JP2001091515A - 標識特異的結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】簡便で、かつ高感度な免疫クロマトグラフ法を
可能にする標識特異的結合体を提供すること。 【解決手段】水分散型高分子粒子を担体とし、該担体の
表面に被検物質に対する特異的結合物質と酵素が固定さ
れていると共に、アントラキノン誘導体及びアゾベンゼ
ン誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合
物が該担体に保持されてなる標識特異的結合体、該標識
特異的結合体を用いることを特徴とする免疫クロマトグ
ラフ法並びに該標識特異的結合体を含有した免疫クロマ
トグラフィー用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、簡便で、かつ高感
度な免疫クロマトグラフ法を可能にする標識特異的結合
体、及びそれを用いた免疫クロマトグラフ法、免疫クロ
マトグラフィー用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっている大腸菌Ｏ１５７を
はじめとする病原性微生物などの食品中や患者からの検
出は、多くの日数、煩雑な操作を要する場合がある。さ
らに、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。これらの診断には、標識化免疫測定法などの種
々の免疫測定法（イムノアッセイ）が好適に用いられて
いる。近年になり迅速かつ簡便にイムノアッセイが行え
る方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている
が、簡便性、感度などの点において十分なものが得られ
ていないのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便で、か
つ高感度な免疫クロマトグラフ法を可能にする標識特異
的結合体を提供することを目的とする。さらに、本発明
は、該標識特異的結合体を用いる簡便で、かつ高感度な
免疫クロマトグラフ法および該免疫クロマトグラフ法に
好適な免疫クロマトグラフィー用キットを提供すること
を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、〔１〕
水分散型高分子粒子を担体とし、該担体の表面に被検
物質に対する特異的結合物質と酵素が固定されていると
共に、アントラキノン誘導体およびアゾベンゼン誘導体
からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物が該担
体に保持されてなる標識特異的結合体、〔２〕 前記
〔１〕記載の標識特異的結合体を用いることを特徴とす
る免疫クロマトグラフ法、ならびに〔３〕 前記〔１〕
記載の標識特異的結合体を含有してなる免疫クロマトグ
ラフィー用キット、に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明の標識特異的結合体は、水
分散型高分子粒子を担体とし、該担体の表面に被検物質
に対する特異的結合物質と酵素が固定されていると共
に、アントラキノン誘導体およびアゾベンゼン誘導体か
らなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物が該担体
に保持されていることに１つの大きな特徴を有する。本
発明においては、これらの化合物を水分散型高分子粒子
からなる担体に保持させているため、該担体への抗体な
どの特異的結合物質や酵素の固定量を効率良く向上させ
ることができ、簡便で、かつ高感度な免疫クロマトグラ
フ法を可能にする。即ち、従来法で抗体などの特異的結
合物質や酵素の固定量を向上させようとすると、これら
を多量に使用する必要があったが、これらは高価であ
り、不利であった。しかし、本願ではアントラキノン誘
導体およびアゾベンゼン誘導体という安価なものを利用
することにより効率的に固定化量の向上が実現された点
に技術的な利点が認められる。

【０００６】アントラキノン誘導体は、アントラキノン
を骨格として有する化合物であればよく、より効果的に
特異的結合物質や酵素を固定させる観点から、さらにア
ミノ基を有する化合物が好ましい。かかるアミノ基は、
第１級アミンまたは第２級アミンを形成しうるアミノ基
であることが好ましい。前記アントラキノン誘導体とし
ては、例えば、下記式（１）〜（１９）：

【０００７】

【化１】

【０００８】

【化２】

【０００９】

【化３】

【００１０】で表される化合物が挙げられる。これらの
化合物のうち、Colour Index name 〔『染料便覧』、
（社）有機合成化学協会編、丸善（株）： ( )内は、
colour Index No.〕による名称は次の通りである。 式（２）：ソルベントバイオレット13 (CI60725) 式（３）：ソルベントバイオレット14 (CI61705) 式（４）：ソルベントブルー11 (CI61525) 式（５）：ソルベントブルー12 (CI62100) 式（６）：ソルベントグリーン３ (CI61565) 式（７）：ディスパースレッド４ (CI60755) 式（８）：ディスパースレッド９ (CI60505) 式（９）：ディスパースレッド11 (CI62015) 式（10）：ディスパースレッド15 (CI60710) 式（11）：ディスパースバイオレット１ (CI61100) 式（12）：ディスパースバイオレット４ (CI61105) 式（13）：ディスパースバイオレット８ (CI62030) 式（14）：ディスパースバイオレット11 (CI60700) 式（15）：ディスパースブルー１ (CI64500) 式（16）：ディスパースブルー３ (CI61505) 式（17）：ディスパースブルー７ (CI62500) 式（18）：ディスパースブルー26 (CI63305) 式（19）：ディスパースブルー27 (CI60767)

【００１１】アゾベンゼン誘導体は、アゾベンゼンを骨
格として有する化合物であればよく、より効果的に特異
的結合物質や酵素を固定させる観点から、さらにアミノ
基を有する化合物が好ましい。かかるアミノ基は、第１
級アミンまたは第２級アミンを形成しうるアミノ基であ
ることが好ましい。前記アゾベンゼン誘導体としては、
例えば、下記式（２０）〜（３０）：

【００１２】

【化４】

【００１３】

【化５】

【００１４】で表される化合物が挙げられる。これらの
化合物のうち、Colour Index name 〔『染料便覧』、
（社）有機合成化学協会編、丸善（株）： ( )内は、
colour Index No.〕による名称は次の通りである。 式（23）：ソルベントイエロー６ (CI11390) 式（24）：ソルベントオレンジ14 (CI26020) 式（25）：ソルベントブラウン３ (CI11360) 式（26）：ディスパースオレンジ１ (CI11080) 式（27）：ディスパースオレンジ３ (CI11005) 式（28）：ディスパースブラック１ (CI11365) 式（29）：ディスパースブラック２ (CI11255) 式（30）：ディスパースブラック29 (CI11260)

【００１５】前記アントラキノン誘導体およびアゾベン
ゼン誘導体は、担体である水分散型高分子粒子への導入
の容易性の観点から、水不溶性または水難溶性であるこ
とが好ましい。

【００１６】アントラキノン誘導体およびアゾベンゼン
誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物
の水分散型高分子粒子への導入は、例えば、水分散型高
分子粒子を懸濁または膨潤させるための溶剤に該化合物
を溶解した液と水分散型高分子粒子の水分散液とを混合
して該粒子内に該化合物と該溶剤とを吸収させたのち、
溶剤のみを水分散型高分子粒子から除去する方法；ある
いは水分散型高分子粒子を懸濁または膨潤させるための
溶剤に該化合物を溶解した液に水と乳化剤を添加して乳
化させたのち、得られた乳化液と水分散型高分子粒子の
水分散液とを混合する方法などが挙げられる。後者の方
法は、水分散型高分子粒子への前記化合物及び溶剤の吸
収速度が速くなるため、好適である。

【００１７】水分散型高分子粒子を懸濁または膨潤させ
るための溶剤は、水分散型高分子粒子がポリスチレン系
粒子である場合、トルエン、ベンゼンなどが好適であ
る。また、前記の乳化剤としては、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアニ
オン性界面活性剤、ポリオキシエチレンノニルフェニル
エーテル等のノニオン性界面活性剤等が好適に使用でき
る。

【００１８】水分散型高分子粒子に保持させるアントラ
キノン誘導体およびアゾベンゼン誘導体からなる群より
選ばれた少なくとも１種の化合物の保持量は、本発明の
効果が得られる量の観点から、水分散型高分子粒子の乾
燥重量１ｇあたり、好ましくは、０．０１ｇ以上であ
り、水分散型高分子粒子の分散安定性の観点から、好ま
しくは、１ｇ以下であることが望ましい。

【００１９】ここで、水分散型高分子粒子の「乾燥重
量」とは、一定量の水分散型高分子粒子を１２０℃で２
時間乾燥した後の重量をいう。また、ここで「保持」と
は、水分散型高分子粒子を水中に分散させた時に水相中
にその物質が実質的に溶けださないことであり、これは
目で見て水相に色が付いていないことから判断され得
る。そして、保持量とは水分散型高分子粒子の粒子内部
への吸着量や粒子表面への付着量など、水分散型高分子
粒子により保持されている化合物の総量を意味する。

【００２０】本発明において、アントラキノン誘導体や
アゾベンゼン誘導体を担体に保持させることにより担体
への抗体などの特異的結合物質や酵素の固定量が向上す
るのは、理由は定かではないが、粒子表面の荷電状態が
変化することにより、結合するタンパク質が粒子に近づ
きやすくなるためではないかと推定される。

【００２１】また、本発明によれば、容易に効率よく固
定量を向上させることができるので、従来法の場合と同
様の量を固定するのであれば、抗体などの特異的結合物
質や酵素の固定に際して、使用する抗体、酵素の使用量
がより少なくてすむという利点がある。

【００２２】本明細書において、「被検物質」とは、免
疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）によりサンドイ
ッチ免疫複合体を形成し得る物質であればよく、例え
ば、細菌（特に大腸菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色
ブドウ球菌等の病原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウ
イルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生
物またはそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒素、
あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原性ペ
プチド等が挙げられる。

【００２３】本発明の標識特異的結合体に用いられる担
体は、水分散型高分子粒子であり、かかる水分散型高分
子粒子は、該粒子表面に酵素および特異的結合物質を固
定させうる物質であればよい。

【００２４】前記水分散型高分子粒子は、不飽和二重結
合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって
調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレ
ン、プロピレンなどのオレフィン系単量体；酢酸ビニ
ル、塩化ビニルなどのビニル系単量体；スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体；
メタクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単量
体；ブタジエンなどのジエン系単量体などが挙げられ
る。

【００２５】水分散型高分子粒子は、上記単量体の単独
重合体や共重合体のほか、得られる粒子に官能基やイオ
ン性基を付与し、または粒子の水性媒体中での分散安定
性を高めるなどの目的で、改質用単量体を共重合するこ
ともできる。このような改質用単量体としては、例え
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸
エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ア
クリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホ
プロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジル
メタクリレートなどが挙げられる。

【００２６】また本発明においては、市販されている種
々の水分散型高分子粒子を用いてもよい。市販されてい
る水分散型高分子粒子としては、例えば、スチレンまた
はその誘導体、例えば、ｐ−クロロスチレンを単量体成
分とする単独重合体または共重合体、スチレン−ブタジ
エン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジエ
ン共重合体などの種々のスチレン共重合体からなるエマ
ルジョンなどが挙げられる。また、本発明においては、
（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその
誘導体を単量体成分とする単独重合体や、該単量体と
（メタ）アクリル酸メチルやエチル、グリシジル（メ
タ）アクリレートなどとの共重合体も用いられる。上述
したスチレンまたはその誘導体と、（メタ）アクリレー
トエステルまたはその誘導体との共重合体も用いられ
る。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、微結晶質セ
ルロースなども挙げられる。

【００２７】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用された標識特異的
結合体が、その使用時や保存時に融着、凝集を起こさな
いように、当該高分子粒子が所要のガラス転移点を有す
るように選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点
は、好ましくは１０℃以上、特に室温以上が好ましい。

【００２８】担体の粒子径は、得られた標識特異的結合
体の分散性、ならびに特異的結合物質などの該担体への
固定性の観点から、好ましくは３μｍ以下、さらに好ま
しくは２μｍ以下であり、得られた標識特異的結合体の
精製の容易性の観点から、好ましくは０．０１μｍ以
上、さらに好ましくは０．１μｍ以上である。

【００２９】標識特異的結合体中の特異的結合物質は、
被検物質と特異的に結合する物質であればよく、抗体、
抗原、ハプテン、オリゴヌクレオチド、エフェクター、
レセプター、酵素、酵素補助因子、酵素阻害剤などが例
示される。本発明においては、前記特異的結合物質は、
抗体、抗原、ハプテン、オリゴヌクレオチドなどが好ま
しい。前記特異的結合物質は、１種類であってもよく、
数種類の被検物質とそれぞれ特異的に結合する数種類の
特異的結合物質を混合して用いることもできる。

【００３０】抗原およびハプテンとしては、クラミジア
・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター
・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、ト
キソプラズマ・ゴンディ、ボレリアなどの各種微生物抗
原、マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、
ＨＢｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原およ
び前記抗原に由来するハプテンなどが挙げられる。

【００３１】抗体としては、モノクローナル抗体および
ポリクローナル抗体のいずれでもよい。具体的には、抗
大腸菌抗体、抗大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗
体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗
ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキ
シン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブ
ミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロ
ブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣ
Ｇ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ヘリコ
バクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ
抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ
抗体および抗ロタウイルス抗体などが挙げられる。

【００３２】オリゴヌクレオチドとしては、前記抗原と
して例示された、各種微生物、マイコプラズマ、各種ウ
イルス等に由来する核酸成分に相補的なオリゴヌクレオ
チドなどが挙げられる。

【００３３】酵素としては、公知の標識に用いられる任
意の酵素が挙げられる。具体的にはペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラー
ゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられる。好ま
しくはより高感度で安定な検出を達成することが可能な
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼである。かかる酵素は、単独でまたは
２種以上を混合して用いることができる。

【００３４】本発明においては、前記のようにアントラ
キノン誘導体やアゾベンゼン誘導体を保持した水分散型
高分子粒子に、特異的結合物質および酵素を固定させる
ことに特徴を有し、固定の方法としては、疎水結合（物
理的吸着）、イオン結合、共有結合などが利用できる。
安定性の観点から、共有結合により強力に固定すること
が好ましい。また、本発明においては、共有結合を介し
て結合させる際に、必要に応じて、特異的結合物質など
の当該高分子粒子上での自由度を高めるために、スペー
サー基を介在させることができる。

【００３５】水分散型高分子粒子に直接にまたはスペー
サー基を介して特異的結合物質および酵素を共有結合に
て結合させる方法としては、慣用の方法が挙げられる。
好適な方法としては、例えば、結合試薬として水溶性カ
ルボジイミドを用いる方法が挙げられる。例えば、アミ
ノアルキルカルボン酸をスペーサー基として用いる場合
であれば、水溶性カルボジイミドを用いて、アミノアル
キルカルボン酸を水分散性粒子に結合させ、次いで、当
該水分散型高分子粒子に結合したアミノアルキルカルボ
ン酸に水溶性カルボジイミドを用いて同様にして、特異
的結合物質および酵素を共有結合にて結合させることが
できる。

【００３６】かかる方法において用いる水溶性カルボジ
イミドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート等を挙げること
ができる。このような水溶性カルボジイミドを用いて、
スペーサー基を介するまたは直接的な、共有結合による
特異的結合物質および酵素の水分散型高分子粒子への結
合は、慣用の方法および条件により行なうことができ
る。

【００３７】標識特異的結合体中の特異的結合物質およ
び酵素の総固定量は、担体の乾燥重量１ｇあたり好まし
くは５〜２００ｍｇであり、その量は上記の範囲内で、
使用する特異的結合物質、酵素の種類などによって適宜
変更し得る。例えば、担体が水分散型高分子粒子の場
合、当該粒子の表面積に鑑みると、前記総固定量は、水
分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり２００ｍｇ以下
が好ましく、さらに好ましくは１５０ｍｇ以下であり、
被検物質の検出の迅速性、感度、再現性の観点から、５
ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上がさらに好ましい。

【００３８】本発明において、酵素量はその活性として
も表すことができる。勿論、固定される酵素の種類、そ
の基質、温度など種々の条件によって異なる。担体に固
定される酵素がペルオキシダーゼである場合には、活性
は以下の方法で測定する。基質である、ＴＭＢ（３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）０．２ｍｇ
／ｍｌと過酸化水素０．０１％とを含む０．１Ｍ−クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３．３ｍｌに、標識特異的結
合体０．０１２５％懸濁液を１００μｌ混合して、２５
℃で反応、５８０ｎｍの波長での吸光度を経時的に測定
し、１分間に当該吸光度を１増加させる酵素活性を１Ｕ
（ユニット）として換算する。

【００３９】酵素がペルオキシダーゼである場合、標識
特異的結合体が、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあ
たり、５，０００〜３００，０００Ｕ、好ましくは１
０，０００〜３００，０００Ｕ、より好ましくは５０，
０００〜３００，０００Ｕの酵素活性を有するように当
該酵素が固定されている事が望ましい。

【００４０】特異的結合物質が、抗体、抗原、ハプテン
である場合の固定量および酵素の固定量の測定は、色素
結合法等を用いて測定し、タンパク質の量として算出さ
れうる。特異的結合物質がオリゴヌクレオチドの場合
は、固定後の遊離のオリゴヌクレオチドを２６０ｎｍの
吸光度を測定することにより算出されうる。

【００４１】このように担体に特異的結合物質および酵
素を固定させた後、例えば膜分離法や濾過、遠心分離法
などの慣用の分離法によって、本発明の標識特異的結合
体を分離精製することができる。このようにして得られ
た本発明の標識特異的結合体は、水中に浸漬して保存し
てもよく、または凍結乾燥して保存してもよい。

【００４２】本発明の標識特異的結合体によれば、前記
したように、酵素の固定量が向上しているため、各種イ
ムノアッセイ、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、組織や細胞
の染色、免疫クロマトグラフ法などを簡便で、かつ高感
度で行なうことができる。

【００４３】本発明の免疫クロマトグラフ法は、前記標
識特異的結合体を用いることを１つの特徴とする。本発
明の免疫クロマトグラフ法は、標識特異的結合体を用い
るため、簡便で、かつ高感度な被検物質の検出を可能に
する。免疫クロマトグラフ法は、一般に以下のような工
程を含むが、かかる方法に限定されるものではない。す
なわち、被検物質に対する特異的結合物質を固定化した
固定相を有する吸水性基材からなる試験片の一端より、
該被検物質に対する他の特異的結合物質を有する標識特
異的結合体と被検液との混合物を吸収させて展開する
と、該混合物中で形成された複合体（標識特異的結合体
−被検物質）は固定相上に固定化された特異的結合物質
と結合して捕捉される。したがって、該固定相に結合し
た標識特異的結合体を測定することにより被検液中の被
検物質を測定することができる。この場合、固定相で捕
捉され形成される複合体の酵素反応により生じる産物を
測定することにより被検物質の検出を行なうことができ
る。

【００４４】本発明の免疫クロマトグラフィー用キット
は、前記免疫クロマトグラフ法に好適であり、標識特異
的結合体を含有することを１つの特徴とする。本発明の
キットは、前記標識特異的結合体を含有するため、簡便
で、かつ高感度な免疫クロマトグラフ法を可能にする。
前記キットには、さらに、緩衝液、発色基質溶液などの
展開用もしくは検出用試薬、被検物質と特異的に結合し
得る抗体などの特異的結合物質を固定化した固定相を有
する吸水性基材からなる試験片などを適宜含有してもよ
い。

【００４５】

【実施例】以下、実施例および実験例を挙げ、さらに具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定
されるものではない。

【００４６】実施例１：標識特異的結合体の作製 １）水分散型高分子粒子懸濁液の作製 スチレンスルホン酸ナトリウム１．５ｇを蒸留水１３７
０ｇに溶解し、得られた溶液に、スチレン３５０ｇ、ア
クリル酸１５ｇを添加した。得られた混合液を窒素ガス
雰囲気下で７５℃に維持し、攪拌しながら、重合開始剤
である過硫酸カリウム１．５ｇを蒸留水３０ｇに溶解し
て得られた水溶液を加え、１０時間重合を行なった。そ
の結果、カルボキシル化された水分散型高分子粒子とし
てカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子（平均粒
子径：約０．１２μｍ、粒子表面カルボキシル基量７μ
ｍｏｌ／ｍ² ）を得た。得られたカルボキシル化ポリス
チレンラテックス粒子を０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．２に固形分濃度が１０重量％になるように分散させ
た。

【００４７】２）水分散型高分子粒子へのソルベントブ
ルー１１の導入 ０．２ｇのソルベントブルー１１をトルエン１０ｇに溶
解した。得られた溶液に０．５重量％ドデシル硫酸ナト
リウム水溶液５０ｇを添加した後、超音波分散機を用い
て乳化した。得られた乳化液を前記１）で得られた水分
散型高分子粒子懸濁液１０ｇに添加し、室温で１０時間
攪拌した。得られた攪拌液をエバポレータに移し、減圧
条件下に水分散型高分子粒子中に吸収されたトルエンを
除去し、ついで０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）を
洗浄液として用いて遠心分離洗浄した。得られた粒子を
固形分濃度が５重量％になるように０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８）に分散させた。

【００４８】３）固定化 前記２）で得られた水分散型高分子粒子の分散液３ｍｌ
に、水溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８）０．５ｍｌと抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（以
下、抗ＨＢｓ抗体という）〔イムノプローブ社製、マウ
ス由来モノクローナル抗体、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８）中１ｍｇ／ｍｌ〕２ｍｌとを加えて１０℃で
５時間反応させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液ｐＨ８を用いて遠心分離洗浄を行い、同緩衝液で
固形分濃度５重量％に調製し、抗ＨＢｓ抗体固定化水分
散型高分子粒子懸濁液を得た。

【００４９】次いで、上記で作製した抗ＨＢｓ抗体固定
化水分散型高分子粒子懸濁液３ｍｌに、水溶性カルボジ
イミド（DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ
ｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８）１ｍｌ、西洋ワ
サビ由来ペルオキシダーゼ〔以下ＨＲＰと略す：和光純
薬社製、１２ｍｇ／ｍｌ（比活性２５０〜３５０Ｕ／ｍ
ｇ）、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８）２ｍｌを加え
て１０℃で３時間反応させた後、０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液（ｐＨ８）を洗浄液として用いて遠心分離洗浄を行
なった。０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）で固形分
濃度２重量％に調製し、抗ＨＢｓ抗体およびＨＲＰを固
定化したラテックス粒子を作製した。

【００５０】実施例２ 水分散型高分子粒子に導入する化合物をソルベントブル
ー１１の代わりにｐ−アミノアゾベンゼン（式（２０）
の化合物）を用いる他は、実施例１と同様に行なった。

【００５１】比較例１ 実施例１の２）の工程を行わない他は、実施例１と同様
に行なった。

【００５２】実験例１ １） 抗体および酵素の固定量の測定 実施例１、２および比較例１で作製した抗ＨＢｓ抗体と
ＨＲＰとを固定化した水分散型高分子粒子について、抗
体および酵素の各固定後の上清をタンパク質定量して算
出したタンパク質量と固定化前に使用した抗体および酵
素のそれぞれの量との差からラテックス粒子の乾燥重量
１ｇあたりの各固定量を算出した。なお、当該タンパク
質定量は、『Coomassie Protein Assay Reagent 』(PIE
RCE 社製) を用い、添付の説明書に従い、５９５ｎｍの
吸光度を測定することにより行なった。結果を表１に示
す。

【００５３】２） 抗体および酵素の固定されたラテッ
クス粒子の酵素活性の測定 実施例１、２および比較例１で作製した抗ＨＢｓ抗体と
ＨＲＰとを固定化したラテックス粒子について、その酵
素活性を測定した。ＴＭＢ（3, 3’, 5, 5’-Tetrameth
ylbenzidine) membrane Peroxidase Substrate System
(Kirkegaard &Perry Laboratories Inc. 社製、ｐＨ
４．５）を基質液として使用した。キュベット内で、上
記の基質液３．３ｍｌに０．０１２５重量％に希釈した
酵素−抗体固定化ラテックス粒子分散液０．１ｍｌを混
合し、２５℃で反応後、分光光度計で５８０ｎｍにおけ
る１分間の吸光度上昇を測定した。吸光度を１分間に１
上昇させる活性を１Ｕ（ユニット）と定義し、ラテック
ス粒子の乾燥重量１ｇあたりの活性で表現した。結果を
表１に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】表１の結果より、アントラキノン誘導体や
アゾベンゼン誘導体を導入した実施例１および２のラテ
ックス粒子においては、抗体および酵素の固定量は多
く、また固定化された酵素の活性も高かった。一方、比
較例１のラテックス粒子においては、実施例１および２
のラテックス粒子に比べ、抗体および酵素の固定量は少
なく、また固定化された酵素の活性も低かった。

【００５６】

【発明の効果】本発明の標識特異的結合体は、アントラ
キノン誘導体およびアゾベンゼン誘導体からなる群より
選ばれた少なくとも１種の化合物を保持する水分散型高
分子粒子を担体として使用するため、該担体への特異的
結合物質や酵素の固定量を向上させることができ、簡便
で、かつ高感度な免疫クロマトグラフ法を可能にすると
いう優れた効果を奏する。また、本発明の免疫クロマト
グラフ法は、該標識特異的結合体を用いるため、簡便
で、かつ高感度な被検物質の検出を可能にするという優
れた効果を奏する。さらに本発明の免疫クロマトグラフ
ィー用キットは、該標識特異的結合体を含有しており、
簡便で、かつ高感度な免疫クロマトグラフ法を可能にす
る。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水分散型高分子粒子を担体とし、該担体
   の表面に被検物質に対する特異的結合物質と酵素が固定
   されていると共に、アントラキノン誘導体およびアゾベ
   ンゼン誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種の
   化合物が該担体に保持されてなる標識特異的結合体。
2. 【請求項２】 アントラキノン誘導体およびアゾベンゼ
   ン誘導体がアミノ基を有する化合物である、請求項１記
   載の標識特異的結合体。
3. 【請求項３】 アントラキノン誘導体およびアゾベンゼ
   ン誘導体が第１級アミンまたは第２級アミンを形成しう
   るアミノ基を有し、かつ水不溶性または水難溶性であ
   る、請求項２記載の標識特異的結合体。
4. 【請求項４】 該特異的結合物質が、抗体、抗原、ハプ
   テンおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれた
   少なくとも１種である、請求項１〜３いずれか記載の標
   識特異的結合体。
5. 【請求項５】 酵素が、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
   スファターゼおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼからなる
   群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１〜４い
   ずれか記載の標識特異的結合体。
6. 【請求項６】 請求項１〜５いずれか記載の標識特異的
   結合体を用いることを特徴とする免疫クロマトグラフ
   法。
7. 【請求項７】 請求項１〜５いずれか記載の標識特異的
   結合体を含有してなる免疫クロマトグラフィー用キッ
   ト。