, filtración en gel, y la relación de sacárido a proteína (peso/peso) final se puede evaluar por ensayo colorimétrico.

En una realización de la invención relacionada, se puede preparar como sigue otro grupo de glicoconjugados de Os MenB N-acilado C_{3}-C_{8}, uno de cuyos ejemplos se denomina aquí "CONJ-2". Fracciones de oligosacáridos de tamaño intermedio con un Dp medio de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, y preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, se anclan en una proteína vehículo por sus extremos reductores para proporcionar glicoconjugados que tienen una polaridad química inversa (orientación). En particular, los extremos reductores de los fragmentos de oligosacárido de MenB N-acilado se pueden convertir en grupos amino libres por aminación reductora usando, por ejemplo, NaCNBH_{3}. Después, los grupos amino libres se pueden modificar uniendo covalentemente una molécula de anclaje que lleve un éster de ácido adípico activo con N-OH de succinimida. La conjugación a una proteína vehículo se produce por desplazamiento nucleófilo del grupo éster activo por el grupo \varepsilon-amino de lisina para proporcionar un enlace amida estable. Como se puede ver con referencia a la Figura 2, los glicoconjugados CONJ-2 resultantes, indicados de forma general en 18, tienen una configuración similar a los glicoconjugados CONJ-1, sin embargo, los fragmentos de sacárido están orientados en dirección opuesta en relación con la proteína vehículo. Esta orientación estructural se parece más a la polaridad química natural del PS MenB. En particular, los fragmentos de oligosacáridos 12 se muestran covalentemente unidos por sus extremos reductores 15 a una proteína vehículo 16 adecuada para proporcionar el glicoconjugado CONJ-2 18.

Con el fin de proporcionar glicoconjugados CONJ-2 en los que los fragmentos oligosacárido estén proyectados hacia fuera de la proteína vehículo, el procedimiento anterior se puede alterar usando un espaciador hidrocarbonado que lleva un éster de ácido adípico activo con N-OH de succinimida para modificar el grupo amino libre en las moléculas aminadas. El brazo espaciador puede incluir una molécula C_{3}-C_{8} que extiende los fragmentos de oligosacáridos hacia fuera de la proteína vehículo en el glicoconjugado.

Todavía se pueden formar otros glicoconjugados a partir de los fragmentos de derivados de OS MenB calibrados descritos antes. En particular, se ha demostrado la presencia de un resto lipídico en los extremos reductores del PS MenB bacteriano. Mandrell y col. (1982) J. Immunol. 129: 2172. Sin ligarse a ninguna teoría en particular, este resto lipídico puede actuar como un mecanismo de anclaje que une el polisacárido a la superficie bacteriana por interacciones hidrófobas. Por lo tanto, la zona de unión sacárido-lípido del PS MenB natural proporciona epítopos únicos (neo-determinantes) que no se presentan en preparaciones de PS MenB purificado, como resultado del efecto de enmascaramiento y/o apantallamiento de la arquitectura de la larga cadena de poli(ácido siálico), o debido a la pérdida del resto lipídico durante la purificación.

De acuerdo con esto, en otras realizaciones relacionadas de la invención, se proporcionan glicoconjugados de OS MenB, ejemplos de los cuales se denominan aquí "CONJ-3" y "CONJ-4", en los que los glicoconjugados se construyen para que tengan propiedades fisicoquímicas e inmunológicas potenciadas debido a la adición de restos lipídicos que proporcionan un mimético de la zona de unión sacárido-lípido de MenB natural. En una realización particular, una fracción sustancialmente homogénea de oligosacáridos de tamaño intermedio que tienen un Dp de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 se pueden obtener como se ha descrito antes. Estos fragmentos de oligosacáridos deben tener suficiente longitud para plegarse en epítopos conformacionales importantes (por ejemplo, hélices extendidas), aunque no deben ser demasiado largas para ejercer enmascaramiento o apantallamiento estérico sustancial de la potencial unión sacárido-lípido de neo-epítopos. Se pueden unir covalentemente cadenas hidrocarbonadas de longitudes variables, por ejemplo lípidos alifáticos de cadena larga C_{3}-C_{16}, tales como fosfatidiletanolamina u otras moléculas de lípidos que contienen grupos propionilo, hexanoilo y decanoilo, en el extremo reductor de los fragmentos de OS MenB usando el procedimiento de acoplamiento de éster activo con N-OH antes descrito. Después, los sialo-oligómeros alquilados resultantes se pueden someter a oxidación de peryodato controlada para introducir grupos aldehído libre terminales en los extremos no reductores de los restos oligosacárido. Después, estos sialo-oligómeros alquilados monovalentes se pueden acoplar a una proteína vehículo adecuada por aminación reductora para proporcionar glicoconjugados CONJ-3. Con referencia a la Figura 3, un glicoconjugado CONJ-3 se indica de forma general en 28. El glicoconjugado comprende restos lipídicos 32 unidos covalentemente a los extremos reductores 25 de los fragmentos de derivado de OS MenB de tamaño intermedio 22 para proporcionar sialo-oligómeros alquilados monovalentes, indicados de forma general en 34. Los sialo-oligómeros alquilados 34 se acoplan a una proteína vehículo 26 por el extremo no reductor 24 de los fragmentos de OS MenB 22.

En una realización relacionada, una fracción sustancialmente homogénea de oligosacáridos de tamaño intermedio con un Dp medio de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 se pueden acoplar covalentemente a lípidos alifáticos C_{3}-C_{16} por el extremo no reductor de fragmentos de derivados de OS MenB usando técnicas de oxidación con peryodato y reducción selectiva. Después los sialo-oligómeros alquilados resultantes se pueden acoplar a una proteína vehículo adecuada convirtiendo primero los extremos reductores de los restos de derivado de oligosacárido de MenB en grupos amino libres por aminación reductora. Después, los grupos amino libres se pueden modificar uniendo covalentemente una molécula de anclaje que lleva un éster de ácido adípico activo con N-OH de succinimida. Opcionalmente, se puede añadir un brazo espaciador C_{3}-C_{8} que lleve el grupo éster activo para proyectar los sialo-oligómeros alquilados hacia fuera de la proteína vehículo. La conjugación a una proteína vehículo se produce por desplazamiento nucleófilo del grupo éster activo por el grupo \varepsilon-amino de la lisina para proporcionar un enlace amida estable para proporcionar glicoconjugados CONJ-4. Con referencia a la Figura 4, se da un glicoconjugado CONJ-4 de forma general en 58. El glicoconjugado incluye restos lipídicos 62 covalentemente unidos a los extremos no reductores 54 de fragmentos de derivados de OS MenB de tamaño intermedio 52 para proporcionar sialo-oligómeros alquilados monovalentes, indicados de forma general en 64. Los sialo-oligómeros alquilados 64 se acoplan a una proteína vehículo 56 por el extremo reductor 55 de los fragmentos de OS MenB 52.

Tanto en los glicoconjugados CONJ-3 como CONJ-4, la región de unión lípido-sacárido está expuesta al disponerse de forma alejada a la proteína vehículo. Esta configuración hace que la región de unión lípido-sacárido (neo-epítopos) sea inmunológicamente accesible y reconocible para inducir la formación de anticuerpos de las regiones de neo-epítopos. Los glicoconjugados CONJ-4 tienen una estructura similar a las de los glicoconjugados CONJ-3, sin embargo, los fragmentos de sacáridos están orientados en dirección opuesta en relación con la proteína
vehículo.

Además de proporcionar glicoconjugados tales como CONJ-3 y CONJ-4 que tienen derivados de OS MenB generados artificialmente con extremos lipídicos, se aíslan y purifican oligómeros de MenB natural que contienen lípidos naturales para usar para preparar preparaciones de glicoconjugados. Por lo tanto, en otra realización de la invención, se pueden digerir PS MenB usando neuraminidasa (más que la hidrólisis ácida antes descrita) que conservan la integridad estructural y química de la parte de sacárido-lípido de la cadena de PS MenB natural. De esta forma, los restos ácido siálico se separan secuencialmente de los extremos no reductores por acción de la enzima neuraminidasa. Usando digestión controlada en el tiempo, se pueden generar fracciones sustancialmente homogéneas de oligómeros sialil-lípido que tienen longitudes de cadena variables. Los restos ácido siálico libres resultantes se pueden separar de la preparación por diálisis, y el retenido, que contiene oligómeros de MenB-lípido, se puede purificar por técnicas de cromatografía de intercambio iónico o interacción hidrófoba. Después los oligómeros de MenB-lípido están disponibles para conjugación a proteínas vehículo adecuadas usando las técnicas antes descritas. En particular, generalmente la conjugación implicará activación selectiva del grupo terminal en el extremo no reductor de los oligómeros de MenB-lípido para permitir la unión covalente en un solo sitio a las moléculas vehículo.

Cada uno de los glicoconjugados antes descritos se preparan usando moléculas vehículo que por si mismas no inducirán la producción de anticuerpos dañinos. Los vehículos adecuados típicamente son macromoléculas metabolizadas lentamente y grandes tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos láctico), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivas. Preferiblemente, los fragmentos de derivados de OS MenB cribados de la presente invención se conjugan a un toxoide bacteriano, tal como, pero sin limitarse, a un toxoide de difteria, tétano, cólera, etc. En realizaciones particulares, los fragmentos de oligosacárido están acoplados a la proteína vehículo CRM_{197}. El vehículo CRM_{197} es una toxina mutante de difteria no tóxica y bien caracterizada que es útil en preparaciones de vacunas de glicoconjugados que se pretende para uso en seres humanos. Bixler y col. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:175, Constantino y col. (1992) Vaccine. En otras realizaciones, los fragmentos de derivado de OS MenB se acoplan a proteínas vehículo que se sabe que tienen potentes epítopos de células T. Entre los vehículos ejemplo se incluyen, pero sin limitar, Fragmento C de la toxina del tétano (TT), y los OMP de clase 1 o clase 2/3 de meningitidis. Dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los glicoconjugados se seleccionan por su capacidad para expresar epítopos asociados a sacáridos que mimetizan los encontrados en la superficie de las células bacterianas de MenB. Los glicoconjugados adecuados para usar con la presente invención estimulan la formación de anticuerpos específicos de bacteria y funcionales en huéspedes inmunizados, y no reaccionan cruzadamente con tejidos del huésped, como se determina usando ensayos de unión aquí descritos.

Varios factores tendrán un impacto en las propiedades físicas e inmunológicas de los glicoconjugados antes descritos. Específicamente, el tamaño de fragmento de oligómero de MenB, la proporción de sacárido a proteína (densidad de carga de hapteno), la química de la unión, y la elección de la proteína vehículo, son todos factores que se deben considerar y optimizar en la preparación de los glicoconjugados presentes. Por ejemplo, una baja densidad de carga de sacárido puede dar como resultado una pobre respuesta del anticuerpo anti-sacárido. Por otra parte, una carga muy pesada de sacáridos podría potencialmente enmascarar importantes epítopos de células T de la molécula de proteína, anulando así el efecto del vehículo y atenuando la respuesta inmunológica total anti-sacárido.

De acuerdo con esto, durante el curso de diferentes reacciones de conjugación, se pueden extraer partes alícuotas y analizarlas por SEC-HPLC con el fin de controlar la extensión del procedimiento de conjugación. Se puede usar un tampón de desagregación, por ejemplo EDTA, SDS, desoxicolato, o similares, para separar componentes que posiblemente se adhieren a las preparaciones por interacciones no covalentes. Para asegurar la glicosilación del vehículo, se puede controlar el desplazamiento del tiempo de retención de la proteína vehículo particular hacia el volumen de exclusión (V_{0}) de la columna. Además, la reducción gradual del área del pico de sacárido en un cromatograma de HPLC se puede usar para indicar la incorporación del sacárido al vehículo.

La caracterización de los glicoconjugados puede incluir la determinación del peso molecular, usando, por ejemplo, columnas de filtración en gel. Otra caracterización también puede incluir la movilidad por electroforesis en equipo de separación SDS-PAGE y análisis de la composición química de los glicoconjugados con respecto a los componentes carbohidratos y aminoácidos. La identificación de la pureza del producto, y la ausencia de los contaminantes residuales (tales como ácidos nucleicos, LPS, y sacáridos libres y/o vehículo) también se puede verificar usando técnicas conocidas. La confirmación de la unión covalente estable se puede llevar a cabo usando una combinación de técnicas analíticas, incluyendo filtración en gel en tampón que contiene detergente, SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western y análisis de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Vella y col. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, (Ellis, R.W. ed), Butterworth-Heinemann, Boston, página 1-22, Seid y col., (1989) Glycoconjugate J., 6:489.

Los glicoconjugados de la presente invención se usan para estimular la formación de respuesta inmunitaria anti-MenB en un huésped inmunizado. Los anticuerpos anti-MenB producidos por el huésped inmunizado deben unirse a la bacteria de MenB y no deben reaccionar de forma cruzada o reaccionar mínimamente de forma cruzada, con los restos ácido siálico del tejido del huésped como se determina usando las técnicas de ensayo de unión aquí descritas. Los anticuerpos anti-MenB se pueden caracterizar completamente con respecto al isotipo, especificidad antígena fina, actividad funcional y reactividad cruzada con restos de poli(ácido siálico) en el tejido del huésped. Se seleccionan glicoconjugados capaces de estimular anticuerpos IgG, no autorreactivos, que tienen actividad bactericida, para usar para preparar formulaciones de vacunas para usar en inmunización anti-MenB.

Por ejemplo, se puede determinar la inmunogenicidad de glicoconjugados de derivados de OS MenB eligiendo sujetos mamíferos, convenientes, animales de laboratorio estándar, tales como roedores y conejos, con composiciones que contienen los glicoconjugados junto con un adyuvante adecuado, descrito a continuación. Generalmente grupos de sujetos se inmunizan y refuerzan varias veces con la composiciones, o con los materiales de control(por ejemplo, sólo adyuvante, PS MenB natural, fragmentos derivados de OS MenB, o complejos derivado de OS MenB/vehículo no covalentes). Se puede obtener antisuero de sujetos inmunizados, y evaluar sueros agrupados de diluciones seriadas, por ejemplo, por ELISA usando técnicas estándar. El suero anti-IgG marcado se puede usar para medir la respuesta de anticuerpos anti-derivados de OS MenB IgG. Con el fin de determinar los isotipos de los anticuerpos estimulados por los conjugados, también se pueden llevar a cabo procedimientos estándar, tales como ELISA, usando moléculas marcadas específicas para IgG subclases IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Una respuesta isotípica que es predominantemente IgG1 junto con IgG2b y, en menor extensión, IgG2a e IgG3 es característica de un antígeno dependiente de células T. Se seleccionan para posterior evaluación, conjugados que se encuentra que son altamente inmunogénicos y producen predominantemente anticuerpos IgG.

En particular, la especificidad de los anticuerpos estimulada por glicoconjugados de derivados de OS MenB seleccionados se puede evaluar más usando ensayos de unión específica competitiva, tales como ELISA de inhibición, o similares. Por ejemplo, el antisuero obtenido de sujetos inmunizados, junto con derivados de OS MenB solubles (o glicoconjugados) o PS MenB natural, se puede hacer reaccionar con derivados de OS MenB unidos (o sus glicoconjugados) en un recipiente de reacción para ELISA adecuado usando anti-Ig marcada (anti-IgM, IgG e IgA) como anticuerpo secundario. Los glicoconjugados de OS MenB que estimulan la formación de los anticuerpos que soninhibidos con mayor extensión por los derivados de OS MenB solubles y glicoconjugados que por losPS MenB naturales solubles (por ejemplo, que estimulan anticuerpos que presentan una mayor afinidad por la molécula de polisacárido modificada) se seleccionan como candidatos para usar en posteriores estudios de inmunización.

La actividad funcional se puede determinar evaluando la actividad bactericida mediada por complemento y/o actividad opsónica. En particular, la actividad bactericida mediada por complemento de los anticuerpos se puede evaluar usando ensayos estándar tales como los descritos por Gold y col. (1970) Infect. Immun. 1:479, Westernik y col. (1988) Infect. Immun. 56:1120, Mandrell y col. (1995) J. Infect. Dis. 172:1279, y Granoff y col. (1995) Clin. Diagn. Laboratory Immunol. 2:574. En estos ensayos, N. meningitidis se hace reaccionar con una fuente de complemento así como con el anticuerpo que se va a ensayar. Los recuentos de bacterias se llevan a cabo a diferentes tiempos de toma de muestra. Los anticuerpos que demuestran actividad bactericida mediada por complemento, demostrado por una reducción mínima de 50% en el recuento de células bacterianas viables determinado después de sesenta minutos de incubación con anticuerpo y complemento, comparado con los recuentos de colonia en el tiempo cero, se considera que presentan actividad bactericida para los propósitos de la presente invención, y son adecuados para el posterior
uso.

La bacteriolisis mediada por complemento se muestra que es el mecanismo principal responsable de la protección del huésped frente a la enfermedad meningocócica invasiva. Sin embargo, una evidencia considerable también soporta un importante papel protector para la opsonización (véase, por ejemplo, Bjerknes y col. (1995) Infect. Immun. 63:160). De acuerdo con esto, la actividad de opsonización de los anticuerpos producidos aquí se puede evaluar como una segunda medición, o como una medición alternativa, para evaluar la actividad funcional. Los resultados de los ensayos de opsonización se pueden usar para complementar los datos bacterianos, y ayudar en la selección de glicoconjugados adecuados capaces de conferir protección.

Se conocen una variedad de procedimientos de ensayo de opsonización en la técnica, y se pueden usar para evaluar la actividad funcional de los anticuerpos inducida por los glicoconjugados de la presente invención. Dichos ensayos estándar incluyen los descritos por Sjursen y col. (1987) Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand., Sec. C 95:283, Halstensen y col. (1989) Scand. J. Infect. Dis. 21: 267, Lehmann y col. (1991) APMIS 99:769, Halstensen y col (1991), NIPH Annals 14:157, Fredlund y col. (1992) APMIS 100:449, Guttormsen y col (1992) Infect. Immun. 60: 2777, Guttormsen y col (1993) J. Infect. Dis 167: 1314, Bjerknes y col (1995) Infect. Immun. 63:160, Hayrinen y col. (1995) J. Infect. Dis. 171:1481, de Velasco y col (1995) J. Infect. Dis. 172:262, y Verheul, A.F.M. (1991) "Vacunas de conjugado de proteína-oligosacárido derivado de LPS meningocócico, Aspectos inmunoquímicos e inmunológicos" ("Menengococcal LPS Derived Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccines, Immunochemical and Immunological Aspects" Tesis, Universidad de Utrech, Holanda, páginas 112-135.

Se pueden usar varios ensayos de unión para evaluar la posible autorreactividad de los anticuerpos inducida por los glicoconjugados de la presente invención. En particular, se puede evaluar en los anticuerpos inducidos la capacidad de unión a células huésped que expresan restos poli(ácido siálico) en sus superficies celulares. Dichas células representan dianas sustitutas para la detección de anticuerpos que presentan actividad autoinmune. Una diana comprende la línea celular de neuroblastoma humano, CHP-134, que expresa la cadena larga de poli(ácido siálico) \alpha2-8 (NCAM) en su superficie celular, como describió Livingston y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:9443. Otras dianas adecuadas incluyen, pero no se limita, células cerebrales de recién nacidos, tejidos derivados, por ejemplo, de riñón, corazón y nervio olfativo, células endoteliales de la vena safena, linfocitos T citotóxicos y células NK naturales. Véase, por ejemplo, Brandon y col. (1993) Intl. J. Immunopathology and Pharmacology 6:77. Las moléculas de anticuerpo obtenidas de sujetos inmunizados se pueden añadir a poblaciones celulares de ensayo adecuadas en cultivo, y se puede detectar y cuantificar directamente la unión potencial de los anticuerpos a las dianas celulares, usando monoclonales marcados, o indirectamente usando un reactivo secundario marcado de forma adecuada que reacciona específicamente con el anticuerpo (por ejemplo, moléculas de anticuerpo anti-murino y proteína A y G de estafilococo). Los anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con el PSA del tejido del huésped de ensayo o que presentan una reactividad mínima no se consideran autorreactivos para los propósitos de la presente invención. Por lo tanto, los glicoconjugados usados para estimular la formación de dichos anticuerpos son adecuados para el posterior uso. Además, algunos anticuerpos que muestran unión con el tejido de ensayo, cuya unión no se afecta por el tratamiento previo de la células de ensayo con neuraminidasa, también pueden ser indicadoras de glicoconjugados que son adecuados para posterior uso. La autorreactividad de dichos anticuerpos se denomina aquí "indeterminada".

Los procedimientos usados para proporcionar los diferentes conjugados de derivado de OS MenB se diseñan para producir inmunogenes superiores que presentan epítopos asociados a sacáridos únicos que mimetizan los encontrados en la superficie del organismo de MenB y son expresados mínimamente en el huésped. Por lo tanto, los derivados de sacáridos descritos aquí son capaces de estimular la producción de anticuerpos específicos de MenB, y se usan directamente en formulaciones de vacunas anti-MenB que se pueden usar en composiciones farmacéuticas para prevenir y/o tratar la enfermedad de MenB y E. coli K1 en seres humanos. Dicha enfermedad incluye meningitis bacteriana y sepsis en bebés, niños y adultos.

Las vacunas pueden comprender uno o más inmunogenes de derivado de OS MenB. Las vacunas también se pueden administrar junto con otros antígenos y agentes inmunorreguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas, citocinas, linfocinas, y quimiocinas, incluyendo pero sin limitar, IL-2, IL-2 modificada (cys125\rightarrowser125), GM-CSF, IL-12, \gamma-interferón, IP-10, MIP1\beta y RANTES.

Las vacunas generalmente incluirán uno o más "vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables" tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampón de pH, y similares.

También se pueden usar adyuvantes para potenciar la eficacia de las vacunas. Los adyuvantes se pueden añadir directamente a las composiciones de vacunas o se pueden administrar por separado, simultáneamente o un poco después, de la administración de la vacuna. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos muramilos (véase después) o componentes de pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación internacional nº WO 90/14837), que contiene Squalene 5%, Tween®80 0,5%, y Span 85 0,5% (que opcionalmente contiene diferentes cantidades de MTP-PE (véase después), aunque no es necesario), formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como un microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene Squalane 10%, Tween®80 0,4%, polímero de bloques plurónico L121 5% y thr-MDP (véase después) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o tratado en un generador de torbellinos para generar una emulsión de tamaño de partículas mayores, y (c) sistema de adyuvante Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Squalene 2%, Tween®80 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consta de monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox®); (3) se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de éste tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante Freunds completo (CFA) y adyuvante Freunds incompleto (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc), factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición.

Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Típicamente, las composiciones de vacunas se preparan como formas inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas para potenciar el efecto del adyuvante, como se ha discutido antes.

Las vacunas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de inmunogen de glicoconjugado de derivado de OS MenB, y cualquier otro de los componentes antes mencionados, que sea necesario. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad de una molécula que inducirá una respuesta inmunitaria en el individuo al cual se le administra sin estimular una respuesta autoinmune. Dicha respuesta generalmente dará como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria a la vacuna mediada por anticuerpo y/o celular y secretora. Normalmente, dicha respuesta incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases inmunológicas, tal como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y T; suministro de señales de activación, crecimiento y diferenciación a células inmunológicas; expansión de poblaciones de células T ayudadoras, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta.

Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para llevar a cabo el tratamiento, es decir, reducción o completa eliminación de síntomas, o prevención de síntomas de enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que se va a tratar; la edad y estado general del sujeto que se va a tratar; la capacidad del sistema inmunológico del sujeto para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado; la gravedad del estado que se va a tratar; la molécula particular seleccionada y su modo de administración, entre otros factores. Una cantidad eficaz adecuada puede ser determinada fácilmente por el experto en la técnica. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar por ensayos rutinarios.

Una vez formuladas, las vacunas se administran convenientemente vía parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular. Entre las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración se incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis.

III. Procedimiento experimental

A continuación se dan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con propósitos de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna forma.

Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero por supuesto puede haber algún error experimental o desviación.

Ejemplo 1 Preparación de conjugados de PS MenB control

Se desaciló PS MenB en su forma sódica purificado, usando NaOH 2 M y NaBH_{4} a aproximadamente 110ºC durante 6 horas para eliminar cuantitativamente los grupos N-acetilo. El PS MenB desacilado se N-propioniló usando anhídrido propiónico para dar PS NPr-MenB, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.727.136 de Jennings y col. La extensión de la N-propionilación se calculó que era aproximadamente 84% por espectroscopía de ^{1}H-RMN. El PS NPr-MenB se purificó por dialización frente a agua destilada, y se sometió a oxidación suave con peryodato para introducir un grupo aldehído terminal en el extremo no reductor para la posterior conjugación con un proteína vehículo, como se describe en la patente de EE.UU. 4.727.136 de Jennings y col. Durante la oxidación suave con peryodato, el PS NPr-MenB se fragmentó, dando lugar a una población heterogénea de fragmentos de oligosacárido NPr-MenB "sin calibrar", que típicamente tienen un Dp medio de más de aproximadamente 30.

La conjugación de los fragmentos de PS NPr-MenB sin calibrar a dos proteínas vehículo diferentes, TT y CRM_{197} se llevó a cabo por aminación reductora en presencia de cianoborohidruro sódico. La reacción de conjugación se llevó a cabo en aproximadamente 5 días a 40ºC. Así se obtuvieron dos conjugados de PS MenB de control, C1/TT y C1/CRM_{197}.

Ejemplo 2 Caracterización de los conjugados

Se llevó a cabo filtración en gel SDS-PAGE y Sephadex®G-100 con el fin de confirmar la formación de restos de conjugado covalentes. Con relación a la Figura 1, se representan los resultados de una típica filtración en gel Sephadex®G-100 del conjugado C1/CRM_{197}. En particular, se presenta en la parte superior de la Figura 5 (figura 5a), el cromatograma de una mezcla no covalente de fragmentos de PS NPr-MenB y de molécula vehículo CRM_{197} antes de la conjugación (por ejemplo, antes de la adición de NaCNBH_{3}). Como puede verse, los sacáridos NPr-MenB eluyeron como un pico ancho cerca del volumen del lecho, mientras que la proteína CRM_{197} eluyó ligeramente por encima del volumen del lecho. El cromatograma después de conjugación (por ejemplo, después de la adición de NaCNBH_{3} para realizar la aminación reductora) se representa en la parte inferior de la Figura 5 (figura 5b). Como se muestra allí, apareció un nuevo pico de alto peso molecular (HMW) cerca del volumen de huecos. Este pico HMW, que contiene tanto sacárido como proteína, se recogió e identificó como el conjugado C1/CRM_{197}.

La proporción final de sacárido a proteína (peso/peso) de los dos conjugados C1 se determinó por ensayos colorimétricos y se encontró que era 0,21 para el conjugado C1/CRM_{197} y 0,15 para el conjugado C1/TT.

Ejemplo 3 Inmunogenicidad de los conjugados de control

Con el fin de evaluar la capacidad de los conjugados de control C1 para estimular una respuesta de anticuerpo anti-PS NPr-MenB IgG en un sujeto inmunizado, se llevó a cabo el siguiente estudio. Se inmunizaron grupos de ratones CD1 (10 animales/grupo) tres veces por inyección intraperitoneal (ip) usando formulaciones de vacuna que contienen conjugados C1/TT o C1/CRM_{197} con adyuvante FCA o alum (contenido de 5,0 \mug de ácido siálico en la vacuna de conjugado para la primera inyección, y contenido de 2,5 \mug de ácido siálico en la segunda y tercera dosis). Los grupos de control se inmunizaron con sólo adyuvante; PS MenB natural; PS NPr-MenB; o complejos PS NPr-MenB/vehículo asociados de forma no covalente.

Se recogieron y juntaron las muestras de suero de cada grupo experimental simultáneamente con cada refuerzo de inmunización, así como 11 días después del refuerzo final. Se hicieron diluciones seriadas de los sueros agrupados y se evaluaron por ELISA usando un sistema de avidina-PS NPr-MenB biotinilado. Después de incubación durante la noche con suero, los pocillos de reacción se incubaron durante 3 horas con suero anti-murino marcado con fosfatasa alcalina específico de IgG. Después de lavado, se añadió fosfato de p-nitrofenilo a los pocillos, y se leyeron los valores de densidad óptica ("DO") a 405 nm después de 30 minutos de desarrollo de color. Los valores de DO se presentan en la Figura 2. Tanto el conjugado C1/TT como C1/CRM_{197} eran inmunogénicos cuando se administraron con FCA, e inmunogénicos en menor extensión cuando se administraron con el adyuvante alum. Los valores de DO de los sueros agrupados de animales inmunizados con las formulaciones de vacuna de conjugado/FCA se muestran en la dilución de suero 1:1600, mientras que los valores de DO de los sueros agrupados de animales inmunizados con las formulaciones de vacuna conjugado/alum se muestran en la dilución de suero 1:400. Como se puede ver con referencia a la Figura 2, no se observó diferencia significativa en la inmunogenicidad debido a la proteína vehículo particular usada (TT o CRM_{197}); sin embargo, el uso del adyuvante FCA aumentó mucho la inmunogenicidad de las composiciones de vacuna.

Ejemplo 4 Caracterización del anticuerpo Respuesta estimulada por los conjugados C1

Con el fin de evaluar la subclase de IgG de la respuesta de anticuerpos inducida por el conjugado de control C1, se llevó a cabo el siguiente estudio. Se dieron tres dosis de composiciones de vacuna que contenían conjugado C1/TT o C1/CRM197 con adyuvante FCA o alum, a grupos de ratones (10 animales por grupo). Las dosificaciones eran las mismas que las usadas en las inmunizaciones del Ejemplo 3 anterior. Se recogieron y agruparon muestras de suero de cada grupo experimental después del refuerzo de inmunización final. Se hicieron diluciones seriadas de los sueros agrupados y se evaluaron por ELISA usando un sistema de avidina-PS NPr-MenB biotinilado. Después de incubación del suero toda la noche, los pocillos de reacción se incubaron durante 3 horas con suero anti-murino marcado con fosfatasa alcalina específico de IgG subclases IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Después de lavar, se añadió fosfato de p-nitrofenilo a los pocillos, y se leyeron los valores de DO a 405 nm después de 30 minutos de desarrollo de color. Los valores de DO se representan en la Figura 3, en la que los valores representan la DO neta después de restar los valores del blanco obtenidos de los pocillos que contenían sólo el sustrato colorimétrico.

Como puede verse, la respuesta de anticuerpos predominante era IgG1; sin embargo, cuando los conjugados se administraron con adyuvante FCA, también fueron respuestas de anticuerpos IgG2b y en menor extensión, IgG2a e IgG3. Por lo tanto la respuesta de anticuerpos provocada en el ratón inmunizado por los conjugados C1 es característica de un antígeno dependiente de células T.

Con el fin de evaluar la respuesta de anticuerpos anti-PS NPr-MenB total inducida por los conjugados C1/TT y C1/CRM_{197} en ratones CD1, y para determinar la especificidad de las respuestas de anticuerpos inducidas por los conjugados, se llevó a cabo el siguiente estudio. Se inmunizaron grupos de ratones CD1 (de 8 a 10 animales por grupo) con tres dosis de formulaciones de vacuna de conjugado o materiales de control como se ha descrito en el Ejemplo 3. Se recogieron y agruparon muestras de suero de cada grupo experimental después del refuerzo de inmunización final. Con el fin de evaluar la respuesta de Ig total a los conjugados C1, se llevó a cabo ELISA en fase sólida en el que se usó PS NPr-MenB biotinilado (unido a los pocillos de reacción por avidina) como antígeno de revestimiento. El anticuerpo de marcaje era IgM anti-murino, IgG e IgA conjugados con fosfatasa alcalina. Después de lavar, se añadió fosfato de p-nitrofenilo a los pocillos, y se leyeron los valores de DO a 405 nm después de 30 minutos de desarrollo de color. Con el fin de evaluar la especificidad, se llevó a cabo ELISA de inhibición competitiva usando el mismo antígeno de revestimiento con adición de 25 \mug/ml de inhibidores de PS NPr-MenB soluble o de PS MenB natural.

Los resultados tanto de la determinación del nivel de respuesta de anticuerpos total como de especificidad de los anticuerpos de respuesta se presenta a continuación en la Tabla 1.

1

Como puede verse en la Tabla 1, los ratones CD1 que fueron inmunizados con las formulaciones de conjugado C1/adyuvante FCA dieron respuestas de anticuerpos a PS NPr-MenB significativas. Además, la respuesta de anticuerpos era específica de PS NPr-MenB como se demostró por la inhibición casi completa (por ejemplo, 97-99%) por el inhibidor de PS NPr-MenB comparado con la inhibición parcial (por ejemplo, 14-36%) observada con el inhibidor de PS MenB natural. El porcentaje de inhibición con los inhibidores solubles se expresa en la Tabla 1 como comparación con los controles tampón.

Con el fin de evaluar la actividad bactericida, se añadieron sueros agrupados obtenidos de los sujetos antes inmunizados a cultivos de N. meningitidis (cultivos de bacterias de MenB) junto con una fuente de complemento. En este ensayo particular se usó una fuente de complemento heteróloga (por ejemplo, suero de conejo joven). También se ensayaron cultivos de control (sueros) negativo y control de complemento, y todos los sueros se inactivaron con calor antes del ensayo. Los resultados de los ensayos bactericidas se describen a continuación en la Tabla 2.

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{142mm} BC _{50}  es el recíproco de
la dilución del  3 ^{er}  suero agrupado posterior al cual el 50% de
las bacterias murieron en relación con los controles de sueros
negativos y controles de complemento.\end{minipage} \cr   ^{2} 
 Grupos de control negativos \cr   \hskip0.5cm  Grupo
3: FCA\cr   \hskip0.5cm Grupo 4: Alum\cr 
 \hskip0.5cm Grupo 5: PS NPr  -  MenB + TT (no
covalente)\cr   \hskip0.5cm Grupo 6: PS
NPr  -  MenB + FCA\cr   ^{3}   Controles de
complemento :\cr   \hskip0.5cm Anti  -  Men
Y MAb + C' = negativo\cr 
 \hskip0.5cm Anti  -  MenB porina MAb + C' =
positivo\cr   \hskip0.5cm Anti  -  MenB porina
MAb - C' = negativo\cr   \hskip0.5cm Suero de grupo de
ratón - C' =
negativo\cr}

En la Tabla 2, se expresa la actividad bactericida como la concentración a la cual el 50% de las bacterias MenB murieron en relación con los controles de sueros negativos y controles de complemento. Como puede verse, los ratones CD1 inmunizados con conjugados C1/TT y C1/CRM_{197} administrados con FCA produjeron anticuerpos que demuestran actividad bactericida significativa.

Ejemplo 5 Preparación de glicoconjugados derivados de OS MenB CONJ-1

Se preparó una preparación de conjugados de toxoide de tétano-derivado de OS NPr-MenB, en lo sucesivo denominado CONJ-1, como sigue. Se desacetiló PS MenB en su forma sódica purificado, con NaOH 2 M a aproximadamente 110ºC durante 6 horas para eliminar cuantitativamente los grupos N-acetilo. El tratamiento alcalino se llevó a cabo en presencia de NaBH_{4}. Después del tratamiento alcalino, el PS MenB desacilado se dializó exhaustivamente en tampón de bicarbonato sódico saturado. Después, el producto dializado se trató con un exceso de anhídrido propiónico con agitación toda la noche a temperatura ambiente para dar PS NPr-MenB. El PS NPr-MenB se dializó exhaustivamente en agua y se recuperó por liofilización. La extensión de la N-propionilación medida por espectroscopía de ^{1}H-RMN se encontró que era sustancialmente 100%.

El PS NPr-MenB se despolimerizó (fragmentó) en condiciones ácidas suaves (por ejemplo, acetato 10 mM, pH 5,5 a 50ºC durante 2 horas) para dar una mezcla de oligosacáridos de NPr-MenB (OS NPr-MenB) de diferentes tamaños. La cinética de la hidrólisis de PS NPr-MenB, y el perfil del oligosacárido fragmentado resultante se puede controlar por cromatografía de FPLC monoQ analítica.

La mezcla de OS NPr-MenB fragmentada se fraccionó por tamaños en Q-Sepharose® con un gradiente salino progresivo bajo (NaCl 100 mM) y alto (NaCl 500 mM). Por análisis analíticos, por ejemplo, el ensayo de resorcinol de Svennerholm para ácido siálico (Svennerholm, L. (1957) Biochem. Biophys. Acta 24:604) y el ensayo colorimétrico de Hantzsch del formaldehído liberado del extremo no reductor de los oligómeros de PS NPr-MenB (Nash, T. (1953) Biochem. J. 55:416), la fracción de NaCl 100 mM debe contener moléculas de OS NPr-MenB de tamaño pequeño con un Dp medio de 3-6 y la fracción de NaCl 500 mM debe contener moléculas de OS NPr MenB de tamaño intermedio con un Dp medio de 13-20. Como se muestra por análisis monoQ analítico sobre columna de Q-Sepharose®, se confirmó el modelo de distribución de oligosacáridos esperado, en el que la fracción de NaCl 100 mM contenía oligómeros pequeños (es decir, Dp medio de 2,85) y la fracción de NaCl 500 mM contenía oligómeros de tamaño intermedio con un Dp medio de 13.

Un grupo de derivados OS NPr-MenB de tamaño intermedio (Dp 13) recuperado de la fracción de NaCl 500 mM de Q-Sepharose® se activó químicamente en el extremo, en su extremo no reductor y se conjugó a toxoide de tétano (TT) por un procedimiento de aminación reductora para proporcionar glicoconjugados CONJ-1. Más particularmente, los oligosacáridos de Dp 13 se sometieron a oxidación suave con peryodato (por ejemplo, perborato sódico 100 mM durante 15-30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente) para introducir un grupo aldehído terminal en los extremos no reductores de los oligosacáridos. Después de la oxidación con peryodato, se usó exceso de etilenglicol para parar la reacción de oxidación. Los derivados de oligosacáridos NPr-MenB de tamaño intermedio y oxidados, se purificaron por desalación en una columna Sephadex®G-25 y después se liofilizaron.

La reacción de conjugación de aminación reductora se llevó a cabo en presencia de cianoborohidruro sódico durante 3 a 5 días. Para la reacción de conjugación, la proporción de sacárido a proteína puede estar en el intervalo de 50 a 250 moles/mol. Para preparar conjugados de OS NPr-MenB/TT, el grupo de oligómeros NPr-MenB con un Dp medio de 13 se combinó con TT preparado de forma adecuada con una proporciona molar inicial alta (200:1) de oligómero a proteína. La reacción se dejó proceder durante 3 días (por ejemplo, 1 día a 40ºC, seguido de 2 días a temperatura ambiente).

El aislamiento y purificación de los glicoconjugados CONJ-1 se puede llevar a cabo por cromatografía de gel permeable con una columna de tamaño apropiado o por cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, usando Phenyl Sepharose®). Cualquiera de los procedimientos cromatográficos es eficaz para separar los glicoconjugados de los reactivos, subproductos y moléculas de proteína vehículo y sacárido sin reaccionar.

Ejemplo 6 Caracterización de glicoconjugado CONJ-1 derivado de OS NPr-MenB

El glicoconjugado CONJ-1 se caracterizó como sigue. Con el fin de demostrar la covalencia (por ejemplo, estableciendo una unión covalente entre OS NPr-MenB y la proteína vehículo), se pueden usar una serie de técnicas fisicoquímicas, incluyendo: SDS-PAGE; transferencia Western; filtración en gel con Sephadex®G-100; análisis de aminoácidos; o similares. Para los propósitos del presente estudio, se usó SDS-PAGE para establecer la unión covalente de los glicoconjugados CONJ-1 de OS NPr-MenB/TT revelando un desplazamiento a pesos moleculares mayores para la banda de conjugado comparado con la banda de proteína vehículo. El análisis de transferencia Western de los glicoconjugados CONJ-1 demostró covalencia por coincidencia de señales positivas para TT y OS-NPr-MenB con antisuero anti-TT y anti-NPr-OS MenB específico.

Basado en factores estéricos, el uso de oligosacáridos en lugar de polisacáridos de gran peso molecular para preparar glicoconjugados CONJ-1 permite una eficacia de acoplamiento mayor de los antígenos de sacárido en la molécula proteína vehículo. La proporción final de sacárido a proteína de estos conjugados basados en oligosacáridos NPr-MenB está en el intervalo de 0,10 a 0,25, que corresponde a aproximadamente de 3 a 5 cadenas de oligosacárido NPr-MenB unido covalentemente por proteína vehículo. En una base en peso, los glicoconjugados CONJ-1 parece que tienen mayor carga de sacárido que el conjugado basado en PS NPr-MenB previamente descrito (Patente de EE.UU. nº 4.727.136) que contiene, como media, aproximadamente de 7,5 a 18,8 veces más sacárido (usando 10.000 Daltons como peso molecular del PS NPr-MenB).

Además, suponiendo que los glicoconjugados CONJ-1 tienen restos sacárido de tamaño sustancialmente homogéneo de una longitud de cadena intermedia (por ejemplo Dp medio de 10-20) se espera que den como resultado glicoconjugados que presenten comportamiento inmunológico más consistente. Además, la activación terminal selectiva (por ejemplo, introducción selectiva del grupo aldehído en el extremo no reductor) de los oligosacáridos NPr-MenB purificados por cromatografía en Q-Sepharose® evita la posibilidad de estructuras heterogéneas de unión cruzada, que pueden darse por el uso de moléculas de PS NPr-MenB con grupos aldehído "activos" introducidos en ambos extremos. En relación con esto, es probable que las moléculas de polisacárido activadas en los dos extremos (que tienen grupos aldehído en ambos extremos) puedan derivar de una oxidación con peryodato de PS MenB N-acilado previamente expuesto a NaBH_{4} durante el procedimiento de N-desacetilación.

Ejemplo 7 Evaluación de la inmunogenicidad de los glicoconjugados de derivados de OS NPr-MenB

Grupos de ratones CD1 y BALB/c de 4 a 6 semanas de edad, de 5 a 6 animales por grupo, fueron vacunados con 3 dosis de una composición de vacuna formada a partir de glicoconjugado de OS NPr-MenB/TT (CONJ-1) y adyuvante FCA. Se vacunó un grupo de control negativo con sólo adyuvante FCA. Las vacunaciones y los refuerzos se administraron con una separación de 3,5 a 4 semanas. Se analizaron los sueros agrupados, recogidos después del segundo refuerzo, por valoraciones ELISA de OS NPr-MenB. Como control positivo se usaron sueros agrupados de una segunda inmunización posterior de ratones CD1 vacunados con un segundo conjugado, OS NPr-MenB-CRM_{197} (denominado CONJ-1/CRM_{197}). También se determinó la especificidad de anticuerpos usando inhibidor de OS NPr-MenB (25 \mug/ml) en un ELISA de inhibición competitiva. También se midió la inhibición por PS MenB natural soluble (PS NAc-MenB) (25 \mug/ml). Para ELISA se usó PS NPr-MenB biotinilado (unido a placas recubiertas de avidina), como el antígeno de recubrimiento. El anticuerpo de marcaje era Ig anti-murino (Anti-IgM, IgG e IgA) conjugado con fosfatasa alcalina. Los resultados de ELISA se presentan a continuación en la Tabla 3.

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{142mm} Porcentaje de inhibición
mostrado con los inhibidores solubles (con 25  \mu g/ml) comparado
con los controles tampón.\end{minipage} \cr  * Véase el
texto.\cr}

Los datos presentados en la Tabla 3 representan valoraciones obtenidas usando la DO neta después de restar los valores de DO en los pocillos que contenían suero diluido con PS NPr-MenB soluble para dar así solamente la unión que no se puede inhibir. Este procedimiento evita describir la unión no específica en el ensayo (véase, por ejemplo, Granoff y col. (1995) Clinic. Diag. Lab. Immunol. 2:574). Se da el porcentaje de inhibición con las moléculas solubles comparado con controles tampón. La respuesta de anticuerpos estimulada por los glicoconjugados CONJ-1 era específica para los derivados de sacáridos NPr-MenB como se pone en evidencia por el 80-90% de inhibición competitiva por el PS NPr-MenB soluble. En contraste, se observó sólo una inhibición de 4-12% cuando se usó PS NAc-MenB soluble. Como puede verse, tanto los ratones CD1 como BALB/c dieron respuestas de anticuerpos significativas a PS NPr-MenB cuando se inmunizaron con los glicoconjugados CONJ-1 comparado con los controles negativos (inmunizaciones sólo con FCA). Las valoraciones ELISA en los ratones CD1 fueron mayores que las obtenidas con ratones BALB/c.

Por lo tanto, se han descrito inmunogenes de derivado de OS MenB y procedimientos para obtenerlos y usarlos.

Claims (36)

1. Un glicoconjugado que comprende un derivado de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-acilo C_{3}-C_{8}, en el que dicho derivado de OS MenB está unido covalentemente a una molécula vehículo y tiene un grado medio de polimerización (Dp) de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.

2. El glicoconjugado de la reivindicación 1, en el que los grupos N-acetilo se sustituyen por grupos N-propionilo.

3. El glicoconjugado de la reivindicación 1, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano.

4. El glicoconjugado de la reivindicación 3, en el que el toxoide bacteriano es toxoide de tétano.

5. El glicoconjugado de la reivindicación 1, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano mutante no tóxico.

6. El glicoconjugado de la reivindicación 5, en el que el toxoide bacteriano mutante es CRM_{197}.

7. El glicoconjugado de la reivindicación 1, en el que el derivado de OS MenB tienen un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

8. Un glicoconjugado que comprende un derivado de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-propionilo, en el que dicho derivado de OS MenB está unido covalentemente a una proteína vehículo de toxoide CRM_{197} y tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

9. El glicoconjugado de la reivindicación 1, en el que el derivado de OS MenB comprende además un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido a él covalentemente.

10. El glicoconjugado de la reivindicación 8, en el que el derivado de OS MenB comprende además un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido a él covalentemente.

11. Un procedimiento para preparar un glicoconjugado que comprende:

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-acilo C_{3}-C_{8};

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de Os MenB de la población de (a) en el que dicho grupo de derivados de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 10 a 20;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de OS MenB activados en un solo extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de OS MenB activados en el extremo a una molécula vehículo para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB que comprende restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el grupo reactivo introducido en la etapa (c) comprende un grupo aldehído reactivo.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico de los derivados de OS MenB se sustituyen por grupos N-propionilo.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano mutante no tóxico.

16. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el derivado de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

17. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el derivado de OS MenB además comprende un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido a él covalentemente.

18. Un procedimiento para producir un glicoconjugado que comprende:

\newpage

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-propionilo;

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de Os MenB de la población de (a), en el que dicho grupo de derivados de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a 18;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de OS MenB activados en un extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de OS MenB activados en el extremo a una molécula vehículo de toxoide bacteriano CRM_{197} para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB/toxoide CRM_{197} que comprende restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el derivado de OS MenB además comprende un lípido de cadena larga C_{3}-C_{16} covalentemente unido a él.

20. Un procedimiento para producir un glicoconjugado que comprende:

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-acilo C_{3}-C_{8};

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de Os MenB de la población de (a), en el que dicho grupo de derivados de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 10 a 20;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de OS MenB activados en un solo extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de OS MenB activados en el extremo a una molécula vehículo para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB que comprende restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el grupo reactivo introducido en la etapa (c) comprende un grupo éster activo.

22. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico de los derivados de OS MenB se sustituyen por grupos N-propionilo.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la molécula vehículo es un toxoide bacteriano mutante no tóxico.

25. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el derivado de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

26. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el derivado de OS MenB además comprende un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido covalentemente a él.

27. Un procedimiento para producir un glicoconjugado que comprende:

(a) proporcionar una población heterogénea de derivados de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-propionilo;

(b) obtener un grupo sustancialmente homogéneo de derivados de Os MenB de la población de (a), en el que dichos derivados de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a 18;

(c) introducir un grupo reactivo en un extremo no reductor de los derivados obtenidos en la etapa (b) para proporcionar derivados de OS MenB activados en un extremo; y

(d) unir covalentemente los derivados de OS MenB activados en el extremo a una molécula vehículo de toxoide bacteriano CRM_{197} para proporcionar un glicoconjugado de OS MenB/toxoide CRM_{197} que comprende restos de OS MenB de tamaño sustancialmente homogéneo.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que el derivado de OS MenB además comprende un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido covalentemente a él.

29. Una composición de vacuna que comprende la combinación de:

un glicoconjugado formado a partir de un derivado de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis de serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-acilo C_{3}-C_{8}, en el que dicho derivado de OS MenB está unido covalentemente a una molécula vehículo y tiene un grado medio de polimerización (Dp) de aproximadamente 10 a aproximadamente 20; y

un excipiente farmacéuticamente aceptable.

30. La composición de vacuna de la reivindicación 29, en la que los grupos N-acetilo del derivado de OS MenB se sustituyen por grupos N-propionilo.

31. La composición de vacuna de la reivindicación 29, en la que el derivado de OS MenB tiene un Dp medio de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.

32. La composición de vacuna de la reivindicación 29, en la que el derivado de Os MenB además comprende un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido covalentemente a él.

33. Una composición de vacuna que comprende la combinación de:

un glicoconjugado formado a partir de un derivado de oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis de serogrupo B (OS MenB), en el que los grupos N-acetilo de los restos ácido siálico se sustituyen por grupos N-propionilo, en el que dicho derivado de OS MenB está unido covalentemente a una proteína vehículo de toxoide CRM_{197} y tiene un grado medio de polimerización (Dp) de aproximadamente 12 a aproximadamente 18; y

un excipiente farmacéuticamente aceptable.

34. La composición de vacuna de la reivindicación 33, en la que el derivado de OS MenB además comprende un lípido alifático de cadena larga C_{3}-C_{16} unido covalentemente a él.

35. La composición de vacuna de la reivindicación 29, que además comprende un adyuvante.

36. La composición de vacuna de la reivindicación 33, que además comprende un adyuvante.