BG108274A - Конюга'и о' хидрок'иалкил'корбяла (has) и ак'ив...н ингр...ди...н' - Google Patents

Конюга'и о' хидрок'иалкил'корбяла (has) и ак'ив...н ингр...ди...н' Download PDF

Info

Publication number
BG108274A
BG108274A BG108274A BG10827403A BG108274A BG 108274 A BG108274 A BG 108274A BG 108274 A BG108274 A BG 108274A BG 10827403 A BG10827403 A BG 10827403A BG 108274 A BG108274 A BG 108274A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
active ingredient
mol
hes
conjugate
group
Prior art date
Application number
BG108274A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Sommermeyer
Wolfram Eichner
Sven Frie
Cornelius Jungheinrich
Roland Scharpf
Katharina Lutterbeck
Original Assignee
Fresenius Kabi Deutschland Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7677789&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG108274(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Fresenius Kabi Deutschland Gmbh filed Critical Fresenius Kabi Deutschland Gmbh
Publication of BG108274A publication Critical patent/BG108274A/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A61P23/02—Local anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

Област на техниката
Настоящото изобретение се отнася до съединения, състоящи се от конюгат от хидроксиалкилскорбяла (HAS) и активен ингредиент, в които хидроксиал кил скорбялата е свързана към активния ингредиент или директно, или през свързващо звено. Изобретението допълнително се отнася до процеси за получаването на ковалентен конюгат от HAS-активен ингредиент, в които HAS и активен ингредиент взаимодействат един с друг в реакционна среда, при което реакционната среда е вода или смес от вода с органичен разтворител, имаща поне 10 тегл.% вода. Изобретението допълнително се отнася до медицинското използване на конюгатите.
Предшестващо състояние на техниката
Клиничното използване на много активни ингредиенти на фармацевтични препарати е неблагоприятно повлияно от множество проблеми (сравни Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 9 (3, 4), (1992) pp. 249 - 304). Парентерално прилагани природни протеини са обект на екскретиране например от ретикулоендотелиалната система, черния дроб, бъбрека и далака. Екскретирането зависи от натоварването на въглехидратните вериги, присъствието на клетъчни рецептори за протеина и формата и размера на молекулата. Границата на екскретиране на гломеруларното филтриране от бъбрека е например приблизително 67 kD.
Като резултат от протеолитично разграждане, може да бъде наблюдавана бърза загуба на биологична активност.
Протеини, експресирани от бактерии, а така също други рекомбинантни протеини, могат да имат увеличена имуногенност и да предизвикват опасни за живота реакции на свръхчувствителност.
Съответните реакции по естествен път предотвратяват медицинското използване на тези продукти.
По тази причина, от преди края на 70-те години системно са били провеждани изследвания в тази област за подобряване свойствата на екзогенни протеини чрез химично модифициране, по-специално полимеризация или свързване към макромолекулни полимери. Много проекти бяха концентрирани върху получаването на конюгати от протеини или други активни ингредиенти от една страна, и полиетиленгликол (PEG) от друга (сравни US 4 179 337). Предимствата, очаквани от съответните реакции на свързване, включват подобрен in vivo период на полуизвеждане на протеините, намалена токсичност, подобрена стабилност и подобрена разтворимост на активните ингредиенти (Abuchowski and Davis, Enzymes as drugs, Holcenberg and Rubberts, Publisher, pp. 367 - 383, John Wiley & Sons N.Y. (1981)).
Процесът на свързване на активните ингредиенти, доказан, че е проблематичен, тъй като активната група на протеина бе инактивирана чрез свързване към PEG или чрез взаимодействията, не осигуряваше реакционния продукт с подходящ добив. За постигане на специфично свързване, което не повлиява неблагоприятно активността на активния ингредиент, в PEG бяха въведени активни групи или активния ингредиент или съединения бяха свързани със свързващо звено. За тази цел, PEG по правило е с активна група, която впоследствие се свързва ковалентно към група на протеин, способна да бъде свързана.
Така например, описана бе загубата на свързваща активност на антитела и техните фрагменти след тяхното свързване към PEG (Kitamura et al., Cancer Res., Vol. 51 (1991), pp. 4310 - 4315; и Pedley, et al., Br. J. Cancer, Vol. 79 (1994), pp. 1126 - 1130). За разрешаване на този проблем Chapman et al. (Nature Biotech., Vol. 17 (1999), pp. 780 - 783) предлагат свързването на PEG към определени региони на свързване на антитялото.
Загубата на активност на свързващия партньор е описана също в
WO 95/13090. Като решение е предложено да се активира PEG с реактивоспособна група и да се свърже PEG към α-интерферон в присъствието на повърхностно-активно вещество посредством тази реактивоспособна група. Като предпочитана реактивоспособна група е цитиран N-сукцинамиден карбонат, за който е казано, че образува уретанова връзка с ε-аминогрупата на лизина, при назованите условия.
WO 96/41813 също разкрива процеси за получаването на полимерполипептиден конюгат, в който полимерът (по-специално PEG) е изменен в специфична област и после свързан към полипептид. За предпочитане амино-окси-ацетилна група е въведена в PEG и това съединение след това е свързано към полипептид, по-специално към IL-8, hG-CSF и IL-1.
Така, в литературата има множество примери на съответните конюгати; сравни PEG-инсулинови конюгати в US 4 179 337, конюгати на PEG-говежди хемоглобин в US 4 412 989, PEG-рибонуклеазни конюгати и PEG-супероксид дисмутазни конюгати във Veronese et. al., Applied Biochem. Biotech., Vol. 11, 141 - 152 (1995), PEG-IL-2 конюгати или PEGIFN-β конюгати в US 4 766 106, PEG-полимуксинови конюгати в WO 90/15628 и PEG-IL-2 конюгати в WO 90/07939. Някои конюгати сега са известни в клиничното приложение. Например, свойствата на ензима аспарагиназа бяха подобрени чрез образуването на конюгат с PEG, и PEGаспарагиназен конюгат е търговски наличен под търговската марка Oncaspar® за терапия на рак. Напоследък, PEG-свързан G-CSF бе одобрен от Агенцията за храни и лекарства на САЩ (Pegfilgastim). Голям брой от други “пегилирани” продукти са в различни фази на клинично разработване, например PEG-CDP870, PEG-Dronabinol, и т.н. (сравни PEGверигата при www.enzon.com или www.inhale.com).
Не само протеини, но и други съединения бяха също свързани към PEG и други полимери съгласно тази схема. WO 97/33552 и WO 97/38727 разкриват например свързването на паклитаксел към PEG и използването на конюгата за лечението на тумори. Използването на PEG-камптотецинов конюгат за лечението на тумори е било изучавано от Enzon във фаза I на клинични изпитания.
Антибиотици също са били свързвани към PEG. Dowling и Russell например, описват фармакокинетиките на окситетрациклин-PEG конюгат (J. Vet. Pharmacol. Ther., vol. 23 (2000), 107 -110). В предшестващото състояние на техниката, антибиотиците също са били видоизменяни с използване на други методи, за да се получат нови функции. Например бе продуциран депо пеницилин, който е прокаин-пеницилиново производно, т.е., сол на пеницилина с прокаиновата база. Това производно има удължена активност и е използвано например в терапията на сифилис.
Реакции на свързване с повече от две съединения също са били демонстрирани. Например, WO 93/23062 разкрива получаването на свързан продукт от антитяло насочено срещу В - клетъчна лимфома, активиран PEG и токсин.
Конюгатите от PEG-акгивен ингредиент обаче, нямат природна структура, за която да са били описани in vivo пътища за разлагане. Между другото по тази причина в допълнение към PEG конюгатите са били а произведени други конюгати и протеинови полимери, за разрешаване на по-горе назованите проблеми. Така, има множество процеси за напречно омрежване на различни протеини и свързване на протеини към макромолекули (сравни резюмето в Wong, S.S., Chemistry of protein conjugation and cross linking, CRCS, Inc. (1993)).
Хидроксиетилскорбялата (HES) е производно на природно срещащ се амилопектин и се разрушава в тялото от α-амилаза. Получаването на HES-протеинови конюгати вече е било описано в предшестващото състояние на техниката (сравни HES-хемоглобинови конюгати в DE 26 16 086 или DE 26 46 854).
Хемоглобинът е протеин, който би могъл да бъде от голяма клинична важност като средство за заместване на кръв и пренасяне на кислород (тъй наречения кислороден преносител на база хемоглобин, НВОС).
Обаче, въпреки че търсенето за такъв продукт бе признато още в началото (сравни Rabiner, J. Exp. Med. 126. (1967) 1127), никой от известните НВОС продукти не е получил до сега статуса на одобрено лекарство.
Природният хемоглобин се състои от две а и β пептидни вериги, всяка от които свързва хема като простетична група. Изолираните хемоглобинови молекули обаче са много нестабилни и бързо се разрушават до по-стабилните α, β димери (MW 32 kDa). Биологичният полу-период на съществуване на изолиран хемоглобин в кръвообращението е приблизително 1 час, тъй като димерите бързо се отделят през бъбреците. В този процес димерите продуцират нефротоксични странични ефекти (сравни Bunn & Jandl, J. Exp. Med. 129. (1967) 925 - 934). Работата по разработването на видоизменени хемоглобинови молекули следователно бе насочена главно към вътрешномолекулното напречно омрежване на хемоглобин, вътрешномолекулно напречно омрежване до образуване на полимерни НВОС форми и/или свързването към полимери.
Известните хемоглобинови конюгати са описани например в Xue и Wong (Meth, in Enzymol., 231 (1994), pp. 308 - 322) и в DE 26 16 086 и DE 26 46 854. Последният разкрива процеси, чрез които хемоглобинът се свързва към HES най-напред чрез взаимодействие на HES с натриев перйодат. Образуват се диалдехиди, към които се свързва хемоглобинът. От друга страна, DE 26 16 086 описва свързването на хемоглобин към HES съгласно процес, в който първо, напречно-омрежващ агент (напр. бромциан) се свързва към HES и след това хемоглобинът се свързва към междинния продукт.
HES е заместено производно на въглехидратния полимер амилопектин, който се среща в царевичното нишесте в концентрация от до 95 %. HES има изгодни реологични свойства и понастоящем е използван в клиниката като обемно-заместващо средство и за хеморазреждаща терапия (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, Vol. 8(8), (1987), pp.
271 - 278; и Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, (1991) 494 498).
Амилопектинът се състои от глюкозни единици, в които главните вериги имат а-1,4-гликозидни връзки, а а-1,6-гликозидни връзки присъстват в местата на разклоняване. Физико-химичните свойства на тази молекула се определят съществено от типа на гликозидните връзки. Поради разклонената а-1,4-гликозидна връзка се образуват спираловидни структури с приблизително 6 глюкозни мономера на навивка.
Физико-химичните и биохимични свойства на полимера могат да бъдат модифицирани чрез заместване. Въвеждането на хидроксиетилова група може да бъде постигнато чрез алкално хидроксиетилиране. Различната реактивоспособност на съответната хидроксилна група в незаместения глюкозен мономер по отношение на хидроксиетилирането може да бъде използвана чрез реакционните условия, и така е възможно ограничено въздействие върху схемата на заместване.
Следователно HES по същество се характеризира посредством разпределение на молекулното тегло и степен на заместване. Степента на заместване може да бъде описана като DS степен на заместване, която се отнася до пропорцията на заместените глюкозни мономери от всички глюкозни единици, или като MS (моларно заместване), което дава броя на хидроксиетиловите групи за глюкозна единица.
HES разтворите се явяват като полидисперсни състави, в които индивидуалните молекули се различават една от друга по отношение степента на полимеризация, броя и подреждането на местата на разклоняване, а така също тяхната схема на заместване. Така, HES е смес от съединения с различни молекулни тегла. Съответно, специфичен HES разтвор се определя чрез средното молекулно тегло, като се използват статистически променливи. Мп се изчислява като просто средноаритметично, по отношение на броя от молекули (средно число), докато Mw, средното тегло, представлява измерена променлива, свързана с масата.
До сега обаче селективното химично свързване на протеини към HES бе спъвано от факта, че HES не е активирана селективно. Така известните от предшестващото състояние на техниката протеин-HES конюгати, са резултат от не-селективно свързване на активирана с бромциан HES към хемоглобин (сравни DE 26 16 086). Съответните процеси могат да доведат до полидисперсни продукти с не еднородни свойства и потенциално токсични странични ефекти.
Един процес бе разкрит първи от Hashimoto (Hashimoto et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern, Vol. 9, (1992) pp. 1271 - 1279), в който редуциращата алдехидна крайна група на един захарид селективно е окислена и е получен реактивоспособен естер (лактон).
На базата на този процес, WO 98/01158 разкрива, че могат да бъдат получени конюгати от хемоглобин-хидроксиетилскорбяла, в които хемоглобинът и HES са свързани селективно един с друг през амидни връзки между свободни аминогрупи на хемоглобина и редуциращата крайна група на HES, присъстваща в окислена форма. И процесът, описан в Hashimoto et al., и процесът съгласно WO 98/01158, обаче са базирани на взаимодействие между захарид (HES) и протеин (хемоглобин) в органичен разтворител. В публикацията фактически е използван диметилсулфоксид (DMSO).
Специалистът с обичайни умения в областта е осведомен за факта, че много протеини са обект на промяна в структурата в органични разтворители, които не се променят във воден разтвор. Нормално, настъпва загуба на активност с промяната в структурата. Във всеки случай е необходимо скъпото отстраняване на органичния разтворител, тъй като даже остатъчни части от органичните разтворители могат да не бъдат приемливи за целеното медицинско използване. Дори потенциалната опасност от онечиствания и промяна в структурата на протеините трябва да бъде изключена, що се отнася до целеното използване.
Същност на изобретението
Така цел на настоящото изобретение е да осигури подобрени конюгати от хидроксиалкилскорбяла-активен ингредиент и процеси за тяхното получаване, които водят до биологично активни конюгати, които могат да бъдат използвани във всекидневната клинична практика. Допълнителна цел на настоящото изобретение е да осигури процес за получаването на конюгати от хидроксиалкилскорбяла-активен ингредиент, в който не се получават странични продукти в значителни количества, тъй като тези странични продукти също повлияват неблагоприятно последващото пречистване на продукта до значителна степен.
Тази цел сега изненадващо бе решена чрез съединения, състоящи се от конюгат от хидроксиалкилскорбяла и активен ингредиент, в който хидроксиалкилскорбяла е ковалентно свързана към активния ингредиент или директно, или през свързващо звено. Съответните конюгати HASактивен ингредиент могат например да бъдат получени чрез процеси, в които се свързват HAS и активен ингредиент в реакционна среда, при което реакционната среда е вода или смес от вода с органичен разтворител, която съдържа поне 10 тегл.% вода.
Изобретението допълнително се отнася до процеси за получаването на ковалентен конюгат от НAS-активен ингредиент, в които HAS и поне един активен ингредиент се свързват във водна реакционна среда и се характеризират с това, че реакционната среда е вода или смес от вода с органичен разтворител, който съдържа поне 10 тегл.% вода.
HAS за предпочитане е окислена преди свързването към активния ингредиент, като особено предпочитано е специфично окисление на редуциращите крайни групи. Алтернативно, свързването може да стане чрез образуването на Шифова база между HAS и активен ингредиент, носещ амино група като междинен продукт. Този междинен продукт след това се редуцира, което води до образуването на метиленова амино група.
Кратко пояснение на приложените фигури
Фигура 1 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HAS, съгласно процес A. Ill;
Фигура 2 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HSA съгласно процес A. IV;
Фигура 3 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HSA съгласно процес A.V и с реакционно време от 2 часа;
Фигура 4 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HSA, процес A.V, реакционно време една нощ;
Фигура 5 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 10 kD и HSA съгласно процес A.V, след 2 часа (Фигура 5а) и една нощ (Фигура 5Ь);
Фигура 6 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HSA съгласно процес A.VII, след 24 часа реакционно време;
Фигура 7 GPC хроматограма на реакция на свързване между охHES 130 kD и HSA съгласно процес B.V;
Фигура 8 SDS-PAGE и Western Blot на различни реакции на свързване между HES и HSA;
Фигура 9 SDS-PAGE и Western Blot на различни реакции на свързване между HES и HSA;
Фигура 10 реакционна схема за получаването на един HES-ДНК конюгат;
Фигура 11 изображение на гел, показващ HES-ДНК конюгата преди и след усвояване с рестрикционен ензим.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение осигурява за пръв път съединения, състоящи се от конюгат от хидроксиалкилскорбяла и активен ингредиент, в който хидроксиалкил скорбялата е ковалентно свързана към активния ингредиент или директно, или чрез свързващо звено. Настоящото изобретение допълнително осигурява конюгати от HAS-активен ингредиент, които могат да бъдат получени с процеси, в които HAS и поне един активен ингредиент взаимодействат един с друг във водна реакционна среда. Процесите допълнително се характеризират с това, че реакционната среда е вода или смес от вода с органичен разтворител, който съдържа поне 10 тегл.% вода.
В контекста на настоящото изобретение, едно химично съединение се означава като активен ингредиент, ако съединението е подходящо да бъде активен компонент на какъвто и да е състав за терапевтични или диагностични цели. За предпочитане, активният ингредиент е активен компонент на лекарство, т.е. съединението в лекарствена формулировка, което постига физиологичен ефект след прилагане на субект.
Един преглед на одобрените лекарства и техните активни ингредиенти е даден във фармакопеята. Всичките активни ингредиенти, посочени във фармакопеята, могат да бъдат използвани за получаването на конюгатите от HAS-активен ингредиент чрез процеса съгласно изобретението. Обаче, съгласно настоящото изобретение терминът активен ингредиент обхваща също всички съединения, които, въпреки че са известни като подходящи за диагностично или терапевтично използване, не можеха все пак да бъдат използвани до сега за тази цел, поради проблемите, описани по-горе. Активният ингредиент за предпочитане е витамин, ваксина, токсин, антибиотик (или противоинфекциозно средство), антиаритмично средство, средство подтискащо апетита, анестетик, аналгетик, противоревматично средство, противоалергично средство, противоастматично средство, антидепресант, антидиабетично средство, антихистамин, антихипертоник или антинеопластично средство. Структурно, то може например да бъде хормон, стероид, липид, протеин, олиго- или полипептид, нуклеинова киселина, по-специално D- или L-нуклеинова киселина, такава като D-ДНК, L-ДНК, D-PHK или L-PHK. Използването на протеини, пептиди, D- или Lнуклеинови киселини като партньори на HAS за свързване, е особено предпочитано.
Съединенията, получени съгласно настоящото изобретение, запазват активността на активния ингредиент и изгодните свойства на HAS. Като допълнителни предимства конюгатите, получени съгласно процеса съгласно изобретението, имат подобрен in vivo период на полуизвеждане на активните ингредиенти, намалена токсичност, подобрена стабилност и/или подобрена разтворимост на активните ингредиенти.
След прилагане, веригата на HAS се съкращава от α-амилазата в плазмата. Така активността на свързания продукт може да бъде определена като активност на природния свързан продукт, т.е. директно след свързването, или като активност на метаболизирания свързан продукт, т.е., след in vivo метаболизирането на свързания продукт. In vivo метаболизирането може да бъде стимулирано чрез in vitro разцепване.
Активността на активния ингредиент може да бъде определена по методи, които са известни за това съединение в областта на техниката. Например, активността на едно антинеопластично средство се определя като инхибираща концентрация (IC), и активността на един противоинфекциозен агент се определя като минималната инхибираща концентрация (MIC). За предпочитане, определянето се осъществява in vitro с подходящи целеви клетки (сравни Chow et al., Haematologica, Volume 86 (2001), pp 485 - 493). In vitro ефектите могат допълнително да бъдат потвърдени с релевантен животински модел (сравни например, мишия модел на бъбречно клетъчния карцином, описан в Changnon et al., ср. BJU Int., Volume 88 (2001), pp 418-424).
Сравнен c несвързаната субстанция, природният свързващ продукт може да има увеличена или намалена активност. За предпочитане обаче, активността не е намалена повече от 5-кратно, по-предпочитано, не повече от 3- или 2-кратно. Метаболизираният продукт за предпочитане има активност, сравнима с тази на несвързаната субстанция, т.е., преди свързването метаболизираният конюгат има поне 50 %, за предпочитане поне 75 % от активността на активния ингредиент, при което запазване на поне 95 % от активността е особено предпочитано.
В контекста на настоящото изобретение, терминът хидроксиалкилскорбяла е използван да обозначи производни на скорбялата, които са заместени с хидроксиалкилова група, имаща 1 до 3 въглеродни атома. Така групата, обозначена като хидроксиалкилскорбяла обхваща хидроксиметилскорбяла, хидроксиетилскорбяла и хидроксипропил скорбяла. Използването на хидроксиетилскорбялата (HES) като свързващ партньор е особено предпочитано за всички изпълнения на изобретението.
Съгласно изобретението е предпочитано хидроксиетилскорбялата да има средно молекулно тегло (средно тегло) от 1 - 300 kDa, като средно молекулно тегло от 5 до 200 kDa е особено предпочитано. Освен това, хидроксиетилскорбялата може да има моларна степен на заместване от 0.1 до 0.8 и отношение от С2:Сб-заместване в обхвата от 2 - 20, във всеки случай спрямо хидроксиетиловите групи.
За свързване на активния ингредиент към HAS може да бъде необходимо на един първи етап да се въведе активна група в активния ингредиент и/или HAS. Съответстващи активни групи могат например да
бъдат тиолни групи или аминогрупи (сравни с Примерите).
По-нататък, активният ингредиент и HAS могат да бъдат свързани един към друг чрез използване на свързващо звено. Всеки напречноомрежващ агент може да бъде използван като свързващо звено. Множество напречно-омрежващи агенти, такива като SMCC (сукцинимидил-4-(М-малеимидо-метил)циклохексан-1-карбоксилат; ср. Пример 7), са търговски налични и добре известни на лицата, специалисти в областта (сравни списъкът по азбучен ред на напречно-омрежващите реагенти в каталога на продуктите на компанията Perbio и www.piercenet.com).
Съгласно допълнително изпълнение на настоящото изобретение, водоразтворими антибиотични производни, които съдържат амино захар, по-специално HAS-даунорубицинови и HAS-доксорубицинови конюгати, и процеси за тяхното получаване доколкото те са разкрити в DE 101 29 369, не са включени в обхвата на настоящото изобретение.
Съгласно предпочитано изпълнение, настоящото изобретение се отнася до съединения, включващи конюгат от HAS и противотуморен активен ингредиент и тяхното използване за лечението на тумори.
Между другото, туморните клетки се различават от нормалните соматични клетки по това, че туморните клетки не са повече предмет на физиологичен контрол на растежа и следователно имат увеличена скорост на клетъчна дифузия. Терапевтичното използване на противотуморни активни ингредиенти в туморната терапия се основава на тази разлика, тъй като токсичната активност на противотуморните активни ингредиенти е насочена главно срещу пролифериращите клетки. Като последица, съединенията се обозначават като противотуморни активни ингредиенти или цитостатици, ако те показват токсична активност срещу пролифериращи клетки (основите на онкологията и последните терапевтични подходи са обобщени например в: Internistic Oncology, Schmoll etal. (eds.), Springer, 1996).
По отношение на тяхната химия, противотуморните активни ингредиенти представляват много хетерогенна група. В допълнение към инхибирането на пролиферацията, предизвикването на апоптоза, програмирана клетъчна смърт, придава значение в дискусиите в течение на последните години. Една класификация на противотуморните активни ингредиенти може например да бъде осъществена на база релевантните целеви молекули (Schmoll et al., виж по-горе):
1. Съединения, които инхибират биосинтеза на ДНК, например като антиметаболити, такива като МТХ, 5-FU, Ara-С или хидроксиурея.
2. Съединения, които действат на ДНК, например чрез предизвикване прекъсване на веригата, интеркалиране, модификация на напречното омрежване във веригата, топоизомеразни токсини, такива като алкилиращи агенти, платинови комплекси, антрациклини, блеомицин, актиномицин-D или епиподофило токсини.
3. Съединения, които действат на РНК, например чрез блокиране на синтеза на иРНК чрез интеркалиране или включване в РНК, включително антрациклини, блеомицин, актиномицин-D или антиметаболити.
4. Съединения, които действат на протеини, например на нивото на рецепторно свързване (напр. хормони или антагонисти), чрез инхибиране на тубулиновата полимеризация (напр. с винка алкалоиди), чрез протеиново напречно омрежване (например с алкилиращи агенти), или фосфорилиране (напр. с инхибитори на протеин киназа С).
Поради противотуморната активност, всички активни ингредиенти имат значителни странични ефекти, които настъпват главно като инхибиране на бързо пролифериращи тъкани. По тази причина, поспециално еритро-, левко- и тромбопоезата се инхибират и растежът на мукозните мембранни епителни се повлиява неблагоприятно. Като резултат, могат да настъпят стомашно-чревни смущения или необратими увреждания на сперматогенезата или ановулация, съответно. Кожата и страничните органи към кожата също често се повлияват. Например, много пациенти страдат от обратима загуба на коса.
В тежки случаи, страничните ефекти могат да доведат до остра загуба на бъбречната функция и токсично-обусловени органни увреждания на сърцето, белия дроб, черния дроб и нервната система. Накрая, като последица от имуносупресивния ефект, може да бъде очакван увеличен брой от инфекции.
Получаването и изследването на конюгати, които съдържат противотуморно средство, бяха следователно фокусирани върху подобряването толерантността на активния ингредиент. За тази цел различни противотуморни активни ингредиенти са били свързани към макромолекули като декстран (сравни Kojima et al., J. Pharm. Pharmakoi., Vol. 32 (1980), p. 30 - 34; Nakane et al., J. Pharm. Pharmakol., vol. 40 (1988), p. 1 - 6, Nomura et al., J. Controlled Release, Vol. 52 (1998), p. 239 - 252; Sato et al., J. Pharm. Sci., Vol. 78 (1989), p. 11 - 16). В отделни случаи бе демонстриран подобрен антитуморен ефект на конюгатите.
Като алтернатива, активни ингредиенти такива като митомицин С бяха също свързани към N-сукцинилхитозан (Song et al., J. Controlled Release, Vol. 42 (1996), p. 93 - 100), карбоксиметилхитин (Song et al., Arch. Pract. Pharm. Vol. 53 (1993), p. 141 - 147) и олигопептиди (Soyez et al., J. Controlled Release, Vol. 47 (1997), p. 71 - 80). Когато бе сравнена c индивидуалния противотуморен активен ингредиент, отново бе наблюдавана подобрена антитуморна активност на конюгатите в поголямата част от анализите.
Съгласно изобретението, сега изненадващо бе намерено, че конюгатите от HAS-активен ингредиент, които съдържат противотуморен активен ингредиент, имат подобрен токсичен ефект срещу туморни клетки и/или намалена токсичност за други клетки. Следователно, конюгатите позволяват един по-широк терапевтичен обхват.
Плазменият период на полуизвеждане на конюгатите значително е увеличен. Това позволява да се преодолеят механизмите на възстановяване в туморни клетки посредством по-дългото излагане. Едновременно, настоящото изобретение позволява по-бавен прилив, особено в здрава тъкан, чрез което се постига намален пик на концентрацията и подобрена толерантност за пациентите.
За получаването на конюгатите съгласно изобретението може да бъде използван всеки противотуморен активен ингредиент. Противотуморният активен ингредиент например може да бъде избран от групата, състояща се от алкилиращи средства, антиметаболити, антибиотици или природни субстанции.
Съгласно едно предпочитано изпълнение, противотуморният активен ингредиент е митомицин С, циклофосфамид, блеоцин, хлорамбуцил, цисплатин, Ara-С, флударабин, доксорубицин, етопозид, 5-FU, МТХ, винбластин, винкристин, виндезин, хидроксиурея, 6-МР или CCNU.
Използването на митомицин С като активен ингредиент е особено предпочитано. Митомицин С принадлежи на групата на антибиотиците и съдържа азиридинова група и хинонова група, и митозанов пръстен. Активният ингредиент е използван за лечението на бъбречно клетъчен карцином и тумори на пикочния мехур, а така също други урологични заболявания. Съединенията подобряват своята активност само при метаболизиране в хипоксични клетки (това означава, предпочитано в туморни клетки) чрез вътрешно-клетъчно ензимно или спонтанно химично редуциране на хинона и загубата на метокси групата. За предпочитане HAS може да бъде свързана към тази метокси група чрез свързващо звено. След вътрешно-клетъчно отцепване на заместителя, същият активен ингредиент присъства вътре в клетката, което причинява алкилиращо напречно омрежване на ДНК, като по този начин се проявява неговия токсичен ефект. Като алтернатива, HAS може да бъде свързан към една от двете NH2-rpynn. Митомицин С показва типична тъканна специфичност. Съгласно изобретението, предпочита се тази специфичност по-специално за отделителните органи, да се повиши посредством свързването към HAS.
Съгласно изобретението, противотуморният активен ингредиент може да бъде свързан към HAS с използване на всеки метод. Обаче се предпочита специфично свързване към редуциращите крайни групи на HAS, тъй като тази процедура създава дефиниран конюгат.
Съгласно едно изпълнение на изобретението, хидроксиетилскорбялата може да бъде свързана към метокси групата на митомицин С. Свързването към метокси групата на митомицин С може да стане чрез свързващо звено.
Съгласно едно допълнително изпълнение, настоящото изобретение се отнася до процеси за получаването на съединение, включващо конюгат от HAS и противотуморен активен ингредиент. Процесът обхваща етапи, в които HAS се свързва ковалентно с противотуморен активен ингредиент или директно, или чрез свързващо звено, и конюгатът се изолира.
Допълнително, изобретението се отнася до фармацевтични състави, които съдържат съединение, включващо конюгат от HAS и противотуморен активен ингредиент. Фармацевтичният състав може освен това да съдържа фармацевтично съвместим носител и/или цитокин. За предпочитане, цитокинът е IL-2, α-интерферон, γ-интерферон.
Фармацевтичният състав може да бъде във всякаква форма за приложение, която е известна в областта. Например, съставът може да бъде формулиран за орално или парентерално приложение. Формулирането на състава се осъществява съгласно процеси, известни в областта на техниката. В допълнение към активния ингредиент, съставът обикновено включва фармацевтично съвместим носител и една или повече спомагателни добавки и евентуално консерванти, промотори на разтворимостта и т.н.
Накрая, настоящото изобретение се отнася до използването на съединение, включващо конюгат от HAS и противотуморен активен ингредиент за получаването на медикамент за лечението на тумори и/или техните метастази, по-специално за лечението на урологични тумори и/или метастази на урологични тумори, за лечението на метастази на бъбречно клетъчен карцином, или за лечението на болести на лимфната система, такива като CLL, лимфома на Hodgkin, NHL, множествена миелома, синдром на Waldenstrom. Съгласно това изпълнение на изобретението, медикаментът може допълнително да съдържа цитокин, такъв като IL-2, аинтерферон, γ-интерферон.
Използването на съединенията съгласно изобретението за получаване на медикамент за лечението на урологични тумори и/или метастази на урологични тумори, такъв като за лечение на метастази на бъбречно клетъчен карцином, е особено предпочитано. Понастоящем, лечебна терапия на бъбречно клетъчен карцином не може да бъде постигната нито с комбинирана хемотерапия, нито с митомицин С самостоятелно. Това може би е поради неблагоприятните фармакокинетики на съединението, тъй като частта само на бъбречното отделяне възлиза на приблизително 18 %. Тъй като HAS почти напълно се отделя през бъбрека, конюгатът показва по-висок процент на бъбречно отделяне в сравнение с не-конюгираната субстанция. Това изпълнение на настоящото изобретение използва вътрешно-клетъчното междинно съхранение на HAS. По-специално, високо заместени видове HAS (HAS 200/0.62) показват едно увеличено вътрешно-клетъчно съхранение, в извънредни случаи даже претоварване. Този феномен е бил също наблюдаван в областта на проксималната тръбичка (Peron et al., Clinical Nephrology, Vol. 55 (2001), p. 408-411).
Съгласно това изпълнение, настоящото изобретение осигурява акумулиране на противотуморен активен ингредиент в определени целеви клетки или тъкани. Следователно, подобрените фармакокинетики на конюгатите правят възможно постигането на значително по-висока концентрация в клетките на целевия орган, като същевременно се използват ниски системни концентрации. Това медицинско използване за предпочитане е употребявано при хипернефроидния карцином и хроматофилния бъбречен карцином, които съставляват приблизително 90 % от всички хистологични типове.
Съгласно едно алтернативно изпълнение, изобретението се отнася до използването на съединенията съгласно изобретението за получаването на медикамент за лечението на болести на лимфната система, такива като CLL, лимфома на Hodgkin, NHL, множествена миелома, синдром на Waldenstrom. Чрез свързването на HAS към противотуморен активен ингредиент съгласно изобретението, вътрешноклетъчното поглъщане на активните ингредиенти се намалява в зависимост от дължината на веригата и степента на заместване. Освен това, радиоактивни кинетични изследвания са показали, че HAS се съхранява в определени органи, между другото в лимфните органи, за попродължително време отколкото в цялото тяло (сравни Bepperling et. al., Crit. Care, Vol. 3, Suppl. 1 (1999), p. 153). Така, настъпва акумулиране на конюгата в целевите клетки, което има за резултат подобрени фармакокинетики с по-ниска системна токсичност.
Лечението на болести на лимфната система като се използва флударабин като активен ингредиент е предпочитано. Флударабинът е халогениран аденинов аналог, който е устойчив на деаминиране.
Изобретението допълнително се отнася до използването на съединенията съгласно изобретението за получаването на медикамент за лечението на кожни/локални първични злокачествени новообразувания или техните метастази. За това могат да бъдат използвани два ефекта, насоченото увеличено поемане от изброените тъкани и намаленото пренасяне на HAS конюгатите извън тъканта. И двата ефекта водят до акумулиране на конюгата в целевите клетки.
Изобретението допълнително се отнася до използването на съединенията съгласно изобретението за получаването на медикамент за лечението на заболявания на хематологияната система или онкологични заболявания, такива като не мало-клетъчен белодробен рак и малоклетъчен белодробен рак, рак на млечната жлеза, сквамозен клетъчен карцином на хранопровода, бъбречно клетъчен карцином, тестикуларен карцином, злокачествен меланом, ALL или CML. По-специално, когато конюгатите се използват за лечението на бъбречно клетъчен карцином, възникват предимства поради силното акумулиране на съединението в тъканта, на която се въздейства, чрез увеличената хидрофилност на конюгата и по-силното бъбречно отделяне в резултат от това. За това изпълнение на изобретението, използването на виндезин като активен ингредиент е особено предпочитано.
Изобретението допълнително се отнася до използването на съединението съгласно изобретението за получаването на медикамент, при който съединението се използва като комбинирана терапия с един или повече допълнителни противотуморни активни ингредиенти или цитокини. Комбинираната терапия може да бъде осъществена чрез прилагане на средство, съдържащо всички активни ингредиенти, или чрез приложение на два или повече различни състава, всеки от които съдържа един активен ингредиент.
Настоящото изобретение допълнително осигурява процес за получаването на медикамент, включващ цитокин и съединение съгласно изобретението, който е подходящ за нови комбинирани терапии. Съответните средства са по-специално подходящи за лечението на напредналия бъбречно клетъчен карцином.
Съгласно друго, особено предпочитано изпълнение на изобретението, са осигурени конюгати от HAS и един антиаритмичен активен ингредиент, а така също тяхното използване за лечението на аритмия.
Отклоненията от времевата последователност и регулярност на сърдечното съкращение (аритмия) от нормалната сърдечна честота, са означени като аритмия. В мнозинството от случаите, тези отклонения са причинени от сърдечна възбуда или заболявания на проводимостта. Субстанциите, които са подходящи за лечението на аритмия, поспециално вентрикуларна аритмия, се означават като антиаритмично активни ингредиенти или антиаритмични средства.
В зависимост от ефекта на антиаритмично активните ингредиенти се прави разлика между блокери на натриевите канали (хинидин, прокаинамид, дизопирамид и т.н.), бета-рецепторни блокери (атенолол, пропанолол и т.н.), селективни удължаващи реполяризацията активни ингредиенти (амиодарон, соталол и т.н.), калциеви антагонисти (верапамил, галопамил и т.н.) и локални анестетици.
Обаче антиаритмично активните ингредиенти, обичайни в тази област, частично показват кратка продължителност на действие. Например, аденозинът е един антиаритмично активен ингредиент с много кратък полупериод на съществуване. Продължителността на действие на тази субстанция е само няколко минути. В много случаи е необходимо удължаването на полупериода на съществуване и продължителността на действие.
Допълнително, отделни антиаритмично активни ингредиенти имат про-аритмогенни странични ефекти и частично даже едно увеличение в смъртността.
Настоящото изобретение осигурява между другото, подобрени антиаритмично активни ингредиенти, които например имат удължена продължителност на действие. Съгласно изобретението, изненадващо е намерено, че HAS-антиаритмичните конюгати имат значително по-дълъг in vivo плазмен период на полуизвеждане, и че активността на активните ингредиенти не е повлияна неблагоприятно до значителна степен чрез свързването към HAS.
Съгласно настоящото изобретение, за получаването на конюгатите може да бъде използван всеки антиаритмично активен ингредиент. Активният ингредиент може да бъде избран от групата, състояща се от блокери на натриевите канали, бета-рецепторни блокери, селективни удължаващи реполяризацията активни ингредиенти, калциеви антагонисти и локални анестетици. За предпочитане, активният ингредиент е аденозин, хинидин, прокаинамид, дизопирамид, лидокаин, фенитоин, мексилетин, айамалин, паржмалиум, пропафенон, атенолол, пропанолол, амиодарон, соталол, верапамил, галопамил или дилтиазем, при което използването на аденозин е особено предпочитано.
Съгласно едно изпълнение на настоящото изобретение, свързването между антиаритмично активния ингредиент и HAS се осъществява чрез редуциращите крайни групи на HAS.
Когато се използва аденозин, този активен ингредиент може например да бъде свързан към HAS през аминогрупата, при което свързване между аминогрупата на аденозина и редуциращата крайна група на HAS е особено предпочитано. Вариант на свързване, при който присъства природен аденозин след метаболизирането (разделяне от HAS), е предпочитан.
Като алтернатива активният ингредиент може да бъде свързан към HAS през тъй нареченото свързващо звено.
Настоящото изобретение допълнително се отнася до фармацевтични състави, съдържащи едно от съединенията съгласно изобретението. Обикновено фармацевтичният състав допълнително съдържа фармацевтично съвместим носител, и той може да бъде формулиран например за интравенозно приложение.
Накрая изобретението се отнася до използването на съединенията съгласно изобретението за получаването на медикамент за лечението на аритмия, по-специално за лечението на вентрикуларна аритмия.
Съгласно едно алтернативно изпълнение, изобретението се отнася до използването на съединение съгласно изобретението за получаването на медикамент за индуцирането на апоптоза, например в туморни тъкани или във възпалителни тъкани.
Настоящото изобретение се отнася до съединения, състоящи се от конюгат от HAS и един противоинфекциозен активен ингредиент или антибиотик, респективно, а така също тяхното използване за лечението на инфекциозни заболявания.
Проникването на микроорганизми (вируси, бактерии, гъби, протозои) в един макроорганизъм (растение, животно, човек) и размножаването в този макроорганизъм, се нарича инфекция. Установяването и развитието на едно инфекциозно заболяване съществено зависят от патогеничността на микроорганизма и имунитета на макроорганизма.
Противоинфекциозни активни ингредиенти от десетилетия са били използвани като хемотерапевтици, за да се води борба с инфекциозни заболявания.
Още в 1928 A. Flemings идентифицира пеницилина чрез характеристиката на активния ингредиент да образува върху културална плака площи, свободни от стафилококи. Пеницилинът бе първият антибиотик, който бе получен в индустриален мащаб и придоби голяма важност в клиничната практика.
Днес, активни ингредиенти от групата на β-лактамовите антибиотици, които се продуцират от гъба от вида Penicillium (например Р. chrysogenum и Р. notatum), се означават като пеницилини. Бактерицидният ефект се основава на блокирането на синтеза на бактериалната клетъчна стена. Пеницилинът деактивира бактериалния ензим транспептидаза, като по този начин се предотвратява напречното омрежване на полизахаридните вериги на муреина на клетъчната стена.
От откриването насам бяха изолирани и синтезирани множество активни ингредиенти, които инхибират растежа на микроорганизмите или убиват микроорганизмите.
Повечето антибиотици произхождат от вида Streptomyces (приблизително 65 %), които бяха изолирани от почвата. Приема се, че тези субстанции се използват от микроорганизма за подтискане конкурентите в почвата.
Броят на изолираните антибиотици се оценява приблизително на 8000, приблизително 100 от които могат да бъдат използвани в областта на медицината. Осъществена бе една класификация на активните ингредиенти в различни класове субстанции съгласно различни аспекти, например химична структура или начин на действие.
Междувременно, антибиотици са одобрявани не само за борба с инфекциозните заболявания, но също като имуно-депресанти, цитостатици в антитуморната терапия, растително-защитни средства, за консервиране на храни, като подобряващ спомагателен агент в храненето на животни и т.н.
В последните години се срещат множество щамове микроорганизми, които са резистентни към антибиотици. В допълнение към единично резистентните щамове, често бяха намирани мулти-резистентни щамове, което усложнява борбата с определени болести.
Когато бе изучавана активността на различни антибиотици срещу определени патогени бе намерено, че някои от активните ингредиенти, например амоксицилин или ампицилин, почти изключително действат извънклетъчно (Scaglione et al., Chemotherapie, Vol. 39 (1993), 416 - 423; Balland et al., J. Antimicrob. Chemother. Vol. 37 (1996), 105 - 115). Следователно, тези активни ингредиенти не могат да бъдат използвани срещу микроорганизми, които присъстват главно вътре в клетката. Били са продуцирани ампицилин-наночастици, за да се подобри вътрешноклетъчната активност (сравни Balland et. al., виж по-горе).
За инфекции като туберкулоза или други инфекции причинени от микобактерии, разширяването на спектъра от лечебни възможности би било желателно поради комбинираната терапия, която винаги се изисква.
Поради другите вътрешно-клетъчни инфекции, такива като инфекция от хламидия, потенциалната важност на които за патогенезата на артериосклерозата бе едва напоследък открита (Stille und Dittmann, Herz, Vol. 23 (1998), p. 185 - 192), вътрешно-клетъчните антибиотици c депо ефект биха могли да представляват важен прогрес в терапията и профилактиката.
Съгласно изобретението, сега изненадващо бе намерено, че свързването на противоинфекциозни активни ингредиенти към HAS има за резултат подобрени фармакокинетични характеристики на активните ингредиенти, по-специално удължен in vivo период на полуизвеждане, подобрено вътрешно-клетъчно поемане и/или ефект на активния ингредиент.
Съгласно изобретението може да бъде използван всеки противоинфекциозен ингредиент или антибиотик, респективно. За предпочитане активният ингредиент е избран от групата, състояща се от аминопеницилини, цефалоспорини, амино-цефалоспорини, беталактамови антибиотици, карбапенеми, аминогликозиди, тетрациклини, макролидни антибиотици, гиразни инхибитори, гликопептидни антибиотици, линкомицини, стрептограмини, еверниномицини, оксазолидинони, нитроимидазоли, сулфонамиди, ко-тримоксазол, локални антибиотици, вирусостатици, антимикотици, туберкулостатици.
Той може да бъде например ампицилин, амоксицилин, цефотаксим, цефтазидим, ванкомицин, клиндамицин, метронидазол, изониазид, рифампицин, рифабутин, рифапентин, етамбутол, пирацинамид, стрептомицин, протионамид или дапсон, при което използването на един аминопеницилин, такъв като ампицилин, амоксицилин, макролид, или на стрептомицин, е особено предпочитано.
Съгласно едно изпълнение на настоящото изобретение, като активен ингредиент е използван амино-пеницилин, който е свързан директно и ковалентно към хидроксиетилскорбялата през аминогрупата на амино пеницилина.
Съгласно друго изпълнение е използван един аминоцефалоспорин вместо аминопеницилина, като по този начин се постига намалена алергенност. Като допълнителни изпълнения могат да бъдат използвани макролид-HAS свързвания, при които е използван еритромицин или негово производно, по-специално еритромициламин. Като алтернатива може да бъде използван стрептомицин като активен ингредиент.
Съгласно едно особено предпочитано изпълнение на настоящото изобретение, свързването между противоинфекциозният активен агент и хидроксиетилскорбялата може да стане чрез редуциращите крайни групи на хидроксиетилскорбялата.
В съответствие с едно допълнително изпълнение на настоящото изобретение, противоинфекциозният активен агент се свързва към хидроксиетилскорбялата през свързващо звено.
Настоящото изобретение допълнително включва фармацевтични състави, които съдържат съединение съгласно изобретението. Обикновено фармацевтичните състави допълнително съдържат фармацевтично съвместим носител.
Накрая, настоящото изобретение се отнася до използването на едно от съединенията съгласно изобретението, за получаването на медикамент за лечението на инфекциозно заболяване. Фармацевтичният състав може по-специално да бъде подходящ за лечението на инфекциозни заболявания, които между другото са причинени от вътрешно-клетъчни патогени. Те могат да произлизат от пълния спектър на патогените и случайни патогени, например бактериални, вирусни или паразитни патогени, микоплазми, микобактерии, хламидии, рикетсии и т.н.
В допълнителен аспект от настоящото изобретение са предвидени конюгати от HAS-нуклеинова киселина. Понастоящем библиотеки с нуклеинови киселини са скринирани в голям мащаб за нуклеинови киселини, които имат желана активност. Например, съответна активност може да бъде способността на нуклеинова киселина да се свърже към определени други нуклеинови киселини, рецептори или вирусни протеини. Това свързване може да бъде стимулирано или инхибирано чрез биологичен сигнал. За тази цел в допълнение към природно срещащи се D-ДНК и D-PHK молекули, се използват също L-ДНК и L-PHK молекули, които се различават от природно срещащите се молекули по това, че те съдържат L-рибоза или L-деоксирибоза, вместо съответните D-форми като компоненти на нуклеиновата киселина (сравни WO 98/08856). В контекста на настоящото изобретение бе показано, че могат да бъдат получени конюгати от HAS-нуклеинова киселина, които могат да запазят тяхната природна функция (сравни пример 7).
Настоящото изобретение допълнително осигурява процеси за получаването на ковалентни конюгати от HAS-активен ингредиент. Процесите могат да бъдат осъществени във водна или органична реакционна среда, при което се предпочита провеждане на свързването във водна среда.
Така, осигурени са процеси за получаването на ковалентен конюгат от HAS-активен ингредиент, в които HAS и поне един активен ингредиент взаимодействат един с друг в реакционна среда. Реакционната среда се характеризира с това, че тя е вода или смес от вода с органичен разтворител, която съдържа поне 10 тегл.% вода.
Реакционната среда от процеса съгласно изобретението съдържа поне 10 тегл.%, за предпочитане поне 50 тегл.%, по-специално поне 80 тегл.%, като например 90 тегл.%, или даже до 100 тегл.% вода, и съответно до 90 тегл.%, за предпочитане до 50 тегл.%, по-специално до 20 тегл.%, например 10 тегл.%, или даже до 0 тегл.%, органичен разтворител. Реакцията става във водна фаза. Предпочитаната реакционна среда е вода.
Процесът съгласно изобретението вече е изгоден, защото токсикологично неприемливите разтворители не е необходимо непременно да бъдат използвани и така от продукта, получен съгласно изобретението, не е наложително отстраняването даже на малки остатъци от токсикологично неприемливи разтворители, което винаги е необходимо съгласно известния процес, за да се избегне нежеланото онечистване с разтворител. Нещо повече, може да бъде пропуснат допълнителният качествен контрол, необходим съгласно процеса известен в областта за остатъците от токсикологично вредни разтворители, тъй като процесът съгласно изобретението спомага за използването на токсикологично приемливи разтворители. Разтворителите, предпочитани съгласно изобретението, са например токсикологично безвредни протни разтворители като етанол или пропиленгликол.
Освен това предимство на процеса съгласно изобретението е, че са основно избягнати необратими или обратими структурни промени на протеини или пептиди, предизвикани от органични разтворители, които не могат да бъдат системно изключени в процеси, протичащи в органични разтворители. Продуктът, получен с процеса съгласно изобретението, е следователно различен от този, получаван в DMSO.
Съгласно изобретението беше още изненадващо намерено, че свързване на HAS към активни ингредиенти може да бъде осъществено във воден разтвор без да бъдат наблюдавани вторични реакции в значителна степен. Така процесът съгласно изобретението води директно до подобрени продукти с голяма чистота. Процесът съгласно изобретението по този начин прави възможно за първи път простото получаване на конюгати от HAS-активен ингредиент, в които активният ингредиент присъства в активна форма и изгодните свойства на HAS са запазени. Не са необходими отделни процеси за изолиране на конюгата от HAS-активен ингредиент, от реакционната смес, тъй като реакцията става във водна фаза, т.е., не е необходимо да бъдат пречиствани органични разтворители.
Съгласно изобретението, предпочита се HAS да се свърже директно към E-NH2-rpyna, a-NH2-rpyna, SH-група, СООН група или -C(NH2)2- група на активния ингредиент. Алтернативно, в HAS може да бъде въведена допълнителна реактивоспособна група, или връзката между HAS и активния ингредиент може да стане през свързващо звено. Използването на съответни свързващи звена за свързването на активни ингредиенти към PEG е известно в областта на техниката. Предпочитано е използването на аминокиселини, по-специално глицин, аланин, левцин, изолевцин и фенилаланин, а така също хидразинови и оксиламинови производни като свързващи звена, както е разкрито в WO 97/38727 и ЕР 605 963.
Съгласно едно изпълнение на процеса от настоящото изобретение, преди да се свърже към активния ингредиент, HAS се окислява. Окисляването може да стане съгласно един от процесите, известни в областта на техниката, като е предпочитано едно селективно окисляване на редуциращите крайни групи на HAS. То улеснява процесите, в които окислената редуцираща крайна група на HAS взаимодейства с аминогрупа от активния ингредиент, което води до образуването на амид. Това изпълнение има особеното предимство, че се постига специфична връзка между HAS и активните ингредиенти, и така - особено хомогенен продукт.
HAS може да бъде подложена на взаимодействие с окислените редуциращи крайни групи и активния ингредиент за предпочитане поне за 12 часа, най-предпочитано поне 24 часа. Освен това, може да бъде желателно да се прибави някакъв активатор, например етилдиметиламинопропил-карбодиимид (EDC). Молното отношение между HAS и активния ингредиент по време на реакцията може да бъде случайно избрано, но нормално е в обхвата от НА8:активен ингредиент от 20.Ί до 1:20, отношение от 6:1 до 1:6 е особено предпочитано. Най-добрите резултати бяха постигнати с молно отношение от НА8:активен ингредиент от приблизително 2:1.
Други реакции на свързване между амино група от активния ингредиент и HAS са естествено също включени в обхвата на изобретението, например, процеси, в които HAS и активният ингредиент взаимодействат директно един с друг, с образуване на Шифова база между HAS и активния ингредиент като междинен продукт. Азометиновата група -CH=N- на Шифовата база след това може да бъде редуцирана със съответното добавяне на <2Н> до метиленамино групата -CH2-NH-. За тази редукция специалистът в областта може да използва множество редукционни агенти, известни в тази област, като редукция с използване на ВН4 е особено предпочитана.
HAS може да бъде свързана с всяка група на активния ингредиент. Свързването за предпочитане се осъществява така, че конюгатът да показва поне 50 %, за предпочитане поне 75 % от активността на активния ингредиент преди свързването, като запазване от поне 95 % от активността е особено предпочитано. Реакцията на свързване естествено може също да бъде контролирана така, че HAS да се свърже изключително към една или повече специфични групи на активния ингредиент, например към лизинови или цистеинови остатъци на един пептид. Особени предимства произтичат, ако HAS е свързана към една или повече специфични групи на активния ингредиент през окислените редуциращи крайни групи, като се получават хомогенни конюгати HASактивен ингредиент със съответен процес.
Съгласно едно предпочитано изпълнение на процеса от настоящото изобретение, като изходни субстанции за реакцията се използват HAS и протеин или пептид. Могат да бъдат използвани всякакви терапевтични или диагностични протеини от естествен или рекомбинантен произход. Списък от активните ингредиенти на рекомбинантен препарат, понастоящем на пазара, може да се намери във Pharma Business, July/August 2000, страници 45 до 60. Настоящото изобретение обхваща получаването на конюгати от HAS-активен ингредиент, които включват всеки един от активните ингредиенти, изброени поименно в тази публикация.
Получаването на конюгати с използване на цитокини, например интерферони, интерлевкини, растежни фактори, ензими, инхибитори на ензими, рецептори, рецепторни фрагменти, инсулин, фактор VIII, фактор IX, антибиотици (или противоинфекциозни средства), пептидни антибиотици, вирус покриващи протеини, хемоглобини, еритропоетин, албумини, hTPA, антитела, фрагменти от антитела, едноверижни антитела, ДНК, РНК или тяхно производно, е особено предпочитано. Особени предимства се получават, когато се използват рекомбинантни протеини или пептиди в процеса съгласно изобретението. Както вече бе казано, съответните протеини често не могат да бъдат използвани като активни ингредиенти поради техните свойства, които са антигенни за хора. Обаче, след свързване към HAS посредством процеса съгласно изобретението, имуногенността на рекомбинантните протеини се понижава, което позволява медицинското използване при хора.
Освен това, при свързването на HAS към протеини, имащи къса верига и към по-малки пептиди, се получават особени предимства. Понастоящем са произведени голям брой пептидни библиотеки, например, фаг-характеризиращи библиотеки, в които на повърхността на фаги са експресирани къси олигопептиди (например 3 до 20-мерни). Нещо повече, антитела с единична полипептидна верига (тъй наречените едноверижни антитела) са експресирани в бактерии или на повърхността на фаги. Тези библиотеки са проверени за специфичен активен ингредиент или свързваща активност. До сега обаче, терапевтичното и диагностично използване на съответните пептидни активни ингредиенти или антитела е пропадало, тъй като те се отделят много бързо от организма поради техния малък размер (сравни Chapman et al., 1999, на цитираното място). С процеса съгласно изобретението тези пептиди могат изгодно да бъдат свързани към HAS и имат in vivo период на пол у извеждане, който позволява същите да се използват като активен ингредиент.
Като алтернатива на горното изпълнение, като активен ингредиент могат да бъдат използвани хормон, стероиден хормон, хормон получен от аминокиселини или хормон получен от мастни киселини. В специфичния случай може да бъде необходимо да се въведе една активна група в хормона преди свързването към HAS, например чрез използването на свързващо звено.
Съгласно изобретението, всяка физиологично съвместима HES може да бъде използвана като изходен материал. HES със средно молекулно тегло (средно тегло) от 1 до 300 kDA, по-специално от 1 до 150 kDa, е предпочитана. HES със средно молекулно тегло от 2 до 40 kD е особено предпочитана. HES за предпочитане има моларна степен на заместване от 0.1 до 0.8 и отношение от С2:С6 заместване в обхвата от 2 до 20, във всеки случай спрямо хидроксиетиловите групи.
Изобретението освен това се отнася до конюгатите от HAS-активен ингредиент, получавани съгласно горните процеси. Тези конюгати имат изгодни свойства, а именно висока активност на активния ингредиент, ниска имуногенност, дълго време на пребиваване в тялото и отлични реологични свойства, които увеличават медицинската полза от конюгатите.
Съответно, настоящото изобретение също така обхваща процеси за получаване на медикамент или диагностично средство, в което конюгат от HAS-активен ингредиент се получава съгласно един от горните процеси и смесва с фармацевтично съвместим носител, адювант или спомагателно средство, известни в тази област, а така също медикаменти или диагностични средства, получавани съгласно този процес.
Медицинското използване на съответния медикамент зависи от типа на използвания активен ингредиент. Ако например е бил използван хемоглобин като активен ингредиент, конюгатът може да бъде използван като средство, пренасящо кислород. Ако, от друга страна, е бил използван цитокин като активен ингредиент за получаването, конюгатът може например да бъде използван в туморната терапия. Концентрацията на конюгата, който ще се използва във всеки случай в медикамента, може да бъде установена незабавно в тестове доза-ефект от всеки специалист в областта.
Диагностичните средства могат да бъдат използвани in vivo или in vitro, за определяне диагнозата на заболяванията или смущенията. Ако се използва антитяло или фрагмент от антитяло като активен ингредиент, конюгатът е подходящ например за осъществяването на процес на ELISA определяне, обичайно за областта на техниката.
Примери за изпълнение на изобретението
В примерите бяха използвани описаните материали както следва:
Човешки серумен албумин (HSA): Sigma-Aldrich АЗ 782
Тип 130/0.5, получена otT91SEP (Fresenius Kabi)
Mw: 130 000 ±20 000 D 42 600 D
HES 130 kD:
Данни:
Mn:
HES 10 kD:
Данни:
Mn:
EDC:
(етил-диметиламинопропилкарбодиимид)
HOBt (1 -хидрокси-1 Н-бензотриазолхидрат)
DIG гликан кит за определяне:
Тип ННН 4-2 (Fresenius Kabi)
Mw: 9 800 D
695D
Sigma-Aldrich no. 16.146-2
Sigma-Aldrich no. 15.726-0
Roche-Boehringer no. 1142 372
Следващите примери 1 до 6 описват свързването на HSA и диаминобутан към HES с окислени редуциращи крайни групи или прякото свързване на HSA към HES. HSA и диаминобутан са просто примери на активните ингредиенти, дефинирани по-горе. Пример 7 описва свързването на олигонуклеотиди към HES.
Пример 1: Селективно окисляване на редуциращите крайни групи на хидроксиетилскорбялата:
За селективното окисляване на редуциращите крайни групи на хидроксиетилскорбялата (130 kD и 10 kD), същите бяха разтворени в минимално количество вода и взаимодействаха с различни количества от йоден разтвор и разтвор на КОН.
Сместа бе разбърквана, докато цветът показа, че 12 е изчезнал. Тази процедура бе повторена няколко пъти, за да се постигне прибавянето на по-голямо количество от йодния разтвор и разтвора на КОН. Разтворът впоследствие бе пречистен с използване на Amberlite IR 120 Na+ катионообменна смола, диализиран за 20 часа срещу дестилирана вода (диализна тръба с гранична стойност от 4-6 kD) и лиофилизиран.
Степента на окисляване бе определяна във всеки случай с използване на процеса, разкрит в Somogyi, N. (Method in Carbohydride Chemistry, Vol. 1. (1962) p. 384 - 386). Протоколите на окислителната реакция са възпроизведени в Таблица 1.
Процес HES (Мп) Йоден разтвор 0.1 N KOH разтвор 0.1 N Разтворител Реакционно време Добив
ОКИСЛЯВАНЕ(1) HES 130 1 g 2.4XW5 mol 0.3 ml 3.0x1 O'5 mol 0.5 ml 5.0x1 O'5 mol Вода 4.0 ml 4 часа 25 °C 30.1 %
ОКИСЛЯВАНЕ (2) HES 130 4g 9.4x10'5 mol 1.0 ml 1.0x1 O'4 mol 1.5 ml Ι.δχΙΟ-4 mol Вода 6.0 ml една нощ 25° С 24.8 %
ОКИСЛЯВАНЕ (3) HES 130 5g 1.2x10^01 1.2 ml 1.2x1 O'4 mol 1.5 ml 1.5x1 O'4 mol Вода 7.5 ml една нощ 25 °C 24.3 %
ОКИСЛЯВАНЕ (4) HES 130 5g 1.2x10^01 3.0 I 3.0x1 O'4 mol 4.5 ml 4.5X10·4 mol Вода 7.5 ml една нощ 25 °C 60.8 %
ОКИСЛЯВАНЕ (5) HES130 5g 1,2x1 O'4 mol 4.0 ml 4.0x1 O'4 mol 5 ml б.ОхЮ·4 mol Вода 7.5 ml една нощ 25 °C 80.0 %
ОКИСЛЯВАНЕ (6) HES 130 8д 1. ΘχΙΟΛτιοΙ 7.0 ml 7.0x1 O’4 mol 11.5 ml 1.2x1 O'3 mol Вода 7.5 ml една нощ 25 °C 88.4 %
ОКИСЛЯВАНЕ (7) HES 130 10 д 2.4Х10·4 mol 10 ml 1,0x10'3 mol 20 ml 2.0x1 O’3 mol Вода 7.5 ml една нощ 25 °C 100%
ОКИСЛЯВАНЕ (1) HES 10 5д 1,4x1 O’3 mol 2.0 ml 2.0x1 O'4 mol 2.0 ml 2.0x104 mol Вода 10.0 ml 20 часа 25 °C 3.0 %
ОКИСЛЯВАНЕ (2) HES 10 5д 1.4x1 O’3 mol 3.5ml 3.5x1 O’4 mol 4.5 ml 4.5x10-* mol Вода 10.0 ml една нощ 25 °C 5.3 %
ОКИСЛЯВАНЕ (3) HES10 15 д 4.1x10'3mol 21.0 ml 2.1x10'3 mol 31.0 ml 3.1XW3 mol Вода една нощ 25 °C 10.5%
ОКИСЛЯВАНЕ (4) HES10 8д 2.2x1 O'3 mol 83.0 ml 8.3x1 O’3 mol 180.0 ml 1.8x1 O'2 mol Вода една нощ 25 °C 80.0 %
ОКИСЛЯВАНЕ (5) HES 10 7д 1.9хЮ’3то1 95.0 ml 9.5x1 O’3 mol 210.0 ml 2.1x10'2mol Вода една нощ 25 °C 100.0%
ОКИСЛЯВАНЕ (6) HES10 6.4 д 1.7х10‘3то1 50 ml 5.0x1 O’3 150 ml 1.5x1 O'2 mol Вода една нощ 25 °C 100.0%
Таблица 1: Окисляване на редуциращите крайни групи на HES (130 kD и 10 kD), при различни условия.
Протоколите, обобщени в тази таблица са възпроизведени в подробности за следното окисляване (6), HES 10 kD: 6.4 g HES 10 kD (1.7 mmol) бяха разтворени в реакционен съд, придружено с непрекъснато разбъркване в няколко ml вода. Прибавени бяха 50 ml 0.1 N йоден разтвор (5.0 mmol) и 150 ml от 0.1 N разтвор на КОН (15 mmol). Тази смес бе оставена да престои една нощ при 25 °C. Сместа бе пречистена с Amberlite IR 120 (Na+ форма) и диализирана срещу вода (диализна тръба с ацетилцелулоза; гранична стойност от 4 до 6 kD). Диализираният продукт бе лиофилизиран (Heraeus-Christ Alpha, сушене в колба една нощ).
Както може да бъде заключено от Таблица 1, постигнато бе пълно окисляване на редуциращите крайни групи (съответстващо на добив от 100 %) на HES 130 kD, след като количеството на йода бе увеличено от
3.0 x IO'5 mol до 1.0 x 10’3 ml.
За пълно окисляване на редуциращите крайни групи на HES 10 kD бе необходимо допълнително увеличаване на йодното количество до концентрация от повече от 2.1 х 10'3.
Пример 2: Свързване на HES с окислени редуциращи крайни групи към HSA във водната Фаза:
За свързването, хидроксиетилскорбяла с окислени редуциращи крайни групи (ox-HES) и HSA бяха напълно разтворени във вода. Когато разтворът бе избистрен, бе прибавен EDC, разтворен във вода. След активирането чрез EDC придружено от умерено разбъркване, бяха прибавени допълнителни количества от EDC. Когато бе подходящо, реакционната смес бе активирана с HOBt и оставена да престоява една нощ. Продуктът бе пречистен за 15 часа чрез диализиране срещу дестилирана вода и след това лиофилизиран (наречено Процес А понататък).
Протоколите на реакцията на свързване са в Таблица 2.
Процес А HSA ox-HES (Mn) EDC HOBt Разтворител Активиране Реакци я
Свързване I ox-HES 130 300 mg 4.4x1 O'6 mol 100 mg (1) 2.4x1® mol 25 mg 1.6x1 O’4 mo 100 mg 7.7x1 O’4 mol Н2О/диоксан 13ml/2ml 1.5 часа 3-4 °C 4 часа 25 °C
Свързване II ox-HES 130 100 mg 1.5x1 O'® mol 300 mg (2) 7.0x1 O'® mol 15 mg 9.7x10·® mol 100 mg 7.7x1 O'4 mol Н2О/диоксан 10ml/3ml 1.5 часа 3-4 °C една нощ 25 °C
Свързване III ox-HES 130 200 mg 3,0x1 O'® mol 3.8 g (5) 8.9x1 O'® mol 46.5 mg 3.0x1 O'4 mol 20 mg 1.5x1 O'4 mol Н2О/диоксан 10ml/3ml 0 часа 24 часа 25 С
Свързване IV ox-HES 130 100 mg 1.5x1 O'® mol 1.9 g (5) 4.5x1 O'5 mol 25 mg 1.6x1 O'4 mol 20 mg 1.5χ10^οΙ Вода 1.5 часа 3-4 °C една нощ 25° С
Свързване V ox-HES 130 200 mg 3.0x1 O'6 mol 4.3 g (5) 1.0x104 mol 100 mg 6.0x1 O'4 mol Omg Вода 0 часа една нощ 25 °C
Свързване VI ox-HES 130 100 mg 1.5x10® 130 mg (7) 3.0x104mol 50 mg 3.0x104 mol Omg Вода* 5 ml+10 ml 0 часа 5 часа 25 °C
Свързване VII ox-HES 10 100 mg 1.5x10® 130 mg (7) 3.0x10-® mol 200 mg 3.0x104 mol Omg Вода* 5ml + 2x10 ml 0 часа 24 часа 25 °C
Свързване I ox-HES 10 100 mg 1.5x1 O'® mol 300 mg (1) 8.1x105mol 5 mg 3.0x105 mol 100 mg 7.7x104 mol Н2О/диоксан 13ml/2ml 1.5 часа 3-4 °C една нощ 25 °C
Свързване II ox-HES 10 70 mg 1.0x1 O’® mol 1.0 g (2) 2.7x1 OXol 15.5 mg 1.0x104 mol Omg Вода 10 ml 0 часа една нощ 25 °C
Свързване III ox-HES 10 200 mg 3.0x10® mol 2.0 g (3) 8.1 хЮ4 mol 77.5 mg 5.0x104 mol 20 mg 1.5Х104 mol Вода 0 часа 6 часа 25 °C
Свързване IV ox-HES 10 50 mg 7.4x107 mol 7-4 g (4) 2.0x103 mol 282 mg 1.5x1 O'3 mol 0 mg Вода 0 часа една нощ 25 °C
Свързване V ox-HES 10 100 mg 1.5x10® mol 103 g (6) 2.8x105 mol 93 mg 5.6x104 mol Omg Вода* 4 ml 0 часа 20 часа 25 °C
Свързване VI ox-HES 10 100 mg 1.5x10® mol 103 g(6) 2.8x1 O’5 mol 200 mg 1.2x103mol Omg Вода* 3x5 ml 0 часа 30 часа 25 °C
*= Добавяне на EDC разтвор с капеща фуния за 60 min
Таблица 2: Реакции на свързване между HES (130 kD и 10 kD) с окислени редуциращи крайни групи и HSA при различни условия (Процес А; числото в скобите в колоната за HES възпроизвежда процеса на окисляване съгласно Таблица 1).
Реакцията на свързване VII между ox-HES 130 kD и HSA е пояснена в подробности както следва; В облодънна колба бяха разтворени 130 mg ox-HES 130 kD (степен на окисляване приблизително 100 %) и 100 mg HSA, съпроводено с разбъркване в приблизително 5 ml вода при стайна температура. Веднага след като разтворът бе избистрен, бяха прибавени 200 mg EDC на 3 порции, всяка разтворена в 5 -10 ml вода, в продължение на период от един час. Между всяко прибавяне реакционната смес бе разбърквана при стайна температура за около 4 часа. След 24 часа реакционно време, сместа бе диализирана срещу вода (диализна тръба с ацетилцелулоза; гранична стойност от 4 до 6 kD). След това продуктът бе лиофилизиран.
Пример 3: Пряко свързване на HES към HSA във водната фаза:
Принципът на тази реакция се основава на образуването на Шифови бази между HES и аминогрупи на протеина, като реакцията се контролира посредством взаимодействието на Шифовите бази към съответстващия амин с NaBH4 (наречен Процес В по-нататък).
За целта HES бе разтворен напълно в малко количество вода. Към края бе добавен HSA, разтворен в боратен буфер, pH 9.0. Към този разтвор бе прибавен NaBH4 и всичко бе оставено при стайна температура, съпроводено от разбъркване. Прибавена бе допълнителна аликвотна част от HES 130 kD, последвана от допълнителен NaBH4. След като реакцията завърши, бяха осъществени диализа и сушене чрез замразяване, както бе описано.
Протоколите на индивидуалните тестове са обобщени в Таблица 3.
Процес В HSA HES(Mn) NaBH4 Буфер pH Реакционно време
СВЪРЗВАНЕ I HES 130 50 mg 7.5x1 O'7 mol 500 mg 1.2x10'5 mol 500 mg 1.3x1 O'2 mol Na2HPO4, 0 ml 7.4 48 часа 25 °C
СВЪРЗВАНЕ II HES 130 100 mg 1.5x1 O'6 mol 1.0 g 2.4x10 5 mol 60 mg .6x1 O'3 mol Na2HPO4,1 ml 7.4 20 часа 25 °C
СВЪРЗВАНЕ III HES 130 50 mg 7.5x10' 7 mol 9.8 g 2.3x1 O'4 mol 285 mg 7.5x1 O'3 mol Na2HPO4,1 ml 7.4 36 часа 25 °C
СВЪРЗВАНЕ IVHES130 50 mg 7.5x1 O'7 mol 2.0 g 4.7X10·5 mol 180 mg 4.7x1 O'3 mol Борат0.1 M 7.4 30 часа 25 °C
СВЪРЗВАНЕ V HES130 50 mg 7.5x1 O'7 mol 4.0 g 9.4x1 O'5 mol 60 mg 1.6x1 O'3 mol Борат 0.1 M 7,4 100 часа 25 °C
СВЪРЗВАНЕ I HES 10 50 mg 7.5x1 O'7 mol 2.8 g 9.4x1 O'5 mol 28 mg 1.6x1 O'3 mol Борат 0.1 M 9.0 80 часа 25 °C
Таблица 3: Пряко свързване между HES (130 kD и 10 kD) и HSA при различни условия (Процес В).
В подробности, за свързването на HES 130 kD, 2.0 g от това съединение бяха напълно разтворени във вода (приблизително 5 ml). Добавени бяха 50 mg HSA, разтворени в 1 ml 0.1 М боратен буфер, pH 9.0. Към този разтвор бяха прибавени 30 mg NaBH4 и всичко бе оставено при стайна температура, съпроводено с разбъркване. След 18 h бяха добавени допълнителна аликвотна част от 2.0 g HES 130 kD, последвана от допълнителни 30 mg NaBH4. След общо 100 h реакционно време, бяха осъществени диализа и сушене чрез замразяване (свързване V, HES 130 kD).
За свързването на HES 10 kD, 1.4 g от това съединение бяха напълно разтворени във вода (приблизително 5 ml). Прибавени бяха 50 mg HSA, разтворени в 1 ml 0.1 М боратен буфер, pH 9.0. Към този разтвор бяха добавени 14 mg NaBH4n всичко бе оставено при стайна температура, съпроводено с разбъркване. След 18 часа бе прибавена допълнителна аликвотна част от 1.4 g HES 10 kD, последвана от допълнителни 14 mg NaBH4. След общо 80 часа реакционно време бяха осъществени диализа и сушене чрез замразяване (свързване I, HES 10 kD).
Пример 4: Анализ на продуктите на свързване с GPC:
Реакционните продукти първо бяха анализирани с гел-проникваща хроматография (GPC).
4.1 За GPC бе използвано устройство FPLC (Pharmacia), което бе свързано към HPLC UV монитор (Hitachi). Освен това бяха използвани следните условия:
Колона: Superose 12 HR 10/30 (1x30 cm) (Pharmacia)
UV монитор: 280 nm
Помпа: 0.2 ml/min
Буфер: 50 mM фосфат/150 mM NaCI pH 7.2.
При тези условия HSA пикът обикновено се намира след 63 min; един малък пик, който е причинен от димери на HSA, също е възможно да бъде измерен приблизително на 57 min.
Хроматограмите, получени чрез GPC могат да бъдат анализирани както следва:
4.2 Фигура 1 е хроматограма, която показва разпределението по размер на продуктите след свързване на ox-HES 130 kD към HSA (свързване III). С този процес на свързване бяха постигнати много добри резултати без активиране с HOBL Измерен бе чист, единичен широк пик на 37 min и допълнителна, по-малка лента на 45 min, което показва продукт на свързване с по-високо молекулно тегло от HSA. В същото време бяха намерени следи от непроменен HSA.
Фигура 2 показва разпределението по размер на продуктите след свързване на ox-HES 130 kD към HSA (свързване IV). Реакцията бе активирана с HOBL Показано е, че това активиране намалява добива, възможно чрез съдействане на вторични реакции.
Фигури 3 и 4 показват разпределението по размер на реакционните продукти по време и след реакцията на свързване на ox-HES 130 kD към HSA (свързване V). След 2 часа реакционно време бе намерен непроменен HSA като продукт с най-висока концентрация, но в допълнение бяха намерени първите продукти на свързване с повисоко молекулно тегло. След като реакцията завърши, бе намерен хомогенен продукт на свързване с време на задържане от приблизително 35 min във висока концентрация. Непроменен HSA и други продукти на свързване присъстваха в относително ниска концентрация.
Фигура 5 показва съответното разпределение по размер на реакционните продукти по време и след реакцията на свързване на ox-HES 10 kD към HSA (свързване V). Тук също е показано, че концентрацията на продуктите на свързване с молекулно тегло, които лежат над теглото на HSA, се увеличава в течение на реакцията.
Накрая, една реакция на свързване, в която почти всички HSA молекули бе възможно да бъдат пренесени в хомогенен продукт на свързване, е показана на Фигура 6 (реакционни продукти на свързване VII).
4.2 Един пример на хроматограмите, които бяха получени при анализа на прякото свързване на HES към HSA, е показан на Фиг. 7 (Процес В, HES 130 kD, свързване V). Значителен пик бе идентифициран приблизително на 65 min (HSA). В допълнение обаче също бе показан един продукт на свързване (пик приблизително на 42 min).
Пример 5; Анализ на продуктите на свързване посредством SDSPAGE и Western Blot:
5.1 PAGE бе проведена в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS), като се използва устройство Miniprotean II от Biorad и 7.5 % акриламидни гелове. Електрофорезата бе осъществена съгласно инструкциите на производителите. Теловете бяха оцветени със сребро, като се използва процесът на Blum (Elektrophoresis, Vol. 8, (1997) р. 93-99), за да се направят протеините видими.
Присъствието на гликани в продуктите на свързване бе определено посредством Western-Blot и Glycan-Detections-Kit от RocheBoehringer. След разделяне на продуктите с SDS-PAGE, те бяха пренесени към нитроцелулозна мембрана, като се използва блотинг апарата от Miniprotean II електрофорезиия възел. Мембраната след това бе окислена с перйодат при условия, при които само вициналните ОН групи се окисляват. Те след това взаимодействаха с един амино-функционализиран дигоксигенин. Свързаният дигоксигенин бе определен посредством специфични моноклонални антитела, които бяха свързани към алкална фосфатаза. За целта бе прибавен субстрат от фосфатазата (4-нитро-тетразолиев хлорид/5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат), която продуцира трудно разтворим синьо-виолетов продукт. Този продукт се утаява върху мембраната и така прави лентите видими. Непроменен HSA и креатиназа бяха използвани като отрицателни контроли, докато трансферинът служеше като положителна контрола.
Точните етапи на процеса са описани в приложената листовка с инструкции към този кит (Roche-Boehringer).
5.2 Всяка от Фигури 8 и 9 показва картина на оцветения със сребро SDSPAGE гел (горна част) и картината на съответните продукти след пренасянето върху мембрана и гликановото определяне (долна част). Както може да бъде заключено от тези фигури, като реакционен продукт по време на реакцията на свързване се образува относително хомогенен гликан, докато в същото време концентрацията на непроменения HSA се намалява.
Пример 6: Анализ на потенциалните вторични реакции:
За определяне дали настъпват вторични реакции във формата на автокондензация на HES с окислени редуциращи крайни групи, бяха приготвени следните реакционни смеси:
ox-HES EDC HOBt Вода Реакционно време
HES130 kD 500 mg 1.2x10’smol 15 mg 7.8x10’5 mol 5.0 ml 30 часа 25 °C
HES 130kD 500 mg 1.2x1 O’5 mol 15 mg 7.8x10’5 mol наситен разтвор 5.0 ml 30 часа 25 °C
HESIOkD 100 mg 2.7x1 O'5 mol 3.4 mg 1.8x10’5 mol 5.0 ml 30 часа 25 °C
HESIOkD 100 mg 2.7x10·® mol 3.4 mg 1.8x10’5 mol наситен разтвор 5.0 ml 30 часа 25 °C
HES 130 kD 700 mg 1.6x10’5 mol 31 mg 1.6x1 O’4 mol 5.0 ml 30 часа 25 °C
HES 130 kD 700 mg 1.6x10’5 mol 31 mg 1.6x1 O’4 mol Наситен разтвор 5.0 ml 30 часа 25 °C
Таблица 4: Реакционни смеси за анализ на вторични реакции
Целта на експериментите бе да демонстрира степента, до която става потенциалната автокондензация на HES в присъствието или отсъствието на HOBt. Пробите бяха лиофилизирани и изпратени на Fresenius-Kabi за осъществяване на анализа.
Чрез GPC и измервания на светлинното разсейване, в границите на определяне от няколко процента, не бяха намерени индикации за увеличаване на молекулното тегло.
Пример 7: Свързване на окислена HES към ДНК и анализ на функционалността на продуктите на свързване
Реакционен принцип:
Схематично представяне на реакцията може да бъде намерено на Фигура 10. На първия етап, амино групата на aMHH-HES12KD 3 взаимодейства с N-хидроксисукцинимидната група на SMCC 4 до образуване на конюгата 5. SMCC 4, който не е взаимодействал, се отделя чрез центрофугиране като се използва центрофугиращо/диализно устройство. Малеимидната група на конюгата 5 след това взаимодейства с тиоловата група на тио-ДНК 1 до желания продукт 6. Областта в 6, която е маркирана в черно просто изобразява разделящ сегмент и може да има всякаква форма.
Оценяването на биологичната активност на конюгата 6 бе осъществено чрез рестрикция с рестрикционния ензим EcoR1. Рестрикционните ензими само разцепват двойно-верижната ДНК с интактна последователност на разпознаване.
Използвана бе двойно-верижна ДНК, синтезирана от MWG Biotech Corporation, Ebersberg, Germany. Последователностите на единичните вериги са:
SEQ ID №: 1: 5'-GTAGAGACAGGAGGCAGCAGTTGAATTCGCAGGGTGAGTAGCAGTAGAGC-3’;
SEQ ID №: 2: 5'-GCTCTACTGCTACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTCCTGTCTCTAC-3';
модифицирана c 5' тиол C6 S-S от MWG (cp. Фигура 10).
И двете ДНК единични вериги бяха разтворени в бидестилирана вода в концентрация от 2 pg/μΙ, и бяха хибридизирани в отношение от 1:1 при 96 °C до двойно-верижна тио-ДНК 1 с концентрация от 2 pg/μΙ.
Анализ на продуктите:
Анализът бе осъществен с гел електрофореза на 4 % агарозен гел с ТВЕ течащ буфер, състоящ се от 45 mM Tris борат, 1 mM EDTA, pH 8.0, като се използва 1 pg ДНК в присъствието на 50 pg етидиев бромид на 100 ml гел във всеки случай. Изображенията бяха снети с използване на модулна CCD-система (INTAS Imaging Instruments, Gottingen, Germany) и UV трансилуминатор UVT-20 S/M/L (Herolab, Wiesloch, Germany) при 312 nm.
μΙ (1 μg ДНК) от реакционната смес бе взета и подложена на разцепване с 1 μΙ (20 U) EcoR1 рестрикционен ензим (New England Biolabs, Schwa Imbach/Taunus, Germany), 1 μΙ реакционен буфер (50 mM натриев хлорид, 100 mM Tris HCI, 10 mM магнезиев хлорид, 0.025 % Triton X-100, pH 7,5 от New England Biolabs) и 7 μΙ бидестилирана вода при 37 °C за 3 часа.
Модификация на HES:
Окисляването на HES12KD (Fresenius, Lot 2540SR2.5P) със средно молекулно тегло от 12.000 g/mol с йоден разтвор до okco-HES12KD 2 бе осъществено съгласно процеса, разкрит в DE 196 28 705.
Взаимодействие на 1,4-диаминобутан с okco-HES12KD 2:
1.44 g (0.12 mmol) okco-HES12KD 2 бяха разтворени в безводен диметилсулфоксид (DMSO), прибавени на капки към разтвор от 1.5 ml (1.50 mmol) -1,4 диаминобутан в азотна атмосфера и разбърквани 19 часа при 40 °C. Реакционната смес бе прибавена към смес от 80 ml етанол и 80 ml ацетон. Образуваната утайка бе разделена чрез центрофугиране и суспендирана повторно в 40 ml вода. Разтворът бе диализиран за 4 дни срещу вода (SnakeSkin диализна тръба, 3.5 KD гранична стойност, Perbio Science Deutschland, Bonn, Germany) и след това лиофилизиран. Добивът бе 80 % (1.06 g) aMHHO-HES12KD 3.
Свързване на aMHHO-HES12KD 3 към тио-ДНК 1:
mg SMCC 4 разтворен в 50 μΙ безводен DMSO бе прибавен към 400 μΙ от 10 mg/ml-разтвор на aMHHo-HES12KD 3 в буфер от 10 тМ натриев фосфат и 150 тМ натриев хлорид, pH 7.44, и сместа бе инкубирана за 80 min при стайна температура и 10 min при 46°С. Впоследствие сместа бе центрофугирана, супернатантата бе отстранена от утайката и тя бе отново центрофугирана. 200 μΙ от супернатантата бяха взети и центрофугирани за 45 min при 14 000 g с центрофугално-диализен агрегат MICROCON YM-3 (Amicon, Millipore, Eschborn, Germany). След прибавянето на 400 μΙ буфер, състоящ се от 10 тМ натриев фосфат и 150 тМ натриев хлорид, pH 7.44, тя бе отново центрофугирана за 45 min. Добавени бяха допълнителни 400 μΙ буфер и отново бе центрофугирано за 60 min. Количеството на конюгатния разтвор, който бе останал в диализния възел бе допълнено до 50 μΙ. 10 μΙ от този разтвор бяха прибавени към 10 μΙ от тио-ДНК разтвора 1 и двата взаимодействаха един с друг 14 часа при стайна температура. 1 μΙ бе взет за анализ. Фигура 11 показва резултатите в пътеки 2 и 3.
Реакционните условия за описания експеримент и за експериментите с модифицирани реакционни условия, са обобщени в Таблица 1. Резултатите са изобразени на Фигура 11.
Обобщение на резултатите:
Бяха анализирани следните условия:
1. Количество от SMCC: 1 mg (пътеки 2, 6, 10, 14) или 5.6 mg (пътеки 4,
8,12,16), респективно;
2. Температура за реакцията с тио-ДНК 1: стайна температура (пътеки
2,4, 6, 8) или 37 °C (пътеки 10,12,14,16), респективно;
3. Буферни условия:
тМ фосфат, 150 тМ натриев хлорид без EDTA, pH 7.44 (пътеки 2, 4,10,12) or 100 πίΜ фосфат, 150 тМ натриев хлорид + 50 mM EDTA, ph 7.23 (пътеки 6, 8,14,16), респективно.
На Фигура 11 пътеки 2-18 представят резултатите от 8-те експеримента на свързване на aMHHO-HES12KD 3 към тио-ДНК 1, като се използва SMCC. Резултатите директно от реакцията или след реакцията и последващото усвояване на ДНК респективно, са изобразени непосредствено един до друг. В пътека 1 смес от различни еталонни ДНК е заредена като маркер за дължина. Пътеки 18 и 19 показват тио-ДНК 1 или усвоена тио-ДНК 1, респективно. В допълнение към не взаимодействалата тио-ДНК 1, всички експерименти показват продукти на свързване при повисоки маси (пътеки 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16). Тъй като HES12KD е смес от молекули с различен размер, продуктите на свързване показват също разпределение по молекулно тегло. Всички продукти на свързване съдържат интактна ДНК, като те могат да бъдат напълно усвоени от EcoR1.
Това също се демонстрира чрез почти пълното изчезване на съответните дифузни ленти след усвояване (пътеки 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17).
Таблица 1: Реакционни условия на свързването на aMHHO-HES12KD 3 към тио-ДНК 1
Пътека Експеримент Температура [°C] SMCC [mg] ДНК HES12KD Буфер
1 Маркер
2 19А1 RT 1 тио-ДНК амино - HES12KD 7.44, 10 mM
3 усвоен
4 19В1 RT 5.6 тио-ДНК амино - HES12KD 7.44, 10 тМ
5 усвоен
6 19С1 RT 1 тио-ДНК амино - HES12KD 7.23, 100 тМ
7 усвоен
8 19D1 RT 5.6 тио-ДНК амино - HES12KD 7.23, 100 тМ
9 усвоен
10 19А2 37 °C 1 тио-ДНК амино-HES12KD 7.44,10 тМ
11 усвоен
12 19В2 37 °C 5.6 тио-ДНК амино - HES12KD 7.44,10 тМ
13 усвоен
14 19С2 37 °C 1 тио-ДНК амино-HES12KD 7.23, 100 тМ
15 усвоен
16 19D2 37 °C 5.6 тио-ДНК амино - HES12KD 7.23, 100 тМ
17 усвоен
18 тио-ДНК
19 усвоен

Claims (16)

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
1. Процес за получаването на ковалентен конюгат от HASактивен ингредиент, в който се свързват HAS и активен ингредиент в реакционна среда, при което:
(a) редуциращите крайни групи на HAS са селективно окислени преди свързването към активния ингредиент;
и (b) реакционната среда е вода или смес от вода с органичен разтворител, който съдържа поне 10 тегл.% вода.
2. Процес съгласно претенция 1, в който активният ингредиент е избран от групата, включваща витамини, ваксини, токсини, антибиотици, антиаритмични средства, средства подтискащи апетита, анестетици, аналгетици, противоревматични средства, противоалергични средства, противоастматични средства, антидепресанти, антидиабетични средства, антихистамини, антихипертоници, антинеопластични съединения, алкилиращи агенти, антиметаболити, блокери на натриевите канали, β-рецепторни блокери, селективни усилватели на реполяризацията, калциеви антагонисти, местни анестетици, аминопеницилини, цефалоспорини, аминоцефалоспорин, бета-лактамови антибиотици, карбапенем, аминогликозид, тетрациклин, макролидни антибиотици гиразни инхибитори, гликопептидни антибиотици, линкомицин, стрептограмин, еверниномицин, оксазолидинон, нитромидазол, сулфонамид, со-тримоксазол, местни антибиотици, вирустатици, антимикотици или туберкулостатици.
3. Съединение съгласно претенции 1 или 2, в което активният ингредиент е избран от групата, включваща хормон, стероид, липид, протеин, олиго- или полипептид или нуклеинова киселина, специфично D или L-нуклеинова киселина, такава като D-ДНК, L-ДНК, D-РНК или L-PHK.
4. Съединение съгласно една от предходните претенции, в което активният ингредиент е избран от групата, включваща ензим, ензимен инхибитор, рецептор, рецепторен фрагмент, инсулин, фактор VIII, фактор IX, цитокин, интерферон, интерлевкин, растежен фактор, пептиден антибиотик, вирус покриващ протеин, хемоглобин, еритропоетин, албумин, hTPA, антитяло, фрагмент от антитяло, едноверижно антитяло или негово производно, стероиден хормон, хормон получен от аминокиселини или хормон, получен от мастни киселини, митомицин С, циклофосфамид, блеомицин, хлорамбуцил, цисплатин, ара-С, флударабин, доксорубицин, етопозид, 5-FU, МТХ, винбластин, винкристин, виндезин, хидроксиурея, 6-МР, CCNU, аденозин, хинидин, прокаин амид, диизопирамид, лидокаин, фенитоин, мексилетин, ажамалин, паржмалиум, пропафенон, атенолол, пропанолол, амиодарон, соталол, верапамил, галопамил, дилтиазем, ампицилин, амоксицилин, цефотаксим, цефтазидим, ванкомицин, клиндамицин, метронизадол, изониазид, рифампицин, рифабутин, рифапентин, етамбутол, пирацинамид, стрептомицин, протионамид или дапсон.
5. Процес съгласно една от предходните претенции, в който HAS се свързва към e-NH2-rpyna, към a-NH2-rpyna, към SH група, към СООН група или към -C(NH2)2 - група на активния ингредиент.
6. Процес съгласно една от предходните претенции, в който окислената редуцираща крайна група на HAS взаимодейства с амино група на активния ингредиент, водещо до образуването на амид.
7. Процес съгласно една от предходните претенции, в който активния ингредиент или HAS се свързва към свързващо звено преди
8. Процес съгласно една от предходните претенции, в който се използва хидроксиетилскорбяла със средно молекулно тегло (средно тегло) от 1 до 300 kDa.
Процес съгласно една от предходните претенции, в който се хидроксиетилскорбяла със средно молекулно тегло от 2 до 40
Процес съгласно една от предходните претенции, в който се използва хидроксиетилскорбяла с моларна степен на заместване от 0.1 до
0.8 и отношение на С2:С6 заместване в обхвата от 2 до 20, във всеки случай спрямо хидроксиетиловите групи.
9.
използва kDa.
10.
получаването на конюгата.
11. Процес за получаването на медикамент или диагностично средство, включващ етапи, в които се получава конюгат от HAS-активен ингредиент съгласно една от претенции 1 до 9, и се смесва с фармацевтично съвместим носител, адювант или спомагателно съединение.
12. Конюгат от HAS-активен ингредиент, получаван по метод за получаване на ковалентен конюгат от HAS-активен ингредиент съгласно една от претенции 1 до 10.
13. Фармацевтичен състав, включващ съединение съгласно претенции 12.
14. Използване на ковалентно съединение HAS-антинеопластичен активен ингредиент съгласно претенция 12 за получаването на фармацевтичен състав за лечение на тумори и/или техни метастази.
15. Използване на ковалентно съединение HAS-антиаритмичен активен ингредиент съгласно претенция 12 за получаването на фармацевтичен състав за лечение на сърдечни ритъмни заболявания.
16. Използване на ковалентно съединение HAS-антибиотичен активен ингредиент съгласно претенция 12 за получаването на фармацевтичен състав за лечение на инфекциозни заболявания, такива като заболявания, причинени от патоген или факултативно патогенни причиняващи агенти, такива като бактериални, вирусни или паразитни патогени, микоплазмиди, микобактерии, хламидии или рикетсии.
BG108274A 2001-03-16 2003-10-15 Конюга'и о' хидрок'иалкил'корбяла (has) и ак'ив...н ингр...ди...н' BG108274A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10112825A DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2001-03-16 HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
PCT/EP2002/002928 WO2002080979A2 (de) 2001-03-16 2002-03-15 Hydroxyalkylstärke-wirkstoff-konjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG108274A true BG108274A (bg) 2004-08-31

Family

ID=7677789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108274A BG108274A (bg) 2001-03-16 2003-10-15 Конюга'и о' хидрок'иалкил'корбяла (has) и ак'ив...н ингр...ди...н'

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7816516B2 (bg)
EP (2) EP1372735B1 (bg)
JP (1) JP2004525170A (bg)
KR (1) KR20030084998A (bg)
CN (2) CN101597337B (bg)
AT (1) ATE529134T1 (bg)
BG (1) BG108274A (bg)
BR (1) BR0208126A (bg)
CA (1) CA2441442A1 (bg)
CZ (1) CZ20032430A3 (bg)
DE (1) DE10112825A1 (bg)
ES (1) ES2371865T3 (bg)
HU (1) HUP0303511A2 (bg)
IS (1) IS6953A (bg)
MX (1) MXPA03008218A (bg)
NO (1) NO20034095L (bg)
NZ (1) NZ528251A (bg)
PL (1) PL366456A1 (bg)
RU (1) RU2003130464A (bg)
WO (1) WO2002080979A2 (bg)
YU (1) YU72203A (bg)
ZA (1) ZA200306363B (bg)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083787B2 (en) * 2000-11-15 2006-08-01 Globeimmune, Inc. Yeast-dendritic cell vaccines and uses thereof
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
RO122279B1 (ro) 2001-08-22 2009-03-30 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Amilopectină hiperramificată pentru utilizare în tratamentul chirurgical şi terapeutic la mamifere sau pentru metode de diagnostic, în special, pentru utilizare ca expandor de volum al plasmei
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
GB0218830D0 (en) * 2002-08-13 2002-09-18 Syngenix Ltd Anaesthetic conjugate
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
CA2496317C (en) 2002-09-11 2014-02-18 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10324710A1 (de) * 2003-05-30 2004-12-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Stärkederivatkomplexe
KR101154343B1 (ko) * 2003-08-08 2012-07-05 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트
JP2007501870A (ja) * 2003-08-08 2007-02-01 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとｇ−ｃｓｆの複合体
US20080274948A1 (en) * 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
ES2642214T3 (es) 2004-01-21 2017-11-15 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
BRPI0507540A (pt) * 2004-02-09 2007-07-03 Supramol Parenteral Colloids processo para a produção de conjugados de polissacarìdeos e polinucleotìdeos
EP2336192A1 (en) * 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
AR048918A1 (es) * 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
CN101137396A (zh) * 2005-03-11 2008-03-05 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 由无活性初始材料制备生物活性糖蛋白
US7597924B2 (en) * 2005-08-18 2009-10-06 Boston Scientific Scimed, Inc. Surface modification of ePTFE and implants using the same
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
DE102006020035A1 (de) * 2006-04-26 2007-10-31 B. Braun Melsungen Ag Herstellung und Verwendung von Poly(hydroxyethylstärke)chitin- und Poly(Carboxymethylstärke)chitin-Verbindungen
ES2386972T3 (es) 2006-05-31 2012-09-10 Genzyme Corporation Uso de polisacáridos para la estimulación de la actividad enzimática
CN101199856B (zh) * 2006-12-15 2011-04-20 天津协和生物科技发展有限公司 一种携氧抗休克药物
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
GB0811743D0 (en) * 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
EP3225248B1 (en) 2008-07-23 2023-06-07 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
EP2326351B1 (en) * 2008-08-19 2017-12-27 Nektar Therapeutics Conjugates of small-interfering nucleic acids
US9011920B2 (en) * 2008-12-06 2015-04-21 B. Braun Melsungen Ag Transport-mediating colloidal pharmaceutical compounds
CN102414277A (zh) * 2009-03-20 2012-04-11 Fp创新研究中心 具有新颖性质的纤维素材料
KR20110137788A (ko) 2009-03-31 2011-12-23 베. 브라운 멜중엔 악티엔게젤샤프트 아미노화된 다당류의 결합생성물
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
CN104017063A (zh) 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
WO2012004008A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
WO2012004006A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
KR20140054009A (ko) 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
CN102911276A (zh) * 2011-08-03 2013-02-06 四川科伦药业股份有限公司 一种处理羟乙基淀粉中内毒素的方法
US9243049B2 (en) 2011-08-09 2016-01-26 Uab Profarma Derivatives of recombinant proteins, homo-multimers of granulocyte colony-stimulating factor and method of preparation thereof
US20140371292A1 (en) * 2011-08-10 2014-12-18 Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
EP2712868A1 (en) 2012-09-28 2014-04-02 B. Braun Melsungen AG 5-Fluoruoracil Derivatives
EP2712629A1 (en) 2012-09-28 2014-04-02 B. Braun Melsungen AG Colloid bonded Medicinal Compounds
CN103768081B (zh) * 2014-01-22 2016-10-12 东北师范大学 一种羟乙基淀粉-阿霉素键合药的制备方法
WO2015132724A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
AU2015323769A1 (en) 2014-09-26 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
CN108743963B (zh) * 2018-06-14 2020-11-03 华中科技大学 一种含有四价铂的抗癌偶联物及其制备方法和应用
CN114174326A (zh) 2019-06-18 2022-03-11 拜耳公司 长期稳定的肾上腺髓质素类似物及其用途
CN112891555B (zh) * 2021-01-31 2024-04-02 华中科技大学 一种羟乙基淀粉接枝二氢卟吩e6的偶联物、其制备和应用
CN114617957B (zh) * 2022-03-10 2024-01-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 羟乙基淀粉血红蛋白偶联物及其制备方法与应用

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (bg)
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
DE2233977A1 (de) 1971-07-14 1973-02-01 Unilever Nv Verfahren zur herstellung oxydierter kohlenhydrate
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4061736A (en) * 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001200A (en) * 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&amp;M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
DK171029B1 (da) 1983-10-11 1996-04-22 Fidia Spa Hyaluronsyrefraktion, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt ophthalmiske præparater indeholdende hyaluronsyrefraktion
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US4667016A (en) * 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4863964A (en) 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
JPH01223473A (ja) * 1988-03-02 1989-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd 平版印刷版の不感脂化処理方法
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
US5003022A (en) * 1989-02-10 1991-03-26 Penford Products Company Starch graft polymers
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE3919729C3 (de) * 1989-06-16 1997-06-19 Fresenius Ag Hydroxyethylstärke als Plasmaexpander, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
KR100221066B1 (ko) 1989-10-13 1999-10-01 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
JPH04199065A (ja) * 1990-11-29 1992-07-20 Fuji Photo Film Co Ltd 電子写真式製版用平版印刷原版および端面処理剤
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
JPH06167837A (ja) * 1992-11-27 1994-06-14 Fuji Photo Film Co Ltd 平版印刷版製造方法
WO1994013697A1 (en) * 1992-12-07 1994-06-23 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of septic shock with conjugated biologically active peptides
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
AU668294B2 (en) 1993-03-16 1996-04-26 Hemosol Inc. Selective crosslinking of hemoglobins by oxidized, ring-opened saccharides
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1997021452A2 (en) * 1995-12-14 1997-06-19 Advanced Magnetics, Inc. Macromolecular prodrugs of nucleotide analogs
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) * 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
WO1998020905A2 (en) * 1996-11-08 1998-05-22 Biomedical Frontiers, Inc. Treatment of iron overload disorders
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) * 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6338843B1 (en) 1997-06-12 2002-01-15 Ml Laboratories Biologically active materials
EP1003760B1 (en) * 1997-08-07 2004-07-28 The University Of Utah Prodrugs and conjugates of selenium containing compounds and use thereof
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6261594B1 (en) * 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
US6818630B1 (en) 1999-06-18 2004-11-16 Ml Laboratories Plc Biologically active materials
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) * 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6417347B1 (en) * 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) * 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
DE10207072A1 (de) * 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
CA2496317C (en) 2002-09-11 2014-02-18 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
ES2214166T1 (es) 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
JP2009093397A (ja) * 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA03008218A (es) 2004-03-10
CN101597337A (zh) 2009-12-09
US20050063943A1 (en) 2005-03-24
EP1671654A2 (de) 2006-06-21
ATE529134T1 (de) 2011-11-15
NZ528251A (en) 2004-12-24
ES2371865T3 (es) 2012-01-10
JP2004525170A (ja) 2004-08-19
RU2003130464A (ru) 2005-04-10
NO20034095L (no) 2003-11-04
WO2002080979A3 (de) 2003-09-12
EP1671654A3 (de) 2008-03-26
WO2002080979A2 (de) 2002-10-17
IS6953A (is) 2003-09-15
CA2441442A1 (en) 2002-10-17
HUP0303511A2 (hu) 2004-01-28
PL366456A1 (en) 2005-02-07
ZA200306363B (en) 2004-07-13
EP1372735A2 (de) 2004-01-02
YU72203A (sh) 2006-05-25
US20060188472A1 (en) 2006-08-24
CN101597337B (zh) 2011-09-07
CZ20032430A3 (cs) 2003-11-12
US7816516B2 (en) 2010-10-19
EP1372735B1 (de) 2011-10-19
KR20030084998A (ko) 2003-11-01
NO20034095D0 (no) 2003-09-15
BR0208126A (pt) 2004-03-02
CN1498115A (zh) 2004-05-19
DE10112825A1 (de) 2002-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG108274A (bg) Конюга&#39;и о&#39; хидрок&#39;иалкил&#39;корбяла (has) и ак&#39;ив...н ингр...ди...н&#39;
US5574018A (en) Conjugates of vitamin B12 and proteins
EP2548582B1 (en) Antitumoral bioconjugates of hyaluronic acid or its derivatives obtained by indirect chemical conjugation
JP4137184B2 (ja) 薬物複合体の製造方法
JP7405616B2 (ja) 生体直交型組成物
JP4538666B2 (ja) 薬物内包アクティブターゲット型高分子ミセル、医薬組成物
JP2002543111A (ja) ポリマーを使用する葉酸で仲介された腫瘍細胞へのターゲッティングの増幅
KR20000016558A (ko) 약물복합체
JP2003506319A (ja) ビタミンに関連したデュアルターゲッティング治療法
CN100372570C (zh) 用于抑制转移或预防恶性肿瘤复发的含有多糖偶联物的药物组合物
US20030103934A1 (en) Drugs having long-term retention in target tissue
US20050220754A1 (en) Vitamin directed targeting therapy
JP2003504312A (ja) 生物学的に活性な材料
CN101405301A (zh) 包含与粘膜粘附聚合物共价连接的药理学活性化合物的结合物以及采用该结合物的透粘膜给予药理学活性化合物的方法
RU2164149C2 (ru) Конъюгаты полимиксина
AU2002362210B8 (en) Polypeptide, the conjugate thereof containing doxorubicine and a pharmaceutical composition based thereon
JPH0633320B2 (ja) ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法
EP4230223A1 (en) Composition
JPH09124512A (ja) 肝臓ターゲティングのための水溶性の薬物−プルラン結合体製剤
US20130259944A1 (en) Methods and compositions for treating cancer with platinum particles
AU683581C (en) Conjugates of vitamin B12 and proteins
JPH01211530A (ja) 抗腫瘍剤
JPH04103538A (ja) 制癌剤副作用抑制剤
PL227543B1 (pl) Sposób wytwarzania koniugatu fibrynogenu glikowanego glukozą z metotreksatem