JPH10282096A - 抗リン脂質抗体測定方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高感度に抗体量の定量が可能で、かつ自動分析
機に適用可能な抗リン脂質抗体測定方法及び試薬を提供
する。 【解決手段】抗リン脂質抗体を被測定物質とし、脂質抗
原との免疫反応により前記抗体を測定する方法におい
て、上記免疫反応の反応系にポリビニルピロリドン（好
ましくは平均分子量１０００〜２００万、濃度０．１〜
５重量％）及び／又はプルラン（好ましくは平均分子量
１０００〜１００万、濃度０．１〜５重量％）が含有さ
れていることを特徴とする抗リン脂質抗体測定方法及び
試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応による抗リン
脂質抗体測定方法及び試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリ
ダム（Treponema Pallidum）が生体に感染すると、病原
体に対する抗体とともにリン脂質と反応性を持つワッセ
ルマン抗体（抗リン脂質抗体）が産生される。従来の梅
毒の検査法は、梅毒菌体に対する抗体を検出するため
に、梅毒菌体から抽出した抗原そのものを用いる方法と
ワッセルマン抗体を検出するためにカルジオリピンを含
む脂質類を抗原として用いる方法の２つに大別される。

【０００３】現在、脂質を用いる方法としては、ＶＤＲ
Ｌ（Veneral Disease Reserch Lab.）法、緒方法、ＲＰ
Ｒ（Rapid Plasma Reagin ）法、ガラス板法等がある
が、定性スクリーニングにはＲＰＲ法、ガラス板法が主
に行なわれている。これら脂質を用いる検査法は梅毒以
外の疾患においても陽性反応を呈するという欠点を有し
ている。しかし、一方で抗リン脂質抗体は梅毒の感染状
態をよく反映するという利点も有しているので、これを
利用して梅毒治療経過を追うことなどにも応用されてい
る。また梅毒以外で陽性反応を呈する疾患としては、全
身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患が知られてお
り、これらの疾患を診断するためにも抗リン脂質抗体を
測定することは有用である。

【０００４】上記ＲＰＲ法はカルジオリピン及びレシチ
ンを含む脂質をカオリン又は炭素末に吸着させたもの
を、白色プレート上で検体と混合し、カオリン又は炭素
末の凝集の有無を判定する方法である。また上記ガラス
板法は、カルジオリピン、レシチン及びコレステリンを
含む脂質抗原液を検体と混合し、コレステリン結晶の凝
集の有無を判定する方法である。上記２法は用手法であ
るため、大量の検体を検査する場合には適していない。
またＲＰＲ法の場合はカオリン又は炭素末の凝集を目視
で、ガラス板法の場合はコレステリン結晶の生成を顕微
鏡下で観察し判定を行なうため、判定には熟練を要す
る。よって判定者によっては判定結果が異なることもお
こり得るという欠点を有していた。さらに上記２法は定
性的に感染しているか否かは判別できるが、抗体の定量
は難しいという欠点を有していた。

【０００５】特表平４−５０３８６５号公報には、リン
脂質をマイクロタイタープレートのウェルに物理吸着さ
せ、ＥＬＩＳＡ法により抗リン脂質抗体を検出する方法
が開示されているが、洗浄時に吸着していたリン脂質が
脱落しやすいため測定値がばらつき、定量性に問題があ
ることや、検出感度が低くなるという欠点があった。上
記公報には化学結合によりマイクロタイタープレートに
リン脂質を結合させ、ＥＬＩＳＡ法により検出する方法
も挙げられているが、化学修飾されたリン脂質を用いる
ため、抗原としての反応性が低下し、これが感度の低下
を招くという欠点があった。さらにＥＬＩＳＡ法では用
手法を必要とするため、検査の自動化に対応できない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的は、高感度に抗体量の
定量が可能で、かつ自動分析機に適用可能な抗リン脂質
抗体測定方法及び試薬を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の抗リン脂質抗体
測定方法は、抗リン脂質抗体を被測定物質とし、脂質抗
原との免疫反応により前記抗体を測定する方法におい
て、上記免疫反応の反応系にポリビニルピロリドン及び
／又はプルランが含有されている。また本発明２の抗リ
ン脂質抗体測定試薬は、抗リン脂質抗体を被測定物質と
し、脂質抗原との免疫反応により前記抗体を測定する試
薬であって、上記免疫反応の反応系にポリビニルピロリ
ドン及び／又はプルランが含有されている。

【０００８】反応系のポリビニルピロリドン及び／又は
プルランの含有量は、少なくなると反応促進の効果が不
十分となり、多くなると反応系の溶液の粘度が高くなり
十分な攪拌が行なわれず、その結果測定値のばらつきが
生じるので、０．１〜５重量％が好ましく、０．５〜
２．５重量％がより好ましい。上記ポリビニルピロリド
ン及びプルランの平均分子量は、小さくなると反応促進
の効果が不十分となり、大きくなると上記溶液中に溶解
しにくくなる。従って、ポリビニルピロリドンは１００
０〜２００万が好ましく、１０万〜１８０万がより好ま
しい。またプルランは１０００〜１００万が好ましい。

【０００９】上記脂質抗原として用いられる脂質として
は、通常カルジオリピン、レシチン（フォスファチジル
コリン）、コレステロールの３種類が用いられるが、こ
れら３種類が全て含まれている必要はなく、少なくとも
カルジオリピンが含まれていればよい。レシチン、コレ
ステロールは特異性の向上や感度の向上を目的としてカ
ルジオリピンと混合して用いられることが多い。これら
の好ましい混合比としては、重量比で、カルジオリピ
ン：レシチン：コレステロール＝１：３〜３０：０．５
〜１０程度であり、これに限定されず、目的に応じて混
合比は適宜選択される。さらに精度を向上させるため、
フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリ
ン、フォスファチジン酸、フォスファチジルエタノール
アミン、フォスファチジルグリセロール等のリン脂質
類、胆汁酸等のコレステロール骨格を有する化合物など
を、上記脂質と混合して使用してもよい。上記脂質は、
動植物から得る方法と合成する方法があるが、目的に応
じて適宜選択される。通常カルジオリピンは動物心臓か
ら抽出・精製したもの、レシチンは卵黄から抽出・精製
したもの、コレステロールは合成したものが使用でき
る。また市販のものを使用してもよい。

【００１０】上記脂質抗原は通常、適当な溶液中に分散
させて使用される。溶液としては特に限定されず、リン
酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げ
られる。分散方法としては、不溶性担体に担持させて分
散させる方法とリポソームを形成させて分散させる方法
がある。前記不溶性担体としては、従来より免疫学的凝
集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられて
いる微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大
量生産が可能な合成高分子からなるラテックスが好まし
い。上記合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、
スチレン−スルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル
酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げら
れ、脂質の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に
保持できる等の理由から、特にポリスチレン、スチレン
−スルホン酸共重合体が好ましい。その他、動物の赤血
球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロ
ジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素
末等の非生物学的粒子なども用いることができる。上記
不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって
異なるが、０．１〜１．０μｍ、好ましくは０．１〜
０．５μｍのものが通常用いられる。

【００１１】上記不溶性担体に脂質抗原を担持させる方
法としては、例えば、エタノール等の適当な溶媒に溶解
した脂質（脂質混合液）に適当な粒径を有するラテック
スを混合し攪拌する（感作工程）。一定時間経過後、タ
ンパク質、糖、ペプチド等を含む溶液で処理し（ブロッ
キング工程）、適当な溶媒に分散させる。上記ラテック
スを分散させる溶媒としては、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。

【００１２】リポソームを形成させる方法としては、超
音波処理法、界面活性剤除去法や溶媒除去法（ボルテッ
クス法）等が挙げられる。上記溶媒除去法を以下に説明
する。フラスコ等にクロロホルム、メタノール、エーテ
ル等の適当な溶媒に溶解した脂質溶液を入れ、エバポレ
ーターを用いて減圧下で蒸発させる。これによりフラス
コ底部に脂質膜が形成される。これに適当な溶媒を加
え、超音波破砕機で分散させる。必要に応じて得られた
分散液を一定のポアサイズの濾過膜で濾過することによ
り、一定の粒径のリポソームを調製する。目的とするリ
ポソームを調製する際に、リポソームを形成させやすく
するために抗リン脂質抗体と反応しない脂質を添加して
もよい。上記リポソームを分散させる際の溶媒として
は、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液
等が挙げられる。

【００１３】上記のようにして得られた試薬と検体中の
抗リン脂質抗体との免疫反応により生じる凝集の度合い
を光学的に測定することにより、検体中の抗リン脂質抗
体量を測定する。

【００１４】反応温度は、上記免疫反応が起こりうるも
のであれば特に限定されないが、恒温で１０〜５０℃の
範囲内で行うのが好ましく、１０〜４０℃がより好まし
い。反応時間は適宜決められる。上記免疫反応を行う際
の反応系の反応液としては、免疫反応が起こりうる生理
的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、
トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液の
ｐＨは、５．５〜８．５が好ましく、さらに好ましくは
６．５〜８．０である。上記反応液には、更に必要に応
じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、アジ化
ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整
剤などを添加してもよい。

【００１５】上記凝集の度合いを光学的に測定する方法
としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成
を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度
分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形
成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過
光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの
測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分
（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度
試験（レートアッセイ）、及びある時点（通常は反応の
終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定
値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイン
トアッセイ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点か
ら比濁法による速度試験を行うことが好ましい。光学的
に測定する方法において、散乱光強度、透過光強度、吸
光度等を検出できる光学機器、特に汎用の自動分析機が
使用できる。測定の波長は２５０〜１０００ｎｍが使用
できる。

【００１６】

【実施例】本発明を実施例につき説明する。 （実施例１） １）脂質抗原液の作成 カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ、シグ
マ社製）２ｍｌ、精製レシチン（ナカライテスク社製）
のエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ、コレス
テロール（ナカライテスク社製）のエタノール溶液（１
０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液を作成し
た。 ２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成 平均粒径４００μｍのポリスチレンラテックス（固形分
１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１００μｌを、
あらかじめ緩やかに攪拌しながら３７℃に保った。これ
に、上記脂質抗原液２５０μｌを一気に添加し、そのま
ま３７℃で緩やかに２時間攪拌した。次いでウシ血清ア
ルブミン（以下ＢＳＡという）（フラクションＶ、Reag
entGrade 、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ
／Ｖ）含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、食塩濃度
０．９重量％、ｐＨ７．４）２ｍｌを一気に添加し、さ
らに３７℃で１時間攪拌した。これを遠心分離して上清
を除き、沈殿したラテックスを再び１％ＢＳＡを含有す
るＰＢＳに懸濁した。この操作を繰り返し、最後に１％
ＢＳＡを含有するＰＢＳ４ｍｌに懸濁してラテックス試
薬を作成した。

【００１７】３）検体希釈液の作成 ５０ｍＭリン酸緩衝液にＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）になる
ように、またポリビニルピロリドン（分子量１２０万、
ＢＡＳＦ社製）を１重量％になるように添加し溶解させ
て検体希釈液を作成した。 ４）感度の測定 検体としてＲＰＲ値が８、４、２、１、０の血清を用い
た。上記ラテックス試薬３０μｌ、上記検体希釈液２１
０μｌ、上記各検体２０μｌを混合し、混合後８０秒か
ら３２０秒の間の吸光度変化量を測定した。測定は生化
学自動分析装置（日立７１７０型自動分析機）を用い、
測定波長は７００ｎｍ、測定温度は３７℃で行なった。
結果を表１に示す。

【００１８】（実施例２）実施例１の３）検体希釈液の
作成において、ポリビニルピロリドンの濃度を０．５重
量％としたこと以外は同様に行なった。結果を表１に示
す。

【００１９】（実施例３）実施例１の３）検体希釈液の
作成において、ポリビニルピロリドンの濃度を１．５重
量％としたこと以外は同様に行なった。結果を表１に示
す。

【００２０】（実施例４）実施例１の３）検体希釈液の
作成において、ポリビニルピロリドンにかえて、プルラ
ン（分子量２０万、林原社製）を用いたこと以外は同様
に行なった。結果を表１に示す。

【００２１】（実施例５）実施例４の３）検体希釈液の
作成において、プルランの濃度を０．５重量％としたこ
と以外は同様に行なった。結果を表１に示す。

【００２２】（実施例６）実施例４の３）検体希釈液の
作成において、プルランの濃度を１．５重量％としたこ
と以外は同様に行なった。結果を表１に示す。

【００２３】（比較例１）実施例１の３）検体希釈液の
作成において、ポリビニルピロリドンを添加しなかった
こと以外は同様に行なった。結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】（実施例７） １）リポソーム懸濁液の調製 ジパルミトイルフォスファチジルコリン（シグマ社製）
のクロロフォルム溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、コレス
テロール（ナカライテスク社製）のクロロフォルム溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、カルジオリピンのエタノール
溶液（５ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）０．２ｍｌ、ジパル
ミトイルフォスファチジルグリセロール（シグマ社製）
のクロロフォルム溶液（５ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌをナ
ス型フラスコに移し、減圧下においてクロロフォルム及
びエタノールを除去し、フラスコの内壁に脂質の薄膜を
形成させた。さらに減圧下に２時間以上放置し、クロロ
フォルムを完全に除去した。このフラスコに３ｍｌのＰ
Ｂ（０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナ
トリウム水溶液、ｐＨ７．４）を添加し、攪拌機で６０
分、緩やかに攪拌して脂質懸濁液を調製した。次いで上
記脂質懸濁液を濾過機（エクストゥルーダー）で濾過を
繰り返し、０．４μｍまで粒径を揃え（サイジング）、
リポソーム懸濁液を得た。 ２）検体希釈液として実施例１の３）で作成した検体希
釈液を用いた。 ３）感度の測定 検体としてＲＰＲ値が８、４、２、１、０の血清を用い
た。上記リポソーム懸濁液３０μｌ、上記検体希釈液２
１０μｌ、上記各検体２０μｌを混合し、混合後８０秒
から３２０秒の間の吸光度変化量を測定した。測定は生
化学自動分析装置（日立７１７０型自動分析機）を用
い、測定波長は７００ｎｍ、測定温度は３７℃で行なっ
た。結果を表２に示す。

【００２６】（実施例８）実施例７の２）の検体希釈液
において、ポリビニルピロリドンにかえて、プルラン
（分子量２０万、林原社製）を用いたこと以外は同様に
行なった。結果を表２に示す。

【００２７】（比較例２）実施例７の２）の検体希釈液
において、ポリビニルピロリドンを添加しなかったこと
以外は同様に行なった。結果を表２に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】比較例ではＲＰＲ血清の０〜８倍におい
て、濃度に相関した直線性が得られておらず、また８倍
の血清でも吸光度変化量がほとんど得られていないのに
対して、実施例ではいずれも濃度にほぼ相関して直線性
が得られ、またＲＰＲ値が低濃度の血清でも定量可能な
十分な吸光度変化量が得られている。

【００３０】

【発明の効果】本発明の抗リン脂質抗体測定方法及び試
薬は上述のとおりであり、低濃度域においても感度が高
く、また自動分析機にも適用が可能となるので、検体中
の抗リン脂質抗体を正確にかつ簡便に定量することが可
能となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等
に有用である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗リン脂質抗体を被測定物質とし、脂質抗
   原との免疫反応により前記抗体を測定する方法におい
   て、上記免疫反応の反応系にポリビニルピロリドン及び
   ／又はプルランが含有されていることを特徴とする抗リ
   ン脂質抗体測定方法。
2. 【請求項２】平均分子量１０００〜２００万のポリビニ
   ルピロリドンが０．１〜５重量％の濃度で含有されてい
   ることを特徴とする請求項１記載の抗リン脂質抗体測定
   方法。
3. 【請求項３】平均分子量１０００〜１００万のプルラン
   が０．１〜５重量％の濃度で含有されていることを特徴
   とする請求項１記載の抗リン脂質抗体測定方法。
4. 【請求項４】抗リン脂質抗体を被測定物質とし、脂質抗
   原との免疫反応により前記抗体を測定する方法に用いら
   れる試薬において、上記免疫反応の反応系にポリビニル
   ピロリドン及び／又はプルランが含有されていることを
   特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。
5. 【請求項５】平均分子量１０００〜２００万のポリビニ
   ルピロリドンが０．１〜５重量％の濃度で含有されてい
   ることを特徴とする請求項４記載の抗リン脂質抗体測定
   試薬。
6. 【請求項６】平均分子量１０００〜１００万のプルラン
   が０．１〜５重量％の濃度で含有されていることを特徴
   とする請求項４記載の抗リン脂質抗体測定試薬。
7. 【請求項７】請求項４〜６のいずれか１項に記載の測定
   試薬において、脂質抗原が不溶性担体に担持されている
   ことを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。
8. 【請求項８】請求項４〜６のいずれか１項に記載の測定
   試薬において、脂質抗原がリポソームとされていること
   を特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。