JP5344450B2 - 電解発光物質を内封するリポソームを用いた迅速高感度アッセイ法 - Google Patents
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(1)下記工程:
(i)電解発光物質を内封するリポソームの表面上で被検物質もしくは被検物質の一部とそれに特異的に結合する物質とを反応させ、ここで被検物質もしくは被検物質の一部またはそれに特異的に結合する物質のいずれかがリポソーム表面上に結合されており、次いで、
(ii)該反応が表面上で起こったリポソーム、または該反応が表面上で起こらなかったリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含み、リポソームの破壊を伴わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法;
(2)下記工程:
(a)被検物質もしくは被検物質の一部を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、リポソームに結合されていない被検物質とを、固相表面に固定化された、被検物質もしくは被検物質の一部と特異的に結合する物質と反応させ、
(c)該固相表面上の、被検物質もしくは被検物質の一部と特異的に結合する物質に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、(1)記載の方法;
(3)工程(a)と工程(c)との間に、工程(b):
被検物質と特異的に結合する物質が結合したリポソームを、被検物質と特異的に結合する物質が結合していないリポソームから分離する
を含む、(2)記載の方法;
(4)工程(a)において固相が電極であり、工程(c)において電極に電圧を印加することによりリポソームに電圧が印加されることを特徴とする、(2)または(3)記載の方法;
(5)電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーにて行う(4)記載の方法;
(6)下記工程:
(a’)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームを、固相表面に固定化された被検物質もしくは被検物質の一部および固相表面に固定化されていない被検物質と反応させ、
(c’)該固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、固相表面に固定化されていない被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、請求項1記載の方法。
(7)工程(a’)と工程(c’)との間に、工程(b’):
固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合したリポソームを、固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合しなかったリポソームから分離する
を含む、(6)記載の方法;
(8)工程(a’)において固相が電極であり、工程(c’)において電極に電圧を印加することによりリポソームに電圧が印加されることを特徴とする、(6)または(7)記載の方法;
(9)電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーにて行う(8)記載の方法;
(10)下記工程:
(d)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、被検物質とを反応させ、
(e)被検物質が結合したリポソームを、被検物質が結合していないリポソームから分離し、次いで、
(f)被検物質が結合したリポソームあるいは結合していないリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、(1)記載の方法;
(11)工程(e)が電気泳動、クロマトグラフィーまたは膜分離を用いて行われる、(10)記載の方法;
(12)電解発光物質がルテニウム(II)錯体である(1)ないし(11)のいずれかに記載の方法;
(13)ルテニウム(II)錯体がトリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム錯体であって、ピリジン部分がヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基を有する側鎖を1〜6個有していてもよいものである、(12)記載の方法;
(14)ルテニウム(II)錯体が、トリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−{4,4’−ビス[フタルイミノブチル]−2,2’−ビピリジン}ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−[4,4’−ビス(4−アミノブチル)−2,2’−ビピリジン]ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−(4−アミノブチル−4’−メチル−2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)錯体、またはビス(2,2’−ビピリジン)−[2,2’−ビス(4−メルカプトブチル)−2,2’−ビピリジン]ルテニウム(II)錯体である、(13)記載の方法;
(15)被検物質と被検物質と特異的に結合する物質との反応が、抗原抗体反応であるか、あるいはリガンドと受容体の反応である、(1)ないし(14)のいずれかに記載の方法;
(16)(1)ないし(15)のいずれかに記載の方法による被検物質の検出または定量に用いられる、(12)ないし(14)のいずれかに記載の電解発光物質を内封したリポソーム試薬であって、電解発光反応に際して破壊する必要のないリポソーム試薬;
(17)(1)ないし(15)のいずれかに記載の方法による被検物質の検出または定量に用いられる、(12)ないし(14)のいずれかに記載の電解発光物質を内封したリポソーム試薬を必須成分として含むアッセイキットであって、電解発光反応に際してリポソームを破壊しないことを特徴とするアッセイキット
を提供するものである。
(i)電解発光物質を内封するリポソームの表面上で被検物質もしくは被検物質の一部とそれに特異的に結合する物質とを反応させ、ここで被検物質もしくは被検物質の一部またはそれに特異的に結合する物質のいずれかがリポソーム表面上に結合されており、次いで、
(ii)該反応が表面上で起こったリポソーム、または該反応が表面上で起こらなかったリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含み、リポソームの破壊を伴わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法を提供する。
下記工程:
(a)被検物質もしくは被検物質の一部を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、リポソームに結合されていない被検物質とを、固相表面に固定化された被検物質と特異的に結合する物質と反応させ、
(c)該固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部と特異的に結合する物質に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法である。
被検物質と特異的に結合する物質が結合したリポソームを、被検物質と特異的に結合する物質が結合していないリポソームから分離する
が含まれていてもよい。工程(b)の分離操作は様々な様式にて行うことができる。典型的には、反応後にリポソームが結合した固相を反応系から取り出すことに行われうる。さらに、取り出した固相を水やバッファーなどの適当な流体にて洗浄してもよい。このような操作も、被検物質と特異的に結合する物質を固相に固定化しておくことにより迅速かつ確実に行うことができるものである。
下記工程:
(a’)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームを、固相表面に固定化された被検物質もしくは被検物質の一部および固相表面に固定化されていない被検物質と反応させ、
(c’)該固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、固相表面に固定化されていない被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法である。すなわち、方法(A’)ではリポソーム表面に被検物質と特異的に結合する物質を結合させ、固相表面に被検物質もしくは被検物質の一部を固定化する。それに対し、方法(A)ではリポソーム表面に被検物質もしくは被検物質の一部を結合させ、固相表面に被検物質と特異的に結合する物質を固定化する。方法(A’)の実施に際して、方法(A)についての説明を参照することができる。
下記工程:
(d)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、被検物質とを反応させ、
(e)被検物質が結合したリポソームを、被検物質が結合していないリポソームから分離し、次いで、
(f)被検物質が結合したリポソームあるいは結合していないリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法である。
参考例、実施例中で使用する略号は以下の意味を有する。
BSA:ウシ血清アルブミン
PBSまたはPB:リン酸緩衝食塩水
DPPE:ホスファチジルエタノールアミンジパルミトイル
DPPC:ホスファチジルコリンジパルミトイル
SPDP:N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
DTP−DPPE:N−3−(2−ジチオピリジル)プロピオニル ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン
DTT:ジチオソレイトール
WSC:水溶性カルボジイミド
NHS:N−ヒドロキシスクシンイミド
DMF:ジメチルホルムアミド
TLC:薄層クロマトグラフィー
PB:リン酸緩衝液
この実施例は上記方法Aに関するものである。
(1)DPPEの活性化(DTP−DPPE調製)
10μmolのDPPE(6.9mg/700μL(CHCl3:CH3OH=9:1))と12μmolのSPDP(3.7mg/300μL(CH3OH))さらに300μmolのトリエチルアミン(2.8μL/200μL(CHCl3))を加え、室温で2時間かく拌しながら反応させた。ついで、PB(0.1M、pH7.4)を2mL加え、かく拌後、振とうすると2層に分かれるので、その水層を除去した。この操作を3回繰り返した後、得られた下層(クロロホルム層)をN2気流下でエバポレートし溶媒を留去した。得られた活性型のDTP−DPPEを濃度が4mMになるようにクロロホルム:メタノール=9:1溶液で溶解した。
(2)DTP−DPPEを含むリポソームの調製
DPPC10μmol、コレステロール5μmol、DTP−DPPE 0.15μmolから脂質フィルムを形成し、参考例3に示す方法により合成したビス(2,2’−ビピリジン)−[4,4’−ビス(4−アミノブチル)−2,2’−ビピリジン]ルテニウム(II)錯体(5mM)を含む1mL PBを加え水和し、多重層リポソームを得た。超音波を10分間照射し、さらに遠心によりチタンを取り除いた後、ゲルろ過クロマトグラフィーし、リポソームを得た。
(3)抗体の活性化
1mg(5.2x10−9mol)/1mL(PB)のヘマグルチニン抗体に、1.3μL(2.6x10−8mol)の20mMSPDP架橋剤を加え(mol比でSPDP:ヘマグルチニン抗体=5:1)、室温で30分間インキュベートした。この反応溶液を3日間4℃で透析した(再生セルロース分画分子量:1000ダルトン)。透析外液は酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5)を用いた。ついで、50mM DTT500μLとSPDP修飾抗体1mLを混ぜ、室温30分間インキュベートし、SPDP部位を還元する。ゲルろ過クロマトグラフィー(セファデックスG−25)により、PB(pH7.4)で溶出し、活性化抗体を得た。
(4)活性部位をもつリポソームと活性化ヘマグルチニン抗体の結合
PB(pH7.4)溶液中、リポソーム(DTP−DPPEとして5x10−5M)と活性化ヘマグルチニン抗体(200μg/mL=1.3x10−6M)を窒素雰囲気下、室温で24時間反応させた。ついで、ゲルろ過クロマトグラフィー(セファロース4B)により、PB(pH7.4)で溶出して遊離した抗体を除去し、ヘマグルチニン抗体結合リポソームを得た。
(1)電極をピラニヤ洗浄(H2SO4:H2O2=3:1、1分)の溶液を4μL、作用電極上に滴下し、蒸留水で洗浄し、風乾した。
(2)ジチオジブタン酸(DTBA)71.5mg(2.52×10−4mol)/30mL EtOH溶液を調製し、電極を7mLの溶液中(シャーレ中)に浸して12時間室温で緩やかにかく拌した(SAMの形成)。反応後、EtOHで洗浄した。
(3)WSC 50mg(2.61×10−4mol)、NHS 30mg(2.61×10−4mol)/10mL PB溶液を調製し、電極を10mLの溶液中(シャーレ中)に浸して1時間室温で緩やかにかく拌した(カルボキシル基の活性化)。反応後、PB溶液で洗浄した。
(4)抗原ペプチド1mg(4.74×10−7mol)/100mL PBS溶液を調製し、電極を10mL溶液に浸して4℃、15時間緩やかにかく拌する(抗原の固定化)。反応後、PB溶液で洗浄した。
(5)2−アミノエタノール61.0mg(1.0×10−3mol)/10mL PB溶液を調製し、電極を10mL溶液に浸して4℃、1時間緩やかにかく拌した(ブロッキング)。反応後、常温に戻して0.02%Tween20含有PB溶液で洗浄した。
(6)電極を風乾し、測定部位以外をシリコンシートで覆った。電極のウェルに種々の濃度の抗原ペプチド溶液(50μL)を入れ、次にリポソーム溶液10μLを入れて室温で1時間競合反応した。
(7)電極ウェルの溶液を取り除き、PB溶液で洗浄後、0.1M電解質溶液(0.1M TEA+0.1M PBS)60μLを入れECL測定した。印加電圧は+1.3V(vs.金電極)であった。
(8)図1の結果が得られた。被検試料中の抗原ペプチド濃度と電解発光強度との間に負の相関関係が認められ、この系を用いて、被検試料中の抗原ペプチド量をfg〜pgオーダーで測定できることがわかった。
この実施例は上記方法Aに関するものである。上記と同じリポソーム調製操作を行い、測定操作では上記測定操作(4)の一部が異なる((4’))。
(4’)ヘマグルチニンタンパク溶液(16.8μg/mL)を50μLずつ作用極に滴下し、4℃、15時間緩やかにかく拌した(抗原の固定化)。反応後、PB溶液で洗浄した。
その後の測定操作は同じあり、図2に示す結果が得られた。被検試料中のヘマグルチニンタンパク濃度と電解発光強度との間に負の相関関係が認められ、この系においても、被検試料中のヘマグルチニンタンパク量をfg〜pgオーダーで測定できることがわかった。
この実施例は上記方法Bに関するものである。
(1)上記と同じリポソーム調製操作を行った。
(2)マイクロチューブ内に各種濃度のヘマグルチニン溶液50μLとリポソーム溶液10μLを加え、30℃1時間インキュベートした。
(3)トリス−塩酸(pH7〜9)緩衝溶液を移動相としたキャピラリー電気泳動装置(フューズドシリカ 75μmx60cm、12kV)に(2)の溶液を注入した。
(4)電気泳動により分離したリポソームの各成分を白金電極上で酸化(1.2V vs. Ag/AgCl)し、電解発光を測定した。
(5)タンパクとの未結合リポソームあるいはタンパク結合リポソームの発光強度を利用してタンパクHA2の検量線を得た(図3)。なお縦軸は、すべてのリポソームに起因する発光シグナルのピーク面積に対するHA2未結合リポソームのピーク面積の割合(%)である。
Claims (17)
- 下記工程:
(i)電解発光物質を内封するリポソームの表面上で被検物質もしくは被検物質の一部とそれに特異的に結合する物質とを反応させ、ここで被検物質もしくは被検物質の一部またはそれに特異的に結合する物質のいずれかがリポソーム表面上に結合されており、次いで、
(ii)該反応が表面上で起こったリポソーム、または該反応が表面上で起こらなかったリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含み、リポソームの破壊を伴わないことを特徴とする、被検物質のアッセイ方法。 - 下記工程:
(a)被検物質もしくは被検物質の一部を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、リポソームに結合されていない被検物質とを、固相表面に固定化された被検物質もしくは被検物質の一部と特異的に結合する物質と反応させ、
(c)該固相表面上の被検物質と特異的に結合する物質に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 工程(a)と工程(c)との間に、工程(b):
被検物質と特異的に結合する物質が結合したリポソームを、被検物質と特異的に結合する物質が結合していないリポソームから分離する
を含む、請求項2記載の方法。 - 工程(a)において固相が電極であり、工程(c)において電極に電圧を印加することによりリポソームに電圧が印加されることを特徴とする、請求項2または3記載の方法。
- 電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーにて行う請求項4記載の方法。
- 下記工程:
(a’)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームを、固相表面に固定化された被検物質もしくは被検物質の一部および固相表面に固定化されていない被検物質と反応させ、
(c’)該固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合したリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、固相表面に固定化されていない被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 工程(a’)と工程(c’)との間に、工程(b’):
固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合したリポソームを、固相表面上の被検物質もしくは被検物質の一部に結合しなかったリポソームから分離する
を含む、請求項6記載の方法。 - 工程(a’)において固相が電極であり、工程(c’)において電極に電圧を印加することによりリポソームに電圧が印加されることを特徴とする、請求項6または7記載の方法。
- 電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーにて行う請求項8記載の方法。
- 下記工程:
(d)被検物質と特異的に結合する物質を表面に有し、電解発光物質を内封するリポソームと、被検物質とを反応させ、
(e)被検物質が結合したリポソームを、被検物質が結合していないリポソームから分離し、次いで、
(f)被検物質が結合したリポソームあるいは結合していないリポソームに電圧を印加して電解発光強度を測定する
を含む、被検物質の検出または定量方法であって、リポソームの破壊を行わないことを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 工程(e)が電気泳動、クロマトグラフィーまたは膜分離を用いて行われる、請求項10記載の方法。
- 電解発光物質がルテニウム(II)錯体である請求項1ないし11のいずれか1項記載の方法。
- ルテニウム(II)錯体がトリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)錯体であって、ピリジン部分がヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基を有する側鎖を1〜6個有していてもよいものである、請求項12記載の方法。
- ルテニウム(II)錯体が、トリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−{4,4’−ビス[フタルイミノブチル]−2,2’−ビピリジン}ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−[4,4’−ビス(4−アミノブチル)−2,2’−ビピリジン]ルテニウム(II)錯体、ビス(2,2’−ビピリジン)−(4−アミノブチル−4’−メチル−2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)錯体、またはビス(2,2’−ビピリジン)−[2,2’−ビス(4−メルカプトブチル)−2,2’−ビピリジン]ルテニウム(II)錯体である、請求項13記載の方法。
- 被検物質と被検物質と特異的に結合する物質との反応が、抗原抗体反応であるか、あるいはリガンドと受容体の反応である、請求項1ないし14のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載の方法による被検物質の検出または定量に用いられる、請求項12ないし14のいずれか1項記載の電解発光物質を内封したリポソーム試薬であって、電解発光反応に際して破壊する必要のないリポソーム試薬。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載の方法による被検物質の検出または定量に用いられる、請求項12ないし14のいずれか1項記載の電解発光物質を内封したリポソーム試薬を必須成分として含むアッセイキットであって、電解発光反応に際してリポソームを破壊しないことを特徴とするアッセイキット。
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