JPH01155271A - 補体活性測定用試薬 - Google Patents

補体活性測定用試薬

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JPH01155271A
JPH01155271A JP31490987A JP31490987A JPH01155271A JP H01155271 A JPH01155271 A JP H01155271A JP 31490987 A JP31490987 A JP 31490987A JP 31490987 A JP31490987 A JP 31490987A JP H01155271 A JPH01155271 A JP H01155271A
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Takahisa Masaki
正木 貴久
Noriko Okada
則子 岡田
Hidechika Okada
秀親 岡田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血清中の補体価又は補体成分の活性を測定す
るための補体活性測定用試薬に関する。
従来の技術 近年補体活性の測定は、自己免疫疾患、感染症、炎症、
癌等の診断や治療の経過等を知る上でのパラメーターと
して注目されている。
従来、補体価(CF2O値)や補体成分の活性を測定す
るに当っては、感作ヒツジ赤血球(EA)の補体による
溶血反応を利用した方法が採用されている。また、補体
活性化の第2経路であるACP (Alternatl
ve complement pathway)の測定
にはウサギ赤血球を用いた溶血反応が利用されている。
しかしながら、これらの赤血球は採血後1ケ月程度しか
保存できず、しかもその品質が不安定であるため、ロッ
ト毎に検定を行わなければならない。
上記ヒツジやウサギの感作赤血球に代わるものとして、
ポルチクスイング(Vortexing )法によって
製造された、リポソーム膜中にハプテンが組込まれた多
重膜リポソームが提案されている(特開昭62−163
966号)。該多重膜リポソームは補体価の測定に利用
できるが、以下のような欠点があり好ましくない。
1) 上記多重膜リポソームでは、抗体や補体は最外層
の膜にしか反応しないため、最外層が破壊されて初めて
その次の膜に抗体と補体とが反応するという経過を追っ
て反応が進まざるを得ない。従って、反応には多くの補
体や抗体が必要となる。
2) 上記のような反応経過をたどるため、封入されて
いる標識物質の放出効率が低く、測定の感度も低下する
。特に、ACPや補体成分の活性の測定に士、分な感度
を得難い。
3) 上記多重膜リポソームを用いて補体価の測定を行
う時に、ハプテンに対する抗体を反応溶液中に加えると
いう操作が必要であり、これが活性測定を煩雑化してい
る。予め抗体を感作させても、最外層の膜上のハプテン
としか反応しないため、やはり上記の操作が必要となる
4) 更に、測定結果が加える抗体の力価によって影響
を受けるという問題点もある。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、主記従来技術の問題点を悉く解消した
補体活性測定用試薬を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明の目的は、−枚膜リポソームの膜中に抗体に感作
されたハプテンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性
の標識物質が封入されていることを特徴とする補体活性
測定用試薬により達成される。
本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。
また、−枚膜であるから予め膜上の全てのハプテンに対
して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を加える
必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果が影響
を受けることもない。
本発明においてリポソーム膜を構成する脂質としては公
知のものを使用でき、例えば、リン脂質、糖脂質等を挙
げることができる。リン脂質としてはその脂肪酸残基の
炭素数が12〜18程度のものを好ましく使用でき、そ
の具体例としては、例えば、卵黄レシチン(egg p
c) 、シラウリロイルホスファチジルコリン(DLP
C)、シミリストイルホスファチジルコリン(DMPC
) 、ジパルミトイルホスファチジルコリン(D P 
P C)、ジステアロイルホ不ファチジルコリン(D 
S P C)、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン(DPPE)、シミリストイルホスファチジル
セリン(DMPS) 、ジパルミトイルスフィンゴミエ
リン(DPSM)等を挙げることができる。
その中でも飽和脂肪酸のものを特に好ましく使用できる
。糖脂質としても公知のものが使用でき、例えば、セラ
ミドモノへキソシド(CMH) 、グロボシドエ、ガン
グリオシドGM、 S0M2等を挙げることができる。
本発明においては上記例示脂質の1種または2種以上を
使用できる。また、膜の安定化のために、リン脂質及び
/又は糖脂質に対し、モル比1程度の割合でコレステロ
ールを添加するのが好ましい。
リポソーム膜に組込むハプテンとしては、抗原性を有し
、リポソームを構成する脂質と容易に結合し且つリポソ
ームの形成を妨げないものであれば特に制限されず、公
知のものから適宜選択して使用できる。その具体例とし
ては、例えば、ジニトロフェニル基(DNP)、トリニ
トロフェニル基(TNP)等の官能基を持つ物質、フル
オレセイン、核酸類、ホルモン類、ペプチド類、テオフ
ィリン等の医薬品の誘導体等を挙げることができる。
リポソーム内に封入される標識物質としては、親水性で
あり且つリポソームから放出された際に走出可能なもの
であれば特に制限されず、公知のものから適宜選択して
使用できる。その具体例としては、カルボキシフルオレ
セイン、カルセイン等の蛍光物質、グルコース等の糖類
、グイレコースー6−リン酸脱水素酵素等の酸化酵素、
NAD。
NADP等の補酵素、ラジカル化合物、ルミノール等の
酸化反応により発光する発光性物質、水溶性色素等を挙
げることができる。
更に本発明においては、リポソーム膜の構成成分として
、リポソームの凝集を防止したり、標識物質の内包率を
高めるために、ジセチルホスフエート、ステアリルアミ
ン等の荷電物質を、脂質の酸化を防止するために、α−
トコフェノール等を使用してもよい。
リポソーム自体の粒径は広い範囲から選択できるが、感
度の点から大きい程望ましく、通常的0.1μm以上と
するのが好ましい。より好ましくは約0.1〜1μm程
度の粒径とするのがよく、それにより、感度が良好で且
つ遠心分離等の操作を行なう時の取扱いも容易な一枚膜
リポソームとなる。
本発明の一枚膜リポソームは、公知の方法例えば、スゾ
カ エフ、  (Szoka  F、 )らの方法〔バ
イオキミカ エ バイオフィジヵ アクタ(Bioch
lmica et Biophysica Acta 
) 601 、 559 (1980))に従い、例え
ば以下のようにして調製できる。
まず、ハプテンと脂質とを溶媒中にて反応させ、ハプテ
ン化脂質を製造する。この際ハプテンと脂質との使用割
合は特に制限されず適宜選択すればよいが、通常後者1
モルに対し1〜10倍モル量程度とすればよい。また溶
媒としては、例えば、クロロホルム等のハロゲン化炭化
水素類、メタノール、イソプロパツール等の低級アルコ
ール類等を挙げることができる。
上記で得られるハプテン化脂質、並びに、必要に応じて
他の脂質、コレステロール等をフラスコ内で適当な有機
溶媒に溶解する。この際、脂質が溶けにくい場合がある
が、クロロホルムを少量添加することにより溶解できる
。次に、この溶液に標識物質の水溶液を加え、超音波処
理し、均一なW10エマルジョンが形成されたら有機溶
媒をロータリーエバポレーター等で留去し、ゲル状にす
る。これに振動を加えることにより、本発明リポソーム
を得ることができる。この方法によれば、通常直径的0
.1〜1μmの1枚膜リポソームを得ることができる。
上記において使用される脂質、有機溶媒及び標識物質の
水溶液の割合は特に制限されず適宜選択すればよいが、
通常脂質1ミリモルに対し、有機溶媒50mG程度及び
標識物質の水溶液15−程度を使用すればよい。標識物
質の水溶液の濃度は特に制限されず、用いる標識物質に
応じて適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば
、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテ
ル類、ハロタン、トリフルオロトリクロロエタン等のハ
ロゲン化炭化水素類等を挙げることができる。
また、有機溶媒を留去して得られるゲル状物に振動を与
えるには、例えば、ポルテックスミキサー等の公知の装
置が使用できる。
リポソームに内封されなかった標識物質は、透析、ゲル
濾過、遠心分離等の公知の方法で容易に除去することが
できる。
かくして得られる一枚膜リポソームは、適当な溶媒に懸
濁させることにより保存される。適当な溶媒としては、
例えばゼラチンベロナール緩衝液(GVB) 、リン酸
緩衝液(P B S)等を挙げることができる。
本発明の一枚膜リポソームに抗体を感作するに当っては
公知の方法が採用できる。抗体としては、使用したハプ
テンをウサギ等に免疫して得られる抗血清を用いればよ
いが、モノクロナール抗体を用いればより好ましい。
本発明のリポソームに抗体を感作させると、リポソーム
膜上のハプテンと抗体とが反応し、その膜上に抗原抗体
複合物が形成される。この抗原抗体複合物に補体を反応
させると膜損傷反応が起り、リポソーム内に封入された
標識物質が放出される。
放出された標識物質を公知の方法に従って定量すること
により、補体活性が測定される。    □発明の効果 本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。
しかも、−枚膜であるため、予め膜上の全てのノ\ブテ
ンに対して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を
加える必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果
が影響を受けることもない。更に、脂質組成を一定にす
ればリポソームを再現性良く得ることができ、ロット差
を少なくすることができるという利点もある。
実施例 以下に実施例及び比較例を挙げ、本発明をより一層明瞭
なものとする。
実施例1 クロロホルムに溶解した5mM  DMPC(シミリス
トイルホスファチジルコリン) 3.0m12.10m
M:+レスチロール1.5m12.o、1mMTNP−
Cap−DPPE ()リニトロフェニルアミノ力プロ
イルジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン)
750uQ、0.1mM  DCP(ジセチルホスフエ
ート)3.0−をナシ型フラスコ中で混合した。ロータ
リーエバポレーターでクロロホルムを留去し、ジエチル
エーテル−クロロホルム(3: 1) 1. 5m12
に再び溶解した。
さらに、0.2Mカルボキシフルオレセイン(CF)5
00μQを加え、バス型ソニケーターで均一なW10エ
マルジョンが形成するまで約2分間超音波処理した。次
に、ロータリーエバポレーターで有機溶媒を留去してゲ
ル化させた後ポルテックスミキサーで振動を与え、これ
をGVB″″ (ゼラチンベロナール緩衝液;稲井眞弥
他、補体学、医歯薬出版 1982)に懸濁させ、18
00Xg、30分の遠心操作によってリポソームを洗浄
した。さらに、GVB−に懸濁したリポソーム(約0.
2mM  DMPC)に10mM  EDTA−GVB
 (10mM  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
を含有したGVB−’)で90倍に希釈した抗ウサギ抗
血清を等量論え、37℃、10分インキュベーションし
た後、1800Xg、30分の遠心操作によってリポソ
ームをGVB−で洗浄して抗体感作−枚膜リポソーム(
LA;Llp。
some−Antibody )を作製した。該リポソ
ームの直径は0.1〜1μmであった。
比較例1 実施例1と同様の脂質、溶媒及び標識物質を用い、特開
昭62−163966号公報に記載の方法に従い、抗体
感作多重膜リポソームを作製した。
実験例1 上記実施例1及び比較例1で得られた各リポソームを用
い、以下の補体活性を測定した。
■ ヒト血清全補体活性の測定 U型マイクロプレート(96穴HGreiner社製)
にGVB””  (0,1mM  MgCQ2゜0.0
3mM  CaCQ2を含有したGVB−)で希釈した
ヒト新鮮血清50μQとLA(約0.2mM  DMP
C) 5uQを加え、37℃、1時間インキュベーショ
ンした。反応後、10mM  EDTA−GVB50μ
Qを加えて反応を止め、マイクロプレート蛍光分光光度
計MT P −F(コロナ社製)で蛍光強度を測定した
(Ex:490nm、  Em : 520nm) o
なお、測定値は蒸留水50μQをヒト新鮮血清の代わり
に加えたときの蛍光強度を100%とした相対蛍光強度
であられした。コントロールにはGVB+十をヒト新鮮
血清の代わりに用いた。図1はこのようにして求めた血
清希釈倍数と全補体活性による蛍光強度の関係をあられ
したグラフである。
■ ヒト血清ACPの測定 U型マイクロプレート(96穴; Gre1ner社製
)に5mM  Mg−EGTA−GVB (5mMMg
c92.5mM  エチレングリコール四酢酸二ナトリ
ウムを含有したGVB″″)で希釈したヒト新鮮血清5
0.clとLA(約0.2mM  DMPC)5μQを
加え、37℃で1時間インキュベーションした。反応後
、10mM  EDTA−GVB50μQを加えて反応
を止め、マイクロプレート蛍光分光光度計MTP−F 
(コロナ社製)で蛍光強度を測定した(Ex : 49
0ni、  Em : 520 nm)。なお、測定値
は蒸留水50μQをヒト新鮮血清の代わりに加えたとき
の蛍光強度を100%とした相対蛍光強度であられした
。コントロールには5mM  Mg−EGTA−GVB
をヒト新鮮血清の代わりに用いた。図2はこのようにし
て求めた血清希釈倍数とACP活性による蛍光強度の関
係をあられしたグラフである。
図1及び図2から、本発明リポソームが従来のリポソー
ムに比べて顕著に優れた補体活性測定感度を有している
ことが判る。即ち、本発明リポソームを用いた場合には
、従来の場合仲比べ補体活性測定感度(相対蛍光強度)
が少なくとも約2倍以上高くなり、反応感度が鋭敏にな
っているため、測定に用いる試料が少なくてすみ、且つ
補体活性のわずかな差を測定することができる。
実験例2 実施例1で得られた本発明リポソームを用い、補体成分
の活性測定を行なった。
■ 補体反応中間体LAC1,4の作製15111Qの
試験管に0℃に冷やしたLA(約0.2mM  DMP
Cを含むCa”” GGVB(0,3mM  CaCO
2,2,5%グルコースを含有したGVB−))2mQ
とヒト新鮮血清100μQを加え、0℃、5分反応さす
た後、0℃に冷やしたCa” ” GGVBlomGを
加え、180OXg、30分の遠心操作によって洗浄し
、本発明の抗体感作−枚膜リポソームにヒト補体第1成
分(C1)及びヒト補体第4成分(C4)が結合した、
LA、C1,4を得た。
■ 補体第2成分(C2〕活性の測定 3、 5+nQの試験管にLACI、4 50μQとG
GVB”十で希釈したモルモット補体第2成分(C2,
2,0×109有効分子/IIIQ)100μQを加え
、30℃、5分インキュベーションした後、10mM 
 EDTA−GVB100μ9を加えた。1分後、10
mM  EDTA−GVBで20倍希釈したモルモット
血清(C−EDTA)100μQを加え37℃、60分
インキュベーションした。更に、10mM  EDTA
−GVB2、5nQp加えた後、日立蛍光分光光度計T
YPE650−10 (日立社製・)で蛍光強度を測定
した。表1はこのようにして求めたC2活性の測定結果
である。
比較のため、C2及びC−EDTAの両方或はいずれか
一方を添加しない場合についても蛍光強度を測定した。
結果を表1に併記する。
表    1 C2−−++ C−EDTA −+ −+ 蛍光強度   4.0  4.4 4.6  B3.2
 99.6※cont、=コントロール 表1から、LACI、4に、C2とC−EDTAの両方
を添加した場合にのみ補体反応が進行すること、C−E
DTAのC2活性が欠けていること及び上記反応系が0
2活性に依存しており、従って上記反応によって02活
性を測定できることが判る。
■ 補体第3成分(C3)の活性測定 3.5−の試験管にLACI、4 50μQとGGVB
+十で希釈したモルモット補体第2成分(C22,0X
109有効分子/m12)100μQを加え30℃、5
分インキュベーションした後、10mM  EDTA−
GVBloo、clを加えた。1分後、10mM  E
DTA−GVBで40倍希釈したヒト新鮮血清(Hue
) 、10mMEDTA−GVBで40倍希釈したヒト
補体第3成分(C3)欠損ヒト血清(RC3)100μ
Qを加えた。さらに、RC3を加えたものに03 (1
00,ug/m(?)100.u9を加えた。37℃、
60分インキュベーションした後、10mMEDTA−
GVB  2.5mGを加え、それぞれの蛍光強度を測
定した。表2はこのようにして求めたC3活性の測定結
果である。
比較のため、RC3、C3及びHuSの1種又は2種を
添加しない場合(コントロールは3種とも添加しない)
についても蛍光強度を測定した。
結果を表2に併記する。
表    2 RC3−+−+ HuS −−+ − C3−−十 表2から、LACI、4.2 (LACI、4にさらに
C2が結合したもの)に、HuS或はRC3とC3とを
添加した場合に補体反応が進行することが判る。従って
、上記反応によりC3活性を測定できる。
【図面の簡単な説明】
図1及び図2は、本発明抗体感作−枚膜リポソームと従
来の抗体感作多重膜リポソームを用いて行なった補体活
性測定の結果を示すグラフである。 (以 上) 1/20   1/40   1/60   1/80
   1/100図    1 1/41/81/121/161/20血清希釈倍率 図   2

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)一枚膜リポソームの膜中に抗体に感作されたハプ
    テンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性の標識物質
    が封入されていることを特徴とする補体活性測定用試薬
JP62314909A 1987-12-11 1987-12-11 補体活性測定用試薬 Expired - Lifetime JPH076987B2 (ja)

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