JPH09508141A - ビタミンｂ▲下１２▼とタンパク質との複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 治療的に有用なタンパク質が、リボース単位の第一級ヒドロキシル部位で共有結合することによってビタミンＢ₁₂に複合される。得られる複合体は生物学的に活性であり、種々の投与経路、好ましくは経口により送達するために適した医薬組成物に配合することができる。経口送達後消化管内での摂取が、精製した内因子の共投与により更に増強される。

Description

【発明の詳細な説明】 ビタミンＢ₁₂とタンパク質との複合体 発明の分野 本発明は、体内のタンパク質レベルを治療的に有効なレベルとするために、経 口を含む種々の投与経路によって送達することができる、ビタミンＢ₁₂と治療用 タンパク質との生物学的に活性の複合体に関する。 発明の背景 胃腸（即ち、Ｇ．Ｉ．）は、摂取した栄養素を物理的に、化学的に及び酵素的 に処理して分解する機能を果たす身体の器官である。Ｇ．Ｉ．管はまた、栄養素 の体内への摂取及び排泄物の除去にも関与している。Ｇ．Ｉ．管は、栄養素を消 化し、消化酵素を分泌するようにＧ．Ｉ．管の他の領域を刺激し、食物を一時的 に貯蔵し、そして腸の中に制御された速度でキームスを放出する胃を含む。胃は また、多数の化学薬品及び生物学的要素を分泌する機能を果たす。しかしながら 、栄養素の摂取は重要な機能ではない。胃の先に十二指腸があり、ここで酸性キ ームスの中和が起こる。脂質の消化のための界面活性剤及びタンパク質の分解の ためのプロテアーゼも十二指腸の中に分泌さ れる。胃と同様に、十二指腸内で栄養素は殆ど吸収されない。栄養素、特にその 消化生成物は基本的に、空腸及び回腸からなる小腸で摂取される。結腸は不用物 及び水の貯蔵及び塩バランスに関与している。大腸内では酵素活性は殆どなく、 大腸はＧ．Ｉ．管の浸透性が最も少ない部分である。 小腸及び大腸の表面域の大部分は、特殊絨毛吸収細胞であるエンテロサイトと 呼ばれる上皮細胞の層から作られている。腸はまた粘液層で内張りされている［ Ｊ．Ｂｒｏｓｔｏｆｆ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ編、食品アレ ルギー及び過敏症（Ｆｏｏｄ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃ ｅ）１９０〜２０５頁（１９８７年）のＣｌａｍｐ，Ｊ．Ｒ．参照］。この粘液 層は巨大分子、例えば、１７キロダルトンより大きい分子量を有する分子に対し てバリヤーとして作用する［Ｔ．Ｚ．Ｃｚａｋｙ編、腸浸透の薬理学（Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏ ｎ）ＩＩ、２０頁（１９８４年）のＴｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｄｉ ｅｔｓｃｈｙ，Ｊ．Ｍ．参照］。他方、エンテロサイト層は、より小さい分子、 即ち約５００ダルトン程度のペプチドに対する目の詰んだ脂質バリヤ ーを形成する［Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，第８巻、２５３〜２９０頁 （１９９２年）参照］。よって、腸の内張りは親油性分子及び親水性分子の両方 に対する有効なバリヤーとして機能する。その結果、タンパク質のような大きな 巨大分子治療薬を経口投与したとき通常、その有効性は制限される。 しかしながら、幾つかの分子は、消化処理の通常の機能としてＧ．Ｉ．管に特 異的に摂取される。これらの物質には、とりわけアミノ酸、グルコース及びビタ ミンが含まれる。このような分子に対して、腸内張りを通過して輸送するための 自然の生物学的機構が存在している。特に、アミノ酸及びグルコースは、エンテ ロサイトの管腔又は先端膜領域内に配置されている輸送体分子によって摂取され る。ビタミン摂取についてのレセプターも、エンテロサイト内張り(enterocyte lining)の先端領域に存在している。 ここで特に興味のあることは、ビタミンＢ₁₂（「ＶＢ₁₂」）の摂取についての 生物学的機構である。シアノコバラミンとしても知られているＶＢ₁₂は、コバル ト原子を取り囲んでいるコリン環構造から構成されている。ＶＢ₁₂は通常、動物 生産物を経て摂取され、胃の酸性環境中に放出される。内因子 （「ＩＦ」）と呼ばれているＶＢ₁₂のための輸送タンパク質はまた、壁細胞によ りヒトの胃の内腔内に分泌される［Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａ ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７９巻、４９３〜５０２頁（１９８０年）参照 ］。ＩＦ、即ち約４４キロダルトンの糖タンパク質は典型的に、ＶＢ₁₂の生理学 的吸収を促進するために必要な量よりも遥かに過剰の量で放出される。分泌され ると、ＩＦはＶＢ₁₂に高い親和力（Ｋ_a１．９×１０¹²Ｍ^-1）で結合するが、十 二指腸内では中性ｐＨ条件下でのみ存在する。ＩＦがＶＢ₁₂と共に錯体化される ようになった後、ＩＦは、殆どのタンパク質を分解するその器官内に存在するプ ロテアーゼに対して耐性になる［Ａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ ｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６１巻、４７ 〜５４頁（１９７８年）参照］。 ＩＦ−ＶＢ₁₂錯体に結合するレセプターは、エンテロサイトの先端膜領域内に 、主として回腸内に存在している［Ｈａｇｅｄｏｒｎ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ａｌｐ ｅｒｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、７３巻、１０１９〜１ ０２２頁（１９７７年）参照］。各エンテロサイト上のＩＦ−ＶＢ₁₂錯 体に対するレセプターの数は小さい、即ち約３００〜４００／細胞であるけれど も、ＩＦ−ＶＢ₁₂錯体に対する結合親和力は高く、４．０×１０⁹Ｍ^-1である［ Ｍａｔｈａｎ，Ｖ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ ｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、５４巻、５９８〜６０８頁（１９７４年）参 照］。そのレセプターに結合した後、ＩＦ−ＶＢ₁₂錯体はエンテロサイト細胞体 内に内在化する［Ｋａｐａｄｉａ，Ｃ．Ｒ．ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｒ． Ｍ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、７６巻、１１６３頁（１９７９年） 参照］。次いでＩＦは明らかにエンテロサイト内で分解される。他方、ＶＢ₁₂は 、細胞を横切ってトランサイトーズし、次いで血清輸送タンパク質であるトラン スコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）との錯体で、体循環の中に放出される［Ｒｏｔｈ ｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｙ、４０巻、４０１頁（１９７８年）及びＤｉｘ，Ｃ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９８巻、１２７２〜１ ２７９頁（１９９０年）参照］。 このＶＢ₁₂摂取機構を、薬物、ホルモン、抗原物質等々のよ うな生物学的活性物質を、腸腔から循環血液中に、これらの物質をＶＢ₁₂に共有 結合させることによって輸送するために使用することが提案されている。ヨーロ ッパ特許出願公開０ ２２０ ０３０ Ａ２には、ＶＢ₁₂の環Ａ、Ｂ及びＣに隣 接したプロピオンアミド側鎖のアミド基を酸加水分解後カルボジイミドを使用す ることによるポリペプチドのアミノ基への化学結合を含むＶＢ₁₂−ポリペプチド 複合体の製造方法が開示されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、硫酸ネオ マイシン及び黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）のＤ−ｌｙｓ−６類似体 とのＶＢ₁₂の複合体の合成が、この出願明細書に例示されている。更に、マウス へのＶＢ₁₂−ＢＳＡ及びＶＢ₁₂−ｌｙｓ−６−ＬＨＲＨ複合体の経口投与が記載 されている。Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ Ｃｈｉｍ ｉｃａ Ａｃｔａ、１６２巻、１５１〜１５５頁（１９８９年）も参照されたい 。 発明の要約 本発明は、ビタミンＢ₁₂と哺乳類種を治療するために有用である治療的に有用 であるタンパク質との生物学的活性複合体を提供する。特に、これらの複合体は 、ＶＢ₁₂のリボース部分の 第一級（５′）ヒドロキシル基を介してＶＢ₁₂を治療タンパク質に共有結合させ ることを含む化学的アプローチを使用して形成される。得られた複合体は、種々 の送達様式、好ましくは経口により哺乳動物に投与することができる。特に、経 口で送達するとき、本発明の複合体は脊椎動物宿主の胃腸管内で内因子に結合す る。ＶＢ₁₂−タンパク質複合体がＩＦに結合すると、これは、タンパク質治療薬 の生物学的活性を残しながらエンテロサイトによって摂取され、血液流の中に輸 送される。経口投与について、この複合体は好ましくは、精製した内因子（ＩＦ ）輸送体タンパク質と一緒に使用され、吸収が一層高まる。 一般的に、本発明の生物学的活性複合体は、治療活性タンパク質を５′−Ｏ− ［グルタロイル］シアノコバラミンと、この二つの間に共有結合を形成する条件 下で反応させることによって製造することができる。好ましくは、ＶＢ₁₂の５′ −Ｏ−グルタロイル誘導体は、ＶＢ₁₂を反応性グルタル酸誘導体、例えば無水物 でアシル化して、α−リボース部分の第一級ヒドロキシル基（５′−ＯＨ）を化 学的に反応性のカルボキシル基に選択的に転換することによって形成される。こ のようにして得られたＶＢ₁₂誘導体を次いで好ましくは官能性結合剤及び／又は スペーサー基と反応させて、第二の誘導体を形成し、次いでこれを治療用タンパ ク質と反応させて、生物学的活性複合体を形成させる。 上記のこれらの複合体及びその製造方法に加えて、本発明にはまたこの複合体 を含有する医薬組成物が含まれる。このような組成物には、必ずしも必要ではな いが、天然に存在するか又は組換え体外因性形であってよい吸収増強量の内因子 が含有されていてよい。 本発明は、種々の治療用タンパク質、好ましくは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ −ＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）又はコンセンサスインターフェロン （ＩＦＮ−Ｃｏｎ）の使用を包含し、これらの使用を後で発明の詳細な記述に例 示する。 本発明の開示の目的のために、用語「ＶＢ₁₂」及び「シアノコバラミン」は、 同じ物質を意味するために互換的に使用する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明による中間体を含むＶＢ₁₂の誘導体並びにＶＢ₁₂−タンパク質 複合体最終生成物の化学構造の三次元表示である。 図２は、ＶＢ₁₂の誘導体の製造方法の反応図式であり、こ れらの誘導体は、本発明によるＶＢ₁₂−タンパク質複合体を製造するために有用 である。本図及び図３〜６の置換基記号（Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃等）の前の数字（１、 ２、３など）は、図１の式の下に記載したこれらの数字に関係している。 図３は、本発明によるＶＢ₁₂とＥＰＯとの複合体の製造方法の反応図式である 。 図４は、本発明によるＶＢ₁₂とＧ−ＣＳＦとの複合体の製造方法の反応図式で ある。 図５は、本発明によるＶＢ₁₂とペギル化した（ポリエチレングリコール変性し た）Ｇ−ＣＳＦとの複合体の製造方法の反応図式である。 図６は、本発明によるＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体の製造方法の反応図 式である。 図７は、非複合ＩＦＮ−Ｃｏｎ及びＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体を十二 指腸内注入した後の、ピコグラム／ミリリットルで示したＩＦＮ−Ｃｏｎの全血 レベルのグラフである。 図８は、非複合ＩＦＮ−Ｃｏｎ及びＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体を十二 指腸内注入した後の、ピコグラム／ミリリットルで示したＴＣＡ−沈殿性ＩＦＮ −Ｃｏｎの血漿レベルのグ ラフである。 図９は、経口ガバージュ、十二指腸内ボーラス又は十二指腸内注入を経て投与 した後の、ラット内因子（ｒＩＦ）の存在下及び不存在下での健康なラットでの⁵⁷ Ｃｏ−標識ＶＢ₁₂の摂取を示す。 図１０は、健康なラットに十二指腸内注入した後の、ＩＦＮ−Ｃｏｎの血漿レ ベルへのＩＦＮ−ＣｏｎとのＶＢ₁₂複合体の影響を示す。ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏ ｎ摂取への組換え体ラット内因子（ｒｒＩＦ）の含有の影響を示す。このデータ は、７２時間に亘る血漿薬物濃度レベル／時間曲線の下の面積（ＡＵＣ₇₂）を表 し、台形方式（ｎ＝４）を用いて誘導される。 図１１は、ラットに静脈内投与した後の、ＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの¹²⁵Ｉ −標識複合体とある時間比較した¹²⁵Ｉ−標識ＩＦＮ−Ｃｏｎの、１００マイク ロリットル当たりのカウント数／分（ｃｐｍ）で示した血液レベルのグラフであ る。 図１２は、ラットに静脈投与した後の、合計ナノグラム／器官で示したＶＢ₁₂ とのＩＦＮ−Ｃｏｎの複合体（パネルＢ）と比較した自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ（パ ネルＡ）の生体分布を示す。 ３個の時点、即ち５分、６０分及び６時間を使用した。 図１３は、静脈内投与した後の、ラット（ｎ＝４）の肝臓内の、合計ナノグラ ムで示したＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体と比較した自然ＩＦＮ−Ｃｏｎの量を 示す。 発明の詳細な記述 好ましくは、本発明によるＶＢ₁₂とタンパク質との複合体は、下記の式のもの であろう。 （式中、Ｒは、 （１）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （２）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₁₂−ＮＨＣＯＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓ −Ｒ₃（式中、Ｒ₃はタンパク質である）又は （３）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₇ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパ ク質である）又は （４）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮＨＲ₁（式 中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （５）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮ＝Ｒ₄（式 中、Ｒ₄はタンパク質である） であり、そして ｎは１〜１２の整数である）。 最も好ましい態様に於いて、このような複合体は図１の式によるものであろう 。 本発明の実施に於いて、治療的に有用なタンパク質でありＶＢ₁₂化合物と共有 結合することが可能なポリペプチドはいずれも使用することができる。例えば、 このタンパク質は組換え体又は天然に存在するものであってよく、これにはとり わけ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリ トロポイエチン（ＥＰＯ）、アルファ、ベー タ、ガンマ等のようなインターフェロン、顆粒球／マクロファージコロニー刺激 因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２等の ようなインターロイキンが含まれていてよいが、これらに限定されない。神経成 長因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３ （ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３）（ＮＴ−３）等々のような神経栄養因子も包 含される。本発明によりＶＢ₁₂と複合されると、このタンパク質はあたかも複合 されていないときと同じ治療目的のために有用であると期待することができる。 本発明を、特に、本発明の実施のための好ましい物質である顆粒球コロニー刺 激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）及びコンセンサスインタ ーフェロン（ＩＦＮ−Ｃｏｎ）に関して、以下に更に示す。これらのタンパク質 は、特別の疾患又は障害の治療のために治療的に有用であることが知られている 。Ｇ−ＣＳＦは、ガンのために化学療法を受けている患者の好中球減少症（即ち 、好中球欠損症）の治療に使用することが承認されている。ＥＰＯは腎臓透析を 受けている患者の慢性貧血の治療に使用することが承認されている。ＩＦＮ−Ｃ ｏｎはウイルス性肝炎感染の治療についてヒト臨床試験中 である。 ＥＰＯの組換え体製造方法及び精製方法は、米国特許第４，７０３，００８号 （Ｌｉｎ）に記載されており、Ｇ−ＣＳＦは米国特許第４，８１０，６４３号（ Ｓｏｕｚａ）及び同第４，９９９，２９１号（Ｓｏｕｚａ）に記載されており、 そしてＩＦＮ−Ｃｏｎは米国特許第４，８９７，４７１号（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ ）及び同第４，６９５，６２３号（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）に記載されている。こ れらの特許の開示を参照して本明細書に含めるとする。 生物学的性質に影響を与えるために、ポリエチレングリコールのようなポリマ ーを共有結合させた上記した及びその他のタンパク質も意図される［例えば、米 国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓ）（その開示を本明細書に参照して 含める）を参照されたい］。このタンパク質と共に使用するためのその他の可能 性のある担体の別には、ポリマーベースの微粒子、リポソーム及びプロテイノイ ドが含まれる。 本発明によるＶＢ₁₂と治療用タンパク質との複合体は、好ましくは、リボース 部分の５′−ＯＨ基のアシル化によるＶＢ₁₂ の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体を得ることを含む方法によって得られる。５′ −Ｏ−グルタロイル誘導体の化学的修飾は、化学結合を形成することができる少 なくとも１個の官能基を用意し、複合体を形成する条件下で修飾５′−Ｏ−グル タロイル誘導体を治療用タンパク質と反応させることによって行われる。 典型的に、アシル化工程は、ＶＢ₁₂をジメチルスルホキシドのような適当な溶 媒中に溶解し、このＶＢ₁₂溶液を適当な反応性グルタル酸誘導体（例えば、無水 物）で処理し、イオン交換クロマトグラフィーにより６０〜７０％収率で標的化 合物、即ち５′−Ｏ−グルタロイル−ＶＢ₁₂を単離することによって行われるで あろう。このＩＦに対して結合する保持能力を有するＶＢ₁₂カルボン酸誘導体の 製造方法は、唯一の適当なモノ酸、即ちε−モノカルボン酸が僅か９〜１０％収 率しか生じない従来のシアノコバラミンプロピオンアミド側鎖加水分解方法を越 えた利点を有する。このようにして得られたＶＢ₁₂カルボン酸誘導体は、（適当 な架橋試薬の存在下で）直接タンパク質に複合させるか又は更に誘導してタンパ ク質との複合のために適した第二の誘導体を形成することができる。 一般的に、本発明は、下記の工程からなる方法による、タン パク質１分子当たり少なくとも１個のＶＢ₁₂分子を含むＶＢ₁₂−タンパク質複合 体の製造方法を提供する。 ａ）ＶＢ₁₂の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体を混合酸無水物、酸ハライド又は 活性化エステルのような適当なアシル化剤に変換し、この新しい誘導体を単離し 、次いでこれをタンパク質と反応させる工程。好ましいアプローチは、ＶＢ₁₂の ５′−Ｏ−グルタロイル誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル の製造及び単離並びにこの誘導体を当該治療用タンパク質と反応させることから なる。 ｂ）ＶＢ₁₂の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体とタンパク質単位との複合を、ジ ヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）− カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル）−４−エチル −カルボジイミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ′−３−ジメチルアミノプロピルカルボジ イミド、Ｎ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウム−３′−スルホナート（ ウッドワード試薬Ｋ）、Ｎ−エチルベンゾイソオキサゾリウムテトラフルオロボ ラート、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル、１，１′−カルボ ニルジイミダゾール、Ｎ−（エトキシカルボニル）−２−エ トキシ−１，２−ジヒドロキノリン及びＮ−（イソブチルカルボニル）−２−イ ソブトキシ−１，２−ジヒドロキノリンのような適当なカルボキシル基活性化試 薬の存在下で行う工程。 ｃ）任意に、次のタンパク質との複合のために適している追加の官能基を導入 する目的で、カルボン酸部位でのＶＢ₁₂の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体の別の 修飾を実施する工程。この最後の工程は、必要に応じて、適当なホモ−又はヘテ ロ二官能性試薬の存在下で行うことができる。このような新しい官能基の付加は 、多数の目的の機能を果たすことができる。ある場合には、この付加は、複合体 に於けるＶＢ₁₂部分とタンパク質表面との間の距離を増加させるためのスペーサ ーアームを加える目的のために行われる。他の場合には、官能基変換を、ＶＢ₁₂ ベースの試薬の反応性又は選択性を変え、そうして次の複合反応に含まれるであ ろうタンパク質側鎖官能基の種類又は数を変えるために使用することができる。 これらの操作の重要性は、本明細書で更に示す実施例により明らかに示される。 一般的に、本発明によるＶＢ₁₂−タンパク質複合体は、この複合体のタンパク 質成分が有用である全ての治療で有用であろう。例えば、ＶＢ₁₂とＥＰＯとの複 合体は、腎不全の場合のよ うな慢性貧血に罹っている患者を治療するために使用することができる。ＶＢ₁₂ とＧ−ＣＳＦとの複合体は、好中球減少症を治療するため又は感染を治療するた めに好中球レベルを増加させるために使用することができる。ＶＢ₁₂とコンセン サスインターフェロンとの複合体は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のようなウイルス性 感染と治療するために使用することができる。 特定の障害又は状態の処置で有効であろう複合体の量は、障害又は状態の性質 に依存し、標準的臨床的方法又は特定のタンパク質について既に確立されている 投与量及び処方計画により決定することができる。可能な場合には、本発明の医 薬組成物の用量−反応曲線を、ヒトで試験する前に最初は試験管内で、同様にバ イオアッセイシステムで、次いで有用な動物モデルシステムで決定することが望 ましい。 投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内及び特に経口が含 まれる。本発明のＶＢ₁₂−タンパク質複合体は特に経口送達・経腸摂取のために 適合されているので、経口投与が好ましい。 本発明はまた、１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤、保存剤、可溶 化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体 と一緒に有効量の本発明のＶＢ₁₂−タンパク質複合体を含む医薬組成物を提供す る。適当な剤形に成分を配合するための標準的な方法を使用することができる。 経口送達のために処方されるか又は適合している医薬組成物が特に好ましい。 胃の中では溶解しないが、十二指腸内又は腸管のどこかでＶＢ₁₂−タンパク質を 放出する組成物が利用できる。この種類の固体剤形には錠剤、カプセル剤、丸剤 、トローチ剤又はドロップ剤、カシェ剤及びペレット剤が含まれる。その他のこ のような固体剤形は、プロテイノイド（米国特許第４，９２５，６７３号参照） 又はリポソーム被包を包含することができる。追加の詳細なことについては、Ｍ ａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ 編、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第１０章（１９７９年）を参 照されたい。固体剤形には腸溶性皮膜を使用することが含まれていてよく、腸溶 性皮膜の例は、マサチューセッツ州、ＭａｌｄｅｎのＲｏｈｍ Ｔｅｃｈ，Ｉｎ ｃ．により製造されたＥｕｄｒａｇｉｔのようなメタクリル酸コポリマー；ニュ ーヨーク州、ニューヨークのＭｏｎｔｒｏｓｅ−Ｈａｅｕｓｅｒ，Ｍｉｌｌｍａ ｓｔｅｒ Ｏｎｙｘ Ｇｒｏｕ ｐにより製造されたＳｈｅｌｌａｃ；ニューヨーク州、ニューヨークのＢｉｄｄ ｌｅ Ｓａｗｙｅｒ Ｃｏｒｐ．により製造されたヒドロキシプロピルメチルセ ルロースフタレート及びテネシー州、ＫｉｎｇｓｐｏｒｔのＥａｓｔｍａｎ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．により製造されたセルロースアセ テートフタレート（ＣＡＰ）である。これらの被覆物質は、個々の又は組み合わ せたフィルムとして使用することができる。最適の胃抵抗性を確保するために、 ５．０より低いｐＨで安定性を有する皮膜が好ましい。 ショ糖を含む皮膜又は皮膜混合物を、胃液に対して保護することを意図しない 錠剤で使用することができる。この種のカプセルは、ドライ治療剤、例えば散剤 の送達のための硬質ゼラチンシェル又は液体治療剤、例えばＶＢ₁₂−タンパク質 溶液の送達のための軟質ゼラチンシェルからなっていてよい。カシェのための被 覆物質はデンプン紙からなっていてよい。丸剤、ドロップ剤、すりこみ錠剤又は 錠剤粉砕物のような他の剤形については、湿分塊化方法を使用することができる 。 本発明のＶＢ₁₂−タンパク質複合体は、非常に小さい粒子サイズ、例えば約１ ミクロンを有する顆粒又はペレットの形で微 細な微粒子として配合することができる。カプセル剤として投与するための組成 物は、粉末、軽く圧縮したプラグ又は錠剤の形であってよい。 薬学的に不活性の物質を使用してＶＢ₁₂−タンパク質複合体を希釈するか又は その増量させることが望ましいか又は必要であろう。適当な希釈剤には、マンニ トール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、変性デキスト リン及びデンプンのような炭水化物が含まれる。充填剤として有用である無機塩 には、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、三リン酸カルシウム、炭 酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが含まれる。市販の希釈剤及び充填剤の例に は、カリフォルニア州、サンフランシスコのＦｏｒｅｍｏｓｔ Ｆｏｏｄｓ Ｃ ｏｍｐａｎｙによって製造されたＦＡＳＴ−ＦＬＯ；イリノイ州、Ｄｅｃａｔｕ ｒのＳｔａｌｅｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造 されたＳＴＡ−ＲＸ１５００；ニューヨーク州、ＣａｒｍｅｌのＥｄｗａｒｄ Ｍａｎｄｅｌｌ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されたＥＭＣＯＭＰＲＥＳＳ；ペ ンシルベニア州、フィラデルフィアのＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製 造されたＡＶＩＣＥＬ及び ニューヨーク州、ＮｏｒｗｉｃｈのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓによ って製造されたＬＡＣＴＯＳＥ ＤＴが含まれる。 本発明による固体剤形で使用するために、崩壊剤が含有されていてもよい。例 にはデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシ メチルセルロースナトリウム、ウルトラマイロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐ ｅｃｔｉｎｅ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、酸性カルボキシメチルセル ロース、天然スポンジ及びベントナイトが含まれる。その他の適当な崩壊剤物質 には、不溶性カチオン交換樹脂、粉末化ゴム、例えば、寒天及びアルギン酸又は アルギン酸塩が含まれる。 この医薬組成物に使用することができるその他の成分には、着色剤、矯味・矯 臭剤及び結合剤、例えば、アラビアゴム、トラガカント、デンプン、ゼラチン、 メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等々；潤滑剤、例えば、ステアリン酸 、ポリテトラフルオロエチレン、液体パラフィン、植物油、ワックス、ラウリル 硫酸ナトリウム等々；滑剤、例えば、タルク、焼成シリカ、水和シリコアルミン 酸塩等々；並びにラウリル流酸ナト リウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホン酸ナトリウ ム等々のようなアニオン性洗剤、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム のようなカチオン性洗剤又はステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン水 素化ひまし油、グリセリンモノステアラート、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エ ステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等々のような非イオン 性洗剤を含む界面活性剤が含まれる。 上記の希釈剤、充填剤、崩壊剤、着色剤、矯味・矯臭剤、結合剤等は、その意 図する目的のために一般的である量で使用することができる。 幾つかの用途のために、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体が長期間に亘って徐々に放 出される徐放性剤形を使用することが望ましいであろう。例えば、ＶＢ₁₂−タン パク質複合体を、拡散又は浸出による放出を可能にするゴムのような不活性マト リックス中に含有させることができる。ゆるやかに変性するマトリックス又は半 透過性膜を使用することも可能である。腸皮膜もその性質により放出を遅延させ る機能を果たす。 前記のように、治療用タンパク質は、ポリエチレングリコールのようなポリマ ーの共有結合により修飾することができる。 このようなポリマーは、経口剤形についてタンパク質安定性を増大させる機能を 果たすことができる。これ以上の情報については、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ ｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９巻、２４９〜３０４頁（１９９２ 年）を参照されたい。また、ポリマーの側鎖に結合することによってＶＢ₁₂及び 治療用タンパク質を含有する担体ポリマーを、増大した量の複合体及び付随して 治療剤を送達する手段として使用することができる。 前記のように、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体を有効量の天然の又は組換え体外因 性内因子と共に使用する場合、経口送達後の消化管内でのＶＢ₁₂−タンパク質複 合体の吸収及び摂取を著しく増大させることができる。従って、実施の好ましい 態様に於いて、この医薬組成物は追加の成分として混合された内因子を含有する ように処方される。典型的に、このような組成物に含有されるＩＦの有効量は、 使用するＶＢ₁₂複合体の量を基準にしており、一般的に２：１を越えないＩＦ： ＶＢ₁₂のモル比の使用が含まれる。 一般的に、本発明のＶＢ₁₂−タンパク質複合体の有効量は、 患者の年令、体重及び疾患の状態又は重度により決定されるであろう。Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎの薬科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、６ ９７〜７７３頁（参照して本明細書に含める）を参照されたい。服用は毎日１回 若しくは２回以上又はもっと少ない頻度であってよく、熟練した医者が認めると き他の組成物と一緒であってもよい。この複合体を使用することによって、更に この複合体との混合物で内因子を使用することによって腸摂取が増大されるので 、単独で投与されたタンパク質と同じ生物利用率を得るために、より低い用量が 可能であると期待される。 特別の態様の記述 下記に示す例示物質、方法、手順及び試験結果を参照して、本発明を更に示す 。物質 ヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ Ｆ）及びヒトコンセンサスインターフェロン（ＩＦＮ−Ｃｏｎ）は、チャイニー ズハムスター卵巣又は細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内でのヒトＤＮＡの発現により 、カリフォルニア州、Ｔｈｏｕｓａｎｄ ＯａｋｓのＡｍｇｅｎ Ｉｎｃ．により組換えにより製造された。ブタＩＦは、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏ ｕｉｓのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得た。ビタミンＢ₁₂ もＳｉｇｍａから得た。緩衝液並びにその他の試薬及び物質は標準的なもので あった。高速液体クロマトグラフィー分析 方法１ カラム：３．９×１５０ミリメートル（ｍｍ）、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（Ｃ１８） 、Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ。移動相Ａ：５０ｍＭ 燐酸塩、ｐＨ６．５；移動相Ｂ：アセトニトリル。勾配：ｔ＝０分で、Ａ９５％ 及びＢ５％；ｔ＝０分とｔ＝５分との間で、Ａ８５％及びＢ１５％まで直線的に 変化させ、ｔ＝１３分まで保持し；ｔ＝１３分とｔ＝２７分との間で、Ａ１５％ 及びＢ８５％まで直線的に変化させ、次いでｔ＝２７分とｔ＝２８分との間で、 出発条件に直線的に戻す。流速：１分間当たり１．５ミリリットル（ｍＬ／分） 。ＵＶ検出器：３６０ナノメートル（ｎｍ）。方法２ カラム：４．６×２５０ミリメートル（ｍｍ）、２１４ＴＰ（Ｃ４）、Ｖｙｄ ａｃ、カリフォルニア州、Ｈｅｓｐｅｒｉａ。 移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ中 ９５％アセトニトリル。勾配：ｔ＝０分で、Ａ９５％及びＢ５％；ｔ＝０分とｔ ＝１０分との間で、Ａ７０％及びＢ３０％まで直線的に変化させ；ｔ＝１０分と ｔ＝５５分との間で、Ａ２５％及びＢ７５％まで直線的に変化させ、ｔ＝６０分 まで保持し、次いでｔ＝６０分とｔ＝６１分との間で、出発条件に直線的に戻す 。流速：０．８ｍＬ／分。ＵＶ検出器：２２０ｎｍ及び３６０ｎｍ。方法３ カラム：７．５×３００ｍｍ、ＵｌｔｒａＳｐｈｅｒｏｇｅｌ ＳＥＣ２００ ０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏ．、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ。２本の カラムを直列に結合。移動相：１００ｍＭ燐酸塩、ｐＨ６．９。流速：１ｍＬ／ 分。ＵＶ検出器：チャンネル１：２８０ｎｍ；チャンネル２：３６０ｎｍ。 実施例１ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンの製造 シアノコバラミン（ＶＢ₁₂）５グラム（ｇ）を、グルタル酸無水物２００ｇ及 びピリジン１６０ｍＬを含有する乾燥ジメチ ルスルホキシド１，０００ｍＬに溶解した。室温（２５℃）で１２時間後に、１ ０％水酸化カリウム水溶液で混合物をｐＨ６．０に維持しながら、水１リットル を添加することによって、過剰のグルタル酸無水物を分解した。次いでシアン化 カリウムを添加して、１０ｍＭの最終濃度を得、そして３Ｎ塩酸を添加して、溶 液をｐＨ６．０に調節した。１時間後に、この溶液をＸＡＤ−１６（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を充填したカラム（５×３０ｃｍ）に添加した。 カラムを最初に脱イオン水で洗浄した。次いで５０％アセトニトリル水溶液でシ アノコバラミン誘導体を溶離した。溶離液を８０ｍＬの体積までロータリエバポ レーターで蒸発させ、ＡＧ１×２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラム（アセタート型、２ ００〜４００メッシュ、４．４×１００ｃｍ）に適用した。このカラムを水で洗 浄して、未反応のシアノコバラミンを除去した。０．１６％酢酸でモノグルタリ ル誘導体を溶離した。少量成分を溶出した後で、主成分を含有する溶出物を捕集 し、ＸＡＤ−１６で脱塩し、約２００ｍＬまで濃縮し、凍結乾燥した。収量は５ ′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン３．５ｇ（６５％）であった。生成 物のサンプルのＨＰＬＣ分析（方法１）により、これが単 一の成分であったことが示された。 赤外スペクトル（ＫＢｒ）１７１４ｃｍ^-1。質量スペクトル：Ｍ＋１，１４６ ９．７４±０．３５；計算値：１４６９．６１ｍ／ｅ。元素分析：Ｃ₆₈Ｈ₉₄ＣＯ Ｎ₁₄Ｏ₁₇Ｐ・９Ｈ₂Ｏ：Ｃ，５０．０６；Ｈ，６．９３；Ｎ，１２．０２％。実 測値：Ｃ，４９．９３；Ｈ，７．１１；Ｎ，１１．９４％。 実施例２ Ｇ−ＣＳＦへの５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンの複合 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドの製造及びこの誘導体とＧ−ＣＳＦとの反応による５′−Ｏ−［ グルタロイル］シアノコバラミンとＧ−ＣＳＦとの複合体の生成を示す。 実施例１に記載したようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコ バラミン６０ミリグラムを、無水エタノール４ｍＬ中の１−（３−ジメチルアミ ノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）１９１ｍｇ及びＮ− ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１１５ｍｇの溶液に添加した。反応混合物 を室温で２時間撹拌し、次いで無水ジクロロメタン ２００ｍＬに滴下により添加して、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミ ン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを製造した。後者を濾過により無定形の微細 沈殿として捕集した。ＨＰＬＣ分析（方法１）により、生成物が純粋であったこ とが示された。 ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド（８．５ｍｇ／ｍＬ）のエタノール溶液を調製し、この溶液０．１ｍＬを１ｍ Ｌの１００ｍＭビシン緩衝液、ｐＨ８．０中のＧ−ＣＳＦ５ｍｇの溶液に添加し た。反応を室温で１時間進行させ、その後反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ４．０に調節し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈した。得られた反応生 成物を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５ ０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙによる溶 離によって、未反応シアノコバラミンから分離した。ＨＰＬＣによる分析（方法 ２）により、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＧ−ＣＳＦとの複 合体が、Ｇ−ＣＳＦの複合度の違いを反映して、２種の部分的に分割された成分 として溶出されたことが示された。これらの複合体中のシ アノコバラミンのＧ−ＣＳＦに対するモル比は、それぞれ１．８４及び０．５２ であった。 実施例３ ＥＰＯへの５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンの複合 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドとＥＰＯとの反応による５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミンとＥＰＯとの複合体の生成を示す。 実施例２に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエタノール溶液０．１８ｍＬを、０． ５ｍＬの１００ｍＭビシン緩衝液、ｐＨ８．０中のＥＰＯ３ｍｇに添加した。４ ℃で２時間後に、２．５ｍＬの２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０ を反応混合物に添加した。得られた反応生成物から、２０ｍＭ酢酸ナトリウム中 で、７．０のｐＨで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０による溶離によって、未反応 シアノコバラミンを分離した。ＨＰＬＣによる分析（方法３）により、５′−Ｏ −［グルタロイル］シアノコバラミンとＥＰＯとの複合体が、 単一ピークとして溶出し、２．５のシアノコバラミンのＥＰＯに対するモル比を 含んでいたことが示された。 実施例４ ＩＦＮ−ＣＯＮへの５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンの 複合 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドとＩＦＮ−Ｃｏｎとの反応による５′−Ｏ−［グルタロイル］シ アノコバラミンとＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体の生成を示す。 ２ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．０に溶解したＩＦＮ−Ｃｏｎ２ミリグラムを、実施 例２に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液（０．２ｍＬ）に添加した。３．５時間室 温で撹拌した後、同じ緩衝液の存在下でＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００でのゲ ルクロマトグラフィーにより、未反応シアノコバラミンを分離した。ＨＰＬＣ（ 方法２）により、得られたＩＦＮ−Ｃｏｎと５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノ コバラミンとの複合体が、３．７のシアノコバラミンのＩＦＮ−Ｃｏｎに対する モル比で、単一ピークとして溶出した。 実施例５ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミドの 製造 本実施例は、中間体として使用するための５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノ コバラミンの１２−アミノドデシルアミド誘導体の製造を示す。 実施例２に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６３ミリグラムを、１，１２−ジアミノ ドデカン１６０ｍｇを含有する無水メタノール１０ｍＬに溶解した。反応混合物 を室温で１５分間撹拌し、その後、真空蒸発により５ｍＬまで体積を減少させた 。この粗製生成物をジクロロメタン５００ｍＬ中に沈殿させ、濾過し、次いで０ 〜１００％勾配の０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル水溶液でＳｉｌｉｃ ａ Ｃ₄（Ｖｙｄａｃ）３．２×１０ｃｍカラムによる溶離により部分的に精製 した。０〜１００％勾配の０．１Ｎ ＨＣｌを使用しＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ２．６×３０ｃｍカラムからの溶離により、更なる精製を行った。得られた 生成物である５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデ シルア ミドを、一般的な方法でＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ₁₈カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で 脱塩し、次いで凍結乾燥した。収量は１５ｍｇ（２３％）であった。生成物のＨ ＰＬＣ分析は方法１によった。 実施例６ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミド− ジチオピリジルプロピオネートの製造 本実施例は、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体の製造で使用するための５′−Ｏ−［ グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミドのジチオピリジ ルプロピオネート誘導体の製造を示す。 Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート１３ミリ グラムを、実施例５に記載したようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］ シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミド１３．８ｍｇ及びトリエチルア ミン０．００１６ｍＬを含有する無水メタノール３ｍＬに添加した。反応混合物 を室温で３０分間撹拌し、１ｍＬまで体積を減少させ、次いでジクロロメタン３ ００ｍＬに滴下により添加した。得られた沈殿生成物である５′−Ｏ−［グルタ ロイル］シアノ コバラミン−１２−アミノドデシルアミド−ジチオピリジルプロピオネートを濾 過し、３０％アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。収量は１２ｍｇ（ ８２％）であった。生成物のＨＰＬＣ分析は方法１によった。質量スペクトル： Ｍ＋１８４８．５０±０．７０；計算値；１８４７．８１ｍ／ｅ。 実施例７ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミド− ジチオピリジルプロピオネートとＧ−ＣＳＦとの反応 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノド デシルアミド−ジチオピリジルプロピオネートとＧ−ＣＳＦとの反応による５′ −Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＧ−ＣＳＦとの複合体の生成を示す 。 実施例６に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン−１２−アミノドデシルアミド−ジチオピリジルプロピオネート４．０６ ｍｇを、塩酸で３．２５のｐＨに酸性化した水０．６７ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ４ｍ ｇの混合物に添加した。４℃で３６時間放置した後、反応生成物から、２０ｍＭ 酢酸ナトリウムで、ｐＨ４．０で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０による溶離によって、未反応５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン−１２−アミノドデシルアミド−ジチオピリジルプロピオネートを分離し た。ＨＰＬＣによる分析（方法２）により、得られた５′−Ｏ−［グルタロイル ］シアノコバラミンとＧ−ＣＳＦとの複合体が、１：１のシアノコバラミンのＧ −ＣＳＦに対するモル比で、単一ピークとして溶出したことが示された。 実施例８ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノドデシルアミド− ジチオピリジルプロピオネートとＧ−ＣＳＦのポリエチレングリコール誘導体と の反応 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−１２−アミノド デシルアミド−ジチオピリジルプロピオネートとＧ−ＣＳＦのポリエチレングリ コール誘導体との反応による５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＧ −ＣＳＦのポリエチレングリコール誘導体との複合体の生成を示す。 ５０％アセトニトリル水溶液０．３４ｍＬ中の５′−Ｏ−［グルタロイル］シ アノコバラミン−１２−アミノドデシルアミド−ジチオピリジルプロピオネート （実施例６）４．０６ ｍｇの溶液を調製した。別に、塩酸で３．２５のｐＨに酸性化した水０．８１ｍ Ｌ中のＧ−ＣＳＦ４．１４ｍｇを含有するＧ−ＣＳＦのポリエチレングリコール 誘導体の溶液を調製した。二つの溶液を混合し、４℃で３６時間放置した。未反 応シアノボラミンを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で、Ｓｅｐｈａｄ ｅｘ Ｇ−５０を使用するゲルクロマトグラフィーにより分離した。Ｇ−ＣＳＦ を含有する画分をプールした。ＨＰＬＣ（方法２）により、得られた５′−Ｏ− ［グルタロイル］シアノコバラミンとポリエチレングリコール−Ｇ−ＣＳＦとの 複合体が、０．８９のシアノコバラミンのＧ−ＣＳＦに対するモル比で、単一の 広いピークとして溶出されたことが示された。 実施例９ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−８−アミノカプリル酸の製造 本実施例は、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体の生成で中間体として使用するための ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンの８−アミノカプリル酸誘導体の 製造を示す。 実施例２に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロ イル］シアノコバラミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６３ミリグラムを、８ −アミノカプリル酸８０ｍｇを含有する無水メタノール１０ｍＬに添加した。反 応混合物を室温で３０分間撹拌し、その体積を真空蒸発により５ｍＬまで減少さ せ、この粗製反応生成物をジクロロメタン５００ｍＬを添加することによって沈 殿させた。この沈殿を濾過し、０〜１００％勾配の１．０％ＴＦＡ中のアセトニ トリルを使用してＳｉｌｉｃａ Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）３．２×１０ｃｍカラムか らの溶離により精製した。生成物を含有する画分をプールし、真空蒸発により（ 約５０ｍＬまで）濃縮し、凍結乾燥し、０〜１００％０．１Ｎ酢酸の勾配でＡＧ １×２カラム（アセタート型、２００〜４００メッシュ、３．２×１６ｃｍ）で 精製した。生成物画分をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ） で濃縮し、次いで凍結乾燥して、赤色粉末として純粋な５′−Ｏ−［グルタロイ ル］シアノコバラミン−８−アミノカプリル酸を得た。生成物のＨＰＬＣ分析は 方法１により行われた。質量スペクトル：Ｍ＋１６０９．６２±０．３５；計算 値：１６１０．７１ｍ／ｅ。 実施例１０ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドとＧ−ＣＳＦとの反応 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−８−アミノカプ リル酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの製造及びこの誘導体とＧ− ＣＳＦとの反応による５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＧ−ＣＳ Ｆとの複合体の生成を示す。 実施例９に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン−８−アミノカプリル酸４０ミリグラムを、無水エタノール１．４ｍＬ中 の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩１１ ８ｍｇ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド７１ｍｇの混合物に添加した。得られ た混合物を室温で２時間撹拌し、次いで無水ジクロロメタン２００ｍＬに滴下に より添加した。得られた生成物である５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラ ミン−８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは無定形の微細粉 末として沈殿し、これを０．４５μｍ細孔サイズフィルター上に 捕集した。 エタノール０．０８ｍＬ中の５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン− ８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．１１ｍｇの溶液を、 ０．８ｍＬの１００ｍＭビシン緩衝液、ｐＨ８．０中のＧ−ＣＳＦ４ｍｇと混合 した。室温で１時間後、混合物を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調節し、１ｍ ｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈した。未反応シアノコバラミンを、ｐＨ４． ０で２０ｍＭ酢酸ナトリウムで溶離することによる、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５ ０でのゲルクロマトグラフィーにより分離した。ＨＰＬＣによる分析（方法２） により、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＧ−ＣＳＦとの複合体 が、二つの部分的に分割されたピークとして溶出されたことが示された。それぞ れの生成物中のシアノコバラミンのＧ−ＣＳＦに対するモル比は、それぞれ２． ７２及び１．８１であった。実施例１１ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドとＥＰＯとの反応 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン −８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルのＥＰＯへの反応に よる５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＥＰＯとの複合を示す。 ０．５ｍＬの１００ｍＭビシン緩衝液、ｐＨ８．０中のＥＰＯ３ｍｇの溶液を 、実施例１０に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコ バラミン−８−アミノカプリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．７０ｍｇ に添加した。混合物を４℃で２時間放置した後、２．５ｍＬの２０ｍＭクエン酸 ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を添加し、未反応シアノコバラミンを、同じ緩衝 液の存在下でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０でのゲルクロマトグラフィーにより分 離した。ＨＰＬＣによる分析（方法３）により、５′−Ｏ−［グルタロイル］シ アノコバラミン−８−アミノカプリル酸とＥＰＯとの複合体が、単一のピークと して溶出され、３．００のシアノコバラミンのＥＰＯに対するモル比を有してい たことが示された。 実施例１２ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラ ジドの製造 本実施例は、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体の製造で中間体とし て使用するための５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンのアジピン酸− １，６−ジヒドラジド誘導体の製造を示す。 実施例２に於けるようにして製造した５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバ ラミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６３ミリグラムを、無水メタノール１０ ｍＬ中のアジピン酸−１，６−ジヒドラジド１３９ｍｇの溶液に添加した。この 溶液を室温で３時間撹拌し、その体積を真空蒸発により５ｍＬまで減少させ、こ の粗製反応生成物をジクロロメタン５００ｍＬを添加することによって沈殿させ た。この沈殿生成物を０．１％ＴＦＡ５ｍＬに溶解し、次いで０〜１００％勾配 の０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルを使用してＳｉｌｉｃａ Ｃ₄（Ｖｙｄａ ｃ）３．２×１０ｃｍカラムにより溶離した。主成分に相当する画分をプールし 、真空蒸発により（約５０ｍＬまで）濃縮し、凍結乾燥し、次いでＳ Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ ＦＦ２．６×３０ｃｍカラムに適用した。０〜１００％勾配の０． １Ｎ ＨＣｌで溶離すると、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−ア ジピン酸−１，６−ジヒドラジドが得られ、これをＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ₁₈カート リッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して脱塩し、凍結乾燥した。収量は３２ｍｇ（５ ０％）であった。 実施例１３ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラ ジドとＥＰＯとの反応 本実施例は、５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１ ，６−ジヒドラジドとＥＰＯとの反応による５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノ コバラミンとＥＰＯとの複合体の生成を示す。 １ｍＬの２０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０中のＥＰＯ６ｍｇを、０．１ Ｍヨウ化ナトリウム０．３ｍＬで４℃で１０分間処理した。生成物を、０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにより溶離す ることによって緩衝液交換をした。溶離生成物を、０．２Ｍ酢酸ナトリウム５． ３ｍＬ中の５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６ −ジヒドラジド２．７ｍｇの溶液と一緒にし、次いで１０時間４℃で撹拌した。 未反応シアノコバラミンを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び１００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、ｐＨ７．０中でＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲでのゲルクロマトグ ラフィーにより分離した。ＨＰＬＣによる分析（方法３）により、５′−Ｏ−［ グルタロイル］シア ノコバラミンとＥＰＯとの複合体が、単一のピークとして溶出されたことが示さ れた。シアノコバラミンのＥＰＯに対するモル比は１．７６であった。 実施例１４ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラ ジドのＩＦＮ−ＣＯＮへの 複合 本実施例は、タンパク質のカルボン酸官能基の使用による、５′−Ｏ−［グル タロイル］シアノコバラミンとＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体の生成を示す。 ２ｍＬの１００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０中のＩＦＮ−Ｃｏｎ２ｍｇの 溶液を、（実施例１２に於けるようにして製造した）５′−Ｏ−［グルタロイル ］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラジド１．６ｍｇ及び１−（ ３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩１．９１ｍｇ と、４℃で１０時間反応させた。次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル） −３−エチルカルボジイミド塩酸塩３．８２ｍｇを添加し、同じ条件下で更に５ 時間反応を続けた。未反応のシアノコバラミンを複合反応生成物から、同じ緩衝 液中でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０でのゲルクロマトグ ラフィーにより分離した。ＨＰＬＣによる分析（方法２）により、得られた５′ −Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンとＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体が、１． ８のシアノコバラミンのＩＦＮ−Ｃｏｎに対するモル比で、二つの部分的に分割 されたピークとして溶出されたことが示された。 実施例１５ ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラ ジドとＥＰＯとの反応 本実施例は、ＶＢ₁₂誘導体のヒドラジジル官能基の使用による５′−Ｏ−［グ ルタロイル］シアノコバラミンとＥＰＯとの複合体の生成のための第二の方法を 示す。 ０．３６ｍＬの水中のＥＰＯ２ｍｇの溶液を、（実施例１２に於けるようにし て製造した）５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン−アジピン酸−１， ６−ジヒドラジド１．０７ｍｇ及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミド塩酸塩１ｍｇと、４℃で１５時間反応させた。未反応シア ノコバラミンを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び１００ｍＭ塩化ナトリウム、 ｐＨ７．０の緩衝液中でＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００でのゲルクロマトグラ フィーにより反 応生成物から分離した。反応生成物である５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコ バラミン−アジピン酸−１，６−ジヒドラジドとＥＰＯとの複合体のＨＰＬＣ分 析（方法３）により、この複合体が単一のピークとして溶出され、０．４４のシ アノコバラミンのＥＰＯに対するモル比を有していたことが示された。 分析手順及び試験方法 内因子結合親和力 ＶＢ₁₂と治療用タンパク質との複合体の内因子（ＩＦ）に対する結合親和力を 、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、５ ４巻、５９８〜６０８頁（１９７４年）にＭａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．により記 載されている手順に基づく競合結合アッセイを使用して測定した。このアッセイ は、ＩＦ及びシアノコバラミンを有しない、１ｍＭ塩化カルシウム、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム及び１重量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する燐酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ミ ズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中で行った。ブタＩＦ（最終濃度１．８４５ｎＭ ）を、ＰＢＳの６００μＬの最終体積中、 各種濃度（０．１２３ｍＭ〜１２．３ｎＭ）の⁵⁷Ｃｏ−シアノコバラミン、比活 性１０〜２０ｐＣｉ／μｇと共に、大過剰のＶＢ₁₂−タンパク質複合体（１２３ ｎＭ）に添加した。この溶液を撹拌し、室温で３０分間インキュベーションし、 その後新しく調製したデキストラン−被覆木炭（ＰＢＳ中木炭０．５重量％、デ キストラン０．１重量％）１ｍＬを４℃で添加した。１０分間インキュベーショ ンした後、ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ−８Ｒベンチトップ遠心分離機、ＶＷＲ Ｓｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄで 、１０００×Ｇ（２５００ｒｐｍ）及び４℃で、混合物を１５分間遠心分離した 。上澄み液を得られたペレットから傾瀉し、Ｃｏｂｒａ２０００ガンマ計数管（ Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、カリフォルニア州、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）で 分析して、結合した⁵⁷Ｃｏ−シアノコバラミンの量を決定した。 （結合した⁵⁷Ｃｏ−シアノコバラミンの遊離⁵⁷Ｃｏ−シアノコバラミンに対す る比）対（⁵⁷Ｃｏ−シアノコバラミンの結合濃度）を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａ ｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、５１巻、６６０〜６７２頁（１９４９年）の方法によってプロ ットした。５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミン及びそのタンパク質複 合体のブタＩＦに対する結合親和力を、下記の式を使用してＳｃａｔｃｈａｒｄ プロットの勾配から決定した。 −勾配＝−Ｋ_app＝−Ｋ_L／（１＋Ｋ_c［Ｌ_f］） （式中、 Ｋ_c＝複合体の結合親和力 Ｋ_L＝シアノコバラミンの結合親和力 ［Ｌ_f］＝未結合複合体の濃度 大過剰の複合体を使用することによって、［Ｌ_f］の値を一定値（１２３ｎＭ ）として取り扱うことが可能になった。６回のアッセイの平均から求めたＫ_Lの 値は、（６．０２±０．９０）×１０⁹Ｍであった。ＶＢ₁₂−Ｇ−ＣＳＦ複合体の試験管内生物学的活性 ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンに対して複合した後の試験管内 でのＶＢ₁₂−Ｇ−ＣＳＦの生体活性を、マウス骨髄細胞内への³Ｈ−チミジンの 試験管内刺激摂取を測定することによって決定した。 骨髄細胞を雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスの後脚から、骨をＰＢＳ でフラッシュすることによって捕集した。この細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ 密度勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１ ０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×最少必須培地（ＭＥＭ）アミノ酸、４０マイ クロモル（μＭ）の必須アミノ酸、０．０４重量％の重炭酸ナトリウム、１×Ｍ ＥＭビタミン溶液、１０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．００５重量％の硫酸ゲン タマイシンを含有するＭｃＣｏｙｓの５Ａ培地で培養した。５％二酸化炭素含有 雰囲気下で３７℃で２時間インキュベーションした後、非付着細胞を上澄み液中 に捕集し、目に見える細胞の数を血球計でカウントした。 １ミリリットル当たりＧ−ＣＳＦ０．０７〜１５００単位（Ｕ／ｍＬ）の範囲 に亘って、標準曲線を作成し、アッセイする前に錯体を約０．３〜３０Ｕ／ｍＬ に希釈した。９６ウエルプレートに、三重で、１００μＬの標準物質又は試験物 質及び１００μＬの４×１０⁴個の非付着マウス骨髄細胞を含有する培養基を添 加した。このプレートを５％二酸化炭素雰囲気下で３７℃で６８時間インキュベ ーションした後、０．５μＣｉのチミジン［メチル−３Ｈ］、２０Ｃｉ／ミリモ ル（ＮＥＮ）マ サチューセッツ州、ボストン）をそれぞれのウエルに添加した。このプレートを 前記のようにして更に５時間インキュベーションした。細胞を濾紙上に捕集し、 水（１０回）及びエタノール（１回）で濯ぎ、次いでベータプレートシンチレー ション計数管（ＬＫＢ）ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、モデル１ ２０５−００１）でＢｉｏｆｌｕｏｒシンチレーション流体中でカウントした。 単位／ミリグラム（Ｕ／ｍｇ）での試験物質の生体活性を、チミジン［メチル −³Ｈ］のＧ−ＣＳＦ刺激摂取の標準曲線から決定した。ＶＢ₁₂−ＥＰＯ複合体の生体内生物学的活性 ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンに複合した後のＥＰＯの造血活 性を、Ｎａｔｕｒｅ、１９１巻、１０６５〜１０６７頁（１９６１年）に記載の Ｃｏｔｅｓ ａｎｄ Ｂｉｎｇｈａｍの方法を使用して、脱低酸素（ｅｘｈｙｐ ｏｘｉｃ）赤血球増加症のマウスで生体内で決定した。 腹腔内（ｉ．ｐ．）注入の前の複合体の希釈は、サンプルのＡ₂₈₀から誘導さ れるタンパク質含有量を基準にした。ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の試験管内生物学的活性 ５′−Ｏ−［グルタロイル］シアノコバラミンに複合させた後のＩＦＮ−Ｃｏ ｎの試験管内生体活性を、培養細胞系内のウイルス複製の抑制の測定によって決 定した。 ＨｅＬａ細胞を９６ウエルプレートの中に１５，０００細胞／ウエルで入れ、 基本培地（１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイ シン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１重量％の非必須アミノ酸、０．１重量％の硫 酸ゲンタマイシン及び１％のＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの修 正イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で、１０％ＦＢＳと共に、５％二酸化炭素下で ３７℃で２４時間インキュベーションした。ＩＦＮ−Ｃｏｎは、基本培地及び０ ．２％ＦＢＳ中で４０〜０．０２ｎｇ／ｍＬ（４０，０００〜１９．５３単位） の範囲の多重希釈で調製した。それぞれの標準サンプル及び適当に希釈した試験 サンプル１００マイクロリットルをそれぞれのウエルに添加した。正（ＩＦＮ− Ｃｏｎ無し）及び負（ウイルス無し）対照の両方について、基本培地単独１００ μＬを添加した。更に１９〜２３時間インキュベーションした後、培地を吸引し 、チャレンジウイルス、即ち脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）１００μＬで、１％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中 で１００〜１０００組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）単位に等しい希釈で置き換え た。このプレートを更に約２２時間インキュベーションし、培地を除去し、細胞 を２００μＬの無水メチルアルコールで５分間固定した。 固定液を除去し、細胞を０．５％ゲンチアン染料中で３０分間染色し、次いで 遊離の染料を濯ぎ、０．５〜２時間空気乾燥した。染料を２００μＬのエチレン グリコールモノメチルエーテルで溶離し、３０分間振盪した。６５０ｎｍでの各 ウエルの吸光度を、Ｖｍａｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａ ｄｅｒ、モデル８８０２６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で決定した 。標準物質についての結果を、ＩＦＮ−Ｃｏｎの対数濃度対染料摂取のパーセン トとしてグラフにした。１０〜８３％染料摂取の間の曲線の直線部分の回帰分析 を行い、試験サンプルの生体活性を決定した。結果 実施例に従って製造したＶＢ₁₂とタンパク質との複合体を、ＶＢ₁₂輸送タンパ ク質である内因子（ＩＦ）に対するそれらの結合親和力及び上記の試験方法を使 用する生物学的活性について評価した。その結果を表１に示す。 表１に示したデータから、５−Ｏ′−グルタロイル基を介した複合体では、Ｉ Ｆ結合親和力が幾らか低下する結果になることが明らかである。しかしながら、 Ｋ_a値は大きいままである。タンパク質複合ＶＢ₁₂についてのＩＦの結合親和力 の範囲を表１に示す。最低のＫ_aは９．３×１０⁷Ｍ（実施例８）であり、ＰＥＧ 分子によるＩＦ結合の立体障害がこの損失の原因であろう。ＩＦについてのＶＢ₁₂ 結合親和力の最大の保持は、５．２×１０⁹Ｍ（実施例１３）であり、これは ＥＰＯ分子のシアル酸を介するＶＢ₁₂の複合である。これらの値は、それぞれ非 複合ＶＢ₁₂結合親和力の１．６％及び８７％の保持に相当し、タンパク質複合Ｖ Ｂ₁₂が尚も内因子に結合しているであろうことを示している。 ＶＢ₁₂複合Ｇ−ＣＳＦの試験管内生体活性が示され、Ｇ−ＣＳＦレセプターに 対して結合し、そうして応答を引き出すための複合体の能力を反映している。Ｖ Ｂ₁₂複合Ｇ−ＣＳＦの生体活性は３３％〜６０％の範囲である。以前の研究は試 験管内生体活性と生体内生体活性との部分的対応のみを示していた。しかしなが ら、殆どの場合に、試験管内で測定可能な活性を有するＧ−ＣＳＦは生体内で応 答を刺激することができる。 カルボキシ基（実施例１５）又はシアル酸基（実施例１３）を介するＥＰＯに 対する５−Ｏ′-［グルタロイル］シアノコバラミンの複合は、脱低酸素赤血球 増加症マウスアッセイで一貫して活性であった複合体を作った。この活性は３３ ％〜６３％の範囲であった。 同様の結果が、ＶＢ₁₂がアミン基（実施例４）又はカルボキシ基（実施例１４ ）を介して複合している、ＩＦＮ−Ｃｏｎの複合体について観察された。得られ た複合体は、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎに比較して２４〜２８％の活性を有し、ウイ ルス抑制研究で測定したものと非常に類似した活性を有していた。 前記の試験結果は、治療用タンパク質ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−Ｃｏｎ に対してＶＢ₁₂を複合化すると、生物学的に活性の分子が得られたことを示して いる。また、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体は完全にＩＦに結合することができる。 ＩＦ結合親和力の保持は、全ての経口ＶＢ₁₂−媒介送達の進展のために必須であ る。ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の生体内生物学的試験 動物へのＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合体の投与を含む追加の試験を以下に 記載する。使用した複合体は実施例１４のものであった。ＩＦＮ−Ｃｏｎ及びＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の放射性標識化 １個のヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州、Ｒｏ ｃｋｆｏｒｄ）を、メーカーの使用説明書に従って、１ミリリットル（ｍＬ）の ＰＢＳ［２５ミリモル濃度（ｍＭ）リン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウ ム、ｐＨ６．７］で予備洗浄した。次いでこのビーズを乾燥し、１００マイクロ リットル（μＬ）の０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液が入ったエッペンドルフ（ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に入れた。このビーズに、Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ、デラウエア州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎから得たＮａ¹²⁵Ｉ（担 体無し、比活性１００ｍＣｉ／ｍＬ）２５μＬを添加し、混合物を室温で５分間 インキュベーションさせた。ＰＢＳ中のＩＦＮ−Ｃｏｎ又はＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃ ｏｎ複合体１５０マイクログラムを、エッペンドルフ管に添加し、ゆっくり混合 し、次いで室温で１５分間インキュベーションした。１Ｍパラヒドロキシ安息香 酸塩３０マイクロリットルを、非標識¹²⁵Ｉを結合するために添加し、混合物を 更に１０分間氷上でインキュベーションした。¹²⁵Ｉ標識タンパク質と未結合¹²⁵ Ｉとの分離 を、ＰＢＳで予め平衡化したＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャ ージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）で行った。ＰＢＳ（５００μＬ）で溶離した 画分を捕集し、Ｃｏｂｒａ５０００ガンマ計数管（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ ｒｄ、イリノイ州、Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ）で放射性活性について評価し た。 標識タンパク質を含有する画分をプールし、４℃でＰＢＳ中で徹底的に透析し た。更なる未結合¹²⁵Ｉが除去されなくなるまで、透析液を連続的に¹²⁵Ｉについ てモニターした。放射性標識タンパク質と混合した遊離の¹²⁵Ｉの量を、トリク ロロ酢酸（ＴＣＡ）の最終６％溶液で沈殿させることによって決定した。非標識¹²⁵ Ｉの量は２％より少なく、ＩＦＮ−Ｃｏｎの量はＡ₂₈₀でのＵ．Ｖ．吸収によ り決定した。¹²⁵Ｉ標識ＩＦＮ−Ｃｏｎの比活性は３．０８×１０⁵ｃｐｍ／μｇ であり、¹²⁵Ｉ標識ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の比活性は４．６７×１０⁵ｃ ｐｍ／μｇであった。ＩＦＮ−Ｃｏｎ ＥＬＩＳＡ ９６ウエルプレートを、１５ｍＭの炭酸ナトリウム及び３５ｍＭの重炭酸ナト リウム、ｐＨ９．２中の１：１０００希釈し た、ＩＦＮ−Ｃｏｎに対するウサギ由来ポリクローナル抗体（Ａｍｇｅｎ Ｉｎ ｃ．カリフォルニア州、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ）１００μＬ／ウエルで被 覆した。被覆は、抗体と共に室温で２時間インキュベーションし、続いて４℃で 一晩インキュベーションすることによって行った。傾瀉した後、５％ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％のＮａＮ₃を含有するＰＢＳからなるブロッキ ング溶液３００μＬを、ウエル内で室温で１時間インキュベーションさせた。０ ．１％Ｔｗｅｅｎ２０と共に、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１３ｍＭのＥＤＴＡ及び ０．２５ｍＭのチメロソール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）を含有する５０ｍＭ Ｔ ｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ７．４からなるＴＮＥ緩衝液５０μＬを、標準サンプル又 は希釈サンプル５０μＬと一緒にウエルに添加した。標準曲線は、試験ラットに 投与したものに依存して、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ又はＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複 合体を使用するアッセイで作成した。次いでＥＩＡプレートを室温で２時間、３ ７℃で更に２時間インキュベーションした。傾瀉した後、プレートを標準洗浄溶 液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリ ーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０ −６３−００）で２回洗浄した。１０％ＦＢＳを含有するＴＮＥ緩衝液中に１： ４０００に希釈したＩＦＮ−Ｃｏｎに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｍｇ ｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ）を添加し、 サンプルを室温で一晩インキュベーションした。傾瀉した後、ＥＩＡプレートを ２回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と複合させた、ヤギ 由来抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディ アナ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を、１：２０００の希釈度で添加した。室 温で２時間インキュベーションした後、プレートを傾瀉し、４回洗浄した。次い でＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号５０−７６−００）１００μＬを添加 し、サンプルを室温で５分間インキュベーションした。１Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄１００μ Ｌを添加することによって反応を終結させ、吸光度を４５０ｎｍで測定し、６３ ０ｎｍでの吸光度に対して参照した。 （１）ラットへのＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の十二指腸内投与 それぞれ体重２５０〜３５０グラムの雄Ｓｐｒａｑｕｅ− Ｄａｗｌｅｙラットを、使用前に７日間隔離し、次いで５０ｍｇ／ｋｇのＮｅｍ ｂｕｔｏｌで腹腔内に麻酔した。胃を、剣状突起の直ぐ下で正中切開（約３〜４ ｃｍ）により露出した。幽門に対して１センチメートル離れた十二指腸内で巾着 縫合を行い、この縫合の中央を約２ミリメートル切開した。次いで１０センチメ ートルのシラスティックカテーテルを十二指腸内に８センチメートル進ませ、カ テーテルも閉じられないように注意しながら巾着縫合を閉じることによって所定 の位置に固定した。 腸からの最適摂取を確保するために、試験サンプル８〜９μＬ／時を注入する ために２４時間かけてＡｌｚｅｔミニ浸透ポンプ、モデル２００１Ｄからの低速 放出を使用した。ポンプには無菌状態でＰＢＳ２２１μＬで表示される全用量を 予め充填しておき、カテーテルの自由端に取り付け、腹膜腔内に置いた。放射性 標識試験サンプルを下記のように配合した。グループ１（ＩＦＮ−Ｃｏｎ、対照） １０μｇ／ｋｇ（９．３×１０⁵ｃｐｍ／ラット）で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ＋０ ．１％ラットアルブミングループ２（ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体） １０μｇ／ｋｇ（１．４×１０⁶ｃｐｍ／ラット）で¹²⁵Ｉ−ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃ ｏｎ＋０．１％ラットアルブミン 手術の終わりに、腹膜を各場合にランニングシルク縫合で閉じ、皮膚切開を創 クリップで閉じた。次いでラットをそれが麻酔から覚めるまでウォーミングパッ ドの上に置いた。 イソフルオラン麻酔を使用して尾静脈から血液サンプルを取り出した。全放射 性活性の量を、ガンマ計数管を使用してそれぞれの血液サンプルについて決定し た。血漿サンプルも、エッペンドルフ遠心分離機で、１２，０００ｒｐｍ、１１ ７５０×ｇで１５分間分間遠心分離することによって調製し、ＴＣＡ沈殿性カウ ント（ＴＣＡの最終６％溶液）の数を血漿中で決定し、血漿中で変化していない ＩＦＮ−Ｃｏｎに関連する放射性活性の量を評価した。 図７の結果は、全ＣＰＭから決定したときの、全血、即ち血漿及び血球中に存 在するＩＦＮ−Ｃｏｎの量を表している。¹²⁵Ｉ−標識ＩＦＮ−Ｃｏｎの幾らか は、幾らかの細胞の上に存在するレセプターに結合するかもしれない。しかしな がら、全てのカウントが変化していないタンパク質に関連していたと しても、決定することは不可能であった。この理由のために、十二指腸内注入の 後のＴＣＡ沈殿性タンパク質の血漿レベルの比較を図８に示す。このデータを見 ると、ＶＢ₁₂複合タンパク質の血漿レベルが、非複合ＩＦＮ−Ｃｏｎに比べて増 加したことがわかる。十二指腸内への２４時間注入期間の間に、ＶＢ₁₂複合タン パク質は、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎについてよりも殆ど２倍大きい血漿レベルに達 した。この注入期間の間にタンパク質は定常状態に達しなかったが、その代わり 時間の経過と共に循環内に蓄積していると思われることは幾らか驚くべきことで ある。そうしてＶＢ₁₂とＩＦＮ−Ｃｏｎとの複合により、消化管からのタンパク 質の全身への送達が増大した。 ＩＦの存在がＶＢ₁₂の増加した摂取になるか否かを決定するために、３種の異 なった送達経路を使用する、ラットへの⁵⁷Ｃｏ−ＶＢ₁₂とＩＦとの共投与を使用 した。幾匹かの試験ラットに、十二指腸内ポンプ注入方法の手段により放射性標 識ＶＢ₁₂を与えた。試験ラットの別の群には、十二指腸内ボーラスとして⁵⁷Ｃｏ −ＶＢ₁₂を与えた。これは、前記の同じ十二指腸内投与手順を使用して行った。 適応は次の通りであった。カ テーテルの端部に接続した管アダプターを有する１立方センチメートルの注射器 を使用して、サンプルをＰＢＳ２００μＬで十二指腸内に注射し、カテーテルを 取り出し、縫合をきつく閉じた。他の試験ラットには経口胃管栄養供給により投 与した。共投与のために設計されたこれらの試験群のために、チャイニーズハム スター卵巣細胞内で作られたラットＩＦ（ｒｒＩＦ）の組換え型を使用した。こ れらの生体内研究の前のｒｒＩＦの結合分析によって、この輸送タンパク質が活 性であったことが示された。ｒｒＩＦの結合親和力（Ｋａ）は８．５８×１０⁹ Ｍ^-1であると計算された。この値は自然のヒトＩＦのもの、２×１０¹⁰Ｍ^-1と同 様であった［Ｓｔｕｐｐｅｒｉｃｈ，Ｅ．ａｎｄ Ｎｅｘｏ，Ｅ．、Ｅｕｒｏｐ ｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９巻、２９９ 〜３０３頁（１９９１年）参照］。このデータは、ｒｒＩＦが臨床設定でブタ又 はヒトＩＦで期待される結果の良好な指標であることを示した。動物を代謝ケー ジの中に収容し、非吸収⁵⁷Ｃｏ−標識ＶＢ₁₂の量を決定するために４８時間に亘 って糞便を集めた。６個の試験群を下記のようにして評価した。 その結果を図９に示す。これからわかるように、胃腸管へのＶＢ₁₂の投与の最 善の方法は、外因性ＩＦの存在下で摂取が僅かに増加する十二指腸内注入を経る ものであると思われる。ＩＦの含有は経口ガバージュにより供給されたこれらの 動物について最も小さい効果を有していた。ＩＦの最大の効果は十二指腸内ボー ラスによる投与で生じた。ここで、ＩＦの含有は経口ガバージュ供給で得られる ものと同様のレベルに対して殆ど３倍高い摂取になったけれども、ＶＢ₁₂の摂取 はＩＦ無しでは非常に劣っていた。これらの結果は、ＩＦの含有がＶＢ₁₂−タン パク質複合体の摂取を増強できることを示唆している。この ことは、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体の放出が小腸内で起こり、胃内では起こらな い腸皮膜を含む組成配合物について特に適しているであろう。 （３）ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−ＣｏｎとＩＦとの複合体 十二指腸内ポンプ注入生体内モデルを使用して、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ又はＶ Ｂ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎを、生きた健康なラットに２４時間かけて投与した。用量 は各場合にＰＢＳ中で５００μｇ／ｋｇであった。内因子の吸収増強効果がある かを評価するために、第三群のラットに組み替え体ラットＩＦ（３ｍｇ／ｋｇ又 は１ｍｇ／ラット）をＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎと一緒に与えた。最初の二つの試 験群には、１個のＡｌｚｅｔミニ浸透ポンプを使用して投与した。第三の試験群 には、１個のＡｌｚｅｔミニ浸透ポンプにＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎを入れ、他の Ａｌｚｅｔミニ浸透ポンプに組換え体ラットＩＦを入れることによって投与した 。二つのポンプを、２センチメートルのカテーテルを介して３方向配管アダプタ ーに接続した。このようにして、それを十二指腸に入れる前に、この２種の物質 を予備混合した。次いで、ＩＦＮ−Ｃｏｎのレベルを決定するために、試験動物 から採取した血清について ＥＬＩＳＡを行った。血漿サンプルを微小容器血清分離器チューブ（Ｂｅｃｔｏ ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．、ニュージャージー州、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌ ａｋｅｓ）に集め、分析するまで−８０℃で貯蔵した。ＡＵＣ分析を、研究を開 始した後７２時間まで行った（ＡＵＣ₇₂）。その結果を図１０に要約する。 これからわかるように、ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体についてのＡＵＣ₇₂は 、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎの１０倍まで増加した。ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎと組換 え体ラット内因子との組合せ物を与えられた動物では、それらの血清中のＩＦＮ −Ｃｏｎレベルが大きく上昇し、特に、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎの３６倍の増加及 びＩＦを含有しないＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎの４倍の増加であった。これらのデ ータは、もう一度、ＶＢ₁₂−タンパク質複合体が非複合タンパク質に比較したと き増強された腸摂取を有することを示す。また、ＶＢ₁₂ベース送達システムの摂 取容量は、輸送タンパク質であるＩＦの含有によって大きく増強される。 （４）ラットへのＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の静脈内投与 Ａ）薬物動力学 留置カニューレを体重２５０グラムの雄Ｓｐｒａｑｕｅ− Ｄａｗｌｅｙラットの右頚静脈内に埋没し、試験動物を試験サンプルの投与の前 １日間回復させた。カニューレを毎日２回ヘパリン３０Ｕ／ｍＬを含有する食塩 水１００μＬで洗った。３匹のラットを１群とする２群のラットを使用し、これ に下記の配合物を陰茎静脈から投与した。グループ１（ＩＦＮ−Ｃｏｎ、対照） ８．２μｇ／ラット又は３３μｇ／ｋｇで¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ；比活性４８ ６ｃｐｍ／ｎｇ又は４．０×１０⁶ｃｐｍ／ラット；注射の体積＝１２０μＬ／ ラットグループ２（ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体） ０．４μｇ／ラット又は１．６μｇ／ｋｇで¹²⁵Ｉ−ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ； 比活性１１７０ｃｐｍ／ｎｇ又は４．０×１０⁶ｃｐｍ／ラット；注射の体積＝ １００μＬ／ラット 全てのサンプルはＰＢＳ中で配合した。留置カニューレを通して血液サンプル を集め、各サンプルの放射性活性の量をＣｏｂｒａ５０００ガンマ計数管（Ｐａ ｃｋａｒｄ）で決定した。 Ｂ）生体分布 陰茎静脈内への下記の組成物を静脈内投与後生体分布分析を するために、３個の時点、即ち５分、６０分及び６時間を選択した。グループ１（ＩＦＮ−Ｃｏｎ、対照） ４．０μｇ／ラット又は１６μｇ／ｋｇで¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ；比活性４８ ６ｃｐｍ／ｎｇ又は２．０×１０⁶ｃｐｍ／ラット；注射の体積＝１００μＬ／ ラットグループ２（ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体） ４．０μｇ／ラット又は１６μｇ／ｋｇで¹²⁵Ｉ−ＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ；比 活性５００ｃｐｍ／ｎｇ又は２．０×１０⁶ｃｐｍ／ラット；注射の体積＝１０ ０μＬ／ラット 動物を殺した後、生命を維持する器官を取り出し、全器官又は重要な部分をガ ンマ計数管でカウントし、次いでその結果を器官の全重量について補正した。血 液中のＩＦＮ−Ｃｏｎの全量の概算のために、全血１ミリリットルをカウントし 、１７ミリリットルの全体積を２５０グラムの体重のラットについて推定した。 消化管に関連し得るＩＦＮ−Ｃｏｎのレベルを決定するために、十二指腸の１０ センチメートル部分を取り出し、ガンマ計数管でカウントした。結果 図１１に示す薬物動力学研究の結果は、記載した用量でのラットの二つの試験 群の循環血液中の自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ及びＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体の性 質の間には非常に僅かしか差異が存在しないことを明らかにしている。複合体の 血液レベルはＩＦＮ−Ｃｏｎ単独よりもゆっくり清掃されると思われるけれども 、両物質は投与後約１時間以内に循環から清掃された。 生体分布研究の結果（図１２及び１３）は特に興味がある。薬物動力学研究で のように、自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ（図１２、パネルＡ）とＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏ ｎ複合体（図１２、パネルＢ）との間の循環レベルに於いて非常に僅かしか差異 が存在しなかった。肝臓及び腎臓への分布は、タンパク質上のＶＢ₁₂の存在によ って最も影響を受けた。特に、肝臓は自然のＩＦＮ−Ｃｏｎに比較して明らかに 上昇した複合体のレベルを有しており、わずか５分後に１．５倍増加した。この 増加は投与後１時間で一層顕著になった（３倍の増加）。６時間後に差は無かっ た（図１２及び図１３）。 腎臓内の自然のＩＦＮ−Ｃｏｎ及び複合ＩＦＮ−Ｃｏｎの分 布（図１２）は、ちょうど逆であることがわかった。体からのＩＦＮ−Ｃｏｎの 除去の主な経路は糸球体濾過によるものであり、このプロセスはＶＢ₁₂の存在に よって抑制されることが明らかであろう。この現象はまた、何故複合体の循環レ ベルがこの研究に於いて自然のＩＦＮ−Ｃｏｎについてよりも一般的に高かった かを説明するであろう。 これらの結果は、典型的に肝臓に影響を与える肝炎のようなウイルス性感染を 治療する際にＶＢ₁₂−ＩＦＮ−Ｃｏｎの利用の点で重要な関係を有している。肝 臓に対する複合体の増加した送達（本研究に於いて殆ど３倍である）のために、 複合体は、その器官でのＩＦＮ−Ｃｏｎの効能を増加させることによって一層有 効な治療薬であることを証明することができる。この可能性は経口送達ＶＢ₁₂− ＩＦＮ−Ｃｏｎ複合体について特に重要である。最初の通過代謝は、消化管から の全ての吸収が最初に肝臓を通り抜け、その後体中に分布されることを指令する 。ＶＢ₁₂はこのような分布を阻止し、経口送達された複合体を肝臓に送達させる ことを助けることができると思われる。この効果は、肝炎を治療するように設計 された治療で特に重要であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キンストラー，オラフ・ボリス アメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、 サウザンド・オークス、セント・チヤール ズ・ドライブ・887、ナンバー・21 (72)発明者 ピツト，コリン・ジエフリイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91361、 サウザンド・オークス、リーワード・サー クル・2379

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 治療用タンパク質が、ビタミンＢ₁₂のリボース単位の第一級（５′）ヒド ロキシル基に共有結合している、ビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的 活性複合体。 ２． 式： （式中、Ｒは、 （１）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （２）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₁₂−ＮＨＣＯＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓ −Ｒ₃（式中、Ｒ₃はタンパク質である）又は （３）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₇ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパ ク質である）又は （４）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮＨＲ₁（式 中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （５）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮ＝Ｒ₄（式 中、Ｒ₄はタンパク質である） であり、そして ｎは１〜１２の整数である）。 を有する請求の範囲第１項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的 活性複合体。 ３． 治療用タンパク質がエリトロポイエチンである請求の範囲第１項記載のビ タミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活性複合体。 ４． 治療用タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求の範囲第１項記載 のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活性複合体。 ５． 治療用タンパク質がコンセンサスインターフェロンである請求の範囲第１ 項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活性複合体。 ６． 治療用タンパク質が組換え手段によって作られる請求の範囲第２項、第３ 項、第４項又は第５項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活性 複合体。 ７． 請求の範囲第１項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活 性複合体及び薬物的に許容される担体を含む医薬組成物。 ８． 血流に生物学的活性量の治療用タンパク質を送達するために、哺乳類の消 化管で摂取され且つ消化管を介して輸送され得る請求の範囲第７項記載の医薬組 成物。 ９． 下記の工程： ａ）リボース単位の第一級（５′）ヒドロキシル基を化学的に反応性のカルボ キシル基に変換することによってビタミンＢ₁₂の化学的に反応性の誘導体を形成 する工程、 ｂ）任意に、リボース単位の化学的に反応性のカルボキシル基を、治療用タン パク質に共有結合させることができる他の官能基に変換する工程、 ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）のビタミンＢ₁₂誘導体を治療用タンパク質と反 応させて、ビタミンＢ₁₂と前記タンパク質との生物学的活性複合体を形成する工 程、及び ｄ）この複合体を回収する工程 からなる、請求の範囲第１項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学 的活性複合体の製造方法。 １０． 工程（ａ）に於いて、ビタミンＢ₁₂をグルタル酸誘導体と反応させて、 ビタミンＢ₁₂の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体を形成する請求の範囲第９項記載 の方法。 １１． 工程（ｂ）に於いて、工程（ａ）からのビタミンＢ₁₂の５′−Ｏ−グル タロイル誘導体をアシル化剤に変換する請求の範囲第１０項記載の方法。 １２． ビタミンＢ₁₂の５′−Ｏ−グルタロイル誘導体を、混合酸無水物、酸ハ ライド又は活性化エステルに変換する請求の範囲第１１項記載の方法。 １３． 活性エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステルである請 求の範囲第１２項記載の方法。 １４． 工程（ｃ）をカルボキシル基活性化剤の存在下で行う請求の範囲第９項 記載の方法。 １５． （１）治療用タンパク質がビタミンＢ₁₂のリボース単位の第一級（５′ ）ヒドロキシル基に共有結合している、ビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生 物学的活性複合体及び（２）吸収増強量のヒト内因子を含む医薬組成物。 １６． ビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的活性複合体が、式： （式中、Ｒは、 （１）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （２）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₁₂−ＮＨＣＯＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓ −Ｒ₃（式中、Ｒ₃はタンパク質である）又は （３）ＣＯ−（ＣＨ₂）n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）₇ＣＯＲ₁（式中、Ｒ₁はタンパ ク質である）又は （４）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮＨＲ₁（式 中、Ｒ₁はタンパク質である）又は （５）ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨＮ＝Ｒ₄（式 中、Ｒ₄はタンパク質である） であり、そして ｎは１〜１２の整数である）。 を有する請求の範囲第１５項記載の医薬組成物。 １７． 治療用タンパク質が、エリトロポイエチン、顆粒状コロニー刺激因子及 びコンセンサスインターフェロンからなる群から選択される請求の範囲第１５項 記載の医薬組成物。 １８． 請求の範囲第１項記載の複合体の形でタンパク質を投与することからな る、経口的に投与された治療用タンパク質に対する哺乳動物の応答を増強させる 方法。 １９． 複合体を内因子と共に投与する請求の範囲第１８項記 載の方法。 ２０． 哺乳動物がヒトである請求の範囲第１８項又は第１９項記載の方法。 ２１． 請求の範囲第１項記載のビタミンＢ₁₂と治療用タンパク質との生物学的 活性複合体を使用することからなる、経口投与によって肝臓に治療用タンパク質 を送達する方法。 ２２． 治療用タンパク質がコンセンサスインターフェロンである請求の範囲第 ２１項記載の方法。 ２３． ヒトへの生体内投与を含む請求の範囲第２１項又は第２２項記載の方法 。