JPH0649100A - カルボキシル化基体への化合物の結合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 各種の分析、診断及び医学上の用途に有用で
あり、かつ各種のイムノアッセイに用いることができる
反応方法を提供することが本発明の目的である。 【構成】 本発明方法は、生物学的活性化合物を水不溶
性カルボキシル化基体と反応させる方法であって、前記
方法は、Ａ．反応性カルボキシル基を有する水不溶性基
体をある特定の２−（Ｎ−複素環式オキシ）ウロニウム
塩と接触させ、次いで、Ｂ．活性基を有する基体を、反
応性アミノ基又はスルフィドリル基を有する生物学的活
性化合物と接触させて、基体と生物学的活性化合物の間
に共有結合を形成することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウロニウム塩活性剤を
用いる、カルボキシル化基体、特に水不溶性基体からの
試薬を調製するための方法及びキットに関する。本発明
は、診断化学の分野において特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】生物学的活性タンパク又は他の分子は、
ある場合には水不溶性キヤリアに結合させる。得られる
試薬は、徴候の指標となる免疫学的目標種の検出のため
の免疫学的原理を用いるヒト及び動物の病理学的症状又
は他の症状（例えば、妊娠）の診断に有用である。ほと
んどの場合、免疫学的目標種は抗原、又は抗原物質に対
し特異的な抗体である。

【０００３】反応性スルフィドリル基又はアミノ基を有
する他の生物学的化合物をポリマー性粒子又は他の物質
に結合させて、アフィニティクロマトグラフィ、酵素反
応、精製操作、核酸捕捉及び特異的結合アッセイ並びに
イムアッセイに用いてきた。磁性粒子、ラテックス粒
子、赤血球、細菌性細胞及び他の微少物質が前記方法に
おいてキヤリア物質として用いられている。

【０００４】カルボキシル化ラテックス粒子は、例えば
米国特許第４，１８１，６３６号明細書に記載されてい
るように、診断用試薬を調製するのに用いられている。
抗体をかかる粒子に結合させる通常の方法のほとんどは
水溶性カルボジイミドを用いる。この方法では、有用な
試薬が調製されるが、粒子上のカルボキシル基と同様に
抗体の露光された反応性基を活性化する傾向がある。そ
の結果、抗体の分子内及び分子間架橋又は重合がおこ
る。そのため相当部分の抗体について、対応する抗原と
の複合体形成が弱められることになる。抗体（そして多
くの他の生物学的種）は比較的高価であるので、この問
題は深刻な経済上の損失となる。カルボジイミドの使用
は、更に最近発見された操作と比べて不十分である。

【０００５】ヨーロッパ特許第０ ３０８ ２３５号公
報は、生物学的活性化合物をカルボキシル化粒子に結合
するのにカルバモイロニウム化合物の使用について記載
している。この方法は、カルボジイミドの使用と比べ、
効率はかなり改良されるが、ある場合には、カルバモイ
ロニウム化合物が、強求核性のアミン副生成物を生成
し、これが粒子上の活性部位に結合すべき化合物と競合
するので、更に改良する必要があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】更に最近、ある種の１
−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウム塩で
は、カルバモイロニウム化合物とのアミン副生成物の形
成が回避され、そしてそれらにより、所望化合物は高レ
ベルの共有結合で粒子に結合され、その結合化合物（例
えば、抗体）によっても活性は高く保持されることが判
明した。しかしながら、かかるピリジニウム塩は市販さ
れておらず、これらの化合物を工業的規模で製造するこ
とには問題があるであろう。これらの塩は吸湿性であ
り、したがって湿気を遮断して貯蔵しなければならず、
製造上の困難性がある。生成物を常に乾燥した状態に保
持するための有効な製造方法を試みると製造コストが増
加することになるであろう。

【０００７】極めて競争の激しい診断具の市場では、試
薬コストを低減して得られた方法及び試験キットが経済
的にたちうちできるようにすることが急務である。しか
しながら、カルボキシル化粒子への化合物の結合効率の
高揚又は試薬安定性のいずれかを断念して、前記の経済
上の利点を得ることはできない。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記の課題は、（１）反
応性カルボキシル基を有する基体、及び（２）構造：

【０００９】

【化３】

【００１０】前記式中、Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は独立
して水素、炭素原子数１〜６個のアルキル、炭素原子数
２〜６個のアルケニルもしくは炭素原子数２〜６個のア
ルキニルであるか、又はＲとＲ¹ は一緒になって、もし
くはＲ² とＲ³ は一緒になって、それらが結合している
窒素原子と共に５〜７員の複素環式環を完成するのに必
要な炭素原子、イオウ原子、窒素原子及び酸素原子を表
すか、又はＲ¹ とＲ³ は一緒になって、それらが結合し
ているウロニウム基と共に５〜７員の複素環式環を完成
するのに必要な炭素原子、イオウ原子、窒素原子及び酸
素原子を表し、Ｒ⁴ は、オキシ基に結合した窒素原子と
一緒になって、５〜１０員の複素環式環を完成するのに
十分である炭素原子及びヘテロ原子を表し、そしてＸ^-
は酸アニオンを表す、により表される２−（Ｎ−複素環
式オキシ）ウロニウム塩からなるキットを用いることに
より克服される。

【００１１】本発明は、また生物学的活性化合物のカル
ボキシル化基体との反応方法を提供し、前記方法は、 Ａ．前記のように反応性カルボキシル基を有する基体を
２−（Ｎ−ヘテロシクロオキシ）ウロニウム塩と接触さ
せ、そして Ｂ．活性基を有する基体を、反応性アミノ又はスルフィ
ドリル基を有する生物学的活性化合物と接触させて基体
と生物学的活性化合物との間に共有結合を形成するこ
と、からなる。

【００１２】

【実施態様】本発明方法により製造した試薬は、多くの
各種化学操作及び生物学的操作に用いることができる。
例えば、これらはアフィニティクロマトグラフィ、酵素
触媒反応、水の精製、イムノアッセイ及び当業者に容易
に明らかな他のプロセスに用いることができる。ある場
合には、本発明は、生物学的化合物又は化学的化合物と
更に反応することができる中間結合置換基を結合するの
に用いることができる。

【００１３】カルボキシル化基体に結合させることがで
きる生物学的活性化合物又は結合置換基は、少なくとも
１個の反応性アミノ又はスルフィドリル基を有する。用
語「生物学的活性」とは、生理的液体中に見出される他
の成分と相互反応を行う能力を有する化合物又は分子を
意味する。かかる相互反応は、酵素の場合は触媒活性で
あってもよい。あるいは、抗体と抗原、糖とレクチン又
はアビジンとビオチン間のような特異的結合相互反応で
あってよい。

【００１４】好ましい実施態様では、例えば、表面カル
ボキシル基を有する水不溶性粒子の場合のように、基体
は水不溶性である。得られた試薬（例えば、粒子に結合
した化合物）は、凝集アッセイ、溶液競合アッセイ及び
乾式競合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び
イムノメトリック（又はサンドウィッチ）アッセイをは
じめとする各種イムノアッセイフォーマットに用いるこ
とができるが、これらに限定されない。

【００１５】本発明方法には最少以下の二工程が含まれ
る： （１）基体中のカルボキシル基を活性化して、基体中に
活性基を生成し、そして（２）その活性基を結合すべき
化合物中の反応性アミノ基又はスルフィドリル基と反応
させる。好ましい実施態様において用いられるものとし
て、水不溶性基体としては、生物学的活性化合物が結合
すべきカルボキシル化物質であって、任意の適切な形状
又は型のものが挙げられる。基体は、適切なポリマー、
ガラス、セラミックス、金属、磁気複合物又はこれらの
混合物から構成されてよい。

【００１６】好ましくは、カルボキシル化基体はカルボ
キシル化粒子である。これらの粒子は乳液重合又は懸濁
重合により得られるポリマー性ラテックス粒子である。
生物学的化合物が結合する際に、これらの粒子は界面活
性剤又はコロイド状懸濁剤を全く含まないことが更に好
ましい。このことは、ポリマー懸濁液又はラテックスの
長期間の透析又は他の精製により一般に達成することが
できる。しかしながら、界面活性剤又はコロイド状懸濁
剤を用いることなくポリマー粒子を調製するのが最も好
ましく、こうすれば、結合中に全く混入しないことが確
かだからである。

【００１７】水不溶性粒子は一般に０．０１〜１００μ
m の範囲、好ましくは０．１〜１０μm の範囲の粒子サ
イズを有する。これらの粒子は、同一の物質から全体が
構成されているという意味で均一粒子であってよく、ま
たこれらの粒子は複合物、コア−シエル粒子又は他の物
質を塗布したものもしくはグラフトしたものであってよ
い。

【００１８】これらの粒子は表面カルボキシル基を有
し、カルボキシル基は多くの従来法により導入すること
ができる。ガラス粒子を、例えば、カルボキシアルキル
基を有するオルガノシロキサン（ゾルゲルガラスを製造
するのに用いられる従来のオルガノシロキサンと類似
の）を用いて処理すると表面カルボキシ基が得られる。
コア−シエル粒子及びグラフトポリマー粒子は、反応性
カルボキシル基を与えるモノマーを用いて、当該技術分
野において知られているようにして得ることができる。
あるいは、粒子は、更に反応させるとカルボキシル基に
転化することができる基（例えば、無水物の加水分解又
はメチロール基もしくはアルデヒド基の酸化）を有する
モノマーから製造することができる。

【００１９】有用なカルボキシル化粒子は、カルボキシ
ル化スチレン及びその誘導体、カルボキシル化スチレン
−ブタジエンコポリマー、アクリル酸及びメタクリル
酸、イタコン酸並びに他のエチレン系不飽和カルボン酸
対応塩及び無水物のホモポリマーから製造することがで
きる。好ましくは、粒子は、 ａ）０．１〜１００モル％の、カルボキシル基（又は対
応塩又は無水物前駆体）を有するエチレン系不飽和重合
性モノマー、及び ｂ）０〜９９．９モル％の、カルボキシル基を有しない
エチレン系不飽和重合性モノマー、からの付加重合によ
り得られるポリマーから製造される。

【００２０】成分（ａ）が得られるモノマーとしては、
アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニット
酸、フマル酸、マレイン酸、β−カルボキシエチルアク
リレート、β−カルボキシエチルメタクリレート、ｍ＆
ｐ−カルボキシメチルスチレン、メタクリルアミドヘキ
サン酸及びＮ−（２−カルボキシ−１，１−ジメチルエ
チル）アクリルアミド又はその塩もくしは無水物前駆体
が挙げられるが、これらに限らない。

【００２１】成分（ｂ）が得られるモノマーは、単独重
合した際、水不溶性、疎水性ポリマーを与えるものであ
り、ビニル芳香族（モノビニル化合物及びジビニル化合
物の両者、例えば、スチレン、ビニルトルエン、４−ｔ
−ブチルスチレン、２−クロロメチルスチレン及びジビ
ニルベンゼン）、アクリル酸エステル、メタクリル酸エ
ステル及びアミド（例えば、メチルアクリレート、エチ
ルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、２−エチル
ヘキシルメタクリレート、メチルメタクリレート、２−
ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリルアミド、
エチレンジメタクリレート及び２−ヒドロキシエチルア
クリレート）、ｐ−スチレンスルホネート、アクリロニ
トリル、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスル
ホン酸ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンス
ルホン酸ナトリウム及び当業者に容易に明らかである他
の物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましく
は、成分（ｂ）は１種又はそれ以上のビニル芳香族モノ
マーから誘導される。

【００２２】好ましくは、前記のコポリマーは１〜約２
０モル％の成分（ａ）及び８０〜９９モル％の成分
（ｂ）を有する。特に有用なカルボキシル含有モノマー
はヨーロッパ特許第０ ４６６ ２２０号公報に詳細に
記載されている。これらのモノマーは一般に以下の構造
により表される： ＣＨ₂ ＝ＣＲ′−Ｌ−ＣＯＯＭ 前記式中、Ｒ′は水素、ハロ又は炭素原子数１〜３個の
アルキルであり、Ｍは水素、アンモニウムイオン又はア
ルカリ金属イオンであり、Ｌは、結合鎖中に８〜５０個
の炭素、窒素、酸素又はイオウ原子を有する二価の有機
性結合基である。

【００２３】本明細書において述べたカルボキシル化粒
子は、本発明に用いる水溶液に懸濁することができる乾
燥粉末として供給することができる。特定のウロニウム
塩が本発明において有用である。これらの化合物は以下
の構造により表される：

【００２４】

【化４】

【００２５】前記式中、Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は独立
して水素、炭素原子数１〜６個の置換もしくは非置換の
アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ
−ブチル、ヘキシル、クロロメチル及びメトキシメチ
ル）、炭素原子数２〜６個の置換もしくは非置換のアル
ケニル（例えば、エテニル、アリル、１−プロペン−２
−イル２−ヘキセン−１−イル、３−メチル−１−ペン
テン−１−イル）、又は炭素原子数２〜６個のアルキニ
ル（例えば、２−プロピン−１−イル、２−ヘキシン−
１−イル又は２−エチル−３−ブチル−１−イル）であ
るか、又は、ＲとＲ¹ は一緒になって、もしくはＲ² と
Ｒ³ は一緒になって、それらが結合している窒素原子と
共に５〜７員の複素環式環（例えば、ピペリジン又はピ
ペリジニウム、ピロリジン又はピロリジニウム、モルホ
リン又はモルホリニウム、ピペラジン又はピペラジニウ
ム、４−メチルピペラジン又は４−メチルピペラジニウ
ム、及びヘキサヒドロアゼピン又はヘキサヒドロアゼピ
ニウム環）を完成するのに必要な炭素、イオウ、窒素及
び酸素原子を表す。分子上のこれらの環は同一であって
も異なっていてもよい。

【００２６】Ｒ¹ とＲ³ はまた、一緒になって、それら
が結合しているウロニウム基と共に５〜７員の置換もし
くは非置換の複素環式環（例えば、イミダゾリウム、ピ
リミジニウム、トリアゾニウム及びアゼピニウム環を完
成するのに必要な炭素、イオウ、窒素及び酸素原子を表
してもよい。好ましくは、Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は同
一の一価の基であるか、又は分子が対称となるように、
ＲとＲ¹ は一緒になって、Ｒ² とＲ³ が一緒になって形
成するものと同一の複素環式環を形成する。更に好まし
くは、Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ ³ は各々水素、炭素原子数
１〜３個のアルキル又は炭素原子数２〜４個のアルケニ
ルであり、最も好ましくは各々はメチルである。

【００２７】前記の複素環式環は、本発明方法における
化合物のカルボキシル基活性化能に悪影響を与えない任
意の位置に１個又はそれ以上の置換基を有していてもよ
い。例えば、これらの環は、１個又はそれ以上の、炭素
原子数６個までのアルキル基（例えば、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ヘキシル及び２−メトキシプロピ
ル）ハロ（例えば、クロロ又はブロモ）及び炭素原子数
６個までのアルコキシ（例えば、メトキシ、プロポキ
シ、イソブトキシ、２−メトキシプロポキシ及びヘキソ
キシ）で置換されていてもよい。

【００２８】前記構造において、Ｒ⁴ は、オキソ基に結
合した窒素原子と一緒になって５〜１０員の複素環式環
を完成するのに十分な炭素及びヘテロ原子（例えば、イ
オウ、酸素又は窒素）を表す。かかる複素環式環は置換
又は非置換であり、そして、１−ベンゾトリアゾリル、
スクシンイミド、１−イミダゾリル、２−イミダゾリジ
ノン−１−イル、モルホリノ、ピリジル、チアゾリル、
ベンゾチアゾリル、キノリル、ピペリジル、ピペラジニ
ル、ピロリル、ピラジニル、ピリミジニル及びピリジジ
ニルが挙げられるが、これらに限定されない。かかる環
は１個又はそれ以上の、低級アルキル（メチル、エチ
ル、イソプロピル又はブチル）、オキソ、ハロ（例えば
クロロ）、低級アルコキシ（例えば、メトキシ、プロポ
キシ、イソブトキシ及びエトキシ）で置換されていても
よい。

【００２９】前記の構造ではまた、Ｘ^- は、分子内塩を
形成するのに必要な化合物のアニオン又はアニオン部分
を表す。代表的アニオンとしては、ハロゲン化物（例え
ば、塩化物、臭化物又はフッ化物）、テトラフルオロボ
レート、トリフレート、ナイトレート、サルフェート、
Ｐ−トルエンスルホネート、パークロレート、メトサル
フェート、ヒドロオキシド及びヘキサフルオロホスフェ
ートが挙げられるが、これらに限定されない。Ｘ^- はま
た複素環式環に結合したスルホネート又はアルキレンス
ルホネートであってよく、アルキレン部分は１〜６個の
炭素原子を有する。

【００３０】本発明の実施に有用な代表的活性剤として
は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イロキシ）
−１，１，−３，３−テトラメチルウロニウムテトラフ
ルオロボレート、２−（スクシンイミド−オキシ）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフル
オロボレート、２−（５−ノルボルネン−２，３−ジカ
ルボキシイミド）−１，１，３，３−テトラメチルウロ
ニウム テトラフルオロボレート、２−（２−ピラゾリ
ン−５−オン−１−イル）−１，１，３，３−テトラエ
チルウロニウムクロライド、２−（２−イミダゾリジノ
ン−１−イル）−１，１，３，３−テトラブチルウロニ
ウムｐ−トルエンスルホネート、２−（３−ベンゾチア
ゾリル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート、２−〔２−（１Ｈ）−キノロ
ン−１−イル〕−１，１，３，３−テトラメチルウロニ
ウム ヘキサフルオロホスフェート、１−〔（１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾール−１−イロキシ）（１−ピロリジニ
ル）メチレン〕ピロリジニウムテトラフルオロボレー
ト、１−〔１−ピペリジル）（スクシンイミドキシ）メ
チレン〕ピペリジニウムトリフレート、４−〔（モルホ
リノ）（１−ピロリジニルオキシ）−メチレン〕モルホ
リニウムクロライド、１−〔（４−メチル−１−ピペラ
ジニル）（４−メチル−１−ピペラジニルオキシ）メチ
レン〕−４−メチルピペラジニウム ブロマイド及び１
−〔（Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノ）（スクシンイミドキ
シ）メチレン〕ピロリジニウムヘキサフルオロホスフェ
ートが挙げられるが、これらに限定されない。

【００３１】ある実施態様において、本発明により製造
した試薬は、それらと組合わさったトレーサーを有する
ことができる。トレーサーは、試薬の検出を可能にする
検出可能種である。有用なトレーサーとしては、ラジオ
アイソトープ及び酵素であるが、それらに限定されな
い。特に有用なトレーサーは着色色素又は蛍光色素であ
る。トレーサーは任意の適切な形で試薬と組合わされ
る。例えば、結合した生物学的活性化合物（例えば、放
射線標識化部分又はオリゴヌクレオチド）と組合せるこ
とができる（例えば、共有結合又はイオン結合で）。あ
るいは，基体、例えば、水不溶性粒子の表面上又は水不
溶性粒子内に結合させる。蛍光性キレート又は着色色素
を既知技法を用いて粒子中に包含させることが特に望ま
しい。

【００３２】本発明の第一工程では、カルボキシル化粒
子は、適切なpH（３〜７）及び適切な温度（一般に１０
〜６０℃）でウロニウム塩活性剤により活性化される。
カルボキシル化基体が粒子である場合は、本方法に用い
る粒子固体のパーセントは一般に０．０１〜３０％であ
り、０．１〜１０％が好ましい。ウロニウム塩は一般に
基体上の全測定カルボン酸レベルに対して１：１〜２０
０：１のモル比で用い、好ましくは１０：１〜１００：
１である。この工程は２０分を要するかもしれない。

【００３３】活性化基体（例えば、粒子）を次に生物学
的に活性な化合物と接触させる（例えば、混合して）。
基体として粒子を用いる場合には、活性化粒子は一般に
０．０１〜３０％固体で存在し、そして生物学的活性化
合物については一般に基体に対する化合物の重量比は
１：１０００〜２：１の量存在する。この工程は、３〜
８の範囲のpH、及び１０〜５０℃の温度で２４時間行
う。

【００３４】カルボキシル化粒子及びウロニウム塩活性
剤は、キット中で別々のパッケージで提供してもよい。
他の物質、装置及び有用な試薬は必要に応じて包含する
ことができる。例えば、キットは結合すべき生物学的活
性化合物（例えば、抗体）も含んでもよい。以下の例で
は、すべての％は特に断らない限り重量％である。

【００３５】例１＆２ ポリマー粒子に結合したウシガ
ンマグロブリンを有する試薬の調製 これらの例は、本発明範囲内の２種の活性剤を用いて、
プロテインウシガンマグロブリンをカルボキシル化ポリ
マー粒子に結合せしめた試薬の調製方法を示すものであ
る。このプロテインは検出のために放射線標識化した。
「比較」試薬は、本発明範囲外の活性剤を用いて同様に
調製した。

【００３６】粒子は、ヨーロッパ特許第０ ４６６ ２
２０号（前出）公報に記載されている操作を用いて、２
種類の異なるポリマーから製造した： ポリマーＡ：ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベ
ンジルチオ）プロピオン酸〕（９７．５９：２．４１モ
ル比、１．３３μm 平均直径）、及び ポリマーＢ：ポリ〔スチレン−コ−モノメタクリロイル
ペンタ（オキシエチレン）フタレート〕９８．８１：
１．１９モル比、１．３μm 平均直径）。

【００３７】プロテインを結合するのに用いた活性剤
は： 例１：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イロキ
シ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラ
フルオロボレート、 例２：２−（スクシンイミドキシ）−１，１，３，３−
テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、及び 比較：１−（１−ピロリジニルカルボニル）−ピリジニ
ウムクロライド。

【００３８】ポリマーＡ粒子及びプロテインの最終懸濁
液は、２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液
（０．１モル濃度、pH５．５）中の粒子３０mg乾燥粒子
当り０．１３４mgの ³Ｈウシガンマグロブリンを含ん
だ。ポリマーＢ粒子及びプロテインの最終懸濁液は、同
一の緩衝液中の粒子３０mg乾燥量当り０．１６４mgの ³
Ｈウシガンマグロブリンを含んだ。各実験に用いた活性
剤の量は４５μmol であった。

【００３９】例１に用いた活性剤（１４４．５mg）を緩
衝液（４mL、１１２．５ミリモル濃度貯蔵溶液）に溶解
した。例２に用いた活性剤（１３５．５mg）を同一の緩
衝液（４mL、１１２．５ミリモル濃度貯蔵溶液）に溶解
した。比較活性剤（９５．９mg）もまた緩衝液（３mL、
１５０ミリモル濃度貯蔵溶液）に溶解した。次に後述の
懸濁液に、例１及び例２については活性剤を各々４００
μL 添加し、比較法では比較の活性剤溶液３００μL を
用いた。

【００４０】試薬懸濁液は、粒子（３０mg乾燥重量）を
大きなミクロフュージ管に加え、続いて緩衝液を加えて
１．５mLとすることにより調製した。得られた懸濁液を
１５分間、１４．０００rpm で遠心し、次いで上澄を捨
てた。緩衝液を各管に加えて最終容量を１mLとし、続い
て活性剤（前記の量）を添加した。次に、これらの管に
蓋をし、次いで１０分間室温で転倒型ミキサーで回転し
て、粒子上のカルボキシル基を活性化した。放射線標識
化プロテインの溶液（１０mg／mL、ポリマーＡとの反応
では１３．４μL 、ポリマーＢとの反応では１６．４μ
L ）を各管に添加し、続いて緩衝液を添加して最終容量
を１．５mLとした。これらの管に再び蓋をし、次いで２
４時間室温で回転して放射線標識化プロテインを粒子上
の活性化基に共有結合させた。ウシ血清アルブミン（２
５０μL 、１００mg／mL）を各管に添加することにより
プロテインの結合を止め、続いて蓋をした管を更に２０
時間室温で回転した。

【００４１】粒子に結合した放射線標識化プロテインの
量を、ａ）各懸濁液（１２５μL で２つ）の試料中の１
分間当りのカウントの総数（ＣＰＭ）、及びｂ）上澄液
１２５μL に残留するcpm を測定し、続いて２５０μL
のアリコットの除去後、残りの反応混合物を遠心分離に
かけて粒子に共有結合したプロテインの分画を測定する
ことにより測定した。各試料（総量２５０μL ）を緩衝
液（６５０μL 、０．１モル濃度）及びドデシル硫酸ナ
トリウム（脱イオン化蒸留水の１０％溶液１００μL ）
と混合した。得られた混合物を、４５°角度に載置した
回転ディスクを用いて３７℃で１６時間転倒回転するこ
とにより混合した。この処理により吸着プロテインは除
去されるが、共有結合したプロテインは除去されない。
結合プロテインの総量を測定するためのものと同様の操
作を用いて共有結合プロテインの量を測定した。

【００４２】粒子に結合した ³Ｈウシガンマグロブリン
の総量、それに共有結合した量、及びに共有結合プロテ
イン：総結合プロテインの比を表Ｉに示す。これらの結
果によれば、例１及び例２に用いた活性剤は、一般に比
較法に用いた活性剤と同様の結合効率があることを示し
ている。しかしながら、先に指摘したように、例１及び
例２に用いた活性剤は容易に入手できるが、比較の活性
剤はそうではない。従って、本発明方法では、比較法と
比べ有意に経済的な利点が得られる。

【００４３】

【表１】

【００４４】例３ 抗体を有する試薬の調製 本例は、本発明を実施して、本発明範囲内の活性剤を用
いる、チロキシンに対して特異的な抗体のポリマー粒子
への共有結合について実証する。本発明をまた、本発明
範囲外の方法により調製した“比較”試薬とも比較し
た。放射線標識化ウシガンマグロブリンの代わりに抗体
溶液（ポリマーＡについては３２．１μL 、ポリマーＢ
については３９．３μL 、４．１７mgプロテイン／mL）
を用いた他は、例１及び例２に述べた操作を用いて、抗
−チロキサンモノクロナール抗体（Beckman Instrument
s, Inc, ）を前記のポリマーＡ及びポリマーＢに共有結
合させた。ウシ血清アルブミンを用いて反応を止め、懸
濁液を遠心分離にかけ、上澄をデカンテーションし、次
いで粒子をホスフェート緩衝塩水溶液（１mL、pH７．
４）中に再懸濁させた。この工程を３回繰り返し、最終
時には固体を緩衝液（１．８mL）中に再懸濁し、次いで
メルチオレート保恒剤（０．０２％）を添加した。比較
実験を、例１及び例２に述べた比較法と同様にして実施
した。

【００４５】得られた試薬分散体中の活性抗体の相対量
を、試薬懸濁液の一連の希釈物（粒子に結合した抗体の
質量に基づいて１×１０^-7〜１×１０^-10 モル濃度の理
論的抗体結合部位）を一定濃度（５×１０^-11 モル濃
度）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化チロキシンと
混合するアッセイにより測定した。この標識化複合体
は、Kunst, Clin. Chem.３４（９）、１８３０〜１８３
３頁（１９８８）に記載された操作と同様に調製してい
る。この希釈液は、ウシ血清アルブミン（１％）及び８
−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩
（８．７×１０^-4モル濃度）を含有するホスフェート緩
衝塩水溶液中、室温で一定攪拌しながら約１時間インキ
ュベートした。遠心分離後、懸濁液中に残存するチロキ
シンのレベル量を測定し、３０％の標識化チロキシンを
結合するのに必要なチロキシン結合部位の濃度を算出し
た。結果を以下の表IIに要約する。

【００４６】これらのデータは、本発明の実施では、抗
体活性は高度に保持されたことを実証するものである。

【００４７】

【表２】

【００４８】例４ カルバマゼピンに特異的な抗体を有
する試薬 本例では、本発明を実施して、カルバマゼピンのイムノ
アッセイにおいて有用な試薬を調製した。本例ではま
た、本発明の範囲外の活性剤（“比較”）を用いて試薬
を調製する比較例もまた行った。試薬用粒子は、前記の
例１に述べたような操作を用いて、ポリ〔スチレン−コ
−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（９
７．５９：２．４１モル濃度比、１．２μm 平均直径）
から調製した。反応用の最終分散体は、２−（４−モル
ホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃度、pH
５．５）中の粒子の乾燥重量３０mg当り０．２５mgの抗
体を含有した。各活性剤は３０μmole量使用した。本発
明では活性剤、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾリルオキ
シ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラ
フルオロボレートを使用し、“比較”活性剤としては１
−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロラ
イドを使用して比較した。

【００４９】分散体は、ポリマー粒子懸濁液（３０mg乾
燥量）を、緩衝液（５００μL ）中、大きなミクロフェ
ージ管に投入することにより調製した。懸濁液を次に１
０分間１４，０００rpm で遠心分離し、次いで上澄を棄
捨した。緩衝液（７４７μL）及び活性剤緩衝液中に各
々調製した１１２．５ミリモル濃度貯蔵溶液２６７μL
）を次に管に添加した。これらの管に蓋をして次いで
室温で１０分間転倒回転した。カルバマゼピンに対して
特異的な抗体の溶液（２．５９mg／mL貯蔵溶液９７μL
）を各々の管に添加した。これらの管を次に４時間室
温で再び回転した。この反応を、ウシ血清アルブミン
（３００μL 、１００mgプロテイン／mL）を一晩、室温
で用いて止めた。過剰部分を前記の例３に述べたように
して除去した。

【００５０】得られた試薬分散体中の活性抗体の相対量
を、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸をアッセ
イから省いた他は、前記の例３に述べたものと同様のア
ッセイで測定した。５０％のカルバマゼピンレベルと結
合するのに必要なカルバマゼピン結合部位の濃度を算出
した。得られた結果は以下のとおりであった：

【００５１】５０％の標識が結合している場合の理論上
のカルバマゼピン結合部位（ミリモル濃度） 例３アッセイ ０．５１ 比較アッセイ ０．５９

【００５２】本例は、容易に使用できる活性剤を用い
て、抗体をポリマー粒子に効率よく結合させることがで
きることを実証するものである。

【００５３】

【発明の効果】本発明は、カルボキシル化物質、例え
ば、カルボキシル化粒子又は反応性カルボキシル基含有
薬品に、反応性アミン−又はスルフィドリル含有化合物
を迅速かつ極めて効率よく結合する手段を提供する。こ
の結合は、以下に述べるある一群のウロニウム塩を用い
て達成される。結合の高効率及び試薬の安定性が達成さ
れるばかりでなく、更に本明細書に述べた活性剤は容易
に入手できる。特に、好ましい化合物、２−（１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾロ）−１−イルオキシ）−１，１，３，３
−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートは市
販されている。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的活性化合物を水不溶性カルボキ
   シル化基体と反応させる方法であって、前記方法が、 Ａ．反応性カルボキシル基を有する水不溶性基体を、構
   造： 【化１】 前記式中、 Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は独立して水素、炭素原子数１
   〜６個のアルキル、炭素原子数２〜６個のアルケニルも
   しくは炭素原子数２〜６個のアルキニルであるか、又は
   ＲとＲ¹ は一緒になって、もしくはＲ² とＲ³ は一緒に
   なって、それらが結合している窒素原子と共に５〜７員
   の複素環式環を完成するのに必要な炭素原子、イオウ原
   子、窒素原子及び酸素原子を表すか、又はＲ¹ とＲ³ は
   一緒になって、それらが結合しているウロニウム基と共
   に５〜７員の複素環式環を完成するのに必要な炭素原
   子、イオウ原子、窒素原子及び酸素原子を表し、 Ｒ⁴ は、オキシ基に結合した窒素原子と一緒になって、
   ５〜１０員の複素環式環を完成するのに十分である炭素
   原子及びヘテロ原子を表し、そしてＸ^- は酸アニオンを
   表す、により表される２−（Ｎ−複素環式オキシ）ウロ
   ニウム塩と接触させ、次いでＢ．活性基を有する基体
   を、反応性アミノ又はスルヒドリル基を有する生物学的
   に活性な化合物と接触させて基体と生物学的に活性な化
   合物との間に共有結合を形成することを含む方法。
2. 【請求項２】 （１）反応性カルボキシル基を有する基
   体及び（２）構造： 【化２】 前記式中、 Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² 及びＲ³ は独立して水素、炭素原子数１
   〜６個のアルキル、炭素原子数２〜６個のアルケニルも
   しくは炭素原子数２〜６個のアルキニルであるか、又は
   ＲとＲ¹ は一緒になって、もしくはＲ² とＲ³ は一緒に
   なって、それらが結合している窒素原子と共に５〜７員
   の複素環式環を完成するのに必要な炭素原子、イオウ原
   子、窒素原子及び酸素原子を表すか、又はＲ¹ とＲ³ は
   一緒になって、それらが結合しているウロニウム基と共
   に５〜７員の複素環式環を完成するのに必要な炭素原
   子、イオウ原子、窒素原子及び酸素原子を表し、 Ｒ⁴ は、オキシ基に結合した窒素原子と一緒になって、
   ５〜１０員の複素環式環を完成するのに十分である炭素
   原子及びヘテロ原子を表し、そしてＸ^- は酸アニオンを
   表す、により表される２−（Ｎ−複素環式オキシ）ウロ
   ニウム塩、を含むキット。