WO2007126051A1 - 抗リン脂質抗体測定用試薬 - Google Patents

抗リン脂質抗体測定用試薬 Download PDF

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WO2007126051A1
WO2007126051A1 PCT/JP2007/059166 JP2007059166W WO2007126051A1 WO 2007126051 A1 WO2007126051 A1 WO 2007126051A1 JP 2007059166 W JP2007059166 W JP 2007059166W WO 2007126051 A1 WO2007126051 A1 WO 2007126051A1
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phospholipid
reagent
antibody
particles
insoluble carrier
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PCT/JP2007/059166
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Inventor
Isao Hirose
Yoshihiro Kurano
Takashi Nakamura
Masami Sugiyama
Original Assignee
Fujirebio Inc.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a phospholipid-immobilized modified insoluble carrier reagent for measuring an anti-phospholipid antibody.
  • RPR Rapid Plasma Regain
  • VDR L Vehicle Diagnostics Lab
  • RST Reagin Screening Test
  • syphilis test methods are anti-phospholipid antibody test methods represented by anti-syphilis treponema (TP) antibody measurement and RPR method (Rapid Plasma Regain, agglutination method).
  • TP anti-syphilis treponema
  • RPR method Rapid Plasma Regain, agglutination method
  • TP antibody is positive and anti-phospholipid antibody is positive, it is judged as syphilis positive, but if TP antibody is positive and anti-phospholipid antibody is negative, the antibody titer may be high after syphilis healing. . Therefore, if anti-phospholipid antibody measurement is not performed with sufficient sensitivity, an erroneous clinical judgment may be made based on the follow-up of the early stage and prognosis of infection.
  • a reagent in which a phospholipid is immobilized on an inert carrier such as a latex particle (phospholipid-immobilized carrier) and suspended in a buffer solution by a method for measuring an anti-phospholipid antibody has been devised.
  • the antibody in the sample binds to the phospholipid antigen immobilized on the particle, and the labeled secondary antibody further binds to the bound antibody.
  • the amount of label bound to the carrier is sensed as a signal. This method is aimed at automating clinical tests and is now widely used.
  • Patent Document 1 data obtained by modifying latex with polylysine and improving the sensitivity of the VDRL method is shown (for example, Patent Document 1).
  • This increase in sensitivity is achieved by neutralizing the negative charge on the latex surface with polylysine, a cationic polymer, to increase the hydrophobicity, thereby bringing the same hydrophobic phospholipid closer and fixed. This is probably because the amount of phospholipids produced increased.
  • polylysine has drawbacks such as the use conditions being limited to pHll or less.
  • the effect of the present invention shown in the table of Examples in Patent Document 1 varies depending on the specimen, and it can be said that the rate of increase in sensitivity is sufficient!
  • the inert carrier is generally negatively charged. Therefore, in order to increase the binding efficiency with proteins (generally negatively charged) and phospholipids (hydrophobic), it is naturally effective to neutralize the carrier by modification with cationic groups or hydrophobic polymers. Presumed.
  • the above example data shows that the problem is not so simple, and in fact, other factors are involved in a complicated way, and the effect as estimated by force cannot be obtained.
  • a polymer used for the purpose of increasing the hydrophobicity of a carrier is positively charged at one end to allow adsorption to the carrier, and allows the other end to bind to a phospholipid. Therefore, a structure that is hydrophobic is selected.
  • the effect of the polymer on the adsorption Z-binding efficiency and immune reaction efficiency varies slightly depending on the molecular weight of each polymer and the functional group to which it is attached. For example, if the length of the polymer is not sufficient, the adsorption to the carrier Z binding efficiency will be low, resulting in an increase in the sensitivity of the immune response as expected. Is not seen.
  • Patent Document 3 the protein or lipid to be measured may become a physical obstacle when approaching the antigen on the carrier, which may lower the reaction efficiency.
  • Patent Document 1 Akira Special Table 63-501902
  • Patent Document 2 Japan Patent Fair 7-50111
  • Patent Document 3 JP-A-2-168163
  • Patent Document 4 Shoko Sho 63-29223
  • Patent Document 5 JP-A 59-195161
  • the problem to be solved by the present invention is to increase the efficiency of immobilizing a highly hydrophobic phospholipid antigen to an insoluble carrier more than the conventional method, which is strongly demanded from the clinic.
  • An object is to provide a reagent for measuring an antiphospholipid antibody that realizes a sensitive measurement method. Means for solving the problem
  • an antiphospholipid antibody measurement reagent in which a phospholipid is immobilized on a surface-modified insoluble carrier obtained by modifying the surface of a specific insoluble carrier with a specific modifying substance.
  • an antiphospholipid antibody can be immunoassayed with higher sensitivity by performing an immunoassay of the antiphospholipid antibody, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a reagent for measuring an antiphospholipid antibody in which a phospholipid is immobilized on an insoluble carrier in which at least one surface modifying substance is bound to the surface, and (1) the surface modification The substance is an alkylamine having 1422 carbon atoms and the insoluble carrier is latex particles, or (2) the surface modifying substance is an alkylamine, polylysine, betaine modified polylysine and alkyl group carbon having 1422 carbon atoms.
  • a reagent for measuring an antiphospholipid antibody which is at least one selected from the group consisting of polyaminoalkyl (meth) acrylic acid having a number of 13 and a mixture of two or more thereof, and wherein the insoluble carrier is gelatin particles.
  • the present invention provides a phospholipid in the sample by an immunoassay utilizing an antigen-antibody reaction between the phospholipid contained in the antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention and a phospholipid antibody in the sample.
  • an immunoassay method for phospholipid antibodies in a sample comprising measuring antibodies.
  • the present invention provides use of the above-described phospholipid-immobilized surface-modified insoluble carrier for production of a reagent for measuring antiphospholipid antibodies.
  • the present invention in the antiphospholipid antibody immunoassay method using latex particles and gelatin particles that are currently used as a carrier, the sensitivity is greatly improved, and the highly sensitive measurement required by the clinic is possible. .
  • the insoluble carrier used in the present invention is latex particles or gelatin particles, and the size, shape, and presence / absence of magnetism thereof are not particularly limited as long as they are used for an immune reaction. Many of these particles are commercially available.
  • latex particles include IMMUTE X (registered trademark) from JSR and micromer (registered trademark) from micromod. Etc. are easily available. It is also possible to make and use homemade particles (Patent Document 4).
  • the size of the particles is preferably 0.5 30 m, more preferably 2nn! ⁇ 10 / zm.
  • the shape is not necessarily a sphere, and may take various forms such as a cube or a pellet, depending on the manufacturing method, and any of them can be used.
  • the magnetic particles described later can be preferably used. Similar to non-magnetic particles, commercially available magnetic particles can be easily obtained, but home-made particles may also be used.
  • the magnetic particles are those in which insoluble carrier particles are mixed with a magnetic substance such as ferrite, and are widely used in the field of immunoassay and are commercially available.
  • a surface modifying substance is bound to the surface of the insoluble carrier particles.
  • the surface modification material serves to improve the efficiency of immobilizing the highly hydrophobic phospholipid antigen to the insoluble carrier by modifying the surface of the insoluble carrier particles.
  • the surface modifier is an alkylamine having 14 to 22 carbon atoms, preferably octadecylamine.
  • a C14-C22 alkylamine can also be used in mixture of multiple types.
  • the surface modifying substances include alkylamines having 14 to 22 carbon atoms, polylysine, betaine-modified polylysine, and polyaminoalkyl (meth) acrylic having alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms. It is at least one selected from the group consisting of acids and mixtures of two or more thereof.
  • alkylamine having 14 to 22 carbon atoms octadecylamine is preferable.
  • the average molecular weight (viscosity average molecular weight) of polylysine is usually about 4,000 to 300,000, preferably about 10,000 to 100,000.
  • Betaine is a trialkylamino acid (the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms), and is preferably trimethyldaricin.
  • “(Meth) acrylic acid” means methacrylic acid and acrylic acid.
  • polyaminoalkyl (meth) acrylic acid having 1 to 3 carbon atoms in the alkyl group polyaminoethyl methacrylic acid is preferred.
  • the average molecular weight (number average molecular weight) of polyaminoalkyl (meth) acrylic acid is usually about 10,000 to 150,000, preferably about 10,000 to 50,000.
  • the surface modifying material is commercially available, a commercially available material may be used or synthesized.
  • polyaminoethyl methacrylic acid can be prepared by polymerizing 2-aminoethyl methacrylate and dimethylformamide. Polymerization methods are in this field Are well known and are also specifically described in the following examples.
  • a water-soluble crosslinking agent water-soluble carbopositimide; WSC
  • N-cyclohexyl N '— (2-morpholinoethyl) carpositimide “metho-p-toluenesulfonate” can be used.
  • Binding using WSC is well known in the art and can be conveniently performed using commercially available reagents, as described in the examples below, V.
  • the modification of the particles can be performed by physical adsorption, which is conventionally used, or by covalent bonding using WSC. These adsorption and covalent modification methods are well known in this field, and examples of covalent bonds using WSC are also described in the following examples. Covalent modification is desirable because the bond is stable and there are few restrictions on subsequent reaction conditions.
  • Phospholipids are immobilized on the surface-modified insoluble carrier particles.
  • the phospholipid to be immobilized is a corresponding antigen of the antiphospholipid antibody to be measured.
  • the antiphospholipid antibody to be measured may be any antibody as long as it is an antibody against phospholipid, and any of antiphospholipid antibodies that have been immunoassayed conventionally.
  • Preferable examples of phospholipids include at least one selected from the group consisting of cholesterol complexed with cardiolipin, lecithin and lipoprotein (LDL cholesterol, HDL cholesterol, VLDL cholesterol, CM cholesterol, etc.). A mixture of two or more of these is also preferred.
  • the phospholipid is usually immobilized by physical adsorption as in the conventional case.
  • the conditions for physical adsorption of phospholipids are well known.
  • a phospholipid solution is added to a suspension of insoluble carrier particles, and mixed by inverting or stirring at room temperature to 37 ° C for 0.5 to 2 hours. Yes (see examples below).
  • Blocking is preferably performed.
  • Masking is to coat the surface with a phospholipid antigen on a surface-modified insoluble carrier particle, and mask the site with protein or the like.
  • protein or the like Usually done.
  • albumin usi serum albumin (BSA), etc.
  • skim milk, casein, etc. are usually used as before.
  • Masking can be performed in the same manner as in the prior art, and is specifically described in the following examples.
  • Particles on which phospholipids are immobilized are used in the same manner as in the past as antigen-sensitized particles for immunoassay of antiphospholipid antibodies.
  • Anti-phospholipid antibodies can be measured using a carrier V, an immunoassay method! /, Or a deviation method! /.
  • a signal detection method such as a chemiluminescent enzyme immunoassay method, which is one of the sandwich methods described in the Examples below, and an immunoassay method by flowmetry.
  • the present invention is aimed at increasing sensitivity in quantitative measurement of antiphospholipid antibodies, but can also be used for the purpose of increasing sensitivity in qualitative tests (detection). Therefore, “measurement” in the present invention includes both quantification and detection.
  • Immunoassay itself is well known and need not be described in the present specification.
  • the above-described phospholipid-immobilized particles are brought into contact with a specimen and washed. Then, the antibody that reacts with the anti-phospholipid antibody and the antigen antibody reacts, and after washing, the antibody bound to the particles is measured.
  • the antibody bound to the particles can be measured by labeling the antibody with an enzyme, fluorescent substance, radioactive substance, piotin or the like.
  • Anti-phospholipid antibodies are measured by the above method for multiple standard samples of known concentrations, each containing different concentrations of anti-phospholipid antibodies, and calibration is performed based on the relationship between the measured labeling amount and the anti-phospholipid antibodies in the standard sample.
  • An antiphospholipid antibody in a sample can be quantified by creating a line and applying the measurement result of an unknown concentration sample to this calibration curve.
  • the sandwich method using an enzyme that catalyzes a reaction that produces a chemiluminescent substance as a label and a substance that produces a chemiluminescent substance as a substrate is a chemiluminescent enzyme immunoassay.
  • enzyme immunoassay is performed. Among them, particularly sensitive immunoassay becomes possible.
  • chemiluminescent enzyme immunoassay using magnetic particles as particles an automated device is commercially available, and immunoassay can be performed simply and with high sensitivity using a commercially available automated device (see Examples below).
  • the three-way cock was switched to introduce argon gas into the flask. This operation was performed three times, and the inside of the flask was sufficiently replaced with argon gas. After completion of the substitution, the flask was immersed in an oil nose and heated to 65 ° C, and stirred vigorously for 3 hours.
  • reaction solution was concentrated to 1/10 volume with an evaporator, and after completion of concentration, dialyzed against ultrapure water for 2 days with a dialysis tube having a fractional molecular weight of 10,000.
  • the target product was freeze-dried to obtain about 12 g.
  • the average molecular weight was 45000.
  • the average molecular weight was measured under the following conditions.
  • the reaction solution was transferred to a dialysis cellulose tube (Sanko Junyaku Co., Ltd.), dialyzed against water first, and then dialyzed overnight against 6 mM hydrochloric acid. Thereafter, the liquid in the dialysis tube was lyophilized to obtain a yield of 118.9 mg.
  • magnetic latex particles and magnetic gelatin particles were modified with various theoretically possible substances (a to g below).
  • surface modifier those prepared in 1 above (see Table 1) and commercially available products were used.
  • the ratio of particles to surface modifier is 1.5 to 2.
  • cardiolipin ethanol solution prepared in 0.041 mL, 10 mg / mL lecithin (manufactured by egg yolk) (Nacalai Testa Co., Ltd.)-Cholesterol prepared in ethanol solution 0.206 mL, 10 mg / mL (Nacalai Tester) Co.) 0.062 mL of one ethanol solution was mixed to make a total of 0.35 mL of mixed phospholipid antigen solution.
  • Antigens were adsorbed to each of the 14 kinds of modified particle suspensions prepared in 2 above (7 kinds of modifying substances and 2 kinds of carriers). That is, while stirring each modified particle suspension (0.45 mL), add the mixed phospholipid antigen solution and sonicate with a water bath sonicator for about 30 seconds. The mixture was mixed by inverting at 37 ° C for 1 hour to adsorb the phospholipid antigen to the particles to obtain a sensitized particle suspension. For comparison, unmodified particles (latex, gelatin) were sensitized in the same manner as the modified particles (referred to as “sensitized particle suspension”).
  • the above sensitized particle suspension is rinsed with 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) and 150 mM NaCl solution, then 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% BSA (SIGMA) 0.1% NaN solution
  • the solution was replaced with 1 mU of 3 solutions, and mixed by inverting at 37 ° C for 1 hour.
  • the solution was replaced with 0.375 mL of the same solution to obtain 2% sensitized 'masking particles.
  • the positive sample has a signal value 17.4 times the average of the negative sample, ie, The S / N value was 17.4. Comparing the positive sample S / N value of each modified particle with this unmodified value, polylysine (PL), betaine polylysine (BPL), and polyaminoethylmethacrylic acid (poly (AEM)) show an increase in signal. However, the increase was only about twice that of unmodified particles (comparative example). In particular, polylysine and betaine polylysine had almost the same signal value for each sample, and the effect of polylysine betaine was almost undetectable.
  • PL polylysine
  • BPL betaine polylysine
  • AEM polyaminoethylmethacrylic acid
  • Gelatin particles modified with the same betaine polylysine were more sensitive than those modified with polylysine alone (below), so it was not as good for latex particles as it did not fail to betaine polylysine. It was suggested that the effect of Tyne should not appear.
  • particles modified with octadecylamine showed an S / N value of 106.5, about 6 times that of unmodified (comparative example), confirming the clear effect.
  • the other modified particles (I. 2 (2), e to g above) have S / N almost the same or rather lower than that of the unmodified particles (comparative example), and the expected effect is obtained. (Not shown in the table).
  • the gelatin particles had a remarkable modification effect compared to the latex particles.
  • the average value of positive sample S / N of non-modified particles is 3.2, 33.7 (10.5 times) for polylysine (PL), 46.5 (14.5 times) for betanized polylysine (BPL), polyaminoethyl methacrylate 03 ⁇ 4 ⁇ 5 ⁇ 1> showed 75.7 (23.7 times) and Octadecylamine (ODA) showed 161.4 (50.4 times).
  • betaine polylysine had a higher S / N value than polylysine, and the effect of solid betaine, which was hardly shown in latex, appeared.
  • the other modified particles (1.2 (2), e to g above) have almost the same or rather lower S / N values than the non-modified particles (comparative example) as with latex particles. No effect was obtained (data not shown).
  • the carrier according to the present invention binds phospholipids at a high density, it can be used as a highly sensitive measuring reagent for antiphospholipid antibodies.

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Abstract

　疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬が開示されている。抗リン脂質抗体測定用試薬は、少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)表面修飾物質が炭素数１４～２２のアルキルアミンであり、不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2)表面修飾物質が炭素数１４～２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１～３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、不溶性担体がゼラチン粒子である。

Description

明 細 書
抗リン脂質抗体測定用試薬
技術分野
[0001] 本発明は、抗リン脂質抗体を測定するための、リン脂質固定化修飾不溶性担体試 薬に関する。
背景技術
[0002] 疾病の診断のため、カルジォリピン、リポタンパクと複合ィ匕したコレステロール等のリ ン脂質に対する血液 ·髄液中の抗体を測定することは臨床診断上不可欠となってい る。特に梅毒検査法で用いられる抗リン脂質抗体測定は、梅毒の診断に不可欠であ る。
[0003] 抗リン脂質抗体の測定方法としては RPR(Rapid Plasma Regain)カード試験法、 VDR L(Venereal Disease Research Lab)法、 RST(Reagin Screening Test)法等が広く知られ ている。
[0004] 現在用いられて 、る最も代表的な梅毒検査法は、抗梅毒トレポネーマ (TP)抗体測 定および RPR法 (Rapid Plasma Regain,凝集法）に代表される抗リン脂質抗体検査法 であり、診断にはこれら 2種類の検査法を組み合わせて用いられるのが一般的である 。これら 2種類の検査を組み合わせるのは、これらの検査結果が検査の時期や感染 の経過によって必ずしも一致しないからである。例えば、 TP抗体陰性で抗リン脂質抗 体陽性の場合は、梅毒初期感染である可能性が高い。また、 TP抗体陽性でかつ抗 リン脂質抗体も陽性ならば、梅毒陽性と判断されるが、 TP抗体は陽性で抗リン脂質 抗体が陰性ならば、梅毒治癒後で抗体価が高い場合が考えられる。従って、抗リン 脂質抗体測定が十分な感度で行われな ヽと、感染初期及び予後の経過観察にぉ 、 て誤った臨床判定が下される可能性がある。
[0005] 近年、抗リン脂質抗体の測定方法にぉ 、て、リン脂質をラテックス粒子等の不活性 担体に固定化し (リン脂質固定ィ匕担体)、これを緩衝液中に懸濁させた試薬が考案さ れている。この試薬を用いた方法では、粒子上に固定化されたリン脂質抗原に検体 中の抗体が結合し、その結合抗体にさらに標識二次抗体が結合し、最終的には間接 的に担体に結合した標識量が信号として感知される。この方法は臨床検査の自動化 を目的としたもので、現在広く用いられている。
[0006] 一方、リン脂質は疎水性が高く、ラテックスやゼラチンのような負に荷電した担体に は接近、吸着がしにくい傾向がみられ、リン脂質をこれらの担体にいかに効率よく固 定ィ匕するかにっ 、て、これまで様々な工夫がなされた。
[0007] その一例として、ラテックスをポリリジンで修飾し、 VDRL法の感度を改良したデータ が示されている（例えば特許文献 1)。この感度上昇は、ラテックス表面のマイナス電 荷をカチオンポリマーであるポリリジンで中和して疎水性を上昇させることにより、同じ く疎水性のリン脂質をより接近 ·固定ィ匕しゃすくした結果、固定されたリン脂質量が増 カロしたためと考えられる。し力しポリリジンは使用条件が pHll以下に限定される等の 欠点がある。また、特許文献 1の実施例の表で示されている当該発明の効果は検体 によって異なり、感度の上昇率も十分とは言!、がた 、。
[0008] また、例えば、 4級アミノ基を有するポリアミンスルホンでプラスチック性のマイクロタ イタ一プレートを処理して梅毒抗原を固定ィ匕し、梅毒陽性家兎の血清を測定したとこ ろ、処理を行わな力つたプレートに比べ約 6〜17倍の吸光度が得られたことが示され た (特許文献 2 表 1)。し力しながら、同じ文献中の HBs抗原を用いて比較したデータ では、感度の上昇は!、ずれの希釈率にお!ヽても約 2倍またはそれ以下である。
[0009] 不活性担体は、一般に負に荷電して 、る。従って、タンパク質 (一般に負に荷電） やリン脂質 (疎水性）との結合効率を上げるためには、カチオン基や疎水性ポリマー で修飾して担体を中和させることが有効であることは当然に推定される。しかし上記 の実施例データは、問題がそれほど単純ではなく実際には他の要素が複雑に関与 して、なかな力推定どおりの効果が得られな 、ことを示して 、る。
[0010] 例えば、担体の疎水性を上げることを目的として使用されるポリマーは、担体への 吸着を可能とするために一端が正に荷電し、もう一端はリン脂質との結合を可能にす るために疎水性であるような構造のものが選択される。その場合、そのポリマーの吸 着 Z結合効率及び免疫反応効率への影響はそれぞれのポリマーの分子量や、結合 している官能基により微妙に異なってくる。例えばポリマーの長さが十分でない場合 、担体への吸着 Z結合効率が低ぐ結果的に、期待するような免疫反応の感度上昇 は見られな 、。し力 ポリマー両端の距離を十分取るためにポリマーの分子量を上げ 過ぎると、ポリマーの粘度が上がり、効果的な反応が困難となる (特許文献 3)。また、 ポリマーの構造によっては、測定対象となるタンパク質や脂質が担体上の抗原ゃ抗 体へ近づく際の物理的な障害となって、逆に反応効率を下げる場合もあり得る。
[0011] これまでのような比較的穏やかな修飾の効果は、従来のプレートによる免疫測定法 においては、プレート法自体が特に高感度とはいえないため、それほど問題にしては こなかった。
[0012] しかし、抗体測定化学発光酵素免疫測定法にお!、ては、本来高感度であった放射 性免疫測定法の流れにより、高感度性が強く求められており、抗リン脂質抗体の検出 も例外ではない。また、前述のように、梅毒の診断の正確性を担保するためにも、で きるだけ感度のよい測定系が望ましい。し力しそれらの要求に対し、これまでの行わ れた工夫や改良は必ずしも十分とは言えず、新たな工夫が求められている。
[0013] 一方、上述のように、修飾の効果はごくわずかな条件の違いで大きく変わるため、 一般論で規定される修飾方法を広く適用して、常に高感度を得ることができるとは考 えにくぐ再現性よく感度を上昇させるためには、担体や修飾物質の種類を設定する 必要がある。しカゝしわずカゝ数種の担体と修飾物質であっても、それらを組合せること により、膨大な実験数が必要となるため、最適な組合せを見出すこと自体が困難であ る。
特許文献 1：特表昭 63 - 501902
特許文献 2：特公平 7 - 50111
特許文献 3：特開平 2 - 168163
特許文献 4：特公昭 63 - 29223
特許文献 5 :特開昭 59— 195161
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 従って、本発明が解決しょうとする課題は、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担 体へ固定ィ匕する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高 感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬を提供することである。 課題を解決するための手段
[0015] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の不溶性担体の表面を特定の修飾物質 で修飾した表面修飾不溶性担体にリン脂質を固定ィ匕した抗リン脂質抗体測定用試 薬を用いて抗リン脂質抗体の免疫測定を行なうことにより、より高感度に抗リン脂質抗 体を免疫測定できることを見出し、本発明を完成した。
[0016] すなわち、本発明は、少なくとも 1種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体 に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、（1)前記表面 修飾物質が炭素数 14 22のアルキルァミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒 子であるか、又は (2)前記表面修飾物質が炭素数 14 22のアルキルァミン、ポリリジ ン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が 1 3のポリアミノアルキル（ メタ)アクリル酸並びにこれらの 2種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも 1 種であり、前記不溶性担体がゼラチン粒子である、抗リン脂質抗体測定用試薬を提 供する。また、本発明は、上記本発明の抗リン脂質抗体測定用試薬に含まれる前記 リン脂質と、検体中のリン脂質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前 記検体中のリン脂質抗体を測定することを含む、検体中のリン脂質抗体の免疫測定 法を提供する。さらに、本発明は、上記したリン脂質固定化表面修飾不溶性担体の、 抗リン脂質抗体測定用試薬の製造のための使用を提供する。
発明の効果
[0017] 本発明によれば、現在用いられて ヽるラテックス粒子、ゼラチン粒子を担体とする抗 リン脂質抗体免疫測定方法において、感度が大幅に改善され、臨床の求める高感度 測定が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明に用いる不溶性担体は、ラテックス粒子又はゼラチン粒子であり、その大き さ、形状、磁性の有無は、免疫反応に用いられるものであれば、特に制限はない。こ れらの粒子は数多く市販されており、例えばラテックス粒子としては JSR社の IMMUTE X (登録商標）や micromod社の micromer (登録商標）等を挙げることができ、また、ゼラ チン粒子はメドジエル社等カゝら容易に入手できる。また、自家製の粒子を作製して使 用することも可能である（特許文献 4)。粒子の大きさは、好ましくは粒径 0.5 30 mで、より好ましくは 2nn！〜 10 /z mである。形状は必ずしも球体とは限らず、立方体や ペレット状等、その製法によって様々な形をとる可能性があり、それらのいずれも使用 することができる。また、それらの形状で、孔ゃ突起等を持つものを、粒子の表面積を 増加する等の目的により用いることが可能である。抗リン脂質抗体の自動測定におい ては、特に後述の磁性粒子等を好ましく用いることができる。磁性粒子は、非磁性粒 子と同様に、容易に市販のものを入手できるが、自家製のものを使用してもよい。な お、磁性粒子は、不溶性担体粒子にフェライト等の磁性物質を配合したものであり、 免疫測定の分野にぉ 、て広く用いられて 、るものであり、市販されて 、るものである。
[0019] 上記不溶性担体粒子の表面には、表面修飾物質が結合されて!、る。表面修飾物 質は、不溶性担体粒子の表面を修飾して、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担 体へ固定ィ匕する効率を高めることに役立つ。
[0020] 不溶性担体粒子がラテックス粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数 14〜22 のアルキルァミン、好ましくはォクタデシルァミンである。なお、炭素数 14〜22のアル キルアミンは、複数種類のものを混合して用いることもできる。
[0021] 不溶性担体粒子がゼラチン粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数 14〜22の アルキルァミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が 1〜 3のポリアミノアルキル (メタ）アクリル酸並びにこれらの 2種以上の混合物から成る群 より選ばれる少なくとも 1種である。ここで、炭素数 14〜22のアルキルァミンとしては、 ォクタデシルァミンが好ましい。ポリリジンの平均分子量 (粘度平均分子量）は、通常 、 4,000〜300,000程度、好ましくは 10,000〜100,000程度である。ベタインは、トリアル キルアミノ酸 (アルキル基の炭素数は好ましくは 1〜3)であり、好ましくはトリメチルダリ シンである。また、「(メタ）アクリル酸」は、メタクリル酸及びアクリル酸を意味する。アル キル基の炭素数が 1〜3のポリアミノアルキル (メタ）アクリル酸としては、ポリアミノェチ ルメタクリル酸が好まし 、。ポリアミノアルキル (メタ）アクリル酸の平均分子量 (数平均 分子量）は、通常 10,000〜150,000程度、好ましくは 10,000〜50,000程度である。
[0022] 上記表面修飾物質は市販されているので、市販のものを用いてもよぐあるいは合 成してもよい。例えばポリアミノエチルメタクリル酸は 2—アミノエチルメタタリレート塩 酸塩とジメチルホルムアミドを重合して作製することができる。重合の方法はこの分野 においては周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
[0023] ベタインをポリリジンに修飾する手段としてはカルボジイミド (R-N=C=N_R)を持つ 水溶性架橋剤（水溶性カルポジイミド; WSC)例えば 1—ェチル—3— (3—ジメチルァ ミノプロピル)カルボジイミド ·塩酸塩や N -シクロへキシル N'— (2—モルフオリノエチ ル)カルポジイミド 'メト p トルエンスルホン酸塩などによる反応を用いることができ る。 WSCを用いる結合はこの分野において周知であり、下記実施例にも記載されて V、るように、市販の試薬を用いて簡便に行うことができる。
[0024] 粒子の修飾は、従来力 用いられている物理的吸着や、 WSCを用いた共有結合に よって行うことができる。これら吸着や共有結合による修飾方法は、この分野において 周知であり、下記実施例にも WSCを用いた共有結合の例が記載されている。共有結 合による修飾は、結合が安定で、その後の反応条件にほとんど制限がないため、望 ましい。
[0025] 上記表面修飾不溶性担体粒子には、リン脂質が固定化される。固定化されるリン脂 質は、測定しょうとする抗リン脂質抗体の対応抗原である。測定すべき抗リン脂質抗 体は、リン脂質に対する抗体であればいずれのものでもよぐ従来から免疫測定され ている抗リン脂質抗体のいずれのものでもよい。リン脂質の好ましい例としては、カル ジォリピン、レシチン及びリポタンパクと複合化したコレステロール（LDLコレステロ一 ル、 HDLコレステロール、 VLDLコレステロール、 CMコレステロール等）から成る群より 選ばれる少なくとも 1種を挙げることができ、これらの 2種又は 3種以上の混合物も好 ましい。
[0026] リン脂質は、通常、従来と同様、物理吸着により固定化される。リン脂質の物理吸着 の条件は周知であり、例えば、不溶性担体粒子の懸濁液にリン脂質溶液を加え、室 温〜 37°Cで 0.5時間〜 2時間転倒混和又は撹拌することにより行なうことができる（下 記実施例参照)。
[0027] リン脂質を固定ィ匕した不溶性担体粒子は、非特異吸着を防止するため、マスキング
(ブロッキング）を行なうことが好ましい。マスキング (ブロッキング）は、表面修飾不溶 性担体粒子上の、リン脂質抗原で被覆されて 、な 、部位をタンパク質等でマスキン グすることであり、この免疫測定用の抗原固定ィ匕担体に対して通常行なわれている。 マスキングに用いるタンパク質は、従来と同様でよぐ通常、アルブミン (ゥシ血清アル ブミン (BSA)等）、スキムミルク、カゼイン等が用いられる。マスキングは、従来と全く同 様に行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。
[0028] リン脂質を固定化した粒子は、抗リン脂質抗体を免疫測定するための抗原感作粒 子として従来と全く同様にして用いられる。抗リン脂質抗体の測定方法は、担体を用 V、る免疫測定方法であれば!/、ずれの方法でもよ!/、。例えば下記実施例に記載され ている、サンドイッチ法の 1種である化学発光酵素免疫測定法や、フローメトリーによ る免疫測定法など、シグナル検出の方法に限定されずに広く用いることができる。ま た、本発明は、抗リン脂質抗体の定量的測定における高感度化を課題としたもので あるが、定性試験 (検出）においても同じく高感度化を目的として使用することができ る。従って、本発明における「測定」は定量と検出の両者を包含する。
[0029] 免疫測定自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載する と、例えば、サンドイッチ法では、上記したリン脂質固定化粒子を検体と接触させ、洗 浄後、抗リン脂質抗体と抗原抗体反応する抗体を反応させ、洗浄後、粒子に結合し た抗体を測定する。抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ピオチン等で標識しておく ことにより粒子に結合した抗体を測定することができる。それぞれ異なる濃度の抗リン 脂質抗体を含む、濃度既知の複数の標準試料について上記方法により抗リン脂質 抗体を測定し、測定された標識量と標準試料中の抗リン脂質抗体の関係に基づき検 量線を作成し、未知濃度の検体についての測定結果をこの検量線に当てはめること により、検体中の抗リン脂質抗体を定量することができる。標識として、化学発光物質 を生成する反応を触媒する酵素を用い、基質として化学発光物質を生成する物質を 用いるサンドイッチ法が化学発光酵素免疫測定法であり、この方法によれば、酵素免 疫測定の中でも特に高感度な免疫測定が可能になる。粒子として磁性粒子を用いる 化学発光酵素免疫測定法は、自動化装置が市販されており、市販の自動化装置を 用いて簡便、高感度に免疫測定を行なうことができる（下記実施例参照)。
実施例
[0030] 以下、本発明を実施例及び比較例に基づき本発明を具体的に説明する。もっとも、 本発明は下記実施例に限定されるものではない。 [0031] I.リン脂質固定ィ匕表面修飾不溶性担体粒子の調製
1. 表面修飾物質の調製
(1) 500 mLのナスフラスコに 2-アミノエチルメタタリレート塩酸塩（ポリサイエンス社） 1 6.6 g (500 mM)、 200 mLのジメチルホルムアミド（和光純薬工業 (株））を入れ、更に 重合開始剤である ΑΙΒΝ(2, 2'-ァゾイソプチ口-トリル）（和光純薬工業 (株）（株)） 100 mgをカ卩えた。これに、冷却管とアルゴンガスで満たしたバルーンを三方コックを用い て接続し、三方コックの残されたラインに真空ポンプを接続した。真空ポンプでフラス コを 1分以上吸引して減圧した後、三方コックを切り替えてアルゴンガスをフラスコに 導いた。この操作を 3回行い、十分にフラスコ内をアルゴンガスに置換した。置換終 了後、フラスコをオイルノ スに浸け 65°Cに加温し、 3時間激しく攪拌した。
[0032] 反応終了後、反応液をエバポレーターで 1/10量まで濃縮し、濃縮終了後、分画分 子量 10000の透析チューブで 2日間超純水に対して透析を行った。
[0033] 透析終了後、 目的物を凍結乾燥し、約 12 gを得た。平均分子量は 45000であった。
なお、平均分子量は、以下の条件により測定した。
カラム： G4000PWXL (東ソ一社製）
溶媒：臭化リチウム 10mMを含有するァセトニトリル溶液
検出装置:示差屈折計
[0034] 上記方法と同様に重合を行 、、ポリ [2—アミノエチルメタクリル-ビニルピリジン]、ポ リ [2-アミノエチルメタクリル-ビュルイミダゾール]、ポリ [2-アミノエチルメタクリル-メタク リロキシェチル トリメチルアンモ -ゥム塩酸]を作製した。製造物質、開始材料、重合 剤、収量、及び平均分子量を以下にまとめた。
[0035] [表 1] 修飾物質名 開始材料 重合剤 収量 平均分子量 ポリ [ 2—ァミノ 2—アミノエチルメタク AIBN (和光純薬！： 約 12 g 45, 000 ェチレメタクリ レ リ レ一卜塩酸塩 （ポリサイ 業 （株）） 100 mg
酸] エンス社） 16. 6 g、 ジメチ
ノレホノレムアミ ド 200 πし
ボリ [ 2 ァミノ 2—アミノエチルメタク AIBN (和光純薬ェ 約 W g 50, 000 ェチルメタクリル リ レー卜塩酸塩 （ポリサイ 業 （株）） 100 rag
ビニルピリジン] エンス社） 8. 3 g
ビニルピリジン （東京化成
Figure imgf000010_0001
ポリ [ 2—ァミノ 2—アミノエチルメタク AIBN (和光純薬ェ 6. 6 g 40, 000 ェチノレメタクリノレ リル （ポリサイエンス社） 業 （株）） 100 mg
一ビニルイミダゾ 8. 3 g
—ル〕 ビニルイミダゾール （東京
化成工業社） 4. 7 g
ポリ [ 2—ァミノ 2—アミノエチルメタク AIBN (和光純薬ェ 14 g 60, 000 ェチノレメタクリノレ リル （ポリサイエンス社） 業 （株））
—メタクリロキシ 8. 3 g 100 rag
ェチルトリメチル メタクリロキシェチノレ
アンモユウム塩 トリメチルアンモニゥム
酸] 麵 10 g
[0036] (2) ポリリジン'臭化水素酸塩 ((株)ペプチド研究所) 200 mgとべタイン（トリメチルダリ シン、和光純薬工業 (株）） 224mgを水 10mLに溶解し、 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノ プロピル)カルポジイミド '塩酸塩（同仁ィ匕学) 552 mgを加え室温で一夜撹拌した。反 応液に 1-ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド ·塩酸塩 272 mgを追 加し、さらに約 5時間撹拌した。反応液を透析用セルロースチューブ (三光純薬 (株)） に移して、はじめ水に対して透析し、続いて 6 mM塩酸に対して一夜透析した。その 後透析チューブ内の液を凍結乾燥し、収量 118.9 mgを得た。
[0037] 2. 担体の修飾
(1) ポリアミノエチルメタクリル酸 (Poly(AEM》によるゼラチン粒子の修飾
5%磁性ゼラチン粒子 (自家製、特許文献 5) lmLを蒸留水 lmLで 3回すすぎ、 10mM MES (pH 5.5) lmLに置換した。これに、上記で作製したポリ (2-アミノエチルメタタリ ル酸） 25mgをカ卩えて溶解し、更に水溶性カルボジイミド (1-ェチル -3-(3-[11]ジメチル ァミノプロピル)カルポジイミド '塩酸）（同仁ィ匕学社製） lOOmgをカ卩えて 3時間激しく攪 拌した。これを蒸留水 lmLで 3回すすぎ、蒸留水 1 mLに置換して、 5%塩基性ポリマー 修飾粒子懸濁液とした。この液 0.15 mLを蒸留水 1 mLで 3回、 44%エタノールで 2回 濯いだ後、蒸留水 0.45 mLに置換し、修飾粒子懸濁液とした。
[0038] (2) その他の修飾
上記と同様の工程で、理論的に可能性のある様々な物質 (下記 a〜g)で、磁性ラテ ックス粒子と磁性ゼラチン粒子を修飾した。表面修飾物質は、上記 1 (表 1参照)で作 製したもの、および市販品を用いた。粒子と表面修飾物質の割合は粒子を 1.5から 2.
0倍 (重量比）とした。
[0039] a ポリ- L-リジン (PL)( (株)ペプチド研究所製）
b ベタイン化ポリリジン (BPL) (上記 1(2))
c ォクタデシルァミン (ODAX和光純薬工業 (株)製）
d ポリ [2-アミノエチルメタクリル酸] (Poly(AEM》（上記 1(1))
e ポリ [2-アミノエチルメタクリル-ビュルピリジン] (Poly(2- aminoethylmethacry卜 co- vi nyl pyridine)) (上記 1(1)、表 1)
f ポリ [2-アミノエチルメタクリル-ビュルイミダゾール] (Poly(2-aminoethylmethacryl-c 0- vinyl imidazole)) (上 til(l)、表 1)
g ポリ [2-アミノエチルメタクリル一メタクリロキシェチルトリメチルアンモ -ゥム塩酸] (P oly(2— aminoethylmethacryl— co— methacryloxyetnyl trimethylammonium— HC1)、上己 1 (1)、表 1)
[0040] 3. 担体の抗原感作及びマスキング
(1) 抗原感作
5 mg/mLカルジォリピン エタノール溶液 (SIGMA)を 0.041 mL、 10 mg/mLに作製 したレシチン (卵黄製) (ナカライテスタ株式会社) -エタノール溶液を 0.206 mL、 10 mg/ mLに作成したコレステロール (ナカライテスタ株式会社)一エタノール溶液 0.062 mLを 混合し、計 0.35 mLの混合リン脂質抗原液とした。
[0041] 上記 2で調製した修飾粒子懸濁液 14種類 (修飾物質 7種類 X担体 2種類)の各液 粒子に抗原を吸着させた。すなわち、各修飾粒子懸濁液 (0.45mL)を攪拌しながら、 混合リン脂質抗原液を加え、水浴型超音波処理機にて約 30秒間超音波処理した後 、 37°Cで 1時間転倒混和し、粒子にリン脂質抗原を吸着させ、感作粒子懸濁液とした 。また、比較のため、非修飾粒子 (ラテックス、ゼラチン)もそれぞれ修飾粒子と同様に 感作した（「感作粒子懸濁液」と呼ぶ)。
[0042] (2) マスキング
上記感作粒子懸濁液を 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)、 150 mM NaCl溶液 1 mLですす いだ後、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、 150 mM NaCl、 1% BSA(SIGMA)、 0.1% NaN溶
3 液 1 mUこ置換し、 37°Cで 1晚転倒混和した。 0.375 mLの同溶液に置換し、 2 %感作' マスキング粒子とした。
[0043] II. 測定と結果
1. 測定
上記 Iで調製した 2^%感作'マスキング粒子を、 150 mM NaCl、 0.1% NaN、 1% BSA
3 で 100倍希釈したもの 0.25 mLを固相とした。また、 0.1 mg/L抗ヒト IgG-アルカリフォス ファターゼ標識体、 0.1 mg/L抗ヒト IgM-アルカリフォスファターゼ標識体、 100 mM Na Cl、 0.1% NaN、 1% BSA溶液 0.35 mLを標識相とした。
3
[0044] RPR陰性血清 4例（Aries Diagnostics GmbH)、 RPR陽性血清 4例（ProMedDx社）、 陽性コントロール血清 (富士レビォ株式会社)を検体とし、検体中の抗リン脂質抗体を 、市販の自動分析装置を用い、発光酵素免疫測定により定量した。すなわち、それ ぞれルミパルス検体希釈液 (富士レビォ株式会社)で 10倍希釈したもの 20 μ Lを検体 として、ルミパルスフォルテ (富士レビォ株式会社)において 2ステップ 20 μ Lモードに て測定した。カットオフインデックスの算出は、検体測定発光カウントを陽性コントロー ル測定発光カウントにカットオフ係数 0.22を乗じたもので除して求めた。
[0045] 2. 結果
(1) ラテックス粒子
ラテックス粒子の結果の一部を下記表 2にまとめた。 Cはシグナルカウント数、 S/N(si gnal/noise)は、各シグナルカウント (C)を陰性検体のシグナルカウントの平均値で割つ たものでノイズの上昇による見かけの感度上昇を排除して 、る。各修飾粒子の感度 比較は陽性検体の S/Nの平均（「平均 S/N値」 )で行った。
[0046] 非修飾粒子 (比較例)では陽性検体は陰性検体平均の 17.4倍のシグナル値、即ち 、 S/N値は 17.4であった。各修飾粒子の陽性サンプル S/N値をこの非修飾での値と比 較すると、ポリリジン (PL)、ベタインィ匕ポリリジン (BPL)、ポリアミノエチルメタクリル酸 (pol y(AEM))ではシグナル上昇が見られたものの、非修飾粒子 (比較例）の 2倍程度の上 昇にとどまった。特にポリリジンとベタインィ匕ポリリジンでは各検体のシグナル値がほと んど同じで、ポリリジンをべタインィ匕した効果はほとんど見出せな力つた。同じべタイン 化ポリリジンで修飾したゼラチン粒子はポリリジンのみで修飾したものより感度が上昇 していたことから（下記）、ポリリジンへのべタインィ匕が失敗したのではなぐラテックス 粒子にお ヽてはべタインの効果が現れな ヽことが示唆された。
[0047] 一方ォクタデシルァミン (ODA)で修飾した粒子は、 S/N値 106.5で、非修飾 (比較例） の約 6倍を示し、明らかな効果が確認できた。
[0048] その他の修飾粒子（上記 I. 2(2)、 e〜g)では S/Nが非修飾粒子 (比較例）とほとんど 同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られな力つた (表には示していな い)。
[0049] [表 2]
Figure imgf000014_0001
[0050] (3) ゼラチン粒子
不溶性担体としてゼラチン粒子を用いた場合の結果を下記表 3に示す。
[0051] 表 3に示されるように、ゼラチン粒子では、ラテックス粒子に比べ、修飾の効果が顕 著であった。非修飾粒子 (比較例）の陽性検体 S/Nの平均値 3.2に対し、ポリリジン (PL )では 33.7(10.5倍)、ベタイン化ポリリジン (BPL)では 46.5(14.5倍)、ポリアミノェチルメタ クリル酸 0¾< 5\1》では75.7(23.7倍)、ォクタデシルァミン (ODA)では 161.4(50.4倍） を示した。また、ポリリジンよりもべタインィ匕ポリリジンのほうが、 S/N値が上昇しており、 ラテックスではほとんど示されな力つたべタインィ匕の効果が現れていた。
[0052] その他の修飾粒子（上記 1.2(2)、 e〜g)ではラテックス粒子と同様、 S/N値が非修飾 粒子 (比較例）とほとんど同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られな かった (データ示さず)。
[0053] [表 3]
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
本願発明による担体は、高密度にリン脂質を結合しているため、抗リン脂質抗体の 高感度測定試薬として使用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 少なくとも 1種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定ィ匕 されて 、る抗リン脂質抗体測定用試薬であって、（1)前記表面修飾物質が炭素数 14 〜22のアルキルァミンであり、前記不溶性担体力 Sラテックス粒子である力 又は (2)前 記表面修飾物質が炭素数 14〜22のアルキルァミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリ リジン及びアルキル基の炭素数が 1〜3のポリアミノアルキル (メタ）アクリル酸並びに これらの 2種以上の混合物力 成る群より選ばれる少なくとも 1種であり、前記不溶性 担体がゼラチン粒子である、抗リン脂質抗体測定用試薬。
[2] 前記表面修飾物質がォクタデシルァミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒子 である請求項 1記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
[3] 前記表面修飾物質がォクタデシルァミン、ポリリジン、ベタイン修飾ィ匕ポリリジン及び ポリアミノエチルメタクリル酸並びにこれらの 2種以上の混合物力 成る群より選ばれ る少なくとも 1種である請求項 1記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
[4] 前記リン脂質は、前記表面修飾物質が表面に結合した前記不溶性担体に物理吸 着により結合している請求項 1ないし 3のいずれ力 1項に記載の抗リン脂質抗体測定 用試薬。
[5] 前記不溶性担体が、磁性を有する粒子である請求項 1な 、し 4の 、ずれか 1項に記 載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
[6] 前記リン脂質が、カルジォリピン、レシチン及びリポタンパクと複合ィ匕したコレステロ 一ルカ 成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1ないし 5のいずれか 1項に 記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
[7] 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の抗リン脂質抗体測定用試薬に含まれる前 記リン脂質と、検体中のリン脂質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により 前記検体中のリン脂質抗体を測定することを含む、検体中のリン脂質抗体の免疫測 定法。
[8] サンドイッチ法による請求項 7記載の免疫測定法。
[9] 発光酵素免疫測定による請求項 8記載の免疫測定法。
[10] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載されたリン脂質固定ィ匕表面修飾不溶性担体の 、抗リン脂質抗体測定用試薬の製造のための使用。
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