CN112175225A - 一种聚乙二醇修饰的固相表面及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种聚乙二醇修饰的固相表面及其制备方法和应用，所述聚乙二醇修饰的固相表面包括固相表面以及修饰在所述固相表面的带有功能基团的聚乙二醇。本发明所述聚乙二醇修饰的固相表面不仅可以降低固相表面的非特异性吸附，还能提升免疫分析的灵敏度以及拓宽检测范围。

Description

一种聚乙二醇修饰的固相表面及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料的化学修饰领域，涉及一种聚乙二醇修饰的固相表面及其制备方法和应用。
背景技术
标记免疫分析技术是当代免疫分析的主流核心技术，标记免疫分析，顾名思义，就是将标记技术和免疫技术相结合进行分析测定，其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性和各标记物的高灵敏可测量性来检测体内各种生物活性物质的活性和浓度。基于标记物的不同(如酶、胶体金、荧光物、发光剂等)，可以分为酶联免疫分析，荧光免疫分析，胶体金免疫分析，化学发光免疫分析等等分析技术；无论哪种标记免疫分析技术，都需要一个固相载体对蛋白质或者小分子进行固定；通过固相载体的固定，在检测的过程中可对目标蛋白和非目标蛋白进行分离，从而达到分析目标蛋白的目的。常见的固相载体有酶标板、聚苯乙烯微球、NC膜、磁珠等等。蛋白质或者小分子在固相载体上固定的方法有物理吸附法和共价交联法。
在标记免疫分析中，待测物中的其它蛋白质在固相表面的非特异性吸附是自然发生的，即使固相载体在固定蛋白质或者小分子后又进行了封闭处理(如采用Glycine封闭，CMO封闭或酪蛋白封闭)，或者是固相载体在交联蛋白质前进行了修饰处理(如用葡聚糖修饰处理)，但是这些处理并没有真正解决由于蛋白质的非特异性吸附造成假阳性或假阴性问题，而且这些处理还引起了免疫分析灵敏度的下降等问题。因此，解决蛋白质的非特异性吸附问题，应该对因寻找解决方案。
蛋白质在固相表面的非特异性吸附，疏水作用力和静电力被认为是非特异性吸附的两大起因，因此控制疏水作用力和静电力作用是抵抗非特异性吸附的物质所应该具有的性质。
聚乙二醇([CH2CH2O]n，Polyethylene glycol，PEG)是一种由环氧乙烷开环聚合形成的直链或枝状聚醚。PEG是一种大分子聚合物，具有线性原子排列，它最重要的性质就是强极化性质以及由此带来的亲水性与水溶性；同时，PEG在广泛pH范围内均为电中性，这种性质可以阻断基质与蛋白质之间的静电场相互作用；PEG的特点使得其可以阻断产生非特异性吸附的疏水力和静电力，因此，使用PEG可以在免疫分析中起到抗非特异性吸附的作用。
但是，在实际运用中，如何使用PEG去解决非特异性吸附吸附，并且在消除非特异性吸附的同时又能保证或者提升免疫分析的灵敏度和检测范围，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的固相表面其制备方法和应用。本发明所述聚乙二醇修饰的固相表面不仅可以降低固相表面的非特异性吸附，还能提升免疫分析的灵敏度以及扩宽检测范围。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种聚乙二醇修饰的固相表面，所述聚乙二醇修饰的固相表面包括固相表面以及修饰在所述固相表面的带有功能基团的聚乙二醇。
在本发明中，采用带有功能基团的不同链长的聚乙二醇共价修饰的固相表面不仅可以降低固相表面的非特异性吸附，还能提升免疫分析的灵敏度以及拓宽检测范围。
优选地，所述聚乙二醇的功能基团为羧基、氨基、巯基、羟基或马来酰亚胺等活性基团。
优选地，所述带有功能基团的聚乙二醇为单臂和/或多臂的带有功能基团的聚乙二醇。
优选地，所述单臂的带有功能基团的聚乙二醇的分子量为350-20000，例如350、500、700、900、1000、3000、5000、8000、10000、13000、15000、18000或20000。
优选地，所述多臂的带有功能基团的聚乙二醇的分子量为2000-40000，例如2000、5000、8000、10000、13000、15000、18000、20000、23000、25000、28000、30000、35000、38000或40000。
优选地，所述多臂为4臂、6臂或8臂。
的活性基团共价结合而修饰在固相表面；
优选地，所述固相表面为固相纳米微球；
优选地，所述固相纳米微球表面的活性基团为羧基、醛基或环氧基。
优选地，所述固相纳米微球的粒径为50nm～300nm，例如50nm、80nm、100nm、110nm、130nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm或300nm。
对纳米微球表面进行改性，使得纳米微球的表面亲水性更强，降低了蛋白质在其表面的非特异性吸附，从而降低了免疫分析中的假阳或者漏检，还能提升免疫分析的灵敏度以及扩宽分析检测范围。
另一方面，本发明提供了如上所述的聚乙二醇修饰的固相表面的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)向含有固相表面的缓冲液中加入带功能基团的聚乙二醇，混合得到反应液；
(2)向步骤(1)得到的反应液中加入活化试剂，孵育，得到所述聚乙二醇表面修饰的固相表面。
通过本发明的方法，聚乙二醇可以通过其表面活性基团同纳米微球表面的活性基团共价结合，对纳米微球表面进行改性，使得纳米微球的表面亲水性更强，降低了蛋白质在其表面的非特异性吸附，从而降低免疫分析中的假阳或者漏检，并且还能提升免疫分析的灵敏度以及扩宽检测范围。
优选地，步骤(1)所述固相表面为固相纳米微球；
优选地，含有固相表面(例如固相纳米微球)的缓冲液中固相表面的固含量为1-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
优选地，步骤(1)所述缓冲液为pH为5-7(例如5、5.3、5.5、5.8、66.4、6.8或7)的MES缓冲液。
优选地，步骤(1)中相对于10mg所述固相微球，所述带功能基团的聚乙二醇的用量为0.35-240mg，例如0.35mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、150mg、180mg、200mg、220mg或240mg。
优选地，步骤(2)所述活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、WSC(N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)或氰基硼氢化钠(NaCNBH3)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述活化试剂用pH为5-7(例如5、5.3、5.5、5.8、66.4、6.8或7)的MES缓冲液配制为活化试剂溶液后，加入骤(1)得到的混合液中。
优选地，所述活化试剂溶液的浓度为10-100mg/mL。
优选地，相对于步骤(1)中10mg所述固相表面，步骤(2)所述活化试剂的用量为0.1-6mg，例如0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg或6mg。
优选地，步骤(2)所述孵育在37±2℃下进行。
优选地，步骤(2)所述孵育在搅拌下进行。
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为16-26小时，例如16小时、17小时、18小时、20小时、22小时、24小时或26小时。
优选地，步骤(2)所述孵育结束后，将反应液离心、弃上清、重悬、再次离心，弃上清，得到所述聚乙二醇表面修饰的固相表面。
另一方面，本发明提供了如上所述的聚乙二醇表面修饰的固相表面在免疫分析中的应用。
本发明所述的聚乙二醇表面修饰的固相表面(例如固相纳米微球)用于免疫分析，可以降低免疫分析中的假阳或者漏检，还能提升免疫分析的灵敏度以及扩宽检测范围。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的聚乙二醇修饰的固相表面，不仅可以降低固相表面的非特异性吸附，还能提升免疫分析的灵敏度以及扩宽检测范围。
附图说明
图1为实施例1中氨基羧基聚乙二醇修饰的羧基乳胶微球的制备过程示意图；
图2为实施例2中氨基羧基聚乙二醇修饰醛基乳胶微球的制备过程示意图；
图3为实施例3中羧基聚乙二醇修饰环氧基时间分辨荧光(TRF)微球的制备过程示意图；
图4为实施例4中氨基马来酰亚胺聚乙二醇修饰羧基受体微球的制备过程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种分子量1000的氨基羧基聚乙二醇修饰的羧基乳胶微球，其制备过程示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
取1ml粒径150nm羧基乳胶微球(5％固含量)，用1.5ml 0.1M的pH 5的MES缓冲液稀释至2％的固含；缓慢搅拌加入10mg分子量为1000的NH2(CH2CH2O)n CH2COOH；称取EDC/EDAC/WSC，用0.1M的pH 5MES配制成20mg/ml；向上述胶乳聚乙二醇反应液中加入100μL的EDC/EDAC/WSC溶液；37度孵育，300rpm搅拌过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用等体积的纯化水超声重新悬浮，再次15000g，20min离心，弃去上清，得到了聚乙二醇修饰的乳胶微球，其表面为羧基。
将该聚乙二醇修饰的羧基乳胶微球应用于免疫分析检测，方法如下：
向制备得到的聚乙二醇修饰的乳胶微球中加入2.5mL 0.1M的MES缓冲液超声悬浮乳胶微球；分别称取EDC/EDAC/WSC，NHS，分别用0.1M pH 5的MES配制成20mg/mL和10mg/mL；向如上乳胶微球溶液中依次加入100μL的EDC/EDAC/WSC溶液，75μL的NHS溶液；室温搅拌反应30min；离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M pH8.0的PB缓冲液4mL超声重悬胶乳微球，加入1mL的anti-CRP抗体(5mg/mL)，迅速混匀，37度反应2h；加入10％的BSA 250μL，37度反应过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；加入5mL的0.02M的pH7.4的PB超声重悬，再次离心，如此重复2次；最后采用0.02M的pH7.4的PB+1％BSA缓冲液稀释包被好的胶乳抗体到2mg/mL，生化仪，510nm检测；结果见表1。
表1分子量1000的PEG修饰羧基胶乳微球的免疫分析结果
胶乳CRP 未用PEG修饰 1000的氨基羧基PEG修饰
样本1，2.8mg/L 测值10.3mg/L 测值2.6mg/L
样本2，6.8mg/L 测值15.7mg/L 测值7.3mg/L
灵敏度<1mg/L 0.498mg/L 0.217mg/L
结果发现，经过分子量1000的PEG的修饰，不仅降低了样本因非特异性造成的假阳性，还极大地提升了试剂的检测灵敏度。
实施例2
本实施例提供一种分子量10000的氨基羧基聚乙二醇修饰醛基乳胶微球，其制备过程示意图如图2所示，具体包括以下步骤：
取0.5mL粒径150nm醛基乳胶微球(10％固含量)，用2mL 0.05M的pH 6的MES缓冲液稀释至2％的固含；缓慢搅拌加入100mg的分子量为10000的NH2(CH2CH2O)n CH2COOH；37℃，300rpm震摇反应4h；称取NaCNBH3，用0.05M的pH 6的MES配成20mg/mL溶液，迅速滴加80μL至反应液中，37℃，300rpm震摇反应过夜；后续步骤与实施例1相同，制备得到分子量10000的氨基羧基聚乙二醇修饰醛基乳胶微球，其表面为羧基；
将该聚乙二醇修饰的醛基乳胶微球用于免疫分析检测，其方法与实施例1中相同。结果见表2。
表2分子量10000的氨基羧基PEG修饰醛基胶乳微球的免疫分析结果
胶乳CRP 未用PEG修饰 10000的氨基羧基PEG修饰
样本1，2.8mg/L 测值10.3mg/L 测值3.1mg/L
样本2，6.8mg/L 测值15.7mg/L 测值6.6mg/L
检测范围 200mg/L 300mg/L
结果发现，经过分子量10000的PEG的修饰，不仅降低了样本因非特异性造成的假阳性，还大大地拓宽了试剂的检测范围。
实施例3
本实施例提供一种分子量20000的羧基聚乙二醇修饰环氧基时间分辨荧光(TRF)微球；其制备过程示意图如图3所示，具体包括以下步骤：
取2.5mL粒径200nm的环氧基时间分辨荧光微球(2％固含量)，加入50μL的10％的1,6己二醇溶液，90度反应过夜；将上述溶液装入透析袋(截留分子量3000)，透析除去小分子得到氨基微球；氨基微球采用15000g，20min高速离心，弃上清，用2.5mL 0.1M的pH 5的MES缓冲液超声重悬至2％的固含；缓慢搅拌加入150mg的分子量为20000的HOOC-O(CH2CH2O)nCOOH，称取EDC/EDAC/WSC，用0.1M的pH 5MES配制成10mg/mL；取200μL滴加到微球PEG反应液中；37度孵育，300rpm搅拌过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用等体积的纯化水超声重新悬浮，再次15000g，20min离心，弃去上清，得到了分子量20000的羧基聚乙二醇修饰环氧基时间分辨荧光(TRF)微球，其表面为羧基。
将该聚乙二醇修饰环氧基时间分辨荧光微球用于免疫分析检测，其方法如下：
加入2.5mL 0.1M的MES缓冲液超声悬浮乳胶微球；分别称取EDC/EDAC/WSC，NHS，分别用0.1M pH 5的MES配制成20mg/mL和10mg/mL；向乳胶微球溶液中依次加入100μL的EDC/EDAC/WSC溶液，75μL的NHS溶液；室温搅拌反应30min；离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M pH8.0的PB缓冲液3.2mL超声重悬微球，加入0.8mL的anti-CRP抗体(5mg/mL)，迅速混匀，37℃反应2h；加入10％的BSA 250μL，37℃反应过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M的pH7.4的PB超声重悬微球，再次离心，如此重复2次；最后采用0.02M的pH7.4的PB+1％BSA缓冲液保存微球抗体TRF-anti-CRP结合物；然后稀释到0.5mg/mL；在时间分辨荧光免疫层析系统上测试CRP项目，结果如表3所示。
表3分子量20000的羧基PEG修饰环氧基TRF微球的免疫分析结果
TRF-anti-CRP 未用PEG修饰 20000的羧基PEG修饰
样本3,11.5mg/L 测值3.5mg/L 测值12.3mg/L
样本4,4.6mg/L 测值15.3mg/L 测值4.9mg/L
检测范围 200mg/L 330mg/L
结果发现，经过分子量20000的羧基PEG的修饰，得到了同实施例2相同的结论：不仅降低了样本因非特异性造成的假阳性和假阴性，还大大地拓宽了试剂的检测范围。
实施例4
本实施例提供一种分子量5000的氨基马来酰亚胺聚乙二醇修饰羧基受体微球，其制备过程示意图如图4所示，具体包括以下步骤：
取2.5mL粒径200nm羧基受体微球(2％固含量)，15000g，20min，弃上清；用2.5mL0.1M的pH 5的MES缓冲液超声重悬至2％的固含；缓慢搅拌加入40mg的分子量为5000的氨基马来酰亚胺聚乙二醇；称取EDC/EDAC/WSC，用0.1M的pH 5MES配制成40mg/mL；向上述胶乳聚乙二醇反应液中加入50μL的EDC/EDAC/WSC溶液；37度孵育，300rpm搅拌过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用等体积的纯化水超声重新悬浮，再次15000g，20min离心，弃去上清，得到了聚乙二醇修饰的受体微球，其表面为马来酰亚胺基团。
将该聚乙二醇修饰的受体微球用于免疫分析检测，其方法如下：
用0.02M pH8.5的PB缓冲液3.5mL超声重悬微球，加入0.5mL的TPO(1mg/mL)，迅速混匀，37度反应过夜；加入5％的乙二醇200μL，37度300rpm反应30min；加入现配的10mg/mL的NaCNBH3溶液100μL，37度300rpm反应2h；加入10％的BSA 200μL，37度300rpm反应过夜；将上述反应液于离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M的pH7.4的PB超声重悬微球，再次离心，如此重复2次；最后采用0.02M的pH7.4的PB+1％BSA缓冲液保存微球；稀释至25ug/mL；在均相检测仪Envision上测试TPO项目；测试结果如表4所示。
表4分子量5000的氨基马来酰亚胺PEG修饰羧基受体微球的免疫分析结果
Figure BDA0002702058990000101
结果发现，受体微球经过分子量5000的氨基马来酰亚胺PEG的修饰，同TPO抗原交联，发现试剂的灵敏度和线性范围都有得到显著改善。
实施例5
本实施例提供一种分子量20000的氨基马来酰亚胺聚乙二醇修饰羧基供体微球，其制备过程示意图如图4所示，具体包括以下步骤：
取5mL粒径180nm羧基供体微球(1％固含量)，15000g，20min，弃上清；用2.5mL0.1M的pH 5的MES缓冲液超声重悬至2％的固含；缓慢搅拌加入160mg的分子量为20000的氨基马来酰亚胺聚乙二醇；称取EDC/EDAC/WSC，用0.1M的pH 5MES配制成40mg/mL；向上述胶乳聚乙二醇反应液中加入200μL的EDC/EDAC/WSC溶液；37度孵育，300rpm搅拌过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用等体积的纯化水超声重新悬浮，再次15000g，20min离心，弃去上清，得到了聚乙二醇修饰的供体微球，其表面为马来酰亚胺基团。
将该聚乙二醇修饰的供体微球用于免疫分析检测，其方法如下：
用0.02M pH8.5的PB缓冲液3.5mL超声重悬微球，加入1mL的anti-AFP(5mg/mL)，迅速混匀，37度反应过夜；加入5％的乙二醇200μL，37度300rpm反应30min；加入现配的10mg/mL的NaCNBH3溶液100μL，37度300rpm反应2h；加入10％的BSA 200μL，37度300rpm反应过夜；将上述反应液于离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M的pH7.4的PB超声重悬微球，再次离心，如此重复2次；最后采用0.02M的pH7.4的PB+1％BSA缓冲液保存微球；稀释至20ug/mL；在均相检测仪Envision上测试TPO项目；测试结果如表5所示。
表5分子量20000的氨基马来酰亚胺PEG修饰羧基供体微球的免疫分析结果
Figure BDA0002702058990000111
Figure BDA0002702058990000121
结果发现，供体微球经过分子量20000的氨基马来酰亚胺PEG的修饰，同anti-AFP交联，发现不仅能消除因非特异造成的假阳性和假阴性，还能保证试剂的灵敏度不下降，并显著拓宽试剂的线性范围。
实施例6
等比例混合实施例1和实施例2制备得到的氨基羧基PEG修饰的胶乳微球，然后再同anti-CRP抗体进行偶联，稀释至2mg/ml，作为胶乳CRP试剂，利用生化仪，510nm检测；其检测方法同实施例1。结果见表6。
表6混合分子量1000和10000的氨基羧基PEG修饰的胶乳CRP结果
Figure BDA0002702058990000122
结果发现，经过混合分子量1000和10000的氨基羧基PEG修饰胶乳制成胶乳CRP试剂，不仅降低了免疫分析中因非特异性造成的假阳性，同时可以提升试剂的灵敏度以及拓宽试剂的检测范围。
对比例1
本对比例提供一种醛基葡聚糖修饰的乳胶微球(同实施例1对比，醛基葡聚糖是一种多羟基醛，可用于固相表面的亲水性修饰)，其制备方法如下：
取2.5mL粒径150nm的环氧基乳胶微球(2％固含量)，加入50μL的10％的1,6己二醇溶液，90度反应过夜；将上述溶液装入透析袋(截留分子量3000)，透析除去小分子得到氨基微球；称取100mg的醛基葡聚糖，用0.1M的pH 5的MES缓冲液溶解后加入到上述氨基微球溶液中；称取NaCNBH3，用0.1M的pH 5MES配制成20mg/mL；迅速滴加0.1mL到上述反应液中；37度孵育，300rpm搅拌过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；用等体积的0.1M的MES缓冲液超声重新悬浮，再次15000g，20min离心，弃去上清，得到了醛基葡聚糖修饰的乳胶微球，其表面为醛基。
向醛基胶乳微球中加入2mL的anti-CRP抗体(5mg/mL)，迅速混匀，37度反应30min；称取NaCNBH3，用0.1M的pH 5MES配制成10mg/mL；迅速滴加0.2mL到上述反应液中；37度孵育，300rpm搅拌过夜；向反应液加入10％的BSA 250μL，37度反应过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；加入5mL的0.02M的pH7.4的PB超声重悬，再次离心，如此重复2次；最后采用0.02M的pH7.4的PB+1％BSA缓冲液稀释包被好的胶乳抗体到2mg/mL，生化仪，510nm检测；
结果见表7；
表7醛基葡聚糖和PEG修饰胶乳微球的结果
Figure BDA0002702058990000131
Figure BDA0002702058990000141
结果发现，醛基葡聚糖修饰的胶乳微球，可以降低样本非特异性造成的假阳性，但是对试剂的灵敏度没有帮助，而采用分子量1000的PEG的修饰，不仅降低了样本因非特异性造成的假阳性,还极大地提升了试剂的检测灵敏度。
实施例7
本实施例提供分子量为1000的羧基氨基PEG修饰的羧基TRF微球，其制备过程示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
取2.5mL粒径150nm的醛基TRF微球(2％固含量)，15000g，20min离心后，用0.1M的pH 5的MES缓冲液重新超声悬浮到2％；缓慢搅拌加入10mg分子量为1000的NH2(CH2 CH2O)nCH2COOH；37℃，300rpm震摇反应4h；称取NaCNBH3，用0.05M的pH 6的MES配成20mg/mL溶液，迅速滴加80μL至反应液中，37℃，300rpm震摇反应过夜；离心机15000g，20min离心，弃去上清；如此两遍；得到了聚乙二醇修饰的TRF微球，其表面为羧基。
将该聚乙二醇修饰的乳胶微球用于免疫分析检测，其方法如下：
加入2.5mL 0.1M的pH 5的MES超声悬浮TRF微球至固含量为2％；分别称取EDC/EDAC/WSC，NHS，分别用0.1M pH 5的MES配制成20mg/mL和10mg/mL；向聚乙二醇修饰的TRF微球中依次加入100μL的EDC/EDAC/WSC溶液，75μL的NHS溶液；室温搅拌反应30min；离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M pH8.0的PB缓冲液4mL超声重悬活化的TRF微球，加入1mL的anti-CRP(5mg/mL)，迅速混匀，37度反应2h；加入10％的BSA 250μL，37度反应过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；加入5mL的0.02M的pH7.4的PB超声重悬，再次离心，如此重复2次；最后用PB+1％BSA缓冲液将交联的TRF-anti-CRP悬浮成1mg/mL备用；在时间分辨荧光免疫层析系统上测试CRP项目。
对比例2
本对比例提供一种采用生物素亲和素(Biotin-SA)的羧基TRF微球(同羧基氨基PEG修饰的TRF微球对比)
生物素亲和素(Biotin-SA)的羧基TRF微球的制备以及免疫分析检测如下：取2.5mL粒径150nm的羧基TRF微球(2％固含量)，15000g，20min离心后，用0.1M的pH 5的MES缓冲液重新超声悬浮到2％；分别称取EDC/EDAC/WSC，NHS，分别用0.1M pH 5的MES配制成20mg/mL和10mg/mL；向步骤2的微球溶液中依次加入100μL的EDC/EDAC/WSC溶液，75μL的NHS溶液；室温搅拌反应30min；离心机15000g，20min离心，弃去上清；用0.02M pH8.0的PB缓冲液4mL超声重悬活化的TRF微球，加入1mL的SA链霉亲和素(5mg/mL)，迅速混匀，37度反应2h；加入10％的BSA 250μL，37度反应过夜；将反应液离心机15000g，20min离心，弃去上清；加入5mL的0.02M的pH7.4的PB超声重悬，再次离心，如此重复2次；最后用PB+1％BSA缓冲液将交联的TRF-SA悬浮成1mg/mL备用；采用EZ-LinkTMNHS-Biotin(Thermo Fisher，20217)按照说明书进行anti-CRP抗体的标记；标记后的Biotin-anti-CRP稀释至1ug/mL，配合1mg/mL的TRF-SA试剂在时间分辨荧光免疫层析系统上测试CRP项目。
对比例2以及实施例6的测试结果如下表8所示。
表8 PEG修饰和生物素亲和素系统对TRF微球的灵敏度和抗非特异性吸附的结果
Figure BDA0002702058990000151
Figure BDA0002702058990000161
发现通过生物素亲和素系统，试剂的灵敏度有得到提升，但是并不能降低样本非特异性的干扰；而采用PEG修饰后，不仅提升了试剂灵敏度，还降低了样本因非特异性造成的假阳性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的聚乙二醇表面修饰的固相表面及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的固相表面包括固相表面以及修饰在所述固相表面的带有功能基团的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述聚乙二醇功能基团为羧基、氨基、巯基、羟基或马来酰亚胺等活性基团。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述带有功能基团的聚乙二醇为单臂和/或多臂的带有功能基团的聚乙二醇。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述单臂的带有功能基团的聚乙二醇的分子量为350-20000；
优选地，所述多臂的带有功能基团的聚乙二醇的分子量为2000-40000；
优选地，所述多臂为4臂、6臂或8臂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述带有功能基团的聚乙二醇通过其带有的功能基团与固相表面的活性基团共价结合而修饰在固相表面。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的聚乙二醇修饰的固相表面，其特征在于，所述固相表面为固相纳米微球；
优选地，所述固相纳米微球表面的活性基团为羧基、醛基或环氧基；
优选地，所述固相纳米微球的粒径为50nm～300nm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的聚乙二醇修饰的固相表面的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)向含有固相表面的缓冲液中加入带功能基团的聚乙二醇，混合得到混合液；
(2)向步骤(1)得到的混合液中加入活化试剂，孵育，得到所述聚乙二醇修饰的固相表面。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述固相表面为固相纳米微球；
优选地，步骤(1)所述含有固相表面的缓冲液中固相表面的固含量为1-10％；
优选地，步骤(1)所述缓冲液为pH为5-7的MES缓冲液；
优选地，步骤(1)中相对于10mg所述固相表面，所述带功能基团的聚乙二醇的用量为0.35-240mg。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、WSC或氰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述活化试剂用pH为5-7的MES缓冲液配制为活化试剂溶液后，加入骤(1)得到的混合液中；
优选地，所述活化试剂溶液的浓度为10-100mg/mL；
优选地，相对于步骤(1)中10mg所述固相表面，步骤(2)所述活化试剂的用量为0.1-6mg；
优选地，步骤(2)所述孵育在37±2℃下进行；
优选地，步骤(2)所述孵育在搅拌下进行；
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为16-26小时；
优选地，步骤(2)所述孵育结束后，将反应液离心、弃上清、重悬、再次离心，弃上清，得到所述聚乙二醇表面修饰的固相表面。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的聚乙二醇表面修饰的固相表面在免疫分析中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113267635A (zh) * 2021-04-29 2021-08-17 广东优尼德生物科技有限公司 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒
CN113945653A (zh) * 2021-09-27 2022-01-18 深圳职业技术学院 一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法
CN116718782A (zh) * 2023-06-12 2023-09-08 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基受体微球及其制备方法和应用
CN116735863A (zh) * 2023-06-12 2023-09-12 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104316679A (zh) * 2014-10-29 2015-01-28 南京基蛋生物科技有限公司 超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用
CN104535761A (zh) * 2014-12-18 2015-04-22 基蛋生物科技股份有限公司 超支化聚缩水甘油醚修饰胶乳微球增强免疫比浊法及其应用
CN106947105A (zh) * 2017-03-31 2017-07-14 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法
CN108046276A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 湖北工业大学 一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及其用途
CN110441514A (zh) * 2019-06-18 2019-11-12 北京利德曼生化股份有限公司 一种胶乳微球与抗体复合物的制备方法、产品及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104316679A (zh) * 2014-10-29 2015-01-28 南京基蛋生物科技有限公司 超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用
CN104535761A (zh) * 2014-12-18 2015-04-22 基蛋生物科技股份有限公司 超支化聚缩水甘油醚修饰胶乳微球增强免疫比浊法及其应用
CN106947105A (zh) * 2017-03-31 2017-07-14 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法
CN108046276A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 湖北工业大学 一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及其用途
CN110441514A (zh) * 2019-06-18 2019-11-12 北京利德曼生化股份有限公司 一种胶乳微球与抗体复合物的制备方法、产品及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113267635A (zh) * 2021-04-29 2021-08-17 广东优尼德生物科技有限公司 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒
CN113267635B (zh) * 2021-04-29 2022-02-11 广东优尼德生物科技有限公司 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒
CN113945653A (zh) * 2021-09-27 2022-01-18 深圳职业技术学院 一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法
CN113945653B (zh) * 2021-09-27 2023-08-18 深圳职业技术学院 一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其分析方法
CN116718782A (zh) * 2023-06-12 2023-09-08 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基受体微球及其制备方法和应用
CN116735863A (zh) * 2023-06-12 2023-09-12 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法

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