JP2002518405A - ビタミンｂ１２誘導体及びそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、ポリマー、ナノ粒子又は治療剤、タンパク質若しくはペプチドへの結合に好適なビタミンＢ₁₂（ＶＢ₁₂）誘導体の製造方法を提供する。 【解決手段】本発明の製造方法は、ＶＢ₁₂の５'ＯＨ基又はその類似体を活性カルボニル求電子剤と反応させることと、続いて前記ＶＢ₁₂誘導体を得ることを含む。また、本発明は、新規なＶＢ₁₂誘導体、本発明の方法により調製されるＶＢ₁₂誘導体、及びポリマー複合体又はナノ粒子の調製におけるその利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的には、ビタミンＢ₁₂（ＶＢ₁₂）又はその類似体と結合させた治
療物質を含む複合体を投与することにより治療物質を供給するためのビタミンＢ ₁₂ 担体分子の新規な誘導体に関する。また、本発明は、一般的にＶＢ₁₂誘導体の
新規な製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＶＢ₁₂の５’ＯＨ基を求電
子剤と反応させることによるこれらのＶＢ₁₂誘導体の製造に関する。

【０００２】

【背景技術】

ペプチド用経口供給機構が、本発明者の一人により着手された最近の研究に基づ
く国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８６／０２９９（ＷＯ８７／０２２５１）に記載されて
いる。この機構では、少なくとも一種の担体分子であって、これに活性物質を結
合させて前記活性物質を腸内腔から循環系に輸送させるようにしたものを利用し
ている。ＶＢ₁₂及びその類似体は、内因子（ＩＦ）に対するＶＢ₁₂の結合が介在
する天然ＶＢ₁₂摂取系を使用して活性物質／ＶＢ₁₂複合体を輸送することにより
理想的な担体分子として作用する。リンパドレナージ系又は血清に一旦排出され
たとき、この複合体は、在来活性物質の生物活性を実質的に保持している。

【０００３】 より最近では、ＶＢ₁₂と薬剤、細胞毒及びＭＲＩ剤との共役系が、腫瘍細胞の検
出及び治療に使用されてきた。ビタミンＢ₁₂（コバルアミン、Ｃｂｌ、ＶＢ₁₂）
が正常に細胞摂取されるには、ビタミンは、まず血漿タンパク質トランスコバル
アミンＩＩ（ＴＣＩＩ）に結合しなければならない。ＣｂｌのＴＣＩＩへの結合
に続いて、得られたＴＣＩＩ−Ｃｂｌ複合体は、細胞表面上のレセプターに親和
性良く結合し、レセプター介在エンドサイトーシス（ＲＭＥ）と称されるプロセ
スを介して細胞により吸収される。細胞内部において、Ｃｂｌが酵素により変更
されて２種のコエンザイムが形成されると、これら２種のコエンザイムが次に２
つの必須の代謝経路に使用される。一つの経路には、メチオニンのデノボ（de n
ovo）合成におけるホモシステインのメチル化が含まれ、メチオニンシンターゼ
が触媒として働く。他の経路には、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへ
の再配列を含み、メチルマロニルＣｏＡムターゼが触媒として働く。ヒト及びネ
ズミの白血病細胞の生体外増殖が、ＴＣＩＩとＣｂｌとの両方に依存することが
最近示された（ＭｃＬｅａｎ，Ｇ．Ｒ．、Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｅ．Ｂ．、Ｒｏｔｈ
ｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｃ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ
．及びＺｉｌｔｅｎｅｒ，Ｈ．Ｊ．、１９９７ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ
ｔｒａｎｓｃｏｂａｌａｍｉｎ ＩＩ ｂｌｏｃｋ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏ
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ（白血病細胞のト
ランスコバルアミンＩＩブロック生体外増殖に対する抗体）、Ｂｌｏｏｄ、８９
、２３５−２４２）。何人かの研究者は、今般、放射線像形成と標的癌化学療法
の両方にＣｂｌ共役系を利用することについて鋭意研究した（Ｓｍｅｌｔｚｅｒ
，Ｃ．Ｃ．、Ｐｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ
．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅ
ｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ
（２種の新規なコバルアミン生物共役系の細胞毒性作用）。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ
Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ、ｐｐ２３２−３；Ｃａｎｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、
Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｃｏｂａｌａ
ｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（放射線標識コバルアミン生物共役系の合成
及び取り込み）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２３０−１；Ｐｉｎｓｏｎ
，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ
，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｏｘｏｒｕｂｉ
ｃｉｎ−ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２種のドキソルビ
シン−コバルアミン生物共役系の合成）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２
２８−９）。

【０００４】 ＶＢ₁₂が薬剤を腸上皮細胞層を横切り、循環系に共輸送するためには、薬剤は
、まずＶＢ₁₂分子に共有結合しなければならない。同様に、ＶＢ₁₂により抗腫瘍
剤が腫瘍を攻撃するようにするためには、抗腫瘍剤は、さらにＶＢ₁₂分子に共有
結合しなければならない。このために、ＶＢ₁₂分子自体を、まず変更して共役す
るのに好適な官能基を提供しなければならない。ＶＢ₁₂のカルボン酸誘導体は、
コリン環構造¹のプロピオンイミド側鎖の穏やかな酸加水分解により容易に得ら
れる（図１参照）。この加水分解により、ＶＢ₁₂の「ｂ」、「ｄ」及び「ｅ」モ
ノカルボン酸が形成される。² 次に、単離されたモノカルボン酸誘導体を、工
業用カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロ
ピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ基に直接共役することができる
。これにより、ペプチドがペプチド結合を介してＶＢ₁₂に結合される。^1,3

【０００５】 ペプチドがＶＢ₁₂へ共役する第二方法は、ＶＢ₁₂分子のコリン環のＣｏ原子上へ
の官能基の軸置換によるものである（式１参照）。この方法において、ＶＢ₁₂の
軸ＣＮリガンドを、官能化アルキル鎖で置き換えることができる。次に、この置
換官能基を、通常の化学的方法を用いてペプチド又はタンパク質へ共役させるの
に使用できる。しかしながら、この方法の一つの主要な欠点は、得られた共役系
が感光性Ｃｏ−Ｃ結合を含有することである。したがって、アルキルコバルアミ
ンの溶液を可視光に当てないように注意しなければならない。

【０００６】 Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ⁴による初期の研究では、ヌクレオチドリガンドの
リボース成分の５’ＯＨへのエステル結合を介してＶＢ₁₂に共役することができ
ることが示された。この研究で、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉは、ジオールデヒ
ドラーゼの精製のためのアフィニティリガンドを形成するのに、この化学的性質
を利用することができるどうかを検討した。５’Ｏ−エステル結合を形成するた
めに、著者等は、ＶＢ₁₂と５４倍過剰の無水コハク酸とを、大容量のＤＭＳＯ（
ＶＢ₁₂＝５ｍｇ／ｍｌ）＋大過剰のピリジン（１２８倍ｗ／ｗ）中で反応させた
。その結果、著者等は、形成された結合は、塩基性ｐＨで不安定であるばかりで
なく、酵素を精製するのにも有効でないことを見いだした。Ａｎｎｕｎｚｉａｔ
ｏ等⁵は、リボースの５'ＯＨへの別の結合方法を記載している。これらの研究者
は、ｐ−マレイミドフェニルイソシアネートをＶＢ₁₂とを反応させ、続いて活性
化ＶＢ₁₂分子を使用してチオール化アルカリ性ホスファターゼと反応させる分続
いて、Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等は、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ⁴の研究をＡ
ｎｎｕｎｚｉａｔｏ等⁵の研究、さらにはＲｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等³、⁶の研
究とを組み合わせて、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ及びコンセンサスインターフェロンを
ＶＢ₁₂の５’Ｏ−グルタロイル誘導体へ共役させた。記載によれば、得られた共
役系は、ラットＩＦに予備複合された共役系のラットへの十二指腸内ポンプ投与
後に活性状態となる。Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等により記載されている方法では
、シアノコバルアミン（ＶＢ₁₂−１３５６ＭＷ）５ｍｇをＤＭＳＯ１，０００ｍ
ｌに溶解し、無水グルタル酸（１１６ＭＷ）２００ｍｇをピリジン１６０ｍｌに
添加した。生成物収量は、約６５％であった。これは、ＶＢ₁₂に対して無水グル
タル酸が４６８モル過剰であることを示す。Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ⁴の研
究において、これらの研究者は、シアノコバルアミン２００ｍｇをＤＭＳＯ４０
ｍｌ＋無水コハク酸（１００ＭＷ）８ｇに溶解して使用し、ヒドロキシル基にカ
ップリングさせた。これは、無水物が５４倍モル過剰であることを示しており、
生成物収量は９０％であった。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等³、⁶により記載さ
れている共役方法では、ＶＢ₁₂一塩基酸を酸による７２時間処理により調製し、
続いてＤｏｗｅｘ １Ｘ８及びＤｏｗｅｘ１Ｘ２により精製しており、この場合
の収量は約５％でしかなかった。ＶＢ₁₂一塩基酸をある種のペプチド及びタンパ
ク質に結合するために、カルボキシル基のさらなる誘導化がしばしば必要であっ
た。

【０００７】 Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ⁴並びにＨａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等⁷並びにＡｎｎｕ
ｎｚｉａｔｏ等⁵により記載されている方法とは別に、ＶＢ₁₂の５’ＯＨ基に対
して共有結合を形成する他の方法がある。これらの方法では、一般的にアガロー
スに存在する糖残基を変更することによりアフィニティ樹脂を調製することがで
きる。これらの方法では、オキシラン（１，４ブタン−ジオールジグリシジルエ
ーテル）、ベンゾキノン又はシアヌリッククロリドとの反応を含む。これらの方
法は、ＶＢ₁₂誘導体の合成で試みられたが、収量が低すぎてプロセスを工業化す
るには不適当であったり、試薬の使用量が多すぎて同様に工業化には不適当であ
るものであった。

【０００８】 したがって、本発明の目的は、上記した従来技術の欠点の一つ以上を克服又は少
なくとも軽減することである。特に、本発明の目的は、スペーサ分子との化学結
合にＶＢ₁₂の５'ＯＨ基を利用するＶＢ₁₂担体分子の誘導体の新規な製造方法を
提供することである。本発明の好ましい目的は、製造が容易であり、高収量で得
られ、且つ容易に精製されることができるＶＢ₁₂誘導体を提供することである。

【０００９】 （発明の開示） 驚くべきことに、本発明者等により、ポリマー、ナノ粒子及び薬学的に活性な薬
剤へ共役するのに好適であるＶＢ₁₂誘導体が、ＶＢ₁₂のリボース成分上の５'Ｏ
Ｈ基とカルボニル求電子剤との反応により容易に調製されることが分かった。

【００１０】 本発明の一態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質
若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ₁₂誘導体の製造方法であって、ＶＢ₁₂の
５'ＯＨ基又はその類似体を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体
を形成する工程と、続いて前記中間体を求核性スペーサ分子と反応させて前記Ｖ
Ｂ₁₂誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。

【００１１】 本発明の別の態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパ
ク質若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ₁₂誘導体の製造方法であって、カル
ボン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成
する工程と、続いてＶＢ₁₂の５'ＯＨ基を前記活性中間体と反応させて前記ＶＢ_{1 2} 誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。

【００１２】 また、本発明の方法により調製されるＶＢ₁₂の誘導体も提供される。これらの誘
導体は、理想的には生物適合性ポリマーに結合されるか、ナノ粒子と関連してい
る。これらのポリマー及びナノ粒子を、薬学的に許容される担体及び／又は希釈
剤と混合して被験者への治療投与用医薬組成物を調製できる。

【００１３】 本明細書及び請求の範囲全体を通して、特記のない限りは、用語「含む」及び
「含有する」とは、記載された完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含む
が、他の完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含むことを排除するもので
はない。

【００１４】 （発明を実施するための最良の形態） 図面を参照して、ここで本発明を詳細に説明する。 本発明のＶＢ₁₂誘導体は、ポリマー、ナノ粒子、治療剤、タンパク質及びペプ
チド並びに他のこのような薬学的に活性な薬剤へ共役する又は結合するのに好適
である。これらのＶＢ₁₂誘導体の製造方法により、一般的に高収量で且つ純度が
よい誘導体を得ることができる。

【００１５】 一般的に、これらの誘導体は、ＶＢ₁₂又はその類似体を溶媒、好ましくは好適な
非水性溶媒、例えば、乾燥ＤＭＦ、乾燥ＴＨＦ又は乾燥ＤＭＳＯ等に溶解し、カ
ルボニル求電子剤、好ましくは１，１'−カルボニルジイミダゾール（１〜５モ
ル過剰）との反応によりＶＢ₁₂の５'ＯＨ基を活性化することにより得られる。
５モル過剰以上の量を使用できるが、一般的には必要としない。好ましくは、Ｖ
Ｂ₁₂を、ＤＭＳＯに高濃度で溶解させる。次に、活性化ＶＢ₁₂中間体を、ペプチ
ド又はタンパク質に直接カップリングさせてもよいし、ジアミノ−スペーサ若し
くはアミノ−スペーサー酸又はアミノ−アルキル鎖と反応させて、ミクロ粒子若
しくはナノ粒子の疎水性表面又は脂質若しくはリポソームに挿入させるのに好適
なＶＢ₁₂の疎水性誘導体を形成してもよい。

【００１６】 また、本発明の別法によれば、ＶＢ₁₂の５'ＯＨエステル誘導体の製造にＶＢ₁₂
の５'ＯＨ基を利用する。５'ＯＨエステル誘導体の合成において、まず、カルボ
ン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性求電子中間体を
調製する。次に、ＶＢ₁₂又はその類似体を、求電子中間体との反応に附すること
により、ＶＢ₁₂の５'ＯＨ基が、カルボニル求電子剤を攻撃し、離脱基に取って
代わってＶＢ₁₂誘導体が得られる。好ましくは、ＶＢ₁₂の５'ＯＨエステル誘導
体の調製において、ＶＢ₁₂をアミノ酸スペーサ又は酸脂質に結合させる。これら
の誘導体は、製造が容易であり、且つ血清エステラーゼにより容易に開裂されて
生体内で在来ＶＢ₁₂を再生するスペーサ又は結合をこれらの誘導体から生成する
のが容易であるという更なる利点がある。

【００１７】 本発明者等は、カルボニル求電子剤を利用して、強陽性カルボニル基を、カル
ボニル基に結合した良好な離脱基と組み合わせることにより弱い５'ＯＨ求核剤
の攻撃を可能にした。これらの方法により、強塩基性（強塩基によりＶＢ₁₂が変
性されることがある）を使用して架橋剤をＶＢ₁₂分子に結合させていた従来技術
の問題を克服できる。

【００１８】 好ましい実施態様によれば、前記カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾ
ール、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネート、
カルボニルジピペリジン、１，１'−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール
）、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネート
、より好ましくはカルボニルジイミダゾールから選択される二官能カルボニル求
電子剤である。

【００１９】 また、本発明によれば、式（Ｉ）で表されるＶＢ₁₂誘導体、又はその塩が提供
される： ＶＢ₁₂−５'Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ¹ （Ｉ） （式中、 Ｒ¹は、Ｃ_1-24アルキル、Ｃ_2-24アルケニル、Ｃ_2-24アルキニル、Ｃ_3-8シクロ
アルキル、（Ｃ_3-8シクロアルキル）アルキル、アミノ、−（Ｃ_1-12アルキル）
Ｃ（Ｏ）Ｒ²、−（Ｃ_2-12アルケニル）Ｃ（Ｏ）Ｒ²、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ_1-8ア
ルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ₂又は−ＣＨ（Ｒ³）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴（これらの全ては、
任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキ
シ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールア
ルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換さ
れていてもよい）であり、 Ｒ²は、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ又はＣ_2-6アルケニルオキシで
あり、 Ｒ³は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、 Ｒ⁴は、ヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ、アミノ酸又はペプチドである）。

【００２０】 好ましくは、Ｒ¹が、ヘキシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オ
クタデシル、アミノエチル、アミノブチル、アミノヘキシル、アミノドデカニル
、ｔ−ブチル−Ｐｈｅ、スクシニルヒドラジジル、アジピルヒドラジジル、Ｇｌ
ｙ−ＯＭｅ又はＧｌｙ−ＯＨである。

【００２１】 また、本発明によれば、式（ＩＩ）で表されるＶＢ₁₂誘導体、又はその塩が提
供される： ＶＢ₁₂−５'Ｏ−ＣＯ−Ｒ¹ （ＩＩ） （式中、 Ｒ¹は、Ｃ_1-24アルキル若しくはＣ_2-24アルケニル（任意にアミノ、アミド、
ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニ
ル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリ
ールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）である
か、又は Ｒ¹は、−ＣＨ（Ｒ²）−ＮＨＲ³であり、 Ｒ²は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、 Ｒ³は、水素、アミン保護基、アミノ酸又はペプチドである）。

【００２２】 好ましくは、Ｒ¹はＣ_8-24アルキル、Ｃ_8-24アルケニル又は−ＣＨ（Ｒ²）−ＮＨ
Ｒ³（式中、Ｒ²はグリシンであり且つＲ³はＢｏｃ又は水素であるか、又はＲ²は
フェニルアラニンであり且つＲ³はＢｏｃ又は水素である）である。当業者には
、他のアミノ酸又はタンパク質を使用してＶＢ₁₂分子又はその類似体を誘導化で
きることが明らかであろう。さらに、アミノ酸又はタンパク質が、これらの反応
剤を本発明のカップリング反応に附する前に、ペンダント官能基の保護又は他の
このようなマスキングを必要とする場合があることが明らかであろう。

【００２３】 本発明のＶＢ₁₂誘導体を、当業者には公知であり、且つ特許又は科学文献に公表
されている標準的方法に準じてポリマーに結合させるか、ナノ粒子等と関連させ
てビタミン複合体を調製できる。このような方法は、例えば、欧州特許第０ ２
２０ ０３０号、オーストラリア特許第６６４３６５号、米国特許第５４４９７
２０号及び第５５４８０６４号に記載されている。

【００２４】 ビタミン複合体は、薬剤又は活性物質、特にホルモン、薬剤、プロドラッグ、
酵素、タンパク質、ペプチド、トキシン、免疫抗原又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類
似体を被験者に導出するのに使用される。被験者は、好ましくは脊椎動物宿主、
より好ましくは獣、家畜、農業用動物及びヒトである。

【００２５】 本発明のＶＢ₁₂誘導体から調製されるポリマー又はナノ粒子は、当業者に公知の
標準的配合方法に準じてポリマー又はナノ粒子を薬学的に許容される担体及び／
又は希釈剤と組み合わせることにより、医薬組成物として配合できる。医薬組成
物は、当業者により決定される所望の投与形態を満たすようにいずれかの許容で
きる方法で配合してよい。

【００２６】 本明細書で教示される方法の主要な利点には、ＶＢ₁₂誘導体の収量の増加、及び
ＶＢ₁₂の活性化の間に使用される化学薬品の減少又は活性化される酸の増加によ
るコストの低下などがある。

【００２７】 （実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例には
限定されない。

【００２８】 実施例１：５'ＯＨ−（ヘキシル）−ＶＢ₁₂の調製 材料：ＶＢ₁₂は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。

【００２９】

【化１】

【００３０】 ＶＢ₁₂ ＦＷ １３５５．４ ＣＤＩ ＦＷ １６２．２ ＤＭＳＯ

【００３１】 固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコ
バルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２
ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキシル
アミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続し
た。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し
、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。
混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて
、未変更ＶＢ₁₂を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで
溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕
することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られ
た固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率６０％；融点２１３〜２１５℃（
分解）；Ｃ₇₀Ｈ₁₀₁Ｎ₁₅Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４８２、実
測値１５０５（Ｍ＋２３）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１０５００）。

【００３２】 実施例２：５'ＯＨ−（ドデシル）−ＶＢ₁₂の調製 固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノ
コバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１
２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ドデシ
ルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続
した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出
し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した
。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおい
て、未変更ＶＢ₁₂を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノール
で溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破
砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得ら
れた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率５２％；融点２１５〜２１８℃
（分解）；Ｃ₇₆Ｈ₁₁₃Ｎ₁₅Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５６６、
実測値１５８９（Ｍ＋２３）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１６９００）。

【００３３】 実施例３：５'ＯＨ−（テトラデシル）−ＶＢ₁₂の調製 固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコ
バルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２
ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。テトラデ
シルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継
続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽
出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出し
た。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにお
いて、未変更ＶＢ₁₂を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノー
ルで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波
破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得
られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率４６％；融点２２８〜２３３
℃（分解）；Ｃ₇₈Ｈ₁₁₉Ｎ₁₅Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５９５
、実測値１６１８（Ｍ＋２３）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１３０００）。

【００３４】 実施例４：５'ＯＨ−（ヘキサデシル）−ＶＢ₁₂の調製 固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコ
バルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２
ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキサデ
シルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継
続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽
出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出し
た。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにお
いて、未変更ＶＢ₁₂を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノー
ルで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、アセトン（
５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を濾過し、得られた固形物をアセト
ンで洗浄し、風乾した：収率４８％；融点２２３〜２２７℃（分解）；Ｃ₈₀Ｈ_{12 1} Ｎ₁₅Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６２３、実測値１６４６（Ｍ
＋２３）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝２００００）。

【００３５】 実施例５：５'ＯＨ−（オクタデシル）−ＶＢ₁₂の調製 材料：ＶＢ₁₂は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。

【００３６】

【化２】

【００３７】 ＶＢ₁₂ ＦＷ １３５５．４ ＣＤＩ ＦＷ １６２．２ ＤＭＳＯ

【００３８】 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解さ
せた。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ:４００ｍｇ、３．３当量）を添
加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。反応混合物を、４等分し、オ
クタデシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）５００ｍｇをアセトン、エタノール、ジク
ロロメタン又はクロロホルムに溶解したものに添加した。２時間反応させた後、
反応を、ＴＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより監視して、生成物（５'ＯＨ−（オク
タデシル）−ＶＢ₁₂）の量を求めた。

【００３９】 次に、等容積の水とＤＣＭを添加することにより生成物を未反応ＶＢ₁₂から分離
した後、Ｂｅｃｋｍａｎ高速遠心分離機で遠心分離した（５Ｋ、１０分）。ＤＣ
Ｍ相を除去し、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（イソプロパノ
ール５０％、アンモニア２％、水４８％）により未変更ＶＢ₁₂から分離した後、
凍結乾燥した：収率６６％；融点２２０〜２２３℃（分解）；Ｃ₈₂Ｈ₁₂₅Ｎ₁₅Ｏ_{1 5} ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６５１、実測値１６７４（Ｍ＋２３）⁺ ；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１７５００）。

【００４０】 実施例６：５'ＯＨ−（アミノエチル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１.０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解し
た。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加
し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノエタン（３．３当量）
を、反応混合物に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エ
チル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、５分間
音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を焼結ガ
ラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、イソプロ
パノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いてシリカカラムによるフラッ
シュクロマトグラフィで精製した。次に、得られた生成物を、凍結乾燥した：収
率６３％；融点２０６〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ ３０／ｎ−Ｂ
ｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．２２；Ｃ₆₆Ｈ₉₄Ｎ₁₆Ｏ_{1 5} ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４４１、実測値１４４１（Ｍ）⁺；ＵＶ
（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１９９００）。

【００４１】 実施例７：５'ＯＨ−（アミノブチル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。
固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、
得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノブタン（３．３当量）を一
度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，
２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）
中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物を
アセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（シリカ、イソプロパ
ノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した：収率
７０％；融点２４２〜２４４℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ ３０／ｎ−Ｂｕ
ＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．０８；Ｃ₆₈Ｈ₉₈Ｎ₁₆Ｏ₁₅
ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４６９、実測値１４６９（Ｍ）⁺；ＵＶ
（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１５５００）。

【００４２】 実施例８：５'ＯＨ−（ｔ−ブチル−Ｐｈｅ）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。
固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、
得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。固形ｔ−ブチル−Ｐｈｅ（３．３当
量）を一度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（
１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５
０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた
固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（
シリカ、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、
凍結乾燥した。

【００４３】 実施例９：５'ＯＨ−（アミノヘキシル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解し
た。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加
し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノヘキサン（３．３当量
）を反応混合物に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチ
ル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン
（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得ら
れた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（イソプ
ロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:
収率９８％；融点２３０〜２３３℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ ３０／ｎ−
ＢｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．１１；Ｃ₇₀Ｈ₁₀₂Ｎ₁₆ Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４９７、実測値１４９７（Ｍ）⁺；
ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１７０００）。

【００４４】 実施例１０：５'ＯＨ−（アミノドデカニル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。
固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、
得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、ジアミノドデカン（３．３当量）
を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１
：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０
ｍＬ）に再懸濁し、５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得
られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラ
フィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いたシリカ樹脂
）で精製した後、凍結乾燥した:収率６８％；融点１５６〜１５８℃（分解）；
ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２
）Ｒ_f＝０．２７；Ｃ₇₆Ｈ₁₁₄Ｎ₁₆Ｏ₁₅ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５
８１、実測値１５８１（Ｍ）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝３３０００）。

【００４５】 実施例１１：５'ＯＨ−（スクシニルヒドラジジル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。
固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、
得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形スクシニルジヒドラジド（３
．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸
エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセ
トン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、
得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグ
ラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、
凍結乾燥した:収率６８％；融点２０６〜２０８℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ
３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．３６；
Ｃ₆₈Ｈ₉₆Ｎ₁₈Ｏ₁₇ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５８１、実測値１５８
１（Ｍ）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝１５７００）。

【００４６】 実施例１２：５'ＯＨ−（アジピルヒドラジジル）−ＶＢ₁₂の調製 ＶＢ₁₂（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。
固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、
得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形アジピルジヒドラジド（３．
３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エ
チル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセト
ン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得
られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、シリカカラムフラッシュクロマ
トグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した
後、凍結乾燥した:収率７３％；融点２０８〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒ
ＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ ２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．３
３；Ｃ₇₀Ｈ₁₀₀Ｎ₁₈Ｏ₁₇ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５５５、実測値
１５５５（Ｍ）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε＝２１１００）。

【００４７】 実施例１３：エステル結合ＶＢ₁₂−フェニルアラニンの調製 Ｂｏｃ−フェニルアラニン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニル
ジイミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解
し、得られた溶液をＣＯ₂の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した
。ＶＢ₁₂（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性
エステル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９
ｍｏｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶ
Ｂ₁₂を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除
去した。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と
、ＤＷ２３％と、ＮＨ₄ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．
５×５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生
成物を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加する
ことにより１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈
殿させ、乾燥させた。

【００４８】 実施例１４：エステル結合ＶＢ₁₂−グリシンの調製 Ｂｏｃ−グリシン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニルジイ
ミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、
得られた溶液をＣＯ₂の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した。Ｖ
Ｂ₁₂（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性エス
テル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９ｍｏ
ｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶＢ₁₂ を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除去し
た。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と、Ｄ
Ｗ２３％と、ＮＨ₄ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．５×
５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生成物
を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加すること
により１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈殿さ
せ、乾燥させた。

【００４９】 実施例１５：ＶＢ₁₂−グリシン酸の 調製 シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及び１，１'−カルボニ
ルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、３０℃のジメチルスルホキシド（
１２ｍＬ）に順次添加し、混合物を２０分間攪拌した。ＯＭｅ−Ｇｌｙ（２．７
ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、トリエチルアミン（２００μＬ）を添加し、得
られた混合物を、室温で２４時間攪拌した。混合物を、酢酸エチル（３０ｍＬ）
に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音
波破砕した。混合物を濾過し、固形物を、アセトンで洗浄した。次に、残留物を
０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に溶解し、３０分間攪拌した。次に粗製酸を、Ｄｏｗｅｘ
１Ｘ４樹脂において、２％酢酸で溶出させて精製した：収率９５％；融点２３
９〜２４２℃（分解）；ＴＬＣ（ⁱＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ₂Ｏ
２５／ＮＨ₄ＯＨ ２）Ｒ_f＝０．４１；Ｃ₆₆Ｈ₉₀Ｎ₁₅Ｏ₁₇ＣｏＰのＭＳ（ＥＳ
Ｉ）質量、理論値１４５６、実測値１４５６（Ｍ）⁺；ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λ₃₆₁（ε
＝１９８００）。

【００５０】 実施例１６：種々の５'Ｏ−ＶＢ₁₂誘導体の相対的ＩＦアフィニティの測定試薬 ＩＦ緩衝液：ＢＳＡ（ＶＢ₁₂及びＩＦ欠失）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ−３９０
２）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌで溶解し
た。

【００５１】⁵⁷ ＣｏＶＢ₁₂：⁵⁷Ｃｏストック（５０μｌ）（Ｋｏｄａｋ）を、ストック５０μ
ｌをＩＦ緩衝液２５ｍｌに添加したものに希釈して、１ｎｇ⁵⁷ＣｏＶＢ₁₂／２５
ｍｌ溶液を得た。冷ＶＢ₁₂２５０ｎｇを、熱⁵⁷ＣｏＶＢ₁₂溶液２５ｍｌに添加し
て１０ｎｇ／ｍｌ溶液を得た。

【００５２】 ブタ内因子：ブタＩＦ（シグマ）を、ＩＦ緩衝液に２００単位／ｍｌで溶解し、
必要となるまで５００μｌロット（１００ＩＵアリコット）で凍結させた。

【００５３】 ＢＳＡ塗布チャコール：ＢＳＡ（１％）を、等容積の０．１Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）の５％チャコール溶液に添加し、３０分間穏やかに攪拌した
。

【００５４】手順： ＶＢ₁₂又はＶＢ₁₂誘導体の１０倍順次希釈液を、ＩＦ緩衝液で１ｎｇ／ｍｌま
で調製した。等容積の希釈ＩＦを、各試料に添加し、室温で２０分間インキュベ
ーションした。等容積のＢＳＡ塗布チャコールを、各試料に添加し、混合してか
ら遠心分離した。遠心分離後、上清と各試料のペレットとを分離し、⁵⁷ＣｏＶＢ ₁₂ を、ガンマカウンターでカウントすることにより求めた。データは、未変更Ｖ
Ｂ₁₂と比較したときの⁵⁷ＣｏＶＢ₁₂結合の阻害％として表す。

【００５５】

【表１】

【００５６】 当業者は、ここに記載の本発明は、具体的に記載以外の修正及び変更をおこなう
ことが分かるであろう。また、本発明は、全てのこのような修正及び変更を含む
。また、本発明は、本明細書で個々に又はまとめて言及又は示した工程、特徴、
組成物及び化合物の全て並びに前記工程又は特徴のいずれかの２以上の組み合わ
せのいずれか及び全てを含む。

【００５７】 参考文献 １．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ Ｇ．Ｊ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
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ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｔｏ
ｔｈｉｏｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ(ｐ−マレイミドフェニルイソシアネート：ヒド
ロキシルのチオールへのカップリング用の新規なヘテロ二官能リンカー)． Ｂ
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【図面の簡単な説明】

【図１】薬剤及びペプチドがＶＢ₁₂に共役する可能性のある３つの部位を持
つＶＢ₁₂分子を示す。これらの共役する部位は以下の通りである：ａ）コリン環
のＣｏ原子上の置換を介した軸で共役する；ｂ）ｅプロピアンイミド側鎖の酸修
飾により直接共役する；及びｃ）ヌクレオチド残基のリボース成分が５'ＯＨ基
へ共役する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 マクイワン・ジョン オーストラリア国 ニュー・サウス・ウェ ールズ 2221、ブレークハースト、ウエス ト・ストリート 241エー Ｆターム(参考） 4C057 BB02 DD03 NN01 4C076 AA65 CC24 CC41 EE59 GG45 4C086 DA39 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA13 NA14 ZC24

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくは
   ペプチドへの結合に好適なＶＢ₁₂誘導体の製造方法であって、ＶＢ₁₂の５'ＯＨ
   基又はその類似体を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成す
   る工程と、続いて前記中間体を求核性スペーサ分子と反応させて前記ＶＢ₁₂誘導
   体を得る工程と、を含む方法。
2. 【請求項２】前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾール
   、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネート、カル
   ボニルジピペリジン、１，１'−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）、
   ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートから
   なる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾール
   である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】前記求核性スペーサ分子が、アミノ置換又はヒドラジジル置換
   スペーサ分子である、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】前記スペーサ分子が、オクタデシルアミンである、請求項４に
   記載の方法。
6. 【請求項６】前記スペーサ分子が、ジアミノエタンである、請求項４に記載
   の方法。
7. 【請求項７】前記スペーサ分子が、ジアミノブタンである、請求項４に記載
   の方法。
8. 【請求項８】前記スペーサ分子が、ジアミノヘキサンである、請求項４に記
   載の方法。
9. 【請求項９】前記スペーサ分子が、ジアミノドデカンである、請求項４に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】前記スペーサ分子が、ジアミノオクタデカンである、請求項
    ４に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記スペーサ分子が、アミノ酸又はペプチドである、請求項
    ４に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記スペーサ分子が、ジヒドラジドである、請求項４に記載
    の方法。
13. 【請求項１３】前記ジヒドラジドが、コハク酸ジヒドラジドである、請求項
    １２に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記ジヒドラジドが、アジピン酸ジヒドラジドである、請求
    項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しく
    はペプチドへの結合に好適なＶＢ₁₂誘導体の製造方法であって、カルボン酸スペ
    ーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と
    、続いてＶＢ₁₂の５'ＯＨ基を前記活性中間体と反応させて前記ＶＢ₁₂誘導体を
    得る工程と、を含む方法。
16. 【請求項１６】前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾー
    ル、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネート、カ
    ルボニルジピペリジン、１，１'−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）
    、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートか
    らなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾー
    ルである、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】前記カルボン酸スペーサ分子が、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅである
    、請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】前記カルボン酸スペーサ分子が、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙである
    、請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】前記請求項のいずれかに記載の方法により製造されたＶＢ₁₂ 誘導体。
21. 【請求項２１】式（Ｉ）で表されるＶＢ₁₂誘導体、又はその塩： ＶＢ₁₂−５'Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ¹ （Ｉ） （式中、 Ｒ¹は、Ｃ_1-24アルキル、Ｃ_2-24アルケニル、Ｃ_2-24アルキニル、Ｃ_3-8シクロ
    アルキル、（Ｃ_3-8シクロアルキル）アルキル、アミノ、−（Ｃ_1-12アルキル）
    Ｃ（Ｏ）Ｒ²、−（Ｃ_2-12アルケニル）Ｃ（Ｏ）Ｒ²、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ_1-8ア
    ルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ₂又は−ＣＨ（Ｒ³）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴（これらの全ては、
    任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキ
    シ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールア
    ルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換さ
    れていてもよい）であり、 Ｒ²は、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ又はＣ_2-6アルケニルオキシで
    あり、 Ｒ³は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、 Ｒ⁴は、ヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ、アミノ酸又はペプチドである）。
22. 【請求項２２】Ｒ¹が、ヘキシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル
    、オクタデシル、アミノエチル、アミノブチル、アミノヘキシル、アミノドデカ
    ニル、ｔ−ブチル−Ｐｈｅ、スクシニルヒドラジジル、アジピルヒドラジジル、
    Ｇｌｙ−ＯＭｅ又はＧｌｙ−ＯＨである、請求項２１に記載のＶＢ₁₂誘導体。
23. 【請求項２３】式（ＩＩ）で表されるＶＢ₁₂誘導体、又はその塩： ＶＢ₁₂−５'Ｏ−ＣＯ−Ｒ¹ （ＩＩ） （式中、 Ｒ¹は、Ｃ_1-24アルキル若しくはＣ_2-24アルケニル（任意にアミノ、アミド、
    ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニ
    ル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリ
    ールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）である
    か、又は Ｒ¹は、−ＣＨ（Ｒ²）−ＮＨＲ³であり、 Ｒ²は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、 Ｒ³は、水素、アミン保護基、アミノ酸又はペプチドである）。
24. 【請求項２４】Ｒ¹が、Ｃ_8-24アルキル又はＣ_8-24アルケニルである、請求
    項２３に記載のＶＢ₁₂誘導体。
25. 【請求項２５】Ｒ¹が−ＣＨ（Ｒ²）−ＮＨＲ³であり、Ｒ²がＧｌｙであり、
    Ｒ³がＢｏｃ又は水素である、請求項２３に記載のＶＢ₁₂誘導体。
26. 【請求項２６】Ｒ¹が−ＣＨ（Ｒ²）−ＮＨＲ³であり、Ｒ²がＰｈｅであり、
    Ｒ³がＢｏｃ又は水素である、請求項２３に記載のＶＢ₁₂誘導体。
27. 【請求項２７】被験者に治療投与するのに好適なポリマー又はナノ粒子であ
    って、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のＶＢ₁₂誘導体を含む、ポリマー
    又はナノ粒子。
28. 【請求項２８】薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と関連した請求項
    ２７に記載のポリマー又はナノ粒子を含む医薬組成物。