JPH0560758A - 補体結合反応の測定にリポソームを用いる免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】被検試料中の被検物質に、補体および該被検物
質に対する免疫物質を作用させて免疫反応を行い、消費
した補体の量を測定することにより被検物質を定量する
免疫測定方法において、免疫反応後の反応液に親水性の
螢光色素を封入したリポソーム試薬を加えて補体を定量
することを特徴とする免疫測定方法。 【効果】微量の被験物質を迅速、簡単且つ感度良く定量
することができるようになった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポソームを用いる免
疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及びその課題】血液中のウイルスまたは細
菌を定量する方法として、臨床検査では補体結合反応が
重要な定量方法として利用されている。この補体結合反
応とは、測定対象である抗原または抗体に対し、対応す
る抗体または抗原を反応させることにより得られる抗原
抗体複合物が、その量に応じて補体を消費する現象を利
用したものであり、あらゆる抗原または抗体の測定に広
く利用することができる。

【０００３】この方法において、補体の量の測定は、従
来感作ヒツジ赤血球を用い、補体による赤血球の溶血反
応を観察することにより行うのが一般的であった。しか
し、この方法では、補体による赤血球の溶血反応を肉眼
で確認する必要があり、測定時間が長くかかるため多量
の試料を処理するのは困難であった。また、実験者によ
り測定値がばらつき、精度に欠けるという欠点があっ
た。

【０００４】また、補体を定量するためのリポソーム試
薬も知られている（特開平１−１５５２７１号公報参
照）。しかし、上記リポソーム試薬を用いて少量の被検
物質を測定する方法は、未だ明らかではなかった。

【０００５】さらに、抗原または抗体を組み込んだリポ
ソームを用いて被検物質を直接に測定する方法もあるが
（特開平２−１６２２６０号公報参照）、この方法では
被検物質ごとに異なる抗体（または抗原）を組み込んだ
リポソームを用意する必要があり、測定の準備が煩雑で
あった。

【０００６】本発明の目的は、少量の被検物質を迅速か
つ簡単正確に測定する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するため鋭意検討を重ねた結果、親水性の螢光色素
を封入したリポソーム試薬を用いることにより、上記目
的を達成できることを見出し本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、被検試料中の被検物
質に、補体および該被検物質に対する免疫物質を作用さ
せて免疫反応を行い、消費した補体の量を測定すること
により被検物質を定量する免疫測定方法において、免疫
反応後の反応液に親水性の螢光色素を封入したリポソー
ム試薬を加えて補体を定量することを特徴とする免疫測
定方法を提供するものである。

【０００９】本発明で被検試料とは、例えばヒト血清、
マウス血清、ウサギ血清、ウシ血清などを意味する。

【００１０】本発明により測定される被検物質は、免疫
反応を起こす物質であり、抗原、抗体、ハプテンなどが
広く使用でき、好ましい抗原としては、サイトメガロウ
イルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、日
本脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ヘルペスウイル
ス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、コ
クサッキーウイルス、ＲＳウイルス、レオウイルス、ロ
タウイルスなどのウイルス類、梅毒、マイコプラズマな
どの細菌類、ツツガムシ、クラミジア等が挙げられる。
好ましいハプテンとしては、ジニトロフェニル基（ＤＮ
Ｐ）またはトリニトロフェニル基（ＴＮＰ）を有する物
質、フルオレセイン、核酸類、低分子量のペプチド類、
ホルモン類などが挙げられる。好ましい抗体としては、
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれ
も用いることができるが、感度の点からはモノクローナ
ル抗体が好ましい。

【００１１】本発明で用いられる補体の供給源として
は、モルモット血清、ウサギ血清、ラット血清、ヒト血
清などの血清が挙げられるが、好ましくはモルモット血
清が良い。被検試料に添加する補体の量としては、被検
試料１ｍｌに対し、３０〜５０μｌ程度である。

【００１２】本発明で用いられる免疫物質とは、被検物
質と複合体を形成する物質であり、被検物質が抗原また
はハプテンのときはその抗原に作用する抗体、被検物質
が抗体のときはその抗体が作用する抗原またはハプテン
を意味する。

【００１３】本発明で使用する親水性の螢光物質とは、
カルボキシフルオレセイン、カルセイン、ルシファーイ
エローなどが挙げられるが、好ましくは、カルボキシフ
ルオレセインが良い。この螢光物質のリポソーム内にお
ける濃度は、螢光物質の種類によっても異なるが、通常
２００ｍＭ程度である。

【００１４】本発明で使用されるリポソーム試薬は、リ
ポソームの膜上に抗体に感作されたハプテンを組み込ん
だもので、微量の補体を高感度で測定し得る。

【００１５】リポソーム膜としては、補体感受性が高い
ため一枚膜のものが好ましい。一枚膜のリポソームの調
製は、例えばスゾカ エフ．（Ｓｚｏｋａ Ｆ．）らの
方法に準じて行うことができる［バイオキミカ エ バ
イオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ），６０１，５５９
（１９８０）参照］。

【００１６】リポソーム膜を構成する脂質としては、公
知のリン脂質、糖脂質を１種または２種以上組み合わせ
たものを広く利用できる。具体的には、リン脂質として
は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジラウリロ
イルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチ
ジルコリンなどのホスファチジルコリン類、ジミリスト
イルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル
ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル
エタノールアミン類、ジステアロイルスフィンゴミエリ
ンなどのスフィンゴミエリン類が挙げられる。また、糖
脂質としては、トリヘキソシルセラミドなどのセラミド
類、グロボシドなどのスフィンゴ糖脂質、ガングリオシ
ドＧＭ₁ などのガングリオシド類が挙げられる。

【００１７】本発明のリポソーム膜には、膜を安定化さ
せるためにコレステロールを添加するのが好ましい。コ
レステロールの添加量は、上記脂質１モルに対し０．５
〜１モル程度である。

【００１８】リポソーム膜に組み込むハプテンとして
は、抗体との結合性を有し、リポソームの安定性を阻害
しないものであれば良く、例えばジニトロフェニル基
（ＤＮＰ）またはトリニトロフェニル基（ＴＮＰ）を有
する物質、フルオレセイン、核酸類、低分子量のペプチ
ド類、ホルモン類などが挙げられるが、好ましくはＤＮ
Ｐ、ＴＮＰが良い。ハプテンとコレステロールを含む脂
質との混合割合は、ハプテン１モルに対し脂質４０〜４
００モルである。

【００１９】本発明で使用するリポソーム試薬は、例え
ば、以下のようにして調製できる。即ち、脂質、ハプテ
ンおよびコレステロールの上記の割合での混合物を、エ
ーテル、イソプロピルエーテル、トリフルオロトリクロ
ロエタン、などの有機溶媒に溶解する。次いで、この溶
液に上記の濃度の親水性螢光色素の水溶液を加え、均一
なＷ／Ｏ型エマルジョンが形成されるまで超音波処理し
た後、有機溶媒を残渣がゲル状になるまで留去する。こ
のゲル状の残渣をボルテックスミキサーなどで振動し
て、目的とするリポソーム試薬を得ることができる。均
一なＷ／Ｏ型エマルジョンを得るためには、例えば脂質
１ミリモルに対し、エーテル２５ｍｌ程度および螢光色
素水溶液８ｍｌ程度を混合するのが良い。

【００２０】リポソームに封入されない螢光色素の除去
は遠心分離、ゲル濾過などの公知の方法により行うこと
ができる。螢光色素の除去が十分であることは、リポソ
ーム試薬の螢光を測定することにより容易に確認でき
る。

【００２１】上記方法により得られたリポソーム試薬
は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ゼラチンベロナ−ル緩衝
液（ＧＶＢ）などに懸濁させて保存する。使用可能な状
態での保存期間は、通常６か月以上である。

【００２２】ハプテンを感作する抗体は、ウサギなどに
該ハプテンを注射することにより免疫し、その抗血清を
用いることもできるが、感度および特異性の点からはモ
ノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

【００２３】上記リポソーム試薬は、ハプテンを感作す
る抗体および補体の存在下で破壊され、内部に封入され
た水溶性螢光物質を放出する。本発明は、この放出され
た螢光物質の螢光強度を測定して残存する補体を定量
し、それにより被験物質を間接的に定量するものであ
る。

【００２４】本発明の方法は、例えば９６穴マイクロプ
レート、試験管（５ｍｌ程度の容量のものが良い）など
を用いて行うことができる。マイクロプレートを用いた
場合には、マイクロプレートリーダーを用いて遠心分離
等の操作を行うことなく自動的に親水性螢光物質の定量
を行うことができる。

【００２５】本発明の被験物質は、通常ｎｇオーダーの
微量物質であるので感度が高く、血清中に存在せず、何
ら操作を加えることなしに測定できる螢光色素により定
量することが必要である。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、微量の被験物質を迅
速、簡単且つ感度良く定量することができる。また、螢
光色素の定量は血清中などにおいても高感度測定ができ
るので、ウイルス、細菌およびその抗体などの血液試料
中の免疫性の物質を定量するのに適している。

【００２７】

【実施例】以下、実施例および比較例を挙げ、本発明を
より一層明瞭なものとするが、本発明はこれら実施例に
より限定されるものではない。

【００２８】

【実施例１】 ＊リポソーム試薬の調製 クロロホルム−メタノール（２：１）に溶解した、０．
１Ｍ ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰ
Ｃ）１５０μｌ、 ０．１Ｍコレステロール１５０μ
ｌ、 １ｍＭ トリニトロフェニルアミノカプロイルジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＴＮＰ
−Ｃａｐ−ＤＰＰＥ）７５μｌおよび１０ｍＭジセチル
ホスフェート３０μｌをナシ型フラスコ中で混合した。
ロータリーエバポレーターで有機溶媒を留去し、ジエチ
ルエーテル−クロロホルム（３：１）１．５ｍｌに再び
溶解した。さらに、０．２Ｍカルボキシフルオレセイン
５００μｌを加え、バス型ソニケーターで均一なエマル
ジョンが形成するまで約２分間超音波処理した。次に、
フラスコをアスピレーターで減圧にしながら有機溶媒を
留去した。フラスコ内の脂質がゲル状になったところで
ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）に懸濁させ１００
００ｇ、２０分間での遠心操作によってリポソームを洗
浄した。得られたリポソームを約２００ｍｌのＧＶＢに
浮遊させ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤ
ＴＡ）を含んだＧＶＢで約４０倍に希釈したウサギ抗Ｔ
ＮＰ抗血清２００ｍｌを加え３７℃で１０分間インキュ
ベーションした後、遠心操作によってリポソームを洗浄
して抗体感作ＴＮＰ−Ｃａｐ−ｌｉｐｏｓｏｍｅを作製
した。

【００２９】

【実施例２】 （１）ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）および抗ウシ血清
ア ルブミン抗体の測定 ９６穴マイクロプレートの各ウェルに以下の抗原、抗体
および補体を各々加えた。

【００３０】抗原：各々以下の１１種の濃度（２５、
１２．５、 ６．３、 ３．０、 １．６、 ０．８、
０．４、 ０．２、 ０．１、 ０．０５、 ０．０
２５）（μｇ／ｍｌ）のＢＳＡを２５μｌずつ各ウェル
に加えた。

【００３１】抗体：各々以下の６種の希釈倍数（１６
０、３２０、６４０、１２８０、２５６０、５１２０）
の抗ＢＳＡ抗体を２５μｌずつ各ウェルに加えた。

【００３２】補体：６０倍に希釈したモルモット血清を
２５μｌずつ各ウェルに加えた。

【００３３】上記の抗原、抗体および補体の混合物を４
℃で一夜放置し、さらに３７℃で１時間加温した後、実
施例１で得たリポソーム試薬（４μＭ）を２５μｌずつ
各ウェルに加えた。３７℃で１時間加温した後、マイク
ロプレートリーダーで壊れたリポソーム試薬から放出さ
れたカルボキシフルオレセインの螢光強度を測定した。
結果を以下の表１に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】表１中、０〜４の各数値は、以下のような
リポソーム試薬を表わす。

【００３６】０：リポソーム試薬の溶解率が、 ０
％以上且つ１２．５％未満である。

【００３７】１：リポソーム試薬の溶解率が、１２．５
％以上且つ３７．５％未満である。

【００３８】２：リポソーム試薬の溶解率が、３７．５
％以上且つ６２．５％未満である。

【００３９】３：リポソーム試薬の溶解率が、６２．５
％以上且つ７５．０％未満である。

【００４０】４：リポソーム試薬の溶解率が、７５．０
％以上且つ１００％未満である。

【００４１】螢光強度は、弱いほうがＢＳＡによる補体
の消費量が多いことを意味する。

【００４２】

【比較例１】リポソーム試薬の代わりに感作ヒツジ赤血
球を用いた他は実施例２と同一の条件で、残存する補体
の定量を行った。結果を以下の表２に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】表２中、０〜４の各数値は、表１と同じ意
味である。

【００４５】表１および表２の結果から、リポソーム試
薬を用いた本発明の方法は、感作ヒツジ赤血球を用いた
従来の方法の結果と良く一致することが明かとなった。

【００４６】

【実施例３】 ＊ヒト血清中の抗サイトメガロウイルス抗体の測定 ９６穴マイクロプレートの各ウェルにＧＶＢを２５μｌ
ずつ分注し、次に一番端の各ウェルにヒト血清を２５μ
ｌずつ加えて倍々希釈を行った。この希釈液に１０倍希
釈したサイトメガロウイルス抗原を２５μｌずつ分注
し、さらに補体としてモルモット血清（６０倍希釈）を
５０μｌずつ各ウェルに加えた。混合液を４℃で一夜放
置した後、実施例１で得たリポソーム試薬（２μＭ）５
０μｌを各ウェルに加え３７℃で約１時間加温し、マイ
クロプレートリーダーで壊れたリポソーム試薬から放出
されたカルボキシフルオレセインの螢光強度を測定し
た。ヒト血清の検体数は、９０であった。

【００４７】

【比較例２】リポソーム試薬の代わりに感作ヒツジ赤血
球を用いた他は実施例３と同一の条件で、残存する補体
の定量を行った。定量は、実施例３の方法と並行して行
い、検体は、実施例３で用いたものと同一の検体を使用
した。各９０検体について各々リポソーム試薬および感
作ヒツジ赤血球を用いて得た結果を比較し、相関図とし
て以下の表３に示した。

【００４８】

【表３】

【００４９】表３に示した検体は、リポソーム試薬の溶
解率が、６２．５％以上（表１および表２の数値が３以
上）の場合を陽性とし、陽性の検体のみについて示し
た。陽性の検体は、９０検体であった。なお、表３中、
縦軸および横軸の数値は、各々血清試料の希釈倍率を示
す。

【００５０】表３中、リポソーム試薬を用いた本発明の
方法と感作ヒツジ赤血球を用いた従来の方法とは、８
７．８％の検体において一致しており、両方法の結果
は、±１管差内には全ての検体が含まれていた。表３の
相関係数は、０．９８４であった。 表３の結果から、
リポソーム試薬を用いた本発明の方法は、感作ヒツジ赤
血球を用いた従来の方法の結果と良く一致することが明
かとなった。

【００５１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 引地 一昌 東京都八王子市小宮町51 株式会社エスア ールエルラボラトリー内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被検試料中の被検物質に、補体および該被
   検物質に対する免疫物質を作用させて免疫反応を行い、
   消費した補体の量を測定することにより被検物質を定量
   する免疫測定方法において、免疫反応後の反応液に親水
   性の螢光色素を封入したリポソーム試薬を加えて補体を
   定量することを特徴とする免疫測定方法。