JP2002365297A - 抗リン脂質抗体測定試薬 - Google Patents

抗リン脂質抗体測定試薬

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JP2002365297A
JP2002365297A JP2001174377A JP2001174377A JP2002365297A JP 2002365297 A JP2002365297 A JP 2002365297A JP 2001174377 A JP2001174377 A JP 2001174377A JP 2001174377 A JP2001174377 A JP 2001174377A JP 2002365297 A JP2002365297 A JP 2002365297A
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Tetsuya Ota
哲也 大田
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】高感度で抗体量の定量が可能で、かつ長期保存
可能な抗リン脂質抗体測定試薬を提供する。 【解決手段】リン脂質抗原を不溶性担体に担持させた抗
リン脂質抗体測定試薬において、酸化防止剤を含む抗リ
ン脂質抗体測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗リン脂質抗体測
定試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリ
ダム(Treponema Pallidum)が生体に感染すると、病原
体に対する抗体とともにリン脂質と反応性を持つワッセ
ルマン抗体(以下、抗リン脂質抗体と記す。)が産生さ
れる。従来の梅毒の検査法は、梅毒菌体に対する抗体を
検出するために、梅毒菌体から抽出した抗原そのものを
用いる方法と抗リン脂質抗体を検出するためにカルジオ
リピンを含むリン脂質を抗原として用いる方法の2つに
大別される。
【0003】現在、リン脂質を用いる方法としては、V
DRL(Veneral Disease ReserchLab.)法、緒方法、
RPR(Rapid Plasma Reagin )法、ガラス板法等があ
り、定性的なスクリーニングに用いられてきた。そのな
かで、近年は、主にRPR法、ガラス板法が用いられて
いる。
【0004】ところが、リン脂質を用いる検査法は梅毒
以外の疾患においても陽性反応を呈するという欠点を有
している。しかし、一方で抗リン脂質抗体は梅毒の感染
状態をよく反映するという利点も有しているので、これ
を利用して梅毒治療経過を追うことなどにも応用されて
いる。また、梅毒以外で陽性反応を呈する疾患として
は、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患が知られ
ているが、これらの疾患を診断するためにも抗リン脂質
抗体を測定することは有用である。
【0005】上記RPR法はカルジオリピン及びレシチ
ンを含むリン脂質をカオリン又は炭素末に吸着させたも
のを、白色プレート上で検体と混合し、カオリン又は炭
素末の凝集の有無を判定する方法である。また、上記ガ
ラス板法は、カルジオリピン、レシチン及びコレステリ
ンを含むリン脂質抗原液を検体と混合し、コレステリン
結晶の凝集の有無を判定する方法である。
【0006】上記2法は用手法であるため、大量の検体
を検査する場合には適していない。また、RPR法の場
合はカオリン又は炭素末の凝集を目視で、ガラス板法の
場合はコステリン結晶の生成を顕微鏡下で観察し判定を
行なうため、判定には熟練を要する。よって判定者によ
っては判定結果が異なることもおこり得るという欠点を
有していた。また、上記2方法は、凝集に伴って凝集体
が沈殿し、溶液濃度が変るため、この溶液を用いる吸光
度測定方法のような自動化測定に適応できないとの問題
点があった。このため、上記2法は定性的に感染してい
るか否かは判別できるが、抗体の定量は難しいという欠
点を有していた。
【0007】特開平6−148193号公報には、コレ
ステロール等のステロイドと、カルジオリピン等のリン
脂質で処理した担体により、抗リン脂質抗体の免疫学的
測定法が開示され、主にカルジオリピンとコレステロー
ルをマイクロタイタープレートに吸着させ、ELISA
法により検出を行なう方法が記載されている。しかしな
がらこの方法では、凝集を吸光度で求めるため陰性、陽
性の判定は客観的に行なえるが、マイクロタイタープレ
ートへの試薬や検体の分注を手作業で行なうため操作が
煩雑になり、また反応時間が長く結果を迅速に得ること
ができない。また、特開平5−212808号公報に
は、磁性粒子を用いる方法で抗リン脂質抗体の検出を行
なっているが、磁力をかける装置などが必要であり汎用
性に乏しい。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決し高感度で抗体量の定量が可能で、かつ長期保存
可能な抗リン脂質抗体測定試薬を提供することを目的と
する。
【0009】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項1記載の本発明は、リン脂質抗原を不溶性担
体に担持させた抗リン脂質抗体測定試薬において、酸化
防止剤を含むことを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬
を提供する。また、請求項2記載の本発明は、酸化防止
剤がトコフェロール類からなる請求項1記載の抗リン脂
質抗体測定試薬を提供する。
【0010】本発明における酸化防止剤としては、例え
ばトコフェロール類が用いられる。その中でも好ましく
は、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−ト
コフェロールであり、その中でも特にα−トコフェロー
ルが好ましく用いられる。また、上記酸化防止剤の使用
量としては、不溶性担体10μgに対して0.01〜
1.0μgであることが好ましい。
【0011】本発明におけるリン脂質抗原は、リン脂質
であるカルジオリピン、レシチンと、脂質であるコレス
テロールから構成されている。通常リン脂質抗原はカル
ジオリピン、レシチン及びコレステロールの3種類が用
いられるが、これら3種類が全て含まれている必要はな
く、少なくともカルジオリピンが含まれていればよい。
【0012】リン脂質抗原の使用量は、例えば、不溶性
担体10μgに対してカルジオリピンが0.01〜1μ
g、レシチンがカルジオリピンの5〜15倍量、コレス
テロールがカルジオリピンの0〜5倍量とされているこ
とが好ましい。カルジオリピンが0.01μgより少な
い場合は、測定に十分な感度を得られず、1μgより多
い場合は、非特異凝集が起こり沈殿が生じてしまう。レ
シチンが、カルジオリピンの5倍量より少ない場合は、
測定に必要な抗原性をもったリン脂質抗原が得られにく
くなり、15倍量より多くなると非特異凝集が起こり沈
殿が生じてしまう。コレステロールは、試薬測定系の感
度を上昇させるために添加するものであり、特に添加さ
れなくてもよいが、添加量がカルジオリピンの5倍量よ
り多くなると非特異凝集が起こり沈殿が生じてしまう。
【0013】上記カルジオリピン、レシチン、及びコレ
ステロールは、非特異反応を抑えるためにできるだけ純
度の高いものを用いるの好ましく、カルジオリピン、コ
レステロールは、90%以上含有され、レシチンは主成
分のフォスファチジルコリンが70%以上含有されてい
るものが好ましい。
【0014】上記リン脂質抗原の測定精度をさらに向上
させるため、例えば、フォスファチジルイノシトール、
フォスファチジルセリン、フォスファチジン酸、フォス
ファチジルエタノールアミン、フォスファチジルグリセ
ロール等のリン脂質類、胆汁酸等のコレステロール骨格
を有する化合物などを、上記リン脂質と混合して使用し
てもよい。
【0015】本発明における不溶性担体は、従来より免
疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用
いられているものが用いられ、例えば合成高分子からな
るラテックス等を用いることができる。好ましくは、ポ
リスチレン、スチレン−スルホン酸共重合体、スチレン
−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエ
ン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステ
ル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体
等が挙げられる。さらに好ましくは、リン脂質の吸着性
に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理
由から、特にポリスチレン、スチレン−スルホン酸共重
合体である。上記不溶性担体の平均粒径は、測定方法、
測定機器によって異なるが、好ましくは0.1〜1.0
μm、さらに好ましくは0.1〜0.5μmのものが用
いられる。
【0016】本発明における抗リン脂質抗体測定試薬
は、リン脂質抗原中に酸化防止剤を混合し不溶性担体に
担持させることにより得られる。
【0017】上記抗リン脂質抗体測定試薬は、適当な検
体希釈液で希釈してもよく、検体希釈液としてはpH
5.0〜9.0の緩衝液であればどのようなものでも用
いることができる。上記緩衝液としては、例えば、リン
酸緩衝液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。また測定感度
の向上や抗原抗体反応の促進のために種々の増感剤を用
いてもよい。上記増感剤としては、例えば、特開平2−
173567号公報に記載されているようなアルキル化
多糖類、特開平5−180838号公報に記載されてい
るようなプルラン及びポリビニルピロリドン等が挙げら
れる。さらに検体中に存在する他の物質により起こる非
特異反応を抑制するために、牛血清アルブミン、卵性ア
ルブミン等を用いてもよい。
【0018】上記抗リン脂質抗体測定試薬は検体中の抗
リン脂質抗体との免疫反応により生じる凝集の度合いを
光学的に測定することにより、検体中の抗リン脂質抗体
量を測定する。光学的に測定する方法において、散乱光
強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、特
に一般の生化学自動分析機であればいずれも使用でき
る。
【0019】上記凝集の度合いを光学的に測定する方法
としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成
を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度
分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形
成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過
光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも2つ
の測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分
(すなわち増加速度)に基づき凝集の程度を求める速度
試験(レートアッセイ)、及びある時点(通常は反応の
終点と考えられる時点)で1つの測定値を得、この測定
値に基づき凝集の程度を求める終点試験(エンドポイン
トアッセイ)を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点か
ら比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
【0020】
【実施例】次に、本発明を実施例、比較例を挙げて説明
する。 (実施例1) 1)リン脂質抗原溶液の作成 カルジオリピン(シグマ社製)のエタノール溶液(5m
g/ml)を2ml、精製レシチン(ナカライテスク社
製)のエタノール溶液(10mg/ml)を10ml、
コレステロール(ナカライテスク社製)のエタノール溶
液(10mg/ml)を3ml及びα−トコフェロール
のエタノール溶液(5mg/ml、和光純薬社製)2m
lを混合しリン脂質抗原溶液を調製した。
【0021】2)リン脂質抗原感作ラテックス試薬の作
成 ポリスチレンラテックス(平均粒径0.4μm、10%
(w/v)、積水化学工業社製)を100μlを37℃
で緩やかに攪拌しておく。これに上記作成したリン脂質
抗原感作溶液250μlを一気に添加し、37℃で緩や
かに2時間攪拌する。次に1重量%の牛血清アルブミン
(BSA)を含むリン酸緩衝液(PBS)を一気に添加
し、さらに37℃で1時間攪拌する。これを15000
rpm、4℃にて15分間遠心分離し、上清液を除き、
沈殿したラテックスを再び1重量%の牛血清アルブミン
を含むリン酸緩衝液3mlに懸濁する。さらにこの操作
を3回繰り返しラテックスを洗浄する。最後に0.5重
量%の牛血清アルブミン、5mMのエチレンジアミン四
酢酸(EDTA)・4Na及び500mMの塩化コリン
を含むPBS4mlに懸濁し、抗リン脂質抗原測定試薬
を調整した。 3)感度の測定 測定には、1検体測定につき、上記2)で調整した抗リ
ン脂質抗原測定試薬を30μl、検体希釈液として、メ
ディエースTPLA(積水化学工業社製)に添付されて
いるものを210μl、測定検体として、RPR値が0
倍、1倍、2倍、8倍の血清を20μlを混合したもの
を使用し、各検体の吸光度変化量を測定した。測定機器
として、生化学自動分析機(日立7170型自動分析
機)を使用し、測定波長は700nmで行なった。 4)保存安定性測定 上記2)で調整した抗リン脂質抗原測定試薬を、30℃
で1週間保存し、再度感度の測定を行った。これらの結
果を図1に示した。
【0022】
【比較例】(比較例1) 1)リン脂質抗原溶液の作成 カルジオリピン(シグマ社製)のエタノール溶液(5m
g/ml)を2ml、精製レシチン(ナカライテスク社
製)のエタノール溶液(10mg/ml)を10ml、
コレステロール(ナカライテスク社製)のエタノール溶
液(10mg/ml)を3ml及びエタノール2mlを
混合しリン脂質抗原溶液を調製した。上記リン脂質抗原
溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法で抗リン脂
質抗体測定試薬調整、感度の測定、保存安定性の測定を
行った。これらの結果を図2に示した。
【0023】
【発明の効果】本発明は、リン脂質抗原を不溶性担体に
担持させた抗リン脂質抗体測定試薬において、酸化防止
剤を含む抗リン脂質抗体測定試薬であるため、大気中に
て酸化されやすいリン脂質を含む試薬を長期間安定的に
保存することができるようになった。さらに、一般の生
化学自動分析に適用可能なため、より迅速に簡便に感度
が高く、また信頼性の高い抗体の測定が可能な抗リン脂
質抗体測定試薬を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1の抗リン脂質抗体測定試薬により検体測
定を行った結果を示す図。
【図2】比較例1の抗リン脂質抗体測定試薬により検体
測定を行った結果を示す図。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 リン脂質抗原を不溶性担体に担持させた
    抗リン脂質抗体測定試薬において、酸化防止剤を含むこ
    とを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。
  2. 【請求項2】 酸化防止剤がトコフェロール類からなる
    請求項1記載の抗リン脂質抗体測定試薬。
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Citations (4)

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JPH06148193A (ja) * 1992-11-02 1994-05-27 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk 抗リン脂質抗体結合用担体及び該担体を用いた免疫学的測定法
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