JPH05180773A - ルミネセンスを利用する分析方法 - Google Patents

ルミネセンスを利用する分析方法

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JPH05180773A
JPH05180773A JP4131039A JP13103992A JPH05180773A JP H05180773 A JPH05180773 A JP H05180773A JP 4131039 A JP4131039 A JP 4131039A JP 13103992 A JP13103992 A JP 13103992A JP H05180773 A JPH05180773 A JP H05180773A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 被検物質の含有が疑われるメジウム中の被検
物質の測定方法を提供する。 【構成】 被検物質の含有が疑われるメジウムを、被検
物質が存在すれば、フォトセンシタイザーと化学ルミネ
ッセンス化合物の接する近位への移動が起こる条件下に
処理することからなる。フォトセンシタイザーは一重項
酸素を発生し、接する近位に存在する化学ルミネッセン
ス化合物を活性化する。ついで、活性化された化学ルミ
ネッセンス化合物が光を生成する。生成した光の量はメ
ジウム中の被検物質の量に相関する。フォトセンシタイ
ザーおよび化学ルミネッセンス化合物の少なくとも一方
は、好ましくは、通常懸濁可能な粒子とその表面で会合
し、それには特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーが結合
している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
１．発明の技術分野 本発明は試料中の被検物質を定量する方法、組成物、お
よびキットに関する。とりわけ本発明は別個の段階を必
要としない特異的結合に基づく検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床診断分野は近年、容易にかつ正確に
定量しうる物質（被検物質）の多様性ならびにその定量
法の両方に関して幅広い拡張をみた。液体中の低濃度の
物質の存在を検出する便利で信頼できる危険のない手段
が望まれている。臨床化学においてこれらの物質は体液
中に１０-12 モル以下の濃度で存在することがある。こ
れら低濃度物質を検出することのむずかしさは利用でき
る試料の量が比較的小さいことによって一層増大する。
【０００３】一検定法を開発する際には多くのことを考
慮しなければならない。一つの考慮すべきことは、被検
物質の濃度変化に対する信号の応答である。第二の考慮
すべきことは、検定に対する実験計画案を容易に実施し
うることである。考慮すべきことの第三は、試料毎の妨
害物質の変動である。試薬の調製および精製の容易なこ
と、装置の入手性、オートメ化の容易なことおよび対象
物質との相互作用も、有用な検定法を開発する上で更に
考慮すべき諸問題である。
【０００４】一つの幅広い技術のカテゴリーは、被検物
質の存在の関数として標識されたリガンドの特別な場所
の極性組織へ特異的に結合しうる受容体を使用すること
である。受容体による観察された結合効果は左右され
る。ある場合には、受容体の結合は単に結合した標識リ
ガンドと非結合標識リガンドとの間の分子量の差を与え
るだけである。他の場合には、
【０００５】受容体の結合は、結合した標識リガンドと
遊離標識リガンドとの分離を促進するか、あるいは標識
リガンドに結合した受容体の量によって信号が変化する
ように標識から得られる信号の性質に影響するかもしれ
ない。更に一つの変法は受容体を標識しリガンドを標識
しないことである。他方、受容体およびリガンド両方を
標識するか、または異なる受容体を二つの異なる標識で
標識する。このようにすると、これら標識がごく接近し
ているときには相互作用が起こり、存在するリガンド
【０００６】の量は受容体の標識が相互作用しうる度合
に影響を及ぼす。広範囲の異なるリガンドに適合しうる
正確な新規技術に対し、あるいは他の方法が容易に適合
し得ない特別な場合に使用できる正確な新規技術に対し
絶えざる要望がある。
【０００７】均一系免疫検定法が小さい分子を対象とし
て以前から記述されて来た。これら検定法の例として、
特にＳＹＶＡ′Ｓ ＦＲＡＴTM検定、ＥＭＩＴTM検定、
酵素チャンネリング免疫検定、および蛍光エネルギー移
動免疫検定（ＦＥＴＩ）、酵素阻害物質免疫検定（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ ａｎｄ ＡｂｂｏｔｔＬ
ａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ）：蛍光偏光免疫検定（Ｄａｎ
ｔｌｉｃｋｅｒ）があげられる。これらの
【０００８】方法はすべて感度が限られていて、ＦＥＴ
Ｉおよび酵素チャンネリング法を含む少数だけが大きい
多重エピトープ性被検物質に対し適している。
【０００９】発光性化合物、例えば蛍光性化合物および
化学発光性化合物は、光を放出するその能力の故に検定
分野で広い応用が見出されている。この理由のため、核
酸検定および免疫検定のような検定における標識として
発光物質が利用されて来た。例えば、幾つかの特異的結
合対を発光物質と抱合させ、種々な実験計画が用いられ
ている。この発光物質抱合体を、被検物質を含むことが
予想される試料中の被検物質の量と関連させて固相と液
相との間に分配できる。これら相のいずれかのルミネッ
センスを測定することにより、観察されたルミネッセン
スのレベルと試料中の被検物質の濃度とを関連づけるこ
とができる。
【００１０】リポソームおよび赤血球ゴーストといった
粒子がカプセル化した水溶性物質の担体として利用され
て来た、例えば、生物活性物質を種々な用途に向けて、
例えばある薬剤をリポソーム調製中にトラップし次に処
置すべき患者へ投与する薬物投与方式に向けて、カプセ
ル化するためにリポソームが使用された。
【００１１】ラテックスビーズおよびリポソームといっ
た粒子も検定に利用されて来た。例えば、均一系検定法
において、抗体または抗原で標識したリポソームの水相
に酵素をトラップすることができる。リポソームは試料
および補体の存在下で酵素を遊離させる。水相中にカプ
セル化された水溶性蛍光染料または非蛍光染料を有
【００１２】する、あるいは脂質小胞の脂質二重層中に
溶解した脂溶性染料を有する抗体−または抗原−標識リ
ポソームも、この表面に結合した抗体または抗原と免疫
化学反応に入りうる被検物質に対する検定に利用されて
来た。リポソームの水相から染料を解放するために染浄
剤が使われた。
【００１３】化学発光標識は配位子結合検定法で顕著な
感度を示すが、一つ以上の化学的活性化工程を必要とす
るのが普通である。蛍光性標識はこの欠点をもたないが
感度が低い。
【００１４】結合する相手と共有結合でつながる基が化
学的活性化によって光を発する免疫検定および核酸検定
に対し化学発光標識が記述された。アクリジニウムエス
テルを利用する核酸検定キットがＧｅｎｐｒｏｂｅ（Ｐ
ａｃｅ２ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商品名）、サン ジェ
ゴ、カリフォルニア州）により販売され、またこの型の
標識を使用するＭａｇｉｃＬｉｔｅ（登録商品名）免疫
検定キットがＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（バーゼル、スイ
ス）により売り出されている。
【００１５】標識された核酸プローブから第二のプロー
ブに結合された蛍光性受容体へのエネルギー移動がサン
ドイッチ核酸検定に対してＨｅｌｌｅｒ等、ＩおよびＩ
Ｉ（以下に述べる）により記述された。Ｍａｇｇｉｏ
Ｉ（以下に述べる）は免疫検定に対する同様な手順を述
べている。ポリヌクレオチドに共有結合した発光物質か
ら、間に挿入された発蛍光団へのエネルギー移動がＨｅ
ｌｌｅｒ等、ＩＶ（以下に述べる）により記述されてい
る。
【００１６】間に挿入された染料からポリヌクレオチド
上の蛍光物質への移動は最近Ｃａｒｄｕｌｌｏ等（後
述）により記述された。更にＭｃ Ｃａｐｒａ（後述）
は、標識としての光増感剤（フォトセンシタイザー）の
使用を記載しており、この場合光増感剤は酸素をその一
重項状態に活性化し、次にこの一重項状態の酸素が加熱
により光を発する化合物と反応する。
【００１７】２．関連技術の簡単な説明 欧州特許願第０，３４５，７７６号明細書（Ｍｃ Ｃａ
ｐｒａ）は、標識として増感剤を利用する特異的結合検
定を開示している。この増感剤は、一つ以上の波長の放
射線で、または他の化学的あるいは物理的刺激（例え
ば、電子移動、電気分解、エレクトロルミネッセンスま
たはエネルギー移動）で励起することによって刺激され
たとき励起状態に達し、そしてこの状態は（イ）分子状
の酸素との相互作用により一重項分子酸素をつくり出
す、あるいは（ロ）ロイコ染料との相互作用によって還
元形（これは分子状の酸素との相互作用によりもとの非
励起状態に戻り、結果として過酸化水素を生ずる）をと
るというどの部分も包含している。
【００１８】励起された増感剤との相互作用はいずれも
試薬の添加により検知可能な信号を発生する。欧州特許
願第０，０７０，６８５号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、
Ｉ）は非放射性エネルギー移動による均質核酸ハイブリ
ッド形成診断法を記載している。
【００１９】光放出ポリヌクレオチドハイブリッド形成
診断法は欧州特許願第０，０７０，６８７号明細書（Ｈ
ｅｌｌｅｒ等、ＩＩ）に記載されている。
【００２０】欧州特許願第０，２３２，９６７号明細書
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｉ）は標的のポリヌクレオチドら
せんに対する検定を行なうための方法と組成物を記載し
ている。その方法は第一および第二のポリヌクレオチド
プローブを含む試薬と試料とを接触させるものである。
これら第一および第二のプローブは、プローブが互に拘
束
【００２１】される最初の位置およびプローブが標的に
結合される第二の位置をとりうる。これらプローブはそ
れがこれら二つの位置の一つに存在することを表示する
信号を生ずるように相互作用しうる標識部分を含む。
【００２２】欧州特許願第０，３１５，３６４号明細書
は、液体中の抗原または抗体の存在あるいは濃度を決定
する免疫化学検定法を記載している。この検定法は、
（イ）第一の標識された抗体または抗原、第二の標識抗
体または抗原、および測定しようとする抗原または抗体
の３成分複合体をつくり、そして（ロ）抗原物質に結合
された相互の接近により高められた第一の標識と第二の
標識との間の相互作用により、少なくとも一つの基質の
存在下で生ずる信号を検知する、ことからなる。
【００２３】欧州特許願第０，２２９，９４３号明細書
（Ｈｅｌｌｅｒ等、ＩＩＩ）は、ポリヌクレオチドハイ
ブリッド形成検定法に対する蛍光ストークスシフトプロ
ーブを記載している。
【００２４】米国特許第４，２２６，９９３号明細書
（Ｂｕｃｋｌｅｒ等）は、化学発光性フタルヒドラジド
で標識した抱合体の合成中間体として有用な免疫機能を
与えたフタルヒドラジドを記載している。この抱合体
は、液体媒質中で配位子あるいはその特異的な結合相手
を測定するための特異的結合検定法における試薬として
役立つ。
【００２５】米国特許第４，３８０，５８０号および第
４，３８３，０３１号明細書（Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ
等、ＩおよびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、ＩＩ）はそれぞ
れ不均質および均質化学発光特異的結合検定法を記載し
ている。
【００２６】米国特許第４，２２０，４５０（Ｍａｇｇ
ｉｏ Ｉ）は化学的に誘導される蛍光免疫検定法を記載
している。
【００２７】米国特許第４，６５２，５３３号明細書
（Ｊｏｌｌｅｙ）は発光性標識を取り込んだ固相免疫検
定法を記載している。
【００２８】米国特許第４，２７７，４３７号明細書
（Ｍａｇｇｉｏ ＩＩ）は化学的に誘導された蛍光免疫
検定法を実行するためのキットを記載している。
【００２９】Ｈｅｌｌｅｒ等（ＩＶ）は、「Ｒａｐｉｄ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔ
ｓ」（１９８５），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．，２４５〜２５７頁で、ＤＮＡハイブリッド形成
方式のための化学発光性および蛍光性プローブを記載し
ている。
【００３０】Ｈａｒａ等は、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｊｐｎ．（１９８４）５７：３００９〜３０１０
で、化学発光触媒として金属錯体化合物を使用する免疫
検定法を述べている。
【００３１】Ｋｕｓｃｈｎｉｒ等は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９６９）１９３．
において、６−アミノフタラジン−１，４−（２Ｈ３
Ｈ）−ジオン中ルミノールの光増感化学発光を記載して
いる。
【００３２】非放射性蛍光滞留エネルギー移動による核
酸ハイブリッド形成の検出法がＣａｒｄｕｌｌｏ等によ
りＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．（１９８８）８５：８７９０〜８７９４に記載され
ている。
【００３３】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）１８３：
２３１〜２４４の中で、相互作用のある蛍光標識および
競合的ハイブリッド形成を用いるポリヌクレオチドの溶
液相検出法を述べている。
【００３４】Ｚｏｍｅｒ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ（１９８９）２２７：１１〜１
９の中で、化学発光標識を述べている。
【００３５】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＩＩは、Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）１７
４：１０１〜１２０の中で、エネルギー移動の時間分割
検出法：理論および免疫検定への応用を述べている。
【００３６】米国特許第４，２９９，９１６号明細書
（Ｌｉｔｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法においてある表面
上での優先的信号生成を記載している。米国特許第４，
２３３，４０２号明細書（Ｍａｇｇｉｏ等）はチャンネ
リングを使用する試薬および方法を記載している。
【００３７】米国特許第４，２６１，９６８号明細書
（Ｕｌｌｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法における免疫学的
対による蛍光消光を記載している。
【００３８】米国特許第４，３１８，７０７号明細書
（Ｌｉｔｍａｎ等、ＩＩ）は特異的受容体検定法におけ
る高分子蛍光消光剤粒子を記載している。
【００３９】米国特許第４，６５０，７７０号明細書
（Ｌｉｕ等）は、発光競合タンパク質結合検定法におけ
るエネルギー吸収粒子による消光を記載している。
【００４０】米国特許第４，６５４，３００号明細書
（Ｚｕｋ等）は蛍光マイクロビーズ消光検定法を記載し
ている。米国特許第４，１７４，３８４号明細書（Ｕｌ
ｌｍａｎ等、ＩＩ）は免疫検定法における免疫学的対に
よる蛍光消光を記載している。
【００４１】米国特許第４，１９３，９８３号明細書
（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＩＩ）は標識したリポソーム粒子
組成物およびそれによる免疫検定法を開示している。
【００４２】米国特許第４，１９９，５５９号および第
３，９９６，３４５号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＶお
よびＶ）は、免疫検定法における免疫学的対による蛍光
消光を記載している。
【００４３】Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，（１９８５）、３１（９），１４２４−１４２６
は、リポソームの水相中にトラップされた染料を有する
大きい単層リン脂質小胞を利用するジゴキシンの比色免
疫検定法を開示している。
【００４４】特許第３，８５０，５７８号（Ｍｃ Ｃｏ
ｎｎｅｌｌ）、第４，４８３，９２１号（Ｙａｖｅｒｂ
ａｕｍ）、および第４，４８３，９２９号明細書（Ｓｚ
ｏｋａ）は、抗原または抗体が脂質小胞の表面に結合さ
れる免疫反応性リポソーム試薬を開示している。
【００４５】米国特許第４，５２９，５６１号（Ｈｕｎ
ｔ等）、第４，５２２，８０３号（Ｌｅｎｋ等）および
第４，４８５，０５４号明細書（Ｍｅｚｅｉ等）は脂質
小胞を調製する種々な方法を記載している。
【００４６】米国特許第４，３１１，７１２号明細書
（Ｅｖａｎｓ等）は凍結乾燥リポソーム混合物の調製法
を開示している。米国特許第４，５８８，５７８号明細
書（Ｆｏｕｎｔａｉｎ等）は単相脂質小胞の製造法およ
び薬物投与系におけるこのような小胞の使用を開示して
いる。
【００４７】米国特許第４，５７６，９１２号明細書
は、多数の発蛍光団を付けたある種の長鎖担体を使用す
る免疫検定の蛍光レベルを高める方法を開示している。
【００４８】米国特許第４，８９１，３２４号明細書は
検定用に発光物質を有する粒子を記載している。植物に
有毒なリポソームによるＴリンパ球の選択的殺細胞がＹ
ｅｍｕ等（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２４６−２５０により記述
されている。
【００４９】Ｍｅｗ等はＪ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ，１３０（３）：１４７３−１４７７（１９８３）の
中で光免疫療法：腫瘍特異的モノクローン抗体−ヘマト
ポルフィリン抱合体を用いる動物腫瘍の治療を開示して
いる。
【００５０】小さい単分子の光学顕微鏡による観察がＨ
ｉｒｓｃｈｆｅｌｄ（１９７６）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐ
ｔｉｃｓ，１５（１２）：３１３５−３１３９により論
議されている。欧州特許願第０，３２２，９２６号明細
書（Ｍｃ Ｃａｐｒａ等）は改良化学発光エステル類、
チオエステル類、およびアミド類を利用する検定法を記
載している。
【００５１】欧州特許願第０，３５２，７１３号明細書
（Ｓｃｈａａｐ）は１，２−ジオキセタン類からの化学
発光を高める方法と組成物を記載している。
【００５２】米国特許第４，９７８，６１４号明細書
（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）はジオキセタン類の酵素誘導分
解を用いる物質検出法を開示している。Ｂｒｏｎｓｔｅ
ｉｎ等（米国特許第４，９５６，４７７号明細書）は
１，２−ジオキセタン類の合成法を述べている。
【００５３】Ｓｃｈａａｐ等はＷＯ第９０／０７５１１
号の中で拘束蛍光物質へのエネルギー移動を通して１，
２−ジオキセタン類からルミネッセンスの増強を記載し
ている。
【００５４】米国特許第４，９５９，１８２号明細書
（Ｓｃｈａａｐ）は、１，２−ジオキセタン類からの化
学発光を増大させる方法ならびに組成物を開示してい
る。米国特許第４，９６２，１９２号（Ｓｃｈａａｐ）
および第４，８５７，６５２号明細書（Ｓｃｈａａｐ）
は化学発光を示す１，２−ジオキセタン化合物を記載し
ている。
【００５５】Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等は米国特許第４，９
３１，２２３号明細書中で化学発光を示す１，２−ジオ
キセタン類を使用する方法を述べている。ＷＯ第９０／
０２７４２号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）には安定な水溶性ジ
オキセタン類の精製法が開示されている。縮合多環式環
を含む新規な化学発光性１，２−ジオキセタン類および
それを用いる検定法がＷＯ第９０／００１６４号（Ｅｄ
ｗａｒｄｓ等）に記載されている。
【００５６】ＷＯ第８９／０６２２６号（Ｅｄｗａｒｄ
ｓ等）は１，２−ジオキセタン類およびその中間体の合
成を記載している。Ｎｅｃｋｅｒｓ等は米国特許第４，
３１５，９９８号明細書中で重合体に結合させた光増感
触媒を述べている。
【００５７】ジオキセタン類の酵素誘導分解を使用する
物質検出法がＷＯ第８８／００６９５号（Ｂｒｏｎｓｔ
ｅｉｎ等）に記載されている。欧州特許願第０，３２
４，２０２号明細書（Ｚｏｍｅｒ等）は化学発光標識物
としてアクリジニウム化合物を開示している。欧州特許
願第０，１４４，９１４号明細書（Ａｌｂｅｒｅｌｌａ
等）は、ハイブリッド結合試薬の標識対を用いるハイブ
リッド形成検定法を記載している。
【００５８】欧州特許願第０，４０１，００１号明細書
（Ｕｒｄｅａ等）は、化学発光性二重トリガー１，２−
ジオキセタン類を記載している。
【００５９】
【発明の開示】課題を解決するための手段 本発明は被検物質の定量法に関する。
【００６０】本発明の一面は被検物質を定量する方法で
あり、本法は被検物質を含むと思われる媒質を（メジウ
ム）を、本質的に準安定な化学種を生ずるように処理す
ることからなる。この化学種は媒質中に拡散し、そして
被検物質存在のために前記化学種にごく接近した準安定
化学種と反応することのできる媒質中のある物質と選択
的に反応することができる。本法は更に前記化学種が物
質と反応したかどうかを決定することからなる（その反
応が媒質中の被検物質の量を表示する）。
【００６１】本発明のもう一つの具体例は、液体媒質中
の被検物質に対する検定法の改良である。この検定法
は、被検物質を含むと思われる媒質を処理して被検物質
の存在と関連した特異的結合対（ｓｂｐ）複合体を形成
せしめ、そしてこの複合体が形成されたかどうかを測定
する工程からなる。
【００６２】その改良点は媒質を（１）特異的結合対の
構成要素と関連する光増感剤と、そして（２）ｓｂｐ構
成要素（ｓｂｐメンバー）と関連する化学発光性化合物
とを一緒にすることからなり、この光増感剤の活性化に
より化学発光性化合物から放出される光の量は媒質中の
被検物質の量と関係づけられる。
【００６３】本発明方法のもう一つの具体例は、被検物
質が、もし存在するとすれば、光増感剤および化学発光
性化合物を非常に接近させるような条件下で、被検物質
を含むと思われる媒質を処理することからなる。結果と
して、光増感剤によりつくり出された一重項酸素が化学
【００６４】発光性化合物を活性化し、これがその後光
あるいはルミネッセンスを発する。発生する光の量は媒
質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６５】もう一つの具体例をあげると、被検物質を
測定するための本発明方法は、第一段階として被検物質
を含むと思われる媒質、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成
要素と関連をもつ光増感剤、および化学発光性化合物を
含有してなる懸濁性粒子からなるコンビネーションを提
供することからなる。
【００６６】この懸濁性粒子はそれに結合した（ｓｂ
ｐ）構成要素を有する。このコンビネーシヨンを処理し
て光増感剤を励起させると、その励起状態で光増感剤が
酸素を活性化し一重項状態にすることができる。次にコ
ンビネーションを発せられたルミネッセンスの量につい
て調べる。このようなルミネッセンスの量は媒質中の被
検物質の量と関係づけられる。
【００６７】別法として、化学発光性化合物をｓｂｐ構
成要素と併合し、懸濁性粒子が光増感剤を含有しかつそ
れに結合したｓｂｐ構成要素を有するようにすることが
できる。
【００６８】もう一つの具体例はコンビネーションを与
える被検物質の測定法である。このコンビネーションは
被検物質を含むと思われる媒質、第一のｓｂｐ構成要素
と併合させた光増感剤、および第二のｓｂｐ構成要素と
併合させた化学発光性化合物からなる。次に光増感剤を
励起させるとこれが酸素を活性化して一重項状態とし、
この一重項酸素が光増感剤と接近して存在する化学発光
性化合物を活性化する。コンビネーションから発せられ
たルミネッセンスは被検物質の量と関係づけられる。
【００６９】もう一つの具体例は被検物質の測定法であ
る。本法は、被検物質を含むと思われる試料、添加され
た化学発光性物質および結合したｓｂｐ構成要素を有す
る第一の懸濁性粒子、および粒子がそれに結合されたｓ
ｂｐ構成要素を有
【００７０】する場合に酸素を活性化してその一重項状
態にすることのできる光増感剤を添加した第二の懸濁性
粒子を水性媒質中で合わせることからなる。次に、この
媒質を照射して酸素の一重項状態をつくり出し、媒質か
ら発せられたルミネッセンスの量を測定する。このよう
なルミネッセンスの量を媒質中の被検物質の量と関連づ
ける。
【００７１】本発明のもう一つの具体例は、化学発光性
化合物を添加した懸濁性粒子からなる組成物に関し、こ
の場合、前記粒子はそれに結合したｓｂｐ構成要素を含
有する。更に本組成物は光増感剤を添加した懸濁性粒子
からなることができる。
【００７２】本発明のもう一つの具体例は（１）化学発
光性化合物を有する懸濁性粒子（この場合、粒子はそれ
に結合されたｓｂｐ構成要素を含有する）および（２）
光増感剤を含む組成物を包装されたコンビネーション中
に含有してなるキットに関する。このキットは光増感剤
を含有してなる第二の懸濁性粒子（この場合、前記粒子
はそれに結合されたｓｂｐ構成要素を有する）からなる
組成物を更に包含することができる。
【００７３】もう一つの具体例をあげると、このキット
は（１）第一のｓｂｐ構成要素と併合された化学発光性
化合物および（２）その励起状態において、第二のｓｂ
ｐ構成要素と併合された酸素をその一重項状態に活性化
することのできる光増感剤からなる。
【００７４】本発明のもう一つの具体例は、（１）被検
物質を含むと思われる媒質、（２）光化学的に活性化で
きる化学発光性化合物と併合させた第一の特異的結合対
（ｓｂｐ）構成要素からなる標識試薬を用意し、第一の
ｓｂｐ構成要素は被検物質または第二のｓｂｐ構成要素
に結合して被検物質の存在と関係づけられる複合体を形
成しうるものであり、前記化学発光性化合物を光化学的
に活性化し、そして化学発光性化合物により発生するル
ミネッセンスの量を検知することからなり、このルミネ
ッセンスの量は媒質中の被検物質の量と関係づけられ
る。
【００７５】もう一つの具体例をあげると、被検物質を
測定するための本発明方法は、第一段階として（１）被
検物質を含むと思われる媒質、および（２）光化学的に
活性化しうる化学発光性化合物に結合された特異的結合
対の構成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬を、
前記標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被
検物質の存在と関係をもって形成される条件下に、検定
媒質中で一緒に合わせることからなる。検定媒
【００７６】質を光照射して光化学的に活性化しうる化
学発光性化合物を活性化する。検定媒質を発光について
調べる。このような信号発光の存在または強度を前記媒
質中の被検物質の量と関係づける。化学発光性化合物か
らのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる。媒
質中にエネルギー受容体を加えておく。
【００７７】もう一つの具体例は被検物質の定量法であ
る。この方法は（１）被検物質を含むと思われる媒質、
（２）光または一重項酸素と反応したとき化学発光しう
る化合物に結合された特異的結合対の第一の構成要素
（ｓｂｐ構成要素）、および（３）第二のｓｂｐ構成要
素に結合されたエネルギー受容体、あるいは結合するよ
うになる可能性のあるエネルギー受容体からなる不溶化
試薬を水性媒質中で同時にあるいは全体的にあるいは部
分的に順次に合わせることからなる。標識試薬が媒質中
の被検物質の存在
【００７８】との関係で形成され、化学発光性化合物か
らのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる条件
を選ぶ。前記化合物は光あるいは一重項酸素によって活
性化される。検定媒質をルミネッセンスについて調べ、
その存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量と関係づ
ける。
【００７９】本発明のもう一つの具体例は被検物質の定
量法であり、本法は（イ）（１）被検物質を含むと思わ
れる媒質、（２）一重項酸素と反応したとき化学発光を
起こしうる化合物に結合された特異的結合対の第一の構
成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬、（３）一
重項酸素発生剤、および（４）第二のｓｂｐ
【００８０】構成要素に結合された、あるいは結合する
ようになる可能性のあるエネルギー受容体からなる試薬
を、標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被
検物質の存在との関係で形成されそして化学発光性化合
物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化するこ
とができる条件下に、検定媒質中で同時にあるいは全体
的にあるいは部分的に順次合わせ、（ロ）一重項酸素発
生体を活性化し、そして（ハ）検定媒質を信号について
調べ、信号の存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量
と関係つげることからなる。
【００８１】本発明のもう一つの具体例はポリヌクレオ
チド被検物質の定量法であり、そして本法は（イ）
（１）ポリヌクレオチド被検物質を含むと思われる試料
および（２）ポリヌクレオチドに結合された光化学的に
活性化しうる化学発光性化合物からなる標識試薬（その
少なくとも一部分は前記ポリヌクレオチド被検物質でハ
イブリッド形成できる）を、標識試薬が、もし存在する
とすればポリヌクレオチド被検物質とハイブリッド形成
する条件下に、検定媒質中で合
【００８２】わせ、（ロ）検定媒質を照射して光化学的
に活性化しうる化学発光性化合物を活性化し、そして
（ハ）媒質のルミネッセンスを測定することからなる。
このルミネッセンスの量を試料中の被検物質の量と関係
づける。
【００８３】本発明のもう一つの具体例はｓｂｐ構成要
素に結合された光化学的に活性化しうる化学発光性化合
物からなる組成物である。本発明のもう一つの具体例は
このような組成物を含有してなるキットである。
【００８４】図面の記述
【００８５】図１はビタミンＢ12の検定結果のグラフに
よる描写である。図２はジゴキシンの検定結果のグラフ
による描写である。
【００８６】図３は本発明によるＨＣＧの検定結果のグ
ラフによる描写である。図４は本発明による試験結果の
グラフによる描写である。
【００８７】図５は本発明によるＴＳＨに対する検定結
果のグラフによる描写である。図６は図５のグラフによ
る描写の一部である。
【００８８】図７は本発明によるＨＣＧに対する別の検
定結果のグラフによる描写である。図８はＤＮＡハイブ
リッド検出検定の結果のグラフによる描写である。
【００８９】図９は合成標的の検出結果のグラフによる
描写である。図１０は全トリヨードチロニン検定のグラ
フによる描写である。
【００９０】特別な具体例の説明
【００９１】本発明は被検物質の定量法に向けられてい
る。本発明の一面は、被検物質を含むと思われる媒質を
処理して本質的に準安定化学種をつくることからなる被
検物質の定量法である。この化学種は媒質中に拡散する
ことが可能であり、そして被検物質の存在により化学種
にごく接近した準安定化学種と反応することのできる媒
質中の物質と選択的に反応することが可能である。
【００９２】本法は更に化学種が該物質と反応したかど
うかを決定することからなり、その反応は媒質中の被検
物質の量を指示する。
【００９３】一般にこの準安定化学種は励起状態であ
る。準安定化学種は１ミリ秒未満、通常は１００ミリ秒
未満、更に一般的には１０ミリ秒未満の寿命をもつ。こ
の準安定化学種は媒質中に拡散する性質がある、即ちそ
れがある部位で生成し、その生成部位から他の部位へ移
動しそこでエネルギーを移したり、前記部位で分子と反
応することができる。
【００９４】この準安定化学種はｔｒａｎｓ−シクロヘ
キセン、α−ラクトン、トリメチレンメタンなどの群か
ら生ずるラジカルイオン、ナイトレン、カルベンといっ
た反応性中間体のいずれでもよい。特に関心をもたれて
いるものは励起一重項状態、例えば一重項酸素、三重項
状態、およびジオキセタン類、例えばジオキセタノンお
よびジオキセタンジオンである。
【００９５】三重項状態は一般に適当な増感剤、例えば
ピレン、をエネルギー受容体、例えばアントラセンと結
合させることによりつくられる。例えば、ジブロモアン
トラセンは三重項状態をとるエネルギー受容体として作
用しうる。三重項状態はそのエネルギーを他の分子に移
動させるように進行し、光の発生といった検知可能な光
化学的反応を開始する。ジオキセタン類、例えばジオキ
セタンジオンは活性な分子と一重項酸素または過酸化水
素との反応から生ずる。例えば、適当なオキサレートお
よび過酸化水素はオキセタンジオンを生成する。
【００９６】セイヨウワサビのペルオキシダーゼのよう
な酵素は一般にラジカル陽イオンまたは一重項酸素を発
生させることができ、そして後者は同様に準安定であ
り、他の分子と反応して検知可能な信号を与えることが
できる。
【００９７】特異的結合対複合体の存在は、複合体の一
構成要素によって準安定化学種をつくり出すことにより
定量できる。このようにするとこの化学種は、該要素が
複合体内にないとき前記構成要素と相互作用することな
く、複合体の別の構成要素と選択的に相互作用しうる。
【００９８】本発明の一面においては、光増感剤および
リガンド、受容体またはポリヌクレオチドからなる組成
物が、検定中化学発光性化合物およびリガンド、受容体
またはポリヌクレオチドからなる組成物へ結合する。こ
の化学発光性化合物は一重項酸素と反応することがで
き、そして生じた生成物は光を発して分解する。一重項
酸素は、通常は光増感剤の照射により光増感剤によって
発生する。
【００９９】化学発光性化合物を含有する組成物に結合
されない光増感剤によってつくり出された一重項酸素は
減衰（ｔ1/2 は水中で約２マイクロ秒である）を受ける
前に化学発光性化合物に到達できない。化学発光性化合
物を含有する組成物に結合するようになる光増感剤を含
有する組成物は一重項酸素をつくり出し、これが化学発
光性化合物と反応する。それはこのようにすると光増感
剤と化学発光性化合物との間に実現された短い距離をこ
のような一重項酸素が存続できるようになるからであ
る。距離の短縮は試料中に被検
【０１００】物質が存在する結果起こる。一重項酸素が
移動する距離の一部分は有機媒質経由がよく、この媒質
中で一重項酸素ははるかに長い寿命、即ち約１００マイ
クロ秒より長い寿命、をもつ。被検物質は光増感剤を含
有する組成物と化学発光性化合物を含有する組成物との
間の結合を調節しなければならない。通常は、化学発光
性化合物および光増感剤の少なくとも一つは表面、とり
わけその表面が懸濁性粒子からなる場合の表面と関わり
をもつ。
【０１０１】光増感剤とごく接近して化学発光性化合物
の一重項酸素励起を含む上記方法は、前記Ｍｃ Ｃａｐ
ｒａの方法と区別すべきである。Ｍｃ Ｃａｐｒａの特
許出願明細書４頁３８−４６行に失活形式で行なう検定
法が記載されている。ＭｃＣａｐｒａの検定法は、増感
剤を抱合させた特異的結合物質および被検物質の複合体
と特異的に結合しうる反応体を利用して増感剤抱合体−
反応体複合体を形成させるものである。失活部分は反応
体に付けられる。
【０１０２】増感剤にきわめて接近させたとき、その失
活部分は結合した増感剤の励起の結果として生ずる信号
を減少あるいは失活させるか、あるいは励起された増感
剤に対する電子またはエネルギーの中間体化学種（即
ち、分子状酸素またはロイコ染料）への移動を減少ある
いは失活させる。この失活形式で被検物質の存在は減衰
しつつあるジオキセタンのルミネッセンスと関係づけら
れる。このようにして、Ｍｃ Ｃａｐｒａは上記米国特
許第４，２２０，４５０号および第４，２７７，４３７
号明細書を引用している。
【０１０３】Ｍｃ Ｃａｐｒａにより記述されたこの失
活検定法形式は励起された増感剤の失活のみを含み、特
異的結合構成要素と関連する化学発光性化合物の一重項
酸素による活性化を包含しない。
【０１０４】更にまたＭｃ Ｃａｐｒａ １４頁３５〜
３６行には、化学発光性部分からのエネルギー移動でポ
リヌクレオチドプローブ検定における増感剤を励起させ
ることが記載されている。Ｍｃ Ｃａｐｒａによるこの
記述は完全に本発明から区別される。即ち、本発明は存
在する被検物質によって光増感剤と化学発光性化合物と
を互にきわめて接近させる方法であり、そこで励起され
た光増感剤が一重項酸素をつくり出し、次にこれが化学
発光性化合物を活性化するのである。
【０１０５】本発明のもう一つの面においては、光化学
的に活性化されて発光性生成物になりうる物質群を標識
として使用する。この物質群は特異的結合対の一構成要
素と関連し、そしてこの試薬は被検物質の検出のための
検定において標識試薬として利用される。光化学的活性
化は前記物質群を光で照射するか、あるいは一重項と物
質群との反応により達成できる。なるべくは、活性化が
一重項酸素による場合増感剤を用いて光活性化を促進す
るのがよい。通常は増感剤が光を吸収し、このようにし
て形成された励起増感剤が酸素を活性化し、一重項酸素
が標識と反応して準安定発光性中間体を与える。
【０１０６】標識として用いる物質群は増感によってあ
るいは増感なしに光活性化を受ける化学発光性化合物の
いずれをも包含し、なるべくは一重項酸素との反応によ
り活性化される物質群である。本発明に係る標識は被検
物質を定量するための均質および不均質両方の検定実験
計画に使用できる。増感剤およびエネルギー受容体があ
ってもなくても化学発光性化合物を活性化するために化
学的試薬を添加する必要がないことが望ましい。
【０１０７】均質実験計画案においては全試薬を合わ
せ、媒質を照射して化学発光性化合物を活性化する。
【０１０８】この検定実験計画案においては、成分をコ
ンビネーションとして提供し、増感剤による酸素の活性
化の関数として生じた光は被検物質濃度の関数であろ
う。本発明方法は光を発生させるのに媒質を加熱せずに
実施できるのが有利な点である。従って、本発明検定法
は一定温度で行なうことができる。
【０１０９】本発明の特別な具体例についての説明を更
に続ける前に、幾つかの用語を定義し、詳細に説明する
ことにする。
【０１１０】被検物質−−検出すべき化合物または組成
物。被検物質は特異的結合対（ｓｂｐ）の一構成要素か
らなることができ、そしてリガンド（これは一価（モノ
エピトープ）または多価（ポリエピトープ）で、通常は
抗原またはハプテンである）のこともあり、また少なく
とも一つの共通したエピトープ部位かデテルミナント部
位を共有する単一化合物または複数の化合物である。
【０１１１】被検物質は細胞、例えば細菌の部分、ある
いは血液型抗原、例えばＡ，Ｂ，Ｄなどを有する細胞の
部分、あるいはＨＬＡ抗原あるいは微生物、例えば細
菌、真菌、原虫、またはウイルスのこともある。
【０１１２】多価リガンド被検物質は通常はポリ（アミ
ノ酸）、即ちポリぺプチドおよびタンパク質、多糖類、
核酸、およびこれらのコンビネーションである。このよ
うなコンビネーションには細菌、ウイルス、クロモソー
ム、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が
含まれる。
【０１１３】大抵の場合、本発明検定法を適用できるポ
リエピトープリガンド被検物質は、少なくとも約５，０
００、もっと一般的には少なくとも約１０，０００の分
子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）のカテゴリー
中対象となるポリ（アミノ酸）は一般に分子量約５，０
００から５，０００，０００、更に普通には分子量約２
０，０００から１，０００，０００であろう。対象とな
るホルモンのうち、その分子量は約５，０００から６
０，０００に及ぶのが普通である。
【０１１４】多種多様なタンパク質が同様な構造上の特
徴をもつタンパク質、特定の生物学的機能を有するタン
パク質、特定の微生物、とりわけ病原性微生物に関係あ
るタンパク質の仲間に関して考慮される。このようなタ
ンパク質には、例えば、免疫グロブリン、シトキン、酵
素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異性抗原
などが含まれる。
【０１１５】下記は構造により関係づけられるタンパク
質の分類である。 プロタミン ヒストン アルブミン グロブリン 硬タンパク質 リンタンパク質 ムコタンパク質
【０１１６】色素タンパク質 リポタンパク質 核タンパク質 糖タンパク質 Ｔ−細胞受容体 プロテオグリカン ＨＬＡ 分類に入らないタンパク質、例えばソマトトロピン、プ
ロラクチン、シンシュリン、ペプシン。
【０１１７】ヒト血漿中に見出される幾つかのタンパク
質は臨床的に重要であり、それらには下記のものが包含
される。
【０１１８】プレアルブミン アルブミン α1 −リポタンパク質 α1 −アンチトリプシン α1 −糖タンパク質
【０１１９】トランスコルチン ４．６Ｓ−ポストアルブミン 貧トリプトファンα1 −糖タンパク質 α1 Ｘ−糖タンパク質 チロキシン結合グロブリン インター−α−トリプシン−阻害物質
【０１２０】Ｇｃ−グロブリン （Ｇｃ１−１） （Ｇｃ２−１） （Ｇｃ２−２）
【０１２１】ハプトグロブリン （Ｈｐ１−１） （Ｈｐ２−１） （Ｈｐ２−２）
【０１２２】セルロプラスミン コリンエステラーゼ α2 −リポタンパク質（複数） ミオグロビン Ｃ−反応性タンパク質
【０１２３】α2 −マクログロブリン α2 −ＨＳ−糖タンパク質 Ｚｎ−α2 −糖タンパク質 α2 −ニューラミノ−糖タンパク質 エリトロポイエチン β−リポタンパク質
【０１２４】トランスフェリン ヘモペキシン フィブリノゲン プラスミノゲン β2 −グリコプロティンＩ β2 −グリコプロティンＩＩ免疫グロブリンＧ
【０１２５】（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン 分子式： γ2 κ2 またはγ2 λ2 免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ） またはγＡ−グロブリン 分子式： （α2 κ2 ）n または（α2 κ2 ）n 免疫グロブリンＭ （ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン 分子式： （μ2 κ2 ）5 または（μ2 λ2 ）5 免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ） またはγＤ−グロブリン（γＤ） 分子式： （δ2 κ2 ）または（δ2 λ2 ） 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ） またはγＥ−グロブリン（γＥ） 分子式： （ε2 κ2 ）または（ε2 λ2 ） 自由κおよびλ軽鎖 補体因子： Ｃ′１ Ｃ′１ｑ Ｃ′１ｒ Ｃ′１ｓ Ｃ′２ Ｃ′３ β1 A α2 Ｄ Ｃ′４ Ｃ′５ Ｃ′６ Ｃ′７ Ｃ′８ Ｃ′９ 重要な血液凝固因子には下記のものが含まれる：
【表１】 ──────────────────────────────────── 国際的呼称 名 称 ──────────────────────────────────── Ｉ フィブリノゲン ＩＩ プロトロンビン ＩＩａ トロンビン ＩＩＩ 組織トロンボプラスチン ＶおよびＶＩ プロアクセレリン、促進物質グロブリン ＶＩＩ プロコンベルチン ＶＩＩＩ 抗血友病グロブリン（ＡＨＧ） ＩＸ クリスマス因子血漿トロンボプラスチン成分（ＰＴＣ） Ｘ Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｒｏｗｅｒ因子、オートプロトロンビン ＩＩＩ ＸＩ 血漿トロンボプラスチン原形（ＰＴＡ） ＸＩＩ Ｈａｇｅｍａｎｎ因子 ＸＩＩＩ フィブリン−安定化因子 ────────────────────────────────────
【０１２６】重要なタンパク質ホルモンには下記のもの
が含まれる：ぺプチドおよびタンパク質ホルモン パラチロイドホルモン （パラトロモン） チロカルシトニン インシュリン グルカゴン
【０１２７】リラキシン エリトロポィエチン メラノトロピン （メラニン細胞刺激ホルモン：インターメジン） ソマトトロピン （成長ホルモン）
【０１２８】コルチコトロピン （副腎皮質刺激ホルモン） チロトロピン 濾胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン （間質細胞刺激ホルモン） ルテオマモトロピックホルモン （ルテオトロピン、プロラクチン） ゴナドトロピン （絨毛性性腺刺激ホルモン）
【０１２９】組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシンＩおよびＩＩ ブラジキニン ヒト胎盤性ラクトゲン
【０１３０】シトキン ＩＬ Ｉ ＩＬ ＩＩ ＩＬ ＶＩ ＥＧＦ ＴＮＦ ＮＧＦ
【０１３１】癌抗原 ＰＳＡ ＣＥＡ ａ−フェトプロテイン 酸ホスファターゼ ＣＡ１９．９ ＣＡ１２５
【０１３２】組織特異的抗原 アルカリ性ホスファターゼ ミオグロビン ＣＰＫ−ＭＢ カルシトニン ミエリン塩基性タンパク質
【０１３３】神経下垂体から生ずるぺプチドホルモン オキシトシン バソプレッシン 終結因子（ＲＦ）
【０１３４】ＣＲＦ，ＬＲＦ，ＴＲＦ，ソマトトロピン
−ＲＦ，ＧＲＦ，ＦＳＨ−ＲＦ，ＰＩＦ，ＭＩＦ
【０１３５】対象となる他の重合体物質はムコ多糖類と
多糖類である。
【０１３６】代表的微生物には次のものが包含される：
【表２】
【表３】
【０１３７】モノエピトープリガンド被検物質は、一般
に分子量約１００から２，０００、より普通には分子量
１２５から１，０００であろう。これら被検物質の例と
して薬物、代謝生成物、有害生物防除剤、汚染物質など
があげられる。分析対象となる薬物にアルカロイドが含
まれる。アルカロイドの中にはモルヒネ系アルカロイ
ド、例えばモルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロ
メトルファン、これらの誘導体および代謝生成物；コカ
イン系アルカロイド、例えばコカインおよびベンジルエ
クゴニン、それらの誘導体および代謝生成物；麦角アル
カロイド、例えばリセルグ酸のジエチルアミド；ステロ
イドアルカロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾ
リンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キノリ
ンアルカロイド；例えばキニーネおよびキニジン；ジテ
ルペンアルカロイド、それらの誘導体および代謝生成物
がある。
【０１３８】薬物の次の群にはステロイド類、例えば、
エストロゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルス
テロイド、胆汁酸、強心性配糖体およびアグリコン類、
例えば、ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニンお
よびサポゲニン、それらの誘導体および代謝生成物が包
含される。また、擬ステロイド物質、例えばジエチルス
チルベストロールも含まれる。
【０１３９】薬物の次の群は５から６環員を有するラク
タム類、例えばバルビツール酸誘導体、例えばフェノバ
ルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダン
トイン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれらの
代謝生成物である。
【０１４０】薬物の次の群は２から３炭素原子を有する
アミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタミン；カ
テコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ドーパ、エ
ピネフリン、ナルセイン、パパベリン、および上記物質
の代謝生成物である。
【０１４１】薬物の次の群はベンズ複素環化合物で、そ
れらにはオキサゼパム、クロロプロマジン、テグレトー
ル、それらの誘導体および代謝生成物が含まれる。上記
複素環はアゼピン類、ジアゼピン類およびフエノチアジ
ン類である。
【０１４２】薬物の次の群はプリン類、例えばテオフィ
リン、カフェイン、それらの代謝生成物および誘導体で
ある。薬物の次の群には大麻から誘導されるもの、例え
ばカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールが
含まれる。
【０１４３】薬物の次の群はホルモン類、例えばチロキ
シン、コルチゾル、トリヨードチロニン、テストステロ
ン、エストラジオール、エストロン、プロゲストロン、
ポリぺプチド、例えばアンギオテンシン、ＬＨＲＨ、お
よび免疫抑制物質、例えばシクロスポリン、ＦＫ５０
６、マイコフェノール酸などである。
【０１４４】薬物の次の群にはビタミン類、例えばＡ、
Ｂ、例えばＢ12、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、サイアミ
ンが含まれる。薬物の次の群はプロスタグランジン類で
あり、これらはヒドロキシル化および不飽和の程度と部
位によって異なる。
【０１４５】薬物の次の群は三環式抗うつ剤、例えばイ
ミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリ
ン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラ
ミン、クロミプラミン、ドキセピン、およびデスメチル
ドキセピンである。
【０１４６】薬物の次の群は抗新生物剤、例えばメトト
レキセートである。薬物の次の群は抗生物質、例えばペ
ニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テ
トラサイクリン、テラマイシン、その代謝生成物と誘導
体である。
【０１４７】薬物の次の群はヌクレオシドおよびヌクレ
オチドで、それらにはＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノ
シン、グアノシン、チミジンおよびシチジン（適当な糖
およびリン酸置換基をもつ）が含まれる。
【０１４８】薬物の次の群は種々雑多な個々の薬物で、
それらにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、メ
ペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプ
ロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビ
ン、バルプロン酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、
クロラムフェニコール、抗コリン作動薬、例えばアトロ
ピン、それらの代謝生成物および誘導体が含まれる。
【０１４９】罹患状態に関係する代謝生成物にはスペル
ミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、およびポル
フィリン１型が含まれる。
【０１５０】薬物の次の群はアミノグリコシド、例えば
ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およ
びアミカシンである。対象となる有害生物防除剤にはポ
リハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフ
ェート、カルバメート、ポリハロゲン化スルフェンアミ
ド、それらの代謝生成物および誘導体がある。
【０１５１】受容体被検物質に対する分子量は一般に１
０，０００から２×１０8 、更に普通には１０，０００
から１０6 であろう。免疫グロブリン、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＥおよびＩｇＭに対する分子量は一般に約１６
０，０００から約１０6 を変化するであろう。酵素の分
子量は一般に約１０，０００から１，０００，０００に
わたるであろう。天然の受容体
【０１５２】は多種多様であり、例えばアビジン、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結
合プレアルブミン、トランスコルチンなどを含めて、分
子量は一般に少なくとも約２５，０００であり、分子量
１０6 以上のこともある。
【０１５３】被検物質という用語は更にポリヌクレオチ
ド被検物質、例えば下に定義されているポリヌクレオチ
ドを包含する。これらにはｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ｔ
−ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ二重らせんなどが含
まれる。被検物質という用語はまたポリヌクレオチド結
合剤である受容体、例えば制限酵素、活性化物質、抑制
因子、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵
素、化学療法剤などをも包含する。
【０１５４】被検物質は宿主から得た体液のような試料
中に直接見出される分子のことがある。この試料は直接
検査することができるが、あるいは被検物質を一層容易
に検出できるようにするため前処理することもある。更
にまた、対象とする被検物質の証明となる作用因子、例
えば対象被検物質に対して相補的な特異的結合対の構成
要素（対象被検物質が試料中に存在するときにのみその
存在が検出されるもの）を検出することによって定量す
ることもできる。従って、被検物質の証明となる作用因
子は、検定で検出される被検物質となる。体液は例えば
尿、血液、血
【０１５５】漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄
液、涙、粘液などでよい。特異的結合対の構成要素
（「ｓｂｐメンバー」）−−
【０１５６】二つの異なる分子の一方のことで、他の分
子の特別な場所の極性組織に特異的に結合し、そのため
後者と相補的であると定義される表面上あるいは空洞の
中に或る領域を有する分子。特異的結合対の構成要素を
指してリガンドおよび受容体（アンチリガンド）とい
う。これらは通常は抗原−抗体のように免疫学的な対の
構成要素であるが、他の特異的結合対、例えばビオチン
−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二重らせ
ん、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、ポリヌクレオチド対、例え
ばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどは免疫学的対で
はないけれども、本発明ならびにｓｂｐ構成要素の定義
に包含される。
【０１５７】ポリヌクレオチド−−自然の状態で約５０
から５００，０００個以上のヌクレオチドを有し、また
単離された状態で約１５から５０，０００個以上のヌク
レオチド、通常は約１５から２０，０００個のヌクレオ
チド、更にしばしば１５から１０，０００個のヌクレオ
チドを有する重合体ヌクレオチドである化合物あるいは
組成物。ポリヌクレオチドには天然に存在するか合成的
につくられた精製または未精製の形にある
【０１５８】いずれかの給源から得られる核酸、例えば
ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、
通常はＤＮＡが包含され、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ
−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体
ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あ
るいはその混合物、遺伝子、クロモソーム、プラスミ
ド、生物学的材料、例えば微生物、例えば細菌、酵母、
ウイルス、ウイロイド、かび、真菌、植物、動物、ヒト
およびその部分などのゲノムでよい。
【０１５９】リガンド−−それに対する受容体が天然に
存在するか、あるいは調製することのできる有機化合
物。
【０１６０】リガンド類縁体−−修飾されたリガンド、
普通１００より大きい分子量を有する有機残基あるいは
被検物質類縁体、同様なリガンドと受容体の競合でき
る。修飾はリガンド類縁体を別の分子の結合する手段を
提供する。リガンド類縁体は、
【０１６１】リガンド類縁体をある中心あるいは標識へ
つなぐ結合による水素の置き換えにより、リガンドと異
なるのが普通であるが、必要ではない。リガンド類縁体
はリガンドと同様の仕方で受容体に結合できる。この類
縁体は、例えばそのリガンドに対する抗体のイデイオタ
イプに対して指向する抗体でありうる。
【０１６２】受容体（「アンチリガンド」）−−ある分
子の特別な場所の極性組織、例えばエピトープ部位また
はデテルミナント部位、を認識しうる化合物または組成
物。代表的受容体には天然に生ずる受容体、例えばチロ
キシン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメ
ント、レクチン、核酸、タンパク質Ａ、相補的成分Ｃ１
ｑなどが含まれる。
【０１６３】特異的結合−−二つの異なる分子のうちの
一つが他の分子を特異的に認識することで、これは別の
分子の認識が相当に弱いのと比較して特別に強い。一般
に、分子はその表面上にあるいは空洞中に二つの分子間
の特異的認識を生ずる領域をもつ。特異的結合の例示は
抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレ
オチド相互作用などである。
【０１６４】非特異的結合−特別な表面構造に比較的依
存しない分子間の非共有結合。非特異的結合は分子間の
疎水的相互作用を含めて幾つかの因子から生じうる。
【０１６５】抗体−−別の分子の特別な場所の極性組織
に対して特異的に結合し、そのため後者と相補的てある
と定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローンでも
ポリクローンでもよく、そしてこの分野でよく知られる
技術により、例えば宿主の免疫化と血清の収集（ポリク
ローン）により、あるいは連続したハイブリッド細胞系
をつくり分泌されたタンパク質（モノクローン）を収集
することにより、あるいは天然抗体の特異的結合に要求
されるアミノ酸順序に対して少なくともコード化するヌ
クレオチド配列あるいはその変異誘発させた変異種をク
ローン化し、発現させることによりつくりうる。
【０１６６】抗体は完全な免疫グロブリンあるいはその
フラグメントを包含し、この免疫グロブリンには種々な
分類およびイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ
３、ＩｇＭなどが含まれる。そのフラグメントはＦａ
ｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′などを含みう
る。更に、ある特定分子に対する結合親和性が保たれる
限り、必要に応じ免疫グロブリンまたはそれらのフラグ
メントの集合体、重合体および抱合体を使用できる。
【０１６７】アルキル−−脂肪族炭化水素から１個のＨ
原子を除去することにより誘導される１価の分枝または
非分枝残基で、低級アルキルおよび高級アルキルの両方
を含む。
【０１６８】低級アルキル−−１から５炭素原子を含む
アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、
イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチルな
ど。
【０１６９】高級アルキル−−６炭素原子より多く、通
常は６から２０炭素原子を含むアルキル、例えばヘキシ
ル、ヘプチル、オクチルなど。
【０１７０】アルキリデン−−同じ炭素原子から２個の
水素原子を取り去ることにより脂肪族炭化水素から誘導
される２価有機基、例えばエチリデン。
【０１７１】アリール−−芳香族炭化水素から１個の水
素原子を取り除くことにより誘導される１個以上の芳香
環、通常は１から４個の芳香環を含む有機基、例えばフ
ェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナフタレンから）
など。
【０１７２】アルアルキル−−アリール基が付いたアル
キル基をもつ有機基、例えばベンジル、フェネチル、３
−フェニルプロピル、１−ナフチルエチルなど。
【０１７３】アルコキシ−−酸素原子によって分子の残
りに付くアルキル基、例えばメトキシ、エトキシなど。
【０１７４】アリールオキシ−−酸素原子によって分子
の残りにつくアリール基、例えばフェノキシ、ナフトキ
シなど。
【０１７５】アルアルコキシ−−酸素原子によって分子
の残りに付くアルアルキル基、例えばベンズオキシ、１
−ナフチルエトキシなど。
【０１７６】置換−−ある分子の水素原子を他の原子に
より置き換えることを意味し、これは１個の原子、例え
ばハロゲンなどのこともあれば、または１から５０個の
原子（このような原子の原子価を満足するのに必要な要
求される水素原子のほか）を有する置換基のような官能
基を形成する原子団の一部のこともある。前記原子は炭
素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群から独立し
て選ばれ、１個以上の金属原子に結合することもあれば
しないこともある。
【０１７７】アルキルチオ−−硫黄原子によって分子の
残りに付くアルキル基、例えばメチルチオ、エチルチオ
など。 アリールチオ−−硫黄原子によって分子の残りに付くア
リール基、例えばフェニルチオ、ナフチルチオなど。
【０１７８】電子供与性基−−ある分子に結合したと
き、その電子供与基が電子不足となり、分子の他の部分
と比較して正に帯電する、即ち電子密度を低下させるよ
うに分子を分極させることのできる置換基。このような
基の例示としてアミン、エーテル、チオエーテル、ホス
フィン、ヒドロキシ、オキシアニオン、メルカプタンお
よびそれらの陰イオン、スルフィドなどがあげられる
が、これらに制限するのではない。
【０１７９】１から５０個の原子（このような原子の原
子価を満足させるのに必要な水素原子を除く）を有する
置換基（これらの原子は炭素、酸素、窒素、硫黄および
リンからなる群から独立して選ばれる）−−有機残基；
この有機残基は残基中の原子の原子価を満足させるのに
必要な数の水素原子のほかに１から５０個の原子を有す
る。一般に主要な原子は炭素（Ｃ）であるが、酸素
（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）でもよ
く、そしてこれらＯ、Ｎ、Ｓ、またはＰがもし存在する
ならばこれらは炭素に結合するか、あるいは相互の１個
以上にあるいは水素または金属原子に結合して種々な官
能基、例えばカルボン酸、アルコール、チオール、カル
ボキサミド、カルバメート、カルボン酸エステル、スル
ホン酸、スルホン酸エステル、リン酸、リン酸エステ
ル、尿素、カルバメート、ホスホルアミド、スルホンア
ミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィ
ン、アセチレン、アミン、ケトン、アルデヒド、ニトリ
ルなどを形成する。
【０１８０】このような有機残基または基の代表例とし
てアルキル、アルキリデン、アリール、アルアルキル、
ならびに上記官能基の１個以上で置換されたアルキル、
アリールおよびアルアルキルがあるが、これらは例示の
ためにあげたのであって制限ではない。
【０１８１】連結基−−分子間の共有結合。連結基は結
ばれる分子、即ち光増感剤、化学発光性化合物、ｓｂｐ
構成要素あるいは粒子とまたはその一部分と関連する分
子の性質によって変化するであろう。通常は存在する官
能基あるいは光増感剤や化学発光性化合物に導入される
官能基がこれらの物質をｓｂｐ構成要素にあるいは粒
子、例えばリポソームの親油性成分または油滴、ラテッ
クス粒子、ケイ素粒子、金属ゾルまたは染料微結晶に結
びつけるために使用される。
【０１８２】大抵の場合、カルボニル官能基、即ちオキ
ソカルボニル、例えばアルデヒドおよび非オキソカルボ
ニル（窒素および硫黄類縁体を含む）、例えばカルボキ
シ、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチオ
ノカルボキシ、の両方が使用される。
【０１８３】オキソの別の官能基には活性ハロゲン、ジ
アゾ、メルカプト、オレフィン、特別に活性化されたオ
レフィン、アミノ、ホスホロなどが含まれる。連結基の
説明は米国特許第３，８１７，８３７号明細書中に見る
ことができ、参考のためその開示を本明細書中に取り入
れている。
【０１８４】連結基は１本の結合から、１から１００個
の原子、通常は約１から７０原子、なるべくは１から５
０原子、更に好ましくは１から２０原子の連鎖までを変
化し、各々は通常炭素、酸素、硫黄、窒素およびリンか
らなる群から独立して選ばれる。連結基中のヘテロ原子
の数は、普通には約０から２０個、通常は約１から１５
個、更に好ましくは２から６個にわたるであろう。鎖中
の原子は、１から５０原
【０１８５】子を有する置換基に対して説明した仕方と
同様にして水素以外の原子で置換することができる。一
般則として、特定の連結基の長さは合成の便利さおよび
エネルギー受容体、発蛍光団、重金属のような項間交差
の解析に対する基の導入が得られるよう任意に選ぶこと
ができる。これら連結基は脂肪族でも芳香族でもよいが
ジアゾ基については芳香族基が通常含まれる。
【０１８６】へテロ原子が存在する場合、酸素は通常オ
キソまたはオキシとして炭素、硫黄、窒素またはリンに
結合して存在し、窒素は通常はニトロ、ニトロソまたは
アミノとして通常は炭素、酸素、硫黄またはリンに結合
して存在し、硫黄は酸素と類似しているが、リンは通常
はホスホネートおよびホスフェートモノエステルまたは
ジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合す
るであろう。
【０１８７】連結基と抱合させるべき分子との間に共有
結合をつくる際の共通の官能基はアルキルアミン、アミ
ジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニ
ジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、ス
ルホネート、およびホスフェートエステル、アミドおよ
びチオエステルである。
【０１８８】大抵の場合、光増感剤および化学発光性化
合物は非オキソカルボニル基、例えば窒素および硫黄類
縁体、ホスフェート基、アミノ基、アルキル化剤、例え
ばハロアルキルまたはトシルアルキル、オキシ（ヒドロ
キシルまたは硫黄類縁体、メルカプト）、オキソカルボ
ニル（例えばアルデヒドまたはケトン）、または活性オ
レフィン、例えばビニルスルホンあるいはα，β−不飽
和エステルを有するであろう。これら官能基はアミン
基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、
例えばブロモアセチルにつながるであろう。アミンおよ
びカルボン酸あるいはその窒素誘導体またはリン酸がつ
ながると、アミド、アミジンおよびホスホルアミドが形
成されるであろう。メルカプタンおよび活性化オレフィ
ンが連結されるとチオエーテルが形成されるであろう。
メルカプタン
【０１８９】およびアルキル化剤がつながるとチオエー
テルが生ずるであろう。還元的条件下でアルデヒドとア
ミンがつながるとアルキルアミンが生成されるであろ
う。カルボン酸またはリン酸とアルコールが結合すると
エステルを生ずるであろう。
【０１９０】親水性あるいは水溶性を付与する基または
官能基−−これは親水性官能基であり、水による固体の
濡れおよび基が結合する化合物の水溶性を増加させる。
このような官能基あるいは機能性基は１から５０個また
はそれ以上の原子を有する置換基でよく、そしてスルホ
ネート、サルフェート、ホスフェート、アミジン、ホス
ホネート、カルボキシレート、
【０１９１】ヒドロキシル、とりわけポリオール、アミ
ン、エーテル、アミドなどを含みうる。代表的な官能基
はカルボキシアルキル、スルホンオキシアルキル、ＣＯ
ＮＨＯＣＨ2 ＣＯＯＨ、ＣＯ−（グルコサミン）、糖、
デキストラン、シクロデキストリン、ＳＯ2 ＮＨＣＨ2
ＣＯＯＨ、ＳＯ3 Ｈ、ＣＯＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3 Ｈ、
ＰＯ3 Ｈ2 、ＯＰＯ3 Ｈ2 、ヒドロキシル、カルボキシ
ル、ケトンおよびそのコンビネーションを包含しうる。
上記官能基の大抵のものは、光増感剤または化学発光性
化合物をｓｂｐ構成要素あるいは支持体に付着させる付
着基としても利用できる。
【０１９２】親油性あるいは脂溶性を付与する基または
官能基−−これは親油性官能基で、水による表面の濡れ
および基を結合させる化合物の水溶性を減少させる。こ
のような官能基または機能性基は１から５０個またはそ
れ以上の原子、通常は水素またはハロゲンで置換された
炭素原子を含むことができ、そしてアルキル、アルキリ
デン、アリールおよびアルアルキルを包含しうる。
【０１９３】この親油基または機能性基は通常は少なく
とも６炭素原子、更に普通には少なくとも１０炭素原
子、そしてなるべくは少なくとも１２炭素原子、通常は
３０炭素原子以下を有する１から６個の直鎖または分枝
鎖脂肪族基を有するであろう。この脂肪族基は５から６
員の環に結合することができ、そして後者は脂環式、複
素環式、または芳香族のいずれでもよい。
【０１９４】光増感剤−−通常は光で励起することによ
り一重項酸素を発生させるための増感剤。光増感剤は光
活性化性（例えば染料および芳香族化合物）でも化学活
性化性（例えば、酵素および金属塩）でもよい。光で励
起したとき光増感剤は通常は共有結合した原子からなる
化合物であり、多数の共役二重結合または三重結合を有
するのが普通である。この化合物は２００−１１００ｎ
ｍ、普通は３００−１０００ｎｍ、なるべくは４５０−
９５０ｎｍの波長範囲の光を吸収すべきであり、吸収極
大における吸光係数は励起波長において５００Ｍ-1ｃｍ
-1より大、なるべくは少なくとも５０００Ｍ-1ｃｍ-1、
更に好ましくは少なくとも５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1であ
るのがよい。
【０１９５】酸素の存在しない状態で光吸収後に生ずる
励起状態の寿命は少なくとも１００ナノ秒であるのが普
通であり、なるべくは少なくとも１ミリ秒がよい。一般
にこの寿命は、媒質により１０-5から１０-3Ｍの範囲内
の濃度で通常存在する酸素に対して、エネルギーを移動
させるのに十分長くなければならない。増感剤の励起状
態はその基底状態とは異なるスピン量子数（Ｓ）を有す
るのが普通であり、通常は、これが普通の場合である
が、基底状態が一重項（Ｓ＝０）であるとき三重項（Ｓ
＝１）であろう。
【０１９６】増感剤は高い項間交差収率を有するのがよ
い。即ち、増感剤の光励起は少なくとも１０％、望まし
くは少なくとも４０％、なるべくは８０％より大きい効
率で長寿命状態（通常は三重項）を生ずる。光増感剤は
検定条件下でせいぜい弱く蛍光性を示すのが普通である
（量子収率は通常は０．５未満、なるべくは０．１未満
がよい）。
【０１９７】光により励起させようとする光増感剤は比
較的光安定性があり、一重項酸素と効率よく反応しな
い。大抵の有用な増感剤には幾つかの構造上の特徴があ
る。大抵の増感剤は堅固な構造、しばしば芳香族構造、
に保持された少なくとも１個、しばしば３個以上の共役
二重結合または三重結合を有する。
【０１９８】それらはしばしば項間交差を促進する少な
くとも１個の基、例えばカルボニルまたはイミン基また
は周期表第３列〜第６列から選ばれる重原子、とりわけ
ヨウ素または臭素を含むか、あるいは拡張された芳香族
構造を有しうる。典型的な増感剤にはアセトン、ベンゾ
フェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−
ジブロモアントラセン、メチレンブルー、メタロ−ポル
フィリン、例えばヘマトポルフィリン、フタロシアニ
ン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスター
フラーレンなど、およびこれら化合物を一層親油性にす
るかまたは一層親水性にするための、そして（または）
例えばｓｂｐ構成要素へ付着させるための付着基として
１から５０原子の置換基を有する上記化合物の誘導体が
包含される。
【０１９９】本発明検定法に利用できる他の光増感剤の
例は、上記性質を有するもので、Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｒｏ、
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ」、１３２頁、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｉｎ
ｃ．，ニューヨーク、１９６５に列挙されているもので
ある。
【０２００】光増感剤は、それを油滴、リポソーム、ラ
テックス粒子などに添加するとき、親油性成分中への溶
解性を確保するため比較的無極性であることが好まし
い。
【０２０１】本発明に役立つ光増感剤は、外部光源によ
る活性化を用いて、あるいは余り好ましくないが、活性
化せずに一重項酸素を生成しうる他の物質および組成物
を含めることも企図されている。このようにして、例え
ばモリブデン酸塩（ＭｏＯ４ = ）およびクロロペルオ
キシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼ＋臭化物また
は塩化物イオン（Ｋａｎｏｂｓｋｙ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５９ ５５９６）は過酸化
水素から一重項酸素と水への変換を触媒することが示さ
れた。
【０２０２】これら組成物のいずれかを、例えばｓｂｐ
構成要素を結合させる粒子に含めて、過酸化水素を補助
試薬として加え、クロロペルオキシダーゼを表面に結合
させそしてモリブデン酸塩をリポソームの水相中に添加
するという検定法に使用できる。また光増感剤として本
当の増感剤ではないが熱、光または化学的活性化により
励起させたとき一重項酸素の分子を放出する化合物があ
ることも本発明の範囲内に含められる。
【０２０３】この部類の化合物のうち最もよく知られた
ものにはエンドペルオキシド、例えば１，４−ビスカル
ボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシ
ド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エ
ンドペルオキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフ
ェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドが含
まれる。これら化合物の加熱あるいはこれらによる直接
の光吸収は一重項酸素を放出する。
【０２０４】支持体あるいは表面−−多孔質または非多
孔質の水不溶性材料からなる表面。この表面は幾つかの
形状、例えばストリップ、棒、粒子（ビーズを含む）な
どのいずれか一つをとりうる。この表面は親水性でもよ
いし、あるいは親水性を与えることもでき、そして無機
粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミ
ナ；天然重合体材料、とりわけセルロース性材料および
セルロースから誘導される材料、例えば繊維含有紙類、
例えば濾紙、クロマトグラフィー用紙など；合成または
変性した天然産生重合体、例えばニトロセルロース、酢
酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミ
ド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレー
ト、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチル
ブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ
（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビ
ニル）などが包含される。これらはそれ自身を使用する
か、あるいは他の材料、Ｂｉｏｇｌａｓｓとして入手で
きるガラス、セラミックス、金属などと共に使用され
る。
【０２０５】天然または合成の構成体、例えばリポソー
ム、リン脂質小胞、および細胞体も使用できる。
【０２０６】支持体あるいは表面へのｓｂｐ構成要素の
結合は、文献で普通に入手できるよく知られた技術によ
り達成できる。例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅ
ｎｚｙｍｅｓ」、Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａ
ｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７８）お
よびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。
【０２０７】表面は通常は多官能性か、多官能性にする
ことができるか、あるいは特異的または非特異的共有ま
たは非共有相互作用を通して、オリゴヌクレオチド、ｓ
ｂｐ構成要素、光増感剤、および（または）化学発光性
化合物を結合しうるかであろう。多種多様な官能基を利
用でき、あるいは取り入れることができる。官能基の例
としてカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、
エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがあげ
られる。多種多様な化合物を表面に連結させる方法は公
知であり、文献に豊富に例示されている。
【０２０８】例えばＣａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４５，３０５９（１９７０）
参照。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ構成要素に対す
る連結基の長さは結合される化合物の性質、結合される
化合物と特異的結合性をもつ表面との間の距離の影響な
どにより広く変化しうる。
【０２０９】粒子−−少なくとも約２０ｎｍそして約２
０ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍそして約
１０ミクロン未満、なるべくは直径約０．１０から２．
０ミクロン、そして通常は１ピコリットル未満の体積を
有する粒子。この粒子は有機または無機性、膨潤可能ま
たは非膨潤性、多孔性または非多孔性で、密度はいずれ
でもよいが、なるべくは水に近似する一般に約０．７か
ら約１．５ｇ／ｍｌの密度がよく、なるべくは水に懸濁
可能で、透明、部分的に透明、または不透明な材料から
構成できる。
【０２１０】粒子は電荷をもつことももたないこともあ
るが、もしそれらが帯電しているときはなるべく負に帯
電するのがよい。粒子は固体（例えば、重合体、金属、
ガラス、有機および無機物、例えば鉱物質、塩およびけ
いそう）、油滴（例えば炭化水素、過フッ化炭化水素、
液体シリコーン）、または小胞（例えば、合成、例えば
リン脂質または天然、例えば細胞およびオルガネル）の
いずれでもよい。
【０２１１】粒子はラテックス粒子または有機または無
機重合体から構成された他の粒子；脂質二重層、例えば
リポソーム、リン脂質小胞；油滴；ケイ素粒子；金属ゾ
ル；細胞；および染料微結晶のいずれでもよい。
【０２１２】有機粒子は通常は重合体（付加重合体か縮
合重合体のいずれか）であり、検定媒質中に容易に分散
しうるものである。有機粒子はまたその表面に直接か間
接的にｓｂｐ構成要素を結合するように、また光増感剤
あるいは化学発光性化合物をその表面に結合するよう
に、あるいはその体積内に取り込むように吸着性をもつ
かそのように機能化しうるであろう。
【０２１３】これら粒子は天然に生ずる材料、合成的に
修飾された天然材料、および合成材料から誘導できる。
天然または合成集成体、例えば脂質二重層、例えばリポ
ソームおよび非リン脂質小胞が特によい。特に関心をも
たれる有機重合体には多糖類、とりわけ架橋多糖類、例
えばアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして入手可
能）、デキストラン（ＳｅｐｈａｄｅｘおよびＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌとして入手可能）、セルロース、デンプンな
ど；付加重合体、例えばポリスチレン、ポリアクリルア
ミド、アクリレートおよびメタクリレートの誘導体のホ
モポリマーおよび共重合体、とりわけヒドロゲルを含め
て遊離ヒドロキシル官能基を有するエステル類およびア
ミド類などがある。無機重合体はシリコーン、ガラス
（Ｂｉｏｇｌａｓとして入手可能）などを包含する。ゾ
ルには金、セレン、および他の金属が含まれる。
【０２１４】粒子はまた光増感剤としても作用しうる分
散水不溶性染料、例えばポルフィリン、フタロシアニン
などでもよい。粒子はまたけいそう、細胞、ウィルス粒
子、マグネトソーム、細胞核なども包含する。
【０２１５】粒子が市販されているものである場合、そ
の粒径はより大きい粒子を粉砕、超音波処理、かきまぜ
などといった機械的手段によって小さい粒子に破壊する
ことにより変えることができる。
【０２１６】粒子は多官能性かまたは多官能性化するこ
とができ、あるいはｓｂｐ構成要素、光増感剤、または
化学発光性化合物に対し特異的または非特異的共有また
は非共有相互作用を通して結合させることができるのが
普通である。多種多様な官能基を利用でき、あるいは取
り入れることができる。典型的な官能基にはカルボン
酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒ
ドロキシル基、メルカプト基などが包含される。
【０２１７】粒子に対してｓｂｐ構成要素、化学発光性
化合物または光増感剤を共有結合によって付ける方法を
用いる場合、その連結の仕方は公知であり、文献に詳細
に例示されている。例えば、Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１
９７０）参照。連結基の長さは連結される化合物の性
質、粒子の性質、連結される化合物と粒子との間の距離
がｓｂｐ構成要素の結合に及ぼす影響および被検物質な
どによって広く変化しうる。
【０２１８】光増感剤および（または）化学発光性化合
物は粒子の表面に溶けるかまたは表面に対し非共有結合
的に結合するように選ぶことができる。この場合これら
化合物は、粒子から解離する能力を減少させそれによっ
て両方の化合物を同じ粒子と関連させるように、なるべ
くは疎水性であるのがよい。
【０２１９】これは多分光増感剤か化学発光性化合物の
いずれかと関連させる唯一の組成の粒子を利用するか、
または光増感剤と一つの型の粒子との会合をまた化学発
光性化合物と他の型の粒子との会合を有利にするように
組成の異なる二つの型の粒子を用いることにより更に減
らすことができるであろう。
【０２２０】各粒子と関連する光増感剤または化学発光
性分子の数は平均して通常は少なくとも１であり、粒子
がすっかり光増感剤または化学発光剤分子から成り立つ
程十分高くてもよい。特に適当な分子数は検定て信号対
バックグランドを最高にするように経験的に選ばれるで
あろう。
【０２２１】ある場合には、多数の異なる光増感剤分子
を粒子と共同させることによりこれをなし遂げるのが最
も良い。通常は粒子中の光増感剤または化学発光性化合
物対ｓｂｐ構成要素の比は少なくとも１とすべきである
が、なるべくは少なくとも１００対１、最も好ましくは
１，０００対１以上である。
【０２２２】油滴−−これは乳化剤で被覆され安定化さ
れた親油性化合物からなる液体粒子で、前記乳化剤は、
例えばリン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミンなど
といった両親媒性分子である。
【０２２３】リン脂質は脂肪族ポリオールの脂肪酸カル
ボン酸エステルを基本とし、少なくとも１個のヒドロキ
シル基は約８から３６、更に普通には約１０から２０炭
素原子のカルボン酸エステルで置換される。前記カルボ
ン酸エステルはエチレン性不飽和部位０から３個、もっ
と普通な場合は０から１個を有し、そして少なくとも１
個、通常はただ１個だけのヒドロキシル基がホスフェー
トで置換されてリン酸エステルを形成する。このホスフ
ェート基は、一般にヒドロキシルまたはアミノ基を有す
る二官能性あるいは多官能性の小さい脂肪族化合物で更
に置換されることがある。
【０２２４】油滴は従来の手順に従い適当な親油性化合
物を陰イオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活
性剤と合わせ（この場合、界面活性剤は混合物の約０．
１から５、更に普通には約０．１から２重量％の量で存
在する）そして混合物を水性媒質中でかきまぜる、例え
ば超音波処理あるいは渦巻きを起こさせることにより調
製できる。代表的な親油性化合物には炭化水素油、過ハ
ロゲン化炭化水素、例えば過フッ化炭化水素、アルキル
フタレート、トリアルキルホスフェート、トリグリセリ
ドなどが含まれる。
【０２２５】ｓｂｐ構成要素は油滴表面に吸着させる
か、あるいは油滴表面の成分に直接または間接的に結合
させるのが普通である。ｓｂｐ構成要素は液体粒子の調
製中または調製後のいずれかで液粒中に添加できる。ｓ
ｂｐ構成要素は、粒子表面上に存在する分子の約０．５
から１００、更に普通には１から９０、しばしば約５か
ら８０そしてなるべくは約５０から１００モルパーセン
トの量で存在するのが普通である。
【０２２６】油滴を安定化するために使用できる両親媒
性化合物の一覧を次に示すが、これは例示のためであっ
てこれらに制限するのではない：ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセ
リン、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵ホスフ
ァチジルコリン、ジアパルミトイルホスファチジルコリ
ン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、レシチン、ガ
ラクトセレブロシド、スフィンゴミエリン、ジセチルホ
スフェート、ホスファチジルイノシトール、２−トリヘ
キサデシルアンモニウムエチルアミン、１，３−ビス
（オクタデシルホスフェート）−プロパノール、ステア
ロイルオキシエチレンホスフェート、リン脂質、ジアル
キルホスフェート、硫酸ドデシルナトリウム、陽イオン
性洗浄剤、陰イオン性洗浄剤、タンパク質、例えばアル
ブミン、非イオン性洗浄剤など。
【０２２７】親油性基を有しそして以前に記述されたこ
とのある他の化合物も使用できる。大抵の場合これら化
合物はアルキルベンゼン類であり、そして直鎖または分
枝鎖の６から２０炭素原子を有するアルキル基（通常は
アルキル基の混合体）を有し、またカルボキシル基、ヒ
ドロキシル基、ポリオキシアルキレン基（２から３炭素
原子のアルキレン）、カルボン酸基、スルホン酸基、ま
たはアミノ基を有する。
【０２２８】脂肪族脂肪酸を使用でき、そしてこのもの
は約１０から３６、更に普通には約１２から２０炭素原
子のものが普通である。また、脂肪酸に対して示した炭
素原子数の制限を有する脂肪アルコール、同様な炭素数
制限をもつ脂肪アミンおよび種々なステロイドも使用で
きる。
【０２２９】油滴は過フッ化炭化水素またはシリコーン
油（シリコーン粒子）からなることができる。このよう
な油滴は米国特許第４，６３４，６８１号および第４，
６１９，９０４号明細書中でＧｉａｅｖｅｒにより述べ
られている（その開示をそっくり本明細書中に取り入れ
ている）。これら油滴は過フッ化炭化水素またはシリコ
ーン油を水相中に分散させることによりつくられる。
【０２３０】油滴は少量の選ばれた油（一般にこのよう
な油は市販されている）を大量の水相と共に容器に入れ
ることにより調製される。
【０２３１】この液体系をかきまぜて乳化を起こさせ次
に遠心する。均一相を取り除き、残留油滴を緩衝した水
性媒質中に再浮遊させる。油滴を使用する前に上記の遠
心およびデカンテーション工程を一回以上繰り返すこと
ができる。
【０２３２】ｓｂｐ構成要素は幾つかの方法で小滴に結
合させることができる。Ｇｉａｅｖｅｒにより説明され
ている通り、特定のｓｂｐ構成要素、とりわけタンパク
質性ｓｂｐ構成要素、は乳化工程に先立ち、またはその
後で過剰のｓｂｐ構成要素を水性媒質中に導入すること
により小滴上に被覆することができる。過剰のｓｂｐ構
成要素を除去するため洗浄工程が望ましい。油を官能基
化することによりｓｂｐ構成要素をつなぐための前記官
能性が導入される。
【０２３３】このような官能基は油滴を光増感剤または
化学発光性化合物に連結させるために使用することもで
きる。他方、光増感剤または化学発光性化合物は油滴の
油相中に可溶であるように選ばれることが多く、その場
合には共有結合されない。油滴が過フッ化炭化水素であ
るとき、フッ素化された光増感剤または化学発光性化合
物は、対応する未フッ素化誘導体より溶け易い場合が多
い。
【０２３４】Ｇａｉｅｖｅｒにより記述された他の油滴
も本発明に使用できる。
【０２３５】リポソーム−−ほぼ球形をした微小ベシク
ル。これは本発明に用いるのに特に適当な材料の一つで
ある。リポソームは少なくとも約２０ｎｍそして約２０
ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍで約１０ミ
クロン未満の直径をもつ。リポソームの直径は沈降ある
いは浮上を制限するように約２ミクロン未満であるのが
よい。
【０２３６】リポソームの外殻はある体積の水または水
溶液を包囲する両親媒性二重層からなる。一つより多く
の二重層をもつリポソームは多重膜小胞と呼ばれる。唯
一つの二重層をもつリポソームは単一膜小胞と呼ばれ
る。親油性光増感剤または化学発光性化合物を使用する
場合には、単一膜小胞よりも大量のこれら物質を取り込
む能力があるので、多重膜小胞の方が本発明にとって好
ましい。両親媒性二重膜はしばしばリン脂質からなる。
【０２３７】本発明方法に利用できる粒子を調製するの
に用いられるリン脂質はレシチンを含めて天然膜に見出
されるどのリン脂質でもまたはリン脂質混合物でもよ
く、あるいは飽和または不飽和１２−炭素または２４−
炭素直鎖脂肪酸の合成グリセリルホスフェートジエステ
ルでもよく、後者の場合、ホスフェートはモノエステル
として、あるいは極性アルコール、例えばエタノールア
ミン、コリン、イノシトール、セリン、グリセリンなど
のエステルとして存在しうる。
【０２３８】特に適当なリン脂質には下記の化合物が含
まれる：Ｌ−α−パルミトイルオレオイル−ホスファチ
ジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホス
ファチジル−グリセリン（ＰＯＰＧ）、Ｌ−α−ジオレ
オイルホスファチジルグリセリン、Ｌ−α（ジオレオイ
ル）−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）お
よびＬ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルβ−（４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシアミド）エタノール（ＤＯＰＥ−ＭＣＣ）。
【０２３９】二重層中のリン脂質はコレステロールで補
うことができ、また他の両親媒性化合物で置き換えるこ
とができる。後者の化合物は通常は帯電した極性ヘッド
基と通常は２本の直線炭化水素鎖からなる疎水性の部分
を有するものである。
【０２４０】このような置き換え化合物の例にはジアル
キルホスフェート、ジアルコキシプロピルホスフェート
（これらアルキル基は１２〜２０炭素原子の直鎖をも
つ）、Ｎ−〔２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタ−デセニ
ルオキシ）〕−１−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル
−アンモニウムクロリド（米国特許第４，８９７，３５
５号明細書、１９９０年１月３０日発行、に開示されて
いる。これは参考として本明細書中に取り入れてい
る）、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなとが含ま
れる。
【０２４１】本発明方法に利用されるリポソームは懸濁
系を安定化しかつ自然凝集を防止するため高い負電荷密
度をもつ。
【０２４２】本発明方法に用いるためにはリポソームは
ｓｂｐ構成要素に結合できねばならず、また水相または
非水相いずれかと関連した光増感剤または化学発光性化
合物を含むことができなければならない。本発明方法に
利用されるリポソームは脂質小胞の外面に結合したｓｂ
ｐ構成要素を有するのが普通である。
【０２４３】リポソームは乾燥リン脂質あるいはリン脂
質に代る物質の水溶液中での水和および機械的分散を含
めて種々な方法により調製できる。この方法でつくられ
たリポソームは種々な大きさと組成と挙動を有する。機
械的に分散したリポソームの挙動の不均一性および不一
致を減らす一つの方法は超音波処理によるものである。
このような方法はリポソームの平均寸法を減少させる。
【０２４４】別法としてリポソーム製造中の最終工程と
して押し出しを使用できる。米国特許第４，５２９，５
６１号明細書は寸法の均一性を改善するため均一な細孔
寸法の膜を通して加圧下にリポソームを押し出す方法を
開示している。
【０２４５】脂質二重層中に溶けた疎水性あるいは両親
媒性の光増感剤または化学発光性化合物を含有するリポ
ソームの製造は、Ｏｌｓｅｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５５７
（９），１９７９により記述された方法を含めて種々な
方法で実施できる。簡単に言えば、有機溶媒、例えばク
ロロホルム中に適当な化合物を含む脂質の混合物を、ガ
ラス容器壁上に薄膜となるまで乾燥させる。この脂質の
膜を適当な緩衝液中で振盪または渦巻きを起こさせるこ
とにより水和する。
【０２４６】その後脂質懸濁系を連続的に小さくした細
孔寸法（例えば、２．０、１．０、０．８、０．６、
０．４および０．２ミクロン）を有する一連のポリカー
ボネートフィルター膜を通して押し出す。これらフィル
ターのいずれか、とりわけ最小のフィルターを通して繰
り返し濾過することが望ましい。このリポソームは、例
えばゲル濾過により、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
１０００のカラムを通すことにより精製できる。
【０２４７】カラムを緩衝液で溶離しリポソームを集め
ることができる。冷所に貯蔵すると、この方法によりつ
くられたリポソームの保存寿命を延長できる。別法とし
て、リポソーム調製後の懸濁液に光増感剤または化学発
光性化合物を添加することができる。
【０２４８】油滴およびリポソームの標識化はしばしば
例えば脂質二重層からなる分子にチオールまたはマレイ
ミドまたはビオチン基の封入を含むであろう。次に光増
感剤、化学発光性分子またはｓｂｐ構成要素を粒子とこ
れら物質の一つとの反応により表面へ結合させることが
できる。即ち、それぞれスルフヒドリル反応性試薬、ス
ルフヒドリル基、またはアビジンに結合される。スルフ
ヒドリル反応性基にはアルキル化試薬、例えばブロモア
セトアミドおよびマレイミドが含まれる。
【０２４９】ｓｂｐ構成要素は弱い疎水性相互作用によ
りリポソーム粒子の表面に引かれることがあるが、しか
しこのような相互作用はインキュベーションおよび洗浄
中に出会うせん断力に耐えるには一般に十分でない。前
に示したように、例えばＤＯＰＥ−ＭＣＣを用いて官能
基化したリポソーム粒子をメルカプタン基で官能基化し
た選ばれたｓｂｐ構成要素と合わせることによって、前
記リポソームへｓｂｐ構成要素を共有結合させることが
好ましい。
【０２５０】例えば、もしｓｂｐ構成要素が抗体である
ならば、それをＳ−アセチル−メルカプトコハク酸無水
物（ＳＡＭＳＡ）と反応させ、そして加水分解するとス
ルフヒドリルで修飾された抗体が得られる。
【０２５１】ラテックス粒子−−「ラテックス」とは水
に懸濁しうる水に溶けない粒状重合体物質で、通常は直
径２０ｎｍから２０ｍｍ、更に好ましくは直径１００か
ら１０００ｎｍの粒径を有するものを意味する。ラテッ
クスはしばしば置換ポリエチレン、例えばポリスチレン
−ブタジエン、ポリアクリルアミド−ポリスチレン、ア
ミノ基をもつポリスチレン、ポリ−アクリル酸、ポリメ
タクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレン
共重合体、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニル
ピリジン、塩化ビニルアクリレート共重合体などの場合
が多い。スチレンおよびカルボキシル化スチレンまたは
他の活性基、例えばアミノ、ヒドロキシル、ハロなどで
官能基化したスチレンの非架橋重合体が特に適当であ
る。置換スチレンとジエン類、例えばブタジエンとの共
重合体がしばしば使用される。
【０２５２】光増感剤または化学発光性化合物と本発明
方法に用いられるラテックス粒子との結合は、重合によ
る粒子の形成中に添加するものであるが、普通には粒子
中への非共有結合的溶解による既成粒子中への取り込み
である。通常は化学発光性化合物または増感剤の溶液が
使用される。利用しうる溶媒には、アルコール類、例え
ばエタノール、エチレングリコールおよびベンジルアル
コール；アミド類、例えばジメチルホルムアミド、ホル
ムアミド、アセトアミドおよびテトラメチル尿
【０２５３】素など；スルホキシド類、例えばジメチル
スルホキシドおよびスルホラン；およびエーテル類、例
えばカルビトール、エチルカルビトール、ジメトキシエ
タンなど、および水が包含される。粒子が溶解しない高
沸点溶媒の使用は高温度の使用を可能にし、粒子中への
化合物の溶解を促進するので特に適当である。溶媒は単
独で用いても組み合わせて用いてもよい。
【０２５４】光増感剤を添加するために特に適した溶媒
は、それらが本来備えている性質の故に、あるいは粒子
に溶けない水のような溶媒中にそれらが溶解しうる能力
のため溶媒を後に粒子から除去できる故に、光増感剤の
三重項励起状態を失活させないものである。芳香族溶媒
が特によく、一般に粒子に溶ける溶媒がよい。粒子中に
化学発光性化合物を添加するための溶媒は、それらが本
来備えている性質の故に、あるいは粒子から除去できる
能力の故に、ルミネセンスを妨害しない溶媒を選ぶべき
である。この場合にもしばしば芳香族溶媒が好ましい。
典型的な芳香族溶媒にはジブチルフタレート、ベンゾニ
トリル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、
ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベ
ンゼンなどが含まれる。
【０２５５】光増感剤または化学発光性化合物を粒子に
共有結合しようとする場合は別として、通常は電子的に
中性の光増感剤または化学発光性化合物を用いるのがよ
い。選ばれる液体媒質は重合体ビーズを粘着性の現われ
る点まで軟化しないことが好ましい。特に適当な技術
は、光増感剤または化学発光性化合物が少なくとも限ら
れた溶解度しかもたない液体媒質中に選ばれたラテック
ス粒子を懸濁させることからなる。
【０２５６】この液体媒質中の光増感剤および化学発光
性化合物の濃度は一重項酸素の生成効率が最高で、また
媒質中での化学発光性化合物からの発光の量子収率が最
高である粒子が得られるように選ぶのがよいが、濃厚で
ない溶液も時としては好ましいであろう。溶媒中での粒
子のひずみあるいは溶解は粒子が不溶である混和性共溶
媒を加えることにより防止できる。
【０２５７】一般に、この手順の間に用いる温度は、光
増感剤標識粒子の一重項酸素形成能力および化学発光性
化合物粒子の量子収率を最大にするように選ばれるが、
ただし粒子がその選ばれた温度において融解あるいは凝
集すべきでないことを条件とする。通常は高温が使用さ
れる。この手順に対する温度は一般に２０℃から２００
℃、更に普通には５０℃から１７０℃にわたるであろ
う。室温ではほとんど不溶性の若干の化合物は、高温で
は低分子量アルコール、例えばエタノールおよびエチレ
ングリコールなどに可溶である。カルボキシル化変性ラ
テックス粒子はこのような温度で低分子量アルコールに
耐えることが示された。
【０２５８】ｓｂｐ構成要素はラテックス粒子の表面に
物理的に吸着させることができ、あるいは粒子に共有結
合させることもできる。ｓｂｐ構成要素がラテックス粒
子の表面に極めて弱くしか結合しない場合、その結合は
ある場合には、インキュベーションおよび洗浄中に出会
う粒子対粒子せん断力に耐えることができないかもしれ
ない。それ故に、吸着を最小にする条件下でｓｂｐ構成
要素をラテックス粒子に共有結合させることが好まし
い。これはラテックスの表面を化学的に活性化すること
により達成できる。
【０２５９】例えば表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルをつくり、粒子表面への検定
成分の非特異的結合を減らすようにこの活性化された粒
子を次にアミノ基をもつリンカー（エステル基と反応す
る）と接触させるかあるいはアミノ基をもつｓｂｐ構成
要素と直接接触させる。このリンカーは検定成分が粒子
表面に非特異的に結合するのを減らすように選ぶのが普
通であり、ラテックス粒子への付着およびｓｂｐ構成要
素への付着の両方に適した官能基をもつことが好まし
い。適当な物質にはマレイミド化したアミノデキストラ
ン（ＭＡＤ）、ポリリジン、アミノ糖類などが含まれ
る。ＭＡＤはＨｕｂｅｒｔ、等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５（７），３１４３，１９７８
記載のようにして調製できる。
【０２６０】一つの方法を示すと、先ずＭＡＤは、水溶
性カルボジイミド、例えば１−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いてカルボキ
シル含有ラテックス粒子に付ける。この被覆粒子を次に
試薬中で平衡化させ非特異的結合を防ぐ。このような試
薬の例として、タンパク質、例えばウシγ−グロブリン
（ＢＧＧ）、および洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔ
ＲＩＴＯＮ Ｘ−１００などがあげられる。
【０２６１】スルフヒドリル基を有するか、またはスル
フヒドリル基を導入するように適当に修飾したｓｂｐ構
成要素を次に粒子の懸濁系へ添加すると、ｓｂｐ構成要
素と粒子上のＭＡＤとの間に共有結合が形成される。次
に過剰の未反応ｓｂｐ構成要素を洗浄により除去する。
【０２６２】金属ゾル−−これは重金属、即ちＩＢ族金
属のような２０より大きい原子番号を有する金属、例え
ば金または銀、あるいはカルコゲン、例えばセレンまた
はテルルからなる粒子である。
【０２６３】金属ゾル粒子は、例えばＬｅｕｖｅｒｉｎ
ｇにより米国特許第４，３１３，７３４号明細書の中で
述べられている（その開示をそのまま参考のため本明細
書中に取り入れている）。このようなゾルには金属、金
属化合物、あるいは金属か金属化合物で被覆した重合体
核のコロイド状水性分散系が含まれる。
【０２６４】金属ゾルは金属または金属化合物、例えば
金属酸化物、金属水酸化物および金属塩、のゾルでもよ
いし、あるいは金属か金属化合物で被覆された重合体核
のものでもよい。このような金属の例は白金、金、銀、
水銀、鉛、パラジウムおよび銅であり、このような金属
化合物の例はヨウ化銀、臭化銀、銅の含水酸化物、酸化
鉄、水酸化鉄または鉄の含水酸化物、アルミニウムの水
酸化物または含水酸化物、クロムの水酸化物または含水
酸化物、酸化バナジウム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、
硫化鉛、硫化水銀、硫酸バリウム、および二酸化チタン
である。一般に、有用な金属または金属化合物は公知の
技術によって容易に実証できる。
【０２６５】上記金属または金属化合物で被覆された重
合体核からなる分散粒子からなるゾルを使用することも
時として有利である。これら粒子は純粋な金属または金
属化合物の分散相と同様な性質をもっているが、大き
さ、密度および金属接触は最適となるように兼有させる
ことができる。
【０２６６】金属ゾル粒子は公知の多数の方法で調製で
きる。例えば、金ゾルの調製にＬｅｕｖｅｒｉｎｇは
Ｇ．ＦｒｅｎｓによるＮａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，２０（１９７３）中の記事
を引用している。
【０２６７】金属ゾル粒子はｓｂｐ構成要素または光増
感剤または化学発光性化合物への連結のため前述したよ
うな種々な官能基を含むように修飾できる。例えば、重
合体結合剤を使用することによって例えば多くの重金属
に強く結合するチオール基を含む重合体の粒子を被覆す
ることができ、あるいは、例えば磁性粒子を被覆するた
めＡｄｖａｎｃｅｄ ＭａｇｎｅｔｉｃｓによりＥＰＯ
特許願第８４４００９５２．２号明細書中に述べられた
金属粒子とトリアルコキシアミノアルキルシランとの反
応による重合体被覆物を結合し形成しうるシリル化剤を
用いて前記粒子を被覆できる。
【０２６８】染料微結晶−−純粋または混合の固体水不
溶性染料、なるべくは前記光増感剤として役立ちうる染
料の微小結晶。本発明方法に有用な染料微結晶は粒径２
０ｎｍから２０μｍをもつ。
【０２６９】染料微結晶をつくる一つの方法が米国特許
第４，３７３，９３２号明細書（Ｇｒｉｂｎａｕ等）に
記載されており、その開示をそのまま参考のため本明細
書中に取り入れている。Ｇｒｉｂｎａｕはコロイド状染
料粒子および疎水性染料または顔料の水性分散系を説明
しており、これらは免疫学的に反応性のある成分を直接
または間接的に付着できる。
【０２７０】一般に、染料粒子は染料を水に分散し次に
遠心することによりつくられる。染料ペレットが得ら
れ、次にガラスビーズを加えた水に再懸濁させる。この
懸濁系を室温で数日間回転させる。液体をデカンテーシ
ョンし、遠心し、液体の吸引後に染料粒子を得る。
【０２７１】染料微結晶のもう一つの製造法は、水と混
和しうる溶媒中に溶かした染料の溶液を水へゆっくり加
えることによる。もう一つの方法は固形染料の水懸濁液
の超音波処理による方法である。
【０２７２】染料粒子へのｓｂｐ構成要素の結合は、直
接または間接的な吸着あるいは共有化学結合による付着
により達成できる。後者は被覆物質および染料いずれか
の中に適当な官能基が存在することにより支配される。
例えば、官能基は、ジアゾ化した芳香族アミノ基および
望む官能基を含む化合物を染料のフェノール性基または
アニリノ基にカップリングすることにより、染料微結晶
の表面上に導入できる。
【０２７３】染料がカルボキシル基を有する場合、染料
微結晶をカルボジイミドにより活性化し、第一級アミノ
成分にカップリングできる。脂肪族第一級アミノ基およ
びヒドロキシル基は、例えば臭化シアンあるいはハロゲ
ン置換ジ−またはトリ−アジン類により活性化し、その
後、第一級アミノ成分との結合あるいは、例えば−Ｓ
Ｈ、または−ＯＨまたは基を含む成分との結合を行なう
ことができる。二官能性反応性化合物を使用することも
できる。
【０２７４】例えば、染料の第一級アミノ成分とｓｂｐ
構成要素との相互カップリングにグルタルアルデヒドを
使用し、そしてチオール基を含む成分への第一級アミノ
成分のカップリングに、例えばヘテロ−二官能性試薬、
例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネートを使用することができる。
【０２７５】化学発光性化合物−−一重項酸素と化学反
応を起こして準安定中間体を生成し、これが分解すると
同時にあるいは分解後に、２５０から１２００ｎｍの波
長範囲内の光を放出する物質。発光は分解および発光を
起こさせるエネルギー受容体または触媒が存在しなくて
も起こるのが普通である。この中間体はその生成後に加
熱しなくとも、あるいは補助的試薬を添加しなくとも自
然に分解することが好ましい。しかし、中間体生成後の
試薬の添加あるいは分解を促進するための高温の使用は
ある種の化学発光性化合物に対して要求されることがあ
るであろう。
【０２７６】化学発光性化合物は、通常は一重項酸素と
反応してしばしばジオキセタン類またはジオキセタノン
類を生成する電子豊富な化合物である。このような化合
物の典型例は、エノールエーテル、エナミン、９−アル
キリデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキル
アクリダン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、ア
リールイミダゾールおよびルシゲニンである。他の化学
発光性化合物は一重項酸素と反応して中間体を生じ、こ
れがその後別の試薬と反応して光を放出するというもの
である。
【０２７７】対象となる化学発光性化合物は一般に３０
０ナノメートル以上、通常は４００ｎｍ以上の波長で発
光する。単独か蛍光性分子と一緒に血清成分が光を吸収
する領域を越える波長で光を発する化合物は特に本発明
に使用されるであろう。血清の蛍光は５００ｎｍ以上で
急速に落ち、５５０ｎｍ以上では比較的重要でなくな
る。
【０２７８】それ故に、被検物質が血清中にあるときは
には、５５０ｎｍ以上の、なるべくは６００ｎｍ以上の
光を発する発光性化合物が特に関心をもたれている。化
学発光性化合物の自己増感を避けるためには、その化学
発光性化合物が光増感剤を励起するのに用いた光を吸収
しないことが好ましい。一般に増感剤を５００ｎｍより
長波長の光で励起するのが好ましいので、化学発光性化
合物による光の吸収は５００ｎｍ以上で非常に低いこと
が望ましい。
【０２７９】化学発光性化合物から長波長発光を望む場
合には、化学発光性化合物にピレンのような長波長エミ
ッターを結合して用いることができる。別法として、化
学発光性化合物を含む媒質中に蛍光性分子を含めること
もできる。特に適当な蛍光性分子は活性化された化学発
光性化合物によって励起され、化学発光性化合物の発光
波長よりも長波長で、通常は５５０ｎｍより長波長で発
光するであろう。また蛍光分子は光増感剤を活性化する
ために使用した光の波長で吸収しないことも普通望まし
い。有用な染料の例にはローダミン、エチジウム、ダン
シル、Ｅｕ（ｆｏｄ）3 、Ｅｕ（ＴＴＡ）3 、Ｒｕ（ｂ
ｐｙ）3 ++（式中、ｂｐｙ＝２，２′−ジピリジル）な
どが包含される。一般に、これら染料はエネルギー
【０２８０】移動過程で受容体として作用し、なるべく
は高い蛍光量子収率を有しかつ一重項酸素と迅速に反応
しないことが好ましい。これらは粒子へ化学発光性化合
物を添加するのと同時に粒子に加えることができる。
【０２８１】電子豊富なオレフィンは一般に式：
【化１】 式中、Ａは電子供与基、例えばＮ（Ｄ）2 、ＯＤ、ｐ−
〔Ｃ6 Ｈ4 Ｎ（Ｄ）2 〕2 、フラニル、Ｎ−アルキルイ
ミダゾール、Ｎ−アルキルピロリル、２−インドリルな
どであり、またＤは、例えばアルキルまたはアリールで
よく、Ａはオレフィン性炭素に直接結合するか、または
他の共役二重結合を介して結合するかのいずれかであ
る、を有するオレフィンと共役した電子供与基をもつ。
【０２８２】オレフィン１中のＣ原子の他の原子価は１
から５０原子の置換基で満されるが、前記基は一緒に結
合して縮合または非縮合の１個以上の環、例えばシクロ
アルキル、フェニル、７−ノルボルニル、ナフチル、ア
ントラシル、アクリダニル、アダマンチルなどを形成す
ることができる。
【０２８３】本発明に使用されるエノールエーテルは一
般に構造：
【化２】 式中、Ｄ1 は独立して引用され、そしてＨおよび１から
５０原子の置換基、なるべくはアリール、ヒドロキシア
リール、アミノアリール、ｔ−アルキル、Ｈ、アルコキ
シ、ヘテロアリールなどからなる群から選ばれ、そして
その炭素原子の一つまたは両方と一緒に結合して環、例
えばシクロアルケン、アダマンチリデン、７−ノルボル
ニリデンなどを形成することができ、Ｄ2 はなるべくは
アルキルまたはアリールがよい、を有する。典型的なエ
ノールエーテルは２，３−ジアリール−４，５−ジヒ
【０２８４】ドロジオキセン類：
【化３】 式中、Ｘ＝Ｏ、ＳまたはＮＤ2 、ＡｒおよびＡｒ′は置
換アリール（少なくとも１個の置換基はアミノ、エーテ
ルまたはヒドロキシル基として存在する）を含めてアリ
ールである、であるが、これは例示であって制限ではな
い。
【０２８５】９−（ジアルコキシメチリデン）−キサン
テン：
【化４】 アルコキシビニルピレン：
【化５】 ９−アルコキシメチリデン−１０−アルキルアクリダ
ン：
【化６】
【０２８６】本発明に使用するビニルスルフィド類は一
般に酸素原子を硫黄原子により置き換えた上記エノール
エーテルを包含する。
【０２８７】本発明に使用するエナミンは一般に構造：
【化７】 式中、Ｄ3 はそれぞれアルキルまたはアリールでよく、
オレフィン上の残りの置換基はＨおよび１から５０原子
の置換基、なるべくはアリール、ヒドロキシアリール、
アミノアリール、ｔ−アルキル、Ｈ、アルコキシ、ヘテ
ロアリールなどから選ばれる、を有する。
【０２８８】典型的なエナミンは下記の化合物である
が、これらは例示であって制限ではない：
【０２８９】ジアルキルアミノビニルピレン：
【化８】
【０２９０】ジアルキルアミノビニル−９，１０−ジフ
ェニルアントラセン
【化９】 式中、ψ＝フェニルなど。
【０２９１】９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダ
ン類は一般に構造：
【化１０】 式中、Ｄ4 はアルキルで、オレフィン上の残りの置換基
はＨ、および１から５０原子の置換基、なるべくはアリ
ール、アルコキシアリール、アミノアリール、ｔ−アル
キル、Ｈ、アルコキシ、ヘテロアリール、などがよく、
また一緒に結合して例えばアダマンチル、シクロペンチ
ル、７−ノルボルニルなどを形成できる、を有する。
【０２９２】典型的なアクリダン類は置換９−ベンジリ
デン−１０−メチルアクリダンおよび９−ジフェニルメ
チレン−１０−メチルアクリダン〔Ｓｉｎｇｅｒ等、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：３８２３（１９
８３）およびＭｃＣａｐｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．９
４４（１９７７）によって記述されている〕、９−メチ
リデン−１０−メチルアクリダン〔Ｅ．Ｗｈｉｔｅ，Ｃ
ｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１４９１（１９７９）により記
述されている〕であるが、これらは例示としてあげたの
であって制限ではない。
【０２９３】炭素（Ｃ）原子上の置換基が対応するオレ
フィン：
【化１１】 上に存在する基である一重項酸素と化学発光性構造物と
の反応で生ずるジオキセタンのあるものは自然に分解
し、またあるものは加熱するかまたは、通常は電子に富
むエネルギー受容体による触媒作用によるか、またはそ
の両方により分解して光を放出する。ある場合には、ジ
オキセタンは自然にヒドロペルオキシドに変換される
が、そのときジオキセタンを再生成し、分解および発光
を可能にするために塩基性ｐＨが要求される。
【０２９４】化学発光性化合物のもう一つの群は２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類である。最も
よく知られた化合物はルミノールであり、このものは５
−アミノ化合物である。この群中の他の化合物には置換
６−アミノ，５−アミノ−６，７，８−トリメトキシお
よびそのジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類縁体が含まれ
る。これら化合物は多段階で一重項酸素により酸化され
分解を起こしてフタレート誘導体を生成し光を放出す
る。
【０２９５】もう一種の一群の化学発光性化合物は、
２，４，５−トリフェニルイミダゾール化合物であり、
これらの化合物は親化合物と共通の名称としてロフィン
（ｌｏｐｈｉｎｅ）の名称を有する。この化学発光性類
似化合物には、パラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ
置換化合物が含まれる。
【０２９６】さらに別の群の化学発光性化合物には、ビ
ス−アリーレン化合物が含まれ、この化合物はＳｉｎｇ
ｅｒによりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１：２６８５（１
９７６）に記載されているビス−９，９′−アクリジリ
デンおよびその１０，１０′−ジメチル誘導体、ルシゲ
ニンおよびビス−９，９′−キサンチリデンを包含す
る。前記要件を満たすその他の化学発光性化合物は、１
９８９年１２月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出
願０，３４５，７７６に見い出すことができる。
【０２９７】光化学的に活性化できる化学発光性化合物
（ＰＡＣＣ）は、光による直接励起または光吸収励起に
よって、あるいは一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）酸素との反
応によって化学反応を受け、通常２５０〜１２００ｎｍ
の波長範囲内の光の同時的にまたは引続いて発光を伴な
い、分解できる準安定反応生成物を生成する物質であ
る。「光活性化できる」の用語には、「光化学的に活性
化できる」ことが含まれる。本発明において好適なＰＡ
ＣＣは一重項酸素と反応して、ジオキセタン化合物また
はジオキセタンオン化合物を生成する化合物である。後
者の化合物は通常、電子に富むオレフィン類である。こ
のような電子に富むオレフィン類の例には、エノールエ
ーテル類、エナミン類、９−アルキリデン−Ｎ−アルキ
ルアクリダン類、アリールビニルエーテル類、ジオキセ
ン類、アリールイミダゾール類、９−アルキリデン−キ
サンタン類およびルシゲニンがある。「ＰＡＣＣ」の用
語の中に含まれるその他の化合物は、ルミノールおよび
他のフタルヒドラジド化合物、ならびに光化学的に不安
定な保護基によって保護されていることから化学発光反
応を受けることから保護されている化学発光性化合物、
たとえばホタルルシフェリン、アクアホリン、ルミノー
ルなどの化合物を包含する。
【０２９８】有利なＰＡＣＣは好ましくは、３００ナノ
メーター以上、好ましくは５００ナノメーター以上、さ
らに好ましくは５５０ｎｍ以上の波長で発光するもので
ある。試料成分が光吸収に有意に関与する波長域をこえ
た波長で光を吸収し、かつまた発光する化合物は本発明
において特に使用される。血清の吸光は５００ｎｍ以上
で急速に減少し、６００ｎｍ以上では無意味になる。従
って、６００ｎｍ以上の光を発光する化学発光性化合物
は特に有利である。しかしながら、試料の干渉吸収が無
い場合には、またはさらに長い波長の光を吸収し、それ
によって化学発光性化合物が活性化される場合には、さ
らに短い波長で吸光性の化学発光性化合物が有用であ
る。
【０２９９】本発明のＰＡＣＣは標識（ラベル）として
使用され、ｓｂｐメンバーと会合させる。下記のＰＡＣ
Ｃ１は一般に、アリル系ＣＨまたはＮＨ基を含有してい
ない。
【０３００】本発明のＰＡＣＣとして適する電子に富む
オレフィン類は、本発明における「化学発光性化合物」
の範中にある。このようなＰＡＣＣは通常、オレフィン
に直接に結合している水素原子を有する原子を有してい
ないが、ただしこの原子が小さい二環状環系の架橋先端
位置などのように、二重結合に関与できない位置にある
場合は除かれる。さらに好適なオレフィン類は、室温で
急速に（６０分より短い時間、好ましくは５分より短い
時間、望ましくは３０秒より短い時間で）崩壊するジオ
キセタンを生成するものである。これらのジオキセタン
化合物は単独で、または蛍光エネルギー受容体と共同し
て、発光することができる。
【０３０１】本発明のＰＡＣＣとして適するエノールエ
ーテル類はまた本発明における「化学発光性化合物」の
範囲内にある。特に有用なエノールエーテル化合物は、
そのアリール環が蛍光を付与する位置で電子供与性基に
より置換されているエーテルと同一炭素上にアリールを
有する化合物である。電子供与性基は、たとえばｍ−ヒ
ドロキシフェニル、ｍ−ジメチルアミノ−フェニル、１
−（５−アミノナフチル）、ピリル、１−（３−ヒドロ
キシピリル）、アントラシル、クリシルなどであること
ができる。２位置に存在する基の一方または両方がアリ
ールであることができ、この場合には、１−炭素の酸素
による置き換えによって生成されるケトンが蛍光体であ
ることができ、このアリールはたとえばβ−ナフチルま
たは２−アントリルである。
【０３０２】これらに制限されないが、エノールエーテ
ル化合物の例には、下記の化合物がある：
【化１２】
【化１３】 （式中、Ｘ1 は、Ｈ、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3 、ＯＣＨ3 また
はＯＨであり、この化合物はＢｒｏｎｓｔｅｉｎ等によ
り米国特許第４，９５６，４７７号に記載されている）
【化１４】 （この化合物は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等により、米国特
許第４，９５６，４７７号に記載されている）
【化１５】 （式中、Ｘ2 は、Ｈ、ＯＨ、Ｎ（ＣＨ3 ）2 またはＯＣ
Ｈ3 であり、この化合物はＰ．Ｓｃｈａａｐにより、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：３５０４（１
９８２）に、およびＰ．Ｓｃｈａａｐにより、Ｐｈｏｔ
ｏｃｈｅｍ．ａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ３０：
３５（１９７９）に記載されている）
【化１６】 （式中、Ｘ2 は上記定義のとおりであり、Ｘ3 はＨ、Ｏ
ＣＨ3 またはＮ（ＣＨ3 ）2 であり、この化合物はＰ．
Ｓｃｈａａｐ、Ｒｅｐｏｒｔ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｏｃｔｏｂｅｒ
１５、１９８６ａｎｄ Ｓ．Ｄ．Ｇａｇｎｏｎ、Ｐｈ．
Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ（１９８２）により開示されている）
【化１７】 （式中、Ｘ4 ＝Ｏ、Ｓ、ＣＨ3 ＮまたはＰｈＮであり、
そしてＹ＝Ｏ、ＳまたはＣＨ3 Ｎであり、そしてＰｈ＝
フェニルであり、この化合物はＰ．Ｓｃｈａａｐにより
Ｒｅｐｏｒｔ ｔｏ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｎａｖａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８７年３月１７日に開示され
ている）
【化１８】 （この化合物は、Ｐ．Ｓｃｈａａｐにより、Ｒｅｐｏｒ
ｔ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９
８６年１０月１５日に記載されている）。
【０３０３】本発明のＰＡＣＣとして適するエナミン類
はまた、本発明における「化学発光性化合物」の範囲内
にある。これらに制限されないが、特に有用なエナミン
化合物の例には、上記エノールエーテル化合物３〜５に
おいて、ＯＣＨ3 がＮ（ＣＨ3 ）2 で置き換えられてい
る化合物がある。別の例には、次式で示される化合物が
ある：
【化１９】
【０３０４】ＰＡＣＣとして適する９−アルキリデン−
Ｎ−アルキルアクリダン化合物はまた、本発明における
「化学発光性化合物」の範囲内にある。特に有用な化合
物は、式（７）において、オレフィン上の残りの置換基
がフェニル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシ
フェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−
モルホレノであるか、または一緒になって環、たとえば
アダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリド、キサンタニ
リジン、１−（３，４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデ
ン）などを形成していてもよい化合物である。本発明に
おいて、ラベルとして特に有用な９−アルキリデン−Ｎ
−アルキルアクリダン化合物の例には、これらに制限さ
れないが、下記の化合物がある：
【化２０】 （この化合物は、Ｓｉｎｇｅｒにより、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．４１、２６８５（１９７６）に記載されてい
る）
【化２１】 （この化合物は、Ｅ．ＷｈｉｔｅによりＣｈｅｍ．Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、１２、１４９１（１９７９）に記載されて
いる）
【化２２】 （式中、Ｒ4 およびＲ5 は独立して、Ｈまたはフェニル
であり、この化合物はＳｉｎｇｅｒ等により、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０２；３８２４（１９８
３）に記載されている）
【化２３】 （この化合物はＭｃＣａｐｒａにより、Ｃｈｅｍ．Ｃｏ
ｍｍ．、Ｎ２４、９４４（１９７７）およびＳｉｎｇｅ
ｒ等による上記刊行物に記載されている）
【化２４】 （この化合物は、ＭｃＣａｐｒａによる上記刊行物に記
載されている）
【化２５】 （この化合物は、ＭｃＣａｐｒａによる上記刊行物に記
載されている）。
【０３０５】上記刊行物の関連記載をここに引用して組
入れる。本発明のＰＡＣＣとして有用な９−アルキリデ
ン−キサンタン化合物は一般に、次の構造を有する：
【化２６】 この構造式において、オレフィン上の置換基はＨおよび
原子数１〜５０の置換基、好ましくはフェニル、ナフチ
ル、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチル
アミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホレノからなる
群から選ばれ、そしてまたこれらの置換基は一緒になっ
て、たとえばアダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリ
ド、キサンタニリジン、１−（３，４−ベンゾ−５−ヒ
ドロフリリデン）など、たとえば９−フェニル−メチリ
デン−キサンテンを形成していてもよい。
【０３０６】もう一種の一群のＰＡＣＣは、２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物である。この
種の最も一般的に知られている化合物はルミノールであ
り、この化合物は５−アミノ化合物である。この一群の
中の他の化合物には、５−アミノ−６，７，８−トリメ
トキシ類似体およびジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類似
体が含まれる。ルミノールは検定法においてラベルとし
て使用されているが、ルミノールの励起が、本発明の場
合のような光活性化によるものではなく、化学的に行な
われていたことに留意すべきである。これらの化合物は
一重項酸素により、およびまた引続く過酸化物または過
酸化水素との反応によって、発光をともなう分解を受
け、１，４−フタラジニジオン化合物に酸化される。
【０３０７】他の一群のＰＡＣＣには、２，４，５−ト
リフェニルイミダゾール化合物があり、この化合物はそ
の親の化合物と共通の名称として、ロフィン（ｌｏｐｈ
ｉｎｅ）と称されている。その化学発光性類似体はパラ
−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換体を包含する。
前記の要件を満たす、他のＰＡＣＣは、１９８９年１２
月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出願第０，３４
５，７７６号に見い出すことができる。
【０３０８】保護されている化学発光性化合物は、光分
離性の保護基を有するＰＡＣＣである。保護基が光活性
化によって分離されると、この化合物は自発的に、ある
いは検定メジウム中に存在する成分により活性化され
て、光を発する。光分離性保護基の例は、これらに制限
されないものとして、ｏ−ニトロベンジル、ｏ−アシル
フェニルエチル、アルコキシベンジルなどを包含し、こ
の基は通常、ＰＡＣＣのヘテロ原子に結合している。保
護されている化学発光性化合物の一部を形成することが
できるＰＡＣＣの例には、前記の電子に富むオレフィン
類がある。本発明のこの態様に係る保護されている化学
発光性化合物の例には、下記の化合物がある：
【０３０９】
【化２７】
【０３１０】保護されている化学発光性化合物の場合に
は、光活性化または光分解の前に、いずれか必要な助剤
を存在させる。このような助剤は酵素および酵素のため
の基質を包含することができる。いくつかの場合には、
いづれもｐＨの制限が必要である。その他の助剤には、
アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ、過酸化水素などがある。上記原則によって指
示される、いずれか適当な保護されている化学発光性化
合物の選択に係る追加の助剤は、当業者にとって明白な
ことである。たとえば、化合物１の場合には、ホタルル
シフェラーゼおよびそのルシフェリン基質を使用するこ
とができる。化合物２の場合には、塩基性メジウム（ｐ
Ｈ＞９）を維持することだけが必要である。２Ａの場合
には、過酸化水素およびホースラディッシュペルオキシ
ダーゼを使用することができる。
【０３１１】補助物質−−本発明に係る検定法において
は、種々の補助物質をしばしば使用する。一例として、
検定メジウム中には通常、緩衝剤を存在させ、また検定
メジウムおよび検定成分のための安定剤を存在させる。
多くの場合には、これらの添加剤に加えて、タンパク
質、たとえばアルブミン類、有機溶剤、たとえばホルム
アミド、四級アンモニウム塩、ポリカチオン、たとえば
デキストランスルフェート、界面活性剤、特に非イオン
性界面活性剤、結合増強剤、たとえばポリアルキレング
リコール類などを含有させることができる。増感剤が照
射によるよりも、化学的に活性化されるものである場合
には、補助剤として、過酸化水素をしばしば含有させ
る。化学発光性化合物の発光波長を、より長い波長に移
すことが望まれる場合には、またはその酸素活性化形態
の分解を触媒させることが望まれる場合には、蛍光分子
を使用することができる。
【０３１２】全体的に、または部分的に引続いて、本発
明で使用される試料および各種助剤を、夾雑ではなく、
（同時的に）配合する場合には、１種または２種以上の
使用剤を残りの使用剤の１種または２種以上と組合せ
て、準配合物を生成させることができる。この準配合物
はそれぞれ、次いで本発明の工程の１つまたは２つ以上
に付することができる。すなわち、これらの準配合物は
それぞれ、所望の結果の１つまたは２つ以上が得られる
条件の下にインキュベートすることができる。
【０３１３】エネルギー受容体−本明細書において、こ
の物質はまた、蛍光エネルギー受容体の用語でも表わさ
れている。３１０ｎｍより高い、通常３５０ｎｍより高
い、そして好ましくは約４００より高い、実質的吸光値
を有する発色団。エネルギー受容体の選択はまた、特定
のＰＡＣＣによって支配される。エネルギー受容体はＰ
ＡＣＣによって発射される光を吸収することができるも
のでなければならない。好ましくは、エネルギー受容体
の最大吸収値は化学発光性化合物の最大発光と同様の波
長であるべきである。吸光係数が高いことが望ましく、
通常１０より大きく、好ましくは１０3 より大きく、特
に好ましくは１０4 より大きいことが望ましい。
【０３１４】エネルギー受容体として有用な種々の一連
の分子はＵｌｌｍａｎ等により、コラム８および９の
Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶに記載されており、これらの関
連記載をここに引用して組入れる。一般に、エネルギー
受容体は蛍光化合物または蛍光体であるが、非常に弱い
蛍光を有するか、または蛍光を有していないエネルギー
受容体も有用である。
【０３１５】多くの上記の望ましい性質を有する一群の
蛍光体はキサンテン染料であり、この染料には、３，６
−ジヒドロキシ−９−フェニル−キサントヒドロールか
ら誘導されるフルオレセイン類、３，６−ジアミノ−９
−フェニルキサンチドロールから誘導されるローダミン
類およびローザミン類が含まれる。ローダミン類および
フルオレセイン類は、９−ｏ−カルボキシフェニル基を
有し、９−ｏ−カルボキシフェニル−キサントヒドロー
ルの誘導体である。これらの化合物は、結合部位とし
て、または結合性官能性基として、フェニル基上に置換
基を有するものとして市販されている。たとえば、アミ
ノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物
が市販されている。
【０３１６】他の一群の蛍光化合物は、アルファまたは
ベータ位置に、通常アルファ位置に、アミノ基を有する
ナフチルアミン化合物である。ナフチルアミノ化合物の
中には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネー
ト、１−アニリン−８−ナフタレンスルホネートおよび
２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが
含まれる。
【０３１７】活性化されると、タンパク質と反応する染
料前駆化合物としては、３−フェニル−７−イソシアナ
トクマリン；９−イソチオシアナトアクリジンなどのア
クリジン化合物；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾイル）
フェニル）マレイミド；下記の式で示される化合物など
のベンゾキサジアゾール化合物：
【化２８】 ４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−
ジアゾール；４−ジメチルアミノ−４′−イソチオシア
ナトスチルベンおよび４−ジメチルアミノ−４′−マレ
イミドスチルベンなどのスチルベン化合物；が包含され
る。
【０３１８】さらに官能性にして、ｓｂｐメンバーと組
合させることができる、その他の染料には、アクリジン
オレンジ、７−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−４−
ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；Ｎ，
Ｎ′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンｐ−トルエ
ンスルホネート；８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレン
トリスルホン酸および１−ピレン酪酸などのピレン化合
物；メロシアニン５４０、ローズベンガル；およびその
他の容易に使用できる蛍光発光分子が包含される。
【０３１９】ポリヌクレオチド検定の場合には、多くの
種々のエネルギー受容体を使用することができるが、二
重鎖核酸に結合すると、蛍光を増すものが好ましい。エ
ピジウムブロマイドおよびアクリジンオレンジなどのよ
うに、侵入する染料は代表的例である。Ｂａｒｔｏｎに
よって開発されたルテニウム誘導体（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：４９６０）は、特に
重要であり、これはこの化合物が挿入されると劇的に切
り換えられるからである。別様には、エネルギー受容体
は化学発光性化合物でラベルしたプローブに接して結合
することができる第二のポリヌクレオチドプローブに結
合させることができ、あるいはエネルギー受容体は結合
されずに、溶液中で自由に分散されるものであってもよ
い。蛍光を有していないエネルギー受容体も含むことが
でき、これは広く種々のアゾ染料、シアニン染料、４，
５−ジメトキシフルオレセイン、ホルマザン類、インド
フェノール類などのいずれでもあることができる。
【０３２０】本発明の態様の一つは、被検物質の測定方
法である。この方法は、増感剤によって発生される短命
な一重項酸素がその自発的崩壊の前に、化学発光性化合
物を反応することができるほど極めて接近することがで
きる量の化学発光性化合物及び増感剤に対して、被験物
質（存在する場合）が影響を及ぼすような条件の下に、
被験物質を含有するものと予想されるメジウムを処理す
ることからなる。この方法はまた、化学発光性化合物に
よって生じるルミネセンスの強度の測定を包含する。生
じるルミネセンスの強度はメジウム中の被験物質の量に
関連する。化学発光性化合物は一重項酸素によって活性
化することができ、そして増感剤は、通常、光励起に応
答する一重項酸素の生成および引続く分子状酸素へのエ
ネルギー転移を触媒する。多くの場合に、表面を増感剤
および化学発光性化合物と極めて接近させる。この場合
の表面は好ましくは懸濁できる粒子の表面である。化学
発光性化合物の活性化によって生成される生成物は、光
の発射をともない、好ましくは自発的に分解する。
【０３２１】この方法は増感剤の分子と化学発光性化合
物の分子とを、検定メジウムのカサ高の溶液中における
それらの間の平均間隔よりも相互に接近させるか、また
はこれらの分子を干渉する、被験物質の存在を予想させ
る。この分離は被分析試料中に存在する被験物質の量に
依存する。
【０３２２】増感剤分子は、化学発光性化合物と会合さ
れていないと、水性メジウム中で崩壊を受ける前に化学
発光性化合物に到達することができない一重項酸素を生
成する。しかしながら、増感剤と化学発光性化合物とが
被験物質の量に応じて、相互に極めて接近すると、増感
剤の照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受け
る前に、化学発光性化合物を活性化することができる。
多数の化学発光性化合物分子および（または）増感剤分
子を表面と会合させることができ、かつまた拡散を表面
に限定することができることから、増感剤および化学発
光性化合物と結合している表面の存在は、化学発光性化
合物に対する一重項酸素の崩壊前の効力または作用を増
加させる。従って、被験物質の存在の関数として、増感
剤と化学発光性化合物とを接近させる表面を使用するこ
とは、好ましいことである。本発明の検定法は、広範囲
の種々の被験物質を、簡単で、効率良く、再現可能な方
法で検出および測定するための方法を提供する。この方
法には、反応中に生成される光の量を測定するための簡
単な装置を使用することができる。
【０３２３】化学発光性化合物と極めて接近する増感剤
の量は、増感剤と化学発光性化合物とがそれぞれ、ｓｂ
ｐメンバーと会合されていることから、被験物質の存在
によって影響を受ける。これは、多くの方法で達成する
ことができ、従って、「会合」（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ）の用語で表わすことにする。増感剤および
化学発光性化合物は、ｓｂｐメンバーに共有結合するた
めの官能性基を含有でき、あるいはｓｂｐメンバーまた
はｓｂｐメンバーに結合できる基は増感剤および（また
は）化学発光性化合物に結合するための官能性基を含有
することができる。
【０３２４】この結合は２種の分子間の直接結合によっ
て達成することができ、あるいはｓｂｐメンバーと増感
剤または化学発光性化合物との間に結合性基を使用する
ことができる。もう一つの態様においては、増感剤およ
び化学発光性化合物の一方または両方を表面に結合させ
るか、または粒子中に配合することもでき、ここにま
た、ｓｂｐメンバーを結合させる。これらの方法の両方
において、ｓｂｐメンバーはそれぞれ、被験物質または
その濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分
に直接的に、または間接的に結合することができる。
【０３２５】増感剤および化学発光性化合物は、粒子の
少なくとも１つの相中に可溶性であることにもとづい
て、粒子中に配合することができ、この場合には、増感
剤および化学発光性化合物は、一団の検定メジウム中よ
りも、粒子内に高濃度で存在する。増感剤および化学発
光性化合物を粒子に共有結合させる場合には、増感剤お
よび化学発光性化合物、あるいは粒子またはその成分を
官能性にして、増感剤および化学発光性化合物と粒子と
を結合する手段を得る。粒子が油滴またはリポソームで
ある場合には、増感剤および化学発光性化合物は１個ま
たは２個以上の長鎖状炭化水素に結合させることがで
き、この炭化水素鎖はそれぞれ、少なくとも１０〜３０
個の炭素原子を有するものである。粒子が滴状フルオロ
カーボンである場合には、これらの粒子中に配合する増
感剤または化学発光性化合物をフッ素化して、溶解性を
増加させ、かつまた別のラベルと結合した別の粒子中へ
の交換を減じることができる。この場合に、結合に使用
する炭化水素は好ましくは、フルオロカーボン鎖で置き
換えることができる。
【０３２６】シリコーン液状粒子の場合には、増感剤お
よび化学発光性化合物はポリシロキサンに結合させるこ
とができる。粒子１個当りの増感剤または化学発光性化
合物の分子の数を最大にするためには、通常、増感剤ま
たは化学発光性化合物の電荷および極性度を最少にし、
これが粒子の非水性部分に存在するようにすることが望
ましい。粒子がリポソームであり、かつまた増感剤また
は化学発光性化合物をリポソームの水性相に保有したい
場合には、極性または電荷が高い増感剤または化学発光
性化合物を使用することが好ましい。
【０３２７】増感剤および化学発光性化合物をどのよう
にして結合させるかは問題ではない。どちらの化合物も
検定期間中に、そのｓｂｐメンバーから脱離することが
できないものであり、かつまた別の一組の増感剤および
化学発光性化合物に結合しているｓｂｐメンバーと結合
することができないものであることが必須要件である。
すなわち、これらの化合物のそれらの各ｓｂｐメンバー
からの脱離は検定に要する時間よりも遅くあるべきであ
る。
【０３２８】化学発光性化合物は、被験物質あるいはそ
の濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分に
対し直接的にまたは間接的に結合できるｓｂｐメンバー
に結合させることができる。「直接的にまたは間接的に
結合できる」の用語は、指定の実体がこの実体に特異的
に結合できる（直接的に）か、または特異結合性の一組
のメンバーにまたは別の実体を結合できる２種または３
種以上のｓｂｐメンバーの複合体に結合できる（間接的
に）ことを意味する。
【０３２９】表面は一般にそこに結合されているｓｂｐ
メンバーを有する。好ましくは、化学発光性化合物を、
通常、懸濁できる粒子内の表面と会合させる。このｓｂ
ｐメンバーは一般に、被験物質または被験物質に対する
レセプターに、直接的にまたは間接的に結合することが
できる。増感剤と会合されたｓｂｐメンバーおよび化学
発光性化合物と会合されたｓｂｐメンバーが両方とも
に、被験物質に結合できる場合には、サンドイッチ検定
法が得られる。増感剤と会合したｓｂｐメンバーまたは
化学発光性化合物と会合したｓｂｐメンバーのうちの一
方が被験物質および被験物質類縁体の両方と結合できる
場合には、競合式検定法が得られる。化学発光性化合物
の粒子表面への結合または粒子内への配合は一般に、増
感剤の粒子表面への結合または粒子内への配合に係る前
記原則と同一の原則によって支配される。
【０３３０】増感剤は通常、上記反応体を含有するメジ
ウムを照射することによって、化学発光性化合物を活性
化させる。このメジウムは増感剤を励起状態に変換する
のに充分のエネルギーを有する波長を有する光によって
照射しなければならない。これによって、増感剤は分子
状酸素を一重項状態の酸素に活性化することができるよ
うにされる。分子状酸素を励起させることができる増感
剤の励起状態は一般に、三重項状態（ｔｒｉｐｌｅｔ）
であり、この状態は基底状態の増感剤よりも、約２０、
一般に少なくとも２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ高いエネルギー
を有する。好ましくは、メジウムを、約４５０〜９５０
ｎｍの波長を有する光により照射するが、さらに短い波
長、例えば２３０〜９５０ｎｍの波長の光を使用するこ
ともできる。生成されるルミネセンスは、写真により、
肉視による、または光度測定によるなどいずれか慣用の
方法によって測定し、その量を決定することができる。
この測定量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３３１】増感剤は通常、この増感剤によって効果的
に吸収される波長の光により照射することによって励起
させることが好ましいが、その他の励起手段も使用する
ことができ、たとえば励起状態のエネルギー供給体、た
とえば第二の増感剤からのエネルギー転移によることも
できる。第二の増感剤を使用する場合には、増感剤によ
っては充分に吸収されないが、第二の増感剤によっては
充分に吸収される波長の光を使用することができる。こ
の第二の増感剤は、たとえば第一の増感剤を有する粒子
の表面に結合させるか、またはこの粒子内に配合するこ
とによって、第一の増感剤と会合させるか、またはメン
バーを有し、化学発光性化合物を含有する懸濁可能な粒
子の組合せを用意し；（ｂ）この組合せを光により処理
し、その増感剤を励起させ；次いで（ｃ）そこから発射
されるルミネセンスの量に関して、この組合せを検査す
る；ことからなる。
【０３３２】発射されるルミネセンスの量はメジウム中
の被験物質の量に関連する。好ましくは、化学発光性化
合物を懸濁可能な粒子内に配合し、かつまたｓｂｐメン
バーをこの粒子に結合させる。さらに好ましくは、増感
剤を、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する、第二の
懸濁可能な粒子内に配合する。
【０３３３】本発明の方法および組成物は、リガンド−
レセプターなどのｓｂｐメンバーを包含する検定法の大
部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合
検定法などに会合するようにすることができる。第二の
増感剤を使用する場合には、この第二の増感剤は通常、
第一の増感剤の最低エネルギー三重項状態よりも高いエ
ネルギーの、最低エネルギー三重項状態を有する。
【０３３４】６３２．６ｎｍの放射線を有するヘリウム
−ネオンレーザーは励起用の安価な光源である。約６２
０〜約６５０ｎｍの領域に最大吸収を有する増感剤はこ
の放射線のヘリウム−ネオンレーザーに適合し、従って
本発明において特に有用である。
【０３３５】本発明のもう一つの態様は、被験物質の測
定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含
有するものと予想されるメジウム、（２）その励起状態
で、酸素と一重項状態に活性化することができる増感剤
（この増感剤はｓｂｐメンバーと会合されている）、お
よび（３）そこに結合されているｓｂｐ適応させること
ができる。これらの検定法は、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ）または不均一系（ｈｅｔｒｏｇｅｎｏｕｓ）
競合法もしくは非競合法であることができる。検定成
分、化学発光性化合物および増感剤は、（１）表面（使
用する場合）、（２）核酸またはレセプター、および
（３）核酸またはリガンドとともに、多くの方法で使用
することができる。会合は、共有結合または非共有結合
であることができる。前記および後記の説明から、特定
の所望の検定に応じて、当業者は適当な会合を選択する
ことができる。
【０３３６】均一系検定法においては、試料を必要に応
じて予備処理し、望ましくない物質を除去する。非競合
的サンドイッチ検定法における反応は、被験物質に対し
て相補的であり、化学発光性化合物と会合しているｓｂ
ｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、レセプタ
ーまたはリガンド）；被験物質に対してまた相補的であ
り、ｓｂｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、
レセプターまたはリガンド）と会合されている増感剤；
対象試料；および必要な助剤；を包含する。好ましく
は、増感剤および化学発光性化合物の一方または両方
を、ｓｂｐメンバーが結合されている粒子内に配合す
る。
【０３３７】競合法においては、一つのｓｂｐメンバー
が被験物質の誘導体であることができ、そして他の一つ
のｓｂｐメンバーが被験物質に対して相補的であること
ができる（たとえば、抗体）。どちらの方法でも、諸成
分は同時的に、または順次、全体的にまたは部分的に、
配合することができる。活性化した増感剤によって生成
される一重項状態酸素の、化学発光性化合物に対する反
応能力は、ｓｂｐメンバーの被験物質に対する結合によ
って支配される。他方、被験物質の存在または量は、照
射、加熱または化学剤の添加により、好ましくは照射に
より、増感剤の活性化によって発射される光の量を測定
することにより、決定することができる。この結合反応
およびその程度の検出は両方ともに、分離することな
く、均一溶液中で行なうことができる。このことは、化
学発光性を利用する従来技術の方法に優る本発明の利点
である。
【０３３８】不均一系検定法においては、検定成分は、
ｓｂｐメンバーである被験物質を含有するものと予想さ
れる試料；化学発光性化合物および増感剤からなる群の
一員を会合して有する、非分散性の表面または粒子のど
ちらかであることができる支持体に結合されているｓｂ
ｐメンバー；およびｓｂｐメンバーが独立して、直接的
にまたは間接的に被験物質またはこの被験物質用のレセ
プターを結合できるように、会合されている、上記群の
他の一員を有するｓｂｐメンバーからなる。
【０３３９】これらの成分は一般に、同時的に、または
順次、全体的に、または部分的に、配合することができ
る。この表面または粒子を次いで、液相から分離し、次
いで分離した相または液相のどちらかを、通常、対象相
の照射によって、その増感剤を活性化させる条件に付
し、次いで発射された光の量を測定する。
【０３４０】被験物質検定における結合反応は、正常に
は、一般に最適検定感度を提供する、中程度のｐＨにお
いて、水性メジウム中で行なう。好ましくは、増感剤の
活性化もまた水性メジウム中で行なう。しかしながら、
分離工程を使用する場合には、たとえばアセトニトリ
ル、アセトン、トルエン、ベンゾニトリルなどのような
非水性メジウムおよび非常に高いｐＨ、例えば１．０よ
り大きいｐＨ、あるいは非常に低いｐＨ、すなわち４．
０より小さいｐＨ、通常では、非常に高いｐＨを有する
水性メジウムを使用することもできる。上記で説明した
ように、この検定法は検定用成分または生成物のいづれ
かを分離することなく（均一系）、あるいは分離して
（不均一系）、行なうことができる。
【０３４１】水性メジウムは水単独であってもよく、あ
るいは０．０１〜８０容量パーセントの補助溶剤を含有
していてもよいが、通常、ｓｂｐメンバーとして、タン
パク質が使用される場合には、水性メジウムは４０％よ
り少ない量の補助溶剤を含有する。結合反応用のメジウ
ムのｐＨは通常、約４〜１１の範囲、さらに一般的には
約５〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲
である。このｐＨが、一重項状態酸素の発生期間中に変
化しない場合には、このｐＨは通常、結合メンバーの最
適結合ｐＨと信号の生成および検定用の他の成分の安定
に最適のｐＨとの間にある。
【０３４２】信号の生成に、高められたｐＨが必要な場
合には、アルカリ性試薬の添加を含む工程を、結合反応
と一重項酸素の発生および（または）信号生成との間に
挿入することができる。一般的に、この高められたｐＨ
は１０より大きく、通常１０〜１４である。不均一系検
定法の場合には、上記したような、非水性溶剤をまた使
用することができ、この場合には、この溶剤が一重項状
態酸素と有効には反応しないことを考慮する。
【０３４３】望ましいｐＨを得、検定期間中にこのｐＨ
を維持するために、種々の緩衝剤を使用することができ
る。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩
衝剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１
種のまたは他の一種の緩衝剤が好適である。
【０３４４】検定において、タンパク質リガンドとレセ
プターとの結合反応を行なうために使用する温度は通
常、中程度の温度であり、一般に測定期間中、一定の温
度、好ましくは２５°〜４０°を使用する。結合反応の
ためのインキュベーション温度は一般的に、約５°〜４
５℃、通常約１５°〜４０℃、さらに通常的には、２５
°〜４０℃である。核酸の結合が検定中に生じる場合に
は、さらに高い温度、通常２０°〜９０°、さらに通常
３５°〜７５℃の温度がしばしば使用される。測定中の
温度、すなわち一重項状態酸素の発生および光検出の期
間中の温度は一般に、約２０°〜１００℃、さらに通常
約２５°〜５０℃、好ましくは２５°〜４０℃の範囲で
ある。
【０３４５】検定することができる被験物質の濃度は一
般に、約１０-4Ｍから１０-16 Ｍ以下、さらに通常、約
１０-6〜１０-14 Ｍで変わる。検定が定量的であるか、
半定量的であるか、または定性的であるか、およびまた
特定の検出技術、対象被験物質の濃度および最高に望ま
しいインキュベーション時間を考慮して、各種成分の濃
度が通常、決定される。
【０３４６】競合検定法においては、検定メジウム中の
各種成分の濃度は一般に、対象被験物質の濃度範囲によ
って決定されるが、各成分のそれぞれの最終濃度は通
常、この検定の感度がこの範囲全体にわたって最適にな
るように、実験的に決定される。すなわち、重要な被験
物質の濃度の変化が実際に測定できる信号の差違として
得られなければならない。
【０３４７】ｓｂｐメンバーの濃度は、被験物質の濃
度、所望の結合速度、およびｓｂｐメンバーが非特異的
に結合する程度に依存する。通常、ｓｂｐメンバーは少
なくとも最低の予想被験物質濃度で、好ましくは少なく
とも予想される最高被験物質濃度で存在させる。非競合
検定法の場合には、この濃度は最高被験物質濃度の１０
〜１０6 倍であることができるが、通常、１０-4Ｍより
少なく、好ましくは１０-6Ｍより少なく、多くの場合に
１０-11 〜１０-7Ｍである。ｓｂｐメンバーと会合させ
る増感剤または化学発光性化合物の量は一般に、ｓｂｐ
メンバー当りで少なくとも１分子であり、増感剤分子ま
たは化学発光性化合物分子を粒子内に配合する場合に
は、１０5 ほど高くてもよく、通常少なくとも１０〜１
０4 であることができる。
【０３４８】添加順序は広く変えることができるが、検
定の種類に応じて、或る好ましい順序がある。最も簡単
な添加順序は、諸物質を同時的に加える順序である。別
法として、諸成分を全体的にまたは部分的に順次、配合
することもできる。検定が競合的である場合には、試料
と被験物質を結合できるｓｂｐメンバーとを配合した後
に、被験物質類縁体を添加することがしばしば望まし
い。場合により、これらの諸成分を配合した後に、イン
キュベーション工程を包含させることができ、このイン
キュベーション工程は一般に、約３０秒〜６時間、さら
に通常、約２分〜１時間の範囲で行ない、その後で増感
剤により一重項酸素を発生させ、次いで発光を測定す
る。
【０３４９】特に好適な添加順序では、被験物質に対し
相補的であり、そして（または）被験物質と同族であ
る、特異結合性の一組のメンバーからなる第一のセット
を被験物質と配合し、次いで第一の特異結合性の一組の
メンバーに対し相補的である特異結合性の一組のメンバ
ーを添加する。これらのメンバーはそれぞれ、増感剤お
よび化学発光性化合物からなる群の別々の一員と会合し
ている。この検定混合物またはその分離した成分を次い
で、照射し、その発光を測定する。
【０３５０】均一系検定法においては、全成分を配分し
た後に、所望により、これらをインキュベートすること
ができる。次いで、この配合物を照射し、生じる発光を
測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量に関連
する。均一系検定法で使用される本発明の諸成分の量
は、被験物質の種類に依存する。一般に、本発明の均一
系検定法は、ＥＭＩＴ検定法（商品名）のような公知検
定法に比較して増大した感度を示す。この利点は、主と
して、本発明の方法で得られる、改善された信号対ノイ
ズ比の結果である。
【０３５１】当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を
不当な実験を行なうことなく実施できるようにするため
に、制限的意味を有していない例を下記に示す。被験物
質、増感剤、化学発光性化合物、表面、粒子および反応
条件の選択は、下記の例の記載から当業者に示唆される
であろう。
【０３５２】本発明の態様の一つにおいて、化学発光性
化合物、９−ベンザル−１０−メチルアクリダンをチロ
イド刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体（試薬１）に
共有結合させる。そのフェニル環に結合しているカルボ
キシル基をＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルによ
り官能性にした９−ベンザル−１０−メチルアクリダン
を抗体のアミノ基と反応させる。結合基はカルボキシア
ミドである。使用増感剤はローズベンガルであり、これ
は０．５ミクロンの平均径を有するラテックス粒子に共
有結合させる。ラテックス粒子とローズベンガルとは、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：３７４１（１９
７５）に記載されているように、エステル結合基を得る
ために、ラテックス上のクロロメチル基によって、相互
に共有結合させる。
【０３５３】このラテックス粒子をＴＳＨに対する第二
の抗体にさらに結合させる（試薬２）。このためには、
ラテックス上のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル
基を使用する。使用抗体は両方ともに、標準ハイブリッ
ドセルライン技術によって調製されるモノクローナル抗
体である。抗体の一つはＴＳＨのα−サブユニットを認
識し、そして他の一つはＴＳＨのβ−サブユニットを認
識する。
【０３５４】検定の実施に際しては、ＴＳＨを含有する
ものと予想される血清試料を患者から得る。５０マイク
ロリッターの試料を、上記試薬１および試薬２ととも
に、トリス緩衝剤によってｐＨ８．０に緩衝されている
水性メジウム５００ｍＬ中で一緒に配合する。試薬１お
よび試薬２の量は、約１０-6モルの各抗体の濃度が得ら
れるに充分にする。この反応混合物を次いで、２５℃で
１時間、インキュベートし、次いで５６０ｎｍの光を３
０秒間照射する。照射後に発射された光の強度を測定
し、３０秒間の間に検出された総光エネルギーを、既知
濃度でＴＳＨを含有する試料により同様の方法で得た数
値と比較し、未知のＴＳＨ濃度を決定する。
【０３５５】別法では、インキュベーションの後に、ラ
テックス粒子をメジウムから分離し、ｐＨ９．５の水性
緩衝メジウム中に入れ、同様に照射し、次いでこの系か
ら発射された光の量を上記のとおりに測定する。
【０３５６】上記方法にもとづく別法においては、試薬
２が第二の抗体に共有結合したローズベンガルであり、
ラテックス粒子は使用しない。さらにもう一つの別法に
おいては、試薬２が第二の抗体に共有結合したローズベ
ンガルであり、かつまた試薬１が、第一抗体が共有結合
しているラテックス粒子に共有結合した９−ベンザル−
１０−メチルアクリダンである。上記方法にもとづくさ
らにもう一つの別法においては、試薬１がすぐ上に記載
されているものであり、試薬２はアビジンが共有結合し
ているラテックス粒子に共有結合したローズベンガルで
あり、かつまたビオチンに共有結合した第二の抗体であ
る第三の試薬（試薬２Ａ）を使用する。試薬１と第三の
試薬とを、試料に配合し、次いでインキュベートする。
次いで、過剰量の試薬２を加え、引続く処理は上記のと
おりに行なう。
【０３５７】上記方法にもとづく、もう一つの別法にお
いては、ローズベンガルの代りにクロロペルオキシダー
ゼを使用する。この検定法では、照射工程の代りに、臭
化ブロマイドおよび過酸化水素を添加し、一重項状態酸
素を発生させる。発射された光を上記のとおりに測定す
る。
【０３５８】本発明に係るもう一つの態様においては、
上記Ｇｉａｅｖｅｒの刊行物に従い鉱油中の増感剤、ク
ロロフィルから油滴の形態の第一セット（試薬３）を調
製する。０．１〜２ミクロンのサイズを有する、この油
滴を官能性にし、次いでヒト慢性ゴナドトロピン（ＨＣ
Ｇ）に対するモノクローナル抗体に結合させる。クロロ
フィルは親油性であり、従ってこの親油性油滴中に不可
逆的に溶解する。
【０３５９】同様の方法で、油滴形の第二のセット（試
薬４）を調製する。このセットの油状滴では、この油状
滴はＨＣＧに対する第二のモノクローナル抗体に共有結
合されており、この第二の抗体は上述の第一のモノクロ
ーナル抗体によって認識される以外のＨＣＧ分子の異な
る部分を認識する。９−（ジフェニルメチリジン）−Ｎ
−メチルアクリダンは、そのアクリダンのフェニル基の
一つに結合しているＮ，Ｎ−ジドデシルカルボキシアミ
ド基を含むことによって、この親油性油滴に不可逆的に
溶解される。これらモノクローナル抗体は、標準的ハイ
ブリッドセルライン技術によって調製される。
【０３６０】ＨＣＧを含有するものと予想される尿試料
（５０マイクロリッター）をｐＨ７．５の水性緩衝メジ
ウム（５００μＬ）中で、それぞれ過剰量の試薬３およ
び試薬４と配合する。このメジウムを２５℃で２０分間
インキュベートする。分離しないで、このメジウムを、
Ｈｅ／Ｎｅレーザーを用いて６３３ｎｍで、１分間照射
し、次いで発射された光を前記のとおりに測定する。こ
の光の量を、既知量のＨＣＧを含有する試料から発射さ
れる量と比較し、この数値の比較によって未知試料中の
ＨＣＧの量を決定する。この方法によって、ＨＣＧの簡
便で、敏感な均一系免疫検定を行なうことができる。
【０３６１】前記方法にもとづくもう一つの別法におい
ては、試薬３がＨＣＧに対する抗体の代りに、フルオレ
セインを含有し、追加の試薬（試薬３Ａ）がフルオレセ
インに共有結合したＨＣＧ抗体を有する。試薬４は第二
のＨＣＧ抗体の代りに、アビジンを含有し、そして第四
の成分（試薬４Ａ）はビオチンに共有結合した第二の抗
体を含有する。この検定においては、試薬４Ａおよび試
薬３Ａを試料に配合し、インキュベートする。その後、
試薬３および試薬４を加え、次いでインキュベートす
る。次いで、上記検定法の残りの工程を行なう。
【０３６２】本発明のもう一つの態様においては、ｐＨ
７．４の緩衝液中のリン脂質を、当該目的用に設計され
ている市販の装置を用いて、０．２ミクロン孔径の膜に
通す、高圧抽出によって、一組のリポソーム（試薬５）
（０．２ミクロン径）を形成する。このリポソームのホ
スファチジルエタノールアミンとメチルカルボキシメチ
ルジスルフィドの活性エステルとを反応させ、次いでジ
チオエリスリトールと反応させることによって、先ずリ
ポソーム上にメルカプトアセトアミド基を形成すること
により、リポソームにチロキシン類縁体を共有結合させ
る。次いで、このスルフヒドリル化したリポソームをブ
ロモアセチルチロキシンと反応させる。このリポソーム
の親油性部分にメタロ−ポルフィリン染料を溶解させ
る。
【０３６３】もう一組のリポソーム（試薬６）を使用
し、チロキシンに対するモノクローナル抗体を結合させ
る。この抗体はチロキシン結合と同様の方法により共有
結合させる。このリポソームの表面に、カルボキシアミ
ド結合性基によって、エナミン（２−ジメチルアミノメ
チレンピラン）を共有結合させる。試薬５および試薬６
を、ｐＨ８．０の水性緩衝検定メジウム（５００μＬ）
中で、チロキシンを含有するものと予想される血清試料
と配合する。このメジウムはアニリノナフタレンスルホ
ン酸（５０マイクロリッター）を含有する。この化合物
は、結合性タンパク質からチロキシンを分離し、酸素活
性化ピランからのエネルギーを受け取り長波長発光を生
じさせる。この検定メジウムを次いで、室温で１時間イ
ンキュベートする。分離工程を行なわずに、このメジウ
ムを６５０ｎｍで１分間照射し、生じる発光をルミノメ
ーターにより測定する。得られた数値は、既知量のチロ
キシンを使用する同様の検定を行なうことによって得ら
れた数値と比較する。この方法により、血清試料中のチ
ロキシンの量が定量できる。
【０３６４】上記方法にもとづく別法においては、試薬
６がチロキシンに対する抗体である代りに、アビジンを
含有する。追加の試薬（試薬６Ａ）はビオチンに共有結
合したチロキシンに対する抗体を含有する。試薬５はチ
ロキシンの代りに、フルオレセインに対する抗体を含有
し、そして追加の試薬（試薬５）はフルオレセインに結
合したチロキシンを含有する。この検定法においては、
試薬５Ａおよび６Ａを、試料と配合し、次いでインキュ
ベートする。次いで、試薬５および６を加え、この混合
物をインキュベートし、検定法の残りの部分を行なう。
【０３６５】前記方法にもとづく、もう一つの別法にお
いては、メタロ−ポルフィリン染料の代りに、モリブデ
ン酸カリウムを使用し、これをリポソームの水性相に配
合する。この検定法においては、照射工程の代りに、過
酸化水素を加えて、一重項状態酸素を生成させる。発射
された光を前記のとおりに測定する。
【０３６６】もう一つの態様においては、Ｇｒｉｂｎａ
ｕにより開示された方法と同様の方法により、染料結晶
中で、２−ヒドロキシエチル−９，１０−ジブロモアン
トラセンを生成させる。Ｂ型肝炎表面抗原を認識するモ
ノクローナル抗体を、カルバメート結合基によって、染
料結晶に共有結合させる。ラテックス粒子を処理し、Ｂ
型肝炎表面抗原に対する第二の抗体を共有結合により不
動化する。このラテックス粒子にはさらに、アミド結合
基により９−（ベンザル−９Ｈ−キサンテン）を共有結
合させる。この染料結晶は平均２ミクロンの粒子サイズ
を有し、そしてこのラテックス粒子は０．２ミクロンの
平均径を有する。モノクローナル抗体は標準ハイブリッ
ドセルライン技術によって調製される。
【０３６７】肝炎を患らっているものと予想される患者
からの血清試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．０の水性検定
メジウム（５００μＬ）中で、過剰量の上記染料結晶お
よびラテックス粒子と配合する。この検定メジウムを次
いで、室温で３０分間インキュベートし、次いでキセノ
ン光源を用いて、３５０ｎｍで１分間照射する。試料中
にＢ型肝炎表面抗原が存在すると、各抗体と抗原との免
疫結合によって、染料結晶とラテックス粒子とが極めて
接近する。このメジウムを照射すると、９，１０−ジブ
ロモアントラセンが励起され、分子状酸素を一重項状態
酸素に変換する。この一重項酸素はキサンテンと反応
し、ジオキセタンを生成させ、このジオキセタンは室温
で自発的に分解し、光を発する。この光を分光計によっ
て測定する。或るしきい値レベル以上の光量は試料中の
Ｂ型肝炎表面抗原の存在を示す。このメジウムの照射は
室温で行ない、そしてまた、この検定は均一系法で行な
われ、Ｂ型肝炎表面抗原用の検定法を提供する。
【０３６８】好適には、この検定法において、Ｅｕ（Ｔ
ＴＡ）3 をラテックス粒子に溶解し、励起したキサンテ
ン誘導体のエネルギーをＥｕ（ＴＴＡ）3 に移行させ
る。これは６００ｎｍ以上のエネルギーを発生する。キ
サンテンルミネセンスから直接に発射される光は血清成
分によって吸収されるので、別段に生じる血清の干渉が
これによって回避される。
【化２９】
【０３６９】もう一つの態様は、赤血球の表面上の特定
の血液型抗原、すなわちＡ型抗原を測定する検定法であ
る。１５０〜５００ｎｍの粒子サイズを有し、前記のと
おりにして調製されるラテックス粒子を使用する。この
ラテックス粒子は、このラテックス粒子に共有結合した
Ａ型抗原に対する抗体を有する。この粒子はまた、この
ラテックス中に溶解している、エノールエーテル、２−
ｐ−ジメチルアミノフェニル−３−フェニル−５，６−
ジヒドロジオキセンを含有する。
【０３７０】このラテックス粒子試薬を水性メジウム
（５００μＬ）中で、全血（１００μＬ）および１×１
０-4Ｍの増感剤と配合する。この増感剤は疏水性増感
剤、すなわちフェナジン−２−カルボン酸である。この
疎水性染料は試料中に存在する赤血球中に侵入する。こ
のメジウムを２５℃で１０分間インキュベートし、次い
でタングステン光源を用いて、４００〜４５０ｎｍで３
０秒間照射する。このメジウムから発射される光を測定
し、Ａ型抗原赤血球を含有していないことが判っている
試料で得られた光の量と比較する。この場合には、しき
い値レベル以上の光の量が血液型Ａ抗原の存在を示す。
【０３７１】本発明のもう一つの態様においては、被験
物質が細胞表面上のＨＬＡ抗原である。ＨＬＡ抗原を含
有するものと予想される試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．
４に緩衝されている水性検定メジウム（５００μＬ）中
に装入する。このメジウムにはまた、チオエーテル結合
性基によってエモシンに共有結合したＨＬＡ抗原に対す
る抗体である試薬の過剰量を加える。この検定メジウム
に、化学発光性化合物をまた加える。化学発光性化合物
は、ＨＬＡ抗原を含有する細胞中に侵入するものである
ように選択する。
【０３７２】この化学発光性化合物は、アクリダン、す
なわち９−（ドデシルフェニルメチリジン−１）−Ｎ−
（２−スルホンオキシエチル）アクリダンである。この
検定メジウムを室温で１時間インキュベートし、次いで
タングステン−ハロゲン光源を用いて、５００〜５５０
ｎｍで１分間照射する。この検定メジウムから発射され
る光を測定し、しきい値レベル以上の光の量がＨＬＡ抗
原の存在を示す。
【０３７３】本発明はまた、０．０４〜４０００ナノメ
ーターの平均径を有し、化学発光性化合物を含有する組
成物を包含する。この化学発光性化合物は、粒子マトリ
ックスに共有結合されていてもよく、あるいはマトリッ
クス中に溶解されているか、またはマトリックス中に溶
解されている溶剤中に溶解されていてもよい。粒子は好
ましくは、滴状の重合体または油状物、あるいはリポソ
ームなどの小胞体である。粒子がリポソームである場合
には、化学発光性化合物を脂質二重層と会合させるか、
またはリポソームの水性内容物中に溶解させる。
【０３７４】この粒子はそこに結合しているｓｂｐメン
バーを含有する。好ましくは、ｓｂｐ結合粒子は１０〜
１０００ｍｍの平均径を有する。相互に結合した２種の
相補的ｓｂｐメンバーを有し、その一つが増感剤に結合
しており、そして他の一つが化学発光性化合物と会合し
ている組成物がまた包含される。
【０３７５】本発明のもう一つの態様は、組合物を提供
する方法にあり、この方法は、（１）被験物質を含有す
るものと予想されるメジウムおよび（２）ＰＡＣＣと会
合した第一の特異結合性の一組の（ｓｂｐ）メンバーを
含有するラベル試薬からなる。ｓｂｐメンバー複合体が
被験物質の存在に関連して生成される条件を選択する。
たとえば、第一のｓｂｐメンバーは被験物質または第二
のｓｂｐメンバーに結合して、被験物質の存在に関連す
る複合体を生成することができるものであることができ
る。この方法はまた、ＰＡＣＣの光化学的活性化および
ＰＡＣＣによって発射されるルミネセンスの量の検出を
包含する。このルミネセンスの量はメジウム中の被験物
質の量に関連する。
【０３７６】一般に、ＰＡＣＣは、光の照射によって、
光化学的に活性化される。この光はＰＡＣＣを直接に活
性化でき、あるいは増感剤を活性化できるものである。
この増感剤は照射されると、分子状酸素を一重項状態の
酸素に変換させる。一重項状態の酸素は次いで、ＰＡＣ
Ｃを活性化する。増感剤は検定の種類に応じて、リガン
ドに結合させることができ、あるいは溶液中に自由に存
在させることができ、あるいは表面に結合させることが
できる。一重項状態酸素によるＰＡＣＣの活性化によっ
て生成される生成物は光を発射して、自発的に分解でき
るか、あるいはさらに物理的または化学的に処理され
て、発光することができる。
【０３７７】ＰＡＣＣを活性化する一重項状態酸素を生
成させるために、異なる多くの増感剤を使用することが
できる。増感剤は直接に、ｓｂｐメンバーに結合させる
ことなく使用することができる。この方法では、比較的
大きい濃度、通常少なくとも１０-7Ｍ、好ましくは少な
くとも１０-6Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１０-5Ｍ
の増感剤を使用する。一般に、この方法で使用する増感
剤の量は、ＰＡＣＣの活性化をもたらす濃度の一重項状
態酸素を生成させるのに充分の量である。この方法は、
ＰＡＣＣの発光が実質的に変えられる場合、複合体が生
成される場合、あるいはメジウム中のＰＡＣＣの量が通
常、結合したラベルと未結合ラベルとの分離によって得
られる場合に、使用することができる。
【０３７８】分離が望まれない場合には、この複合体中
のＰＡＣＣの発光はエネルギー受容体によって変えるこ
とができ、この場合には、被験物質が存在する結果とし
て生成される複合体にエネルギー受容体が結合すること
によって、ＰＡＣＣに極めて接近される。このエネルギ
ー受容体が螢光体である場合には、発光の波長が通常、
変更される。エネルギー受容体が螢光体ではない場合に
は、ＰＡＣＣがこの複合体と結合された時点で、その化
学ルミネセンスが通常、消失する。
【０３７９】本発明のもう一つの態様においては、増感
剤およびＰＡＣＣを一団の検定メジウム溶液と本明細書
に記載の表面とに分配する。この分配は、分析しようと
する試料中に存在する被験物質の量に依存し、増感剤は
通常、ｓｂｐメンバーに結合させる。表面と会合しない
増感剤分子は、一重項状態酸素を生成するが、この一重
項酸素は水性メジウム中で崩壊を受ける前にＰＡＣＣに
到達することはできない。しかしながら、増感剤および
ＰＡＣＣが両方ともに、表面と会合して、被験物質の存
在の結果として、複合体を形成する場合には、増感剤の
照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受ける前
にＰＡＣＣを活性化することができる。この方法におい
て、増感剤の使用量は、増感剤に結合したｓｂｐメンバ
ーを含まない増感剤を用いる前述の方法におけるよりは
格別に少ない量であることができる。
【０３８０】理解できるように、この対象検定法は、試
料中の広く種々の被験物質を検出し、測定するための、
簡便で、効果的であり、かつまた再現性を有する方法を
提供し、この方法には、反応中に生成される光の量の測
定に、肉視または慣用の装置を使用することができる。
【０３８１】被験物質の存在の結果として、増感剤が表
面と会合するようになる場合には、増感剤は通常、ｓｂ
ｐメンバーと会合させる。これは、多くの方法で達成す
ることができる。増感剤がｓｂｐメンバーに結合性の官
能性基を有していてもよく、あるいはｓｂｐメンバーが
増感剤に結合性の官能性基を有していてもよい。この結
合は、２個の分子間の直接結合であることができ、ある
いはｓｂｐメンバーと増感剤との間に、結合性基を使用
することもできる。
【０３８２】もう一つの態様では、増感剤を粒子に結合
させるか、または粒子中に配合することができ、この粒
子にはまた、ｓｂｐメンバーを結合させる。両方の場合
において、ｓｂｐメンバーは被験物質に結合することが
できるものである。増感剤は粒子の少なくとも１つの相
に可溶性であることから、粒子中に配合することができ
る。増感剤を粒子中に配合しない場合には、増感剤は粒
子に結合させることができる。この目的には、増感剤ま
たは粒子、あるいはその成分を官能性にして、増感剤お
よび粒子の結合手段を得る。油状滴の形態または脂質二
重層の形態の粒子の場合には、粒子組成に適合しうる長
鎖状炭化水素に結合させることによって、増感剤を粒子
に結合することができる。多くの場合に、８〜２０個ま
たはそれ以上の炭素原子を有する、少なくとも１種の、
好ましくは２種の炭化水素鎖が使用される。
【０３８３】粒子がフルオロカーボンの滴状物である場
合には、増感剤をフッ素化し、その溶解性を増大させ、
かつまた交換を減じることができ、好ましくは、結合に
使用する炭化水素鎖の代りに、フルオロカーボン鎖を使
用する。シリコーン粒子の場合には、増感剤はポリシロ
キサンに結合させることができる。通常、増感剤の電荷
および極性を最少にして、増感剤が粒子の非水性部分内
に存在するようにすることが望ましい。前述したよう
に、このｓｂｐメンバーに結合した増感剤を含む方法
は、本明細書中に充分に説明されている。
【０３８４】前述したように、ＰＡＣＣは「ｓｂｐメン
バーと会合させる」、すなわち本発明においてＰＡＣＣ
はラベルとして機能する。本明細書で使用するものとし
て、「ｓｂｐメンバーと会合」の用語は、次の様相を包
含する：通常、ＰＡＣＣとｓｂｐメンバーとの会合は共
有結合による。しかしながら、このラベル試薬がまた、
懸濁できる粒子からなり、この粒子にＰＡＣＣが結合し
ているか、またはこの粒子内にＰＡＣＣが非共有的に配
合されていることもできる。この懸濁できる粒子はま
た、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する。
【０３８５】このｓｂｐメンバーは一般に、被験物質
に、または被験物質に結合できるｓｂｐメンバーに、結
合することができる。もう一種のｓｂｐメンバーを使用
し、これを被験物質に結合させることができる場合に
は、サンドイッチ検定法が得られる。ＰＡＣＣに結合し
たｓｂｐメンバーはまた、被験物質に対し類縁体である
ことができ、この場合には、競合検定法を得ることがで
きる。
【０３８６】増感剤を使用する場合に、増感剤は、上記
諸反応体を含有するメジウムが照射されると、ＰＡＣＣ
を活性化する作用を果たす。メジウムは増感剤を励起状
態に変換し、分子状酸素を一重項状態酸素に活性化でき
るのに充分のエネルギーの波長を有する光で照射する。
ｓｂｐメンバーに結合している場合には、この増感剤の
濃度は非常に小さく、しばしば１０-6〜１０-12 Ｍまた
はそれ以下であることができる。増感剤が結合されてい
ない場合には、増感剤濃度は、明白な量の光を吸収する
のに充分の濃度、通常少なくとも０．１％、好ましくは
１〜８０％である。
【０３８７】増感剤の励起状態は通常、最低三重項状態
であり、基底状態よりも少なくとも２５Ｋｃａｌ／ｍｏ
ｌ、好ましくは２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ多くのエネルギー
を有する。一般に、メジウムは、約３００〜１２００ｎ
ｍ、通常４５０〜９５０ｎｍ、好ましくは５５０〜８０
０ｎｍの波長を有する光により照射する。照射時間は活
性化ＰＡＣＣの寿命、光強度および所望の発光強度に依
存する。短命の活性化ＰＡＣＣの場合には、この照射時
間は、マイクロ秒ほどの短い時間であることができ、こ
の場合には、強いフラッシュランプまたはレーザーを使
用する。長命な活性化ＰＡＣＣを使用する場合には、こ
の照射時間はさらに長くてもよく、かつまた強度の低い
光源を使用することができる。
【０３８８】一般に、照射期間にわたる集積光強度は増
感剤分子の少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも
３０％を励起させるのに充分なものであるべきであり、
最も好ましくは、増感剤の分子の全部を少なくとも一度
は励起させる強度である。
【０３８９】上記いずれの場合においても、生成される
光またはルミネセンスは肉視により、写真により、日射
計により、分光光度計により、あるいはいずれかその他
の慣用の測定手段により、その量を測定することがで
き、この量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３９０】ヘリウム−ネオンレーザーは、６３２．６
ｎｍで励起させるための、安価な光源である。この波長
で光を吸収する増感剤は、ヘリウム−ネオンレーザーの
発射線と適合でき、従って本発明において特に有用であ
る。その他の光源には、たとえばアルゴン、ＹＡＧ、Ｈ
ｅ／Ｃｄおよびルビイなどの他のレーザー類、ホトダイ
オード類、水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ラン
プ、タングステンおよびタングステン／ハロゲンなどの
強烈なランプ、およびフラッシュランプが含まれる。
【０３９１】本発明のもう一つの態様は、被験物質の測
定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含
有するものと予想されるメジウム、（２）一重項状態酸
素との反応によって化学発光することができる化合物に
結合した一対の特異結合体（ｓｂｐメンバー）のうちの
第一のメンバーを含むラベル試薬および（３）上記ラベ
ル試薬を含むｓｂｐメンバー複合体が上記メジウム中の
被験物質の存在に関連して生成され、上記化学発光性化
合物からのエネルギーが下記螢光エネルギー受容体を活
性化できる条件の下に、第二のｓｂｐメンバーに結合し
た、または結合できるようになる螢光エネルギー受容体
を含有する不溶化した試薬を、同時的に、あるいは順次
全体的または部分的に、検定メジウム中で配合し、
（ｂ）上記化合物を光により活性化し、次いで（ｃ）そ
の存在または強度が上記メジウム中の被験物質の量に関
連する信号に関して、上記検定メジウムを検査する、こ
とからなる。
【０３９２】本発明に係るこの方法および組成物は、リ
ガンド−レセプターなどのｓｂｐメンバーを含む検定法
の大部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド
結合検定などに適合させることができる。この検定法
は、均一系、不均一系、競合式またはサンドイッチ式で
あることができる。均一系検定法においては、望ましく
ない物質を分離するために、必要に応じて、試料を予備
処理することができる。サンドイッチ式検定法の場合の
免疫学的反応は通常、ｓｂｐメンバー、たとえば抗体お
よび対象試料を包含する。この抗体は被験物質に対し相
補的であり、ＰＡＣＣ、第二のｓｂｐメンバー、たとえ
ば抗体に結合することができ、この第二の抗体はまた、
被験物質に対し相補的である。競合法においては、ＰＡ
ＣＣは被験物質に対する類縁体、通常、被験物質の誘導
体と、または被験物質に対し相補的のｓｂｐメンバー、
たとえば抗体と、会合させることができる。
【０３９３】ＰＡＣＣはそれだけで、またはエネルギー
受容体と会合させて使用することができる。エネルギー
受容体を活性化するために活性化ＰＡＣＣによって発生
される発光能は、２種のｓｂｐメンバーの結合によって
支配されることがあり、あるいは活性化ＰＡＣＣの近く
に比較的高濃度のエネルギー受容体が存在する結果であ
ることもある。後者の場合に、その濃度は通常、少なく
ともマイクロモル、通常ミリモルである。これとは逆
に、ＰＡＣＣがｓｂｐメンバーに結合している場合に
は、その濃度は全く少なく、しばしば１０-5〜１
０-15 、通常１０-8 〜１０-14 であり、その程度の検
出は、均一溶液中で分離することなく行なうことができ
るが、ただしＰＡＣＣが結合性複合体中に存在する場合
には、ルミネセンス強度は変えられる。
【０３９４】不均一系検定法では、ｓｂｐメンバーであ
る被験物質を含有するものと予想される試料を、支持体
に結合した相補的ｓｂｐメンバーからなる試薬と配合す
る。この支持体はＰＡＣＣを有する表面または粒子であ
ることができる。もう一つのｓｂｐメンバーと会合して
いるエネルギー受容体をまた使用することができ、この
場合には、このｓｂｐメンバーは被験物質に対し相補的
であるか（サンドイッチ式）または類縁体であるか（競
合式）のどちらかであることができる。これらの材料は
一般に、同時的にあるいは順次全体的または部分的に配
合する。この支持体を次いで、液相から分離し、固体相
または液体相のどちらかを、通常対象の特定の相の照
射、および発射光の量の測定によって、ルミネセンスエ
ネルギーの存在に関して検査する。
【０３９５】被験物質の検定は通常、中程度のｐＨ、一
般に最適検定感度を提供するｐＨにおいて、水性緩衝メ
ジウム中で行なう。前記で説明したように、この検定法
は、検定成分または生成物のいずれをも分離することな
く（均一系）またはこれらのいずれかを分離して（不均
一系）、行なうことができる。
【０３９６】この水性メジウムは水単独であることがで
き、あるいは０．０１〜８０容量パーセント、またはそ
れ以上の補助溶剤を含有していてもよい。メジウムのｐ
Ｈは通常、約４〜１３の範囲、さらに通常約５〜１０の
範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲である。ｐＨ
は通常、結合性メンバーの最適結合ｐＨと検定の他の試
薬、たとえば信号発生物質のメンバーに関して最適のｐ
Ｈとの間にある。たとえば、活性化ＰＡＣＣは、崩壊し
てルミネセンスを発生するために、或るｐＨ範囲を必要
とすることがある。
【０３９７】所望のｐＨを達成し、測定中、このｐＨを
維持するために、各種緩衝剤を使用することができる。
緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩衝
剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１種
または他の１種の緩衝剤が好適である。
【０３９８】検定の実施には通常、中程度の温度が用い
られ、一般に測定期間中、一定の温度、好ましくは室温
を使用する。インキュベーション温度は一般的に約５°
〜９９℃、通常約１５°〜７０℃、さらに通常では、２
０°〜４５℃の範囲である。測定期間中の温度は一般
に、約１０°〜７０℃の範囲であり、さらに通常、２０
°〜４５℃、さらに好ましくは２０°〜２５℃の範囲で
ある。いくつかの場合には、活性化ＰＡＣＣが崩壊し
て、ルミネセンスを発生するために、１００℃まで加熱
することが求められることもある。
【０３９９】検定することができる被験物質の濃度は一
般に、約１０-5〜１０-17 Ｍ、さらに特に約１０-6〜１
０-14 Ｍで変化する。検定が定量的であるか、半定量的
であるか、または定性的であるか、また特定の検出技術
および対象の被験物質の濃度などを考慮して、各種試薬
の濃度を決定する。
【０４００】検定メジウム中の各種試薬の濃度は一般
に、対象の被験物質の濃度範囲によって決定されるが、
各試薬の最終濃度は通常、検定の感度をその範囲全体に
わたって最適するために、実験により決定される。すな
わち、被験物質の濃度の有意の変化は正確に測定できる
信号の差異を提示する。
【０４０１】添加の順序は広く変えることができるが、
検定の種類に応じて或る好ましい順序がある。特に均一
系に対する最も単純な添加順序は全ての材料を同時に添
加するものである。別法として、各種試薬を全部または
部分的に順次配合することもできる。場合により、試薬
の配合の後に、インキュベーション工程を含ませること
ができ、この工程は一般に約３０秒〜６時間、さらに通
常、約２分〜１時間の範囲である。
【０４０２】均一系検定法においては、試薬の全部を配
合した後に、所望により、これらをインキュベートする
ことができる。次いで、この組合せ物を照射し、生じる
発光を測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量
に関連する。均一系検定において使用される本発明の試
薬の量は被験物質の種類に依存して変わる。
【０４０３】当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を
不当な実験を行なうことなく実施できるために、下記に
検定の例を示すが、これは制限する意味を有するもので
はない。被験物質、増感剤、ＰＡＣＣ、表面、粒子およ
び反応条件の選択は本明細書の記載および下記の例から
当業者に示唆されることは明らかである。
【０４０４】次の検定において、諸成分は、ｐＨ６〜
８．５の主として水性のメジウム中に配合する。 Ａ． ＨＣＧ検定では、尿試料を、（１）１ミクロンの
ラテックス粒子に結合したＨＣＧに対する抗体および
（２）ＰＡＣＣ４に結合したＨＣＧの分離した、無重複
エピトープに対する抗体と配合する。この懸濁液を３０
分間インキュベートした後に、粒子を遠心分離によりメ
ジウムから分離し、洗浄し、次いで３００ｎｍの光を照
射する。この照射後に発射される光の強度は試料中のＨ
ＣＧの量に関連する。分離した粒子は、直接に照射する
ことができ、あるいは照射の前に、水性または非水性溶
剤中に懸濁することもできる。
【０４０５】Ｂ． Ａに類似している血清中のＨＣＧの
検定方法では、使用するラテックスビーズを増感剤の銅
フタロシアニンで染色し、次いでインキュベートした後
にメジウムから分離し、次いで６００ｎｍの光を照射す
る。発射された光の強度は試料中のＨＣＧの量に関連す
る。
【０４０６】Ｃ． 血清中のジゴキシンの検定では、ジ
オキシゲニンに共有結合させたＰＡＣＣのルミノール
を、テトラデシルフタロシアニンで染色してあるポリス
チレンウエル中で試料とともにインキュベートする。こ
のウエルの表面にはジゴキシンに対する抗体を塗布す
る。３０分間のインキュベーションおよび検定メジウム
の除去の後に、このウエルに６００ｎｍの光を照射す
る。この照射に先立ち、アルカリ溶液（ｐＨ１０〜１
２）を添加すると好ましい。照射後に発射された光の強
度は試料中のジゴキシンの濃度に逆比例する。
【０４０７】Ｄ． 尿中のアルブミンの検定では、試料
を、（１）ＰＡＣＣでラベルしたアルブミンに対する抗
体および（２）次式のエネルギー受容体でラベルした無
重複アルブミンエピトープに対して指向するアルブミン
に対する抗体、と配合する：
【化３０】 この検定メジウムに、増感剤、メチレンブルーを含ませ
る。このメジウムを１０分間、インキュベートし、次い
で６００ｎｍの光を照射する。照射を止めた後に、エネ
ルギー受容体によって発射される光（約５００ｎｍ）の
強度は試料中のアルブミンの量に直接に関連する。
【０４０８】Ｅ． 血清中のチロキシンの検定では、試
料を、ラテックスビーズに結合したチロキシンと配合す
る。このビーズには、ＰＡＣＣ１０（Ｘ2 はＮ（Ｃ
Ｈ3 ）2 である）を配合してある。この検定メジウム中
には、増感剤、ローズベンガルに結合したチロキシンに
対する抗体を含有させる。１０分間のインキュベーショ
ンの後に、メジウム５５０ｎｍの光を照射し、この照射
を止めた後に発射される光を測定する。この発光の強度
は試料中のチロキシンの量に逆に関連する。
【０４０９】Ｆ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレ
オチド配列の検定では、９−フェニルメチリデンキサン
タンであるＰＡＣＣ２３に結合されており、標的配列と
相補的な２５−塩基オリゴヌクレオチドを試料と混合す
る。このメジウムを次いで、７５℃に加熱し、次いで５
５℃に冷却し、存在する標的配列にこのオリゴヌクレオ
チドを交雑する。この雑種形成溶液中には、エネルギー
受容体で、挿入体であるアクリジン オレンジ、および
増感剤であるフタロシアニン テトラスルホン酸を存在
させるか、またはハイブリッド形成反応の完了後に、こ
れらの成分を加えてもよい。この溶液を次いで、６００
ｎｍの光で照射し、この照射を止めた後に、アクリジン
オレンジによって発射される光（約５００ｎｍ）の強
度を測定する。この光強度は標的配列の存在に直接に関
連する。
【０４１０】Ｇ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレ
オチド配列の検定では、増感剤であるフタロシアニンに
よりラベルされており、標的配列に対し相補的な２５−
塩基オリゴヌクレオチドを、上記Ｆと同様に標的に交雑
させる。二重鎖ＤＮＡの微少グルーブに結合する化合物
であるＨｏｅｃｈｓｈ ｄｙｅ ３３２５８をＰＡＣＣ
２０のＮ−メチル−９−フェニルメチリデンアクリダン
に結合させ、これをメジウム中に加えるか、またはハイ
ブリド形成の後に加える。このメジウムに次いで、６０
０ｎｍの光を照射し、この照射の停止後に発射される光
を測定する。発光の強度は試料中に存在する標的配列の
量に直接に関連する。
【０４１１】Ｈ． 血清中のＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）の検定では、試料を、（１）ＰＡＣＣで染色されて
おり、かつまたＨＢｓＡｇに対する抗体が塗布されてい
る１５０ｎｍラテックス粒子および（２）増感剤テトラ
フェニルポルフィリンで染色されており、かつまたＨＢ
ｓＡｇに対する抗体が塗布されている１５０ｎｍラテッ
クスビーズと配合する。この混合物を１時間インキュベ
ートした後に、この懸濁液に５５０ｎｍの光を照射す
る。この照射の停止後に発射される光の強度を測定す
る。この強度は試料中のＨＢｓＡｇの量に関連する。
【０４１２】Ｉ． 全血中のＨＢｓＡｇの検定において
は、方法Ｈにしたがうが、ＰＡＣＣ含有ラテックスビー
ズを、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＰＡＣ
Ｃ２３および次式のエネルギー受容体により染色したラ
テックスビーズにより置き換える：
【化３１】 ６１０〜６２０ｎｍで発射される光の強度を測定する。
この強度は試料中のＨＢｓＡｇの濃度に関連する。
【０４１３】本発明のもう一つの態様は、被験物質を含
有するものと予想される試料中の被験物質の存在または
その量を測定するために、本発明の検定法を簡便に行な
うのに有用なキットに関する。本発明の多能性を増すた
めに、諸試薬を同一または別別の容器にパッケージした
組合せ物として提供することができる。この組合せ物中
の諸試薬の割合は、方法および検定を実質的に最適にす
る割合にする。諸試薬はそれぞれ、別々の容器に入れる
ことができ、あるいは各種試薬を、試薬の交さ反応性お
よび安定性に応じて、１個または２個以上の容器で組合
せることもできる。
【０４１４】このキットの形態の一つは、（１）ｓｂｐ
メンバーを結合して有しており、かつまた化学発光性化
合物を含有する懸濁できる粒子からなる組成物および
（２）増感剤、からなる。この増感剤はｓｂｐメンバー
に結合させることもでき、あるいはｓｂｐメンバーが結
合されている粒子と会合させることもできる。このキッ
トはまた、別にパッケージされたものとして、補助試薬
などを含む検定を実施するための他の試薬を包含するこ
ともできる。
【０４１５】本発明に係る、もう一つの形態のキット
は、第一のｓｂｐメンバーを会合している化学発光性化
合物、および第二のｓｂｐメンバーと会合しており、そ
の励起状態で、酸素をその一重項状態に活性化すること
ができる増感剤のパッケージされた組合せ物からなる。
【０４１６】もう一つの形態のキットは、（１）ｓｂｐ
メンバーに結合したＰＡＣＣを含有する組成物を含有す
る。このキットはまた、１種または２種以上の追加のｓ
ｂｐメンバー試薬および所望により、増感剤を含有する
ことができる。エネルギー受容体をｓｂｐメンバーに結
合させ、試薬を形成することもでき、あるいはエネルギ
ー受容体をそれ自体、試薬として提供することもでき
る。表面に結合したｓｂｐメンバーを包含させることも
できる。このキットはさらにまた、補助試薬などを含
む、検定を行なうためのその他の試薬を別のパッケージ
として包含することもできる。
【０４１７】例 本発明を、さらに以下の実施例によって説明する。実施
例中で使用される部および百分率は、とくに指示のない
限り、重量によるものである。温度は摂氏で表示する。
【０４１８】略号： ＡｂF ：フルオレセインに対するマウスモノクローナル
抗体 Ａｂ1F：内因子に対するマウスモノクローナル抗体 Ｂ12−ＬＣ25−Ｆ：鎖長２５原子の連結基、すなわち ＨＮ（ＣＨ2)6 ＮＨＣＯＣＨ2 ＯＣＨ2 ＣＯＮＨ（ＣＨ
2)6 ＮＨＣＯＣＨ2 ＮＨＣＯ によってカルボキシフルオレセイン（Ｆ）に連結された
ビタミンＢ12 ＢＡ−Ｃ18：４−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボキシ
アミドメトキシ）ベンザル−９−メチルアクリジン
【化３２】 ｔ−Ｂｕ：三級ブチル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ビオチン−ＬＣ21−Ｆ
【化３３】 ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン Ｃｈｌ−ａ−クロロフィル−ａ
【化３４】 Ｄ−Ｈ2 Ｏ：脱イオン水 ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン ＤＰＰＧ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩
【化３５】 Ｆ：フルオレセイン Ｆ−ＮＨＳ：６−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド Ｆ−ＬＣ21ＮＨ2 ：連結基ＨＮ（ＣＨ2)6 ＮＨＣＯＣＨ
2 ＯＣＨ2 ＣＯＮＨ（ＣＨ2)6 ＮＨ2 が結合したカルボ
キシフルオレセイン ＨＣＧ：ヒト繊毛性ゴナドトロピン Ｌｉｐ：リポソーム ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）フタロシアニン塩化ア
ルミニウム錯体
【化３６】 ＯＤ：油滴 ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有油滴 ＰＢ：ポリスチレンビーズ ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有ＰＢ ＰＢ／ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）アルミニウムフ
タロシアニン含有ＰＢ ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩溶液０．０２Ｍ ＮａＰｉ，
０．１４Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２ Ｐｉ：リン酸塩 スルホ−ＮＨＳ：スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン（チロトロピックホルモ
ン） ＳＡＴＡ：Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル ＲＬＵ：相対光量単位 Ａｂ1 （ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧβ抗体
（１２Ａ８） Ａｂ2 （ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧα抗体
（９Ｄ７） Ａｂ1 （ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ1 抗体
（３５） Ａｂ2 （ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ2 抗体
（９Ｇ３） 〔注：Ａｂ1 （ＴＳＨ）とＡｂ2 （ＴＳＨ）において、
Ａｂ1 およびＡｂ2 はＴＳＨのβ鎖の異なる２つのエピ
トープに対する抗体である〕 ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド １Ｆ：内因子 ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：アビジンに共有結合した
ＢＡ−Ｃ18 ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10：ＡｂF でコートされたＰＢ／ｎ
Ｃ10 ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ＴＥＡ：トリエチルアミン ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー ＴＮＢＳＡ：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン
酸 Ｄｉｇ−ＣＭＯ：ジゴキシゲニン−３−オンのＯ−カル
ボキシメチルオキシムＢＧＧ：ウシγグロブリン ビオチン−ＬＣ7 −ＮＨＳ：スルホスクシンイミジル−
６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート
【０４１９】モノクローナル抗体はすべて、標準的なハ
イブリッド細胞法で製造した。略述すれば、適当な免疫
原を宿主、通常マウスまたは他の適当な動物に注射し、
適当な期間をおいたのちに宿主から脾臓細胞を採取し
た。別法として、宿主から非感作細胞を単離し、in vi
tro で免疫原により直接感作した。ハイブリッド細胞
は、上記細胞を適当な骨髄腫細胞系と融合し、融合細胞
を培養することによって形成させた。培養ハイブリッド
細胞を特定の抗原、たとえばＴＳＨまたはＨＣＧに対す
るその結合親和性についてスクリーニングした。多数の
スクリーニング方法、たとえばＥＬＩＳＡスクリーニン
グが使用された。選択された融合細胞を最クローン化し
た。
【０４２０】例 １ ビタビンＢ12のアッセイ Ｂ12−ＬＣ25−Ｆ接合体の調製 ２５原子長の架橋腕をもつＢ12−ＬＣ25−Ｆ接合体（下
記参照）は、Ｂ12分子をメチルイソシアネートアセテー
ト（Ｂ12分子中のリボ−スのヒドロキシル基と反応し
て、安心なカルバメート結合を形成する）と反応させ、
ついでメチルエステル塩基加水分解してカルボキシル基
を遊離させることによりＢ12分子にカルボキシル基を導
入して製造した。５′−ＯＨ位に導入されたカルボキシ
ル基をＢ12のＮＨＳエステルに変換し、ついでフルオレ
セインアミンＦ−ＬＣ21−ＮＨ2 と反応させて最終生成
物Ｂ12−ＣＬ25−Ｆを生成させた。 Ａ． ５−カルボキシフルオレセイン上２１原子鎖の合
成反応図
【化３７】
【０４２１】１．２ｇ（０．００５６モル）のモノ保護
ジアミン１Ｃ１を２５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解
し、この溶液を攪拌しながら０．６４ｇ（０．００５６
モル）の無水グリコール酸１Ａ１を加え、反応混合物を
室温に５時間放置した。反応混合物を濃縮し、５０ｍｌ
の水、５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相を０．
１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍｌ）、水（２×５０ｍｌ）で洗浄
し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮すると
１．３５ｇの１Ａ２が生成した。 1Ｈ ＮＭＲ １００
ＭＨｚ（ＣＤ3 ＯＤ） δ４．０，３．８５（２Ｓ，
４，Ｏ−ＣＨ2 −ＣＯ） ｗ３．０，２．８２（２ｔ，
４，ＮＣＨ2 ） δ１．４（Ｓ，ＣＨ3 ）
【０４２２】５００ｍｇ（１．３３ミリモル）の５−カ
ルボキシフルオレセイン、１Ａ３（５酸化リン上、８０
℃、０．０５ｍｍの真空中で１６時間乾燥）を２０ｍｌ
の無水ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を攪
拌しながら、２８０ｍｇ（１．４６ミリモル）の１−エ
チル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドと１
６８ｍｇ（１．４６ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドを加えた。１６時間攪拌したのち、４００ｍｇ
（１．８５ミリモル）のモノｔ−Ｂｏｃ １，６−ジア
ミノヘキサンを加え、この混合物をさらに４時間室温で
攪拌した。得られた混合物を濃縮して濃厚な溶液とし、
１：９メタノール−酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解
し、水（３×５０ｍｌ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍ
ｌ）で抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、
真空中で蒸発させた。残留物を、Ａｎａｌｔｅｃｈ １
０００μ、２０×２０ｃｍシリカゲルＧＦプレート上、
ジクロロメタン中０．５％酢酸および１０％メタノール
を用いて精製した。純粋なバンドをプールし、ジクロロ
メタン／メタノール（１：１）で抽出し、濃縮し、残留
物を最小量のメタノールに溶解し、水中に滴下した。混
合物をついで遠心分離し、固体を真空中で乾燥すると８
３％の１Ａ４が生成した。
【０４２３】３．５ｇ（０．００６４モル）のモノｔＢ
ｏｃ １，６−ジアミノヘキシル−５−カルボニルフル
オレセイン１Ａ４（０．０５ｍｍ真空中、五酸化リン
上、９０℃で１６時間乾燥）を４０ｍｌのジクロロメタ
ン／トリフルオロ酢酸１／１で処理した。この溶液を氷
浴中で５分間攪拌したのち、溶媒を蒸発させ、粗製の残
留物を一夜真空中で乾燥した。
【０４２４】４２ｍｇのモノ−ｔ−Ｂｏｃ １，６−ジ
アミノヘキシルグリコール酸アミド１Ａ２、２２ｍｇ
（０．１９０ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、および３６．４ｍｇ（０．１９０ミリモル）の１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド４ｍｌの無水ジクロロメタン中に混合し、室温で
１６時間攪拌した。この活性化酸の溶液を、上述の１，
６−ジアミノヘキシル−５−カルボキシルフルオレセイ
ン誘導体７５ｍｇ（０．１２７ミリモル）、１０ｍｌの
無水ジメチルホルムアミドおよび６６ｍｌのトリエチル
アミンの溶液に攪拌しながら滴下した。１時間後、反応
混合物を水に取り、酢酸エチルで抽出した。有機相を水
（３×２５ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
し、濃縮し、２０×２０ｃｍ １０００ｍ Ａｎａｌｔ
ｅｃｈシリカゲルＧＦプレート上、ジクロロメタン中１
０％メタノール、０．５％酢酸を用いて精製した。純粋
なバンドを単離し、メタノール／ジクロロメタンで抽出
し、濃縮し、真空中で乾燥した。残留物を４ｍｌのメタ
ノールに取り、攪拌した０．１Ｎ ＨＣｌ（８ｍｌ）中
に滴下し、遠心分離し、乾燥し、８４ｍｇの１Ａ５、収
率８４％を得た。 1Ｈ ＮＭＲ ５００ ＭＨｚ（ＣＤ
3 ＯＤ） δ８．４（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝．７１Ｈ
ｚ） δ８．１７（ｄｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈ
ｚ） δ７．３（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
δ４．０４（ｄ，４，Ｏ−ＣＨ2 −ＣＯ） δ１．４１
（Ｓ，９，３ＣＨ3 ） 元素分析Ｃ42Ｈ52Ｎ4 Ｏ11として：Ｃ，６３．７：Ｈ，
６．８；Ｎ，７．０ 分析値：Ｃ，６３．５６；Ｈ，６．６４；Ｎ７．０
【０４２５】上記５−カルボキシフルオレセインのｔＢ
ｏｃ−２１−原子長鎖アミン（０．０５ｍｍ真空中、五
酸化リン上、８０℃で乾燥）に、室温でトリフルオロ酢
酸５ｍｌを加えた。５分後、酸を蒸発させ、ついで真空
中８０℃で乾燥させると、トリフルオロ酢酸塩１Ａ６が
得られた。 ＦＡＢ−ＭＳ Ｃ37Ｈ44Ｎ4 Ｏ（Ｍ＋Ｈ) + ６８９
【０４２６】Ｂ． Ｂ12のリボース環のＯ 5′位の、５
−カルボキシフルオレセインに連結した２５原子スペー
サーによる修飾の反応様式
【化３８】
【０４２７】ビタミンＢ１２（１Ｂ１）（４８時間８０
℃で乾燥、１０μ）２５ｍｇ（０．０１８５ミリモル）
を１．２５ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解し
た。この溶液に攪拌しながら、２１．２ｍｇのイソチオ
シアネート酢酸メチルエステル（０．１８５ミリモル）
を加え、反応混合物を室温に２４時間放置した。反応混
合物を攪拌した酢酸エチル溶液１０ｍｌ中に滴下した。
沈澱した生成物を遠心分離し、ついで最小量のメタノー
ルに再懸濁し、再沈澱させた。この物質を、Ｗｈａｔｍ
ａｎ ＰＬＣ18Ｆ製造用プレート１０００μ ２０×２
０ｃｍ上、０．５ｍｌ酢酸＋１ｇＮａＣｌ／１００ｍｌ
含有２：８イソプロパノール−水で溶出して精製した。
Ｒｆ＝０．６２５。吸着物質から単離するとメチルエス
テル１Ｂ２が得られた。 （＋）−ＦＡＢＭ５（Ｃ67Ｈ93Ｃ0 Ｎ15Ｏ17Ｐ）分子量
１４６９．６；（Ｍ＋Ｈ）１４７０，（Ｍ−ＣＮ）+ １
４４４
【０４２８】４０ｍｇ（０．０２７２ミリモル）のＢ12
Ｏ5 ′−カルボニルグリシンメチルエステル１Ｂ２を
２．５ｍｌの２／１メタノール−水に取り、水酸化アン
モニウムでｐＨを９．５に調整し、室温で１６時間攪拌
した。 ｔｌｃ分析 Ｗｈａｔｍａｎ ＫＣ18Ｆ ２：８イソプロパノール−水、０．５％酢酸、１％Ｎａ
Ｃｌ Ｒｆ≒０．７９
【０４２９】反応混合物を濃縮乾固し、生成物をＷｈａ
ｔｍａｎ ＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ、２０×２０
ｃｍ２個を用い、上述と同様に溶出して単離した。純粋
なバンドをメタノールで抽出し、抽出液を濃縮し、２：
７メタノール−ジクロロメタンに溶解し、濾過し、濃縮
した。残留物を４ｍｌのメタノールに溶解し、４ｍｌの
エチルエーテルに滴下した。沈殿を遠心分離し、Ｐ2 Ｏ
5 上、０．５ｍｍ、６０℃で１６時間乾燥すると、生成
物１Ｂ３ ２８ｍｇが得られた。 （＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ66Ｈ91ＣｏＮ15Ｏ17Ｐ）分子
量１４５５．７，（Ｍ＋Ｈ）+ １４５６，（Ｍ−ＣＮ）
+ １４３１
【０４３０】１５ｍｇ（０．０１３ミリモル）のＢ12Ｏ
5′−カルボニルグリシン１Ｂ３、３．６６ｍｇ（０．
０１６ミリモル）Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、１．９５ｍｇ（０．０１７ミリモル）Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドを５ｍｌの無水ジメチルホルムアミ
ドと混合し、室温で１６時間攪拌した。反応混合物を、
１３．６ｍｇ（０．１７ミリモル）の５−カルボキシフ
ルオレセインの２１−原子長鎖アミン１Ａ６と２．０２
ｍｇ（０．０２ミリモル）トリエチルアミンの４ｍｌ乾
燥ジメチルホルムアミド中溶液に攪拌しながら滴下し、
室温で１２時間攪拌した。
【０４３１】粗製反応混合物を真空下４０℃で濃縮し、
残留物を２ｍｌのメタノールに取り、６ｍｌのエチルエ
ーテルで沈殿させ、遠心分離した。固体をＷｈａｔｍａ
ｎＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ ２０×２０ｃｍ上、
７：３メタノール−水、０．５％酢酸で溶出して精製し
た。２Ｒｆ≒０．７８、１Ｂ４ 収率３７％ （＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ103 Ｈ133 ＣｏＮ19Ｏ
25Ｐ），（Ｍ＋Ｈ）+ ２１２５；（Ｍ−ＣＮ）21 Ｕ
Ｖ／ｍａｘ ３６０（ε ２６，６００），５０（ε５
７，０００），５５０（ε ９５００）
【０４３２】ＩＩ．抗−内因子（ＡｂIF）抗体のビオチ
ン化 モノクローナル抗−内因子抗体（ＡｂIF）は、Ｋｏｈｌ
ｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ ２５６
（１９７５）４９５−４９７に報告された方法に基づく
標準的ハイブリッド細胞法によって製造した。
【０４３３】Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．からのビオチン−Ｌ
Ｃ7 −ＮＨＳを用い、３種の異なるレベルのビオチン化
（反応混合物中のＡｂIF：ビオチン＝１：１０，１：５
０，または１：２００）を実施した。ＡｂIFは０．０５
Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．８中
〔ＩｇＧ〕＝２．５ｍｇ／ｍｌとした。この溶液に、所
要量のビオチン−ＬＣ7 −ＮＨＳを含有するＤＭＳＯ
（総容量の１％）を加え、ついで溶液を４℃で一夜イン
キュベートした。最後に、反応混合物をＳｅｐｈａｄｅ
ｘTM Ｇ−２５上で精製し、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，
０．０２％ ＮａＮ3 ／ｐＨ＝７．２に対して大規模に
透析した。ビオチン化−内因子抗体は凍結して保存し
た。
【０４３４】ＩＩＩ．粒子の製造 Ａ．原料 １７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｍｅｌ，
ＩＮ ４６０３２ ３８ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｄｕｋｅ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３ エチレングリコール、ベンジルアルコール、ベンゾニト
リル：ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−２５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｎＣ10：Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ ９８１０５
【０４３５】Ｂ．ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10 １．３８ｎｍ直径粒子 ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製
した。エチレングリコール（１６ｍｌ）を２０ｍｌのガ
ラスバイアルに取り、実験室用ホットプレート上で１０
０°に加熱した。ベンジルアルコール（１．６ｍｌ）を
加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。保存ラテックス
懸濁液（２ｍｌ，１０％固体含有３８ｎｍカルボキシレ
ート修飾ラテックス）を加え、混合物を３〜４分間放置
して平衡化させた。ｎＣ10溶液（０．４ｍｌ）を徐々に
１００μｌ部ずつ添加した。１００°への加熱を５分間
続けたのち、混合物を放置して温度を室温まで低下させ
た。冷却後、混合物を、５０％含水エタノールで平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２．５×１５
ｃｍ）に適用した。ラテックス含有分画をプールし、水
で平衡化した第二のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム
（２．５×３５ｃｍ）に適用した。ラテックスは３０ｍ
ｌの容量中に溶出した。 ２．１７５ｎｍ直径粒子 ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製
した。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌの
エルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレ
ート上で１１０°に加熱した。ベンジルアルコール（８
ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ｎＣ10
溶液（２ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸
濁液（１０ｍｌ，１０％固体含有１７５ｎｍカルボキシ
レート修飾ラテックス）を添加した。１００°〜１１０
°への加熱を激しく攪拌しながら１０分間継続した。つ
いでフラスコを室温の水浴中に置き冷却した。冷却後、
混合物を等容量のエタノールで希釈し、直ちに１５，０
００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で２
時間遠心分離した。わずかに青色の上清を傾潟し、ペレ
ットを、粒子を分散するために浴ソニケーターを用いて
５０％含水エタノール（２０ｍｌ）中に再懸濁した。遠
心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。上清を
傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心分離の
のち、ペレットを水に再懸濁し、最終容量を２０ｍｌと
した。
【０４３６】３．ビーズのＡｂF への結合は例３，Ｖに
記載する。
【０４３７】Ｃ．アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18 １７５ｎｍ直径粒子 ＢＡ−Ｃ18の１０ｍＭ溶液をベンゾニトリル中に調製し
た。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレー
ト上で１００°に加熱した。ベンゾニトリル（９ｍｌ）
を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ＢＡ−Ｃ18溶
液（１ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸濁
液（１０ｍｌ，上述の１０％固体含有１７５ｎｍラテッ
クス）を添加した。加熱を１００°で、激しく攪拌しな
がら５分間継続した。ついでフラスコを室温の水浴中に
置いて冷却した。冷却後、混合物を等容量の５０％含水
エタノールで希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍ（Ｓｏ
ｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で計４時間遠心分離し
た。上清を傾潟し、ペレットを、粒子を分散させるため
に浴ソニケーターを用いて含水エタノール中に再懸濁し
た。遠心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。
上清を傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心
分離ののち、ペレットを水に再懸濁して最終容量を２０
ｍｌとした。ビーズのアビジンへの結合は例３，ＶＩに
記載する。
【０４３８】ＩＶ．アッセイプロトコール アッセイは、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，
０．１％ ＢＳＡ，ｐＨ７．５。ＢＳＡはＢ12およびＢ
12バインダーを含まなかった）中、Ｂ12カリブレーター
（元の１０μｇ／ｍｌ Ｂ12保存溶液から希釈、１０μ
Ｍ ＫＣＮ）１００μｌを５０ｍｌの２．２ｎｇ／ｍｌ
Ｂ12−ＬＣ25−Ｆおよび５０μｌの予め混合した８８
ｎｇ／ｍｌ内因子（ＩＦ）、８．８μｇ／ｍｌ ＡｂIF
−ビオチンと混合して実施した。これらの混合物を室
温、暗所で１５分間インキュベートし、ついで各チュー
ブに１０10ビーズアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18および
２．５×１０11ビーズＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10を含有する
０．７５ｍｌの０．０５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ
ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００／ｐＨ８．２緩衝液を加え、インキュ
ベーションをさらに３０分間、室温暗所で振盪しながら
継続した。最後に、各チューブを、光源として６５０ｎ
ｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプを用い
て１分間照射し、ついで化学ルミネッセンス光を、Ｔｕ
ｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを用いて２０秒間集
積して測定した。結果は表３にまとめる。
【０４３９】例 ２ ジゴキシンのアッセイ Ｉ．ＡｂDig −ビオチンの製造 抗−ジゴキシンモノクローナル抗体（ＡｂDig ）は標準
的ハイブリッド細胞系法に従って製造し、抗体は固定化
プロテインＡで精製した。ついで、この抗体（０．０５
Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．８中約
２〜２．５ｍｇ／ｍｌ）とビオチン−ＬＣ7 −ＮＨＳ
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ Ｉｌｌ．）（まずＤＭＦ中に可溶化し、その
小部分を反応に使用）を互いに混合し、４℃に３時間イ
ンキュベートしてＡｂDig −ビオチンを製造した。反応
混合物中、反応原料のモル比は抗体：ビオチン−ＬＣ7
−ＮＨＳ＝１．２５であった。カップリングしなかった
ビオチンはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムによって除
去した。最終の接合体は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．
００１％チメロサール／ｐＨ＝７．４中、４℃または凍
結して保存した。
【０４４０】ＩＩ．Ｄｉｇ−ＬＣ9 −Ｆの製造 この試薬は、（１）Ｆ−ＮＨＳ、（２）Ｆ−ＬＣ9 −Ｎ
Ｈ2 、および（３）Ｄｉｇ−ＬＣ9 −Ｆを製造すること
により３連続工程で調製した。 Ａ．Ｆ−ＮＨＳの製造：ＤＭＦ中１００ｍｇ／ｍｌ ６
−カルボキシフルオレセインおよび３０．６ｍｇ／ｍｌ
ＮＨＳの溶液２ｍｌに、２７５ｍｇ／ｍｌＤＣＣ
０．４ｍｌを加えた。混合物を室温暗所で一夜攪拌し
た。生成したジシクロヘキシル尿素を濾去した。Ｆ−Ｎ
ＨＳの形成は、シリカプレート上ＣＨ2 Ｃｌ2 ：メタノ
ール：酢酸＝８５：１５：１の溶媒系を用いたＴＬＣに
よってチェックした。ＤＭＦをロートバップで除去し、
生成物（Ｆ−ＮＨＳ）はさらに減圧下で乾燥し、乾燥器
中に４℃で保存した。
【０４４１】Ｂ．Ｆ−ＬＣ9 −ＮＨ2 の製造：ＤＭＦ中
ビス−（３−アミノプロピル）−メチルアミン（Ｌ
Ｃ9 ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）の溶液１．５ｍｌに、
ＤＭＦ中１２５ｍｇ／ｍｌ Ｆ−ＮＨＳ １．２ｍｌを
加え、ついで室温暗所で攪拌しながら一夜インキュベー
トした。Ｆ−ＮＨＳ：ＬＣ9 のモル比は１：４０であっ
た。次に反応混合物を０．５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．０
で１／２０に希釈し、混合物のｐＨをリン酸（１．０
Ｍ）の添加によって５．０に調整し、全混合物を、０．
５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．０で平衡化したＢｉｏＲｅ
ｘ−７０TMカラム（２．５×１０ｃｍ）上に負荷した。
負荷後、カラムを、ビス−（３−アミノプロピル）メチ
ルアミンが除去されるまで（ＴＮＢＳＡ反応でモニタリ
ング）開始緩衝液で洗浄した。カラムを０．００１Ｍ
ＮａＰｉ／ｐＨ＝６．０で洗浄して６−カルボキシフル
オレセイン夾雑物を除去した。低イオン強度緩衝液によ
る洗浄で、６−カルボキシフルオレセインのみでなく、
同定されていない他のフルオレセイン含有夾雑物も除去
された。次に、カラムをＤ−Ｈ2 Ｏで洗浄して塩を除去
した。最後にカラムを０．８Ｍ ＮＨ4 ＯＨで溶出し
た。水酸化アンモニウムを凍結乾燥で除去した。純度を
チェックしたのち、生成物を−２０℃で乾燥器に保存し
た。反応は濾紙電気泳動（パラゴン電気泳動システムを
用い、０．０５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．８で２０分
間）およびＴＬＣ（溶媒としてＤ−Ｈ2 Ｏ中５０％メタ
ノールを用い、Ｃ18プレート上）で追跡した（また、生
成物の純度をチェックした）。
【０４４２】Ｃ．Ｄｉｇ−ＬＣ9 −Ｆの製造：米国特許
第４，０３９，３８５号例２の記載（この開示は参考と
して本明細書に導入する）に従って製造したＤｉｇ−Ｃ
ＭＯ２３．０５ｍｇ（０．０５ミリモル）、５０．３５
ｍｇ（０．１ミリモル）のＦ−ＬＣ9 −ＮＨ2 および１
９．２ｍｇ（０．１ミリモル）のＥＤＡＣを１．５ｍｌ
のＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５：１）溶媒中に含有する溶液
を、室温暗所で一夜攪拌した。Ｄｉｇ−ＬＣ9 −Ｆおよ
びＤｉｇ−ＣＭＯ（未反応分が残っていれば）を、３ｍ
ｌのＤ−Ｈ2 Ｏを添加して沈殿させ、濾過し、溶媒を捨
てた。濾過された物質をＣＨ2 Ｃｌ2 ：メタノール：酢
酸＝６０：４０：５からなる溶媒系に再溶解し、同じ溶
媒系中シリカゲルカラム（１．５×２０ｃｍ）上に負荷
した。これらの条件下に、Ｄｉｇ−ＣＭＯはＤｉｇ−Ｌ
Ｃ9 −Ｆ接合体の前を移動し、Ｆ−ＬＣ9 −ＮＨ2 はカ
ラムの頂部に結合したままであった。この物質の純度
は、上述の溶媒系を用いたＴＬＣシリカゲルプレート、
および濾紙上ｐＨ＝５．８における電気泳動によってチ
ェックした。精製された物質からロートバップによって
溶媒を除去し、生成物を最小容量のメタノール／ＤＭＦ
（７０：３０）に再溶解し、ついで遠心分離して不溶性
物質（シリカゲル）を除去した。最終工程は、精製時に
可溶化されて生成物と共溶出する大部分のシリカゲルの
除去のために実施された。生成物はメタノール／ＤＭＦ
（７０：３０）溶媒系中に−１０℃〜−２０℃で保存し
た。生成物の濃度は、既知量の６−カルボキシフルオレ
セインを用いて作成した標準曲線からＡ490 によって測
定した。
【０４４３】ＩＩＩ．アッセイプロトコール アッセイは、血清（ヒト無ＴＳＨ正常血清）中ジゴキシ
ンカリブレーター５０ｍｌを、アッセイ緩衝液（０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．
１５Ｍ ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２ｍｇ
／ｍｌ ＢＧＧ／ｐＨ８．２）中１．７４ｎｇ／ｍｌ
ジゴキシン−ＬＣ9 −Ｆ接合体５０μｌおよび上述の同
じ緩衝液中１６０ｎｇ／ｍｌのＡｂDig −ビオチン５０
μｌと混合して実施した。これらの混合物を室温で１５
分間インキュベートし、ついで各チューブに、１０10ア
クセプタービーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）およ
び２．５×１０11感作ビーズ（ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10）
を含有する０．７５ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐ
Ｈ８．２緩衝液を加えて、インキュベーションを室温暗
所でさらに３０分間継続した。最後に、各チューブを、
光源として６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハ
ロゲンランプを用いて１分間照射し、ついで化学ルミネ
ッセンス光をＴｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを
用いて２０秒間測定した。結果は図２にまとめる。
【０４４４】例 ３ ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよび甲状腺 刺激ホルモンのアッセイ Ｉ．試薬および原料 Ａ． ＢＡ−Ｃ18は以下の操作によって製造した。試薬
は、とくに指示したものを除き、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌから入手した。 １．ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸ジオクタデシルアミド 新たに蒸留したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍ
ｌ溶液に、ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸（Ｋ＆Ｋ Ｌａ
ｂｓ）（分子量１８０，０．５４０ｇ，３．０ミリモ
ル）、トリエチルアミン（分子量１０１．１９，０．３
３３ｇ，３．３ミリモル）およびトリメチルアセチルク
ロリド（分子量１２０．５７，０．３９８ｇ，３．３ミ
リモル）を添加した。２０分間還流加熱したのち、ジオ
クタデシルアミン（Ｆｌｕｋｅ）（分子量５２２．０
１，１．７２３ｇ，３．３ミリモル）を加えた。反応混
合物を一夜還流した。翌日、反応混合物を水で希釈し、
反応溶液をメチレンクロリドで抽出した。メチレンクロ
リド抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥した。
【０４４５】２．ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボ
キシアミドメトキシベンザル−９−メチルアクリダン 無水ＴＨＦ中１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチ
ルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈｉ Ｃｈｅｍ．１１４，
３，１９８８）（分子量３０３．２７，０．１００ｇ，
３．３ミリモル）に、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチル
リチウム溶液０．４１３ｍｌを−７８℃で（アセトン／
ドライアイス浴）アルゴン下に添加した。ｎ−ブチルリ
チウム溶液を加えると溶液は黄色を呈した。ｎ−ブチル
リチウムの添加２０分後に上記アミドのＴＨＦ溶液を添
加した。反応溶液を一夜放置して温度を室温まで上昇さ
せた。翌日、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸
エチル／ヘキサン）によって単離した。単離された生成
物はマススペクトル分析およびＮＭＲで分析し、暗所に
保存した。
【０４４６】Ｂ．一重項酸素発生染料（ｎＣ10）はＵＬ
ＴＲＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎから入手した。ＥＤＡＣ，ＳＡＴＡ，ＨＣＧ，および
ＢＳＡはＳｉｇｍａ Ｃｏ．から入手した。Ａｂ1 （Ｔ
ＳＨ）−ビオチンおよびＡｂ2 （ＨＣＧ）−ビオチンな
らびにＡｂ2 （ＴＳＨ）−Ｆは例１のＩＩの記載の操作
と同様にして製造した〔また、米国特許出願０７／３８
９，６５９号（１９８９年８月４日出願）、欧州特許公
告４１１，９４５号（１９９１年２月６日公告）に対応
参照。その関連部分を参考として本明細書に導入す
る〕。Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓのルミノメーター
（２０ｅ型）を用いた。
【０４４７】ＩＩ．抗−ＨＣＧ抗体で安定化した油滴
〔Ａｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18）の製造 抗−ＨＣＧ抗体標識油滴（ＯＤ）は、１ｍｌの１０ｍｇ
／ｍｌ抗−ＨＣＧ−β（１２Ａ８，ＩｇＧ）を、ジブチ
ルフタレート中５ｍＭ ＢＡ−Ｃ18 ５０μｌ含有ガラ
ス管中に移して製造した。蛋白質は０．０５Ｍ ＮａＰ
ｉ，０．１５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７．６中に取った。油分
は超音波処理と同時に連続的な機械的攪拌を行い乳化し
た。小さな油滴の調製には高エネルギーのソニケーター
が必要なことに留意すべきである。超音波処理はＢｒｏ
ｎｓｏｎソニケーターを用いて７分間行った（冷却剤と
して室温の流水を使用した）。２５％ Ｎａ2 ＳＯ4 溶
液を加えて非結合蛋白質を除去すると８％〜９％の最終
濃度が得られ、ついで遠心分離した（マイクロフュー
ジ，セット８，１０分間）。洗浄工程は３回実施した
（遠心分離速度は、油滴が分離されるが合体はしないよ
うに調整しなければならない）。最終の洗浄後、粒子を
１ｍｌの０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５ＭＮａＣｌ，
４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６に懸濁し、３分間再
び超音波処理した。調製物の最終容量を５ｍｌに調整
し、スクロースを最終濃度２％に添加した。これらのＡ
ｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18粒子は４℃で保存し
た。上述の方法によって製造した油滴のサイズは不均一
で、平均直径は１〜５μであった。
【０４４８】ＩＩＩ．アビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ10の製造 リポソームはメタノール希釈法で製造した。典型的に
は、脂質混合物、すなわちコレステロール（２．０ｍ
ｇ）、ＤＰＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉ
ｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（２３．８）、
ＤＰＰＧ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，
Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（６．５ｍｇ）、マレ
イミド−ＤＰＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，
Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅ）（０．５ｍｇ）およびｎＣ
10（０．５ｍｇ）を温メタノール（２００μｌ）に溶解
し、ついで攪拌した緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，
０．０５ＭＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ６．０）
２ｍｌ中に添加した。次にこの懸濁液を緩衝液Ｂ中Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１．５×２０ｃｍ）に
通した。リポソーム含有分画をプールし、必要な場合に
は大きな粒子を除去するためにマイクロフュージで遠心
分離した。最後に、マレイミド含有リポソームを、緩衝
液Ｂ中スクシニル化アビジン−ＳＨ（以下に記載のよう
にして製造）の溶液に攪拌しながら添加した。アルゴン
で通気洗浄後、この混合物を一夜４℃で穏やかに混合し
た（攪拌棒は使用しない）。２ｍＭのメルカプトコハク
酸（反応混合物容量）により４℃で３０分間処理して過
剰のマレイミド基を遮断し、ついでヨード酢酸を最終濃
度５ｍＭになるように加えて過剰のチオール基を遮断し
た（４℃，３０分）。ついで反応混合物をＣｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ−３０TM装置によって２．５〜３ｍｌに濃縮
し、カップリングしなかったアビジン分子は、緩衝液Ｂ
中Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−２Ｂカラム（１．５×５０ｃ
ｍ）でゲル濾過して除去した。
【０４４９】ＩＶ．スクシニル化アビジン−ＳＨの製造 アビジンをＳＡＴＡ（アビジン１モルあたり５モル）と
４℃で一夜反応させた（１Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ７．４中
１０ｍｇ／ｍｌアビジン）。この溶液にＤＭＦ中無水コ
ハク酸（アビジン１モルあたり５０モル）を加え（総Ｄ
ＭＦは反応容量の１％未満）、溶液を２時間インキュベ
ートした。反応混合物のｐＨは０．５ＭＮａ2 ＨＰＯ4
を添加して７．４に維持した。室温で１時間ヒドロキシ
ルアミン（０．１Ｍ，ｐＨ７．０で）によって処理して
保護チオール基を遊離させた。最後に、緩衝液Ｂ（０．
０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ／ｐＨ６．０、気体を除去し、アルゴンを飽和）
中１．５×３０ｃｍ Ｇ−２５カラムを用いて過剰の小
分子量分子を除去した。蛋白質のピーク（アビジン−Ｓ
Ｈ）を集め、この蛋白質をマレイミド含有リポソームと
反応させた。
【０４５０】Ｖ．抗−フルオレセイン被覆ｎＣ10染色ビ
ーズ（ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10）の製造 カルボキシル化ポリスチレンビーズ（３８ｎｍ）（例
１，ＩＩＩＢ参照）をｎＣ10で染色した。ＥＤＡＣ／ス
ルホ−ＮＨＳの接合法を用いて、これらのポリスチレン
ビーズにＡｂF をカップリングさせた。典型的には、５
ｍｇ／ｍｌ ｎＣ10染色カルボキシル化ポリスチレンビ
ーズおよび１１ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳを含む０．
０２Ｍ ＮａＰｉ（ｐＨを５．５に調整）１０ｍｌを、
新たに調製したＥＤＡＣ（２００ｍｇ／ｍｌ）のＤ−Ｈ
2 Ｏ中溶液１ｍｌと混合した。室温（暗所）で２５分間
インキュベートしたのち、ビーズを遠心分離して過剰の
ＥＤＡＣを除去した（ＥＤＡＣはこれらのビーズの微小
凝集を起こさせるので、たとえばＳｏｒｖａｌのＳＡ−
６００ローターを１５０００ｒｐｍで使用する慣用の遠
心分離で、それらをペレット化することが可能であっ
た）。ペレット化されたビーズを３ｍｌの０．００５Ｍ
ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に再懸濁し、攪拌した蛋白質溶
液〔１５ｍｌの０．０２Ｍ Ｂｏｒａｘ，０．０８Ｍ
ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ３ＧＩ ＩｇＧ（ＡｂF ），
８ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．９）中に移した。この
混合物を一夜４℃で穏やかに振盪した（攪拌はしな
い）。ビーズ上に反応性の基が残っていれば、０．０８
３Ｍグリシンおよび１５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．
９により４℃で６０分間処理して遮断した。カップリン
グしなかった蛋白質は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１
５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．６で連続洗浄して除去した。
最終ペレットは洗浄緩衝液に再懸濁し、超音波処理し、
そのまま４℃に保存した。これらのビーズの最終サイズ
は１４０ｎｍであった。
【０４５１】ＶＩ．アビジン被覆、ベンザルアクリジン
染色ビーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）の製造 カルボキシル化ラテックスビーズ（０．１７５μ）をＢ
Ａ−Ｃ18で染色した（例１，ＩＩＩＣ参照）。これらの
粒子へのアビジンの接合には、ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨ
Ｓ接合法を使用した。スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣによる
ビーズの活性化は、ＡｂF ＰＢ／ｎＣ10の製造について
上述したのと同じ方法で実施した。活性化されたビーズ
（１００ｍｇ）は遠心分離してＥＤＡＣを除去し、つい
で２．５ｍｌの０．００５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に
再懸濁し、攪拌したアビジン溶液（１５ｍｌの０．０２
５Ｍ Ｂｏｒａｘ，１．３３ｍｇ／ｍｌ アビジン／ｐ
Ｈ９．１）中に移した。ついで混合物を４℃で一夜、穏
かに混合した。２０μｌのＤＭＦ中１Ｍ無水コハク酸
（アビジンに対して６０倍モル過剰）を加えてビーズ上
のアビジンをスクシニル化し、さらに４℃で１時間イン
キュベートした。ビーズを７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（反応
混合物中の最終濃度）により４℃で６０分間遮断した。
最後にビーズを０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ／ｐＨ７．６で３回遠心分離によって洗浄し、１
０ｍｌの洗浄緩衝液中に保存した。最終工程で、ビーズ
を超音波処理して、モノ分散粒子を得た。蛋白質の標識
後も粒子サイズには有意な変化はなかった（約１９０ｎ
ｍ）。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18は洗浄緩衝液中４℃
で保存した。
【０４５２】ＶＩＩ．ビオチン−ＬＣ21−Ｆの製造 １．反応式
【化３９】
【０４５３】２．原料 ６−カルボキシフルオレセイン、Ｋｏｄａｋ ビオチン−ＮＨＳエステル、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ． ４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミン、Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． 酸化カルシウムから蒸留した乾燥ＤＭＦ、Ａｇ−ＭＰ−
１（Ｃｌ- ）陰イオン交換樹脂、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ
【０４５４】３．フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３ ６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＩ １）（１０
ｇ，２６．６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶
解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．２２ｇ，
２８ミリモル）を固体としてＤＭＦ溶液に加え、溶解さ
せた。ついで混合物を氷浴で冷却した。ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（５．８ｇ，２８ミリモル）を乾燥Ｄ
ＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、上述の冷ＤＭＦ溶液に一度
に加えた。混合物を氷浴の温度で３０分間攪拌し、つい
で放置して温度を室温まで上昇させた。反応の経過はｔ
ｌｃ（１％酢酸含有１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ2 Ｃｌ2 ）で
追跡した。３時間後にフルオレセインＮＨＳエステルＶ
ＩＩ２の生成は完結した。
【０４５５】４，９−ジオキサ−１，２−ドデカンジア
ミン（２５．５ｇ，１２５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１
０ｍｌ）で希釈した。フルオレセインＮＨＳエステル反
応混合物をアルゴン気相下氷中で冷却し、ジアミン溶液
を５分間を要して滴加した。冷却浴を取り去り、攪拌を
室温で継続した。反応の経過は上記の系を用いたｔｌｃ
で追跡した。反応が完結したと判断された時点で、反応
混合物を水（１００ｍｌ）によって希釈し、氷中で冷却
してジシクロヘキシル尿素を沈殿させ、これを濾過して
除去した。
【０４５６】濾液にＡＧ−ＭＰ−１（Ｃｌ- ）陰イオン
交換樹脂を懸濁させ、クロマトグラフィーカラム中に注
いだ。樹脂を、ニンヒドリンで遊離のジアミンがも早検
出されなくなるまで５０％含水メタノールで洗浄した。
ついで樹脂を５０％含水メタノール中０．１Ｎ塩酸で溶
出した。フルオレセインアミン塩酸塩が最初に、ついで
６−カルボキシ−フルオレセインが溶出した。純粋な分
画をプールし、ロートバップで乾固させた。高真空下に
乾燥すると、純粋なフルオレセインアミン塩酸塩（ＶＩ
Ｉ３）３．４ｇが回収された。
【０４５７】４．フルオレセイン−ＬＣ21−ビオチン
ＶＩＩ４ フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３（３５０ｍｇ，
０．６１ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し
た。トリエチルアミン（３００ｍｌ）、ついでビオチン
ＮＨＳエステル（４４５ｍｇ，０．８ミリモル）を添加
した。反応の経過はｔｌｃ（ＭｅＯＨ−ＣＨ2 Ｃｌ2 −
酢酸−水，２０：７８：１：１）で追跡した。反応が完
了したと判断された時点で、ＤＭＦをロートバップで除
去した。残留物をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、シ
リカゲル（１０ｇ）を懸濁させた。この懸濁液をロート
バップで流動性の粉末に乾燥し、これをジクロロメタン
に懸濁し、ジクロロメタンで平衡化したシリカゲルカラ
ム（２．５×２５ｃｍ）の頂部に適用した。カラムを上
記ｔｌｃ溶媒混合物で溶出した。生成物を含有する分画
をプールし、溶媒をロートバップで除去した。残留物を
エタノールに取り、濾過した。濾液をゆっくり蒸発させ
ると、生成物はゴム状物として枕積した。ゴム状物を高
真空下に乾燥すると、フルオレセイン−ＬＣ21−ビオチ
ンＶＩＩＩ４（Ｆ−ＬＣ21−ビオチン）３５０ｍｇが得
られ、これはさらに精製することなくそのまま使用し
た。
【０４５８】ＶＩＩＩ．アッセイ Ａ．ＨＣＧアッセイ標準曲線（Ｌｉｐ含有ＯＤ） ＨＣＧアッセイはまず、ＨＣＧ（量を様々に変えて）、
Ａｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18およびＡｂ2 （Ｈ
ＣＧ）−ビオチンを互いに混合することによって実施し
た。室温で１時間インキュベートしたのち、過剰量のア
ビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ10を加え、インキュベーションを
室温でさらに３０分間続けた。最後に、チューブをそれ
ぞれ１分間照射し、ルミネッセンスを２０秒間測定し
た。
【０４５９】プロトコール：サンプル緩衝液〔０．０５
Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳ
Ａ，２０％スクロース，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸
（Ｔ−５００）ｐＨ７．５〕中様々な濃度のＨＣＧ５０
μｌ、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１
５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳＡ，ｐＨ７．５）中４μ
ｇ／ｍｌ Ａｂ2 （ＨＣＧ）−ビオチン５０μｌ、およ
びＡｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０μｌ
（５×１０8 ＯＤ／チューブ）を混合する。室温、暗所
で振盪しながら１時間インキュベートする。１．５×１
０12アビジン−ｎＣ10 Ｌｉｐ ５０μｌ（７．３×１
０10Ｌｉｐ／チューブ）を添加する。室温、暗所で振盪
しながらインキュベートする。ハロゲンランプ（６５０
ｎｍカットオフフィルターを使用した場合の光出力１２
０ｍＷ）を１分間照射する。ついで光源を切り、放射光
の強度を２０秒間測定する。結果は図３にまとめる。
【０４６０】Ｂ．ビオチン−ＬＣ21−Ｆのアッセイ 試験は、５０ｍｌのアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18（２×
１０11ビーズ／ｍｌ）、５０ｍｌのＡｂF −ＰＢ／ｎＣ
10（５×１０12ビーズ／ｍｌ）および１００ｍｌのビオ
チン−ＬＣ21−Ｆ（様々な量）を、０．０５Ｍ ＮａＰ
ｉ，０．１５ＭＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ
７．６中に混合することにより実施した。この混合物を
室温、暗所で、振盪しながら１．５時間インキュベート
した。最後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５
０ｎｍカットオフフィルターを添付）で１分間照射した
のち、光出力を２０秒間Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノ
メーターで光強度を集積して測定した。結果は図４にま
とめる。
【０４６１】Ｃ．ＴＳＨアッセイ標準曲線 ＴＳＨアッセイは、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ
ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６中様々
の濃度のＴＳＨ２００μｌを、５０μｌの４μｇ／ｍｌ
Ａｂ1 （ＴＳＨ）−ビオチンおよび４μｇ／ｍｌ Ａ
ｂ2 （ＴＳＨ）−Ｆと混合することによって実施した。
これらの混合物を室温で１．５時間インキュベートし
た。ついで各チューブに１００μｌの１０10アビジン−
ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18ビーズおよび２．５×１０11 ＡｂF
−ＰＢ／ｎＣ10ビーズ含有ＰＢＳを添加した。インキュ
ベーションを室温でさらに１．５時間続けた。最後に各
チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフ
フィルターを添付）で照射したのち、光出力を２０秒間
Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターで光強度を集積
して測定した（図５および図６）。
【０４６２】例 ４ 可溶性フォトセンシターザーおよび アクセプター油滴を使用したＨＣＧアッセイ Ｉ．試薬： アクセプター染色油滴＝Ａｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ
−Ｃ18（例３，ＩＩに記載） Ａｂ2 （ＨＣＧ）−ビオチン：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．から購入したビオチンのＮＨＳ誘導体
から、例２，Ｉと同様にして調製 ストレパビジン−Ｔ６８０：Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｅｓＣｏ．より。上述のｎＣ10染料の可
溶性類縁体で標識されたストレパビジン
【０４６３】ＩＩ．アッセイ アッセイは、様々な量のＨＣＧを含有するサンプル緩衝
液〔０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸
（Ｔ５００），２０％スクロース／ｐＨ７．６〕５０μ
ｌを、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１
５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６）
中４μｇ／ｍｌ抗−ＨＣＧ−ビオチンおよび５×１０8
油滴含有Ａｂ1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０
μｌと混合して実施した。この混合物を、室温、暗所で
１時間インキュベートした。ついで、アッセイ緩衝液中
２μｇ／ｍｌのストレパビジン５０μｌを各チューブに
加え、インキュベーションをさらに３０分間続けた。最
後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカ
ットオフフィルター添付）で１分間照射し、Ｔｕｒｎｅ
ｒの２０ｅルミノメーターを用いて２０秒間光出力を測
定した。結果は図７にまとめる。
【０４６４】例 ５ 標的オリゴヌクレオチドの均一系アッセイ 標的配列は大腸菌Ｋ１２ ＤＮＡ Ｊ遺伝子（Ｊ．Ｃ．
Ａ．Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｋ．Ｔｉｌｌｙ，Ｅ．Ｃｒａｉ
ｇ，Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｚｙｌｉｃｚ ＆ Ｃ．Ｇｅｏ
ｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
１：１７８２−１７８５，１９８６）から選択した。Ｂ
ｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０を用いるホスファイトトリエ
ステル法によって、以下の配列をもつ５０マーを製造
し、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮTM Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ
ｉｔｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）
を用いて５′末端にビオチンを導入した。 配列：ＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣ ＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＡ プローブは、改変Ｃにフルオレセイン（Ｆ）が結合し、
以下の配列 を有する相補性の３０マーとした。
【０４６５】フルオレセインは、改変ヌクレオチドＮ4
−ＬＣＡ−５−メチルデオキシシチジンＣＥＤＴ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉ
ｏｎｅｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を挿入し、つ
いで５−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシス
クシンイミドを３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ含有ｐＨ９．０
ＮａＨＣＯ3 中２００倍モル過剰使用して、そのエス
テルで標識した。粗生成物はポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製した。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18および
ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10ビーズは前例の記載と同じであっ
た。
【０４６６】標的についての標準曲線は、それを、４ｇ
／ｌウシ血清アルブミンおよび１０ｍｇ／ｍｌウシ胸腺
ＤＮＡを担体として含有する５０ｍＭ ＮａＨ2 Ｐ
Ｏ4 ，６００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５中に系列希釈
して作成した。その一部（５μｌ）を、１２×７５ポリ
プロピレン試験管中、同一緩衝液５μｌに取った４．８
ピコモルのフルオレセイン標識プローブに添加した。混
合物を覆って、７２℃に１０分間加熱して、完全なハイ
ブリダイゼーションを保証した。４ｇ／ｌウシ血清アル
ブミン含有５０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，６００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，ｐＨ７．５の５０μｌ中に約１０10のドナー
（センシタイザー）（ＡｂF −ＰＢ／ｎＣ10）を加え、
ついで同一の緩衝液５０μｌ中２．５×１０11アクセプ
ター（Ａｖｉｄｉｎ−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）ビーズを添加
した。旋回振盪機上、室温で３０分間振盪したのち、各
チューブを前例に記載した６５０ｎｍフィルター付きハ
ロゲンランプを用いて１分間照射した。Ｔｕｒｎｅｒル
ミノメーターを用いて２０秒間、光の発生を測定した。
得られた標準曲線は図８に示す。
【０４６７】例 ６ ビオチン化プローブおよびフルオレセイン化 プローブに結合する合成標的の検出 ビオチン化プローブの製造 脱塩した５′−アミノ−修飾オリゴヌクレオチド（３０
マー） ５′−ＵＡＡ−ＴＡＣ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＴＴＧ−ＣＣ
Ｔ−ＴＣＡ−ＣＧＣ−ＴＣＧ−ＡＡＡ−３′ ５０ナノモルを０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ９．０に溶解した。この緩衝溶液に、スクシンイミジ
ル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（Ｐｉｅｒ
ｃｅ ＃２１３３６−Ｇ）のＤＭＦ中１２０ｍｇ／ｍｌ
溶液１２５μｌを加えた。混合物を一夜インキュベート
し、製造用電気泳動〔ＴＢＥ（Ｔｒｉｓホウ酸ＥＤＴ
Ａ）緩衝液：８９ｍＭ ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン）塩基，８９ｍＭホウ酸，２．５
ｍＭ Ｎａ2 ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸），ｐ
Ｈ８．３〕を用い、４００ボルトで４時間精製した。ビ
オチン化オリゴヌクレオチドをゲルから切り出し、３ｍ
ｌの０．１Ｍ ＮＨ4 ＣＯ3 により３７℃で一夜溶出し
た。この物質を再びＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｃ−１８カラム，
Ｗａｔｅｒｓ ＃５１９１０）上で精製し、真空乾燥
し、二重蒸留水中に懸濁した。ビオチン化プローブの収
量は３４．８ナノモル（５８％）であった。
【０４６８】フルオレセイン化プローブの製造 中央のシトシン（位置１４）アミノ修飾オリゴヌクレオ
チド（３０マー） ５′−ＣＴＧ−ＣＣＧ−ＧＴＧ−ＣＧＣ−ＣＡＴ−ＧＵ
Ｔ−ＣＧＣ−ＣＣＧ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−３′ ５０ナノモルの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 緩衝液、ｐＨ
９．６（１９０μｌ）およびアセトニトリル（１２０μ
ｌ）の混合物中溶液を調製した。５／６カルボキシフル
オレセインスクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃０１１１２）のＤＭＦ中０．１
Ｍ溶液２００μｌを上記緩衝液に加えた。混合物を一夜
室温でインキュベートした。以後の工程はビオチン化プ
ローブについて上述した工程と同じである。フルオレセ
イン化プローブは４１％の収率で得られた。
【０４６９】アッセイ操作 アッセイ緩衝液 ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン〕，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ
８．３，５ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸，０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
および２５μｇ／ｍｌウシ胸腺ＤＮＡ含有 フルオレセイン化プローブ（１．５ピコモル）およびビ
オチン化プローブ（１．２ピコモル）を含有するアッセ
イ緩衝液４０ｍｌを、アッセイ緩衝液中に系列希釈した
合成標的ＤＮＡ １０μｌに添加した。混合物を５５℃
で５分間ハイブリダイズした。ビーズ（それぞれ５０μ
ｌのアッセイ緩衝液中２０μｇのアビジンビーズおよび
３０μｇの抗フルオレセインビーズ）を添加した。ビー
ズを含有する溶液を５５℃で１５分間インキュベートし
た。
【０４７０】アビジンビーズは、０．１７５μカルボキ
シル化ポリスチレンビーズにベンザルアクリダンを負荷
して製造し、ＥＤＡＣ〔１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド，Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃Ｅ−６３８３）法によってア
ビジンを付加させた。
【０４７１】ベンザルアクリダンは、無水テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）中１０−ジメトキシホスフィニル−９
−メチルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈ Ｃｈｅｍ．１１
４，３，１９８８）に−７８℃（アセトン／ドライアイ
ス浴）においてアルゴン気相下、ヘキサン中１．６Ｍ
ｎ−ブチルリチウム溶液０．４１３ｍｌを添加して製造
した。ｔ−ブチルリチウム溶液を添加し、ｔ−ブチルリ
チウムの添加２０分後にＴＨＦ中上記アミドの溶液を加
えた。反応溶液を一夜放置して、温度を室温に上昇させ
た。ついで、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸
エチル／ヘキサン）で単離した。単離された生成物はマ
ススペクトル分析およびＮＭＲによって分析し、暗所に
保存した。
【０４７２】抗フルオレセインビーズは、０．０４μポ
リスチレンカルボキシル化ビーズにテトラ−ｎ−デシル
−Ａｌ−フタロシアニン（Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ，ロット番号ＧＲ１１−８２）を負荷して製造
し、ビーズにＥＤＡＣ法を用いて抗フルオレセイン抗体
を付加させた。
【０４７３】シグナルは、ビーズを含有する溶液を６５
０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプで
６０秒間照射して読み取った。ルミネッセンスは２０秒
間測定した。結果は表１にまとめ、図９に示す。
【０４７４】例 ７ ビオチン化増幅生成物の検出 ビオチン化配列のＰＣＲによる製造 標的：大腸菌ゲノムＤＮＡ プライマー：５′−ビオチン化２４マー ５′−ＵＣＡ−ＴＧＧ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＴＣＡ−ＧＧ
Ｔ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−３′ および非ビオチン化１８マー ５′−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＣＧＣ−ＧＧＧ−ＣＴＧ−ＴＴ
Ｇ−３′ 各１００ｎＭ 循環条件： 単一サイクル： ９４℃：３分 ５９℃：１分 ７２℃：１．５分 ついで３５サイクル： ９４℃：１分 ５９℃：１．５分 ７２℃：２分
【０４７５】フルオレセイン化プローブを用いる検出 アッセイ緩衝液中１．５ピコモルのフルオレセイン化プ
ローブ１０μｌを例６に記載の操作と同様にして調製
し、２０μｌのＰＣＲ生成物に、様々な初期標的濃度に
おいて添加した。混合物を９５℃で５分間変性し、つい
で５５℃で５分間ハイブリダイズさせた。ビーズ（５０
μｌのアッセイ緩衝液中、２０μｇのベンザルアクリダ
ンおよび３０μｇのＡｌ−フタロシアニンビーズ）を添
加した。ビーズを含有する溶液を５５℃で１５分間イン
キュベートした。シグナルは例６に記載の操作後に読み
取った。結果は表２にまとめる。
【０４７６】例 ８ 総トリヨードサイロニンのアッセイ Ｉ．ビーズの製造 原料 １７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇ
ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ エチレングリコール、エトキシエタノール、ベンジルア
ルコール、クロロフィル−ａ：Ａｌｄｒｉｃｈ ユーロピウム（ＩＩＩ）テオニルトリフルオロアセトネ
ート（ＥｕＴＴＡ）：Ｋｏｄａｋ オリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）：Ａｌｄ
ｒｉｃｈ ジオキセン〔１−（４−ジメチルアミノフェニル）−６
−フェニル１，４−ジオキセン〕：Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉ
ｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．
Ａ．Ｂｕｒｎｓ ＆ Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃ
ｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０，３５−４４
（１９７９）に記載された操作を改良して製造した。
【０４７７】操作 １．クロロフィル−ａセンシタイザービーズ ベンジルアルコール中クロロフィル−ａ溶液（１．０ｍ
ｌ，０．６ｍＭ）を１０５℃で８．０ｍｌのベンジルア
ルコールに加えた。１７５ｎｍのサイズのカルボキシレ
ート修飾ラテックスの水懸濁液（１０％，１．０ｍｌ）
をベンジルアルコール溶液に添加した。この混合物を１
０５℃で５分間攪拌し、室温に冷却した。エタノール
（１０．０ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレ
ットを１：１エタノール−水混合物（１０．０ｍｌ）に
再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再懸濁および遠
心分離操作を水（１０．０ｍｌ）で反復し、ペレットを
水（１．８ｍｌ）に再懸濁した。
【０４７８】性質 Ａ．染料濃度：上記ビーズ懸濁液１０μｌをジオキサン
（９９０μｌ）に添加して調製した溶液は、６６０ｎｍ
に０．１１の吸収を有することが明らかにされた。これ
はビーズ１ｇ中２．６マイクロモルのクロロフィル−ａ
に相当する。
【０４７９】一重項酸素の発生：２ｍｌのリン酸塩緩衝
液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ含
有）中、クロロフィル−ａビーズ（２００μｇ）、２×
１０-4モルのアントラセン９，１０−ジプロピオン酸
（ＡＤＰＡ）の混合物を、６４５ｎｍカットオフフィル
ターを付したタングステン−ハロゲンランプで２０分間
照射した。ビーズを濾過して除き、酸素化生成物の濃度
を４００ｎｍにおいて分光測定法により測定した。速度
は１分あたり酸素化生成物３．０ナノモルであった。同
一の条件下、可溶性センシタイザー、アルミニウムフタ
ロシアニンテトラスルホン酸アルミニウムは同量の酸素
化生成物を生成した（ビーズ中のセンシタイザーの量は
２００・１０-6・２．６・１０-6＝５２０ピコモルであ
った。
【０４８０】２．クロロフィル−ａ／テトラブチルスク
アレートセンシタイザービーズ カルボキシル化ラテックスビーズ（サイズ１７５ｎｍ、
水中１０％固体、３０．０ｍｌ）を遠心分離した。上清
を捨て、ペレットはエチレングリコール（６０．０ｍ
ｌ）に再懸濁した。懸濁液を１００℃に加熱した。クロ
ロフィル−ａ１．６７ｍＭ、テトラブチルスクアレート
〔１，３−ビス（４−ジブチルアミノフェニル）スクア
レート〕３．３３ｍＭのベンジルアルコール溶液９．０
ｍｌを徐々に、３分を要して懸濁液に添加した。加熱を
７分間継続したのち、懸濁液を水浴中で室温に冷却し
た。ベンジルアルコール懸濁液を冷エタノール（１２０
ｍｌ）に加えた。混合物を遠心分離し、上清は捨てた。
ペレットを水中５０％エタノールに再懸濁し、懸濁液を
遠心分離した。同じ再懸濁、遠心分離操作を水中５０％
エタノール（３０ｍｌ）を用いて反復した。
【０４８１】性質 Ａ．染料濃度：ビーズ中のテトラブチルスクアレートの
濃度は、クロロフィル−ａビーズについて上述したのと
同様にして分光測光法で測定した。ビーズ中４４μＭ染
料が認められた。
【０４８２】Ｂ．一重項酸素の生成：エタノール中ＡＤ
ＰＡの５ｍＭ溶液２５μｌを、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．
０（２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）中ビーズ（１
００μｇ）の懸濁液に添加した。混合物を上述のよう
に、６１０ｎｍ長通過フィルターを用いて照射した。一
重項酸素の生成速度はＡＤＰＡの吸収（４００ｎｍ）の
低下速度から計算した。このビーズは７・１０-2マイク
ロモル／分の一重項酸素を生成することが明らかにされ
た。
【０４８３】３．ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯア
クセプタービーズ １７５ｎｍカルボキシル化ラテックスビーズ（水中１０
％懸濁液）２０ｍｌをエトキシエタノール（２０．０ｍ
ｌ）に添加した。混合物を９０℃に加熱した。１０ｍＭ
ジオキセン、２０ｍＭ ＥｕＴＴＡおよび６０ｍＭ Ｔ
ＯＰＯのエトキシエタノール溶液２０ｍｌを、混合物に
添加した。加熱を７分間、９７℃までの温度で継続し
た。混合物を室温に冷却した。エタノール（４０．０ｍ
ｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを８０％
エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。再懸濁
および遠心分離の操作を１０％エタノール（３６ｍｌ）
を用いて反復した。
【０４８４】性質 Ａ．染料濃度：ビーズ中のＥｕＴＴＡ濃度は上述のよう
に分光測光法で測定し、０．０７Ｍであることが明らか
にされた。ジオキセンの濃度はＥｕＴＴＡの存在下には
測定できないので、ジオキセンのみを負荷したビーズ中
で同じ条件下に測定した。濃度は０．０１６Ｍであるこ
とが明らかにされた。
【０４８５】Ｂ．シグナル生成：リン酸緩衝液（０．５
ｍｌ，２０ｍＭリン酸塩，５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％
Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．０）中ビーズ（２５μｇ）
の懸濁液を、同じ緩衝液中２μＭアルミニウムフタロシ
アニンテトラスルホネートの溶液と混合した。混合物を
６１０ｎｍ長通過フィルターを付した１２５Ｗタングス
テン−ハロゲンランプで１分間照射した。照射後、混合
物をＴｕｒｎｅｒＴＤ−２０ｅ ルミノメーター中に置
き、ルミネッセンスを２０秒間測定した。強度は３２７
ＲＬＵ（相対光量単位）／秒であった。放射光の波長
は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ６５０−４０走査スペク
トロフルオリメーターを用いて測定した。主要な放射ピ
ークは６１５ｎｍ付近に集中した。
【０４８６】ＩＩ．アッセイ操作 ４０ｎｍビーズへの抗体のＥＤＡＣ／ＮＨＳカップリン
グ ７３．６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
＃２４５１０Ｇ）を、水中４ｍｇ／ｍｌカルボキシレー
ト修飾４０ｎｍポリスチレンビーズ（クロロフィル−ａ
およびテトラブチルスクアレートで染色）の懸濁液６ｍ
ｌに溶解した。０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 １３６μｌ
を加えた。ｐＨを５．２に調整した。さらに１３６μｌ
の水を添加した。１３０．４ｍｇのＥＤＣＡ〔１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．＃Ｅ
−６３８３〕を４５４μｌの水に取り、攪拌したビーズ
懸濁液に徐々に加えた。この懸濁液を室温で２０分間イ
ンキュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−
６００ローターを用い１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０
分間遠心分離した。上清は捨てた。ついで、ビーズを
１．２ｍｌの５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８中に
再懸濁し、懸濁液を超音波処理してビーズを再度分散さ
せた。１．７ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ（モノクローナル抗−
フルオレセイン）＋６．７ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＋１７ｍＭ
ｂｏｒａｘを含有する溶液（ｐＨ９．２）４．８ｍｌ
を攪拌しながらビーズを徐々に加え、一夜４℃で穏やか
に混合した。８００μｌの２Ｍグリシン、ついで０．１
Ｍ ｂｏｒａｘ中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ２．８ｍｌを
ビーズ懸濁液に加えた。懸濁液を超音波処理し、４℃で
３時間穏やかに混合した。ビーズを１５，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離した。上清は捨てた。ビーズを３ｍ
ｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，ｐＨ７．６に再懸濁し、懸濁液を超音波処理した。
遠心分離、再懸濁および超音波処理工程を計３回反復し
た。３回目の遠心分離後、ビーズを２．４ｍｌの５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
６に再懸濁した。得られた懸濁液を超音波処理して、４
℃で保存した。
【０４８７】１７５ｎｍビーズへのアビジン−ＤのＥＤ
ＡＣ／ＮＨＳカップリング ４．４ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、水中２５ｍｇ／ｍｌの
カルボキシレート修飾１７５ｎｍポリスチレンビーズ
（ジオキセン／ＢｕＴＴＡ／ＴＯＰＯで染色）２５ｍｇ
／ｍｌの懸濁液０．４ｍｌに溶解した。０．０１６０ｍ
ｌの０．２５ＭＮａＨ2 ＰＯ4 を添加した。０．０３０
ｍｌの水に溶解した８ｍｇのＥＤＡＣを旋回させたビー
ズ懸濁液に徐々に加えた。懸濁液を室温で２０分間イン
キュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６
００ローターを用い、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０
分間遠心分離した。上清は捨てた。
【０４８８】ビーズを０．６ｍｌの０．００５Ｍリン酸
ナトリウム、ｐＨ５．８に再懸濁した。懸濁液を超音波
処理してビーズを再び懸濁させた。ビーズを再び、１．
３３ｍｇ／ｍｌアビジン−Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）＋１７ｍ
Ｍ ｂｏｒａｘ含有ｐＨ９．２の溶液３ｍｌに攪拌しな
がら、徐々に添加し、一夜４℃で穏やかに混合した。Ｄ
ＭＦ中１Ｍ無水コハク酸０．００４ｍｌを加えた。懸濁
液を、穏やかに混合しながら４℃で１時間インキュベー
トした。１０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．０中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ０．４ｍｌ
を添加した。懸濁液を４℃で３時間穏やかに混合した。
ビーズを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
上清を捨てた。ビーズを、３ｍｌの５０ｍＭリン酸ナト
リウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁し
た。懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁および
超音波処理工程を計３回反復した。３回目の遠心分離
後、ビーズを２．２５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム
＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。懸
濁液を超音波処理して、４℃で保存した。
【０４８９】総Ｔ3 アッセイ アッセイ緩衝液 ：０．０７５Ｍ バルビタール，０．２
Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ ＢＳＡ，１．２５％マウスＩ
ｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（分子量５０
０，０００），１．０ｍｇ／ｍｌデキストランＴ−５０
０，１０μｇ／ｍｌ凝集ＩｇＧ
【０４９０】ビーズ アクセプタービーズ ：アビジン−ＥＤＡＣ，１７５ｎ
ｍ，ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯを負荷 センシタイザービーズ：抗フルオレセイン−ＥＤＡＣ，
４０ｎｍ，クロロフィル−ａ／スクアレートを負荷
【０４９１】アッセイプロトコール アッセイ緩衝液中８−アニリノ−１−ナフタレンスルホ
ン酸アンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ，Ａ−３１２５）溶液
（０．７５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌをＴ3 標準溶液または
サンプル５０μｌに加えた。アッセイ緩衝液１００μｌ
を添加した。アッセイ緩衝液中ビオチン化抗−Ｔ3 （７
０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。アッセイ緩衝液
（５０μｌ）中、トレーサー、Ｔ3 −ＬＣ21−Ｆ１
【化４０】 Ｔ3 −ＬＣ21−Ｆ１ （１．８ｎｇ／ｍｌ）を添加した。混合物を３７℃で１
５分間インキュベートした。センシタイザービーズ（５
０μｇ）およびアクセプタービーズ（６．２５μｇ）の
アッセイ緩衝液中懸濁液５００μｌを添加し、混合物を
３７℃で１５分間インキュベートした。「停止溶液」
（５０μｌ）（１０μＭフルオレセイン，０．５ｍＭビ
オチン）を添加した。シグナルは、６１０ｎｍカットオ
フフィルター付きハロゲンランプで、照射１分、測定２
０秒で読み取った。
【０４９２】結果 結果は図１０にまとめる。ルミネッセンスシグナルはＴ
3 濃度の関数としてプロットした。シグナルの変化は
８．５ｎｇ／ｍｌ Ｔ3 で９４％であった。０．５ｎｇ
／ｍｌにおけるシグナルの変化は３８％であった。
【０４９３】以上、本発明を、明快にし理解しやすくす
るために、例示および実施例によって詳細に説明した
が、ある種の改変または修飾は特許請求の範囲内に包含
されることは明白である。
【表４】 Ｂｉｏ−プローブおよびＦｌ−プローブに結合する 標的蛋白質の検出 標的（ピコモル／１５０μｌ） ＲＬＵ 標的濃度 （ｐＭ） ──────────────────────────────────── １． １．０７ １６７７ ７４９０ ２． ０．５４ １６７１ ３７４０ ３． ０．２７ １４０７ １９３０ ４． ０．１３ ９７９ ９３０ ５． ０．０６７ ６８８ ４６１ ６． ０．０３４ ３９９ ２３０ ７． ０．０１７ １９２ １２０ ８． ０．００８ ９５ ５７ ９． ０．００４ ５８ ３０ １０． ０．００２ ３０ １５ １１． ０ １７ １２． ０ １６
【表５】 ビオチン化増幅生成物の検出 生 成 物 ＲＬＵ ─────────────────────────── １． ２０％（１０8 ）a ７９ ２． ２０％（１０6 ）a ４５ ３． ２０％（１０4 ）a ２５ ４． ２０％（０）a ９ a 増幅反応容量の２０％、（ ）内は反応混合物中 の初期の標的分子数
【図面の簡単な説明】
【図１】ビタミンＢ12の検定結果のグラフによる描写で
ある。
【図２】ジゴキシンの検定結果のグラフによる描写であ
る。
【図３】本発明によるＨＣＧの検定結果のグラフによる
描写である。
【図４】本発明による試験結果のグラフによる描写であ
る。
【図５】本発明によるＴＳＨに対する検定結果のグラフ
による描写である。
【図６】図５のグラフによる描写の一部である。
【図７】本発明によるＨＣＧに対する別の検定結果のグ
ラフによる描写である。
【図８】ＤＮＡハイブリッド検出検定の結果のグラフに
よる描写である。
【図９】合成標的の検出結果のグラフによる描写であ
る。
【図１０】全トリヨードチロニン検定のグラフによる描
写である。
フロントページの続き (72)発明者 フライアー キラコシアン アメリカ合衆国カリフォルニア州サン ジ ョセ，ウイリアムズ ロード 4851 (72)発明者 ジョン エス．ピーズ アメリカ合衆国カリフォルニア州ロス ア ルトス，ロシタ アベニュー 699 (72)発明者 ユリ ダニロフ アメリカ合衆国カリフォルニア州マウント ビュー，ロイド ウエイ 1522 (72)発明者 ダニエル ビー．ワグナー アメリカ合衆国カリフォルニア州サニイベ イル，ティコンデロガ 951

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被検物質の含有が疑われるメジウムを処
    理して本質的に準安定な種を形成させ、この種はメジウ
    ム中に拡散可能で上記被検物質の存在によってその種に
    接する近位に移動するメジウム中の物質と優先的に反応
    することが可能であり、この種がメジウム中の被検物質
    の量を指示する上記物質との反応を生じたかどうかを測
    定することからなる被検物質の分析方法
  2. 【請求項２】 被検物質の含有が疑われるメジウムを被
    検物質が存在すれば特異的結合対（ｓｂｐ）複合体を形
    成するように処理し、この複合体が形成されたかどうか
    を測定する工程からなる液体メジウム中の被検物質のア
    ッセイにおいて、フォトセンシタイザーの活性化に応じ
    て化学ルミネッセンス化合物から放射される光量がメジ
    ウム中の被検物質量に相関する（１）特異的結合対（ｓ
    ｂｐ）のメンバーに会合したフォトセンシタイザーと
    （２）ｓｂｐメンバーに会合した化学ルミネッセンス化
    合物とを上記メジウムに混合することからなる改良方法
  3. 【請求項３】 被検物質の含有が疑われるメジウムを、
    被検物質が存在すればフォトセンシタイザーと化学ルミ
    ネッセンス化合物が接する近位に移動してそのフォトセ
    ンシタイザーによって生成される一重項酸素がその化学
    ルミネッセンス化合物を活性化しついで光を発生するよ
    うな条件下に処理し、上記メジウム中の被検物質量に相
    関するその光量を測定することからなる被検物質の定量
    方法
  4. 【請求項４】 化学ルミネッセンス化合物はオレフィン
    基およびそのオレフィン基と共役する１個または２個以
    上の電子供与置換基を含有する「請求項３」記載の方法
  5. 【請求項５】 化学ルミネッセンス化合物は９−アルキ
    リデン−Ｎ−メチルアクリダン類、エノールエーテル
    類、およびエナミン類から選択される「請求項３」記載
    の方法
  6. 【請求項６】 フォトセンシタイザーまたは上記化学ル
    ミネッセンス化合物の少なくとも一方は、懸濁可能な粒
    子とその表面で会合している「請求項３」記載の方法
  7. 【請求項７】 表面も接する近位に同様に移動し、表面
    は懸濁可能な粒子上に存在し、この粒子はラテックス粒
    子、脂質二重層、油滴、シリカ粒子、金属ゾル、および
    染料微結晶からなる群より選ばれる「請求項３」記載の
    方法
  8. 【請求項８】 フォトセンシタイザーはメチレンブル
    ー、ローズベンガル、ポルフィリン類およびフタロシア
    ニン類からなる群より選ばれる染料である「請求項３」
    記載の方法
  9. 【請求項９】 上記フォトセンシタイザーおよび上記化
    学ルミネッセンス化合物はそれぞれ、それが会合する特
    異的結合対（ｓｂｐ）を有し、このｓｂｐメンバーは独
    立に、リガンド、受容体、ポリヌクレオチド、およびポ
    リヌクレオチド結合物質からなる群より選ばれる「請求
    項３」記載の方法
  10. 【請求項１０】 （ａ）（１）被検物質の含有が疑われ
    るメジウム、（２）励起状態において酸素を一重項酸素
    に活性化できるフォトセンシタイザーであって、特異的
    結合対（ｓｂｐ）のメンバーに会合したフォトセンシタ
    イザー、および（３）化学ルミネッセンス化合物からな
    る特定の懸濁可能な粒子であって、それに予めｓｂｐメ
    ンバーが結合されている粒子、の混合物を準備し、
    （ｂ）この混合物を光で処理してフォトセンシタイザー
    を励起させ、（ｃ）その混合物から放射される、上記メ
    ジウム中の被検物質量に相関するルミネッセンス量につ
    いて上記混合物を調べることからなる被検物質の定量方
    法
  11. 【請求項１１】 （ａ）（１）被検物質の含有が疑われ
    るメジウム、（２）第一のｓｂｐメンバーに会合したフ
    ォトセンシタイザー、および第二のｓｂｐメンバーに会
    合した化学ルミネッセンス化合物からなる混合物を準備
    し、（ｂ）この混合物を光で処理してフォトセンシタイ
    ザーを励起させ、（ｃ）上記メジウムから放射され、上
    記メジウム中の被検物質量に相関するルミネッセンス量
    について上記混合物を調べることからなる被検物質の定
    量方法
  12. 【請求項１２】 （ａ）（１）被検物質の含有が疑われ
    るサンプル、（２）化学ルミネッセンス化合物が導入さ
    れた第一の懸濁可能な粒子であって、予めｓｂｐメンバ
    ーが結合されている粒子、（３）励起状態において酸素
    を一重項酸素に活性化できるフォトセンシタイザーが導
    入された第二の懸濁可能な粒子であって、予め特異的結
    合対（ｓｂｐ）のメンバーが結合されている粒子、をメ
    ジウム中に混合し、（ｂ）上記メジウムを照射して一重
    項酸素を生成させ、（ｃ）上記メジウムから放射され、
    上記メジウム中の被検物質量に相関するルミネッセンス
    の量を測定することからなる被検物質の定量方法
  13. 【請求項１３】 第一のｓｂｐメンバーに会合した化学
    ルミネッセンス化合物、および第二のｓｂｐメンバーに
    会合し励起状態において酸素を一重項酸素に活性化でき
    るフォトセンシタイザーのパッケージされた組み合わせ
    であるキット
  14. 【請求項１４】 （１）化学ルミネッセンス化合物を包
    含する懸濁可能な粒子であって、予めｓｂｐメンバーが
    結合されている粒子からなる組成物、および（２）上記
    組成物には含まれない、励起状態において酸素を一重項
    酸素に活性化できるフォトセンシタイザーのパッケージ
    された組み合わせである「請求項１３」記載のキット
  15. 【請求項１５】 フォトセンシタイザーを包含する第二
    の懸濁可能な粒子であって、予めｓｂｐメンバーが結合
    されている粒子からなる組成物を含む「請求項１４」記
    載のキット
  16. 【請求項１６】 （１）被検物質の含有が疑われるメジ
    ウム、（２）光化学的に活性化可能な化学ルミネッセン
    ス化合物（ＰＡＣＣ）と会合し、上記被検物質の存在に
    相関して上記被検物質または第二のｓｂｐメンバーと複
    合体を形成できる第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバ
    ーからなる標識試薬の混合物を準備し、上記ＰＡＣＣを
    光化学的に活性化し、上記ＰＡＣＣによって生成され、
    上記メジウム中の被検物質量に相関するルミネッセンス
    量を検出することからなる被検物質の分析方法
  17. 【請求項１７】 光化学的活性化は上記ＰＡＣＣと一重
    項酸素の反応による「請求項１６」記載の方法
  18. 【請求項１８】 一重項酸素はフォトセンシタイザーの
    活性化によって生成される「請求項１７」記載の方法
  19. 【請求項１９】 被検物質と第一のｓｂｐメンバーは、
    リガンド、受容体、およびポリヌクレオチドからなる群
    よりそれぞれ独立に選択される「請求項１６」記載の方
    法
  20. 【請求項２０】 ＰＡＣＣはオレフィン基およびそのオ
    レフィン基と共役する１個または２個以上の電子供与置
    換基を含有する「請求項１６」記載の方法
  21. 【請求項２１】 ＰＡＣＣは９−アルキリデンアクリダ
    ン類、エノールエーテル類、９−アルキリデンキサンタ
    ン類およびエナミン類から選択される「請求項１６」記
    載の方法
  22. 【請求項２２】 （１）被検物質の含有が疑われるメジ
    ウム、（２）光化学的に活性化が可能な化学ルミネッセ
    ンス化合物（ＰＡＣＣ）に結合した特異的結合対（ｓｂ
    ｐ）メンバーからなる標識試薬を、上記メジウム中の被
    検物質量に相関して上記標識を包含するｓｂｐメンバー
    複合体が形成される条件下にアッセイメジウム中に混合
    し、上記アッセイメジウムに光を照射してＰＡＣＣを活
    性化し、上記メジウム中の被検物質量に相関するシグナ
    ルの存在または強度についてアッセイメジウムを調べる
    ことからなる被検物質の分析方法
  23. 【請求項２３】 ＰＡＣＣからのエネルギーによって活
    性化されるエネルギーアクセプターを包含させる「請求
    項２２」記載の方法
  24. 【請求項２４】 （１）被検物質の含有が疑われるメジ
    ウム、（２）一重項酸素との反応で化学ルミネッセンス
    を発生することができる化合物（「上記化合物」）に結
    合した特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる標識試
    薬、ならびに（３）第二のｓｂｐメンバーからなる不溶
    化試薬を、上記標識試薬と上記不溶化試薬を包含するｓ
    ｂｐメンバー複合体が上記メジウム中の被検物質の存在
    に相関して形成される条件下、同時にまたは全部もしく
    は一部を順次、アッセイメジウム中に混合し、上記アッ
    セイメジウムおよび上記不溶化試薬を分離し、上記アッ
    セイメジウム中または上記不溶化試薬上の上記化合物を
    光で活性化し、上記メジウムまたは上記試薬を上記メジ
    ウム中の被検物質量に相関するシグナルの存在または強
    度について調べることからなる被検物質の分析方法
  25. 【請求項２５】 （１）被検物質の含有が疑われるメジ
    ウム、（２）一重項酸素との反応で化学ルミネッセンス
    を発生することができる化合物（「上記化合物」）に結
    合した第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる
    標識試薬、（３）一重項酸素発生物質、および（４）第
    二のｓｂｐメンバーに結合したまたは結合できる螢光エ
    ネルギーアクセプターからなる試薬を、上記標識試薬と
    上記エネルギーアクセプターを包含するｓｂｐメンバー
    複合体が上記メジウム中の被検物質の存在に相関して形
    成され、上記化合物からのエネルギーが上記エネルギー
    アクセプターを活性化できる条件下、同時にまたは全部
    もしくは一部を順次、アッセイメジウム中に混合し、上
    記一重項酸素発生物質を活性化し、上記メジウムを上記
    メジウム中の被検物質量に相関するシグナルの存在また
    は強度について調べることからなる被検物質の分析方法
  26. 【請求項２６】 特異的結合対のメンバーと会合した光
    化学的に活性化が可能な化学ルミネッセンス化合物（Ｐ
    ＡＣＣ）からなる組成物
  27. 【請求項２７】 （１）特異的結合対（ｓｂｐ）メンバ
    ーが結合した光化学的に活性化できる化学ルミネッセン
    ス化合物（ＰＡＣＣ）からなる組成物、および（２）上
    記組成物には含まれないフォトセンシタイザーのパッケ
    ージされた組み合わせであるキット
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