ES2230679T3 - Procedimiento de preparacion de conjugados de vacunas que utilizan una sal de uronio. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento para producir un conjugado para una vacuna que incluye mezclar un reactivo a base de sales de uronio con un primer resto (por ejemplo un polisacárido). Según la invención, el reactivo a base de sales de uronio tiene una estructura química que se corresponde con la fórmula (I), en la que R{sup,1} se define como (a), en la que R{sup,6} representa carbono, hidrógeno y opcionalmente uno o más heteroátomos que, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros, que puede estas sustituido o insustituido. R{sup,2}, R{sup,3}, R{sup,4} y R{sup,5}, cada uno independientemente, representan un átomo de hidrógeno, un alquilo sustituido o insustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un alquenilo sustituido o insustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Alternativamente, R{sup,2} y R{sup,3}, cuando se toman conjuntamente, pueden representar átomos de carbono, hidrógeno, azufre, nitrógeno u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a7 miembros con el átomo de nitrógeno al que están unidos. Del mismo modo, R{sup,4} y R{sup,5}, cuando se toman conjuntamente, pueden representar un anillo heterocíclico similar. X- representa un anión ácido (por ejemplo, Cl{sup,-}, Br{sup,-}, F{sup,- }, I{sup,-}, PF{sub,6}{sup,-} y BF{sub,4}{sup,-}). También según este procedimiento, se mezcla un segundo resto (por ejemplo, una proteína, un péptido o una lipoproteína) con el primer resto. El primer y segundo restos reaccionan y forman un conjugado.

Description

Procedimiento de preparación de conjugados de vacunas que utilizan una sal de uronio.

Las vacunas han sido muy eficaces al proteger a la gente de una amplia variedad de enfermedades, ya sean causadas por virus, bacterias u hongos. La capacidad de las vacunas para inducir una protección específica frente a semejante amplia variedad de organismos patógenos es resultado de su capacidad para estimular respuestas de anticuerpos humorales específicos, así como respuestas mediadas por células. Esta invención hace referencia a un procedimiento para preparar tales vacunas, y concretamente a un procedimiento para elaborar productos conjugados que sean utilizados en la preparación de vacunas. Adicionalmente, el procedimiento de la invención puede ser utilizado para producir inmunógenos y otros reactivos inmunológicos, terapéuticos, o de diagnóstico valiosos.

A menudo es deseable inducir respuestas inmunes frente a polisacáridos. Por ejemplo, los anticuerpos contra un polisacárido capsular bacteriano pueden proporcionar protección frente a las bacterias. Muchos polisacáridos, sin embargo, son escasamente inmunogénicos, concretamente en lactantes y niños pequeños. Además, tanto en niños como en adultos, no hay normalmente un efecto de refuerzo con inmunizaciones de polisacáridos repetidas, y la principal clase de anticuerpos en la IgM. Estos rasgos son todos característicos de los denominados antígenos "independientes de las células T" ("IT").

En muchos casos, la inmunogenicidad de los polisacáridos puede ser intensificada enlazando covalentemente proteínas o péptidos que contengan epítopos de las células T a polisacáridos. Asimismo se conocen otros ciertos componentes, tales como lípidos, ácidos grasos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas para intensificar la inmunogenicidad de los polisacáridos. Como se describe en la solicitud de patente de los "productos conjugados duales" de Mond y Lees, la conjugación de una proteína a un polisacárido puede intensificar la respuesta inmune a la proteína así como al polisacárido. Ver la patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.100. Este efecto también se describe en A-Lee, y col., "Enhanced Immunogenicity of Protein-Dextran Conjugates: I. Rapid Stimulation of Enhanced Antibody Responses to Poorly Immunogenic Molecules", Vaccine, Vol. 12, Núm. 13, (1994), págs. 1160-1166. En vista de este potencial para mejorar la respuesta inmune frente a los polisacáridos, existe la necesidad en la técnica de métodos para enlazar covalentemente proteínas u otros radicales a polisacáridos.

Idealmente, el procedimiento para enlazar covalentemente radicales a polisacáridos se debe realizar de modo que se mantenga la antigenicidad de los componentes tanto polisacáridos como proteicos y se minimice el deterioro de los epítopos necesarios de cada componente. Además, el enlace debe ser estable. Por lo tanto, existe la necesidad de medios suaves y lentos para acoplar polisacáridos, carbohidratos de elevado peso molecular, y carbohidratos de bajo peso molecular a materiales en fase sólida (v.g., partículas o superficies sólidas). Así, existe la necesidad en la técnica de medios mejorados para acoplar polisacáridos, carbohidratos de elevado peso molecular, y carbohidratos de bajo peso molecular a materiales en fase sólida.

Se utilizan dos métodos principales para acoplar moléculas entre sí. En el primer método, el medio para el acoplamiento abarca el entrecruzamiento de una proteína (o péptido u otro radical) directamente a un polisacárido (o algún otro radical). Sin embargo, a veces se necesita una molécula espaciadora entre los dos radicales acoplados, ya sea para facilitar el procedimiento químico y/o intensificar la respuesta inmune a la proteína y/o el polisacárido. En cualquier método, normalmente es necesario activar o funcionalizar el polisacárido antes de que se produzca el entrecruzamiento. Algunos métodos de activación o funcionalización de polisacáridos se describen en W.E. Dick, y col., "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens: A survey and Consideration of Design and Preparation Factors", Conjugate Vaccines (Eds. Cruse, y col.), Karger, Basel, 1989, Vol. 10, págs. 48-114. Se describen métodos de activación adicionales en R.W. Ellis, y col. (Editors), Development and Clinical Uses of Haemophilus B Conjugate Vaccines, Marcel Dekker, Nueva York (1994).

Un método preferido para activar polisacáridos se describe en las solicitudes de patente CDAP de Lees Patente de los Estados Unidos Núm. 5.651.971; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.693.326; y Patente de los Estados Unidos. El uso de CDAP también lo describen Lees, y col., en "Activation of Soluble Polysaccharides with 1-Cyano-4-Dimethylamino Pyridinium Tetrafluoroborate for Use in protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines and Immunological Reagents"; Vaccine, Vol. 14, Núm. 3 (1996), págs. 190-198.

Un método específico de preparación de productos conjugados es por medio de la condensación de aminas (o hidrazidas) y carboxilos a amidas utilizando carbodiimidas. El nucleófilo carboxilado reacciona con la carbodiimida para formar un intermedio altamente reactivo pero inestable que se puede hidrolizar o hacer reaccionar después con una amina para formar un enlace amida estable. La 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida ("EDC") es un ejemplo soluble en agua de esta clase de reactivo de carbodiimida.

Como ejemplo de esta reacción, Robbins describe la funcionalización de polisacárido de Haemophilus influenza ("PRP") con hidrazidas y la condensación de este material funcionalizado con carboxilos sobre el toxoide del tétanos. Ver C. Chu, y col., Infection and Immunity, Vol. 40, 1983, comenzando en la página 245. Adicionalmente, el acoplamiento de un polisacárido carboxilado al toxoide de la difteria mediante este procedimiento general también es descrito por Robbins. Ver S.C. Szu, y col., Journal of Experimental Medicine, Vol. 166, 1987, comenzando en la página 1510.

Sin embargo, en general, existen una miríada de problemas cuando se intenta utilizar la carbodiimida para el acoplamiento de ligandos multivalentes (v.g. proteínas y polisacáridos) que contienen tanto grupo activables como nucleófilos. La reacción es difícil de controlar, y frecuentemente conduce a homopolimerización extensiva, entrecruzamiento entre cadenas, y antigenicidad reducida. Un problema adicional es que el intermedio de carboxil-carbodiimida puede experimentar un desplazamiento del acilo de O a N, dando como resultado un producto de adición no reactivo, estable que añade nuevos epítopos a la proteína (ver, G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, California, (1996).

Otro método para formar productos conjugados es a través del uso de intermedios éster activos. Entre los reactivos que forman intermedios éster activos se incluyen norbornano, ácido p-nitrobenzoico, NHS (N-hidroxisuccinimida), y S-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida). Los ésteres de NHS (u otros reactivos apropiados) pueden reacciona con nucleófilos como aminas, hidrazidas, y tioles. Los productos de reacción de los ésteres de NHS con aminas e hidrazidas son particularmente estables, formando un enlace amida. Los intermedios de ésteres de NHS pueden ser formados en un procedimiento de una etapa utilizando carbodiimida (para activar los carboxilos) y NHS (o S-NHS). En este procedimiento, la NHS (o S-NHS), el componente que contiene carboxilo, y el componente que contiene amina se combinan, y la carbodiimida se añade a esto. Aunque la eficacia del acoplamiento a menudo es superior en esta reacción que en el caso en el que no está presente la NHS, en este procedimiento pueden producirse problemas, tales como la homopolimerización, el entrecruzamiento entre cadenas, y el sobre-entrecruzamiento. Adicionalmente, se pueden producir otras reacciones secundarias no deseables y ocasionar problemas, como se describirá con más detalle más abajo.

Alternativamente, se puede utilizar un procedimiento de activación en dos etapas. En este procedimiento, se intenta separar o destruir la carbodiimida restante antes de añadir el componente que va a ser entrecruzado. En un protocolo en el que se utiliza EDC y NHS, antes de añadir la proteína, el resto de la carbodiimida es desactivado con un tiol (v.g., mercaptoetanol). Ver Grabarek y Gergely, Analytical Biochemistry, Vol. 185 (1990), comenzando en la página 131. Mediante este método, se minimiza la cantidad de carbodiimida presente durante la adición de la proteína. La adición del tiol, sin embargo, también puede hidrolizar el intermedio éster de NHS deseado. En este procedimiento de dos etapas, sería preferible aislar el intermedio éster de NHS. Puede ser difícil, no obstante, aislar este intermedio debido a que es sólo moderadamente estable en medio acuoso.

Un problema adicional con los procedimientos de carbodiimida/NHS es la posible formación de un derivado de \beta-alanina resultante de la reacción de la carbodiimida con dos moles de NHS en una transposición de Lossen (ver Wilchek and Miron, Biochemistry, Vol. 26, comenzando en la página 2155, 1987. Este derivado puede reaccionar aminas para formar un entrecruzamiento inestable.

La carbodiimida y la NHS también han sido utilizadas para activar oligosacáridos. En tales procedimientos, los extremos reductores de los oligosacáridos son funcionalizados con grupos carboxilo y después convertidos en ésteres activos utilizando carbodiimida y NHS en disolvente orgánicos. Estos oligosacáridos funcionalizados son acoplados después a proteínas. Ver Porro, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.153.312 (6 de octubre de 1992) para el uso de este procedimiento con un oligosacárido de Neisseria meningitidis tipo C. La eficacia del acoplamiento global referida es, no obstante, baja, y se utilizan oligosacáridos de bajo peso molecular. Una razón para la baja eficacia de acoplamiento es que los oligosacáridos tienen sólo una NHS por molécula. Esta o bien se hidroliza o bien se acopla.

Se conocen una variedad de reactivos diferentes para introducir ésteres de NHS; sin embargo, la mayoría de estos requieren disolventes orgánicos secos y no son adecuados para su uso en medios acuosos. Una excepción incluye ciertas sales de uronio, tales como el reactivo tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)N,N,N',N'-tetrametiluronio (TSTU), que son algo estables en agua, aunque más en medios orgánicos/acuosos mixtos. Se ha utilizado el TSTU para formar ésteres de NHS de moléculas de bajo peso molecular en disolventes orgánicos (ver Moller y col., "Versatile Procedure of Multiple Introduction of 8-Aminomethylene Blue into Oligonucleotides", Bioconjugate Chemistry, Vol. 6 (1995), págs. 174-178; Lefevre y col., ``Texas Res-X and Rhodamine Res-X New Derivatives of Sulforhodamine 101 and Lissamine Rhodamine B with Improved Labeling and Fluorescence Properties, "Bioconjugate Chemistry, Vol. 7(1996), págs. 482-489; y Bannwarth y col.", 219, Bathophenanthroline-ruthenium (II) Complexes as Non-Radioactive Labels for Oligonucleotides which can be Measured by Time-Resolved Fluorescence Techniques, ``Helvetica Chimica Acta, Vol. 71(1988), comenzando en la pág. 2085. Adicionalmente, se han utilizado el TSTU y otras sales de uronio para formar ésteres de NHS de moléculas de bajo peso molecular en medios orgánicos/acuosos mixtos (ver Knorr y col., "New Coupling Reagents in Peptide Chemistry", Tetrahedron Letters, Vol. 30, Núm. 15(1989), págs. 1927-1930; y Bannwarth y Knorr, "Formation of Carboxamides with N,N,N',N'-Tetramethyl(Succinimido)Uronium Tetrafluoroborate in Aqueous/Organic Solvent-Systems", Tetrahedron Letters, Vol. 32, Núm. 9 (1991), págs. 1157-1160.

También se ha utilizado TSTU para preparar ésteres activos de cuentas carboxiladas en fase sólida en disolventes orgánicos (ver Wilchek y col., "Improved Method for Preparing N-H-Hydroxysuccinimide Ester-Containing Polymers for Affinity Chromatography", Bioconjugate Chemistry, Vol. 5 (1994), págs. 491-492. Los reactivos como TSTU son ventajosos frente al método de la carbodiimida/NHS debido a que existe una probabilidad reducida de diversas reacciones secundarias, tales como una reacción de desplazamiento de O a N o una transposición de Lossen.

M.A. Andersson, y col., "Synthesis of oligosaccharides with oligoethylene glycol spacers and their conversion into glycoconjugates using N,N,N',N'-tetramethyl(succinimido)uronium tetrafluoroborate as a coupling reagent", Glycoconjugate Journal, Vol. 10(1993), págs. 461-465, describen el uso de TSTU para activar un sacárido activado en un disolvente acuoso/orgánico mixto y el posterior acoplamiento de este material activado a una proteína. Andersson no describe el uso de este método para producir vacunas.

En la Solicitud de Patente Europea Núm. 0.569.086 A2 (S.J. Danielson y col.) se describe el uso de TSTU y reactivos similares para preparar ésteres activos de sustratos y partículas carboxilados insolubles. Estos sólidos activados son acoplados con posterioridad a moléculas biológicamente relevantes para preparar reactivos de diagnóstico.

A pesar de los diversos métodos de acoplamiento y activación descritos en los diversos documentos mencionados antes, existe la necesidad actual en la técnica de métodos mejorados para acoplar moléculas biológicamente relevantes entre sí para producir vacunas. Adicionalmente, existe la necesidad en la técnica de un procedimiento mejorado para acoplar moléculas biológicamente relevantes a superficies y partículas no carboxiladas para producir diversos reactivos. Esta invención pretende proporcionar un método de acoplamiento mejorado para producir productos conjugados para vacunas e inmunógenos. Además, estos métodos serán útiles para producir reactivos inmunológicos, reactivos de diagnóstico, y reactivos terapéuticos.

La presente invención se refiere a un método para producir una vacuna de producto conjudado, que comprende:

Mezclar un reactivo de sal de uronio con un primer radical seleccionado entre polisacáridos, donde el reactivo de sal de uronio tiene una estructura química que corresponde a la fórmula I:

1

donde:

R^{1} se define como 2 donde R^{6} representa átomos de carbono, átomos de hidrógeno, y opcionalmente uno o más heteroátomos, que, junto con el átomo de nitrógeno al que están anclados, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros, que puede estar sustituido o no sustituido;

donde R^{2} y R^{3} se definen como sigue:

R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido; o

R^{2} y R^{3}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrógeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros puede estar sustituido o no sustituido;

donde R^{4} y R^{5} se definen como sigue:

R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono; o

R^{4} y R^{5}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrogeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros puede estar sustituido o no sustituido; y

X^{-} representa un anión ácido; y

mezclar un segundo radical con el primer radical, donde el segundo radical se selecciona de grupo de proteínas, péptidos, lipoproteínas, haptenos, y carbohidratos, con lo que el primer radical y el segundo radical reaccionan para formar la vacuna conjugada.

Se prefiere mezclar el reactivo de sal de uronio con el primer radical antes de mezclar el segundo radical con el primer radical, donde se inicia una reacción entre el reactivo de la sal de uronio y el primer radical.

Preferiblemente, el primer radical es un polisacárido en solución.

Más preferiblemente, en el método se incluye adicionalmente la etapa de aislar un producto de la reacción entre el reactivo de la sal de uronio y el polisacárido antes de mezclar el segundo radical con el producto.

Se prefiere adicionalmente mezclar el reactivo de la sal de uronio con el primer radical al menos dos veces diferentes antes de mezclar el segundo radical con el primer radical.

Por otra parte, se prefiere mezclar el segundo radical con el primer radical antes de mezclar el reactivo de la sal de uronio con el primer radical.

Además, se prefiere mezclar el segundo radical con el primer radical a la vez que se mezcla el reactivo de la sal de uronio con el primer radical.

Adicionalmente se prefiere mezclar el reactivo de la sal de uronio con el primer radical al menos dos veces diferentes.

Además, se prefiere que el anión ácido sea un anión seleccionado del grupo formado por Cl^{-}, Br^{-}, F^{-}, I^{-}, PF_{6}^{-}, y BF_{4}^{-}.

Por otra parte, se prefiere que el reactivo de la sal de uronio sea un miembro seleccionado del grupo de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio; y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

Se prefiere que el primer radical sea un polisacárido en solución, y más preferiblemente que el polisacárido contenga al menos un grupo carboxilo.

Adicionalmente se prefiere que el primer radical sea un polisacárido seleccionado del grupo de polisacárido de tipo C de Neisseria meningitidis, polisacárido de Haemophilus influenza, polisacárido Pneumocócico, dextrano y dextrano carboxilado.

Además, se prefiere que el primer radical sea un polisacárido, incluyendo adicionalmente el método la etapa de carboxilar el polisacárido antes de mezclar el reactivo de la sal de uronio y antes de mezclar el segundo radical, más preferiblemente que el polisacárido sea activado haciéndolo reaccionar con un reactivo seleccionado del grupo formado por CNBr, CDAP, y un reactivo de vinilsulfona, y después carboxilado.

Otra realización consiste en que el segundo radical sea una proteína.

Una realización adicional consiste en que el reactivo de la sal de uronio sea un miembro seleccionado del grupo de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio; y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

Se prefiere que el primer radical incluya al menos un grupo carboxilo,

o que el primer radical incluya al menos un grupo hidroxilo.

Esta invención se refiere a un método para producir un producto conjugado, y ventajosamente, vacunas conjugadas. En este método, se activa un primer radical (un polisacárido) con un reactivo de sal de uronio. Se cree que el reactivo de sal de uronio activa los grupos carboxilo o hidroxilo presentes en el primer radical, aunque los Solicitantes no desean estar unidos a mecanismos químicos específicos o teorías de funcionamiento. El primer radical puede estar presente en un medio acuoso, en una mezcla de un medio acuoso/orgánico, o en un medio orgánico. Según el procedimiento de la invención, el reactivo de sal de uronio tiene una estructura química correspondiente a la fórmula I:

3

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R^{1} se define como 4 donde R^{6} representa átomos de carbono, átomos de hidrógeno, y opcionalmente uno o más heteroátomos, que, junto con el átomo de nitrógeno al que están anclados, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros, que puede estar sustituido o no sustituido;

R^{2} y R^{3} se definen como sigue:

R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido; o

R^{2} y R^{3}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrógeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros puede estar sustituido o no sustituido.

R^{4} y R^{5} se definen como sigue:

R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono; o

R^{4} y R^{5}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrogeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico puede estar sustituido o no sustituido.

X^{-} representa un anión ácido; (v.g., Cl^{-}, Br^{-}, I^{-}, PF_{6}^{-}, y BF_{4}^{-}). Otros aniones ácidos adecuados para su uso en esta invención se describen en la Solicitud de Patente Europea Núm. 0.569.086.

Asimismo, en el método de la invención, se mezcla un segundo radical (v.g., una proteína, un péptido, un hapteno, una lipoproteína, un carbohidrato, una molécula orgánica, una molécula espaciadora, un material en fase sólida, un reactivo homobifuncional, etc.) con el primer radical. El primer radical se activa y reacciona con el segundo radical para formar un producto conjugado o un primer radical funcionalizado.

En una clase preferida de reactivos de sal de uronio para su uso en esta invención se incluyen sales de fórmula I donde el grupo 5 es un miembro seleccionado del grupo de:

6

Entre los reactivos específicos de esta clase se incluyen: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("HBTU"); tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TBTU"); tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TNTU"); y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TSTU"). Otros reactivos activadores de sal de uronio para su uso en esta invención se describen en la Solicitud de Patente Europea Núm. 0.569.086.

En el método de la invención, el reactivo de sal de uronio puede ser mezclado con el primer radical antes de mezclar el segundo radical con el primer radical. Esto inicia una reacción de activación entre el reactivo de sal de uronio y el primer radical. En esta primera etapa, el primer radical es activado por el reactivo de sal de uronio, y después de eso, se mezcla el segundo radical con el primer radical activado. Opcionalmente, el primer radical activado puede ser aislado de la mezcla de reacción antes de mezclar el segundo radical, y después el segundo radical puede ser mezclado con el producto aislado que incluye el primer radical activado por la sal de uronio.

En cuanto a otro procedimiento alternativo, se puede mezclar el segundo radical con el primer radical antes de mezclar el reactivo de sal de uronio con el primer radical. De esta manera, cuando se mezcla se sal de uronio con la mezcla del primer y el segundo radicales, el primer radical es activado por el reactivo de la sal de uronio, y la reacción entre el primer radical y el segundo radical prosigue en una sola etapa. Asimismo se puede producir una reacción en una sola etapa cuando e reactivo de la sal de uronio y el segundo radical se mezclen simultáneamente con el primer radical.

Si se desea, el primer radical puede ser funcionalizado con uno o más grupos químicos que sean susceptibles de ser activados por la sal de uronio. Por ejemplo, un polisacárido puede ser funcionalizado con carboxilos. Esto se puede lograr, por ejemplo, activando el primer radical, un polisacárido, con un reactivo seleccionado del grupo de CNBr, CDAP, y un reactivo de vinilsulfona, seguido de reacción con ácido 6-aminohexanoico.

La invención también puede ser utilizada para producir inmunógenos, reactivos inmunológicos, reactivos terapéuticos, o reactivos de diagnóstico.

El procedimiento para producir un producto conjugado según esta invención tiene diversas ventajas sobre los diferentes métodos y procedimientos descritos en los documentos indicados antes. Ninguno de los documentos indicados antes describe el uso de reactivos de sal de uronio para formar vacunas conjugadas. El procedimiento de la invención, por otra parte, es un método directo y fácil para producir vacunas conjugadas. El procedimiento de la invención puede ser realizado ventajosamente en una fase en solución y puede ser utilizado con polisacáridos tanto carboxilados como no carboxilados. Además, la reacción puede continuar utilizando pequeñas cantidades de reactivos, permitiendo determinar de manera rápida, eficaz, y poco costosa las condiciones de reacción óptimas. A diferencia de muchos métodos de acoplamiento conocidos, el procedimiento de la invención también permite un acoplamiento directo del primer y el segundo radicales (v.g., los materiales proteico y polisacárido). Esto simplifica adicionalmente el procedimiento de reacción y reduce los costes.

Además, el procedimiento de la invención es ventajoso debido a que se utilizan reactivos relativamente seguros y condiciones de reacción suaves (v.g., pH bajo, sin cubierta u otras instalaciones especiales). Muchos polisacáridos, tales como el polisacárido PRP, son fácilmente hidrolizados a pH extremos. Las condiciones utilizadas durante la activación con sal de uronio y el acoplamiento son relativamente suaves y lentas con el fin de conservar los epítopos en el polisacárido (es decir, se inducen modificaciones mínimas de la proteína y el polisacárido sustancias de partida). La activación con CNBr, por otra parte, requiere el uso de un pH elevado y un reactivo muy tóxico bajo una cubierta.

Otra ventaja de la invención hace referencia al procedimiento de una etapa descrito antes. Debido a que los componentes proteico y polisacárido pueden ser mezclados entre sí antes de iniciar la activación y el acoplamiento, el método de la invención permite continuar añadiendo reactivo de nueva aportación y eliminando los excesos de reactivos hasta lograr un nivel de acoplamiento suficiente y deseado. Esto no es fácilmente posible con otros métodos de activación, especialmente aquellos métodos que requieren la activación del polisacárido seguido de la adición de la proteína. El método de la invención también permite controlar el progreso del acoplamiento durante el procedimiento de conjugación, limitando de ese modo el residuo o el uso excesivo de los diversos reactivos.

Los aspectos ventajosos de la invención se comprenderán y se apreciarán más completamente junto con la siguiente descripción detallada y la figura adjunta, donde la Fig. 1 ilustra las series de HPLC para las Muestras 1A y 1C en el Ejemplo 1 descrito más abajo.

El procedimiento de la invención se describe generalmente como sigue. Un primer radical (un polisacárido) se hace reaccionar con un reactivo de sal de uronio en un entorno adecuado para transferir un éster de NHS al primer radical. Por ejemplo, según la invención, se puede hacer reaccionar un polisacárido con un reactivo de TSTU en una base, tal como una base de dimetilaminopiridina ("DMAP"). Esta reacción puede tener lugar en un medio acuoso, en un medio orgánico/acuoso mixto, o en un medio orgánico. Se pueden utilizar diversos disolventes orgánicos, incluyendo acetonitrilo, dimetilformamida ("DMF"), y N-metilpirrolidinona ("NMP"). Durante la reacción se mantiene generalmente un pH suavemente alcalino (v.g., 8 a 9,5), si fuera necesario, añadiendo más base. El segundo radical (v.g., una proteína) se mezcla con el primer radical al mismo tiempo durante este procedimiento.

La cantidad de reactivo de sal de uronio puede ser ajustada y el tiempo de variación puede ser variado para optimizar la activación y la eficacia del acoplamiento. La adición del reactivo de sal de uronio puede ser escalonada para minimizar el exceso de reactivo de sal de uronio en la reacción en cualquier momento dado. Si se desea, se puede separar el reactivo de sal de uronio viejo o en exceso, v.g., mediante diálisis o ultrafiltración, antes de mezclar nuevo reactivo con la mezcla de proteína/polisacárido. De esta manera, se puede optimizar la cantidad y el porcentaje de disolvente orgánico de la mezcla y también mantener la concentración de proteína y polisacárido a un nivel óptimo para facilitar un buen acoplamiento. Esta etapa de separación de reactivo ofrece un nivel de control sobre el acoplamiento debido que se pueden añadir pequeñas cantidades de reactivo activante, según sea necesario, y se puede controlar el progreso de la reacción de conjugación (v.g., analizando alícuotas de la mezcla de reacción). Este procedimiento también ofrece posibilidades para escalonar el procedimiento de conjugación. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de reacción óptimas (tales como el pH y el tiempo de reacción), las cantidades de reactivo, y las concentraciones de reactivo través de la experimentación de rutina.

Se puede seguir cualquier procedimiento de conjugación sin apartarse de la invención. Por ejemplo, en un procedimiento, se utiliza un polisacárido carboxilado como sustancia de partida. Esto se puede completar partiendo con un polisacárido que contenga naturalmente grupos carboxilo, tal como el polisacárido de tipo C de Neisseria meningitidis ("PsC Neisseria"). Alternativamente, se pueden añadir grupos carboxilo a un polisacárido. Los expertos en la técnica conocen una variedad de procedimientos para la carboxilación de polisacáridos. Por ejemplo, los polisacáridos pueden ser activados con CNBr o CDAP y carboxilados con un reactivo apropiado, tal como ácido 6-aminohexanoico. La activación con CNBr es descrita por W.E. Dick, supra, y la activación con CDAP es descrita en las solicitudes de patente y artículos de Lee descritos antes. También se pueden utilizar reactivos de vinilsulfona para activar polisacáridos.

En un protocolo de una etapa según la invención, el primer radical y el segundo radical se mezclan primero, y el reactivo de sal de uronio se mezcla después. El reactivo de sal de uronio puede ser añadido en pequeñas cantidades en una pluralidad de momentos diferentes. El primer radical es activado y reacciona con el segundo radical.

Este protocolo de una etapa se describe con más detalle en los siguientes ejemplos generales. Primero se mezcla un primer radical (un polisacárido) con un segundo radical (v.g. una proteína). Después se mezcla un reactivo de sal de uronio (v.g., TNTU o TSTU) con esta mezcla, seguido de la adición de una sustancia bases (v.g., trietilamina ("TEA")). En este procedimiento, el operario puede continuar añadiendo TNTU adicional y/o TEA hasta que se observa un nivel de acoplamiento suficiente o deseado. De hecho, el procedimiento de reacción y el grado de acoplamiento pueden ser determinados en diferentes momentos diferentes analizando alícuotas de la mezcla de reacción a medida que la reacción continúa.

En un protocolo de dos etapas según la invención, el primer radical (un polisacárido) es activado con un reactivo de sal de uronio, y después de eso, el segundo radical (v.g. una proteína) es mezclado con el primer radical activado. El tampón, la concentración de reactivo, el tiempo, y las condiciones de temperatura, etc. pueden ser seleccionados de manera que en el momento en el que se mezcla el segundo radical (es decir, el componente que se va a unir), la concentración del reactivo activante es demasiado baja para causar una polimerización significativa de ese componente. Debido a la relativa estabilidad del éster de NHS y de su multiplicidad en el primer radical, todavía puede haber un número suficiente de grupos activados en la molécula del primer radical en el momento en el que se mezcla el segundo radical para que tenga lugar el acoplamiento. De esta manera, se puede evitar la necesidad de aislar el intermedio activado del primer radical. Si se desea y si el intermedio es estable, sin embargo, el producto de reacción de la reacción de la sal de uronio y el primer radical (polisacárido activado con la sal de uronio) puede ser aislado antes de mezclar con él el material del segundo radical. Asimismo, según la invención, se puede activar el primer radical con el reactivo de sal de uronio, aislar, y almacenar para su posterior uso, con tal que permanezca estable en las condiciones de aislamiento y almacenamiento.

La presencia de algún reactivo de sal de uronio en el momento en el que el segundo radical se mezcla puede no ser perjudicial debido a que puede promover el acoplamiento del segundo radical con el primer radical al continuar activando los radicales. Realmente, la presencia de algún exceso de reactivo de sal de uronio cuando se añade el segundo radical en este protocolo de dos etapas puede volver el procedimiento global algo así como "una mezcla" de los procedimientos de una y dos etapas.

En general, se encuentran disponibles al menos dos mecanismos para activar un primer radical. En un mecanismo, se activan los grupos carboxilo del primer radical, y en otro mecanismo, se activan los grupos hidroxilo. El procedimiento de la invención puede ser utilizado con muchos polisacáridos debido a que están o pueden estar carboxilados o hidroxilados. Debido a que los polisacáridos contienen naturalmente grupos carboxilo como parte de su unidad de repetición, v.g., PsC de Neisseria, no siempre es necesaria una carboxilación separada. Típicamente, algunos de estos grupos carboxilo pueden ser modificados sin destruir la antigenicidad del polisacárido. Se pueden utilizar estos carboxilos nativos, o se pueden añadir "brazos" carboxilados fácilmente al polisacárido, como se describe en los ejemplos. En otros casos, se pueden introducir fácilmente grupos carboxilo, especialmente con CDAP. Por ejemplo, se puede utilizar CADP para derivar el polisacárido de tipo 14 ("Pn 14") Pneumocócico con ácido 6-aminohexanoico. Los polisacáridos que contienen amina pueden ser carboxilados utilizando anhídrido glutárico. Se puede preparar carboximetildextrano fácilmente a partir de dextrano y ácido cloroacético como base, como describe Inman, Journal of Immunology, Vol. 114, página 704 (1975). Los métodos para convertir diversos grupos funcionales en grupos carboxilo también son bien conocidos. Obsérvese el estudio de G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, California, (1996), pág. 187. Así, muchos polisacáridos pueden ser carboxilados y activados mediante el método según la invención.

Sin embargo, como se ha observado antes, no es un requerimiento que el material de partida del primer radical contenga carboxilos. Los grupos hidroxilo del primer radical también pueden ser activados con reactivos de sal de uronio. Como se demuestra en los ejemplos más abajo, el proceso de la invención puede ser utilizado con sustancias de partida que no contengan carboxilos (v.g., Pn14). Así, se puede contemplar como opcional la utilización de una sustancia del primer radical que contenga carboxilos.

Entre los ejemplos de polisacáridos específicos para su uso en el método según la invención se incluyen dextrano, dextrano carboxilado (tal como carboximetildextrano), polisacárido de tipo C de Neisseria meningitidis, polisacáridos Pneumocócicos (tales como Pn 14, Pn 6, Pn 19, y Pn 23), y polisacárido y lipopolisacárido de Haemophilus influenza ("PRP").

En el procedimiento de reacción de la invención, el primer radical activado reacciona con un segundo radical presente en la mezcla de reacción. Entre los ejemplos adecuados de materiales que pueden ser utilizados como segundo radical se incluyen proteínas, haptenos, péptidos, lipoproteínas, carbohidratos, moléculas orgánicas, moléculas espaciadoras, materiales en fase sólida, reactivos homobifuncionales, o reactivos heterobifuncionales. Este segundo radical puede ser un material natural o sintético que sea o bien soluble o bien insoluble en agua. El procedimiento según la invención puede ser utilizado para elaborar productos conjugados de estos primer y segundo radicales, incluyendo productos conjugados de proteína/polisacárido, y similares. Adicionalmente, se puede acoplar un primer radical activado (un polisacárido activado) a una superficie de amina o hidrazida en el procedimiento de la invención para producir reactivos.

Entre los ejemplos de las proteínas adecuadas específicas para su uso en esta invención se incluyen seralbúmina bovina, toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, toxoide pertusis, proteína rib, intimina, y proteína gD. Entre los ejemplos de los péptidos adecuados para su uso en la invención se incluyen péptido LHRH y péptido consenso CFA/I (ver F.J. Cassels, y col., Journal of Industrial Microbiology, 1996 Annual Meeting for the Society of Industrial Microbiology). Entre los ejemplos de las lipoproteínas adecuadas para su uso en la invención se incluyen lipoOspA y lipoD. Entre los ejemplos de los haptenos adecuados se incluyen PamCys y monofosforolípido A. Entre los ejemplos de otros carbohidratos para su uso en la invención se incluyen proteínas glicosiladas y peroxidasa de rábano picante. En un ejemplo de molécula orgánica adecuada para su uso en la invención se incluye la biotinhidrazida. Entre los ejemplos de las moléculas espaciadoras adecuadas se incluyen hexanodiamina y dihidrazida adípica. Entre los ejemplos de los materiales en fase sólida para su uso en la invención se incluyen las placas de ELISA ("análisis de inmunoabsorción con enzima ligada"), cuentas, y medios cromatográficos. Entre los ejemplos de los reactivos heterobifuncionales se incluyen hidrazido[3-(2-piridilditio)propionato] y mercaptoetilamina. En un ejemplo de reactivo homobifuncional adecuado para su uso en la invención se incluye la cistamina.

Entre los reactivos de sal de uronio preferidos para su uso según la invención se incluyen los miembros del siguiente grupo: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("HBTU"); tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TBTU"); tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TNTU"); y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio ("TSTU"). Estas sales de uronio son asequibles de NovaChem. Adicionalmente, se puede obtener TSTU de Aldrich. TSTU y TNTU son los reactivos de sal de uronio particularmente preferidos. Debido a que es un reactivo relativamente suave, TSTU es un entrecruzador menos nocivo que las carbodiimidas. Los solicitantes han observado que TSTU parece ocasionar mucha menos homopolimerización que EDC.

Se han elaborado diversas vacunas utilizando productos conjugados producidos mediante el procedimiento de la invención. Entre las vacunas se incluyen, pero no están limitadas a, las vacunas expuestas más abajo:

Vacuna de la difteria

Vacuna de pertusis (subunidad)

Vacuna del tétanos

H. influenza, tipo b (polirribosafosfato)

S. pneumoniae, todos los serotipos

E. coli, endotoxina o antígeno J5 (LPS, Lípido A, y Gentabiosa)

E. coli, polisacáridos O (serotipo específico)

Klebsiella, polisacáridos (serotipo específico)

S. aureus, tipos 5 y 8 (serotipo específico y antígenos protectores comunes)

S. epidermidis, serotipo polisacárido I, II y III (y antígenos protectores comunes)

S. meningitidis, serotipo específico o antígenos de proteínas

Vacuna de la polio

Vacuna de paperas, sarampión, rubéola

Virus Respiratorio Sincitial

Rabia

Hepatitis A, B, C y otros

Virus de la inmunodeficiencia humana I y II (GP120, GP41, GP160, p24, otras)

Herpes simplex tipos 1 y 2

CMV

EBV

Varicela/Zoster

Malaria

Tuberculosis

Candida albicans, otras cándidas

Pneumocystis carinii

Mycoplasma

Virus de la influenza A y B

Adenovirus

Streptococcus Grupo A

Streptococcus Grupo B, serotipos Ia, Ib, II y III

Pseudomonas aeruginosa (serotipo específico)

Rhinovirus

Parainfluenzae, tipos 1, 2, y 3

Coronavirus

Salmonella

Shigella

Rotavirus

Enterovirus

Chlamidia trachomatis y pneumoniae (TWAR)

Glicoproteínas

Neo-formans cryptococcus

Como ejemplo específico del procedimiento de la invención, se pueden utilizar sales de uronio para activar lipopolisacáridos de la manera descrita con más detalle en los ejemplos de más abajo. Después de eso, el lipopolisacárido activado puede ser acoplado a una proteína para su uso en una vacuna. Los anticuerpos contra los lipopolisacáridos y lipooligosacáridos pueden proporcionar protección frente a la sepsis por Haemophilus influenza no tipable.

En el procedimiento de la invención, se pueden elaborar productos conjugados en los que la razón en peso del segundo radical con respecto al primer radical en el producto conjugado es mayos de 0,05 mg/mg (v.g. 0,05 mg de proteína/mg de polisacárido). Para las vacunas de productos conjugados de proteína/polisacárido, la razón en peso de la proteína con respecto al polisacárido puede ser mayor de 0,05, prefiriéndose un intervalo de 0,05 a 7, y siendo particularmente preferido el intervalo de 0,1 a 2 mg de proteína por mg de polisacárido.

La invención se describirá más abajo más específicamente en términos de diversas realizaciones preferidas y ejemplos específicos. Estas realizaciones preferidas y ejemplos específicos deben ser considerados ilustrativos de la invención, y no limitantes de la misma. Adicionalmente, en ciertos ejemplos se utiliza seralbúmina bovina (BSA) como proteína modelo y/o dextrano como polisacárido modelo. Por supuesto, también se pueden utilizar en la práctica de la invención proteínas y dextranos biológicamente relevantes. Los ejemplos específicos que incluyen proteínas y polisacáridos biológicamente relevantes también están incluidos en esta solicitud.

Muchos de los ejemplos específicos de más abajo incluyen el uso de DMAP como base en el procedimiento de reacción. No obstante, se pueden utilizar muchas otras bases. Por ejemplo, también se pueden utilizar carbonato de sodio, hidróxido de sodio, trietilamina, o dietilisopropilamina sin apartarse de la invención.

En los siguientes ejemplos también se incluyen diversas abreviaturas, procedimientos normalizados, y materiales que son bien conocidos por los expertos en la técnica. La siguiente información ayudará a comprender más fácilmente la información incluida en los siguientes ejemplos. Estas definiciones se aplican en los siguientes ejemplos, a menos que haya una indicación al contrario.

Se utiliza BSA monomérica en ciertos ejemplos debido a que el uso de la proteína monomérica hace más fácil observar el procedimiento de acoplamiento como un desplazamiento en el peso molecular. La BSA monomérica utilizada en estos ejemplos fue preparada a partir de fracción V de Cohn de BSA(de Sigma Chemical Co.) o BSA con un bajo contenido en endotoxina de Intergen (de Intergen Corp.) mediante un breve tratamiento con yodoacetamida 10 mM en tampón HEPES (descrito más abajo) a pH 7,3, y después filtración en gel en una columna de 2,5 x 100 cm S100HR (de Pharmacia) como se describe en Lees, y col., Vaccine, Vol. 14, Núm. 3, (1996) pág. 190-198 (descrito antes). El dextrano era dextrano T2000 obtenido de Pharmacia. Para algunos experimentos, se utilizó la fracción de elevado peso molecular del dextrano T2000. Este material fue obtenido haciendo pasar dextrano por una columna de filtración en gel (2,5 x 100 cm S400 HR), como se ha descrito antes. El toxoide del tétanos, los diversos polisacáridos Pneumocócicos, el polisacárido de Neisseria meningitidis y el polisacárido PRP fueron obtenidos de SmithKline Beecham (Rixensart, Bélgica). Entre las fuentes comerciales para las proteínas y los polisacáridos adecuados para su uso en el invención se incluyen American Tissue Culture Collection of Rockville, Maryland y Berna Laboratories de Florida.

El "tampón HEPES" (o "tampón HE"), utilizado en esta solicitud hace referencia a una mezcla de ácido hidroxietilpiperazino-N'-2-etanosulfónico 0,15 M ("HEPES") y etilendiaminotetraacetato 2 mM ("EDTA") para proporcionar una solución que tiene un pH de 7,3. "HEPES" hace referencia a HEPES solo, sin EDTA (pH = 8). "Tampón 5 x HEPES" (o "tampón 5 x HE") representa una mezcla de volúmenes iguales de tampón 5 x HEPES y solución salina. "Solución salina" representa una solución 0,15 M de NaCl en agua.

Cuando se llevan a cabo cromatografías líquidas de alta resolución ("HPLC"), a menos que se indique de otro modo, se utilizaba una bomba Waters modelo 626 con un controlador modelo 600S y un detector de la absorbancia modelo 486. Antes de hacer funcionar las cromatografías HPLC, todas las muestras fueron filtradas por centrifugación utilizando una unidad de filtro Ultrafree MC 0,45 \mum. Las columnas de HPLC de exclusión por tamaños que se utilizaban, a menos que se indicara lo contrario, eran columnas Phenomenex Biosep G4000 (300 x 7,8 mm) equilibradas con tampón fosfato de potasio 0,1 M a un pH de 7,3. La velocidad de la serie era de 1 ml/minuto. Algunas series incluían el uso de una columna de guarda del mismo material. La filtración estéril, cuando se realizaba, ser llevaba a cabo en un dispositivo Millex GV, a menos que se indicara lo contrario.

El "pH", utilizado en esta solicitud, hace referencia a un pH aparente medido mediante el electrodo de Ross (asequible de Orion Research) o estimado mediante papel de pH Colorfast (asequible de EM Science).

Además, en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, la presencia de aminas fue determinada utilizando un análisis de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS), como describen J. Vidal y C. Franci, J. Immunol. Meth., Vol. 86, pág. 155 (1986). La presencia de hidrazidas también fue determinada utilizando un análisis de TNBS como describen Qi, y col., Anal. Chem. Vol. 275, pág. 275, pág. 139 (1988). La presencia de polisacáridos fue determinada utilizando el método del resorcinol/ácido sulfúrico de Monsigny, y col., Anal. Chem. Vol. 175, pág. 525 (1988), utilizando el patrón de polisacárido relevante. La presencia de proteína fue determinada utilizando el Coomassie Plus Protein Assay Reagent (asequible de Pierce Chemical Co., de Rockport, Illinois) (utilizando como patrón una proteína apropiada, tal como BSA o toxoide del tétanos).

Finalmente, cuando se utiliza HPLC para determinar el grado de conjugación (v.g., mg de proteína/mg de polisacárido), éste se calcula a partir de la proporción de proteína/polisacárido inicial de las sustancias de partida y del porcentaje de absorbancia de UV para el pico de proteína conjugada (basándose en la absorbancia de UV total de la proteína), medido mediante la HPLC.

Ejemplo 1

En este primer ejemplo, se acoplaron radicales polisacáridos de dextrano a un radical de proteína BSA para producir un producto conjugado. Los radicales de dextrano estaban tanto carboxilados como no carboxilados.

Se preparó carboximetildextrano ("CMdextrano") a una concentración de 39 mg de dextrano/ml en solución salina mediante el método de Inman, identificado antes. El dextrano no carboxilado estaba presente a una concentración de 74 mg/ml en solución salina. La proteína BSA monomérica estaba presente a una concentración de 32 mg/ml en tampón 2,5 x HEPES que tenía un pH de 7,3. Los reactivos TSTU y DMAP estaban presentes cada uno en forma de soluciones en DMF 0,2 M.

Muestra 1A

Para esta muestra, se mezclaron 82 \mul de sustancia de CM dextrano con 82 \mul de agua y 86 \mul de DMF. En el momento t = 0, se añadieron 10 \mul de TSTU y 10 \mul de DMAP a la sustancia de dextrano. En el momento t = 1 minuto, se añadieron 10 \mul más de TSTU, y en el momento t = 2 minutos, se añadieron 10 \mul más de TSTU. Durante esta porción del procedimiento, se añadió DMAP según fuera necesario para mantener el pH de la solución en el intervalo de 8-9. En total, se añadieron aproximadamente 50 \mul de DMAP.

En el momento t = 5 minutos, se añadieron 100 \mul de sustancia de BSA a la mezcla de reacción, y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche a una temperatura ambiente de 4ºC para producir el producto conjugado.

Muestra 1B

En la Muestra 1B, se siguió el procedimiento de la Muestra 1A, pero se utilizó dextrano T2000 en lugar de sustancia de CM dextrano.

Muestra 1C

Para la Muestra 1C, se siguió el procedimiento de la Muestra 1A, pero se sustituyeron los 82 \mul de solución salina por la sustancia de CM dextrano utilizada en la Muestra 1A. Esta muestra era una muestra de control que ilustraba los efectos de eliminar la sustancia de polisacárida.

Los productos de reacción de las Muestras 1A a 1C fueron analizados mediante HPLC en una Phenomenex Biosep SEC3000, 7,8 x 150 cm, equilibrada en KPO_{4} 0,1 M a pH 7,3. Se encontró que la Muestra 1A, utilizando CM dextrano, producía un producto conjugado de BSA/dextrano que tenía aproximadamente 0,67 mg de BSA/mg de dextrano. La muestra 1B, utilizando una sustancia de partida de dextrano no carboxilado, daba como resultado un producto conjugado de BSA/dextrano que tenía aproximadamente 0,87 mg de BSA/mg de dextrano. La Muestra 1C, la muestra de control que no incluía un polisacárido de dextrano, mostraba menos del 5% de proteína de elevado peso molecular. Esto indica que sólo una pequeña cantidad de dimerización de la proteína resultaba del procedimiento de reacción.

La Fig. 1 ilustra las series de HPLC para las Muestras 1A y 1C. Como se muestra en la HPLC para la Muestra 1A, se encontró un pico de absorbancia de elevado peso molecular muy pronunciado para el producto conjugado. Este pico de elevado peso molecular representa el producto conjugado de BSA/TSTU/CM dextrano de la Muestra 1A. La serie de HPLC para la Muestra 1C de Control, que incluía solución salina sustituyendo al polisacárido de CM dextrano, no manifestaba este pico de elevado peso molecular correspondiente a un producto conjugado.

Este Ejemplo demuestra que las sales de uronio pueden ser utilizadas para producir productos conjugados de proteínas con polisacáridos tanto carboxilados como no carboxilados. Existe una mínima homopolimerización del componente de proteína en este procedimiento de reacción.

Ejemplo 2

Este Ejemplo ilustra que diversos polisacáridos diferentes pueden ser activados con reactivos de sal de uronio. Además, los polisacáridos de este Ejemplo, una vez activados, fueron funcionalizados con aminas o hidrazidas. Este polisacárido fue activado por reactivos de sal de uronio y derivados tanto con aminas (Muestra 2A) como hidrazidas (Muestra 2H). En las Muestras 2B a 2E se utilizan polisacáridos capsulares Pneumocócicos ("Pn") clínicamente relevantes. Las Muestras 2F y 2G demuestran que los reactivos de sales de uronio pueden ser utilizados para activar polisacáridos carboxilados, y la Muestra 2F demuestra adicionalmente que esta clase de reactivos puede activar un polisacárido vegetal. La Muestra 21 muestra el uso de la invención con un polisacárido PRP clínicamente relevante.

Los protocolos experimentales para realizar la activación y derivación se describirán con más detalle más abajo. Se prepararon los siguientes reactivos y se utilizaron en los diversos experimentos descritos más abajo, a menos que haya alguna indicación al contrario: (a) reactivo TSTU preparado en forma de una solución en DMF 0,5 M; (b) reactivo de DMAP preparado en forma de una solución en agua 0,5 M; (c) reactivo de etilendiamina preparado en forma de una solución en agua 1 M; y (d) solución de dihidrazida adípica preparada en forma de una solución en agua 0,5 M.

Muestra 2A

La Muestra 2A se preparó según el siguiente protocolo. Se mezclaron 65 \mul de dextrano T2000, a una concentración de 74 mg/ml con 35 \mul de solución salina y 100 \mul de agua. En el momento t = 0, se añadieron 20 \mul de TSTU (0,5 M en DMF) a la solución. En el momento t = 20 segundos, se añadieron 20 \mul de DMAP (0,5 M en agua), y después a t = 1 minuto y t = 1,5 minutos, se añadieron 20 \mul adicionales de TSTU a la mezcla de reacción. En total, se añadieron 60 \mul de TSTU a la sustancia de partida de dextrano. Durante el procedimiento, se añadió DMAP, según fuera necesario, para mantener el pH de la solución de reacción en el intervalo de 8 a 8,5.

En el momento t = 2 minutos, se añadieron 300 \mul de etilendiamina 0,67 \muM. Al cabo de 1 hora, se eliminaron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (de BioRad), equilibrada en solución salina, y se reunió. Se analizaron las diaminas y el dextrano de la sustancia resultante, y se determinó que el polisacárido activado resultante contenía 9,4 NH_{2}/100 KDa de dextrano.

Muestra 2B

Esta Muestra describe la activación de un polisacárido biológicamente relevante utilizando las sales de uronio en el procedimiento de la invención.

En el momento t = 0, se añadieron 20 \mul de TSTU a 0,5 ml de una solución de polisacárido Pn 14, que tenía una concentración de 10 mg Pn 14/ml en agua. Inmediatamente después de eso, se añadieron a la solución 20 \mul de DMAP. En el momento t = 1 minuto, se añadieron 20 \mul adicionales de TSTU, y en el momento t = 1,5 minutos, se añadieron 20 \mul más de TSTU. Durante este procedimiento se añadió una cantidad adecuada de DMAP para mantener la solución de reacción a un pH de aproximadamente 8,5. En el momento t = 2 minutos, se añadieron 200 \mul de una solución de etilendiamina 1 M.

Al cabo de aproximadamente 1 hora, se extrajeron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (asequible de BioRad), equilibrada con solución salina. Se realizaron análisis para determinar la presencia de aminas (NH_{2}) y polisacárido, y se determinó que este polisacárido activado contenía 7,6 NH_{2}/100 KDa Pn 14.

Muestra 2C

En esta Muestra, se siguió el procedimiento de la Muestra 2B, excepto que la sustancia de partida era 0,5 ml de Pn 6 a una concentración de 10 mg/ml en agua. Tras el análisis inicial, las muestras se reunieron y se concentraron utilizando un dispositivo Centricon (asequible de Amicon). La muestra se hizo recircular por la columna P6DG y se volvió a analizar. Se determinó que el polisacárido Pn 6 activado resultante contenía 10,4 NH_{2}/100 KDa Pn 6.

Muestra 2D

En esta Muestra, se siguió el procedimiento de la Muestra 2B, excepto que la sustancia de partida era 0,5 ml de Pn 19 a una concentración de 10 mg/ml en agua. Se determinó que el polisacárido Pn 19 activado resultante contenía 9,9 NH_{2}/100 KDa Pn 19.

Muestra 2E

En esta Muestra, se siguió el procedimiento de la Muestra 2C, excepto que la sustancia de partida era 0,5 ml de Pn 23 que tenía una concentración de 10 mg/ml en solución salina. Se determinó que el polisacárido Pn 23 activado resultante contenía 3,4 NH_{2}/100 KDa Pn 23.

Muestra 2F

Para esta Muestra, la solución de polisacárido era 0,5 ml de pectina (pectina de fruta cítrica asequible de Sigma) a una concentración de 10 mg/ml en agua, más 200 \mul de carbonato de sodio (1 M), a un pH de aproximadamente 9,6. En el momento t = 0, se añadieron a esta solución de polisacárido 20 \mul de TSTU 0,5 M (en DMF). Después, en el momento t = 1 minuto, se añadieron 20 \mul más de TSTU, y el pH se mantuvo en el intervalo de 9-9,5 utilizando la solución de carbonato de sodio 1 M. En el momento t = 3 minutos, se añadieron 500\mul de etilendiamina 1 M (en agua). Esta mezcla de reacción se dejó estar durante la noche a la temperatura ambiente, y después se eliminaron las sales en una columna P6DG (asequible de BioRad). Se determinó que el polisacárido activado resultante contenía 8,4 NH_{2}/100 KDa Pectina.

Muestra 2G

Para esta Muestra, se mezclaron 200 \mul de CM dextrano (conteniendo 7,5 carboxilos/100 KDa), a una concentración de 48 mg/ml en solución salina, con 200 \mul de agua. En el momento t = 0, se añadieron a la solución 20 \mul de TSTU (0,5 M en DMF). En el momento t = 20 segundos, se añadieron 20 \mul de DMAP (0,5 M en agua), y después, a t = 1 minutos y t = 1,5 minutos, se añadieron 20 \mul más de TSTU a la mezcla de reacción. En total, se añadieron 60 \mul de TSTU al CM dextrano sustancia de partida. Durante el procedimiento, se añadió DMAP, según fuera necesario, para mantener el pH de la solución de reacción en el intervalo de 8 a 8,5.

En el momento t = 2 minutos, se añadieron 200 \mul de etilendiamina 0,5 M (en agua). Al cabo de 1 hora, se extrajeron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (de BioRad), equilibrada en solución salina, se reunieron, se concentraron en un dispositivo Centricon 30 (asequible de Amicon), y se extrajeron las sales de nuevo. Se analizaron las aminas y el dextrano de la sustancia resultante, y se determinó que el polisacárido activado resultante contenía 10,6 NH_{2}/100 KDa CM dextrano.

Muestra 2H

En esta Muestra, se siguió el procedimiento de la Muestra 2B, excepto que la sustancia de partida era 100 \mul de dextrano T2000 que tenía una concentración de 55 mg/ml en agua. Asimismo, durante el procedimiento de reacción, en el momento t = 2 minutos, se añadieron 200 \mul de la solución de hidrazida adípica 0,5 M en lugar de los 200 \mul de solución de etilendiamina 1 M del Procedimiento de la Muestra 2B.

Se determinó el polisacárido dextrano T2000 activado resultante contenía 8,9 hidrazida ("Hz") por 100 KDA de dextrano.

Muestra 2I

En esta Muestra, se activó un polisacárido PRP utilizando un reactivo de sal de uronio TNTU. Para hacerlo, se mezclaron 80 \mul de TNTU 0,3 M (en NMP) y 48 \mul de TEA 0,5 M (en NMP) en 0,5 ml de PRP (a una concentración de 10 mg/ml) en NaCl 2M. Al cabo de 2 minutos, se añadieron 250 \mul de hexanodiamina 0,5 M en borato de sodio 0,1 M (pH = 9,3) a la mezcla anterior. La reacción continuó durante la noche a una temperatura de 4ºC. Después se extrajeron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (asequible de BioRad), equilibrada con solución salina.

Se analizaron las aminas y el polisacárido del producto de reacción, y se determinó que la sustancia resultante tenía 11,4 grupos NH_{2}/100 kDa PRP.

Conclusión referente al ejemplo 2

Este Ejemplo ilustra que los reactivos de sal de uronio pueden ser utilizados para derivar una variedad de polisacáridos diferentes y para funcionalizar los polisacáridos o bien con aminas o bien cono hidrazidas. Las proteínas o cualquier otro radical secundario pueden ser sustituidas por diaminas o hidrazidas y acopladas a los polisacáridos activados. Asimismo, este Ejemplo muestra que se pueden funcionalizar polisacáridos clínicamente relevantes mediante el procedimiento de la invención, así como polisacáridos vegetales.

Ejemplo 3

Este Ejemplo demuestra el procedimiento de la invención en el que se separan los reactivos de sales de uronio antes de acoplar la proteína al polisacárido activado.

El polisacárido sustancia de partida era 5 mg de sustancia de dextrano T2000, presente a una concentración de 74 mg de dextrano/ml de solución (correspondiente a 68 \mul de la solución de dextrano). Se añadieron a esta solución de dextrano 68 \mul de agua, 135 \mul de NMP, 50 \mul de TSTU 0,2 M (en NMP), y 50 \mul de DMAP 0,2 M (2n NMP). El pH al comienzo era de aproximadamente 9,6 y caía desde este nivel.

En el momento t = 30 minutos, se añadió aproximadamente 1 ml de agua. El exceso de reactivos se separó después por ultrafiltración utilizando una membrana Filtron Omega 30 K, tamaño 10 ml, para producir 0,5 ml de volumen final. Después se añadió 1 ml más de agua, y la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 400 \mul. El polisacárido se separó del aparato, y se utilizaron 100 \mul más de agua para enjuagar la membrana, proporcionando de ese modo un volumen total de aproximadamente 500 \mul.

Se añadió monómero de BSA a una razón de 1,7 mg BSA/mg de dextrano a esta solución de polisacárido activado. La concentración final de BSA era de aproximadamente 7,3 mg/ml.

Esta mezcla de reacción se dejó estar durante la noche a una temperatura de aproximadamente 4ºC. Se realizó una HPLC (DO 280 nm) para determinar la existencia de producto conjugado de BSA/dextrano y la cantidad de sustancia BSA presente en el producto conjugado de la reacción. La HPLC se realizó en Phenomenex SEC3000, 150 x 7,8 cm, equilibrada con KPO_{4} 0,1 M, pH = 7,3, a una velocidad de serie de 1 ml/minuto. A partir de la HPLC, se descubrió que el 35% de la proteína estaba presente en el pico de elevado peso molecular para el producto conjugado (y el 65% estaba presente en forma de proteína libre). Por lo tanto, se encontró que el producto conjugado resultante contiene aproximadamente 0,6 mg de BSA/mg de dextrano.

Ejemplo 4

Para este ejemplo, se añadieron el reactivo de sal de uronio y otros diversos reactivos a la sustancia polisacárido en momentos diferentes. Entre las adiciones del reactivo de sal de uronio, se eliminaban los excesos de reactivos mediante ultrafiltración.

Se preparó una solución que contenía 15 mg de dextrano, 15 mg de monómero de BSA, y 3,33 ml de solución salina. En el momento t = 0, se añadieron a la solución 40 \mul de TNTU 0,3 M (en NMP) y 12 \mul de TEA 1 M (en NMP). Después, en el momento t = 2 minutos, se añadieron 6 \mul adicionales de TEA.

En el momento t = 1 hora, se realizó el siguiente protocolo de lavado. La mezclase lavó mediante ultrafiltración (en un Filtron Omega 30, tamaño 10 ml). La mezcla filtrada se diluyó hasta 10 ml con solución salina y después se concentró a 3 ml. De esta solución, se separaron 0,6 ml para el análisis.

A la solución de polisacárido restante, se añadieron TNTU y TEA de la misma manera descrita antes. Tras un tiempo de reacción de 1 hora, el protocolo de lavado se repitió de nuevo. En este momento, se separaron de nuevo 0,6 ml para el análisis.

El procedimiento de adición de TNTU y TEA se repitió una tercera vez y de nuevo una cuarta vez, habilitando el protocolo de lavado descrito antes entre estos procedimientos. Para estas tercera y cuarta adiciones, no obstante, se dobló la cantidad de TNTU y TEA.

Tras la cuarta adición de TNTU y TEA, después de que la reacción continuara durante 1,5 horas, se concentró la mezcla de reacción a 1,5 ml, y se separaron 0,5 ml de esta solución para el análisis. La sustancia restante se concentró a 0,6 ml.

Se añadieron 40 \mul de TNTU y 10 \mul de TEA a los 0,6 ml de sustancia restante. Al cabo de 1 hora, la mezcla se hizo pasar sobre una columna de filtración en gel S400HR. Por medio del análisis de las muestras, se encontró que tras la primera adición, la sustancia de producto conjugado resultante contenía aproximadamente 0,043 mg BSA/mg de dextrano. Después de la cuarta adición, el producto conjugado contenía 0,17 mg de BSA/mg de dextrano.

Este Ejemplo demuestra que cuando se diluyen las proteína y el polisacárido, existe un acoplamiento menor que cuando están más concentrados. Mediante la adición repetida de reactivos, era posible aumentar significativamente la cantidad de acoplamiento. La separación del reactivo y el disolvente utilizados mantiene bajas sus concentraciones, incluso cuando se añaden múltiples veces.

Ejemplo 5

(Sólamente comparativo)

En este Ejemplo, se acopló un carbohidrato a una proteína utilizando TSTU para formar un producto conjugado. Para este procedimiento, se mezclaron 20 \mul de TSTU 0,5 M (en DMF, correspondiente a aproximadamente 10 \mumoles de TSTU) y 20 \mul de DMAP 0,5 M (en agua) en 200 \mul de sacarosa (correspondiente a aproximadamente 30 \mumoles). En el momento t = 1 minuto, se añadieron 20 \mul adicionales de la solución de TSTU y 20 \mul de la solución de DMAP. En el momento t = 1,5 minutos, se añadieron otros 20 \mul de la solución de TSTU y otros 20 \mul de DMAP. Después, en el momento t = 2 minutos, se añadieron 200 \mul de 32,2 mg/ml de BSA (monomérico) en solución salina a la solución de sacarosa activada. Al cabo de aproximadamente 20 segundos, se añadieron 20 \mul de carbonato de sodio 1 M, y después se añadieron otros 20 \mul de carbonato de sodio 1 M.

Al cabo de aproximadamente 20 minutos, se extrajeron las sales de la mezcla de reacción resultante en una columna de 1 x 15 cm P6GD (asequible de BioRad), equilibrada con PBS, y se reunieron los volúmenes no válidos. Después, se concentró la sustancia utilizando un dispositivo Centricon 30 (asequible de Amicon) y de nuevo se extrajeron las sales, y finalmente se reunieron los volúmenes no válidos. Se determinó el volumen de proteína mediante el análisis de BioRad, y se determinó el contenido de carbohidrato utilizando el análisis del resorcinol con sacarosa como patrón. Se encontró que el producto conjugado resultante tenía 17,5 moles de sacarosa por mol de BSA. Esto indicaba el acoplamiento de un carbohidrato de bajo peso molecular a una proteína.

Ejemplo 6

Se utilizan diversas sales de uronio en este ejemplo para demostrar que se pueden utilizar diferentes sales para activar polisacáridos en el procedimiento de la invención. En total, se sometieron a ensayo cuatro sales de uronio diferentes, esto es TSTU, TNTU, HBTU y TBTU, en este Ejemplo.

Todas las sales de uronio departida fueron producidas en una solución 0,3 M en NMP. El DMAP utilizado en este procedimiento también estaba presente en una solución 0,3 M en NMP. La sustancia proteica de BSA es monomérica con una concentración de 64,4 mg BSA/ml. Esta sustancia de BSA se mezcló 1:1 (en peso) con tampón 5 x HEPES (que corresponde a HEPES 0,75 M y EDTA 5 mM para producir una solución que tenía un pH de aproximadamente 7,3).

Para llevar a cabo el procedimiento de reacción para este Ejemplo, se mezclaron 54 \mul de dextrano T2000 a una concentración de 74,4 mg/ml (correspondiente a 4 mg de dextrano) con 28 \mul de solución salina, 82 \mul de agua, y 86 \mul de NMP en cada uno de cuatro tubos de ensayo diferentes. Después, en el momento t = 0, se añadieron 10 \mul de una de las sales de uronio a cada tubo de ensayo de manera que cada tubo contuviera una sal de uronio diferente. También se añadieron 10 \mul de DMAP a cada tubo de ensayo junto con la sal de uronio. En el momento t = 1 minuto, se añadieron 10 \mul más de la sal de uronio apropiada al correspondiente tubo de ensayo, y de nuevo en el momento t = 2 minutos, se añadieron 10 \mul más de la sal de uronio apropiada al correspondiente tubo de ensayo. Durante esta porción del procedimiento de reacción, el pH de la solución se mantuvo en el intervalo de 8-9 con DMAP, y se necesitaba un total de aproximadamente 50 \mul de DMAP en cada tubo de ensayo para mantener el pH en este intervalo.

En el momento t = 10 minutos, se añadieron 100 \mul de la solución de BSA a cada tubo de ensayo, cuya cantidad corresponde a aproximadamente 1 mg de BSA/mg de dextrano. Se dejó que la reacción de cada tubo de ensayo prosiguiera durante aproximadamente 20 horas, momento en el cual se analizó el producto de reacción mediante HPLC en Phenomenex BioSep G4000 (150 x 7,8 cm, KPO_{4} 0,1 M al 50%, pH = 7,3, KCl 0,5 M al 50%, 1 ml/minuto) controlada a 280 nm. Los resultados del análisis se tabulan más abajo.

TABLA 1

Sal de Uronio	% BSA HMW
TSTU	79%
TNTU	87%
HBTU	36%
TBTU	27%

Estos resultados confirman que todos los reactivos de sal de uronio sometidos a ensayo funcionaban activando el polisacárido y apoyaban el acoplamiento del polisacárido activado a la proteína.

Ejemplo 7

Solo comparativo

Este Ejemplo demuestra que se puede utilizar TNTU para activar poli(alcohol vinílico) sintético ("PVA"). El PVA fue obtenido de Aldrich (número de catálogo 36.062-7). Estaba hidrolizado en un 80% y tenía un peso molecular medio de 9.000 a 10.000. El PVA fue solubilizado en agua, con un calentamiento lento, hasta una concentración de 20 mg/ml. Se mezclaron 250 \mul de esta solución de PVA (correspondiente a aproximadamente 5 mg de PVA) con 250 \mul de hexanodiamina para proporcionar una solución que tenía un pH de aproximadamente 8. En el momento t = 0, se añadieron 40 \mul de TNTU 0,3 M y 24 \mul de TEA 1 M en NMP a la solución de PVA. Después, en el momento t = 1 minuto, se añadieron 12 \mul de solución de TEA 1 M.

La reacción se dejó continuar durante la noche. Se formaba una masa sólida en la solución, y la mezcla se calentó para resolubilizar el sólido. La solución resultante se sometió después a diálisis exhaustivamente en solución salina (volumen = aproximadamente 3,5 ml). Se determinó que la solución de PVA resultante, activada con TNTU, era aproximadamente 0,113 mM en NH_{2}, lo que corresponde a más de 6 NH_{2}/100 KDa.

Este Ejemplo demuestra que una sal de uronio (v.g., TNTU en este ejemplo) puede activar alcoholes secundarios. Puesto que PVA es un polímero sintético (que no contiene grupos carboxilo), éste muestra que el procedimiento de la invención puede ser utilizado para activar polímeros no carboxilados, sintéticos.

Ejemplo 8

Este Ejemplo se proporciona para demostrar el procedimiento de una etapa para activar y acoplar simultáneamente proteínas y polisacáridos clínicamente relevantes.

Muestra 8A

Para esta muestra, la sustancia de partida proteica, toxoide del tétanos, estaba presente en una solución salina a una concentración de 16,8 mg/ml. El polisacárido utilizado era un polisacárido PRP, solubilizado a una concentración de 10 mg/ml en NaCl 2 M mediante rotación durante una hora a la temperatura ambiente. El agente activante TNTU estaba presente en una solución 0,3 M en NMP. La TEA utilizada en este Ejemplo estaba presente en una solución 2 M en NMP. Finalmente, la glicina utilizada estaba a una concentración 2 M en agua, ajustada a pH 8.

Para el procedimiento de reacción, se combinaron 0,5 ml de la solución de PRP (correspondiente a 5 mg de PRP) con 297 \mul de la solución de toxoide del tétanos (correspondiente a 5 mg de TT). Esta mezcla se concentró después a 0,5 ml utilizando un dispositivo Centricon 50 (de Amicon).

Después de eso, en el momento t = 0, se añadieron 50 \mul de agente activante TNTU. Aproximadamente 15 segundos más tarde, se añadieron 20 \mul de TEA. Al cabo de 2 horas, se añadieron 100 \mul del reactivo de glicina.

La mezcla de reacción se dejó estar durante la noche. Después, la muestra se hizo pasar por una columna de filtración en gel de 1 x 50 cm S400HR, equilibrada con solución salina. Las fracciones de elevado peso molecular se reunieron y se analizaron en cuanto al toxoide del tétanos y el PRP. Se encontró que la sustancia tenía 0,78 mg de toxoide del tétanos por mg de PRP.

Muestra 8B

Para esta Muestra, se preparó un producto conjugado de toxoide del tétanos/PsC de Neisseria utilizando TNTU como agente activante para activar el PsC de Neisseria. Este procedimiento de reacción seguía el protocolo de reacción de una etapa en el que la proteína y el polisacárido se mezclan primero entre sí, y después de eso, se añade el reactivo activante de sal de uronio a esta mezcla.

Primero, se añaden 238 \mul de toxoide del tétanos (con una concentración de 16,8 mg/ml) a 0,4 ml de PsC de Neisseria (con una concentración de 10 mg/ml en solución salina). Esta mezcla se concentró después a aproximadamente 0,3 ml utilizando un dispositivo de filtración a presión Filtron Omega 30.

Después se añadieron 50 \mul de TNTU 0,3 M (en NMP) a la mezcla de proteína/polisacárido concentrada. Después de eso, se añadieron 50 \mul de TEA 1 M (en NMP), y poco después, se añadieron 25 \mul más de TEA 1 M.

La reacción prosiguió durante la noche a 4ºC. La mezcla se hizo pasar sobre una columna de filtración en gel (Pharmacia), 1 x 50 cm, equilibrada con PBS. La mezcla se filtró en condiciones estériles en un Millex GV para obtener la fracción de elevado peso molecular.

Este producto de reacción se analizó para determinar el contenido de toxoide del tétanos y PsC de Neisseria. Se encontró que el producto conjugado resultante contenía 0,32 mg de TT/mg de PsC de Neisseria.

Como resulta evidente a partir de los resultados de ensayo, este Ejemplo demuestra el procedimiento de la invención en el que el polisacárido es activado y acoplado a la proteína en un procedimiento de una sola etapa. Además, este Ejemplo demuestra la utilidad del TNTU en la producción de productos conjugados clínicamente relevantes con un polisacárido que contenga carboxilo.

Ejemplo 9

Este Ejemplo describe el uso de reactivos de sales de uronio para preparar reactivos en fase sólida. En general, se activa un polisacárido en medio líquido (v.g., medio acuoso, orgánico/acuoso mixto, u orgánico) con un reactivo de sal de uronio y se acopla a cuentas con grupos amino, placas para ELISA, u otra sustancia en fase sólida. El polisacárido acoplado y la sustancia en fase sólida pueden ser útiles, por ejemplo, como reactivo de diagnóstico, tal como una sustancia en fase sólida para absorber anticuerpos específicos para análisis. Sigue un ejemplo más específico.

Se pipetearon 100 \mul de Pn 14 (a 10 \mug/ml) en pocillos de una placa de ELISA funcionalizada con amino (v.g., Nunc "Covalink"). Se pipetearon 5 \mul de TSTU 0,3 M (en NMP) en cada pocillo, seguido de 5 \mul de TEA 0,3 M (en NMP). Como controles, se colocaron en pocillos adicionales TSTU y TEA solamente, o Pn 14 solamente. Al cabo de 1 hora, los pocillos fueron lavados con solución salina. Los pocillos se sometieron a ensayo en cuanto a la presencia de Pn 14 unido a la placa de ELISA utilizando antisueros anti-PN 14 positivos conocidos, según Lees y col., Vaccine, 1996, descrito antes.

Estas placas de ELISA se utilizan después para la evaluación de antisueros anti-Pn 14.

También se pueden acoplar otros polisacáridos a las sustancias en fase sólida. Los expertos en la técnica serán capaces de idear esquemas de acoplamiento para otros reactivos en fase sólida, tales como microcuentas con grupos amino e hidrazida (asequibles de Bangs Laboratories) y medios cromatográficos con grupos amino o hidrazida (asequibles de Pharmacia).

Ejemplo 10

En este Ejemplo se prepararon diversos reactivos y productos conjugados basados en Pneumocócico 14. El reactivo basado en Pneumocócico comprende un producto conjugado de biotina-Pn 14, acoplado a través de un espaciador (Muestra 10A) o directamente al polisacárido activado (Muestra 10B).

Muestra 10A

La sustancia de partida para este procedimiento eran 0,5 ml de Pneumocócico de tipo 14 (asequible de American Tissue Culture Collection de Rockville, Maryland) a una concentración de 10 mg/ml en agua. En el momento t = 0, se añadieron 20 \mul de TSTU 0,5 M (en DMF) al polisacárido, seguido inmediatamente de la adición de 20 \mul de DMAP (0,5 ml en agua). A t = 1 minuto, se añadieron 20 \mul más de TSTU, y se añadieron 20 \mul más de TSTU a t = 1,5 minutos. Se añadieron 200 \mul de etilendiamina 1 M (en agua) a t = 2 minutos. Se añadió periódicamente DMAP a la solución de reacción por medio de este procedimiento, con el fin de mantener el pH de la solución a aproximadamente 8,5.

Al cabo de 1 hora, se extrajeron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (de BioRad, equilibrada en solución salina), y la sustancia resultante se analizó en cuanto a las aminas y los polisacáridos. Se determinó que la sustancia, que contenía etilendiamina/TSTU/Pn 14 tenía 7,6 aminas/100 kDa de Pn 14 a una concentración de 2 mg/ml.

Después se produjo el producto conjugado con biotina. Se mezclaron 300 \mul de la mezcla de etilendiamina/TSTU/
Pn 14 descrita antes (2 mg/ml) con 50 \mul de 5 x HE. Después, se añadieron a la mezcla 1,6 mg de sulfo NHS LC biotina (asequible de BioAffinity Systems) en 60 \mul de DMF al 50%. Al cabo de 1 hora, la mezcla de reacción todavía era positiva para TNBS, de manera que se añadió LC biotina sólida adicional. Al cabo de 2 horas en total, se extrajeron las sales de la mezcla de reacción en una columna P6DG (de BioRad), equilibrada con PBS, y se reunieron los volúmenes no válidos.

Muestra 10B

Esta Muestra se produjo de la misma manera que la Muestras 10A, excepto que en el momento t = 2 minutos se añadieron 250 \mul de hidrazida biotincaproica (asequible de Sigma), en DMF al 50% (la sustancia de biotina es escasamente soluble). Al cabo de 1 hora, la sustancia no disuelta se separó por centrifugación, y se extrajeron las sales de la solución resultante en una columna P6DG (asequible de BioRad), equilibrada en solución salina.

Para confirmar el acoplamiento de la biotina con el Pn 14 en estas Muestras, se realizó un análisis para la biotina mediante ELISA, como se describe generalmente en E.A. Bayer y M. Wilchek, Methods of Enzimology, Vol. 184 (1990), págs. 49-51. En resumen, para este procedimiento, se recubrieron placas Stripwell de inmunoanálisis ELISA (asequibles de Nunc Maxisorp) con estreptavidina (asequible de Zymed) a 1 \mug/ml en PBS y luego se incubaron en un entorno sin aspiración con las concentraciones indicadas de Pn 14 biotinilado o Pn 14 de control. Después se utilizó un anti-Pn 14 monoclonal para someter a ensayo la unión del Pn 14 a las placas recubiertas con estreptavidina.

La siguiente tabla ilustra los resultados del ensayo.

TABLA 2 Análisis de absorbancia ELISA de Pn 14-Biotina o Pn 14 en placas recubiertas con estreptavidina (resultados del ensayo en 10 minutos)

7

	Anticuerpo Primario: Anti-Pn 14 monoclonal a 1:2.000
	Anticuerpo Secundario: IgG-3 anti-ratón de Conejo-HRP
	Sustrato: TMB
	Bloqueo: Ninguno

Como resulta evidente a partir de estos resultados de análisis, el Pn 14 de control no marcado no se unía a las placas de ELISA recubiertas con estreptavidina, como indicaba el nivel de fondo de la absorbancia. Las muestras de producto conjugado, sin embargo, se unían a las placas de manera que se pudieran desprender, incluso a concentraciones tan bajas como 1 ng/ml. Esto indica que las Muestras 10A y 10B contenían Pn 14 marcado con biotina.

Muestra 10C

Para esta Muestra, se sintetizó una vacuna de producto conjugado clínicamente relevante en la que se acoplaba toxoide del tétanos a polisacárido Pn 14 con un espaciador. Para este procedimiento, se utilizó la sustancia NH_{2}/TSTU/Pn 14 producida en la Muestra 10A. El procedimiento de la reacción de acoplamiento, que es el mismo procedimiento de acoplamiento general descrito en A. Lees, y col., Vaccine, Vol. 12, Núm. 13, (1994), págs. 1160-1166, descrito antes, se llevó a cabo como sigue.

Para este procedimiento de acoplamiento, se combinaron 100 \mul de HEPES 0,75 M, EDTA 10 mM a pH 7,3, y 75 \mul de yodoacetato de N-hidroxisuccinimida 0,1 M ("SIA", asequible de BioAffinty Systems) en DMF con 1,66 mg de la sustancia NH_{2}/TSTU/Pn 14 presente en 1,15 ml de solución salina. Esta reacción producía un producto de reacción de Pn 14 yodoacetilado (Pn 14-SIA).

En un procedimiento separado, se mezclaron 3 mg de toxoide del tétanos, a una concentración de 16,8 mg/ml en solución salina (correspondiente a 180 \mul de solución), con 100 \mul de HE y 6 \mul de S-acetiltioacetato de N-succinimidilo ("SATA", asequible de BioAffinity Systems) en DMF. Esta reacción producía una proteína del tétanos con tioles protegidos "TT-SATA").

Al cabo de tres horas, se extrajeron las sales de los productos de reacción anteriores en una columna de 1 x 15 cm P6DG (de BioRad), equilibrada en PBS para el producto de toxoide del tétanos y equilibrada en solución salina para el producto de Pn 14. Los volúmenes no válidos de cada fracción se concentraron (por separado) en un dispositivo Centricon 30 (asequible de Amicon).

En este momento, se combinaron 125 \mul de producto de reacción TT-SATA con aproximadamente 300 \mul del producto de reacción Pn 14-SIA y 50 \mul de 5 x HE e hidroxilamina 0,5 M. La reacción se dejó proseguir durante la noche. Después, la reacción se sofocó añadiendo 10 \mul de mercaptoetanol 10 mM ("BME") y se dejó estar durante una hora. Luego, se añadieron 10 \mul de yodoacetamida 0,5 M, y esta mezcla se dejó estar durante 10 minutos. La mezcla de reacción resultante se hizo pasar por una columna de filtración en gel S400HR (asequible de Pharmacia) (1 x 50 cm, equilibrada en PBS, 0,25 ml/minuto, aproximadamente 1 ml/tubo), y se obtuvo una fracción de volumen no válido. Se encontró que el producto conjugado resultante tenía aproximadamente 1,5 mg de toxoide del tétanos por mg de Pn 14.

Muestra 10D

Para esta Muestra, se acopló una proteína de toxoide del tétanos directamente a un polisacárido Pn 14 utilizando TNTU como agente activante. Por lo tanto, esta Muestra demuestra que se puede producir un producto conjugado de proteína/polisacárido clínicamente relevante utilizando un agente activante de TNTU.

Primero, se mezclaron un polisacárido Pn 14 y una proteína de toxoide del tétanos en solución salina, cada uno a una concentración de aproximadamente 6,3 mg/ml. Después, a t = 0, se añadieron 24 \mul de TNTU 0,5 M en NMP a la mezcla. Luego se añadieron 12 \mul de TEA 1M. En el momento t = 1 minuto, se añadieron 6 \mul más de TEA 1M a la mezcla.

En el momento t = 75 minutos, se sofocó la reacción añadiendo 150 \mul de glicina 1 M (pH 8). La mezcla se fraccionó en una columna S400HR (equilibrada en PBS), y se reunió la fracción de elevado peso molecular, se sometió a filtración en condiciones estériles, y se analizó. Se encontró que la sustancia producto conjugado resultante contenía 0,44 mg de toxoide del tétanos por mg de Pn 14.

Además de demostrar que el agente activante de sal de uronio TNTU puede ser utilizado para producir un producto conjugado clínicamente relevante, este Ejemplo demuestra que la etapa de activación y la etapa de acoplamiento pueden tener lugar en un procedimiento de una etapa. Notablemente, en el procedimiento de este Ejemplo, la proteína y el polisacárido se mezclan entre sí primero, y después se añade a la mezcla el reactivo activante (TNTU). A medida que el polisacárido es activado por el reactivo activante, la proteína se encuentra inmediatamente disponible para el acoplamiento en un procedimiento de una etapa conveniente.

Ejemplo 11

En este Ejemplo, se sometió a ensayo la inmunogenicidad de ciertos productos conjugados producidos utilizando los agentes activadores de uronio.

Muestra 11A

Para comenzar el procedimiento de preparación del producto conjugado, se mezclaron entre sí 2,5 mg de polisacárido Pn 14 y 2,5 mg de proteína de toxoide del tétanos en un volumen total de 350 \mul. E el momento t = 0, se añadieron 24 \mul de TNTU 0,5 M (en NMP), y después se añadieron 12 \mul de TEA 1 M (en NMP). En el momento t = 1 minuto, se añadieron 6 \mul adicionales de TEA 1 M.

La reacción se sofocó en el momento t = 75 minutos añadiendo 150 \mul de glicina 1 M (pH = 8). La mezcla de reacción se hizo pasar por una columna de filtración en gel S400HR, equilibrada en PBS (se reunieron las fracciones de elevado peso molecular, se sometieron a filtración en condiciones estériles, y se analizaron. Se determinó que el producto conjugado resultante tenía 0,44 mg de TT/mg de Pn 14.

Muestra 11B

Para esta Muestra, se utilizó el producto conjugado toxoide del tétanos-SATA-SIA-NH_{2}/TSTU/Pn 14 preparado en el Ejemplo 10C. Como se ha observado antes, se encontró que este producto conjugado incluía 1,5 mg de TT/mg de Pn 14.

Datos de inmunogenicidad

Se utilizaron la Muestra 11A y la Muestra 11B en un modelo de ratón para someter a ensayo la inmunogenicidad de los productos conjugados resultantes. Se trataron tres grupos de ratones (que tenían cuatro ratones por grupo) con diversos inmunógenos diferentes. Un grupo de ratones se trató con la Muestra 11A de producto conjugado para vacuna, un grupo con la Muestra 11B de producto conjugado para vacuna, y un grupo con Pn 14 solo. El día 0 cada ratón fue vacunado con una dosis cebadora del respectivo inmunógeno (cada inmunógeno contenía 5 \mug de Pn 14, ya estuviera presente solo o como parte del producto conjugado). El día 14, cada ratón recibió una inmunización de refuerzo utilizando el mismo inmunógeno. Los ratones fueron desangrados el Día 28. Los sueros de los ratones del grupo fueron reunidos, y se tituló la IgG anti-Pn 14 dando los siguientes resultados:

TABLA 3

Producto Conjugado	Título IgG anti-Pn 14
Muestra 11A	72.900
Muestra 11B	110.284
Solo Pn 14	326

Como se demostró mediante estos resultados de ensayo, las dos Muestras elaboradas según la invención, utilizando sales de uronio, inducían excelentes respuestas inmunogénicas en los ratones del grupo. Como se esperaba, el Pn 14 solo inducía una respuesta inmunogénica pequeña.

Ejemplo 12

Para este ejemplo, se investigaron las propiedades inmunológicas y bactericidas de un producto conjugado producido según el procedimiento de la invención. En este caso, se preparó un producto conjugado de toxoide del tétanos/PsC de Neisseria utilizando TNTU como agente activador.

Primero, se añadieron 4 mg de solución de toxoide del tétanos (que tenía una concentración de 19,8 mg/ml) a 0,4 ml de PsC de Neisseria (que tenía una concentración de 10 mg/ml en solución salina). La sustancia de toxoide del tétanos fue obtenida de Mass Public Health Labs. En el momento t = 0, se añadieron 50 \mul de TNTU 0,3 M (en NMP) a la mezcla de proteína y polisacárido. Después de eso, se añadieron 25 \mul de TEA 2 M (en NMP).

La reacción prosiguió durante la noche a 4ºC. Después, la mezcla se hizo pasar por una columna de filtración en gel S400HR (Pharmacia), equilibrada con PBS. Las fracciones de elevado peso molecular se reunieron y se sometieron a filtración en condiciones estériles haciendo pasar la mezcla a través de un dispositivo Millex GV (asequible de Millipore Corp.). Se determinó que el producto conjugado resultante contenía 0,29 mg de TT/mg de PsC de Neisseria.

Esta sustancia producto conjugado fue utilizada después en un modelo de ratón para someter a ensayo la inmunogenicidad de los productos conjugados resultantes. Cada uno de los cuatro ratones fue vacunado con una dosis cebadora del producto conjugado que contenía 2,5 \mug de PsC de Neisseria en Día 0. El Día 14, cada ratón recibió una inmunización de refuerzo del producto conjugado en la misma cantidad. Los ratones fueron desangrados el Día 28. Los sueros de los ratones fueron reunidos y analizados mediante ELISA (punto final DO 0,1) en cuanto a los anticuerpos anti-PsC. Adicionalmente, se realizó un análisis bactericida según el procedimiento descrito en K.H. Wong, y col., Journal of Biological Standards, Vol. 5 (1977), comenzando en la página 197. Se obtuvieron los siguientes resultados de ensayo.

Título de IgG anti-PsC = 31.019

Título bactericida = 1:320

Como resulta evidente a partir de estos datos, el producto conjugado producido según la invención inducía respuestas inmunológicas excelentes en los ratones del grupo. Adicionalmente, se inducía un excelente efecto bactericida por medio de los productos conjugados producidos según la invención (un título bactericida mayor de 1:40 es considerado típicamente protector).

En una vacuna, inmunógeno, u otro reactivo inmunológico, terapéutico o de diagnóstico, los productos conjugados producidos según la invención pueden ser combinados con un medio o vehículo de liberación farmacéuticamente aceptable mediante mecanismos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Tales vacunas y reactivos contendrán una cantidad eficaz del producto conjugado producido según la invención, junto con una cantidad adecuada de vehículo, con el fin de proporcionar la forma de administración apropiada para un sujeto u otro uso pretendido. En las vacunas se pueden incluir alumbre u otros coadyuvantes.

Entre los medios o vehículos farmacéuticamente ejemplares se incluyen por ejemplo, líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal, o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. La solución salina es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Asimismo se puede emplear soluciones de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, concretamente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences.

Al describir la invención, los solicitantes han demostrado ciertas teorías en un esfuerzo para describir cómo y por qué la invención funciona de la manera que funciona. Estas teorías se exponen sólo con fines informativos. Los solicitantes no están sujetos a ningún mecanismo químico o físico o teoría de funcionamiento.

Adicionalmente, los solicitantes han descrito numerosos ejemplos y procedimientos para producir productos conjugados según la invención. Si bien estos procedimientos pueden ser optimizados adicionalmente (v.g., optimizando las condiciones de pH durante el acoplamiento), semejante optimización del procedimiento y de las condiciones de reacción es un asunto de experimentación rutinaria.

Lista de Marcas Registradas utilizadas en esta solicitud

FICOLL

T200 DEXTRANO

COOMASSIE PLUS

CENTRICON

COVALINK

Claims (20)

1. Un método de producción de una vacuna de producto conjugado, que comprende:

mezclar un reactivo de sal de uronio con un primer radical seleccionado entre polisacáridos, donde el reactivo de sal de uronio tiene una estructura química que corresponde a la fórmula I:

8

donde:

R^{1} se define como 9 donde R^{6} representa los átomos de carbono, átomos de hidrógeno, y opcionalmente uno o más heteroátomos, que, junto con el átomo de nitrógeno al que están anclados, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros, que puede estar sustituido o no sustituido;

donde R^{2} y R^{3} se definen como sigue:

R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido; o

R^{2} y R^{3}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrógeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros puede estar sustituido o no sustituido;

donde R^{4} y R^{5} se definen como sigue:

R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono;

R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, un alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido, o un alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono; o

R^{4} y R^{5}, cuando se toman juntos, representan los átomos de carbono, hidrogeno, azufre, nitrógeno, u oxígeno necesarios para completar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros con el átomo de nitrógeno al cual están anclados, donde el anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros puede estar sustituido o no sustituido; y

X^{-} representa un anión ácido; y

mezclar un segundo radical con el primer radical, donde el segundo radical se selecciona de grupo de proteínas, péptidos, lipoproteínas, haptenos, y carbohidratos, con lo que el primer radical y el segundo radical reaccionan para formar la vacuna de producto conjugado.

2. Un método según la reivindicación 1, donde el grupo 10 es un miembro seleccionado del grupo formado por:

11

3. Un método según la reivindicación 1, donde el reactivo de sal de uronio se mezcla con el primer radical antes de mezclar el segundo radical con el primer radical, donde se inicia una reacción entre el reactivo de sal de uronio y el primer radical.

4. Un método según la reivindicación 3, donde el primer radical es un polisacárido en solución.

5. Un método según la reivindicación 4, que incluye adicionalmente la etapa de aislar un producto de la reacción entre el reactivo de sal de uronio y el polisacárido antes de mezclar el segundo radical con el producto.

6. Un método según la reivindicación 3, donde el reactivo de sal de uronio se mezcla con el primer radical al menos dos veces antes de mezclar el segundo radical con el primer radical.

7. Un método según la reivindicación 1, donde el segundo radical se mezcla con el primer radical antes de mezclar el reactivo de sal de uronio con el primer radical.

8. Un método según la reivindicación 1, donde el segundo radical se mezcla con el primer radical a la vez que el reactivo de sal de uronio se mezcla con el primer radical.

9. Un método según la reivindicación 1, donde el reactivo de sal de uronio se mezcla con el primer radical al menos dos veces diferentes.

10. Un método según la reivindicación 1, donde el anión ácido es un anión seleccionado del grupo formado por Cl^{-}, Br^{-}, F^{-}, I^{-}, PF_{6}^{-}, y BF_{4}^{-}.

11. Un método según la reivindicación 1, donde el reactivo de sal de uronio es un miembro seleccionado del grupo de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio; y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

12. Un método según la reivindicación 1, donde el primer radical es un polisacárido en solución.

13. Un método según la reivindicación 12, donde el polisacárido contiene al menos un grupo carboxilo.

14. Un método según la reivindicación 1, donde el primer radical es un polisacárido seleccionado del grupo del polisacárido de tipo C de Neisseria meningitidis, el polisacárido de Haemophilus influenza, el polisacárido Pneumocócico, dextrano y dextrano carboxilado.

15. Un método según la reivindicación 1, donde el primer radical es un polisacárido, incluyendo el método adicionalmente la etapa de carboxilar el polisacárido antes de mezclar el reactivo de sal de uronio y antes de mezclar el segundo radical.

16. Un método según la reivindicación 15, donde el polisacárido es activado haciéndolo reaccionar con un reactivo seleccionado del grupo de CNBr, CDAP, y un reactivo de vinilsulfona, y después carboxilado.

17. Un método según la reivindicación 12, donde el segundo radical es una proteína.

18. Un método según la reivindicación 12, donde el reactivo de sal de uronio es un miembro seleccionado del grupo de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio; y tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

19. Un método según la reivindicación 1, donde el primer radical incluye al menos un grupo carboxilo.

20. Un método según la reivindicación 1, donde el primer radical incluye al menos un grupo hidroxilo.