JP5823953B2 - 内因性リポ蛋白質の影響回避方法及び試薬 - Google Patents

内因性リポ蛋白質の影響回避方法及び試薬 Download PDF

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Description

本発明は、内因性リポ蛋白質の影響回避方法、並びにこの方法を用いた抗リン脂質抗体測定試薬及び前立腺特異抗原測定試薬に関する。
抗リン脂質抗体は、次の二つの疾患により生体内に産生される。一つは梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリダム(Treponema Pallidum)に感染した場合であり、他の一つは全身性エリテマトーデス(SLE)等の自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群が発症した場合である。
いずれの抗リン脂質抗体も、リン脂質であるカルジオリピンを主成分とする脂質抗原に対して産生された抗体であり、その診断に使用される検査試薬はカルジオリピンを含有している。
現在、上記リン脂質を用いる梅毒の検査方法としては、炭素又はカオリン末を担体としたVDRL(Veneral Disease Research Lab.)法、RPR(Rapid Plasma Reagin)カードテスト法(非特許文献1)、ポリスチレン共重合体等から成るラテックスを担体とし、生化学自動分析機を用いて測定を行うラテックス凝集法(特許文献1)等が用いられている。
一方、抗リン脂質抗体症候群の検査方法としては、ELISA法による測定(特許文献2)が行われている。
前立腺癌は男性にみられる悪性疾患であり、特に米国及び日本において、急激に増加している腫瘍である。前立腺癌は増殖の遅い腫瘍であること、放射線療法や抗男性ホルモン療法が奏効しやすいという特徴があることから、早期発見が重要な課題である。
前立腺特異抗原(Prostate Specific Antigen、以下、単に「PSA」ということがある)は、前立腺上皮細胞から分泌されるセリンプロテアーゼの一種で、分子量33000〜34000ダルトンの糖蛋白である。このPSAは、前立腺に疾患があると血液中の濃度が健常者よりも高くなるため、前立腺疾患(特に前立腺癌)の早期発見に有用となっている。PSAには、血中でプロテアーゼインヒビターと結合する複合体型と、非結合の遊離型PSA(以下、「fPSA」ということがある)があるが、血中のPSAの多くは複合体型であり、前立腺特異抗原−α1−アンチキモトリプシン複合体(以下、「PSA−ACT」ということがある)や、前立腺特異抗原−α2−マクログロブリン複合体等が存在している。このうち、免疫学的測定方法で測定できるのは、fPSAとPSA−ACTの2種類である。
特開平7−103980号公報 特開平6−148193号公報 特開2001−242171号公報
Public Health Reports Vol.75(1960),985−988
一般的に、抗原抗体反応による免疫凝集反応を光学的に測定することにより、疾病の有無を診断する試薬は、検体中の妨害成分の影響を受け、測定値が不規則に低下してしまう場合がある。このような現象は、被測定物質を生理食塩水や緩衝液等の検体中の妨害成分の影響を受けない溶液に添加した場合と、血清及び血漿等の妨害成分が含有される場合に測定値が大きく異なってしまうことで明らかである。
この現象が起こることによる問題点としては、次の2点が挙げられる。
(1)検体中の抗体量又は抗原量が少ない場合、妨害成分の影響により免疫凝集反応が十分に起こらず、疾病に罹患しているにもかかわらず見逃す可能性がある。
(2)測定試薬の測定範囲以上の抗体量又は抗原量を含む検体の正確な抗体量又は抗原量を測定するには、生理食塩水又は血清等で該検体を希釈して、抗体量又は抗原量を測定範囲内にまで減量して測定し、その後希釈倍率を掛けて正確な抗体量又は抗原量を算出することが行われているが、生理食塩水には上記妨害成分が含有されていないため、検体に抗体又は抗原を含まない血清で希釈した場合と、生理食塩水で希釈した場合の測定結果が乖離してしまい、正しい抗体量又は抗原量が測定できない。
従って、本発明の課題は、上記のような血清や血漿中の妨害成分を明らかにし、当該妨害成分の影響を回避する手段を提供することにある。
そこで、本発明者は、前記血清や血漿中に存在する免疫測定の妨害成分を解明すべく種々検討したところ、全く意外にも、抗原抗体反応に基づく吸光度が生理食塩水にリポ蛋白質を添加した溶液を検体とした場合に低下してしまうことから、当該妨害成分が内因性リポ蛋白質であることを見出した。さらに検討を続けたところ、免疫反応の反応系にグリセロリン脂質を含有せしめれば、当該内因性リポ蛋白質による測定値への影響を回避することができ、より正確に検体中の抗体又は抗原を測定可能になることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
(1)被測定物質が血中の抗体又は抗原であり、被測定物質が抗体である場合は抗原、抗原である場合は抗体との免疫反応により被測定物質を測定する試薬において、免疫反応の反応系にグリセロリン脂質を含有させることを特徴とする内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
(2)グリセロリン脂質が、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンから選ばれる1種以上である(1)記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
(3)被測定物質が、抗リン脂質抗体である(1)又は(2)記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
(4)被測定物質である抗リン脂質抗体が、梅毒感染により血中に出現する抗梅毒リン脂質抗体、又は自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群により血中に出現する抗リン脂質抗体である(3)記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
(5)被測定物質が血中の抗体又は抗原であり、被測定物質が抗体である場合は抗原、抗原である場合は抗体との免疫反応により被測定物質を測定する試薬において、前記免疫反応の反応系にグリセロリン脂質が含有されていることを特徴とする血中の抗体又は抗原測定試薬。
(6)グリセロリン脂質が、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンから選ばれる1種以上である(5)記載の測定試薬。
(7)被測定物質が、抗リン脂質抗体である(5)又は(6)記載の測定試薬。
(8)抗原又は抗体が不溶性担体に担持されている(5)〜(7)記載の測定試薬。
(9)被測定物質である抗リン脂質抗体が、梅毒感染により血中に出現する抗梅毒リン脂質抗体である(7)又は(8)記載の測定試薬。
(10)被測定物質である抗リン脂質抗体が、自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群により血中に出現する抗リン脂質抗体である(7)又は(8)記載の測定試薬。
(11)被測定物質が前立腺特異抗原である(5)又は(6)記載の測定試薬。
(12)抗体が抗前立腺特異抗原抗体であり、抗体が不溶性担体に担持されている(5)、(6)又は(11)記載の測定試薬。
特許文献3においては、カウンティングイムノアッセイ法においてホスファチジルコリンを添加する方法が示されているが、陰性検体で散見される非特異凝集を抑制するために添加されているものである。非特異凝集とはヒト血液検体中にまれに含まれる成分(例えば、試薬中に含有する成分に対する抗体等)により、本来の特異的な免疫凝集反応以外、つまりは検出目的である抗リン脂質抗体とリン脂質との免疫反応以外の凝集反応が起こることである。特許文献3におけるホスファチジルコリンは、このような反応を抑制することを目的としており、いわば非特異凝集抑制剤と言える。
一方、本発明におけるグリセロリン脂質は、ヒト血液検体中に普遍的に含有されるリポ蛋白質によって、正常な免疫反応の凝集抑制が起こってしまうという現象を解消し、より正確に検出目的である抗体又は抗原を検出することを目的としており、いわばリポ蛋白質の影響回避剤といえる。
本発明のグリセロリン脂質の効果は、上記特許文献3のホスファチジルコリンとは、根本的に異なる。
本発明により提供される試薬は、免疫反応の反応系にグリセロリン脂質を含有させることを特徴とする内因性リポ蛋白質の影響回避した試薬であり、内因性リポタンパク質の影響を受ける抗リン脂質抗体測定試薬においては、その影響を回避することにより、より正確な測定が可能となる。
図1は検討1における比較例1の結果であり、反応系中にグリセロリン脂質を含有していない。 図2は検討1における実施例2の結果であり、反応系中に0.06重量%の鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを含有する場合の結果である。 図3は検討2における実施例1の結果であり、反応系中に0.12重量%の鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを含有する場合の結果である。 図4は検討2における実施例2の結果であり、反応系中に0.06重量%の鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを含有する場合の結果である。 図5は検討2における実施例3の結果であり、反応系中に0.03重量%の鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを含有する場合の結果である。 図6は検討2における実施例4の結果であり、反応系中に0.03重量%の合成ホスファチジルグリセロールである1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩を含有する場合の結果である。 図7は、検討2における実施例5の結果であり、反応系中に0.06重量%の鶏卵黄由来ホスファチジルエタノールアミンを含有する場合の結果である。 図8は検討2における実施例6の結果であり、反応系中に0.03重量%の合成ホスファチジルコリンである1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリンを含有する場合の結果である。 図9は検討2における実施例7の結果であり、反応系中に0.03重量%の合成ホスファチジルコリンである1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリンを含有する場合の結果である。 図10は検討2における実施例8の結果であり、反応系中に鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを0.015重量%及び鶏卵黄由来ホスファチジルエタノールアミンを0.015重量%含有する場合の結果である。 図11は検討2における比較例1の結果であり、反応系中にグリセロリン脂質を含有しない場合の結果である。 図12は検討3における実施例9の結果であり、反応系中に鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールを0.015重量%含有する場合の結果である。 図13は検討3における比較例2の結果であり、反応系中にグリセロリン脂質を含有しない場合の結果である。
本発明は、被測定物質が血中の抗体又は抗原であり、被測定物質が抗体である場合は抗原、抗原である場合は抗体との免疫反応により被測定物質を測定する試薬において、免疫反応の反応系にグリセロリン脂質を含有させることを特長とする内因性リポ蛋白質の影響回避方法、及び内因性リポ蛋白質の影響を回避した試薬である。
本発明において、内因性リポ蛋白質の影響回避の目的で、免疫反応の反応系に含有させる、グリセロリン脂質としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等が挙げられる。このうち、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンが好ましく、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンが特に好ましい。
添加するグリセロリン脂質の濃度は反応系に0.005〜0.20重量%含有させることが好ましい。より好ましくは0.015〜0.12重量%であるが、測定に用いる検体量により添加量は適宜調節する必要があるため、これに限定されるわけではない。
また、グリセロリン脂質は、反応系に含有させればよく、検体希釈液に含有させてもよく、抗体や抗原の含有試薬に含有させてもよいが、内因性リポ蛋白質の影響回避効果の点から、検体希釈液に含有させるのが好ましい。
上記ホスファチジン酸の由来は、動物又は植物を問わない。一般的には、ホスファチジン酸はホスファチジルコリンやホスファチジルグリセロールをホスホリパーゼA2により分解することにより得られる。
上記ホスファチジン酸に含まれる2つのアシル基の炭素数及び不飽和度については限定されない。一般的には、炭素数は10〜18、不飽和結合は0〜2個を含有するアシル基である。また、2つのアシル基各々の炭素数及び不飽和結合の数は同一である必要はなく、異なった炭素数のアシル基の組み合わせ、飽和と飽和、飽和と不飽和もしくは不飽和と不飽和のアシル基の組み合わせでもよい。一般的に動物や植物由来のホスファチジン酸は、異なった炭素数のアシル基を持つもの、及び異なった不飽和結合数のアシル基を持つものが組み合わされたものの混合物である。
上記ホスファチジン酸は化学的に合成されたものでもよい。実際に市販されているものとしては、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジン酸ナトリウム塩、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジン酸ナトリウム塩、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジン酸ナトリウム塩等がある。
上記ホスファチジルコリンとしては、由来は動物又は植物を問わない。よく用いられるものは、大豆、鶏卵黄より精製したものである。
上記ホスファチジルコリンに含まれる2つのアシル基の炭素数及び不飽和度については限定されない。一般的には、炭素数は10〜22、不飽和結合は0〜2個を含有するアシル基である。また、2つのアシル基各々の炭素数及び不飽和結合の数は同一である必要はなく、異なった炭素数のアシル基の組み合わせ、飽和と飽和、飽和と不飽和もしくは不飽和と不飽和のアシル基の組み合わせでもよい。一般的に由来が動物や植物由来のホスファチジルコリンは異なった炭素数のアシル基を持つもの、及び異なった不飽和結合数のアシル基を持つものが組み合わされたものの混合物である。
上記ホスファチジルコリンは化学的に合成されたものでもよい。実際に市販されているものとしては、1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−ミリストイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−ミリストイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−ミリストイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−ステアロイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−パルミトイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン等がある。
上記ホスファチジルグリセロールとしては、由来は動物又は植物を問わない。よく用いられるものは、大豆、鶏卵黄より精製したものである。
上記ホスファチジルグリセロールに含まれる2つのアシル基の炭素数及び不飽和度については限定されない。一般的には、炭素数は10〜22、不飽和結合は0〜2個を含有するアシル基である。また、2つのアシル基各々の炭素数及び不飽和結合の数は同一である必要はなく、異なった炭素数のアシル基の組み合わせ、飽和と飽和、飽和と不飽和もしくは不飽和と不飽和のアシル基の組み合わせでもよい。一般的に動物や植物由来のホスファチジルグリセロールは、異なった炭素数のアシル基を持つもの、及び異なった不飽和結合数のアシル基を持つものが組み合わされたものの混合物である。
上記ホスファチジルグリセロールは化学的に合成されたものでもよい。実際に市販されているものとしては、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールアンモニウム塩、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールアンモニウム塩、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールアンモニウム塩、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩、1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩等がある。
上記ホスファチジルエタノールアミンとしては、由来は動物又は植物を問わない。よく用いられるものは、大豆、鶏卵黄より精製したものである。
上記ホスファチジルエタノールアミンに含まれる2つのアシル基の炭素数及び不飽和度については限定されない。一般的には、炭素数は10〜22、不飽和結合は0〜2個を含有するアシル基である。また、2つのアシル基各々の炭素数及び不飽和結合の数は同一である必要はなく、異なった炭素数のアシル基の組み合わせ、飽和と飽和、飽和と不飽和もしくは不飽和と不飽和のアシル基の組み合わせでもよい。一般的に動物や植物由来のホスファチジルエタノールアミンは、異なった炭素数のアシル基を持つもの、及び異なった不飽和結合数のアシル基を持つものが組み合わされたものの混合物である。
上記ホスファチジルエタノールアミンは化学的に合成されたものでもよい。実際に市販されているものとしては、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン等がある。
上記ホスファチジルセリンとしては、由来は動物又は植物を問わない。よく用いられるものは、大豆、鶏卵黄より精製したものである。
上記ホスファチジルセリンに含まれる2つのアシル基の炭素数及び不飽和度については限定されない。一般的には、炭素数は10〜22、不飽和結合は0〜2個を含有するアシル基である。また、2つのアシル基各々の炭素数及び不飽和結合の数は同一である必要はなく、異なった炭素数のアシル基の組み合わせ、飽和と飽和、飽和と不飽和もしくは不飽和と不飽和のアシル基の組み合わせでもよい。一般的に動物や植物由来のホスファチジルセリンは、異なった炭素数のアシル基を持つもの、及び異なった不飽和結合数のアシル基を持つものが組み合わされたものの混合物である。
上記ホスファチジルセリンは化学的に合成されたものでもかまわない。実際に市販されているものとしては、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリンナトリウム塩、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリンナトリウム塩、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリンナトリウム塩、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリンナトリウム塩等がある。
上記グリセロリン脂質は、反応系の緩衝液に溶解あるいは分散状態で存在させるのが好ましい。難溶であるものに関しては、超音波処理による分散あるいは溶解を行ってもよい。また、界面活性剤を添加することで溶解させることもできる。
上記界面活性剤としては、一般的に脂質を可溶化できるものであれば使用することができるが、好ましくはスクロースモノラウレート等のショ糖脂肪酸エステル、リゾホスファチジルコリン、オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド等のアルキルグリコシド、デキストラン硫酸等である。
本発明における被測定物質は、血中の抗体又は抗原であればよく、特に限定されるわけではなく、公知のものが対象となる。代表的なものを例示すると、抗梅毒トレポネーマ抗体、抗リン脂質抗体、抗HBs抗体、HBs抗原、風疹抗体、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ロタウイルス抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、ヒトC反応性蛋白質、ストレプトリジンO、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、イムノグロブリンG、イムノグロブリンM、イムノグロブリンA、イムノグロブリンE、インシュリン、リウマチ因子等の公知の被測定物質を挙げることができる。
このうち、内因性リポ蛋白質の影響が大きい、抗リン脂質抗体が好ましい。ここで抗リン脂質抗体としては、梅毒感染により血中に出現する抗梅毒リン脂質抗体、又は自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群により血中に出現する抗リン脂質抗体が挙げられる。
また、前立腺特異抗原の場合もより好ましい。
本発明の方法及び測定試薬においては、被測定物質が抗体である場合には抗原と免疫反応させ、被測定物質が抗原の場合には抗体と免疫反応させる。従って、通常本発明の測定試薬には、被測定物質と免疫反応する抗原又は抗体が含まれる。当該抗原又は抗体としては、被測定物質が抗リン脂質抗体の場合にはリン脂質である。被測定物質が前立腺特異抗原の場合には抗前立腺特異抗原抗体である。
上記リン脂質抗原として用いられるリン脂質としては、通常、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、及びコレステロールの3種類が用いられるが、これら3種類が全て含まれている必要はなく、測定する疾患により選択される。自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群の測定試薬の場合、少なくともカルジオリピンが含まれていればよく、抗梅毒リン脂質抗体測定試薬の場合には、少なくともカルジオリピンとホスファチジルコリンが含まれていればよい。ホスファチジルコリンやコレステロールは、特異性の向上や感度の向上を目的として、カルジオリピンと混合して用いられることが多い。これらの好ましい混合比としては、重量比で、カルジオリピン:ホスファチジルコリン:コレステロール=1:(3〜30):(0〜10)程度、より好ましくは1:(3〜30):(0.5〜10)程度であるが、これに限定されず、目的に応じて混合比は適宜選択される。
上記リン脂質は、動植物から得る方法と合成する方法があるが、目的に応じて適宜選択される。通常、カルジオリピンは、牛の心臓から抽出・精製したもの、ホスファチジルコリンは、卵黄から抽出・精製したもの、コレステロールは、羊毛より抽出・精製したもの、及び合成したものが使用できる。また市販のものを使用してもよい。
上記リン脂質抗原等の抗原や抗前立腺特異抗原抗体等の抗体は、通常、適当な溶液中に分散させて使用される。該溶液としては特に限定されず、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。分散させる方法としては、不溶性担体に担持させて分散させる方法とリポソームを形成させて分散させる方法がある。
前記不溶性担体としては、従来より免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができる。中でも、工業的に大量生産が可能な合成高分子からなるラテックスが好ましい。上記合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。中でも、リン脂質の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸共重合体が特に好ましい。その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子、ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。上記不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、透過型電子顕微鏡装置による測定で0.1〜1.0μm、好ましくは0.1〜0.5μmのものが通常用いられる。
上記不溶性担体に、上記リン脂質抗原を担持する方法としては特に限定されず、従来公知の方法により、物理的、及び/又は化学的結合により担持させる方法などが挙げられる。
上記不溶性担体に物理的にリン脂質抗原を担持させる方法としては、例えば、エタノール等の適当な溶媒に溶解したリン脂質(リン脂質混合液)に適当な粒子径を有するラテックスを混合し攪拌し(感作工程)、一定時間経過後、タンパク質、糖、ペプチド等を含む溶液で処理し(ブロッキング工程)、適当な溶媒に分散させる方法があげられる。
上記ラテックスを分散させる溶媒としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。
これら検査方法により測定される検体としては、前記の被測定物質が含まれている可能性のある血液、血清、血漿、脳脊髄液等が用いられる。
測定方法としては、上記のようにして得られた試薬と検体中の抗リン脂質抗体等の被測定物質との免疫反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の抗リン脂質抗体量等の被測定物質量を測定する。
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒子径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球光度濁度法等が挙げられる。上記の測定法において、異なる時点で少なくとも2つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加速度に基づき凝集の程度を求める速度試験(レートアッセイ)、あるいはある時点(通常は反応の終点と考えられる時点)で1つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験(エンドポイントアッセイ)を利用できる。測定の簡便性、迅速性の点から、比濁法による速度試験を行うことが好ましい。光学的に測定する方法において、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、特に汎用の自動分析機が使用できる。測定の波長は250〜1000nmが使用でき、好ましくは、540〜800nmである。
反応温度は、上記免疫反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、恒温で10〜50℃の範囲内で行うのが好ましく、10〜40℃がより好ましい。反応時間は適宜決められる。
上記免疫反応を行う際の反応系の反応液としては、免疫反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のpHは、5.5〜8.5が好ましく、さらに好ましくは6.5〜8.0である。上記反応液には、さらに必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、測定感度の向上、及び/又は抗原抗体反応の促進を目的として、水溶性高分子を含有してもよい。上記水溶性高分子としては、例えば、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、本発明の抗リン脂質抗体測定試薬においては、ポリビニルピロリドンを用いるのが特に好ましい。
本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
(実施例1)
1)脂質抗原液の作製
カルジオリピンのエタノール溶液(5mg/mL、シグマ社製)2mL、ホスファチジルコリン(COATSOME NC−50、日油社製)のエタノール溶液(10mg/mL)10mL、コレステロール(ナカライテスク社製)のエタノール溶液(10mg/mL)3mLを混合し、脂質抗原液を作製した。
2)ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器(容量2L)に、蒸留水1,100g、スチレン200g、スチレンスルホン酸ナトリウム0.2g、及び蒸留水50gに過硫酸カリウム1.5gを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、70℃で攪拌しながら48時間重合した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置(日本電子社製、「JEM−1010型」)を用いて10000倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低100個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。このようにして平均粒子径:0.40μmのラテックスAが得られた。
3)脂質抗原感作ラテックス試薬の作製
上記2)で作製したラテックスA(固形分10重量%)100μLを、あらかじめ緩やかに攪拌しながら37℃に保った。これに、上記脂質抗原液330μLを一気に添加し、そのまま37℃で緩やかに2時間攪拌した。次いでウシ血清アルブミン(以下、BSAという)(フラクションV、ReagentGrade、ミリポア社製)を1重量%含有する100mmol/Lリン酸緩衝食塩水(100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)、0.9重量%NaCl、(以下、PBSという))2mLを一気に添加し、さらに37℃で1時間攪拌した。これを遠心分離して上清を除き、沈殿したラテックスを再び1重量%BSAを含有するPBSに懸濁した。この操作を繰り返し、最後に1重量%BSA、7.5重量%塩化コリン、0.14重量%EDTA・2Na、および0.1重量%アジ化ナトリウムを含有する100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、PBという)4mLに懸濁してラテックス試薬を作製した。
4)検体希釈液の作製
50mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)にBSAを1重量%、プルラン(分子量20万、林原社製)を1.0重量%、アジ化ナトリウムを0.1重量%、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロール(COATSOME NG−50LS、日油製)0.17重量%になるように添加し、撹拌した後、氷冷下で、超音波破砕機により溶液が透明となるまで30分間以上超音波処理(上記機器で、Power20%、0.25インチマイクロチップ使用)を行うことにより、検体希釈液を作製した。
(実施例2)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの濃度を0.085重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例3)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの濃度を0.043重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例4)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの代わりに合成ホスファチジルグリセロールである1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロールナトリウム塩(COATSOME MG−4040、日油製)を0.043重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例5)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの代わりに鶏卵黄由来ホスファチジルエタノールアミン(COATSOME NE−50、日油製)を0.085重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例6)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの代わりに合成ホスファチジルコリンである1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(COATSOME MC−4040、日油製)を0.043重量%、界面活性剤としてリゾホスファチジルコリン(COATSOME MC−40H、日油製)を0.014重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例7)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの代わりに合成ホスファチジルコリンである1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(COATSOME MC−6080、日油製)を0.043重量%、界面活性剤としてリゾホスファチジルコリン(COATSOME MC−40H、日油製)を0.014重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(実施例8)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロールの濃度を0.021重量%及び鶏卵黄由来ホスファチジルエタノールアミンを0.021重量%となるように添加した以外は同様に行った。
(比較例1)
実施例1の4)検体希釈液の作製において、グリセロリン脂質を未添加とした以外は同様に行った。
(実施例9)
1)ラテックス粒子の作成
拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器(容量2L)に、蒸留水1100g、スチレン200g、スチレンスルホン酸ナトリウム0.2g、及び、蒸留水50gに過硫酸カリウム1.5gを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、70℃で攪拌しながら48時間重合した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置 (日本電子社製、「JEM−1010型」)を用いて10000倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低100個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。このようにして平均粒子径:0.40μmのラテックスBが得られた。
2)抗PSA抗体感作ラテックス試薬の作製
ラテックスB(固形分10%(w/v)、抗PSA抗体63291をそれぞれ20mmol/Lグリシン緩衝液(pH9.0)で希釈し、1%ラテックス液、0.4mg/mL抗体液を調製した。これらを1:1(1容+1容)で混合し、約1時間攪拌した。この混合液2容に、ブロッキング液(10重量%BSA)を0.1容添加し、約1時間攪拌した。次に5mmol/L MOPS(pH7.0)溶液に透析後、3Abs/mL(600nm)となるように希釈して抗PSA抗体感作ラテックス溶液aを得た。
また、ラテックスB(固形分10%(w/v)、抗PSA抗体63251を用いた以外は上記抗PSA抗体感作ラテックス溶液a作製と同様に操作し、抗PSA感作ラテックス溶液bを得た。
このようにして得られたラテックス溶液aとラテックス溶液bを1:1(1容+1容)で混合し、抗PSA抗体感作ラテックス試薬とした。
3)検体希釈液の作成
30mmol/L HEPES緩衝液(pH7.0)にBSAを0.1重量%、塩化カリウムを0.5mol/L、ポリビニルピロリドンK90(和光純薬工業製)を0.3%、鶏卵黄由来ホスファチジルグリセロール(COATSOME NG−50LS、日油製)0.115重量%となるように添加し、撹拌した後、超音波破砕機により溶液が透明となるまで30分間以上超音波処理を行うことにより、検体希釈液を作成した。
(比較例2)
実施例9の3)検体希釈液の作成において、グリセロリン脂質を未添加とした以外は同様に行った。
以下、実施例1〜9及び比較例1および2について検討を行った結果を示す。
(検討1)
1)内因性リポ蛋白質の分画
臭化カリウム密度勾配遠心法で高密度リポ蛋白質(以下、HDLとする)を分画した。
50mL超遠心チューブに1.21g/mLの臭化カリウム溶液を12mL分注する。これに10mLの梅毒陰性血清を臭化カリウム溶液と混ざらないようにゆっくりと分注し、積層する。次に精製水12mLを血清と同様に混ざらないようにゆっくりと分注し、積層する。
超遠心分離機にて44000rpm、20時間、4℃で遠心分離する。
注射針とテフロン(登録商標)チューブを接続したものを用意し、ペリスタポンプで溶液を吸引できるようにする。この注射針を超遠心分離後の超遠心チューブにゆっくりと底まで挿入し、ペリスタポンプにより、臭化カリウム密度勾配がかかった血清を吸い上げる。吸い上げた溶液は0.7mLずつフラクションとして分種し、43本のフラクションが得られた。
この43本のフラクションのHDLコレステロール濃度を測定すると、フラクションNo.5〜15の範囲でHDLが存在することがわかった。HDLコレステロール濃度の最も高い領域である、フラクションNo.9〜13を一つにまとめ、臭化カリウムを除去するために生理食塩水(以下、生食という)で透析をした。透析後のHDLコレステロール濃度をコレステスト(登録商標)N HDL(積水メディカル社製)で測定すると、40mg/dLであった。
以上の方法により、HDL含有生食溶液を得ることができた。
2)測定検体
120R.U.(R.U.は、梅毒陽性抗体価の単位で、1R.U.は、RPRカード法の1倍に相当し、1R.U.以上で梅毒陽性と診断する。国際標準品を測定した場合、1R.U.は、0.4IUである。)の抗体価を持つ梅毒抗リン脂質抗体陽性検体を上記検討1の1)で得たHDL含有生食溶液、生食又は血清で段階的に希釈したものを調製した。
3)凝集量の測定
凝集量の測定には日立7180形生化学自動分析装置を用いた。上記実施例2又は比較例1で作製した検体希釈液を180μLと上記検討1の2)で作製した各検体20μLを上記自動分析装置のセル中で混合し、混合後5分間、37度でインキュベートした。次に上記実施例1の1)で作製したラテックス試薬を60μL添加し、混合後5分間、37度でインキュベートした。測定波長700nmにおけるラテックス試薬添加直後の吸光度とラテックス試薬添加5分後の吸光度差(以下、結果では△Abs×10000で表記する)を自動分析装置で算出した。この吸光度差が、免疫反応により増加した凝集量となる。
4)結果
結果を図1及び図2に示す。
図1及び図2から、比較例1においてHDL含有生食溶液で希釈した場合は、血清で希釈した場合と同様に吸光度の低下が認められた。このことから、血清中のHDLが妨害成分であり、吸光度低下の原因であると考えられた。それに対して、グリセロリン脂質を添加した実施例2においては、HDL含有生食溶液や、血清で希釈した場合においても、比較例1のような吸光度の低下が抑制され、ほぼ生食と同様の吸光度となった。以上のことから、実施例2で添加したグリセロリン脂質がHDLによる妨害を抑制し、吸光度低下を抑制していることがわかった。
(検討2)
1)測定検体
120R.U.の抗体価を持つ梅毒抗リン脂質抗体陽性検体を生食又は血清で段階的に希釈したものを調製した。
2)凝集量の測定
凝集量の測定には日立7180形生化学自動分析装置を用いた。上記実施例1〜8又は比較例1で作製した検体希釈液を180μLと上記検討1の1)で作製した各検体20μLを上記自動分析装置のセル中で混合し、混合後5分間、37度でインキュベートした。次に上記実施例1の1)で作製したラテックス試薬を60μL添加し、混合後5分間、37度でインキュベートした。測定波長700nmにおけるラテックス試薬添加直後の吸光度とラテックス試薬添加5分後の吸光度差(以下、結果では△Abs×10000で表記する)を自動分析装置で算出し、この吸光度差が、免疫反応により増加した凝集量となる。
3)結果
結果を図3〜図11に示す。
実施例1〜8のいずれにおいても比較例1よりも生食と血清の各抗体濃度における吸光度差が減少しており、各種グリセロリン脂質添加によって血清中の妨害成分による吸光度の低下を改善していることがわかった。
(検討3)
1)測定検体
PSA濃度9.5ng/mLの検体を、生食及び女性血清で希釈したものを使用した。
2)凝集量の測定
凝集量の測定には日立7180形生化学自動分析装置を用いた。上記実施例9及び比較例2で作成した検体希釈液を90μLと上記検討1の1)で作成した各検体10.8μLを上記自動分析装置のセル中で混合し、混合後5分間、37℃でインキュベートした。次に上記実施例9の1)で作成したラテックス試薬を90μL添加し、混合後5分間、37℃でインキュベートした。測定波長800nmにおけるラテックス試薬添加直後の吸光度とラテックス試薬添加5分後の吸光度差(以下、結果では△Abs×10000で表記する)を自動分析機が算出し、この吸光度差が、免疫反応により増加した凝集量となる。
3)結果
結果を図12および図13に示す。
実施例9は比較例2よりも生食と血清の各PSA濃度における吸光度差が減少しており、各種グリセロリン脂質添加によって血清中の妨害成分による吸光度の低下を改善していることがわかる。
本発明は、免疫反応により血中の被測定物質を測定する試薬における、内因性リポ蛋白質の影響の回避方法であり、内因性リポ蛋白質の影響抗リン脂質抗体測定試薬においては、その影響を回避することにより、より正確な測定が可能となる。

Claims (9)

  1. 被測定物質が血中の抗体又は抗原であり、被測定物質が抗体である場合は抗原、被測定物質が抗原である場合は抗体との免疫反応により生じる凝集の度合を光学的に測定することにより被測定物質を測定する試薬において、被測定物質が抗体である場合の抗原、又は被測定物質が抗原である場合の抗体が担持されている合成高分子からなるラテックスを用いるとともに、該免疫反応の反応系に、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンから選ばれる1種以上のグリセロリン脂質を溶解又は分散状態で含有させることを特徴とする内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
  2. 被測定物質が抗リン脂質抗体である請求項記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
  3. 被測定物質である抗リン脂質抗体が、梅毒感染により血中に出現する抗梅毒リン脂質抗体又は自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群により血中に出現する抗リン脂質抗体である請求項記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
  4. 被測定物質が前立腺特異抗原である請求項1記載の内因性リポ蛋白質の影響回避方法。
  5. 被測定物質が血中の抗体又は抗原であって、被測定物質が抗体である場合は抗原、被測定物質が抗原である場合は抗体が担持されている合成高分子からなるラテックスを用いた抗原抗体による免疫反応により生じる凝集の度合を光学的に測定することにより被測定物質を測定する試薬において、前記免疫反応の反応系に、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンから選ばれる1種以上のグリセロリン脂質が溶解又は分散状態で含有されていることを特徴とする血中の抗体又は抗原測定試薬。
  6. 被測定物質が、抗リン脂質抗体である請求項記載の測定試薬。
  7. 被測定物質である抗リン脂質抗体が、梅毒感染により血中に出現する抗梅毒リン脂質抗体である請求項記載の測定試薬。
  8. 被測定物質である抗リン脂質抗体が、自己免疫疾患である抗リン脂質抗体症候群により血中に出現する抗リン脂質抗体である請求項6又は7記載の測定試薬。
  9. 被測定物質が前立腺特異抗原である請求項記載の測定試薬。
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