JPH08198911A - ビオチン化ラテックス小球、その小球の製造方法および生物学的検出用試薬としての使用 - Google Patents
ビオチン化ラテックス小球、その小球の製造方法および生物学的検出用試薬としての使用Info
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- JPH08198911A JPH08198911A JP7258133A JP25813395A JPH08198911A JP H08198911 A JPH08198911 A JP H08198911A JP 7258133 A JP7258133 A JP 7258133A JP 25813395 A JP25813395 A JP 25813395A JP H08198911 A JPH08198911 A JP H08198911A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Abstract
(57)【要約】
【課題】 結合能力の高い新規なビオチン化ラテックス
小球を提供する。 【解決手段】 エチレン性不飽和モノマーの重合により
得られる重合体からなり、表面に官能基を有するラテッ
クス小球であって、ビオチン残基が該基の少なくとも一
部の上に、２価の鎖を介してグラフト化されていること
を特徴とするラテックス小球。該小球を使用して得られ
るアビジン−またはストレプトアビジン−ビオチン複合
体に、および該小球または複合体の、診断用、生物学的
検定用または免疫学的検定用の試薬としての使用。
小球を提供する。 【解決手段】 エチレン性不飽和モノマーの重合により
得られる重合体からなり、表面に官能基を有するラテッ
クス小球であって、ビオチン残基が該基の少なくとも一
部の上に、２価の鎖を介してグラフト化されていること
を特徴とするラテックス小球。該小球を使用して得られ
るアビジン−またはストレプトアビジン−ビオチン複合
体に、および該小球または複合体の、診断用、生物学的
検定用または免疫学的検定用の試薬としての使用。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なビオチン化
ラテックス小球（ミクロスフェア）、その小球の製造方
法、およびビオチン化ラテックス小球の、またはアビジ
ンもしくはストレプトアビジンとの複合体の、診断用ま
たは生物学的（免疫学的、酵素的等）検定用の、および
分子生物学における試薬としての応用に関する。
ラテックス小球（ミクロスフェア）、その小球の製造方
法、およびビオチン化ラテックス小球の、またはアビジ
ンもしくはストレプトアビジンとの複合体の、診断用ま
たは生物学的（免疫学的、酵素的等）検定用の、および
分子生物学における試薬としての応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】（ストレプト）アビジン−ビオチンの相
互作用は、様々な生物学的用途、特にＤＮ
Ａ（．．．．）の分離および配列決定、核酸のハイブリ
ダイゼーション、免疫学的検定、細胞標識付けおよび細
胞選別の分野、において長年にわたって使用されてい
る。
互作用は、様々な生物学的用途、特にＤＮ
Ａ（．．．．）の分離および配列決定、核酸のハイブリ
ダイゼーション、免疫学的検定、細胞標識付けおよび細
胞選別の分野、において長年にわたって使用されてい
る。
【０００３】ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビ
ジン−ビオチン認識方式の利点は数多くあって良く知ら
れており、それらは、 − これら２種類の分子間に強い相互作用を引き起こ
し、洗浄、結合および分析の様々な段階の際に変動する
pH条件下で複合体の安定性を確保し、 − 非特異的結合を減少させ、 − ストレプトアビジンサポートと結合させる目的で、
ビオチンを、それらの活性を変えずに生物学的高分子
（macromolecule ）に、比較的容易に導入する、ことで
ある。
ジン−ビオチン認識方式の利点は数多くあって良く知ら
れており、それらは、 − これら２種類の分子間に強い相互作用を引き起こ
し、洗浄、結合および分析の様々な段階の際に変動する
pH条件下で複合体の安定性を確保し、 − 非特異的結合を減少させ、 − ストレプトアビジンサポートと結合させる目的で、
ビオチンを、それらの活性を変えずに生物学的高分子
（macromolecule ）に、比較的容易に導入する、ことで
ある。
【０００４】ビオチンは、ビタミンＨとも呼ばれ、式
【０００５】
【化５】 を有し、非常に高い選択性でアビジンまたはストレプト
アビジンに結合し得るという利点がある（ｋｄ＝１．３
ｘ１０-15 モル／ｌ）。
アビジンに結合し得るという利点がある（ｋｄ＝１．３
ｘ１０-15 モル／ｌ）。
【０００６】アビジンは、卵白中に存在する、それぞれ
１２８個のアミノ酸からなる４つの等しいサブユニット
を有し、等電点が１０である糖タンパク質である。それ
は４分子までのビオチンを、すなわちサブユニットあた
り１個のビオチンを結合することができる。用語“アビ
ジン”は、このタンパク質の、グリコシル化されたタン
パク質と本質的に同じ親和力特性を有するグリコシル化
されていない形態をも意味する。
１２８個のアミノ酸からなる４つの等しいサブユニット
を有し、等電点が１０である糖タンパク質である。それ
は４分子までのビオチンを、すなわちサブユニットあた
り１個のビオチンを結合することができる。用語“アビ
ジン”は、このタンパク質の、グリコシル化されたタン
パク質と本質的に同じ親和力特性を有するグリコシル化
されていない形態をも意味する。
【０００７】ストレプトアビジンは、Streptomyces avi
dinii の培養物から得られるタンパク質であり、やはり
４個の等しいサブユニットを有し、等電点が約５〜６で
ある。
dinii の培養物から得られるタンパク質であり、やはり
４個の等しいサブユニットを有し、等電点が約５〜６で
ある。
【０００８】通常、使用するストレプトアビジンはプロ
テイナーゼＫで消化されている。しかし、本発明の範囲
内では、“ストレプトアビジン”の表現は、例えばスト
レプトアビジン遺伝子のクローニング後に得られる天然
の形態をも意味する（Argarana CE, Nucleic Acids Re
s. 1986; 14:1871-1882）。
テイナーゼＫで消化されている。しかし、本発明の範囲
内では、“ストレプトアビジン”の表現は、例えばスト
レプトアビジン遺伝子のクローニング後に得られる天然
の形態をも意味する（Argarana CE, Nucleic Acids Re
s. 1986; 14:1871-1882）。
【０００９】さらに、医学診断用物質としてのラテック
ス小球の応用も公知である。例えば、ラテックス粒子は
凝集反応試験に使用され、抗体または抗原の存在または
不在を確認するために使用される。具体的には、抗体ま
たは抗原はラテックス粒子の表面に結合し、続いて体
液、例えば血清、髄液（ＳＦ）、尿または組織抽出製造
物、中に含まれる対応する抗原または抗体と反応するこ
とができる。検出方法は当業者には良く知られている。
ス小球の応用も公知である。例えば、ラテックス粒子は
凝集反応試験に使用され、抗体または抗原の存在または
不在を確認するために使用される。具体的には、抗体ま
たは抗原はラテックス粒子の表面に結合し、続いて体
液、例えば血清、髄液（ＳＦ）、尿または組織抽出製造
物、中に含まれる対応する抗原または抗体と反応するこ
とができる。検出方法は当業者には良く知られている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】最近、表面にストレプ
トアビジン基を有する磁性小球を含むラテックスが提案
され、特に医学診断および免疫学的検定の分野で使用さ
れている。
トアビジン基を有する磁性小球を含むラテックスが提案
され、特に医学診断および免疫学的検定の分野で使用さ
れている。
【００１１】しかし、その様なラテックスは、粒子表面
の緻密性（closeness ）がストレプトアビジンの部分的
な変性を引き起こし、ビオチンと結合する能力を低下さ
せる、あるいは少なくとも制御し難くすることがあるの
で、十分に満足のいく結果をもたらさない。
の緻密性（closeness ）がストレプトアビジンの部分的
な変性を引き起こし、ビオチンと結合する能力を低下さ
せる、あるいは少なくとも制御し難くすることがあるの
で、十分に満足のいく結果をもたらさない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ビオチン化さ
れたラテックス小球（biotinylated latex microspher
e）の製造方法であって、 ａ）ビオチンの表面濃度が多様で既知である粒子を得る
可能性を切開く、変性ビオチンの共有グラフト化の容易
な制御を確実にする方法、を提供する。
れたラテックス小球（biotinylated latex microspher
e）の製造方法であって、 ａ）ビオチンの表面濃度が多様で既知である粒子を得る
可能性を切開く、変性ビオチンの共有グラフト化の容易
な制御を確実にする方法、を提供する。
【００１３】また、本発明は次のような新規な小球を提
供する。 ｂ）どの様な様式においても、同じベースから、アビジ
ンラテックスまたはストレプトアビジンラテックスを製
造する可能性を提供し、使用者に異なった付加価値を有
する２種類の製品を提供できる。ストレプトアビジン
は、より高価ではあるが、その等電点がより低く（５〜
６に近い）、またアビジン中の各サブユニットの表面に
存在するグリコシル化された残基を通常含まないので、
アビジンよりも妨害が少ない。 ｃ）重合体サポートにより表われる固相の緻密性による
立体応力を排除することができる。 ｄ）ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−ア
ビジン複合体の形成を促進する。 ｅ）３種類のビオチン化されたコンジュゲートを結合す
る能力を保持することができる。
供する。 ｂ）どの様な様式においても、同じベースから、アビジ
ンラテックスまたはストレプトアビジンラテックスを製
造する可能性を提供し、使用者に異なった付加価値を有
する２種類の製品を提供できる。ストレプトアビジン
は、より高価ではあるが、その等電点がより低く（５〜
６に近い）、またアビジン中の各サブユニットの表面に
存在するグリコシル化された残基を通常含まないので、
アビジンよりも妨害が少ない。 ｃ）重合体サポートにより表われる固相の緻密性による
立体応力を排除することができる。 ｄ）ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−ア
ビジン複合体の形成を促進する。 ｅ）３種類のビオチン化されたコンジュゲートを結合す
る能力を保持することができる。
【００１４】本発明は第一に、エチレン性不飽和モノマ
ーの重合により得られる重合体からなり、表面に官能基
を有するラテックス小球であって、ビオチン残基が該基
の少なくとも一部の上に、２価の鎖を介してグラフト化
されていることを特徴とするラテックス小球に関する。
ーの重合により得られる重合体からなり、表面に官能基
を有するラテックス小球であって、ビオチン残基が該基
の少なくとも一部の上に、２価の鎖を介してグラフト化
されていることを特徴とするラテックス小球に関する。
【００１５】ビオチン化された残基／２価鎖の組合せは
“ビオチン化鎖”とも呼ばれる。
“ビオチン化鎖”とも呼ばれる。
【００１６】ラテックス小球は通常、エチレン性不飽和
モノマーの重合によって得られる重合体からなり、その
表面で官能化されている。
モノマーの重合によって得られる重合体からなり、その
表面で官能化されている。
【００１７】これらは、ビニル芳香族モノマー、エチレ
ンモノマー、エチレン性またはアルカン酸またはエステ
ルに由来する単位を含む、一部が官能化されたホモ重合
体または共重合体である。
ンモノマー、エチレン性またはアルカン酸またはエステ
ルに由来する単位を含む、一部が官能化されたホモ重合
体または共重合体である。
【００１８】この種のものは、当業者なら容易に入手す
ることができ、その幾つかを以下に上げるが、これらに
限定するものではない。これらのモノマーは、 −イソプレン、１，３−ブタジエン、塩化ビニリデンま
たはアクリロニトリル型のエチレンモノマー、 −ビニル芳香族モノマー、例えばスチレン、ブロモスチ
レン、アルファ−メチルスチレン、エチルスチレン、ビ
ニルトルエン、クロロスチレンまたはクロロメチルスチ
レンまたはビニルナフタレン、 −アルケン酸、エステルまたは無水物、例えばアクリル
酸またはメタクリル酸、アルキル基が３〜１０個の炭素
原子を有するアクリル酸アルキルおよびメタクリル酸ア
ルキル、アクリル酸ヒドロキシアルキル、アクリルアミ
ド、４または５個の炭素原子を有するエチレン系酸（et
hylenic acid）のエステル、ならびに −二官能性モノマー、例えばジビニルベンゼンまたは
２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート
および／または他の、水に不溶な共重合性モノマーなど
があげられる。
ることができ、その幾つかを以下に上げるが、これらに
限定するものではない。これらのモノマーは、 −イソプレン、１，３−ブタジエン、塩化ビニリデンま
たはアクリロニトリル型のエチレンモノマー、 −ビニル芳香族モノマー、例えばスチレン、ブロモスチ
レン、アルファ−メチルスチレン、エチルスチレン、ビ
ニルトルエン、クロロスチレンまたはクロロメチルスチ
レンまたはビニルナフタレン、 −アルケン酸、エステルまたは無水物、例えばアクリル
酸またはメタクリル酸、アルキル基が３〜１０個の炭素
原子を有するアクリル酸アルキルおよびメタクリル酸ア
ルキル、アクリル酸ヒドロキシアルキル、アクリルアミ
ド、４または５個の炭素原子を有するエチレン系酸（et
hylenic acid）のエステル、ならびに −二官能性モノマー、例えばジビニルベンゼンまたは
２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート
および／または他の、水に不溶な共重合性モノマーなど
があげられる。
【００１９】これらのモノマーの一部は、生物学的分
子、例えばタンパク質および酵素、が有する、例えばア
ミンまたはカルボキシル型の官能基と直接または間接的
に反応し得る基を有する。これらの官能基の代表例とし
て、ハロゲン、カルボキシル、アミン、イソシアネー
ト、アジリジン、アルデヒドおよびスルホニル基、およ
びエポキシおよびクロロメチル官能基を挙げることがで
きる。
子、例えばタンパク質および酵素、が有する、例えばア
ミンまたはカルボキシル型の官能基と直接または間接的
に反応し得る基を有する。これらの官能基の代表例とし
て、ハロゲン、カルボキシル、アミン、イソシアネー
ト、アジリジン、アルデヒドおよびスルホニル基、およ
びエポキシおよびクロロメチル官能基を挙げることがで
きる。
【００２０】本発明において更に特に使用されるモノマ
ーは、アリーレンおよび／またはアルキレンの族に属す
る。これらは、好ましくはビニル芳香族化合物、例えば
スチレン、アルファ−メチルスチレン、エチルスチレ
ン、ｔｅｒｔ−ブチルスチレンおよびビニルトルエンで
ある。これらのモノマーは、ハロゲン、アミン、アルコ
キシ、カルボキシルおよび／またはスルホニル型の１種
以上の官能基で置換されているのが好ましい。
ーは、アリーレンおよび／またはアルキレンの族に属す
る。これらは、好ましくはビニル芳香族化合物、例えば
スチレン、アルファ−メチルスチレン、エチルスチレ
ン、ｔｅｒｔ−ブチルスチレンおよびビニルトルエンで
ある。これらのモノマーは、ハロゲン、アミン、アルコ
キシ、カルボキシルおよび／またはスルホニル型の１種
以上の官能基で置換されているのが好ましい。
【００２１】これらのモノマーは単独で、または互いに
任意の比率で混合して使用される。
任意の比率で混合して使用される。
【００２２】重合体粒子は、従来のエマルション中にお
ける重合、マイクロエマルション中、懸濁液中またはマ
イクロ懸濁液中の重合、または所望により、有機媒体中
の重合の様な、どの様な重合技術を使用しても得られ
る。これらの技術は当業者には良く知られているので、
ここでは説明しない。
ける重合、マイクロエマルション中、懸濁液中またはマ
イクロ懸濁液中の重合、または所望により、有機媒体中
の重合の様な、どの様な重合技術を使用しても得られ
る。これらの技術は当業者には良く知られているので、
ここでは説明しない。
【００２３】本発明の粒子は、疎水性であり、大きさが
一般的に０．０１〜２０ミクロン、好ましくは５ミクロ
ン未満である。これらはある一定の大きさを有し、単分
散し、ラテックス中に、ラテックスの総重量に対して
０．０５〜３０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の
量で存在する。
一般的に０．０１〜２０ミクロン、好ましくは５ミクロ
ン未満である。これらはある一定の大きさを有し、単分
散し、ラテックス中に、ラテックスの総重量に対して
０．０５〜３０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の
量で存在する。
【００２４】一般的に、小球の１平方ナノメートルあた
りの官能基の表面密度は０．１〜約５０である。
りの官能基の表面密度は０．１〜約５０である。
【００２５】ラテックス小球は磁化させることができる
が、この場合、例えば米国特許第４，３３９，３３７
号、第４，３５８，３８８号および第４，９４８，７３
９号に記載されている様に、小球を、磁化し得る材料と
組み合わせる。
が、この場合、例えば米国特許第４，３３９，３３７
号、第４，３５８，３８８号および第４，９４８，７３
９号に記載されている様に、小球を、磁化し得る材料と
組み合わせる。
【００２６】小球の磁化し得る部分を構成できる材料の
中で、磁鉄鉱、赤鉄鉱、二酸化クロム、イットリウム−
鉄の混合酸化物、フェライト、たとえばマンガン、ニッ
ケル、マンガン−亜鉛フェライトなど、コバルト、ニッ
ケル、ガドリニウム、サマリウム−コバルト合金などを
挙げることができる。好ましい材料は一般的に磁鉄鉱お
よび赤鉄鉱である。
中で、磁鉄鉱、赤鉄鉱、二酸化クロム、イットリウム−
鉄の混合酸化物、フェライト、たとえばマンガン、ニッ
ケル、マンガン−亜鉛フェライトなど、コバルト、ニッ
ケル、ガドリニウム、サマリウム−コバルト合金などを
挙げることができる。好ましい材料は一般的に磁鉄鉱お
よび赤鉄鉱である。
【００２７】小球中に含まれる磁化し得る材料の量は、
磁化し得るコンポジット小球の約０．５〜７０重量％、
好ましくは約１５〜６０重量％である。
磁化し得るコンポジット小球の約０．５〜７０重量％、
好ましくは約１５〜６０重量％である。
【００２８】“スペーサーアーム”として作用する２価
の鎖が存在する結果、小球が表す固相の緻密性による立
体応力は排除される。さらに、小球の表面から離れたタ
ンパク質（アビジンまたはストレプトアビジン）が、３
種類の他のビオチン化されたコンジュゲートを結合する
能力を保持する。
の鎖が存在する結果、小球が表す固相の緻密性による立
体応力は排除される。さらに、小球の表面から離れたタ
ンパク質（アビジンまたはストレプトアビジン）が、３
種類の他のビオチン化されたコンジュゲートを結合する
能力を保持する。
【００２９】好ましくは、２価の鎖は平均の長さが５〜
１２０オングストロームであるが、５〜５０オングスト
ロームが有利であり、１５オングストローム近くがさら
に有利である。
１２０オングストロームであるが、５〜５０オングスト
ロームが有利であり、１５オングストローム近くがさら
に有利である。
【００３０】“ビオチン残基”の表現は、アビジンまた
はストレプトアビジンと結合（conjugate ）し得る基を
意味する。この残基は、式
はストレプトアビジンと結合（conjugate ）し得る基を
意味する。この残基は、式
【００３１】
【化６】 （式中、Ｘは酸素原子、硫黄原子またはイミノ基Ｎ−Ｈ
である。）の構造を有する。
である。）の構造を有する。
【００３２】一般的に、この残基は式
【００３３】
【化７】 （式中、Ｒ1 は２価のＣ1 〜Ｃ8 炭化水素基であり、Ｘ
は酸素原子、硫黄原子またはイミノ基Ｎ−Ｈであり、Ｚ
は基Ｃ＝Ｏまたは−Ｓ−である。）のビオチニル基から
なる。
は酸素原子、硫黄原子またはイミノ基Ｎ−Ｈであり、Ｚ
は基Ｃ＝Ｏまたは−Ｓ−である。）のビオチニル基から
なる。
【００３４】好ましくは、２価の鎖は３〜８０、好まし
くは８〜２０個の炭素原子を含む。
くは８〜２０個の炭素原子を含む。
【００３５】それは一般的に、所望により置換された２
価の炭化水素基であり、所望により主鎖中に、窒素、酸
素、硫黄またはリン原子から選択された１個以上の異種
原子を含み、炭素原子の１個以上が所望によりカルボニ
ル基または誘導体（イミン、オキシム等）であるか、ま
たは１個以上の環または複素環化合物を含む。
価の炭化水素基であり、所望により主鎖中に、窒素、酸
素、硫黄またはリン原子から選択された１個以上の異種
原子を含み、炭素原子の１個以上が所望によりカルボニ
ル基または誘導体（イミン、オキシム等）であるか、ま
たは１個以上の環または複素環化合物を含む。
【００３６】２価基の置換基は、小球の官能基上へのグ
ラフト化が困難に、または不可能にさえなる様な立体障
害を起こさない基である。したがって、これらの基は、
嵩の小さな置換基、例えばメチル、アミノまたはＯＨ基
などである。
ラフト化が困難に、または不可能にさえなる様な立体障
害を起こさない基である。したがって、これらの基は、
嵩の小さな置換基、例えばメチル、アミノまたはＯＨ基
などである。
【００３７】同様に、鎖自体の一部であるこれらの置換
基または異種原子も、この鎖の末端基と官能基の反応を
妨害してはならない。
基または異種原子も、この鎖の末端基と官能基の反応を
妨害してはならない。
【００３８】一般的に、各ラテックス小球上のビオチン
化された鎖の数は、診断試験を行なうのに十分でなけれ
ばならない。
化された鎖の数は、診断試験を行なうのに十分でなけれ
ばならない。
【００３９】実用的な観点から、この数は、多かれ少な
かれ、小球上に存在する官能基の量の割合である。
かれ、小球上に存在する官能基の量の割合である。
【００４０】この割合は、小球の表面に存在する官能基
の１〜５０％が有利であり、好ましくは、この割合は５
〜３０％である。
の１〜５０％が有利であり、好ましくは、この割合は５
〜３０％である。
【００４１】先に述べた様に、小球の１平方ナノメート
ルあたりの官能基の表面密度は１〜５０であるので、該
数は容易に求められる。
ルあたりの官能基の表面密度は１〜５０であるので、該
数は容易に求められる。
【００４２】第一の変形では、ラテックス小球は下記の
構造 Ｍ−［ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｂ］n III （式中、ｎは単位表面積あたりのグラフト化された分子
の平均数であり、Ｍはラテックス小球を表わし、Ｂはビ
オチン化された鎖を表わし、Ｒは、所望により、窒素、
酸素、硫黄またはリン原子から選択された１個以上の異
種原子、１個以上のカルボニル基または誘導体、１個以
上の環または複素環化合物を含む、所望により置換され
た２価の炭化水素基である。）を有する。
構造 Ｍ−［ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｂ］n III （式中、ｎは単位表面積あたりのグラフト化された分子
の平均数であり、Ｍはラテックス小球を表わし、Ｂはビ
オチン化された鎖を表わし、Ｒは、所望により、窒素、
酸素、硫黄またはリン原子から選択された１個以上の異
種原子、１個以上のカルボニル基または誘導体、１個以
上の環または複素環化合物を含む、所望により置換され
た２価の炭化水素基である。）を有する。
【００４３】好ましくは、Ｂは、ＺがＣ＝Ｏである上記
の式IIに相当する。さらに好ましくは、Ｒ1 は２価の基
（ＣＨ2 ）4 である。
の式IIに相当する。さらに好ましくは、Ｒ1 は２価の基
（ＣＨ2 ）4 である。
【００４４】しかし、本発明は、この特定の形態のビオ
チン残基に限定されるものではなく る。
チン残基に限定されるものではなく る。
【００４５】好ましくは、本発明の小球の製造に好適な
多くの２価基Ｒの中で、カダベリン、エチレンジアミ
ン、ヘキサメチレンジアミンまたはジヒドラジド、例え
ばアジポヒドラジド、ペプチド残基、塩基性アミノ酸残
基、例えばリシン、好ましくは式 （式中、Ｒ2 、Ｒ3 は、同一であるか、または異なるも
のであって、２価のＣ1〜Ｃ8 、好ましくはＣ2 〜
Ｃ6 、有利にはＣ5 鎖である。）の残基の２価基を挙げ
ることができる。
多くの２価基Ｒの中で、カダベリン、エチレンジアミ
ン、ヘキサメチレンジアミンまたはジヒドラジド、例え
ばアジポヒドラジド、ペプチド残基、塩基性アミノ酸残
基、例えばリシン、好ましくは式 （式中、Ｒ2 、Ｒ3 は、同一であるか、または異なるも
のであって、２価のＣ1〜Ｃ8 、好ましくはＣ2 〜
Ｃ6 、有利にはＣ5 鎖である。）の残基の２価基を挙げ
ることができる。
【００４６】小球の表面における官能基の表面密度は１
平方ナノメートルあたり１〜５０が有利であることはす
でに述べた。
平方ナノメートルあたり１〜５０が有利であることはす
でに述べた。
【００４７】好ましくは、表面官能基上にグラフト化さ
れた、ビオチン化されたスペーサーアームの百分率は１
〜５０％である。有利には、この百分率は５〜３０％で
ある。
れた、ビオチン化されたスペーサーアームの百分率は１
〜５０％である。有利には、この百分率は５〜３０％で
ある。
【００４８】したがって、数ｎは、球の直径が与えられ
れば決定され、一般的に約０．１〜約１０である。
れば決定され、一般的に約０．１〜約１０である。
【００４９】第二の変形では、ラテックス小球は下記の
構造 Ｍ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−Ｂ］n IV （式中、Ｍおよびｎは構造III の場合と同じ意味を有
し、Ｂはビオチン化された鎖を表わし、Ｒは、所望によ
り、窒素、酸素、硫黄またはリン原子から選択された１
個以上の異種原子、１個以上のカルボニル基または誘導
体、１個以上の環または複素環化合物を含む、所望によ
り置換された２価の炭化水素基である。）を有する。
構造 Ｍ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−Ｂ］n IV （式中、Ｍおよびｎは構造III の場合と同じ意味を有
し、Ｂはビオチン化された鎖を表わし、Ｒは、所望によ
り、窒素、酸素、硫黄またはリン原子から選択された１
個以上の異種原子、１個以上のカルボニル基または誘導
体、１個以上の環または複素環化合物を含む、所望によ
り置換された２価の炭化水素基である。）を有する。
【００５０】好ましくは、Ｂは、ＺがＳである上記の式
IIに相当する。さらに好ましくは、Ｒ1 は２価の基（Ｃ
Ｈ2 ）4 である。
IIに相当する。さらに好ましくは、Ｒ1 は２価の基（Ｃ
Ｈ2 ）4 である。
【００５１】しかし、本発明は、この特定の形態のビオ
チン残基に限定されるものではなく、−Ｓ−（ＣＨ2 ）
4-鎖が同等の鎖により置き換えられた残基にも適用され
る。
チン残基に限定されるものではなく、−Ｓ−（ＣＨ2 ）
4-鎖が同等の鎖により置き換えられた残基にも適用され
る。
【００５２】小球の表面における官能基の表面密度は１
平方ナノメートルあたり１〜５０が有利であることはす
でに述べた。
平方ナノメートルあたり１〜５０が有利であることはす
でに述べた。
【００５３】好ましくは、表面官能基上にグラフト化さ
れた、ビオチン化されたスペーサーアームの百分率は１
〜５０％である。より好ましくは、この百分率は５〜３
０％である。
れた、ビオチン化されたスペーサーアームの百分率は１
〜５０％である。より好ましくは、この百分率は５〜３
０％である。
【００５４】したがって、数ｎは、球の直径が与えられ
れば決定され、一般的に約０．１〜約１０である。
れば決定され、一般的に約０．１〜約１０である。
【００５５】好ましくは、本発明の小球の製造に好適な
多くの２価基Ｒの中で、次の２価基
多くの２価基Ｒの中で、次の２価基
【００５６】
【化８】 を挙げることができる。
【００５７】無論、他の同等の基も適当である。
【００５８】本発明は、小球が上記のものから選択され
ることを特徴とする、ビオチン化された小球−アビジン
または−ストレプトアビジン複合体にも関連する。
ることを特徴とする、ビオチン化された小球−アビジン
または−ストレプトアビジン複合体にも関連する。
【００５９】特に、個々のビオチン残基がアビジンまた
はストレプトアビジンに結合している小球に関する。
はストレプトアビジンに結合している小球に関する。
【００６０】本発明は、上記の小球または複合体の製造
方法であって、 ａ）官能基を活性化させる工程、 ｂ）末端が、活性化された官能基に対して反応性を有す
るビオチン化された鎖をグラフト化する工程、 ｃ）所望により、アビジンまたはストレプトアビジンと
複合体形成する工程 を行なうことを特徴とする方法にも関する。
方法であって、 ａ）官能基を活性化させる工程、 ｂ）末端が、活性化された官能基に対して反応性を有す
るビオチン化された鎖をグラフト化する工程、 ｃ）所望により、アビジンまたはストレプトアビジンと
複合体形成する工程 を行なうことを特徴とする方法にも関する。
【００６１】好ましくは、工程ｃ）を行なってビオチン
化された小球−アビジンまたは−ストレプトアビジン複
合体を得るために、ビオチン１モルあたり過剰モルのア
ビジンまたはストレプトアビジンを使用する（２の近く
が有利である）。
化された小球−アビジンまたは−ストレプトアビジン複
合体を得るために、ビオチン１モルあたり過剰モルのア
ビジンまたはストレプトアビジンを使用する（２の近く
が有利である）。
【００６２】結合（複合体形成）は、公知の方法、例え
ばリン酸塩緩衝液＋ウシ血清アルブミンの存在下で行な
い、続いてリン酸塩緩衝液で洗浄する。
ばリン酸塩緩衝液＋ウシ血清アルブミンの存在下で行な
い、続いてリン酸塩緩衝液で洗浄する。
【００６３】ここで、それぞれ構造III およびIVの小球
を製造できる具体的な実施態様を説明する。
を製造できる具体的な実施態様を説明する。
【００６４】構造III のビオチン化小球を製造する方法
の一つでは、第一工程で、下記の反応
の一つでは、第一工程で、下記の反応
【００６５】
【化９】 により、カルボジイミド、特にＣＭＣまたは１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ド＝メト−ｐ−トルエンスルホネートまたはＥＤＣ（１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド＝メチオジド）の存在下で、スルホ−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）の活性エステルを合
成することにより、カルボキシル化ラテックスを活性化
する。
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ド＝メト−ｐ−トルエンスルホネートまたはＥＤＣ（１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド＝メチオジド）の存在下で、スルホ−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）の活性エステルを合
成することにより、カルボキシル化ラテックスを活性化
する。
【００６６】反応は水性溶液中で行なう。純水中のカル
ボジイミドとカルボキシル化ラテックスの反応は、カル
ボジイミドを過剰に使用すれば、実際上瞬間的である。
ボジイミドとカルボキシル化ラテックスの反応は、カル
ボジイミドを過剰に使用すれば、実際上瞬間的である。
【００６７】好ましい態様では、カルボジイミドの直後
にＳ−ＮＨＳの水溶液を加える。反応は、可視ＵＶ吸収
分光測定法によりＳ−ＮＨＳの消失を監視することによ
り制御することができる（λmax ＝２６８nm、リン酸塩
緩衝液pH＝７中のモル吸光係数：ε＝７５００ mol-1．
１．cm-1）。
にＳ−ＮＨＳの水溶液を加える。反応は、可視ＵＶ吸収
分光測定法によりＳ−ＮＨＳの消失を監視することによ
り制御することができる（λmax ＝２６８nm、リン酸塩
緩衝液pH＝７中のモル吸光係数：ε＝７５００ mol-1．
１．cm-1）。
【００６８】この活性化エステル製造工程には、反応を
迅速に、できるだけ完全に行なうために、２〜２０、好
ましくは４〜１０（ラテックスの−ＣＯＯＨ官能基に対
して）モル過剰のＥＤＣで、および特にＥＤＣの濃度よ
りも大きな、すなわち５〜１００（ラテックスの−ＣＯ
ＯＨ官能基に対して）、好ましくは７〜５０モル過剰の
Ｓ−ＮＨＳで、活性化時間１５〜２０分間で作業するの
が好ましい。過剰のＳ−ＮＨＳは、上澄み液のＯＤが無
視できる様になるまで、水またはＮａＣｌ水溶液（例え
ば０．２５Ｍ）で何回か洗浄することにより、除去す
る。
迅速に、できるだけ完全に行なうために、２〜２０、好
ましくは４〜１０（ラテックスの−ＣＯＯＨ官能基に対
して）モル過剰のＥＤＣで、および特にＥＤＣの濃度よ
りも大きな、すなわち５〜１００（ラテックスの−ＣＯ
ＯＨ官能基に対して）、好ましくは７〜５０モル過剰の
Ｓ−ＮＨＳで、活性化時間１５〜２０分間で作業するの
が好ましい。過剰のＳ−ＮＨＳは、上澄み液のＯＤが無
視できる様になるまで、水またはＮａＣｌ水溶液（例え
ば０．２５Ｍ）で何回か洗浄することにより、除去す
る。
【００６９】第二工程では、下記の反応
【００７０】
【化１０】 により、アミン末端を有するビオチン化された鎖を活性
ラテックスに、アミド結合を形成することによりグラフ
ト化する。
ラテックスに、アミド結合を形成することによりグラフ
ト化する。
【００７１】好ましくは、ビオチン化鎖が、小球上に存
在する−ＣＯＯＨ官能基の数に対して実質的に化学量論
的な比率になる様に反応を行なう。活性化ラテックス上
のアミンのグラフト化は、アミド化の際に解放されるＳ
−ＮＨＳのアッセイにより制御することができる。反応
は、塩基性pH、特に９の近くのpHを有する緩衝液、特に
ホウ砂緩衝液中で行なうが、水中またはＮａＣｌ水溶液
中で行なうこともできる。
在する−ＣＯＯＨ官能基の数に対して実質的に化学量論
的な比率になる様に反応を行なう。活性化ラテックス上
のアミンのグラフト化は、アミド化の際に解放されるＳ
−ＮＨＳのアッセイにより制御することができる。反応
は、塩基性pH、特に９の近くのpHを有する緩衝液、特に
ホウ砂緩衝液中で行なうが、水中またはＮａＣｌ水溶液
中で行なうこともできる。
【００７２】ビオチン−２価鎖化合物の製造方法は、当
業者には公知の合成方法により、市販のジアミンから出
発し、そのＮＨ2 基の１個を所望によりマスクして実行
する。
業者には公知の合成方法により、市販のジアミンから出
発し、そのＮＨ2 基の１個を所望によりマスクして実行
する。
【００７３】構造IVの小球の一製造方法の一つは、 ａ）スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドア
ルキル）アリールエステル型のヘテロ２官能性スペーサ
ーアーム、例えばスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ートまたはＳ−ＳＭＣＣ、またはカプロン酸のマレイミ
ドスルホスクシンイミジルエステルの２官能性スペーサ
ーアーム、によりアミン含有ラテックスを活性化させる
工程、および ｂ）−ＳＨ末端を有するビオチン化鎖を活性化されたラ
テックス上にグラフト化する工程、 を含むことを特徴とする。
ルキル）アリールエステル型のヘテロ２官能性スペーサ
ーアーム、例えばスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ートまたはＳ−ＳＭＣＣ、またはカプロン酸のマレイミ
ドスルホスクシンイミジルエステルの２官能性スペーサ
ーアーム、によりアミン含有ラテックスを活性化させる
工程、および ｂ）−ＳＨ末端を有するビオチン化鎖を活性化されたラ
テックス上にグラフト化する工程、 を含むことを特徴とする。
【００７４】アミン含有ラテックスの活性化は、例えば
式
式
【００７５】
【化１１】 のスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートまたはＳ−
ＳＭＣＣの作用により、中性または僅かに塩基性のpHで
行なう。アミン含有ラテックスとＳ−ＳＭＣＣの反応
は、ＵＶ分光測光により監視する。遠心分離した試料
で、Ｓ−ＮＨＳの出現により、２６８nmに一つのピーク
を検出することができる。
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートまたはＳ−
ＳＭＣＣの作用により、中性または僅かに塩基性のpHで
行なう。アミン含有ラテックスとＳ−ＳＭＣＣの反応
は、ＵＶ分光測光により監視する。遠心分離した試料
で、Ｓ−ＮＨＳの出現により、２６８nmに一つのピーク
を検出することができる。
【００７６】スルフヒドリル末端を有するビオチン化ス
ペーサーアームとの反応は、下記の反応である。
ペーサーアームとの反応は、下記の反応である。
【００７７】
【化１２】 本発明の最後の課題は、上記の小球または複合体を診断
または検出試薬としての使用である。
または検出試薬としての使用である。
【００７８】アビジン−またはストレプトアビジン−ビ
オチン系は、広範囲な生物学分野に使用できる。上記の
複合体または小球は、特に核酸のハイブリダイゼーショ
ン、免疫学的検定または酵素検定試験に使用できる。
オチン系は、広範囲な生物学分野に使用できる。上記の
複合体または小球は、特に核酸のハイブリダイゼーショ
ン、免疫学的検定または酵素検定試験に使用できる。
【００７９】第一の特徴により、小球はＤＮＡ分離の分
野に使用できる。
野に使用できる。
【００８０】この変形では、小球を、アビジンまたはス
トレプトアビジンまたはビオチン化ＤＮＡストランドの
存在下に置く。この方法には、アビジンまたはストレプ
トアビジンを複数の箇所でビオチンと結合できるという
利点がある。
トレプトアビジンまたはビオチン化ＤＮＡストランドの
存在下に置く。この方法には、アビジンまたはストレプ
トアビジンを複数の箇所でビオチンと結合できるという
利点がある。
【００８１】ビオチン化ＤＮＡの製造は、公知の方法
で、適切な比率のビオチン化ヌクレオチドを使用してＰ
ＣＲ法による増幅により実行する。
で、適切な比率のビオチン化ヌクレオチドを使用してＰ
ＣＲ法による増幅により実行する。
【００８２】また、ビオチン化ＤＮＡの代わりに、ビオ
チン化抗体に結合した、その抗体に特異的なタンパク質
を使用することにより、同じ方法を免疫学的検出にも応
用できる。
チン化抗体に結合した、その抗体に特異的なタンパク質
を使用することにより、同じ方法を免疫学的検出にも応
用できる。
【００８３】この方式は、無論、他の分子、例えばレク
チン、プロテインＡなどにも適用できる。
チン、プロテインＡなどにも適用できる。
【００８４】第二の特徴では、これらの複合体が上記の
反応に直接関与し、アビジンまたはストレプトアビジン
が最早遊離の形態にはない。
反応に直接関与し、アビジンまたはストレプトアビジン
が最早遊離の形態にはない。
【００８５】第三の特徴により、これらの複合体はアビ
ジン−またはストレプトアビジン−ビオチンの親和性サ
ポートとして使用する。
ジン−またはストレプトアビジン−ビオチンの親和性サ
ポートとして使用する。
【００８６】固定化された複合体は、上記の変形で述べ
た生物学的種の精製、回収または特性試験に使用するこ
とができる。
た生物学的種の精製、回収または特性試験に使用するこ
とができる。
【００８７】例えば、細胞中に存在するタンパク質はビ
オチン化抗体と反応することがあり、細胞を分解した
後、このタンパク質を、本発明の複合体により形成され
た親和性カラム（アフィニティカラム）上に回収するこ
とができる。
オチン化抗体と反応することがあり、細胞を分解した
後、このタンパク質を、本発明の複合体により形成され
た親和性カラム（アフィニティカラム）上に回収するこ
とができる。
【００８８】溶離は、タンパク質を複合体から解離する
ことにより行なうことができる。
ことにより行なうことができる。
【００８９】同様に、ＰＣＲにより予め増幅したＤＮＡ
に付着させ、ビオチン化した放射性ＤＮＡプローブを、
本発明の複合体からなるサポート上に固定化させること
ができる。放射能計数が検出すべきＤＮＡ分子の数を示
す。
に付着させ、ビオチン化した放射性ＤＮＡプローブを、
本発明の複合体からなるサポート上に固定化させること
ができる。放射能計数が検出すべきＤＮＡ分子の数を示
す。
【００９０】その他の用途には、ＰＣＲ法と組み合わせ
たＤＮＡの固相配列決定、考究する細胞に特異的でビオ
チン化した抗体と組み合わせた細胞選別が含まれる（Cl
in.Chem. 37/5, 625-636(1991) P. Diamandisら参
照）。
たＤＮＡの固相配列決定、考究する細胞に特異的でビオ
チン化した抗体と組み合わせた細胞選別が含まれる（Cl
in.Chem. 37/5, 625-636(1991) P. Diamandisら参
照）。
【００９１】無論、当業者は、本発明の範囲から離れる
ことなく、他の用途を認識することができる。
ことなく、他の用途を認識することができる。
【００９２】下記の例により本発明を更に詳細に説明す
る。実施例１：ビオチン化した磁性ラテックスの製造 使用する磁性ラテックスは、PROLABO 社からESTAPOR M
1. 070/60の番号で市販されている製品で、下記の特性
を有する。 − ビーズの平均直径 ０．８μｍ − 推定密度 １．９４g.ml-1 − 懸濁液中のラテックスの質量百分率 １０％ − フェライト（磁性顔料）の質量百分率 ６０％ − −ＣＯＯＨ官能基の表面濃度 乾燥ラテックスの１９７μeq.g-1 − ビーズの表面積 ２μｍ2 − ビーズの体積 ０．２７μｍ3 − 乾燥ラテックス１ｇあたりのビーズ数 ２ｘ１０12 − ビーズ１個あたりの−ＣＯＯＨ官能基 ６．２１ｘ１０6 の数 − −ＣＯＯＨ官能基の密度 ３１−ＣＯＯＨ／nm2 これらのラテックスは多分散性である。
る。実施例１：ビオチン化した磁性ラテックスの製造 使用する磁性ラテックスは、PROLABO 社からESTAPOR M
1. 070/60の番号で市販されている製品で、下記の特性
を有する。 − ビーズの平均直径 ０．８μｍ − 推定密度 １．９４g.ml-1 − 懸濁液中のラテックスの質量百分率 １０％ − フェライト（磁性顔料）の質量百分率 ６０％ − −ＣＯＯＨ官能基の表面濃度 乾燥ラテックスの１９７μeq.g-1 − ビーズの表面積 ２μｍ2 − ビーズの体積 ０．２７μｍ3 − 乾燥ラテックス１ｇあたりのビーズ数 ２ｘ１０12 − ビーズ１個あたりの−ＣＯＯＨ官能基 ６．２１ｘ１０6 の数 − −ＣＯＯＨ官能基の密度 ３１−ＣＯＯＨ／nm2 これらのラテックスは多分散性である。
【００９３】ラテックスは活性化する前に洗浄する。
【００９４】洗浄したマイクロビーズ２４mgを２回蒸留
した水１ml中に入れ、攪拌（Vortex４００ rpm）するこ
とにより、カルボキシル官能基濃度４７４μＭになる。
５モル過剰のＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピルカルボジイミドメチオジド）を加え、Ｅ
ＤＣの１分後に５０モル過剰のＳ−ＮＨＳを加える。
した水１ml中に入れ、攪拌（Vortex４００ rpm）するこ
とにより、カルボキシル官能基濃度４７４μＭになる。
５モル過剰のＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピルカルボジイミドメチオジド）を加え、Ｅ
ＤＣの１分後に５０モル過剰のＳ−ＮＨＳを加える。
【００９５】１５分以内に、活性エステルの形成に必要
なＳ−ＮＨＳの量は完全に消費される。過剰のＳ−ＮＨ
Ｓを、上澄み液のＯＤが無視できる様になるまで、０．
２５ＭのＮａＣｌ水溶液で何回か洗浄することにより、
除去する。
なＳ−ＮＨＳの量は完全に消費される。過剰のＳ−ＮＨ
Ｓを、上澄み液のＯＤが無視できる様になるまで、０．
２５ＭのＮａＣｌ水溶液で何回か洗浄することにより、
除去する。
【００９６】ビオチン−Ｘ−カダベリンのグラフト化を
下記の条件下で行なった。 − 媒体： 蒸留水（４ml）、 − 初期−ＣＯＯＨ官能基に対して化学量論的な量のビ
オチン−Ｘ−カダベリン、 − 渦巻攪拌（４００回転／分）。
下記の条件下で行なった。 − 媒体： 蒸留水（４ml）、 − 初期−ＣＯＯＨ官能基に対して化学量論的な量のビ
オチン−Ｘ−カダベリン、 − 渦巻攪拌（４００回転／分）。
【００９７】得られた生成物は下記の特性を有する。
【００９８】ビオチン−Ｘ−カダベリンによりグラフト
化されたラテックスの百分率は約７％（初期のカルボキ
シル官能基に対するビオチン官能基のマイクロ当量とし
て表わす）である。
化されたラテックスの百分率は約７％（初期のカルボキ
シル官能基に対するビオチン官能基のマイクロ当量とし
て表わす）である。
【００９９】ナトリウムアジド０．０１％（最終濃度）
を含む、２回蒸留水中のストレプトアビジンペルオキシ
ダーゼ溶液を、ラテックス上にグラフト化されたビオチ
ン１モルあたりストレプトアビジンペルオキシダーゼ２
モルの量で、すなわちビオチン２．１μｇに対してペル
オキシダーゼに結合したストレプトアビジン１ｍｇの量
で、ビオチン化ラテックスに加える。
を含む、２回蒸留水中のストレプトアビジンペルオキシ
ダーゼ溶液を、ラテックス上にグラフト化されたビオチ
ン１モルあたりストレプトアビジンペルオキシダーゼ２
モルの量で、すなわちビオチン２．１μｇに対してペル
オキシダーゼに結合したストレプトアビジン１ｍｇの量
で、ビオチン化ラテックスに加える。
【０１００】ビオチン−ストレプトアビジン結合をＰＢ
Ｓ＋ＢＳＡ緩衝液［ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１ g
/lを含む０．２５ＭのＮａＣｌ中０．１Ｍリン酸塩、pH
７．２］中で行ない、次いでラテックス−ストレプトア
ビジンを０．２５ＭのＮａＣｌ中０．１Ｍリン酸緩衝液
で４回洗浄し、この緩衝液１ml中に保存する。実施例２：ビオチン化した非磁性カルボキシル化ラテッ
クスの製造 使用する非磁性ラテックスは、PROLABO 社からESTAPOR
K1. 030 の番号で市販されている製品で、下記の特性を
有する。 − ビーズの平均直径 ０．３μｍ − 推定密度 １g.ml-1 − 懸濁液中のラテックスの質量百分率 １０％ − −ＣＯＯＨ官能基の表面濃度 乾燥ラテックスの２３７μeq.g-1 − ビーズの表面積 ０．２８μｍ2 − ビーズの体積 ０．０１３９μｍ3 − 乾燥ラテックス１ｇあたりのビーズ数 ７．９ｘ１０13 − ビーズ１個あたりの−ＣＯＯＨ官能基 ２ｘ１０6 の数 − −ＣＯＯＨ官能基の密度 ７．１−ＣＯＯＨ／nm2 これらのラテックスは単分散性である。
Ｓ＋ＢＳＡ緩衝液［ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１ g
/lを含む０．２５ＭのＮａＣｌ中０．１Ｍリン酸塩、pH
７．２］中で行ない、次いでラテックス−ストレプトア
ビジンを０．２５ＭのＮａＣｌ中０．１Ｍリン酸緩衝液
で４回洗浄し、この緩衝液１ml中に保存する。実施例２：ビオチン化した非磁性カルボキシル化ラテッ
クスの製造 使用する非磁性ラテックスは、PROLABO 社からESTAPOR
K1. 030 の番号で市販されている製品で、下記の特性を
有する。 − ビーズの平均直径 ０．３μｍ − 推定密度 １g.ml-1 − 懸濁液中のラテックスの質量百分率 １０％ − −ＣＯＯＨ官能基の表面濃度 乾燥ラテックスの２３７μeq.g-1 − ビーズの表面積 ０．２８μｍ2 − ビーズの体積 ０．０１３９μｍ3 − 乾燥ラテックス１ｇあたりのビーズ数 ７．９ｘ１０13 − ビーズ１個あたりの−ＣＯＯＨ官能基 ２ｘ１０6 の数 − −ＣＯＯＨ官能基の密度 ７．１−ＣＯＯＨ／nm2 これらのラテックスは単分散性である。
【０１０１】ラテックスは活性化する前に洗浄する。
【０１０２】活性化反応は、カルボキシル官能基の濃度
６２μＭ、７過剰のＥＤＣおよび３過剰のＳ−ＮＨＳを
含む２回蒸留水の中で完全に行なう。
６２μＭ、７過剰のＥＤＣおよび３過剰のＳ−ＮＨＳを
含む２回蒸留水の中で完全に行なう。
【０１０３】３分以内に、活性エステルの形成に必要な
Ｓ−ＮＨＳの量は完全に消費される（ＯＤ＝０．６
８）。
Ｓ−ＮＨＳの量は完全に消費される（ＯＤ＝０．６
８）。
【０１０４】ビオチン−Ｘ−カダベリンのグラフト化を
下記の条件下で行なった。 − 媒体： 蒸留水、 − 初期−ＣＯＯＨ官能基に対して化学量論的な量のビ
オチン−Ｘ−カダベリン、 − 渦巻攪拌（４００回転／分）。
下記の条件下で行なった。 − 媒体： 蒸留水、 − 初期−ＣＯＯＨ官能基に対して化学量論的な量のビ
オチン−Ｘ−カダベリン、 − 渦巻攪拌（４００回転／分）。
【０１０５】ビオチン−Ｘ−カダベリンによりグラフト
化されたラテックスの百分率は約７％（初期のカルボキ
シル官能基に対するビオチン官能基のマイクロ当量とし
て表わす）である。
化されたラテックスの百分率は約７％（初期のカルボキ
シル官能基に対するビオチン官能基のマイクロ当量とし
て表わす）である。
【０１０６】ナトリウムアジド０．０１％（最終濃度）
を含む、２回蒸留水中のストレプトアビジンペルオキシ
ダーゼ溶液を、ラテックス上にグラフト化されたビオチ
ン１モルあたりストレプトアビジンペルオキシダーゼ２
モルの量でビオチン化ラテックスに加え、複合体を得
る。
を含む、２回蒸留水中のストレプトアビジンペルオキシ
ダーゼ溶液を、ラテックス上にグラフト化されたビオチ
ン１モルあたりストレプトアビジンペルオキシダーゼ２
モルの量でビオチン化ラテックスに加え、複合体を得
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ // Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｚ (72)発明者 ピエール、ブロン フランス国フランシュビル、シュマン、 ド、ラ、シャルドニエール、３ (72)発明者 フランソワーズ、レラ フランス国ノルナン、ル、ロセオン（番地 なし) (72)発明者 ジャン‐リュック、タブロー フランス国ジャポノスト、リュ、マリウ ス、ファーブル、３
Claims (23)
- 【請求項１】エチレン性不飽和モノマーの重合により得
られる重合体からなり、表面に官能基を有するラテック
ス小球であって、ビオチン残基が前記基の少なくとも一
部の上に、２価の鎖を介してグラフト化されていること
を特徴とする、ラテックス小球。 - 【請求項２】２価の鎖の平均長が５〜１２０オングスト
ロームである、請求項１に記載の小球。 - 【請求項３】２価の鎖が３〜８０個の原子を有する、請
求項１または２に記載のラテックス小球。 - 【請求項４】ビオチン残基が式 【化１】 （式中、Ｒ1 は２価のＣ1 〜Ｃ8 炭化水素基であり、Ｘ
は酸素原子、硫黄原子またはイミノ基Ｎ−Ｈであり、Ｚ
は基Ｃ＝Ｏまたは−Ｓ−である。）を有する、請求項１
〜３のいずれか１項に記載のラテックス小球。 - 【請求項５】ラテックス小球が下記の構造 Ｍ−［ＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｂ］n III （式中、ｎは単位表面積あたりのグラフト化された分子
の平均数を表わし、特に平方ナノメートルあたり０．１
〜１０であり、Ｍはラテックス小球を表わし、Ｂはビオ
チン残基であり、Ｒは、所望により、窒素、酸素、硫黄
またはリン原子から選択された１個以上の異種原子、１
個以上のカルボニル基または誘導体、１個以上の環また
は複素環化合物を含む、所望により置換された２価の炭
化水素基である。）を有する、請求項１〜４のいずれか
１項に記載のラテックス小球。 - 【請求項６】ビオチン残基が式 【化２】 を有する、請求項５に記載のラテックス小球。
- 【請求項７】Ｒが、式 （式中、Ｒ2 、Ｒ3 は、同一であるか、または異なるも
のであって、２価のＣ2〜Ｃ6 鎖である。）の２価の残
基からなる群から選択される、請求項６に記載のラテッ
クス小球。 - 【請求項８】ラテックス小球が下記の構造 Ｍ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−Ｂ］n IV （式中、ｎは単位表面積あたりのグラフト化された分子
の平均数を表わし、特に平方ナノメートルあたり０．１
〜１０であり、Ｍはラテックス小球を表わし、Ｂはビオ
チン残基であり、Ｒは、所望により、窒素、酸素、硫黄
またはリン原子から選択された１個以上の異種原子、１
個以上のカルボニル基または誘導体、１個以上の環また
は複素環化合物を含む、所望により置換された２価の炭
化水素基である。）を有する、請求項１〜４のいずれか
１項に記載のラテックス小球。 - 【請求項９】ビオチン残基が式 【化３】 を有する、請求項８に記載のラテックス小球。
- 【請求項１０】Ｒが、式 【化４】 の２価の残基からなる群から選択される、請求項８に記
載のラテックス小球。 - 【請求項１１】小球の１平方ナノメートルあたりの官能
基の表面密度が１〜５０である、請求項１〜１０のいず
れか１項に記載のラテックス小球。 - 【請求項１２】小球上に存在する官能基の数に対するビ
オチン残基の百分率が１〜５０％である、請求項１〜１
１のいずれか１項に記載の小球。 - 【請求項１３】ビオチン化ラテックス小球およびアビジ
ンまたはストレプトアビジンの複合体であって、ビオチ
ン化ラテックス小球が、請求項１〜１２のいずれか１項
に記載のものであることを特徴とする複合体。 - 【請求項１４】ビオチン残基１個あたり約１分子のアビ
ジンまたはストレプトアビジンが結合している、請求項
１３に記載のビオチン化ラテックス小球およびアビジン
またはストレプトアビジンの複合体。 - 【請求項１５】請求項１〜１２のいずれか１項に記載の
小球の、または、請求項１３または１４に記載の複合体
の製造方法であって、 ａ）小球の官能基を活性化させる工程、 ｂ）末端が、活性化された官能基に対して反応性を有す
るビオチン化された鎖をグラフト化する工程、 ｃ）所望により、アビジンまたはストレプトアビジンと
複合体形成する工程、 を行なうことを特徴とする方法。 - 【請求項１６】請求項１５に記載のラテックス小球の、
構造III の小球の製造方法であって、 ａ）カルボジイミドの存在下で、スルホ−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）により、カルボキシル
化ラテックスを活性化する工程、 ｂ）ＮＨ2 末端を有するビオチン化鎖を、活性化された
ラテックス上にグラフト化する工程、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１７】請求項１５に記載のラテックス小球の、
構造IVの小球の製造方法であって、 ａ）スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドア
ルキル）アリールエステル型のヘテロ２官能性スペーサ
ーアームによりアミン含有ラテックスを活性化させる工
程、および ｂ）−ＳＨ末端を有するビオチン化鎖を、活性化された
ラテックス上にグラフト化する工程、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１８】スペーサーアームがスルホスクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドアルキル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートまたはＳ−ＳＭＣＣである、請
求項１７に記載の製造方法。 - 【請求項１９】アビジンまたはストレプトアビジンとの
複合体が、過剰モルのアビジンまたはストレプトアビジ
ンと接触させることにより得られる、請求項１５〜１８
のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項２０】アビジンまたはストレプトアビジンの過
剰モルが約ファクター２である、請求項１９に記載の製
造方法。 - 【請求項２１】請求項１〜１２のいずれか１項に記載の
小球、または請求項１３または１４に記載の複合体の、
生物学的検出用試薬としての使用。 - 【請求項２２】この使用がハイブリダイゼーションまた
はＤＮＡの配列決定を目的とする、請求項２１に記載の
使用。 - 【請求項２３】この使用がタンパク質の精製または細胞
選別を目的とする、請求項２２に記載の使用。
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| FR9410789 | 1994-09-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| US (1) | US5795719A (ja) |
| EP (1) | EP0700933A1 (ja) |
| JP (1) | JPH08198911A (ja) |
| CA (1) | CA2157811A1 (ja) |
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| JP2008514424A (ja) * | 2004-10-01 | 2008-05-08 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 複合濾過物品 |
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| JP4797144B2 (ja) * | 2000-08-21 | 2011-10-19 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子 |
| JP2016020822A (ja) * | 2014-07-14 | 2016-02-04 | 住友ベークライト株式会社 | 分析用担体、その製造方法および使用方法 |
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-
1995
- 1995-09-07 EP EP95402027A patent/EP0700933A1/fr not_active Withdrawn
- 1995-09-08 US US08/525,065 patent/US5795719A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1995-09-11 JP JP7258133A patent/JPH08198911A/ja active Pending
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