JPH11295312A - 抗リン脂質抗体測定方法及び抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原の反応性の低下や、担体からの抗原の遊
離等による感度低下がなく、安定かつ精度の高く、生化
学自動分析機に適応でき、簡便かつ迅速大量に測定可能
であり、しかも従来の抗リン脂質抗体を測定する方法と
して標準的な試験法として知られているＲＰＲ法の結果
との一致性に優れた、抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬及び該試薬を用いた抗リン脂質抗体の測定方法を
提供する。 【解決手段】 抗原性を有するリン脂質をリポソームの
膜構成成分として組み込んだリポソーム懸濁液を抗リン
脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬の主成分とし、該試薬
を１００ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で、抗
リン脂質抗体が含まれていると疑われる被検液と接触さ
せて抗原抗体反応させ、抗原抗体反応により生じた凝集
量を透過光の減少として測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗リン脂質抗体を
測定するためのリポソームを用いた免疫凝集反応試薬に
関する。さらに詳しくは抗原性を有するリン脂質をリポ
ソームの膜構成成分として組み込んだリポソーム懸濁液
を用いた免疫凝集反応試薬、及び該免疫凝集反応試薬を
用いた、被検試料中に存在する広い濃度範囲の抗リン脂
質抗体を簡単な操作で、または汎用の生化学自動分析機
を用いて、測定の再現性に優れ、測定が短時間で可能で
あり大量に一括して処理可能な抗リン脂質抗体の測定方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒を初めとする感染症、悪性腫瘍及び
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患
患者では、陰性に帯電したリン脂質、特にカルジオリピ
ンに対する抗体が血中に存在することが見出されてい
る。これらの病気等の診断のために、検体中に含まれて
いるリン脂質に対応する抗リン脂質抗体を測定する方法
が知られている。このような抗リン脂質抗体を測定する
方法としては、従来よりよく用いられている方法として
炭素粒子付着リン脂質抗原懸濁液を利用したＲＰＲ法
（Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍａ Ｒｅａｇｉｎカード試験
法）、ＶＤＲＬ（Ｖｅｎｅｒｅａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）法、ＲＳＴ
（Ｒｅａｇｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法等
の迅速性に優れたものが知られていた。しかし、これら
の方法は目視判定法によるものであり、測定精度の管理
上において実施者、測定日等により、測定結果が異なる
等の問題があった。

【０００３】近年、目視判定法に代えて、分析機による
測定法が提案されている。すなわち、リン脂質抗原をラ
テックス粒子等の不溶性担体に固定化し、得られた懸濁
液を免疫凝集反応試薬として分析機で測定する方法が提
案されている。このような試薬において、ラテックス粒
子等の不溶性担体へのリン脂質抗原の固相化方法とし
て、特表平４−５０３８６５号公報には、磁性体粒子に
リン脂質抗原の有機溶媒溶液を加え、溶媒を蒸発させて
磁性体粒子表面にリン脂質抗原を物理吸着させる方法が
開示されている。しかし、この方法を用いた場合、測定
操作における洗浄時に磁性体粒子に吸着していた抗原と
してのリン脂質が剥がれ落ちるなどして、測定値にばら
つきが生じたり、測定感度の低下を招くなどの問題があ
り、また、試薬の製造上も複数種のリン脂質を抗原とし
て用いた場合、リン脂質の種類によって分子の大きさや
極性が異なるので、微細な製造条件の変動で磁性体粒子
への吸着状況が変化し、安定した試薬の製造が困難であ
った。

【０００４】これらの点を鑑み、特開平８−１０５８９
０号公報では、種類の異なるリン脂質を抗原としてそれ
ぞれ個別にラテックス粒子に固定化し、これらを混合し
て試薬とする製造方法が開示されており、また、特開平
８−１０５８９１号公報及び特開平８−１０５８９２号
公報では、不溶性担体をそれぞれ脂溶性染料、あるいは
カチオン性官能基を有する化合物で処理し、その後前記
不溶性担体にリン脂質を抗原として固定化する方法が開
示されている。しかし、これらの方法は、製造方法が煩
雑であったり、脂溶性染料あるいはカチオン性官能基を
有する化合物によるラテックス粒子の処理条件設定が複
雑である等の問題があった。

【０００５】また、カルジオリピン、レシチン、コレス
テロールを用いて調製されたリポソーム中に染料を封入
し、このリポソーム懸濁液をスライド上或いはプラスチ
ックカード上で梅毒血清と混合することにより、凝集反
応の結果生じた凝集物を目視して検査することが、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄ，９０（１９８６）１８９−１９６に示されてい
る。しかし、この方法では、リポソーム粒子直径は１〜
１０μｍと大きく、また用いるリポソーム懸濁液の濃度
が凡そ５ｍＭリン脂質濃度と高いため、生化学自動分析
機に安定して適用することができないという問題があ
り、また、高価なリポソームを大量に使用するという問
題があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した問
題点を解決することを目的とし、詳しくは、抗原の反応
性の低下や、担体からの抗原の遊離等による感度低下が
なく、安定かつ精度が高く、生化学自動分析機に適応で
き、簡便かつ迅速大量に測定可能であり、しかも従来の
抗リン脂質抗体を測定する方法として標準的な試験法と
してよく知られているＲＰＲ法の結果と一致性に優れ
た、抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬及び該試薬
を用いた抗リン脂質抗体の測定方法を提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の抗リン脂質抗体
の測定方法は、抗原性を有するリン脂質をリポソームの
膜構成成分として組み込んだリポソーム懸濁液を、１０
０ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で、抗リン脂
質抗体が含まれていると疑われる被検液と接触させて抗
原抗体反応させ、前記抗原抗体反応により生じた凝集量
を透過光の減少として測定することを特徴とする。

【０００８】また、本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫
凝集反応試薬は、抗原性を有するリン脂質をリポソーム
の膜構成成分として組み込んだリポソームが、１００ｍ
Ｍ以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で使用される形態
であることを特徴とする。

【０００９】このような形態の抗リン脂質抗体測定用免
疫凝集反応試薬は、１試薬系でもよくまた、２以上の別
体となった試薬であってもよい。

【００１０】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、好ましくは、１００ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化
コリンを含有する検体希釈液からなる第１試薬と、抗原
性を有するリン脂質をリポソームの膜構成成分として組
み込んだリポソーム懸濁液からなる第２試薬を構成要素
として含む。

【００１１】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、通常、前記第１試薬と第２試薬は別体となっ
て組み合わされたものである。

【００１２】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、用いるリポソームの平均粒子直径を１００ｎ
ｍ以上３００ｎｍ以下とすることにより、リポソームを
安定な懸濁液とすることができ、汎用の生化学自動分析
装置に適用した場合、安定して処理が可能となり、測定
の再現性に優れた抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試
薬を提供することができる。

【００１３】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、リポソーム懸濁液のリポソーム含量がリポソ
ームに含有されるリン脂質の濃度に換算して０．５ｍＭ
以上、好ましくは２ｍＭ以上であることを特徴とする。
このようなリポソーム含量とした抗リン脂質抗体測定用
免疫凝集反応試薬は、汎用の生化学自動分析装置におい
て被検液との抗原抗体反応により生じた凝集量を透過光
の減少として測定することができ、短時間で大量に一括
した処理が可能となり、しかも、リポソームの懸濁液の
濃度（リポソーム含有量）が従来の凝集量を目視により
測定する場合に比べて、低く（リポソーム含有量が少な
く）することが可能となり、例えば、半分程度でよいの
で、高価なリポソームの使用量が少なくてすむ。

【００１４】前記本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝
集反応試薬に含まれる、抗原性を有するリン脂質とは、
カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ
ァチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイ
ノシトール、ホスファチジルグリセロホスフェートから
選択される１種又は２種以上の陰性に帯電した抗原性を
有するリン脂質であることを特徴とする。リポソームの
膜構成成分の一部として陰性に帯電したリン脂質を使用
することにより、リポソームを安定な懸濁液とすること
ができ、安定な抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬
を提供することができる。

【００１５】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬に含まれるリポソームは、リポソーム調製時に使
用した水溶液の浸透圧よりも高い浸透圧の水溶液でリポ
ソームの外水相が置換されて、浸透圧が負荷されたリポ
ソームであることを特徴とする。浸透圧が負荷されたリ
ポソームは、測定時に濁度の高いものとなり、十分な測
定感度が達成される。この浸透圧負荷処理は、塩（例え
ば、ＮａＣｌ）濃度の低い緩衝液によってリポソームを
調製しておいたものを、塩濃度の高い緩衝液によって透
析し、リポソームの外側の水相を塩濃度の高い緩衝液で
置換することによって行う。

【００１６】上記置換処理によるリポソームの濁度の上
昇は、次のような理由と考えられる。すなわち、リポソ
ームはその性質からいわゆる半透膜と考えられており、
この置換処理では、塩、例えば、ＮａＣｌはリポソーム
膜を通過できないが、しかし、水分子はリポソーム膜を
通過できるため塩濃度の低い内水相から高い外水相へ移
動する。このときリポソーム内容積が減少し圧縮される
ため、リポソームを形成している脂質の分子密度が高く
なり、その結果リポソームの濁度が上昇すると考えられ
る。

【００１７】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、上記のように構成されているので、化学結合
により抗原を担体に固定する場合に見られる抗原性の低
下や、物理吸着により抗原を担体に固定する場合に見ら
れる凝集測定法における洗浄時の抗原の遊離を抑制する
効果があり、さらにリポソームを安定な懸濁液とするこ
とができ、しかも免疫凝集反応によって生ずる濁度は高
いものとなる。即ち、測定感度が高いものとなる。

【００１８】本発明の抗リン脂質抗体測定免疫瀕集反応
試薬に使用されるリポソームの膜構成脂質は、好ましく
はリン脂質、コレステロール、抗原性を有するリン脂質
を主体とする混合溶液から調製される。リン脂質中の脂
肪酸残基は、炭素数が１２〜１８、特に偶数であること
が好ましい。また重合性リン脂質を用いたリポソームも
使用できる。リポソーム調製時に混合する脂質の割合
は、ホスファチジルコリン等のリン脂質１００モルに対
して、コレステロールが０モルを越え１００モル以下、
好ましくは２０〜１００モル、抗原性を有するリン脂質
は５モル以上とすることにより、被検物質中の抗体を反
応させて生じた凝集量を分光光度計、汎用の生化学自動
分析機を適用することが可能となる。

【００１９】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬において、リポリームの安定化の目的、及び試薬
の感度や特異性を高める目的で、リポソームの膜構成成
分に既知の脂溶性物質および両親媒性物質を混合するこ
ともできる。

【００２０】本発明の抗原性を有するリン脂質をリポソ
ームの膜構成成分として組み込む方法は、リポリーム調
製時の脂質混合溶液に、あらかじめ溶解しておいた抗原
性を有するリン脂質の溶液を混合して、例えば、リン脂
質、コレステロール、抗原性を有するリン脂質を主体と
する混合溶液からＶｏｒｔｅｘｉｎｇ法またはガラスビ
ーズを使用する方法が適用できるが、本発明はこれに限
定されるものでなく、そのほかに逆相蒸発法、エタノー
ル注入法等公知の調製法が応用できる。

【００２１】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬におけるリポリーム内水相には、分光光度計や生
化学自動分析機における測定感度を高める目的や、試薬
自体の保存安定性を高めることを目的として、アクリル
アミド等の屈折率の高い物質や電解質、タンパク質、高
分子、糖類等を封入することができる。

【００２２】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬におけるリポソーム懸濁液中には、そのリポソー
ムの保存安定性の向上および反応特異性の向上を目的と
して既知の添加物、例えば糖類、アミノ酸、アルコー
ル、キレート剤、電解質、グロブリン、アルブミン、リ
ポ蛋白等の物質を添加できる。

【００２３】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、通常、緩衝液による懸濁液状態として保存す
ることができ、他の保存状態、例えば凍結乾燥状態での
保存も適用できる。また、凍結乾燥状態で保存する場合
には安定化剤として知られる既知の物質を添加すること
ができる。

【００２４】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、生化学自動分析機に適用させる場合には、通
常、試薬構成を希釈及び前処理を行うための希釈液と、
抗原成分をリポソームの膜構成成分として組み込んだリ
ポソーム懸濁液からなる抗原液とを組み合わせてなる２
試薬系にて用いることが望ましいが、これに限定されず
該リポソーム懸濁液のみの構成で希釈・前処理・反応を
行うことができる１試薬系、又は希釈・前処理・反応を
３つ以上の試薬に分担させた３試薬系以上への応用も可
能である。

【００２５】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬を２試薬系で用いる場合には、リポソーム懸濁液
以外の試薬（即ち、第１試薬等）には試薬の感度および
特異性を向上させることを目的として糖類、高分子ポリ
マー、タンパク質、界面活性剤、電解質、アルコール、
キレート剤等の物質を添加できる。

【００２６】本発明の抗リン脂質抗体の測定方法は、上
記の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬を抗リン脂
質抗体が含まれていると疑われる被検液と接触させて抗
原抗体反応させ、前記抗原抗体反応により生じた凝集量
を透過光の減少として測定することを特徴とする。

【００２７】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬を用いた免疫分析法による被検試料中の抗リン脂
質抗体の定量は、例えば次のようにして行われる。ま
ず、本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬及
び測定対象を含む試料を適当な緩衝液中で混合し、試料
中に含まれる抗リン脂質抗体と抗原抗体反応を引き起こ
させ、それに伴うリポソームの凝集を形成させる。その
凝集量に依存した光の透過光の減少を分光光度計または
生化学自動分析機等により測定し、免疫比濁法により、
即ち、予め作成しておいた検量線より試料中の測定対象
物の量を測定することができる。

【００２８】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬を用いた免疫分析法は、被検物質中の抗体と抗原
抗体反応させて生じた凝集量を、分光光度計、汎用の生
化学自動分析機を用いることで簡便かつ迅速に大量に検
体を測定することができる。

【００２９】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬によって測定される抗リン脂質抗体は梅毒、マラ
リア、エイズ、結核等の感染症または自己免疫疾患の診
断に使用されるものであるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００３０】前記本発明の抗リン脂質測定用免疫凝集反
応試薬は、免疫反応による被検液中の抗リン脂質抗体量
を判定するにあたり、従来法として標準的に使用されて
いるＲＰＲ法により測定した結果との一致性を改善させ
る目的で該試薬中に塩化コリンを含むことを特徴とす
る。塩化コリンは対照試験で用いるＲＰＲ法テスト試薬
中にも含まれているが、本発明の抗リン脂質抗体測定用
免疫凝集反応試薬においても、１００ｍＭ以上５Ｍ以内
含有させ抗原自身の陰性帯電によって生じる凝集反応の
阻害を、陽性荷電を有する電解質である塩化コリンによ
って抑制することで、凝集反応の促進をはかり被検体中
の共存物質の影響により生じる、ＲＰＲ法により測定し
た結果との不一致を改善させる。塩化コリンが１００ｍ
Ｍ未満だと凝集反応の進行が不十分となり、一方５Ｍを
超えると塩化コリンの溶解が不十分となり好ましくな
い。

【００３１】また、同時に本発明の抗リン脂質抗体測定
用免疫凝集反応試薬は、その調製の再現性や試薬の安定
性を確保するためにそのリポソーム膜中に脂溶性の抗酸
化物質（例えばトコフェロール）や金属キレート物質
（例えばＥＤＴＡ）を含むことが望ましい。

【００３２】前記抗酸化物質を含むことが望ましい理由
は、以下の通りである。即ち、本発明の試薬でリポソー
ムの膜構成成分として使用している抗原、特にカルジオ
リピンはその化学的構造式から酸化されやすい。したが
って、脂溶性の抗酸化物質をリポソーム膜中に含ませる
ことは、リポソーム脂質膜中に潜り込み抗原の酸化を抑
制し、その調製の再現性や試薬の安定性を確保しやすく
なるからである。

【００３３】また、前記金属キレート物質を含むことが
望ましい理由は、以下の通りである。即ち、本発明の抗
リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬で使用している抗
原、特にカルジオリピンはその化学的構造式から二価金
属（Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺）とキレート効果により、二価金属
を包摂しリポソーム膜の内部でヘキサゴナール構造を形
成する。本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試
薬中においては、二価金属（Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺）が該試薬
中に存在すればヘキサゴナール構造を形成し、抗原を不
安定化させるので望ましくない。したがって、リポソー
ム膜中に金属キレート物質を含ませることによって、二
価金属（Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺）の影響を除去することが望ま
しい。

【００３４】

【実施例】〔実施例１〕 １）検体希釈液（第１試薬）の調製 リン酸緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ，１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，ｐＨ７．０）に１Ｍ塩化コリンを溶解し検体希釈液
（第１試薬）を得た。

【００３５】２）リポソームの調製 １００ｍｌナシ型フラスコに、ジステアロイルフォスフ
ァチジルコリン（ＤＳＰＣ：１０ｍＭ，４ｍｌ）、コレ
ステロール（Ｃｈｏｌ：１０ｍＭ，４ｍｌ）及びカルジ
オリピン（ＣＬ：１ｍＭ，８ｍｌ）より成る脂質（クロ
ロホルムまたはクロロホルム／メタノールに溶解したも
の）を入れて、リポソーム調製用原液とした。

【００３６】該フラスコ内のリポソーム調製用原液に対
して、溶媒をエバポレーターで留去し、フラスコ内壁に
フィルム状に脂質薄膜を形成させた。この脂質薄膜を１
〜２時間真空乾燥した後、ＮａＣｌを含まないリン酸緩
衝液（１０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．０）と８００μｍの粒
径のガラスビーズ４ｇを添加し、フラスコを１０分間転
倒攪拌した。その後ガラスビーズを濾紙で濾過し、エク
ストゥルーダーを用いてリポソームをサイジングした。
サイジングはポアサイズ０．６μｍ、０．２μｍのポリ
カーボネート膜を各５回ずつ窒素ガスで加圧することに
より行い、粒子径を調節した。得られたリポソーム懸濁
液を１００倍量のリン酸緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で１日間透析操作を行
った。

【００３７】３）抗脂質抗体測定用リポソーム緩衝液
（第２試薬）の調製 前記工程２）で調製した脂質抗原を含むリポソーム懸濁
液をリン酸緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ，１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．０）によってリポソームをリン元素濃度
で３ｍＭに希釈し、抗脂質抗体測定用リポソーム緩衝液
（第２試薬）を得た。

【００３８】４）自動分析機による抗リン脂質抗体の測
定 抗脂質抗体の測定には日立７１７０型自動分析機を用い
て行った。測定パラメーターはサンプル１６μ１、前記
第１試薬２４０μ１、前記第２試薬８０μ１、を用い、
測定波長は主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて、
測光ポイントは１９−３４の２ポイント分析により５分
間の吸光度変化量を求めた。

【００３９】該吸光度変化量測定の被検体としては抗脂
質抗体との反応性をＲＰＲ法試薬（ＲＰＲカードテスト
「化血研」：商品名、三光純薬社（販売元））を用い８
倍希釈した従来のＲＰＲ法についても陽性を示したヒト
陽性被検体であって、且つ本発明の抗リン脂質抗体測定
用免疫凝集反応試薬との反応性が異なる２種類の被検体
（陽性血清１、陽性血清２）を用意し、生理食塩水
（０．９％ＮａＣｌ水溶液）にて２倍、４倍、８倍、１
６倍に希釈したものを用いた。

【００４０】また、該ＲＰＲ法において陰性と判定され
るヒト血清を対照陰性検体（陰性血清：ｎ＝１０の平均
値）（無希釈）として用い、同様の測定を行った。その
結果を下記の表１に示す。

【００４１】〔比較例１〕検体希釈液中の塩化コリンの
濃度を０ｍＭとした以外は前記実施例１と同じ方法で免
疫凝集反応試薬を評価した。その結果を下記の表１に示
す。 〔実施例２〕検体希釈液中の塩化コリンの濃度を２５０
ｍＭとした以外は前記実施例１と同じ方法で免疫凝集反
応試薬を評価した。その結果を下記の表１に示す。 〔実施例３〕検体希釈液中の塩化コリンの濃度を５００
ｍＭとした以外は前記実施例１と同じ方法で免疫凝集反
応試薬を評価した。その結果を下記の表１に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】〔実施例４〕１００ｍｌナシ型フラスコ
に、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰ
Ｃ：１０ｍＭ，４ｍｌ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ：
１０ｍＭ，４ｍｌ）、カルジオリピン（ＣＬ：１ｍＭ，
８ｍｌ）及び±−α−トコフェロール（ｔｏｃｏ：５ｍ
Ｍ，８０μ１）より成る脂質（クロロホルムまたはクロ
ロホルム／メタノールに溶解したもの）を入れ、該脂質
混合物に対してＥＤＴＡを含み、ＮａＣｌを含まないリ
ン酸緩衝液（１０ｍＭＰＢ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．０）によって懸濁してリポソーム調製用原液とし
た。

【００４４】該リポソーム調製用原液を用い、以下の工
程は前記実施例１と同様にして、免疫凝集反応試薬を調
製し、且つ前記実施例１と同様に自動分析機を用いて評
価した。なお、透析液およびリポソーム懸濁液にはＥＤ
ＴＡを含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を用いた。
調製直後および調製後低温条件下に５日間放置した時の
測定値の変化、及び回収率を下記の表２に示す。

【００４５】〔実施例５〕前記実施例１と同様に免疫凝
集反応試薬を調製し、前記実施例４に従って評価した。
その結果を下記の表２に示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】表２によれば、トコフェロール及びＥＤＴ
Ａをリポソーム膜中に存在させたものは低温安定性に優
れていることが分かる。

【００４８】〔実施例６〕前記実施例４と同じ免疫凝集
反応試薬を用いて、ＲＰＲ法試薬（三光純薬社製ＲＰＲ
カードテスト「化血研」：商品名）を用いた従来のＲＰ
Ｒ法との判定の一致性を比較した。従来のＲＰＲ法によ
って陽性と判定されたヒト血清を２５検体、陰性と判定
されたヒト血清を２５検体用いた。前記実施例４の試薬
と従来法を比較し、それぞれの方法により陽性及び陰性
と判定した個数を調べた。陽性の判定が一致した比率を
感度とし、陰性の判定が一致した比率を特異度とし、一
致率を求めその結果を下記の表３に示す。なお、該免疫
凝集反応試薬における陽性判定は陰性血清２５検体の平
均値に２倍の標準偏差値をたした値より大きな吸光度を
示したものを陽性とした。

【００４９】〔比較例２〕前記比較例１と同様に免疫凝
集反応試薬を調製し、前記実施例６と同様に従来のＲＰ
Ｒ法との判定の一致性を比較した。その一致率の結果を
下記の表３に示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】表３によれば、塩化コリンを存在させた免
疫凝集反応試薬は、従来のＲＰＲ法と感度、特異度が近
く、一致率が高い。

【００５２】

【発明の効果】本発明の抗リン脂質抗体測定方法及び抗
リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬によれば、抗原性
を有するリン脂質をリポソームの膜構成成分として直接
組み込んでいるので、リン脂質抗原の固相化が容易であ
り、しかも化学結合の場合に見られるような抗原性の低
下や、物理吸着に見られるようなリポソーム調製におけ
る洗浄時の抗原の遊離等の不都合がない。したがって、
高感度な抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬とする
ことができ、且つ本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝
集反応試薬は、汎用の生化学自動分析装置に使用しても
上記の不都合がなく安定して使用できるので、凝集反応
で生じた凝集量を透過光の減少として測定することがで
き、測定の再現性に優れ、測定が短時間で大量に一括し
た処理が可能である。

【００５３】本発明の抗リン脂質抗体測定方法及び抗リ
ン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬においては、１００
ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で凝集反応させ
ているので、従来の標準的な試験法であるＲＰＲ法との
結果の一致性に優れている。

【００５４】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬においては、陰性に帯電したリン脂質をリポソー
ムの膜構成成分の一部とすることにより、リポソームを
安定な懸濁液とすることができ、安定な抗リン脂質抗体
測定用免疫凝集反応試薬を提供することができる。

【００５５】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬におけるリポソームの粒子平均直径を、１００ｎ
ｍ以上３００ｎｍ以下とすることにより、リポソームを
安定な懸濁液とすることができ、汎用の生化学自動分析
装置に適用した場合、安定して処理が可能となり、測定
の再現性に優れた抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試
薬を提供することができる。

【００５６】本発明の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
応試薬は、リポソームの懸濁液中のリポソーム含量を
０．５ｍＭ以上とすることができるので、汎用の生化学
自動分析装置において被検液との抗原抗体反応により生
じた凝集量を透過光の減少として測定することができ、
短時間で大量に一括した処理が可能となり、しかも、リ
ポソームの懸濁液の濃度（リポソーム含有量）が従来の
凝集量を目視により測定する場合に比べて、低く（リポ
ソーム含有量が少なく）することが可能となり、例え
ば、半分程度でよいので、高価なリポソームの使用量が
少なくてすむ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅田 衛 茨城県結城市北南茂呂1075−２ 日水製薬 株式会社研究本部内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）抗原性を有するリン脂質をリポソ
   ームの膜構成成分として組み込んだリポソーム懸濁液
   を、１００ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で、
   抗リン脂質抗体が含まれていると疑われる被検液と接触
   させて抗原抗体反応させ、 （２）前記抗原抗体反応により生じた凝集量を透過光の
   減少として測定することを特徴とする抗リン脂質抗体の
   測定方法。
2. 【請求項２】 前記リポソームの懸濁液におけるリポソ
   ーム含有量は０．５ｍＭ以上である請求項１記載の抗リ
   ン脂質抗体の測定方法。
3. 【請求項３】 前記リポソームの平均粒子直径が１００
   ｎｍ以上３００ｎｍ以下である請求項１または２記載の
   抗リン脂質抗体の測定方法。
4. 【請求項４】 前記リポソームの膜構成成分において、
   リン脂質１００モルに対して、抗原性を有するリン脂質
   が５モル以上含有される請求項１、２又は３記載の抗リ
   ン脂質抗体の測定方法。
5. 【請求項５】 前記抗原性を有するリン脂質とは、カル
   ジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチ
   ジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシ
   トール、ホスファチジルグリセロホスフェートから選択
   される１種又は２種以上の陰性に帯電したリン脂質であ
   る請求項１、２、３又は４記載の抗リン脂質抗体の測定
   方法。
6. 【請求項６】 前記リポソームは、リポソーム調製時よ
   りも高い浸透圧の水溶液でリポソームの外水相が置換さ
   れて、浸透圧負荷されたリポソームである請求項１、
   ２、３、４又は５記載の抗リン脂質抗体の測定方法。
7. 【請求項７】 抗原性を有するリン脂質をリポソームの
   膜構成成分として組み込んだリポソームが、１００ｍＭ
   以上５Ｍ以内の塩化コリンの存在下で使用される形態で
   あることを特徴とする抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反
   応試薬。
8. 【請求項８】 ２以上の別体となった試薬であることを
   特徴とする請求項７記載の抗リン脂質抗体測定用免疫凝
   集反応試薬。
9. 【請求項９】 １００ｍＭ以上５Ｍ以内の塩化コリンを
   含有する検体希釈液からなる第１試薬と、 抗原性を有するリン脂質をリポソームの膜構成成分とし
   て組み込んだリポソーム懸濁液からなる第２試薬を、構
   成要素として含む抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試
   薬。
10. 【請求項１０】 前記リポソームの懸濁液におけるリポ
    ソーム含有量は０．５ｍＭ以上である請求項７、８又は
    ９記載の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬。
11. 【請求項１１】 前記リポソームの平均粒子直径が１０
    ０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である請求項７、８、９又は
    １０記載の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬。
12. 【請求項１２】 前記リポソームの膜構成成分におい
    て、リン脂質１００モルに対して、抗原性を有するリン
    脂質が５モル以上含有される請求項７、８、9、１０又
    は１１記載の抗リン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬。
13. 【請求項１３】 前記抗原性を有するリン脂質とは、カ
    ルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファ
    チジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノ
    シトール、ホスファチジルグリセロホスフェートから選
    択される１種又は２種以上の陰性に帯電したリン脂質で
    ある請求項７、８、９、１０、１１又は１２記載の抗リ
    ン脂質抗体測定用免疫凝集反応試薬。
14. 【請求項１４】 前記リポソームは、リポソーム調製時
    よりも高い浸透圧の水溶液でリポソームの外水相が置換
    されて、浸透圧負荷されたリポソームである請求項７、
    ８、９、１０、１１、１２又は１３記載の抗リン脂質抗
    体測定用免疫凝集反応試薬。