JP2011047923A - リポソーム組成物及びその製造方法並びにそれを用いたアナライトの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】リポソームと、前記リポソームの内水相に封入された化学物質とを含むリポソーム組成物において、前記リポソームを構成する脂質二分子膜が、正又は負の電荷を有し、前記化学物質が、前記脂質二分子膜が有する電荷とは逆の電荷を有する。
【選択図】図1
Description
図1は、実施の形態1におけるリポソーム組成物を概念的に示したものである。
活性型DPPEの調製は化1に示す反応スキームに従って行った。
ナス型フラスコ中に、クロロホルム/無水メタノール=9:1で調製した溶液にそれぞれ溶解したジパルミトイルホスファチジルコリン(以下DPPCと略す)、活性型DPPE、コレステロール、及び、ジセチルリン酸を入れ、エバポレーターにて溶媒を留去し、フラスコ内壁に脂質フィルムを形成させた。DPPC、活性型DPPE、コレステロール及びジセチルリン酸の投入量は、表1に示すとおり調整した。
次に、SPDP修飾リガンドの調製を化2に示す反応スキームに従って行った。
さらに、リポソーム組成物表面へのリガンドの修飾を化3及び化4に示す反応スキームに従って行った。
まず、調製したリポソーム組成物を含む溶液を10mmol/lリン酸緩衝液(pH7.4)で400倍希釈し、電気化学発光強度を測定した。ガラス基板上にスパッタ装置(アルバック製SH−350)により、チタン10nmを下地に金200nmを形成させ、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成した。得られた直径3mmの作用電極を有する金電極チップの作用電極に、400倍希釈したリポソーム組成物を含む溶液を2μl滴下し、65℃の恒温槽中に5分間放置した。その後、0.1mol/lリン酸二水素カリウム、0.1mol/lリン酸水素ニカリウム及び0.1mol/lTEAからなる電解発光液を80μl滴下し、0V〜1.3Vまで電圧走査し、4秒間の電気化学発光強度を光電子倍増管(浜松ホトニクス製H7360−01)で測定した。リポソーム濃度は、予め同様の手順でトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体で作成した検量線を基に定量した。化学物質内包リポソームの電気化学発光強度の測定結果を表3に示す。
Y=X/Z×100
Y:トリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体の封入パーセント(%)
X:溶液中に含まれる全リポソームに封入されたトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体の濃度(mol/l)
Z:封入前に導入されたトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体の濃度(mol/l)
結果、封入前に導入されたトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体の濃度は、5mmol/lであるため、条件1での封入パーセントは0.124%、条件2は0.246%、条件3は0.084%、条件4は0.09%であった。従って、全リポソーム脂質二分子膜形成成分に対し3モル%量のジセチルリン酸を加えた条件1では、従来法と比較して47%、全リポソーム脂質二分子膜形成成分に対し22モル%量のジセチルリン酸を加えた条件2では、従来法と比較して、173%高濃度にリポソーム内水相中にトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体が含まれていることになる。更に、リポソーム組成物中のトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム錯体濃度を確認するために、15mlにメスアップした化学物質内包リポソーム溶液について、マイクロプレートリーダーで波長450nmでの吸光度を測定した。測定結果を表4に示す。
実施の形態2は、リポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法に関する。アナライトの分析では、一般的な免疫分析法である非競合法(サンドイッチ法)や競合法のいずれを用いても同様の効果が得られるが、実施の形態2においては、一例として磁性ビーズを用いた非競合法(サンドイッチ法)に関して説明する。
実施の形態3では、実施の形態1と同様の手順でルテニウム錯体を内包したリポソームを調製し、リポソーム表面にウサギ由来のBSA抗体を修飾させ、実施の形態1とは異なる測定方法にて、リポソームに内包された化学物質の封入パーセントを割り出した。実施の形態1とは異なる測定方法で封入パーセントを割り出す理由は以下の通りである。リポソームは微少のサイズであり、調製したリポソームの個数、リポソーム内水相の容積等を正確に求めることは困難である。従って、別の観点からの測定方法を用いて封入パーセントの割り出しを行うことで、本発明でリポソーム封入パーセントの向上が見込めることを、多角的に検討することが好ましいと考えられた。
実施の形態4では、実施の形態3で調製したリポソーム組成物を用いて、競合法によりBSAの測定を試みた。検出方法は、電気化学発光検出により行った。また、実施の形態3で調製したリポソーム組成物は、ビスビピリジン{{4,4’−(4−アミノブチル)}−2,2’−ビピリジン}ルテニウム錯体を内包している。このビスビピリジン{{4,4’−(4−アミノブチル)}−2,2’−ビピリジン}ルテニウム錯体は、リンカー部位にアミンを2つ有した構造であり、このアミンが金電極と強固な配位結合を形成するため、金電極表面に吸着し易く、除去され難い。従って、リポソーム組成物の破壊及び洗浄等の操作を伴う競合反応においては、これら操作で吸着され易く、除去され難いビスビピリジン{{4,4’−(4−アミノブチル)}−2,2’−ビピリジン}ルテニウム錯体の使用が適している。
2 リポソーム内水相
3 正の電荷を有する化学物質
4 リガンド
5 リンカー
6 無極性溶媒を含む溶媒に溶解した負の電荷を有する脂質二分子膜形成成分
7 脂質フィルム
8 正の電荷を有する化学物質を溶解した水溶液
9 多重層リポソーム組成物
10 フィルター
11 単層かつ均一なリポソーム組成物
12 固相
13 抗体
14 アナライト
15 アナライト及びリガンドと特異的に結合する化合物
16 リガンドによって修飾されたリポソーム組成物
17 抗体によって修飾されたリポソーム組成物
18 金電極
19 抗原
20 SAM結合部位
Claims (43)
- リポソームと、前記リポソームの内水相に封入された化学物質とを含むリポソーム組成物であって、
前記リポソームを構成する脂質二分子膜が、正又は負の電荷を有し、
前記化学物質が、前記脂質二分子膜が有する電荷とは逆の電荷を有する、リポソーム組成物。 - 前記リポソーム組成物は、脂質二分子膜の電荷量に応じて、前記内水相に内包する化学物質の封入パーセントが調節されている請求項1に記載のリポソーム組成物。
- 前記脂質二分子膜を形成する成分が、リン脂質及び糖脂質のうちいずれか一方又は双方を含む、請求項1又は2に記載のリポソーム組成物。
- 前記リポソームが、外表面にリガンドを有する、請求項1〜3のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記リガンドが、抗体、抗原、ペプチド、核酸、プロテインA、プロテインG、アビジン、及び、ビオチンからなる群より選ばれた少なくとも1つである、請求項4に記載のリポソーム組成物。
- 前記リポソームが、単層リポソームである、請求項1〜5のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記単層リポソームは、直径が20〜200nmの範囲にある、請求項6に記載のリポソーム組成物。
- 前記化学物質が、親水性を有するものである、請求項1〜7のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記脂質二分子膜を形成する成分が、負の電荷を有する脂質二分子膜成分を含み、前記負の電荷を有する脂質二分子膜成分により、前記脂質二分子膜に負の電荷が付与される請求項1〜8のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記負の電荷を有する脂質二分子膜成分が、酸性リン脂質、シアル酸を有する糖脂質、及び、リン酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項9に記載のリポソーム組成物。
- 前記リン酸エステルは、ジセチルリン酸である、請求項10に記載のリポソーム組成物。
- 前記化学物質が、正の電荷を有する化学物質である、請求項1〜11のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記正の電荷を有する化学物質が、金属錯体である、請求項12に記載のリポソーム組成物。
- 前記金属錯体が、電気化学発光性を有するものである、請求項13に記載のリポソーム組成物。
- 前記金属錯体が、アミノ基、ホスフィノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む有機化合物、及び/又は、複素環式化合物を、配位子として含むものである、請求項13又は14に記載のリポソーム組成物。
- 前記複素環式化合物が、ピリジン部位を有する化合物である、請求項15に記載のリポソーム組成物。
- 前記ピリジン部位を有する化合物が、ビピリジン骨格又はフェナントロリン骨格を有する化合物である、請求項16に記載のリポソーム組成物。
- 前記有機化合物が、ビス(ジフェニルホスフィノ)エテンである、請求項15に記載のリポソーム組成物。
- 前記金属錯体が、中心金属にルテニウム又はオスミウムを含む、請求項13〜18のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記脂質二分子膜を形成する成分が、正の電荷を有する脂質二分子膜成分を含み、前記正の電荷を有する脂質二分子膜成分により、前記脂質二分子膜に正の電荷が付与される請求項1〜8のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- 前記正の電荷を有する脂質二分子膜成分が、アミン化合物である、請求項20に記載のリポソーム組成物。
- 前記アミン化合物が、ステアリルアミンである、請求項21に記載のリポソーム組成物。
- 前記化学物質が、負の電荷を有する化学物質である、請求項20〜22のいずれか一つに記載のリポソーム組成物。
- リン脂質及び糖脂質のうち少なくとも1つと、リポソームを構成する脂質二分子膜に正又は負の電荷を付与する脂質二分子膜形成成分と、前記脂質二分子膜とは逆の電荷を有する化学物質と、水との存在下で、リポソームを形成することにより、前記リポソームの内水相に前記化学物質を封入する工程を含む、リポソーム組成物の製造方法。
- リン脂質及び糖脂質のうち少なくとも一つと、リポソームを構成する脂質二分子膜に正又は負の電荷を付与する脂質二分子膜形成成分とを含む脂質フィルムを形成する工程と、
前記脂質フィルムと、前記脂質二分子膜形成成分とは逆の電荷を有する化学物質を溶解した水溶液とを接触させる工程と、
前記接触工程後、前記脂質フィルムと前記水溶液とを混合して前記化学物質を内包したリポソームを形成させる工程とを含む請求項24に記載のリポソーム組成物の製造方法。 - 前記封入工程で形成されたリポソームの外表面に、リガンドを修飾する修飾工程をさらに含む、請求項24又は25に記載のリポソーム組成物の製造方法。
- 前記脂質二分子膜に負の電荷を付与する成分が、酸性リン脂質、シアル酸を有する糖脂質、及び、リン酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項24〜26のいずれか一つに記載のリポソーム組成物の製造方法。
- 前記化学物質が、正の電荷を有する化学物質である、請求項24〜27のいずれかに記載のリポソーム組成物の製造方法。
- 前記脂質二分子膜に正の電荷を付与する成分が、ステアリルアミンを含む、請求項24〜26のいずれか一つに記載のリポソーム組成物の製造方法。
- 前記化学物質が、負の電荷を有する化学物質である、請求項24〜26又は29のいずれか一つに記載のリポソーム組成物の製造方法。
- 請求項4記載のリポソーム組成物を用い、前記リガンドとアナライトとの結合反応を利用してサンドイッチ法又は競合法で前記アナライトを分析するアナライトの分析方法であって、
前記化学物質は、シグナルを発生可能なものである、アナライトの分析方法。 - 前記正の電荷を有する化学物質が、金属錯体である、請求項31に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記金属錯体が、電気化学発光性又は蛍光性を有するものである、請求項32に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記金属錯体が、アミノ基、ホスフィノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む有機化合物、及び/又は、複素環式化合物を、配位子として含むものである、請求項32又は33に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記複素環式化合物が、ピリジン部位を有する化合物である、請求項34に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記ピリジン部位を有する化合物が、ビピリジン骨格又はフェナントロリン骨格を有する化合物である、請求項35に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記有機化合物が、ビス(ジフェニルホスフィノ)エテンである、請求項34に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記金属錯体が、中心金属にルテニウム又はオスミウムを含む、請求項32〜37のいずれかに記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記シグナルは、電気化学発光又は蛍光である、請求項31〜38のいずれかに記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記リポソームが、単層リポソームである、請求項31〜39のいずれかに記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記単層リポソームは、直径が20〜200nmの範囲にある、請求項40に記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記リガンドが、抗体、抗原、ペプチド、核酸、プロテインA、プロテインG、アビジン、及び、ビオチンからなる群より選ばれた少なくとも1つである、請求項31〜41のいずれかに記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
- 前記アナライトが、抗体、抗原、ペプチド、及び、核酸からなる群より選ばれた少なくとも1つである、請求項31〜42のいずれかに記載のリポソーム組成物を用いたアナライトの分析方法。
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