JPH0633320B2 - ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法 - Google Patents

ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法

Info

Publication number
JPH0633320B2
JPH0633320B2 JP60278843A JP27884385A JPH0633320B2 JP H0633320 B2 JPH0633320 B2 JP H0633320B2 JP 60278843 A JP60278843 A JP 60278843A JP 27884385 A JP27884385 A JP 27884385A JP H0633320 B2 JPH0633320 B2 JP H0633320B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ara
conjugate
hsa
carbodiimide
monophosphate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP60278843A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS61171430A (ja
Inventor
ルイジ・フイウメ
コラド・ブシ
アレツサンドロ・マツテイオリ
マツシモ・バルダツチ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RABO BARUDATSUCHI SpA
Original Assignee
RABO BARUDATSUCHI SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RABO BARUDATSUCHI SpA filed Critical RABO BARUDATSUCHI SpA
Publication of JPS61171430A publication Critical patent/JPS61171430A/ja
Publication of JPH0633320B2 publication Critical patent/JPH0633320B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウイルス起源の肝炎症状の治療学的処置にお
いて有用な、ラクトサミン化ヒトアルブミン（lactosam
inated human albumin）とアデニン−９−β−Ｄ−アラ
ビノフラノシド５′モノホスフエートの結合体（conjug
ates）に関する。
数年来、アデニン−９−β−Ｄ−アラビノシド（ａｒａ
−Ａ）及びそのモノホスフエート（ａｒａ−ＡＭＰ）は
ウイルスＢによつて誘発された慢性肝炎の処置において
使用されている。ａｒａ−Ａ及びａｒａ−ＡＭＰはウイ
ルス複製を阻害する（inhibit）。
〔(1)チヤドウイツク、アール ジー、バツセンデイン
エムエフ、クローフオードイーエム、トーマスエイチ
シー、シヤーロツク エス．，ブリテイツシユ．メデイ
カル．ジヤーナル．，１９７８；２：５３１−３３（Ch
adwick RG,Bassendine MF,Crawford EM,Thomas HC,Sher
lock S.,Br.Med.J.,１９７８；２：５３１−３３．）参
照〕。
(2)ポラード アール ビー、スミス ジエイ エル、
ニール イー エイ、グレゴリー ピー、メリガン テ
イー エル、ロビンリンダブリユー シー．、ジヤーナ
ル オブ アメリカン メデイカル アソシエーシヨン
１９７８；２３９：１６４８−５０（Pollard RB,Smi
th JL,Neal EA,Gregory PB,Merigan TL,Robinson WC.,
ＪＡＭＡ １９７８；２３９：１６４８−５０．）。
(3)バツセンデイン エム エフ、チヤド ウイツク
アール ジー、サルメロン ジエイ・シプトン ユー・
トーマス エイチシー、シヤーロツク エス、ガストロ
ンエンテロロジー１９８１；８０：１０１６−２２．
（Basasendine MF,Chadwick RG,Salmeron J.Shipton U.
Thomas HC,Sherlock S.,Gastroenterology １９８１：
１０１６−２２．）。
(4)スクラード ジーエイチ、ポラード アールビー、
スミス ジエイエル等、インフエクト．デイス １９８
１；１４３：７７２−８３（Scu-llard GH,Pollard RB,
Smith JL et al.,Infect.Dis １９８１；１４３：７７
２−８３．）。
(5)ウエラー アイブイデイー、バツセンデイン エム
エフ、クラキシ等．，グツド １９８２；２３：７１７
−２３（Weller IVD,Bassen-dine MF,Craxi et al.,Gut
１９８２；２３：７１７−２３．）。
(6)スミス シーアイ、キツチエン エルケイ、スクラ
ード ジーエイチ、ロビンソン ダブリユ エス、グレ
ゴリー ピービー、メリガン テイーシー．，ジヤーナ
ル オブ アメリカン メデイカル アソシエーシヨン
１９８２；２４７：２２６１−６５．（Smith CI,Kit
chen LK,Scullard GH,Robin-son WS,Gregory PB,Meriga
n TC.,ＪＡＭＡ １９８２；２４７：２２６１−６
５．）。
(7)フーフナーグル ジエイエイチ、ハンソン アール
ジー、ミヌーク ジー ワイ等．ガストロエンテロロジ
ー １９８４；８６：１５０−５７（Hoofnagle JH,Han
ton RG,Minuk GY et al.Gastroenterology１９８４；８
６：１５０−５７）参照〕。
或る患者においては、これらの化合物は肝臓の組織学的
外観（histological appearance）の改善及び感染性の
低下（loss of infectivity）も生じる。
〔(8)スクラード ジーエイチ、アンドレ エルエル、
グリーンバーグ エイチビー等．ヘパトロジー １９８
１；１：２２８−３２．（Scullard GH,Andres LL,Gree
nberg HB et al.Hepatology １９８１；２２８−３
２）．）。
(9)スクラード ジーエイチ、グリーンレバーグ エイ
チビー、スミスジエイエル、グレゴリーピービー、メリ
ガン テイーシー、ロビンソン ダブリユエス、ヘパト
ロジー １９８１；２：３９−４９（Scullard GH,Gree
nberg HB,Smith JL,Gregory PB,Merigan TC,Robinson W
S,Hepatology １９８１；２：３９−４９）参照〕。
しかしながら、これらの薬は、胃腸管及び骨髄（medull
a ossium）の主として中枢神経系のレベルにおいて副作
用を生じ、これはしばしばそれらの投与を中断させる。
これらの副作用は、もしａｒａ−Ａ又はａｒａ−ＡＭＰ
が肝細胞に選択的に運ばれるならば排除され又は減少す
るかも知れない。
〔前記の文献(7)及び（１０） サックス エスエル、
スミス ジエイエル、ポラード アールビー等、ジヤー
ナル オブ アメリカン メデイカル アソシエーシヨ
ン１９７９；２１４−２８（Sacks SL,Smith JL,Pollar
d RB et al.ＪＡＭＡ １９７９；２１４−２８）。
（１１）サツクス エスエル；スクラードジーエイチ、
ポラード アール ビー、グレゴリー ピービー、ロビ
ンソン ダブリユエス、メリガン テイーシー．，アン
チマイクロバイアル エージエント アンド ヘモセラ
パー．１９８２；２１−９３−１００（Sacs SL;Sculla
rd GH,Pollard RB,Gregory PB,Robinson WS,Merigan T
C.,Antimicrob.Agets Chemother.１９８２；２１−９３
−１００）． （１２） ホイトレイ アール．アルフオード シー、
ヘスエフ、ブツシヤナンアール．，ドラツグス；２０−
２６７−８２（Whitley R.Alford C.Hess F,Buchanan
R.,Drugs １９８０；２０−２６７−８２）．参照〕。
このために、ａｒａＡＭＰは肝柔組織細胞（hepatic pa
renchima cells）中にのみ浸透し、そこでリンソームに
より破壊されるラクトサミン化アルブミン（lactosamin
ated albumin）（Ｌ−ＳＡ）と結合せしめられた。エク
トロメリアウイルス（Ectromelia virus）によって誘発
された肝炎にかかつているマウスに結合体Ｌ−ＳＡ−ａ
ｒａ−ＡＭＰ（conjugate Ｌ−ＳＡ−ａｒａ−ＡＭ
Ｐ）の投与の後、ａｒａ−ＡＭＰは肝細胞においてその
薬理学的に活性な形態において濃縮される。Ｌ−ＳＡ−
ａｒａ−ＡＭＰ結合体は、相同アルブミン（homologue
albumin）を用いて製造されると、少なくともマウスに
おいては免疫原性（inmunogenic）ではない。
〔（１３） フイウム エル．，ブシ シー．，マツテ
イオリ エー、バルボニ ピージー、バルバンテイー
ブロダノ ジー．，エフイービーエスレター．１９８
１；１２９−２６１−６４（Fiume L.,Busi C.,Mattiol
i A.Balboni PG,Barba-nti-Brodano G.,FEBS Lett.１９
８１；１２９−２６１−６４）． （１４）アシユウエル ジー、ハルフオード ジエイ、
アンニユ レブ、バイオケム、１９８２；５１：５３１
−５４（Ashwell G.Harford J.Annu Rev.Biochem.１９
８２：５１：５３１−５４）。
（１５）フイウム エル、ブシ シー、マツテイオリ
エー．，エフイービーエス レター、１９８２；１４
６：４２−４６（Fiume L,Busi C,Mattioli A.,FEBS Le
tt.１９８２；１４６：４２−４６）。
（１６）フイウム エル．，マツテイオリエー、ブシ
シー．，アツコルシ シー．，グツド（Fiums L.,Matti
oli A,Busi C.,Accorsi C.,Gut） （１７）フイウム エル．，マツテイオリエー ブシ
シー．，スピノザ ジー．，ウイーランド テイー．，
エキスペリエンテイア １９８２；３８：１０８７−８
９（Fium L.,Mattioli A,Busi C,.Spinosa G.,Wieland
T.,Experientia １９８２；３８：１０８７−８９）。
参照〕。
これらの実験において使用されたＬ−ＳＡ−ａｒａ−Ａ
ＭＰ結合体を製造した方法 〔（１８）フイウム エル、マツテイオリエー、ブシ
シー、等、エフ イー ビーエスレター；１１６：１８
５−８８（Fiume L.Mattioli A,Busi C.et al.FEBS Let
t；１１６：１８５−８８）〕 は酸性環境（pH5.3−5.5）におけるＬ−ＨＳＡと活性化
されたａｒａ−ＡＭＰの結合反応（conjugation）基づ
いている。
この方法は、凍結乾燥後、もし−２０℃で貯蔵されたと
しても、短い時間（室温で約１−３及び０−４℃で１週
間以下並びに−２０℃で数週間（some weeks））に不溶
性になり、従つて広範に治療学的に使用するには役に立
たない製品をもたらすという欠点を有する。
本発明の主要な目的は、凍結乾燥後無期限に可溶性のま
まである結合体生成物を与える、ara−ＡＭＰとラクト
サミン化ヒトアルブミンの結合反応(conjugation)の方
法を提供することである。この目的は、カルボジイミド
で活性化されたara−ＡＭＰとL-SHAを6.5より高いpHで
相互に接触させることを特徴とする、ara−ＡＭＰとL-S
HAとの結合反応方法によつて達成される。
好ましい態様に従えば、水性溶液の形態にあるara−Ａ
ＭＰ及びL-SHAをカルボジイミド、特に１−エチル−３
−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミドの存
在下に接触させ、それによりara−ＡＭＰの活性化を直
接に反応媒体中で行なう。下記の詳細な説明からわかる
通り、本発明の方法によつて得られた結合体は分光光度
法により計算して、５乃至２０間で変るara−ＡＭＰと
タンパク質のモル比を示す。本発明の主な利点は、治療
的活性は同じであるが、本発明の結合体は製造及び凍結
乾燥の後可溶性のままであり、従つてそれが室温で貯蔵
されたとしても治療学的に有用であり、このことは工業
的製造が可能であり、及び工業的製造を可能ならしめ及
び工業的製造を予測することができることを意味し、こ
れに対して従来この結合体は、それが短い時間に不溶性
になることにより製造の殆んど直後使用されなければな
らなかつたということにある。かくして、この目的は、
アデニン−９−β-D-アラビノフラノシド５′モノホス
フエートをラクトサミン化ヒトアルブミンと結合させる
ことを含む方法において、水性溶液中の結合されるべき
上記２つの成分をカルボジイミド、好ましくは１−エチ
ル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミ
ドの存在下に攪拌しながらインキユベートすること及び
反応混合物pHを6.5より高い値に調節し、次いで反応混
合物を分離することを特徴とする前記本発明の方法によ
り達成される。
たとえ室温に保持されたとしても凍結乾燥後可溶性のま
まである結合体が本発明の方法によつて得られる理由は
まだ解明されていないけれども、かかる結果について下
記理論的説明を与えることは持つとものように思われ
る。
ラクトサミン化ヒトアルブミンと、式 を有するカルボジイミドで活性化されたara−ＡＭＰの
結合反応において、それは式 （式中Ｒ及びＲ′はカルボジイミド上に存在する特定の
化学的基を表わす） を有するカルボジイミドによつても活性化され、５つの
誘導体が形成され得る。即ち、 １） ２） ３） ４） ５） （式中形成されているバンド(band)の種類はかつこ内に
示されている）。
始めの４つの誘導体は、それぞれ、L-HSAの基、ＣＯＯ
−、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、とカルボジイミドにより活性
化されたara-AMPの反応から生じる。
第５の誘導体は、ara−ＡＭＰの糖（アラビノース）の
ＯＨ基とL-HSA（カルボジイミドにより活性化された）
のカルボキシル基の反応に由来する。しかしながら、こ
の第５の誘導体の形成はありそうもない。何故ならば、
ara−ＡＭＰにおいて利用し得るアラビノースのＯＨ基
は、強い条件下でのみエステル化することができる２級
ＯＨ基であるからである。
第１の誘導体において、ara−ＡＭＰのホスフエートは
ホスホ無水物結合を介してタンパク質のカルボキシル基
に結合している。これは、ＮＨ2基の存在下においてア
ミノリシスを受ける非常に反応性の結合であり、それに
よりカルボアミドバンド(carboamidic band)が形成され
そしてホスフエートが放出される［ジ．デイ サバト、
ダブリユ．ビー．ジエンクス、ジヤーナル オブ アメ
リカン ケミカル ソサイエテイ、８３巻、４３９３−
４４００−、１９６１(G.Di Sabato,W.P.Jencks,J.Am.C
hem.Soc.８３，４３９３−４４００−，１９６１）］。
酸性pHにおいて製造された結合体においては、ホスホア
ンハイドライド結合は、他のL-HSA分子のＮＨ2基と凍結
乾燥後に反応することによつて、L-HSA分子の付随する
重合を伴つてカルボアミド結合を形成する。
この徐々に進行する重合は誘導体の溶解性損失の原因で
ある。31ＰのＲＭＮスペクトル分析によつて、5.5の如
き酸性pHで製造された結合体においては、ara−ＡＭＰ
とL-HSAの間のすべての結合はホスホ無水物型であり、
これに対して製造がより高いpH、例えば7.5で行なわれ
るときはara−ＡＭＰとL-HSAとの間の結合は２つの型で
ある： a)ara−ＡＭＰホスフエートのタンパク質のリジン残基
ε−ＮＨ2との間のホスホアミド型、 b)ara−ＡＭＰホスフエートとタンパク質のカルボキシ
ル残基（グルタミン及び／又はアスパラギン酸の）との
間のホスホ無水物型。
かくして、２つの型の結合の割合は結合反応のpHに依存
しているように思われる。
これは酸性pHでは十分にプロトン和しており(protonate
d)(-NH3 +)従つてカルボジイミドにより活性化されてい
るara-ＡＭＰと反応することはできないL-HSAのＮＨ2基
は、アルカリ性pHにおいては反対に少なくとも一部脱プ
ロトン化され(deprotonated)、従つて活性化されたara-
ＡＭＰとの反応にいてＣＯＯ−基と首尾良く競合するこ
とができ、かくして第２誘導体（ホスホアニドライドバ
ンド）の形成に導くということにより極めて確からし
い。これは、カルボジイミドによつてヒトアルブミンと
チミジル酸の結合反応をpH7.5で行ない、そしてこれら
の条件下ではホスホアミデートのみが形成される（化合
物２におけると同じ結合）ことを証明することができた
ハロラン(Halloran)及びバーカー(Parker)［ジヤーナル
イムノロジー(J.Immun.９６、３７３、３７８、１９
６６）］の実験によつて確かめられる。
ラクトサミン化ヒトアルブミンとara-ＡＭＰの結合体
は、上記方法とは異なる反応経路によつても得ることが
でき、その場合には、ホスホリル化されていないヌクレ
オシドから出発して、ara-Aは無水コハク酸によつてara
-Aスクシネートに又は無水グルタル酸によつてara-Aグ
ルタレートに転化することができる。しかる後、これら
の誘導体は、それらのスクシンイミドエステルを介して
又は混合無水物法によつて又はカルボジイミドによつて
Ｌ−ＨＳＡに結合することができる。これらの方法の１
つによつて、ara-Aはara-Aグルタレートに転化され、こ
のものはそのヒドロキシスクシンイミドエステルを介し
てアシアロフエチユイン(asialofetuine)(AF)に結合さ
れた（ＡＦは、L-HSAと同様に、肝細胞に選択的に浸透
する糖タンパク質である）。かくしてara-Aの肝標的化
(hepatic targeting)をマウスにおいて生じるのに薬理
学的に活性であることが見出されたara-A-glut-AF結合
体が得られた［フイウム等(Fiume et al.,ＦＥＢＳレタ
ー（ＦＥＢＳ Lett）。１１６、１８８（１９８
０）］。
下記実施例は本発明の方法を限定することなく説明する
ものである。
実施例１ ara−ＡＭＰ７５mg（２１６μモル）をNaHCO3（粉末）
を添加してＨ2Ｏ１．５ml中に溶解する。この溶液にL-H
SA７５mg（0.946μモル）を加える（モル比ラクトース
／アルブミン＝２９−３１）。L-HSAが溶解すると、pH
を電位差計の制御下に１０Ｎ NaOHで7.5に至らしめ、
そして１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）
カルボジイミド７５ｇ（３９１μモル）を加える。混合
物を暗所で攪拌下に２５℃で２４時間インキユベート
し、次いで、２容量の0.9％NaClを加えた後、セフアデ
ツクスG-100カラム（４０−１２０μ）1.9×１３０cmで
クロマトグラフイーにかけ、平衡化しそしてNaClの0.9
％溶液で溶出する。
L-HSAのモノマー及びオリゴマーに相当する画分を一緒
にしそしてそのpHがNaHCO3で7.5−８に調節されている
Ｈ2Ｏに対して２−４℃で透析する。次いで、結合体を
凍結乾燥する（５０−５５mg）。結合体は生理学的溶液
(0.9％NaCl)中に１００mg／ml（最大試験濃度）まで可
溶である。
ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動をウエーバー ケ
イ(Weber K)及びオスボーン エム(Osborn M)の方法、
ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(J.B
iol.Chem.)。１９６９、２４、４４０６−１２、の方法
に従つてドデシル硫酸ナトリウムの存在下に行なつた。
電気泳動の後、ゲルをクーマシー ブリリアントブルー
(Coomassie brilliant blue)で着色しそしてデンシトメ
ーター法による結合解析を行なつた。最も高い割合の結
合はラクトサミン化ヒトアルブミンの移動度を有してお
り、次の結合はラビツトの７Ｓγ−グロブリンの移動度
を有している。横座標に電気泳動移動度を、そして縦座
標にL-HSA及びそのオリゴマー形態（モノマー、ダイマ
ー、トリマー及びテトラマー）の分子量の対数をチヤー
トにプロツトすることによつて直線が得られる。この事
実は第２、第３及び第４バンド（割合が減少する順に）
はそれぞれL-HSAのダイマー、トリマー及びテトラマー
に相当することを示唆する。
電気泳動は結合体がL-HSAモノマー約３７％、ダイマー
２２％、トリマー１５％及びテトラマー８％を含み、残
りの１８％はL-HSAのより高級オリゴマー（添付図に示
された如き）から成ることを示す。これらの百分率は凍
結乾燥の４ケ月後に行なわれた電気泳動分析により示さ
れた如く長期間において変化しない。かくして、上記方
法に従つて製造された結合体は公知方法に従つて製造さ
れた結合体と異なつて凍結乾燥後に重合を起こさないこ
とが証明される。
凍結された結合体のモル比ara-ＡＭＰ／タンパク質を測
定するために、結合体を再びセフアデツクスＧ−１００
カラムでクロマトグラフイーに付し、平衡化しそして0.
9％NaClで溶離する。
モル比は下記の方法により分光光度法により決定する。
アルブミンの濃度はロウリー等(Lowry et al)の方法
［ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
(J.Biol.Chem.１９５１、１９３、２６６−75)により測
定され、次いで２６０ｍμにおける光学密度が分光光度
計で読み取られる。次いで、その波長におけるアルブミ
ンによる寄与 は差し引かれ、そして得られる値からara-ＡＭＰの濃度 が計算される。上記方法によつて得られた結合体の６つ
の異なる調製物のモル比は１３−１５であることが見出
された。０−４℃又は室温に保持された結合体の溶解性
及びモル比ara-ＡＭＰ／L-HSAは長期間（今日までに試
験された最大の時間である少なくとも４ケ月まで）にお
いて減少しない。
実施例２ ara-ＡＭＰ１５０mgをNaHCO3（粉末）を添加して３mlＨ
2Ｏ中に溶解する。この溶液にＬ30−ＨＳＡ１５０mgを
加える。L-HSAが溶解すると、pHを電位差計による制御
下に１０Ｎ NaOHで7.5に調節し、しかる後１−エチル
−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１５
０mgを加える。混合物を暗所で攪拌下に２５℃で２４時
間インキユベートする。
混合物（約３ml）を磁気手段によつて攪拌下に保持され
たNaClの0.3％水溶液５を含有するフラスコに入れら
れた6.3mmの直径を有するビスキング管(Visking tube)
中で透析する。
これらの条件下では結合体の沈澱は起こらない。透析は
０−４℃で２４時間続け、そしてNaClの0.3％溶液を２
回変える。２４時間及び２回のこの変更の後遊離ara-Ａ
ＭＰは最早存在しない。
結合体を集め、そしてその容量を測定する。結合体(150
mg)は今やNaClを含有する溶液(3mg／ml)中に溶解した状
態で含まれている。結合体各１００mg当り９mgのNaClが
存在しているように更にNaClを加え、次いで凍結乾燥を
行なう。この状態において、凍結乾燥された調製物１０
９mgを１mlＨ2Ｏで溶解することによつて（溶解性は最
適である）、注射にいつでも使用できる状態の生理学的
溶液(0.9％NaCl)１ml中の結合体１００mgの溶液が得ら
れ、又はこのものは生理学的溶液で更に希釈することが
できる。
実施例１に従つて製造されたara-ＡＭＰ−Ｌ−ＨＳＡ結
合体の生物学的性質 ara-ＡＭＰとの結合反応は、ガラクトースで終るタンパ
ク質に特異的な肝細胞の受容体とのL-HSAの相互作用能
力に影響を与えない。
事実、マウスにおいて（以下に報告したデータからわか
る通り）、血漿からの放射性アシアロフエチユイン(AF)
の消失は結合体及び等量の結合されていないＬ31ＨＳＡ
（non-conjugated Ｌ31ＨＳＡ）によつて同じ速度で競
合的に阻止される（フエチユインは、シアル酸の除去の
後はガラクトース残基を露出しそして肝細胞中に選択的
に浸透するウシ胎仔血清(bovine phoetal serum)のタン
パク質である）（既に記載したアシユウエル等の論文
（１４）参照）。
フエチユインは酵素により脱シアル化され、(desialate
d)［(22)モレル エージー、フアンデルハマー シージ
エイ、シヤインバーグ ＩＨ、アシユエウル ジー．ジ
ヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、１９
６６；２４１：３７４５−４９（(22)Morell ＡＧ、Va
n der Hamer CJ、Scheinberg IH、Ashwell G.J.Biol.Che
m.１９６６；２４１：３７４５−４９）］、次いで［14
Ｃ］ホルムアルデヒドで標識された［(23)コツクス ア
ールエー、グリーンウエル ビー、バイオケミカル ジ
ヤーナル。１９８０；１８６−８６１−７２(Cox RA、Gr
eenwell P.Biochem J.１９８０；１８６−８６１−７
２）］。
２８−３０ｇの雌のスイスマウス(Swiss mice)に14ＣＳ
Ｆ(4.9×１０6dpm／mg)2μｇ／ｇを静脈内に注射した。
Ｌ31-ＨＳＡまたは結合体を２μｇ／ｇの投与量で14Ｃ
ＡＦと同時に静脈内に投与した。すべての場合に、注射
した容量は１０μ／ｇであつた。１０分後この動物を
殺しそして血漿の放射能を測定した。各値は１０匹のマ
ウスから得られた結果の平均（±S.E.）を表わす。
表２は、エクトロメリア ウイルス(Ectromelia virus)
により誘発された肝炎にかかつたマウスの腸(intestin
e)及び骨髄(medulla ossium)における細胞ＤＮＡ(cellu
lar DNA)の合成並びに肝臓におけるウイルスＤＮＡの合
成に対して、放射性チミジンの２時間前に注射された２
つの投与量の結合体の作用を示す。結合体は他の２つの
器官における阻害を引き起こすことなく肝臓におけるＤ
ＮＡの合成を阻害する。体重１ｇ当り1.33mgの投与量で
マウスに静脈内経路により投与された結合体は毒性の明
白な徴候を何ら引き起こさない。結合体のこの投与量の
注射に続く１０日間における体重増加の曲線及び食物消
費の曲線は生理学的溶液を静脈内投与された対照マウス
のそれに等しかつた。1.33mg／ｇの投与量は試験された
最大投与量であり、そしてエクトロメリアウイルスによ
り誘発された肝炎の処置にたいして使用される投与量よ
り４０−５０倍大きい（表２参照）。
結合体L-HSA-ara-AMPの6.5より高いpHにおける製造の更
なる実施例 これらの実施例下記表３に報告されたデータから再び始
めそれら及び再び始めることができる（その製造が実施
例１に記載された結合体は表の結合体NO.1に相当す
る）。使用したカルボジイミド、L-HSAのラクトース／
アルブミン モル比、反応時間及び温度、反応体濃度及
びpH値（それらは常に6.5より大きいとの条件下に）を
変えることによつて、たとえ室温に保持されたとしても
凍結乾燥後可溶性のままである結合体が常に得られる。
【図面の簡単な説明】
添付図面は実施例１に記載の電気泳動のグラフ図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マツシモ・バルダツチ イタリー国56100ピサ・ビアデレピアツジ エ ９

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】カルボジイミドで活性化されたアデニン−
    ９−β−Ｄ−アラビノフラノシド５′モノホスフエート
    （ａｒａ−ＡＭＰ）とラクトサミン化ヒトアルブミン
    （Ｌ−ＨＳＡ）を相互に反応させて、ラクトサミン化ヒ
    トアルブミンとアデニン−９−β−Ｄ−アラビノフラノ
    シド５′モノホスフエートの結合体を製造する方法にお
    いて、結合反応を6.5より高いpHで行なうことを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】カルボジイミドによるａｒａ−ＡＭＰの活
    性化を、ａｒａＡＭＰ及びＬ−ＨＳＡを含有する反応媒
    体中で、該反応媒体中にカルボジイミドを導入すること
    によって直接行なうことを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  3. 【請求項３】該カルボジイミドが１−エチル−３−（ジ
    メチル−アミノプロピル）−カルボジイミドであること
    を特徴とする特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。
  4. 【請求項４】該pHが6.5乃至9.5であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】該pHが7.5であることを特徴とする特許請
    求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】該反応を２５℃の温度で行なうことを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】該結合体のアデニン−９−β−Ｄ−アラビ
    ノフラノシド５′モノホスフエートとラクトサミン化ヒ
    トアルブミンのモル比が５乃至２０であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。
JP60278843A 1984-12-11 1985-12-11 ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法 Expired - Fee Related JPH0633320B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT23998A/84 1984-12-11
IT23998/84A IT1177381B (it) 1984-12-11 1984-12-11 Metodo per la preparazione di coniugati della adenina-9-beta-d-arabino furano-side 5' monofosfato con albumina umana lattosaminata, coniugati risultanti e relative composizioi terapeuticamente attive

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS61171430A JPS61171430A (ja) 1986-08-02
JPH0633320B2 true JPH0633320B2 (ja) 1994-05-02

Family

ID=11211397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60278843A Expired - Fee Related JPH0633320B2 (ja) 1984-12-11 1985-12-11 ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4794170A (ja)
EP (1) EP0184838B1 (ja)
JP (1) JPH0633320B2 (ja)
AT (1) ATE48612T1 (ja)
AU (1) AU576923B2 (ja)
CA (1) CA1252719A (ja)
DE (2) DE184838T1 (ja)
ES (1) ES8704945A1 (ja)
IT (1) IT1177381B (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1207507B (it) * 1985-10-21 1989-05-25 Baldacci Lab Spa Coniugato della 9-(2-idrossietossimetil)guanina con albumina umana lattosaminata, procedimento per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che la contengono.
US5554386A (en) * 1986-07-03 1996-09-10 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides
IT1245217B (it) * 1991-03-12 1994-09-13 Baldacci Lab Spa Coniugato di azidotimidina ed albumina umana procedimento per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che lo contengono
IT1256110B (it) * 1992-11-23 1995-11-28 Procedimento di coniugazione di nucleosidi antivirali con albumina umana lattosaminata
ITMI20010027A1 (it) * 2001-01-10 2002-07-10 Uni Di Bologna Dipartimento Di Composizioni teraputiche per una chemioterapia locoregionale non invasiva delle micrometastasi epatiche
ATE411819T1 (de) * 2003-02-17 2008-11-15 Upperton Ltd Konjugate für medizinische abbildungen umfassend träger, targeting-anteile und kontrastmittel

Also Published As

Publication number Publication date
CA1252719A (en) 1989-04-18
AU5118685A (en) 1986-06-19
ATE48612T1 (de) 1989-12-15
ES8704945A1 (es) 1987-05-01
DE3574707D1 (de) 1990-01-18
AU576923B2 (en) 1988-09-08
ES549828A0 (es) 1987-05-01
IT1177381B (it) 1987-08-26
IT8423998A1 (it) 1986-06-11
EP0184838B1 (en) 1989-12-13
IT8423998A0 (it) 1984-12-11
JPS61171430A (ja) 1986-08-02
EP0184838A3 (en) 1987-04-29
EP0184838A2 (en) 1986-06-18
US4794170A (en) 1988-12-27
DE184838T1 (de) 1987-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5981507A (en) Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
Russell-Jones et al. Vitamin B12 mediated oral delivery systems for granulocyte-colony stimulating factor and erythropoietin
BG108274A (bg) Конюга'и о' хидрок'иалкил'корбяла (has) и ак'ив...н ингр...ди...н'
JPH06503354A (ja) アシアロ糖蛋白抱合薬剤
KR20030074637A (ko) 글리코실화/갈락토실화된 펩티드, 이관능기적 링커 , 및뉴클레오티드성 단량성/중합체의 접합체, 및 관련 조성물및 사용 방법
JPH11507034A (ja) 抗原プロセシング細胞標的複合体
Fiume et al. SELECTIVE INHIBITION OF ECTROMELIA VIRUS DNA SYNTHESIS IN HEPATOCYTES BY ADENINE-9Q-D-ARABINOFURANOSIDE (ARA-A) AND ADENINE-9 $3-D-ARABINOFURANOSIDE 5’-MONOPHOSPHATE (ARA-AMP) CONJUGATED TO ASIALOFETUIN
US20120213732A1 (en) Targeted delivery of antiviral compounds through hemoglobin bioconjugates
FI97692C (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen aktivaattori-kohdistusosa -konjugaatin ja esilääkkeen valmistamiseksi
WO2001079302A1 (fr) Combinaison d'acide folique et de polysaccharide, son procede de preparation et composition pharmaceutique contenant cette combinaison agissant comme principe actif
JPH0633320B2 (ja) ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法
Fiume et al. Targeting of antiviral drugs to the liver using glycoprotein carriers
JP2001081103A (ja) ヒアルロン酸結合薬剤
EP0624098B1 (en) Process of conjugation of antiviral nucleosides with lactosaminated human albumin
JPH09510696A (ja) 肝細胞を標的とする薬物結合体
EP0220657B1 (en) Conjugate of 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanine with lactosaminated human albumin, process for the peparation thereof and pharmaceutical compositions containing it
CA2566874C (en) Targeted delivery of anti-viral compounds through hemoglobin bioconjugation
JPH01211530A (ja) 抗腫瘍剤
EP0652776B1 (en) Hepatotropic conjugates of antiviral drugs, carriers thereof and pharmaceutical compositions containing them
JP2997848B2 (ja) Ｎ―アセチルキトオリゴ糖とマイトマイシン類の複合体及び抗腫瘍剤
AU2003231664B2 (en) Hemoglobin-haptoglobin complexes
Franssen Drug targeting to the kidney with low molecular weight proteins
EP0551442A1 (en) Self-assembling ion pair drugs
WO1992014758A1 (en) Conjugate molecules

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees