JPH076987B2 - 補体活性測定用試薬 - Google Patents
補体活性測定用試薬Info
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- JPH076987B2 JPH076987B2 JP62314909A JP31490987A JPH076987B2 JP H076987 B2 JPH076987 B2 JP H076987B2 JP 62314909 A JP62314909 A JP 62314909A JP 31490987 A JP31490987 A JP 31490987A JP H076987 B2 JPH076987 B2 JP H076987B2
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- JP
- Japan
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- complement
- liposome
- antibody
- activity
- membrane
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- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血清中の補体価又は補体成分の活性を測定す
るための補体活性測定用試薬に関する。
るための補体活性測定用試薬に関する。
従来の技術 近年補体活性の測定は、自己免疫疾患、感染症、炎症、
癌等の診断や治療の経過等を知る上でのパラメーターと
して注目されている。
癌等の診断や治療の経過等を知る上でのパラメーターと
して注目されている。
従来、補体価（CH50値）や補体成分の活性を測定するに
当っては、感作ヒツジ赤血球（EA）の補体による溶血反
応を利用した方法が採用されている。また、補体活性化
の第２経路であるACP（Alternative complement pathwa
y）の測定にはウサギ赤血球を用いた溶血反応が利用さ
れている。しかしながら、これらの赤血球は採血後１ケ
月程度しか保存できず、しかもその品質が不安定である
ため、ロット毎に検定を行わなければならない。
当っては、感作ヒツジ赤血球（EA）の補体による溶血反
応を利用した方法が採用されている。また、補体活性化
の第２経路であるACP（Alternative complement pathwa
y）の測定にはウサギ赤血球を用いた溶血反応が利用さ
れている。しかしながら、これらの赤血球は採血後１ケ
月程度しか保存できず、しかもその品質が不安定である
ため、ロット毎に検定を行わなければならない。
上記ヒツジやウサギの感作赤血球に代わるものとして、
ボルテクスィング（Vortexing）法によって製造され
た、リポソーム膜中にハプテンが組込まれた多重膜リポ
ソームが提案されている（特開昭62−163966号）。該多
重膜リポソームは補体価の測定に利用できるが、以下の
ような欠点があり好ましくない。
ボルテクスィング（Vortexing）法によって製造され
た、リポソーム膜中にハプテンが組込まれた多重膜リポ
ソームが提案されている（特開昭62−163966号）。該多
重膜リポソームは補体価の測定に利用できるが、以下の
ような欠点があり好ましくない。
１）上記多重膜リポソームでは、抗体や補体は最外層の
膜にしか反応しないため、最外層が破壊されて初めてそ
の次の膜に抗体と補体とが反応するという経過を追って
反応が進まざるを得ない。従って、反応には多くの補体
や抗体が必要となる。
膜にしか反応しないため、最外層が破壊されて初めてそ
の次の膜に抗体と補体とが反応するという経過を追って
反応が進まざるを得ない。従って、反応には多くの補体
や抗体が必要となる。
２）上記のような反応経過をたどるため、封入されてい
る標識物質の放出効率が低く、測定の感度も低下する。
特に、ACPや補体成分の活性の測定に十分な感度を得難
い。
る標識物質の放出効率が低く、測定の感度も低下する。
特に、ACPや補体成分の活性の測定に十分な感度を得難
い。
３）上記多重膜リポソームを用いて補体価の測定を行う
時に、ハプテンに対する抗体を反応溶液中に加えるとい
う操作が必要であり、これが活性測定を煩雑化してい
る。予め抗体を感作させても、最外層の膜上のハプテン
としか反応しないため、やはり上記の操作が必要とな
る。
時に、ハプテンに対する抗体を反応溶液中に加えるとい
う操作が必要であり、これが活性測定を煩雑化してい
る。予め抗体を感作させても、最外層の膜上のハプテン
としか反応しないため、やはり上記の操作が必要とな
る。
４）更に、測定結果が加える抗体の力価によって影響を
受けるという問題点もある。
受けるという問題点もある。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記従来技術の問題点を悉く解消した
補体活性測定用試薬を提供することにある。
補体活性測定用試薬を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明の目的は、一枚膜リポソームの膜中に抗体に感作
されたハプテンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性
の標識物質が封入されていることを特徴とする補体活性
測定用試薬により達成される。
されたハプテンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性
の標識物質が封入されていることを特徴とする補体活性
測定用試薬により達成される。
本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。
また、一枚膜であるから予め膜上の全てのハプテンに対
して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を加える
必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果が影響
を受けることもない。
して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を加える
必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果が影響
を受けることもない。
本発明においてリポソーム膜を構成する脂質としては公
知のものを使用でき、例えば、リン脂質、糖脂質等を挙
げることができる。リン脂質としてはその脂肪酸残基の
炭素数が12〜18程度のものを好ましく使用でき、その具
体例としては、例えば、卵黄レシチン（egg PC）、ジラ
ウリロイルホスファチジルコリン（DLPC）、ジミリスト
イルホスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファ
チジルコリン（DSPC）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスファチ
ジルセリン（DMPS）、ジパルミトイルスフィンゴミエリ
ン（DPSM）等を挙げることができる。その中でも飽和脂
肪酸のものを特に好ましく使用できる。糖脂質としても
公知のものが使用でき、例えば、セラミドモノヘキソシ
ド（CMH）、グロボシドエ、ガングリオシドGM1、GM2等
を挙げることができる。
知のものを使用でき、例えば、リン脂質、糖脂質等を挙
げることができる。リン脂質としてはその脂肪酸残基の
炭素数が12〜18程度のものを好ましく使用でき、その具
体例としては、例えば、卵黄レシチン（egg PC）、ジラ
ウリロイルホスファチジルコリン（DLPC）、ジミリスト
イルホスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファ
チジルコリン（DSPC）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスファチ
ジルセリン（DMPS）、ジパルミトイルスフィンゴミエリ
ン（DPSM）等を挙げることができる。その中でも飽和脂
肪酸のものを特に好ましく使用できる。糖脂質としても
公知のものが使用でき、例えば、セラミドモノヘキソシ
ド（CMH）、グロボシドエ、ガングリオシドGM1、GM2等
を挙げることができる。
本発明においては上記例示脂質の１種または２種以上を
使用できる。また、膜の安定化のために、リン脂質及び
／又は糖脂質に対し、モル比１程度の割合でコレステロ
ールを添加するのが好ましい。
使用できる。また、膜の安定化のために、リン脂質及び
／又は糖脂質に対し、モル比１程度の割合でコレステロ
ールを添加するのが好ましい。
リポソーム膜に組込むハプテンとしては、抗原性を有
し、リポソームを構成する脂質と容易に結合し且つリポ
ソームの形成を妨げないものであれば特に制限されず、
公知のものから適宜選択して使用できる。その具体例と
しては、例えば、ジニトロフェニル基（DNP）、トリニ
トロフェニル基（TNP）等の官能基を持つ物質、フルオ
レセイン、核酸類、ホルモン類、ペプチド類、テオフィ
リン等の医薬品の誘導体等を挙げることができる。
し、リポソームを構成する脂質と容易に結合し且つリポ
ソームの形成を妨げないものであれば特に制限されず、
公知のものから適宜選択して使用できる。その具体例と
しては、例えば、ジニトロフェニル基（DNP）、トリニ
トロフェニル基（TNP）等の官能基を持つ物質、フルオ
レセイン、核酸類、ホルモン類、ペプチド類、テオフィ
リン等の医薬品の誘導体等を挙げることができる。
リポソーム内に封入される標識物質としては、親水性で
あり且つリポソームから放出された際に定量可能なもの
であれば特に制限されず、公知のものから適宜選択して
使用できる。その具体例としては、カルボキシフルオレ
セイン、カルセイン等の蛍光物質、グルコース等の糖
類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等の酸化酵素、
NAD、NADP等の補酵素、ラジカル化合物、ルミノール等
の酸化反応により発光する発光性物質、水溶性色素等を
挙げることができる。
あり且つリポソームから放出された際に定量可能なもの
であれば特に制限されず、公知のものから適宜選択して
使用できる。その具体例としては、カルボキシフルオレ
セイン、カルセイン等の蛍光物質、グルコース等の糖
類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等の酸化酵素、
NAD、NADP等の補酵素、ラジカル化合物、ルミノール等
の酸化反応により発光する発光性物質、水溶性色素等を
挙げることができる。
更に本発明においては、リポソーム膜の構成成分とし
て、リポソームの凝集を防止したり、標識物質の内包率
を高めるために、ジセチルホスフェート、ステアリルア
ミン等の荷電物質を、脂質の酸化を防止するために、α
−トコフェノール等を使用してもよい。
て、リポソームの凝集を防止したり、標識物質の内包率
を高めるために、ジセチルホスフェート、ステアリルア
ミン等の荷電物質を、脂質の酸化を防止するために、α
−トコフェノール等を使用してもよい。
リポソーム自体の粒径は広い範囲から選択できるが、感
度の点から大きい程望ましく、通常約0.1μｍ以上とす
るのが好ましい。より好ましくは約0.1〜１μｍ程度の
粒径とするのがよく、それにより、感度が良好で且つ遠
心分離等の操作を行なう時の取扱いも容易な一枚膜リポ
ソームとなる。
度の点から大きい程望ましく、通常約0.1μｍ以上とす
るのが好ましい。より好ましくは約0.1〜１μｍ程度の
粒径とするのがよく、それにより、感度が良好で且つ遠
心分離等の操作を行なう時の取扱いも容易な一枚膜リポ
ソームとなる。
本発明の一枚膜リポソームは、公知の方法例えば、スゾ
カ エフ．（Szoka F.）らの方法〔バイオキミカ エ
バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica A
cta）601,559（1980）〕に従い、例えば以下のようにし
て調製できる。
カ エフ．（Szoka F.）らの方法〔バイオキミカ エ
バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica A
cta）601,559（1980）〕に従い、例えば以下のようにし
て調製できる。
まず、ハプテンと脂質とを溶媒中にて反応させ、ハプテ
ン化脂質を製造する。この際ハプテンと脂質との使用割
合は特に制限されず適宜選択すればよいが、通常後者１
モルに対し１〜10倍モル量程度とすればよい。また溶媒
としては、例えば、クロロホルム等のハロゲン化炭化水
素類、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコー
ル類等を挙げることができる。
ン化脂質を製造する。この際ハプテンと脂質との使用割
合は特に制限されず適宜選択すればよいが、通常後者１
モルに対し１〜10倍モル量程度とすればよい。また溶媒
としては、例えば、クロロホルム等のハロゲン化炭化水
素類、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコー
ル類等を挙げることができる。
上記で得られるハプテン化脂質、並びに、必要に応じて
他の脂質、コレステロール等をフラスコ内で適当な有機
溶媒に溶解する。この際、脂質が溶けにくい場合がある
が、クロロホルムを少量添加することにより溶解でき
る。次に、この溶液に標識物質の水溶液を加え、超音波
処理し、均一なW/Oエマルジョンが形成されたら有機溶
媒をロータリーエバポレーター等で留去し、ゲル状にす
る。これに振動を加えることにより、本発明リポソーム
を得ることができる。この方法によれば、通常直径約0.
1〜１μｍの１枚膜リポソームを得ることができる。
他の脂質、コレステロール等をフラスコ内で適当な有機
溶媒に溶解する。この際、脂質が溶けにくい場合がある
が、クロロホルムを少量添加することにより溶解でき
る。次に、この溶液に標識物質の水溶液を加え、超音波
処理し、均一なW/Oエマルジョンが形成されたら有機溶
媒をロータリーエバポレーター等で留去し、ゲル状にす
る。これに振動を加えることにより、本発明リポソーム
を得ることができる。この方法によれば、通常直径約0.
1〜１μｍの１枚膜リポソームを得ることができる。
上記において使用される脂質、有機溶媒及び標識物質の
水溶性の割合は特に制限されず適宜選択すればよいが、
通常脂質１ミリモルに対し、有機溶媒50ml程度及び標識
物質の水溶液15ml程度を使用すればよい。標識物質の水
溶液の濃度は特に制限されず、用いる標識物質に応じて
適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば、ジエ
チルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、
ハロタン、トリフルオロトリクロロエタン等のハロゲン
化炭化水素類等を挙げることができる。また、有機溶媒
を留去して得られるゲル状物に振動を与えるには、例え
ば、ボルテックスミキサー等の公知の装置が使用でき
る。
水溶性の割合は特に制限されず適宜選択すればよいが、
通常脂質１ミリモルに対し、有機溶媒50ml程度及び標識
物質の水溶液15ml程度を使用すればよい。標識物質の水
溶液の濃度は特に制限されず、用いる標識物質に応じて
適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば、ジエ
チルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、
ハロタン、トリフルオロトリクロロエタン等のハロゲン
化炭化水素類等を挙げることができる。また、有機溶媒
を留去して得られるゲル状物に振動を与えるには、例え
ば、ボルテックスミキサー等の公知の装置が使用でき
る。
リポソームに内封されなかった標識物質は、透析、ゲル
過、遠心分離等の公知の方法で容易に除去することが
できる。
過、遠心分離等の公知の方法で容易に除去することが
できる。
かくして得られる一枚膜リポソームは、適当な溶媒に懸
濁させることにより保存される。適当な溶媒としては、
例えばゼラチンベロナール緩衝液（GVB）、リン酸緩衝
液（PBS）等を挙げることができる。
濁させることにより保存される。適当な溶媒としては、
例えばゼラチンベロナール緩衝液（GVB）、リン酸緩衝
液（PBS）等を挙げることができる。
本発明の一枚膜リポソームに抗体を感作するに当っては
公知の方法が採用できる。抗体としては、使用したハプ
テンをウサギ等に免疫して得られる抗血清を用いればよ
いが、モノクロナール抗体を用いればより好ましい。
公知の方法が採用できる。抗体としては、使用したハプ
テンをウサギ等に免疫して得られる抗血清を用いればよ
いが、モノクロナール抗体を用いればより好ましい。
本発明のリポソームに抗体を感作させると、リポソーム
膜上のハプテンと抗体とが反応し、その膜上に抗原抗体
複合物が形成される。この抗原抗体複合物に補体を反応
させると膜損傷反応が起り、リポソーム内に封入された
標識物質が放出される。放出された標識物質を公知の方
法に従って定量することにより、補体活性が測定され
る。
膜上のハプテンと抗体とが反応し、その膜上に抗原抗体
複合物が形成される。この抗原抗体複合物に補体を反応
させると膜損傷反応が起り、リポソーム内に封入された
標識物質が放出される。放出された標識物質を公知の方
法に従って定量することにより、補体活性が測定され
る。
発明の効果 本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。しかも、一枚膜であるため、
予め膜上の全てのハプテンに対して抗体を感作できるの
で、活性測定中に抗体を加える必要がなく、従って抗体
の力価によって測定結果が影響を受けることもない。更
に、脂質組成を一定にすればリポソームを再現性良く得
ることができ、ロット差を少なくすることができるとい
う利点もある。
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。しかも、一枚膜であるため、
予め膜上の全てのハプテンに対して抗体を感作できるの
で、活性測定中に抗体を加える必要がなく、従って抗体
の力価によって測定結果が影響を受けることもない。更
に、脂質組成を一定にすればリポソームを再現性良く得
ることができ、ロット差を少なくすることができるとい
う利点もある。
実施例 以下に実施例及び比較例を挙げ、本発明をより一層明瞭
なものとする。
なものとする。
実施例１ クロロホルムに溶解した5mM DMPC（ジミリストイルホス
ファチジルコリン）3.0ml、10mMコレステロール1.5ml、
0.1mM TNP−Cap−DPPE（トリニトロフェニルアミノカプ
ロイルジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン）750μｌ、0.1mM DCP（ジセチルホスフェート）3.0m
lをナシ型フラスコ中で混合した。ロータリーエバポレ
ーターでクロロホルムを留去し、ジエチルエーテル−ク
ロロホルム（3:1）1.5mlに再び溶解した。さらに、0.2M
カルボキシフルオレセイン（CF）500μｌを加え、バス
型ソニケーターで均一なW/Oエマルジョンが形成するま
で約２分間超音波処理した。次に、ロータリーエバポレ
ーターで有機溶媒を留去してゲル化させた後ボルテック
スミキサーで振動を与え、これをGVB-（ゼラチンベロナ
ール緩衝液；稲井眞弥他、補体学、医歯薬出版 1982）
に懸濁させ、1800×ｇ、30分の遠心操作によってリポソ
ームを洗浄した。さらに、GVB-に懸濁したリポソーム
（約0.2mM DMPC）に10mM EDTA−GVB（10mM エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウムを含有したGVB-）で90倍に希
釈した抗ウサギ抗血清を等量加え、37℃、10分インキュ
ベーションした後、1800×ｇ、30分の遠心操作によって
リポソームをGVB-で洗浄して抗体感作一枚膜リポソーム
（LA;Lipospme-Antibody）を作製した。該リポソームの
直径は0.1〜１μｍであった。
ファチジルコリン）3.0ml、10mMコレステロール1.5ml、
0.1mM TNP−Cap−DPPE（トリニトロフェニルアミノカプ
ロイルジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン）750μｌ、0.1mM DCP（ジセチルホスフェート）3.0m
lをナシ型フラスコ中で混合した。ロータリーエバポレ
ーターでクロロホルムを留去し、ジエチルエーテル−ク
ロロホルム（3:1）1.5mlに再び溶解した。さらに、0.2M
カルボキシフルオレセイン（CF）500μｌを加え、バス
型ソニケーターで均一なW/Oエマルジョンが形成するま
で約２分間超音波処理した。次に、ロータリーエバポレ
ーターで有機溶媒を留去してゲル化させた後ボルテック
スミキサーで振動を与え、これをGVB-（ゼラチンベロナ
ール緩衝液；稲井眞弥他、補体学、医歯薬出版 1982）
に懸濁させ、1800×ｇ、30分の遠心操作によってリポソ
ームを洗浄した。さらに、GVB-に懸濁したリポソーム
（約0.2mM DMPC）に10mM EDTA−GVB（10mM エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウムを含有したGVB-）で90倍に希
釈した抗ウサギ抗血清を等量加え、37℃、10分インキュ
ベーションした後、1800×ｇ、30分の遠心操作によって
リポソームをGVB-で洗浄して抗体感作一枚膜リポソーム
（LA;Lipospme-Antibody）を作製した。該リポソームの
直径は0.1〜１μｍであった。
比較例１ 実施例１と同様の脂質、溶媒及び標識物質を用い、特開
昭62−163966号公報に記載の方法に従い、抗体感作多重
膜リポソームを作製した。
昭62−163966号公報に記載の方法に従い、抗体感作多重
膜リポソームを作製した。
実験例１ 上記実施例１及び比較例１で得られた各リポソームを用
い、以下の補体活性を測定した。
い、以下の補体活性を測定した。
ヒト血清全補体活性の測定 Ｕ型マイクロプレート（96穴;Greiner社製）にGVB
++（0.1mM MgCl2,0.03mM CaCl2を含有したGVB-）で希釈
したヒト新鮮血清50μｌとLA（約0.2mM DMPC）５μｌを
加え、37℃、１時間インキュベーションした。反応後、
10mM EDTA−GVB50μｌを加えて反応を止め、マイクロプ
レート蛍光分光光度計MTP−Ｆ（コロナ社製）で蛍光強
度を測定した（Ex:490nm,Em:520nm）。なお、測定値は
蒸留水50μｌをヒト新鮮血清の代わりに加えたときの蛍
光強度を100％とした相対蛍光強度であらわした。コン
トロールにはGVB++をヒト新鮮血清の代わりに用いた。
図１はこのようにして求めた血清希釈倍数と全補体活性
による蛍光強度の関係をあらわしたグラフである。
++（0.1mM MgCl2,0.03mM CaCl2を含有したGVB-）で希釈
したヒト新鮮血清50μｌとLA（約0.2mM DMPC）５μｌを
加え、37℃、１時間インキュベーションした。反応後、
10mM EDTA−GVB50μｌを加えて反応を止め、マイクロプ
レート蛍光分光光度計MTP−Ｆ（コロナ社製）で蛍光強
度を測定した（Ex:490nm,Em:520nm）。なお、測定値は
蒸留水50μｌをヒト新鮮血清の代わりに加えたときの蛍
光強度を100％とした相対蛍光強度であらわした。コン
トロールにはGVB++をヒト新鮮血清の代わりに用いた。
図１はこのようにして求めた血清希釈倍数と全補体活性
による蛍光強度の関係をあらわしたグラフである。
ヒト血清ACPの測定 Ｕ型マイクロプレート（96穴;Greiner社製）に5mM Mg−
EGTA−GVB（5mM MgCl2,5mM エチレングリコール四酢酸
二ナトリウムを含有したGVB-）で希釈したヒト新鮮血清
50μｌとLA（約0.2mM DMPC）５μｌを加え、37℃で１時
間インキュベーションした。反応後、10mM EDTA−GVB50
μｌを加えて反応を止め、マイクロプレート蛍光分光光
度計MTP−Ｆ（コロナ社製）で蛍光強度を測定した（Ex:
490nm,Em:520nm）。なお、測定値は蒸留水50μｌをヒト
新鮮血清の代わりに加えたときの蛍光強度を100％とし
た相対蛍光強度であらわした。コントロールには5mM Mg
−EGTA−GVBをヒト新鮮血清の代わりに用いた。図２は
このようにして求めた血清希釈倍数とACP活性による蛍
光強度の関係をあらわしたグラフである。
EGTA−GVB（5mM MgCl2,5mM エチレングリコール四酢酸
二ナトリウムを含有したGVB-）で希釈したヒト新鮮血清
50μｌとLA（約0.2mM DMPC）５μｌを加え、37℃で１時
間インキュベーションした。反応後、10mM EDTA−GVB50
μｌを加えて反応を止め、マイクロプレート蛍光分光光
度計MTP−Ｆ（コロナ社製）で蛍光強度を測定した（Ex:
490nm,Em:520nm）。なお、測定値は蒸留水50μｌをヒト
新鮮血清の代わりに加えたときの蛍光強度を100％とし
た相対蛍光強度であらわした。コントロールには5mM Mg
−EGTA−GVBをヒト新鮮血清の代わりに用いた。図２は
このようにして求めた血清希釈倍数とACP活性による蛍
光強度の関係をあらわしたグラフである。
図１及び図２から、本発明リポソームが従来のリポソー
ムに比べて顕著に優れた補体活性測定感度を有している
ことが判る。即ち、本発明リポソームを用いた場合に
は、従来の場合に比べ補体活性測定感度（相対蛍光強
度）が少なくとも約２倍以上高くなり、反応感度が鋭敏
になっているため、測定に用いる試料が少なくてすみ、
且つ補体活性のわずかな差を測定することができる。
ムに比べて顕著に優れた補体活性測定感度を有している
ことが判る。即ち、本発明リポソームを用いた場合に
は、従来の場合に比べ補体活性測定感度（相対蛍光強
度）が少なくとも約２倍以上高くなり、反応感度が鋭敏
になっているため、測定に用いる試料が少なくてすみ、
且つ補体活性のわずかな差を測定することができる。
実験例２ 実施例１で得られた本発明リポソームを用い、補体成分
の活性測定を行なった。
の活性測定を行なった。
補体反応中間体LAC1,4の作製 15mlの試験管に０℃に冷やしたLA（約0.2mM DMPCを含む
Ca++GGVB（0.3mM CaCl2、2.5％グルコースを含有したGV
B-））2mlとヒト新鮮血清10μｌを加え、０℃、５分反
応させた後、０℃に冷やしたCa++GGVB10mlを加え、1800
×ｇ、30分の遠心操作によって洗浄し、本発明の抗体感
作一枚膜リポソームにヒト補体第１成分（C1）及びヒト
補体第４成分（C4）が結合した、LAC1,4を得た。
Ca++GGVB（0.3mM CaCl2、2.5％グルコースを含有したGV
B-））2mlとヒト新鮮血清10μｌを加え、０℃、５分反
応させた後、０℃に冷やしたCa++GGVB10mlを加え、1800
×ｇ、30分の遠心操作によって洗浄し、本発明の抗体感
作一枚膜リポソームにヒト補体第１成分（C1）及びヒト
補体第４成分（C4）が結合した、LAC1,4を得た。
補体第２成分（C2）活性の測定 3.5mlの試験管にLAC1,4 50μｌとGGVB++で希釈したモル
モット補体第２成分（C2、2.0×109有効分子/ml）100μ
ｌを加え、30℃、５分インキュベーションした後、10mM
EDTA−GVB100μｌを加えた。１分後、10mM EDTA−GVB
で20倍希釈したモルモット血清（Ｃ−EDTA）100μｌを
加え37℃、60分インキュベーションした。更に、10mM E
DTA−GVB2.5mlを加えた後、日立蛍光分光光度計TYPE650
−10（日立社製）で蛍光強度を測定した。表１はこのよ
うにして求めたC2活性の測定結果である。
モット補体第２成分（C2、2.0×109有効分子/ml）100μ
ｌを加え、30℃、５分インキュベーションした後、10mM
EDTA−GVB100μｌを加えた。１分後、10mM EDTA−GVB
で20倍希釈したモルモット血清（Ｃ−EDTA）100μｌを
加え37℃、60分インキュベーションした。更に、10mM E
DTA−GVB2.5mlを加えた後、日立蛍光分光光度計TYPE650
−10（日立社製）で蛍光強度を測定した。表１はこのよ
うにして求めたC2活性の測定結果である。
比較のため、C2及びＣ−EDTAの両方或はいずれか一方を
添加しない場合についても蛍光強度を測定した。結果を
表１に併記する。
添加しない場合についても蛍光強度を測定した。結果を
表１に併記する。
表１から、LAC1,4に、C2とＣ−EDTAの両方を添加した場
合にのみ補体反応が進行すること、Ｃ−EDTAのC2活性が
欠けていること及び上記反応系がC2活性に依存してお
り、従って上記反応によってC2活性を測定できることが
判る。
合にのみ補体反応が進行すること、Ｃ−EDTAのC2活性が
欠けていること及び上記反応系がC2活性に依存してお
り、従って上記反応によってC2活性を測定できることが
判る。
補体第３成分（C3）の活性測定 3.5mlの試験管にLAC1,4 50μｌとGGVB++で希釈したモル
モット補体第２成分（C2 2.0×109有効分子/ml）100μ
ｌを加え30℃、５分インキュベーションした後、10mM E
DTA−GVB100μｌを加えた。１分後、10mM EDTA−GVBで4
0倍希釈したヒト新鮮血清（HuS）、10mM EDTA−GVBで40
倍希釈したヒト補体第３成分（C3）欠損ヒト血清（RC
3）100μｌを加えた。さらに、RC3を加えたものにC3（1
00μg/ml）100μｌを加えた。37℃、60分インキュベー
ションした後、10mM EDTA−GVB 2.5mlを加え、それぞれ
の蛍光強度を測定した。表２はこのようにして求めたC3
活性の測定結果である。
モット補体第２成分（C2 2.0×109有効分子/ml）100μ
ｌを加え30℃、５分インキュベーションした後、10mM E
DTA−GVB100μｌを加えた。１分後、10mM EDTA−GVBで4
0倍希釈したヒト新鮮血清（HuS）、10mM EDTA−GVBで40
倍希釈したヒト補体第３成分（C3）欠損ヒト血清（RC
3）100μｌを加えた。さらに、RC3を加えたものにC3（1
00μg/ml）100μｌを加えた。37℃、60分インキュベー
ションした後、10mM EDTA−GVB 2.5mlを加え、それぞれ
の蛍光強度を測定した。表２はこのようにして求めたC3
活性の測定結果である。
比較のため、RC3、C3及びHuSの１種又は２種を添加しな
い場合（コントロールは３種とも添加しない）について
も蛍光強度を測定した。結果を表２に併記する。
い場合（コントロールは３種とも添加しない）について
も蛍光強度を測定した。結果を表２に併記する。
表２から、LAC1,4,2（LAC1,4にさらにC2が結合したも
の）に、HuS或はRC3とC3とを添加した場合に補体反応が
進行することが判る。従って、上記反応によりC3活性を
測定できる。
の）に、HuS或はRC3とC3とを添加した場合に補体反応が
進行することが判る。従って、上記反応によりC3活性を
測定できる。
図１及び図２は、本発明抗体感作一枚膜リポソームと従
来の抗体感作多重膜リポソームを用いて行なった補体活
性測定の結果を示すグラフである。
来の抗体感作多重膜リポソームを用いて行なった補体活
性測定の結果を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】一枚膜リポソームの膜中に抗体に感作され
たハプテンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性の標
識物質が封入されていることを特徴とする補体活性測定
用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62314909A JPH076987B2 (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 補体活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62314909A JPH076987B2 (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 補体活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01155271A JPH01155271A (ja) | 1989-06-19 |
| JPH076987B2 true JPH076987B2 (ja) | 1995-01-30 |
Family
ID=18059100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62314909A Expired - Lifetime JPH076987B2 (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 補体活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH076987B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0560758A (ja) * | 1991-08-30 | 1993-03-12 | Ishizu Seiyaku Kk | 補体結合反応の測定にリポソームを用いる免疫測定方法 |
| EP0642021B1 (en) * | 1993-09-07 | 2000-11-02 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Process for measuring complement activity and reagent used therefor |
| JP4666284B2 (ja) * | 2005-11-30 | 2011-04-06 | 味の素株式会社 | グルカン感受性予測方法、グルカン感受性増強剤及びそのスクリーニング方法 |
| JP2011047923A (ja) * | 2009-07-27 | 2011-03-10 | Panasonic Corp | リポソーム組成物及びその製造方法並びにそれを用いたアナライトの分析方法 |
-
1987
- 1987-12-11 JP JP62314909A patent/JPH076987B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01155271A (ja) | 1989-06-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |