JPH01155271A

JPH01155271A - 補体活性測定用試薬

Info

Publication number: JPH01155271A
Application number: JP31490987A
Authority: JP
Inventors: Takahisa Masaki; 正木　貴久; Noriko Okada; 則子岡田; Hidechika Okada; 秀親岡田
Original assignee: ISHIZU SEIYAKU KK
Current assignee: ISHIZU SEIYAKU KK
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1987-12-11
Publication date: 1989-06-19
Anticipated expiration: 2010-01-30
Also published as: JPH076987B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、血清中の補体価又は補体成分の活性を測定す
るための補体活性測定用試薬に関する。

従来の技術近年補体活性の測定は、自己免疫疾患、感染症、炎症、
癌等の診断や治療の経過等を知る上でのパラメーターと
して注目されている。

従来、補体価（ＣＦ２Ｏ値）や補体成分の活性を測定す
るに当っては、感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）の補体による
溶血反応を利用した方法が採用されている。また、補体
活性化の第２経路であるＡＣＰ　（Ａｌｔｅｒｎａｔｌ
ｖｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ）の測定
にはウサギ赤血球を用いた溶血反応が利用されている。

しかしながら、これらの赤血球は採血後１ケ月程度しか
保存できず、しかもその品質が不安定であるため、ロッ
ト毎に検定を行わなければならない。

上記ヒツジやウサギの感作赤血球に代わるものとして、
ポルチクスイング（Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ　）法によって
製造された、リポソーム膜中にハプテンが組込まれた多
重膜リポソームが提案されている（特開昭６２−１６３
９６６号）。該多重膜リポソームは補体価の測定に利用
できるが、以下のような欠点があり好ましくない。

１）　上記多重膜リポソームでは、抗体や補体は最外層
の膜にしか反応しないため、最外層が破壊されて初めて
その次の膜に抗体と補体とが反応するという経過を追っ
て反応が進まざるを得ない。従って、反応には多くの補
体や抗体が必要となる。

２）　上記のような反応経過をたどるため、封入されて
いる標識物質の放出効率が低く、測定の感度も低下する
。特に、ＡＣＰや補体成分の活性の測定に士、分な感度
を得難い。

３）　上記多重膜リポソームを用いて補体価の測定を行
う時に、ハプテンに対する抗体を反応溶液中に加えると
いう操作が必要であり、これが活性測定を煩雑化してい
る。予め抗体を感作させても、最外層の膜上のハプテン
としか反応しないため、やはり上記の操作が必要となる
。

４）　更に、測定結果が加える抗体の力価によって影響
を受けるという問題点もある。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、主記従来技術の問題点を悉く解消した
補体活性測定用試薬を提供することにある。

問題点を解決するための手段本発明の目的は、−枚膜リポソームの膜中に抗体に感作
されたハプテンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性
の標識物質が封入されていることを特徴とする補体活性
測定用試薬により達成される。

本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。

また、−枚膜であるから予め膜上の全てのハプテンに対
して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を加える
必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果が影響
を受けることもない。

本発明においてリポソーム膜を構成する脂質としては公
知のものを使用でき、例えば、リン脂質、糖脂質等を挙
げることができる。リン脂質としてはその脂肪酸残基の
炭素数が１２〜１８程度のものを好ましく使用でき、そ
の具体例としては、例えば、卵黄レシチン（ｅｇｇ　ｐ
ｃ）　、シラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰ
Ｃ）、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ
）　、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　
Ｐ　Ｃ）、ジステアロイルホ不ファチジルコリン（Ｄ　
Ｓ　Ｐ　Ｃ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＰＰＥ）、シミリストイルホスファチジル
セリン（ＤＭＰＳ）　、ジパルミトイルスフィンゴミエ
リン（ＤＰＳＭ）等を挙げることができる。

その中でも飽和脂肪酸のものを特に好ましく使用できる
。糖脂質としても公知のものが使用でき、例えば、セラ
ミドモノへキソシド（ＣＭＨ）　、グロボシドエ、ガン
グリオシドＧＭ、　Ｓ０Ｍ２等を挙げることができる。

本発明においては上記例示脂質の１種または２種以上を
使用できる。また、膜の安定化のために、リン脂質及び
／又は糖脂質に対し、モル比１程度の割合でコレステロ
ールを添加するのが好ましい。

リポソーム膜に組込むハプテンとしては、抗原性を有し
、リポソームを構成する脂質と容易に結合し且つリポソ
ームの形成を妨げないものであれば特に制限されず、公
知のものから適宜選択して使用できる。その具体例とし
ては、例えば、ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）、トリニ
トロフェニル基（ＴＮＰ）等の官能基を持つ物質、フル
オレセイン、核酸類、ホルモン類、ペプチド類、テオフ
ィリン等の医薬品の誘導体等を挙げることができる。

リポソーム内に封入される標識物質としては、親水性で
あり且つリポソームから放出された際に走出可能なもの
であれば特に制限されず、公知のものから適宜選択して
使用できる。その具体例としては、カルボキシフルオレ
セイン、カルセイン等の蛍光物質、グルコース等の糖類
、グイレコースー６−リン酸脱水素酵素等の酸化酵素、
ＮＡＤ。

ＮＡＤＰ等の補酵素、ラジカル化合物、ルミノール等の
酸化反応により発光する発光性物質、水溶性色素等を挙
げることができる。

更に本発明においては、リポソーム膜の構成成分として
、リポソームの凝集を防止したり、標識物質の内包率を
高めるために、ジセチルホスフエート、ステアリルアミ
ン等の荷電物質を、脂質の酸化を防止するために、α−
トコフェノール等を使用してもよい。

リポソーム自体の粒径は広い範囲から選択できるが、感
度の点から大きい程望ましく、通常的０．１μｍ以上と
するのが好ましい。より好ましくは約０．１〜１μｍ程
度の粒径とするのがよく、それにより、感度が良好で且
つ遠心分離等の操作を行なう時の取扱いも容易な一枚膜
リポソームとなる。

本発明の一枚膜リポソームは、公知の方法例えば、スゾ
カ　エフ、　　（Ｓｚｏｋａ　　Ｆ、　）らの方法〔バ
イオキミカ　エ　バイオフィジヵ　アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｌｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　
）　６０１　、　５５９　（１９８０））に従い、例え
ば以下のようにして調製できる。

まず、ハプテンと脂質とを溶媒中にて反応させ、ハプテ
ン化脂質を製造する。この際ハプテンと脂質との使用割
合は特に制限されず適宜選択すればよいが、通常後者１
モルに対し１〜１０倍モル量程度とすればよい。また溶
媒としては、例えば、クロロホルム等のハロゲン化炭化
水素類、メタノール、イソプロパツール等の低級アルコ
ール類等を挙げることができる。

上記で得られるハプテン化脂質、並びに、必要に応じて
他の脂質、コレステロール等をフラスコ内で適当な有機
溶媒に溶解する。この際、脂質が溶けにくい場合がある
が、クロロホルムを少量添加することにより溶解できる
。次に、この溶液に標識物質の水溶液を加え、超音波処
理し、均一なＷ１０エマルジョンが形成されたら有機溶
媒をロータリーエバポレーター等で留去し、ゲル状にす
る。これに振動を加えることにより、本発明リポソーム
を得ることができる。この方法によれば、通常直径的０
．１〜１μｍの１枚膜リポソームを得ることができる。

上記において使用される脂質、有機溶媒及び標識物質の
水溶液の割合は特に制限されず適宜選択すればよいが、
通常脂質１ミリモルに対し、有機溶媒５０ｍＧ程度及び
標識物質の水溶液１５−程度を使用すればよい。標識物
質の水溶液の濃度は特に制限されず、用いる標識物質に
応じて適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば
、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテ
ル類、ハロタン、トリフルオロトリクロロエタン等のハ
ロゲン化炭化水素類等を挙げることができる。

また、有機溶媒を留去して得られるゲル状物に振動を与
えるには、例えば、ポルテックスミキサー等の公知の装
置が使用できる。

リポソームに内封されなかった標識物質は、透析、ゲル
濾過、遠心分離等の公知の方法で容易に除去することが
できる。

かくして得られる一枚膜リポソームは、適当な溶媒に懸
濁させることにより保存される。適当な溶媒としては、
例えばゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）　、リン酸
緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）等を挙げることができる。

本発明の一枚膜リポソームに抗体を感作するに当っては
公知の方法が採用できる。抗体としては、使用したハプ
テンをウサギ等に免疫して得られる抗血清を用いればよ
いが、モノクロナール抗体を用いればより好ましい。

本発明のリポソームに抗体を感作させると、リポソーム
膜上のハプテンと抗体とが反応し、その膜上に抗原抗体
複合物が形成される。この抗原抗体複合物に補体を反応
させると膜損傷反応が起り、リポソーム内に封入された
標識物質が放出される。

放出された標識物質を公知の方法に従って定量すること
により、補体活性が測定される。　　　　□発明の効果本発明では、補体活性測定用試薬として用いるリポソー
ムが一枚膜であるため、多重膜リポソームに比べ極めて
鋭敏に補体反応をとらえることができ、使用する補体や
抗体の量も少なくてよい。

しかも、−枚膜であるため、予め膜上の全てのノ＼ブテ
ンに対して抗体を感作できるので、活性測定中に抗体を
加える必要がなく、従って抗体の力価によって測定結果
が影響を受けることもない。更に、脂質組成を一定にす
ればリポソームを再現性良く得ることができ、ロット差
を少なくすることができるという利点もある。

実施例以下に実施例及び比較例を挙げ、本発明をより一層明瞭
なものとする。

実施例１クロロホルムに溶解した５ｍＭ　　ＤＭＰＣ（シミリス
トイルホスファチジルコリン）　３．０ｍ１２．１０ｍ
Ｍ：＋レスチロール１．５ｍ１２．ｏ、１ｍＭＴＮＰ−
Ｃａｐ−ＤＰＰＥ　（）リニトロフェニルアミノ力プロ
イルジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）
７５０ｕＱ、０．１ｍＭ　　ＤＣＰ（ジセチルホスフエ
ート）３．０−をナシ型フラスコ中で混合した。ロータ
リーエバポレーターでクロロホルムを留去し、ジエチル
エーテル−クロロホルム（３：　１）　１．　５ｍ１２
に再び溶解した。

さらに、０．２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）５
００μＱを加え、バス型ソニケーターで均一なＷ１０エ
マルジョンが形成するまで約２分間超音波処理した。次
に、ロータリーエバポレーターで有機溶媒を留去してゲ
ル化させた後ポルテックスミキサーで振動を与え、これ
をＧＶＢ″″　（ゼラチンベロナール緩衝液；稲井眞弥
他、補体学、医歯薬出版　１９８２）に懸濁させ、１８
００Ｘｇ、３０分の遠心操作によってリポソームを洗浄
した。さらに、ＧＶＢ−に懸濁したリポソーム（約０．
２ｍＭ　　ＤＭＰＣ）に１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ−ＧＶＢ
　（１０ｍＭ　　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
を含有したＧＶＢ−’）で９０倍に希釈した抗ウサギ抗
血清を等量論え、３７℃、１０分インキュベーションし
た後、１８００Ｘｇ、３０分の遠心操作によってリポソ
ームをＧＶＢ−で洗浄して抗体感作−枚膜リポソーム（
ＬＡ；Ｌｌｐ。

ｓｏｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ　）を作製した。該リポソ
ームの直径は０．１〜１μｍであった。

比較例１実施例１と同様の脂質、溶媒及び標識物質を用い、特開
昭６２−１６３９６６号公報に記載の方法に従い、抗体
感作多重膜リポソームを作製した。

実験例１上記実施例１及び比較例１で得られた各リポソームを用
い、以下の補体活性を測定した。

■　ヒト血清全補体活性の測定Ｕ型マイクロプレート（９６穴ＨＧｒｅｉｎｅｒ社製）
にＧＶＢ””　　（０，１ｍＭ　　ＭｇＣＱ２゜０．０
３ｍＭ　　ＣａＣＱ２を含有したＧＶＢ−）で希釈した
ヒト新鮮血清５０μＱとＬＡ（約０．２ｍＭ　　ＤＭＰ
Ｃ）　５ｕＱを加え、３７℃、１時間インキュベーショ
ンした。反応後、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ−ＧＶＢ５０μ
Ｑを加えて反応を止め、マイクロプレート蛍光分光光度
計ＭＴ　Ｐ　−Ｆ（コロナ社製）で蛍光強度を測定した
（Ｅｘ：４９０ｎｍ、　　Ｅｍ　：　５２０ｎｍ）　ｏ
なお、測定値は蒸留水５０μＱをヒト新鮮血清の代わり
に加えたときの蛍光強度を１００％とした相対蛍光強度
であられした。コントロールにはＧＶＢ＋十をヒト新鮮
血清の代わりに用いた。図１はこのようにして求めた血
清希釈倍数と全補体活性による蛍光強度の関係をあられ
したグラフである。

■　ヒト血清ＡＣＰの測定Ｕ型マイクロプレート（９６穴；　Ｇｒｅ１ｎｅｒ社製
）に５ｍＭ　　Ｍｇ−ＥＧＴＡ−ＧＶＢ　（５ｍＭＭｇ
ｃ９２．５ｍＭ　　エチレングリコール四酢酸二ナトリ
ウムを含有したＧＶＢ″″）で希釈したヒト新鮮血清５
０．ｃｌとＬＡ（約０．２ｍＭ　　ＤＭＰＣ）５μＱを
加え、３７℃で１時間インキュベーションした。反応後
、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ−ＧＶＢ５０μＱを加えて反応
を止め、マイクロプレート蛍光分光光度計ＭＴＰ−Ｆ　
（コロナ社製）で蛍光強度を測定した（Ｅｘ　：　４９
０ｎｉ、　　Ｅｍ　：　５２０　ｎｍ）。なお、測定値
は蒸留水５０μＱをヒト新鮮血清の代わりに加えたとき
の蛍光強度を１００％とした相対蛍光強度であられした
。コントロールには５ｍＭ　　Ｍｇ−ＥＧＴＡ−ＧＶＢ
をヒト新鮮血清の代わりに用いた。図２はこのようにし
て求めた血清希釈倍数とＡＣＰ活性による蛍光強度の関
係をあられしたグラフである。

図１及び図２から、本発明リポソームが従来のリポソー
ムに比べて顕著に優れた補体活性測定感度を有している
ことが判る。即ち、本発明リポソームを用いた場合には
、従来の場合仲比べ補体活性測定感度（相対蛍光強度）
が少なくとも約２倍以上高くなり、反応感度が鋭敏にな
っているため、測定に用いる試料が少なくてすみ、且つ
補体活性のわずかな差を測定することができる。

実験例２実施例１で得られた本発明リポソームを用い、補体成分
の活性測定を行なった。

■　補体反応中間体ＬＡＣ１，４の作製１５１１１Ｑの
試験管に０℃に冷やしたＬＡ（約０．２ｍＭ　　ＤＭＰ
Ｃを含むＣａ””　ＧＧＶＢ（０，３ｍＭ　　ＣａＣＯ
２，２，５％グルコースを含有したＧＶＢ−））２ｍＱ
とヒト新鮮血清１００μＱを加え、０℃、５分反応さす
た後、０℃に冷やしたＣａ”　”　ＧＧＶＢｌｏｍＧを
加え、１８０ＯＸｇ、３０分の遠心操作によって洗浄し
、本発明の抗体感作−枚膜リポソームにヒト補体第１成
分（Ｃ１）及びヒト補体第４成分（Ｃ４）が結合した、
ＬＡ、Ｃ１，４を得た。

■　補体第２成分（Ｃ２〕活性の測定３、　５＋ｎＱの試験管にＬＡＣＩ、４　５０μＱとＧ
ＧＶＢ”十で希釈したモルモット補体第２成分（Ｃ２，
２，０×１０９有効分子／ＩＩＩＱ）１００μＱを加え
、３０℃、５分インキュベーションした後、１０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ−ＧＶＢ１００μ９を加えた。１分後、１０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ−ＧＶＢで２０倍希釈したモルモット
血清（Ｃ−ＥＤＴＡ）１００μＱを加え３７℃、６０分
インキュベーションした。更に、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ
−ＧＶＢ２、５ｎＱｐ加えた後、日立蛍光分光光度計Ｔ
ＹＰＥ６５０−１０　（日立社製・）で蛍光強度を測定
した。表１はこのようにして求めたＣ２活性の測定結果
である。

比較のため、Ｃ２及びＣ−ＥＤＴＡの両方或はいずれか
一方を添加しない場合についても蛍光強度を測定した。

結果を表１に併記する。

表　　　　１Ｃ２−−＋＋Ｃ−ＥＤＴＡ　−＋　−＋蛍光強度　　　４．０　　４．４　４．６　　Ｂ３．２
　９９．６※ｃｏｎｔ、＝コントロール表１から、ＬＡＣＩ、４に、Ｃ２とＣ−ＥＤＴＡの両方
を添加した場合にのみ補体反応が進行すること、Ｃ−Ｅ
ＤＴＡのＣ２活性が欠けていること及び上記反応系が０
２活性に依存しており、従って上記反応によって０２活
性を測定できることが判る。

■　補体第３成分（Ｃ３）の活性測定３．５−の試験管にＬＡＣＩ、４　５０μＱとＧＧＶＢ
＋十で希釈したモルモット補体第２成分（Ｃ２２，０Ｘ
１０９有効分子／ｍ１２）１００μＱを加え３０℃、５
分インキュベーションした後、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ−
ＧＶＢｌｏｏ、ｃｌを加えた。１分後、１０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ−ＧＶＢで４０倍希釈したヒト新鮮血清（Ｈｕｅ
）　、１０ｍＭＥＤＴＡ−ＧＶＢで４０倍希釈したヒト
補体第３成分（Ｃ３）欠損ヒト血清（ＲＣ３）１００μ
Ｑを加えた。さらに、ＲＣ３を加えたものに０３　（１
００，ｕｇ／ｍ（？）１００．ｕ９を加えた。３７℃、
６０分インキュベーションした後、１０ｍＭＥＤＴＡ−
ＧＶＢ　　２．５ｍＧを加え、それぞれの蛍光強度を測
定した。表２はこのようにして求めたＣ３活性の測定結
果である。

比較のため、ＲＣ３、Ｃ３及びＨｕＳの１種又は２種を
添加しない場合（コントロールは３種とも添加しない）
についても蛍光強度を測定した。

結果を表２に併記する。

表　　　　２ＲＣ３−＋−＋ＨｕＳ　−−＋　− Ｃ３−−十表２から、ＬＡＣＩ、４．２　（ＬＡＣＩ、４にさらに
Ｃ２が結合したもの）に、ＨｕＳ或はＲＣ３とＣ３とを
添加した場合に補体反応が進行することが判る。従って
、上記反応によりＣ３活性を測定できる。

【図面の簡単な説明】

図１及び図２は、本発明抗体感作−枚膜リポソームと従
来の抗体感作多重膜リポソームを用いて行なった補体活
性測定の結果を示すグラフである。（以　上）１／２０　　　１／４０　　　１／６０　　　１／８０
　　　１／１００図　　　　１１／４１／８１／１２１／１６１／２０血清希釈倍率図　　　２

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一枚膜リポソームの膜中に抗体に感作されたハプ
テンが組込まれ且つ該リポソーム内に親水性の標識物質
が封入されていることを特徴とする補体活性測定用試薬
。