JPH09510696A - 肝細胞を標的とする薬物結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、アシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を治療剤の標的とするための結合体を提供する。これらの結合体は、治療剤及びアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドを含み、この治療剤及びリガンドは、橋掛け剤により結合される。橋掛け剤は、架橋剤、多官能性キャリアー分子又は架橋剤及び多官能性キャリアー分子であってよい。好適具体例において、治療剤は、ヌクレオシドアナログ又はコルヒチンであり、そしてリガンドは、アシアロオロソムコイド、アラビノガラクタン又はチロシル（グルタミル）グルタメートのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミドである。好適架橋剤には、アミノアシル誘導体、カルボキシアシル誘導体、ホスフェート、ペプチド及び還元的に不安定な架橋剤が含まれる。好適な多官能性キャリアー分子には、ポリアミノ酸及び多糖類が含まれる。この発明の結合体を用いて細胞を治療剤の標的として、例えば、ウイルス感染した肝細胞におけるウイルスＤＮＡの複製を阻止することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 肝細胞を標的とする薬物結合体発明の背景 非特異的毒性は、ウイルス感染及び癌等の病気の治療のための化学療法剤の開 発に対する主要な障害である。これらの両方の型の病気の増殖する分子的機構が 正常細胞の代謝と密接に関係しているので、これらの病気の増殖を選択的にブロ ックする薬物の発見は遅かった。従って、従来の化学療法は、治療剤の平衡させ た使用に依存しており、それらの多くは、未感染細胞又はトランスフォームされ てない細胞において毒性が明白となる前の活性濃度の狭い範囲を有するものであ り、それ故に、治療剤の一層高濃度での使用を妨げるものである。ある種の治療 剤の効力に対する更なる障害は、それらの薬剤の体内での不活性化及び／又はそ れらの薬剤の体からの迅速な排泄を含み、それ故に、それらの治療活性を制限す る。 薬物の治療活性を増大させるために取られたアプローチは、その薬物をその薬 物のキャリアーとして働く巨大分子に結合することであった。薬物の巨大分子へ の結合は、薬物の排泄速度を遅くし、恐らくは非特異的なピノサイトーシスによ る薬物の細胞への取り込みを増大させることができる。ある種の薬物は、高分子 の巨大分子例 えば多糖類及びポリアミノ酸に結合され、その薬物の減少した不活性化及び体か らの減少した排泄を生じた。例えば、Bernstein，A．等、(1978)J.Natl.Cancer Inst.60:379-384; Kato，Y.等、(1984)Cancer Res．44:25-30; Kery，V.等、(19 90)Int．J．Biochem．22:1203-1207; Onishi，H.等、(1991)Drug Design and De livery 7:139-145を参照されたい。 しかしながら、特異的レセプターのリガンドとして機能しない巨大分子への薬 物の結合は、治療剤の非特異的毒性の問題を扱っていない。治療剤の特異性を増 大させるための１つの戦略は、所望の細胞集団に対する薬物の標的を定めた送達 を達成するための細胞特異的リガンドへの薬物の結合を含む。薬物送達の標的と されるべき細胞（例えば、ウイルス感染した又は悪性の細胞）の表面上の構造に 結合するリガンドへの薬物の結合は、標的細胞によるレセプター媒介のエンドサ イトーシスによる薬物の特異的取り込みを増大させて非特異的細胞毒性を減少さ せることができる。 薬物結合用に用いられてきた１つの細胞特異的リガンドの典型は、標的細胞上 に存在する表面構造に対するモノクローナル抗体である。例えば、治療剤を抗腫 瘍細胞抗体に結合させることによる治療剤の腫瘍細胞への標的を定めた送達が広 く研究されてきた（総説は、Pietersz,G.A.(1990)Bioconjugate Chemistry 1(2) :89-95を参照されたい）。 薬物結合用に用いられてきた他の型の細胞特異的リガンドは、標的細胞上に存 在する糖蛋白質に対する膜レセプターに結合する糖蛋白質である（総説としては 、Bodmer，J.L.及びDean，R.T.(1988)Methods in Enzymology，112:298-306を参 照されたい）。臨床的に特に重要な１つの標的細胞は、肝実質細胞又は肝細胞で あり、これは、肝炎ウイルス例えばＢ型肝炎ウイルスの一次感染部位である。ヌ クレオシドアナログアデニンアラビノフラノシドモノホスフェート（ａｒａＡＭ Ｐ）及びアシクロバー（acyclovir）モノホスフェート（ＡＣＶＭＰ）は、Ｂ型 肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の治療のための治療剤としての見込みを示したが、それ らの遊離の薬物としての使用は、毒性、急速なクリアランス（ａｒａＡＭＰにつ いて）及び乏しい細胞取り込み（ＡＣＶＭＰについて）等の問題を伴うものであ った（例えば、Jacyna，M.R.及びThomas，H.C.(1990)British Medical Bulletin ，46:368-382; Sacks，S.L．等(1979)JAMA 241:28; Whitley,R.等(1980)Drugs 2 0 :267; Balfour，H.H.(1984)Ann．Rev．Med．35:279; Weller，I.V.D.等(1983)J ．Antimicrov．Chemother．11:223を参照されたい）。ａｒａＡＭＰ及びＡＣＶ ＭＰは、それらを、肝細胞上に存在するアシアロ糖蛋白質レセプターに結合する ラクトサミン化したヒト血清アルブミン（以下、Ｌ−ＨＳＡ）に結合することに より肝細胞を標的とした（Fiume，L．等(1981)FEBS Letters 129:261-264； Fiume，L．等(1988)Pharm．ActaHelv．63:137-139；Fiume，L．(1989)Naturwiss enschaften 76:74-76; 米国特許第４，７９４，１７０号）。これらの場合、ホ スフェート部分を用いてヌクレオシドアナログをＬ−ＨＳＡに架橋した。ＡＣＶ ＭＰも又、グルタレート架橋剤又はスクシネート架橋剤によってＬ−ＨＳＡに結 合された（米国特許第４，７２５，６７２号）。Ｌ−ＨＳＡに結合されたａｒａ ＡＭＰ結合体は、アシアロ糖蛋白質レセプターにより選択的に循環から取り去ら れ、肝細胞中でＤＮＡ合成を阻害した（Fiume，L．等(1981)FEBS Letters 129:2 61-264）。Ｌ−ＨＳＡと結合されたＡＣＶＭＰ結合体は、肝細胞中で遊離の薬物 を放出することが示された（Fiume，L．等(1989)Naturwissenschaften 76:74-76 ）。両結合体は、ウッドチャック肝炎ウイルスのＤＮＡレベルを未結合の薬物よ り低投与量で低下させ（Ponzetto，A.等(1991)Hepatology 14:16-24）、又ａｒ ａＡＭＰ−Ｌ−ＨＳＡ結合体は、ヒトにおいてＨＢＶ複製を阻止した（Fiume，L ．等(1988)Lancet 2:13-15）。しかしながら、ラクトサミン化アルブミンを細胞 特異的リガンドとして使用することは欠点となり得る。Ｌ−ＨＳＡのアシアロ糖 蛋白質レセプターに対する特異性は、ラクトサミネーションにおいてアルブミン に結合するガラクトシル残基から生じる。もしこのプロセスの効果がないとする と、多くのアルブミンに結合したガラクトシル残基は、アシアロ糖蛋白質レセプ ターに対 する高い親和性を有するリガンドを生成するのに十分でなく、それにより、結合 体の標的を定める能力を減じることがあり得る。 多官能性のキャリアー分子も又、薬物の治療活性を増大させるために用いられ た。多官能性キャリアー分子は、他の分子が結合し得る多数の反応性側鎖を有し 、それ故に、多数の小分子が単一分子のキャリアーに結合することができるとい う利点を有する。薬物は、非特異的取り込みを増大させるために多官能性キャリ アー分子例えばポリグルタミン酸に結合された（例えば、Kato，Y．等(1984)Can cer Res．44:25-30を参照されたい）。しかしながら、多官能性キャリアー分子 の利用と治療剤の標的を定めるための細胞特異的リガンドとを組み合わせる試み は、限界を示した。ある研究（Fiume，L．等(1986)FEBS Letters 203:203-206） においては、ＡＳＧＲを介してウイルス感染した肝細胞を抗ウイルス剤の標的と するための結合体において、ガラクトース残基をポリリジンに結合することによ り、ポリリジンが用いられた。次いで、ａｒａＡＭＰ及びＡＣＶＭＰがガラクト シルポリリジンに結合された。２つの構築物のうち、ａｒａＡＭＰ−ガラクトシ ル−ポリリジンのみが、効果的に肝細胞を標的とし、Ectromeliaウイルス感染し たマウスにおけるＤＮＡ合成を阻止した；ＡＣＶＭＰ−ガラクトシル−ポリリジ ン結合体は不活性であった。発明の要約 この発明は、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的 とすることのできる薬物結合体に関するものである。治療剤をアシアロ糖蛋白質 レセプターに対するリガンドに結合することにより、アシアロ櫃蛋白質レセプタ ーをその治療剤の標的とする。治療剤とリガンドを結合させる１種以上の橋掛け 剤（bridgingagent）により、治療剤をリガンドに結合する。橋掛け剤は、治療 剤とリガンドとを、その薬剤の治療活性又はリガンドの結合活性を破壊すること なく結合させる特性を有する。リガンドのアシアロ糖蛋白質レセプターへの結合 は、結合体のレセプター媒介のエンドサイトーシスによる細胞による取り込みを 促進する。 好適具体例において、結合体は、治療剤並びに、アシアロオロソムコイド、ア ラビノガラクタン及び合成リガンドＹＥＥ（ＧａｌＮＡｃＡＨ）₃から選択する アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドを含む。治療剤を、橋掛け剤（架 橋剤、多官能性キャリアー分子又は架橋剤と多官能性キャリアー分子の両者であ ってよい）によりリガンドに結合する。架橋剤を単独で用いる場合には、架橋剤 を治療剤とリガンドの両者に共有結合させ、それにより、治療剤をリガンドに結 合させる。例えば、リガンド上のアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル 基と反応する架橋剤を用いることができる。同様に、多官能性キャリアー分子を 単独で用いる場合に は、多官能性キャリアー分子を、治療剤とリガンドの両者に共有結合させ、それ により、治療剤をリガンドに結合させる。例えば、アルデヒド基と反応性の多官 能性キャリアー分子例えばポリアルデヒドデキストランを用いることができる。 或は、架橋剤と多官能性キャリアー分子の両者を用いる場合には、架橋剤が治療 剤と多官能性キャリアー分子の両者と共有結合し且つ多官能性キャリアー分子が リガンドと共有結合して、それにより、治療剤をリガンドに結合させるように試 薬を選択する。架橋剤は、アミド結合、ホスホアミド結合又はジスルフィド結合 により多官能性キャリアー分子に結合することができる。例えば、アミノアシル 架橋剤を、多数の反応性のカルボキシル基を有する多官能性キャリアー分子と共 に用いることができ、或は、カルボキシアシル架橋剤を、多数の反応性のアミノ 基を有する多官能性キャリアー分子と共に用いることができる。 これらの結合体において用いるための好適な架橋剤には、スクシネート及びグ ルタレートのカルボキシアシル誘導体、トランス−４−アミノメチルシクロヘキ サンカルボキシレート若しくは４−アミノブチレートのアミノアシル誘導体、（ ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートの誘導体又はアミノ酸配列Ｌｅｕ− Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプチドが含まれる。好適な多官能性キャリアー分子には 、ポリアミノ酸例えばポリリジン、ポリオルニチン、ポリグルタミン酸及びポリ アスパラギン酸 並びに多糖類例えばポリアルデヒドデキストランが含まれる。 この発明の結合体を用いて、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している肝細 胞を治療剤の標的とすることができる。こうして、肝細胞のウイルス感染に対し て効果のある治療剤をアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドに結合する ことができる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルスに対して効果的な抗 ウイルス性の薬物を、これらの結合体において用いることができる。好適な型の 抗ウイルス治療剤はヌクレオシドアナログである。この発明は、ヌクレオシドア ナログとアシアロ糖蛋白質レセプターリガンド例えばアシアロオロソムコイドを 含む結合体を包含し、ヌクレオシドアナログが９−β−Ｄ−アラビノフラノシル シトシン、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン、ジデオキシシチ ジン、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン及び３’−アジド−３’−デオ キシチミジンである結合体を含む。この発明の結合体は、ウイルス感染した細胞 例えばＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞におけるウイルスＤＮＡの複製を阻止 するのに有用である。 この発明は、更に、患者において、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現してい る細胞を治療剤の標的とする方法を提供する。この方法は、治療剤とアシアロ糖 蛋白質レセプターリガンド例えばアシアロオロソムコイドとの結合体を形成する こと、及びその結合体を生理的に許容 し得るビヒクルにて患者に投与することを含む。図面の簡単な説明 図１は、ＨＢＶ ＤＮＡ感染した２．２．１５細胞におけるＨＢＶ ＤＮＡの 複製中間体（ＲＩ）及び弛緩した環（ＲＣ）の形態の細胞内蓄積に対するａｒａ Ｃ−グルタメート−ＰＬ−ＡＳＯＲ結合体の濃度の増加の効果を示すグラフであ る。 図２は、ＨＢＶ ＤＮＡ感染した２．２．１５細胞における弛緩した環状のＨ ＢＶ ＤＮＡの細胞内蓄積に対する遊離のＡＣＶ及びＡＣＶＭＰ−ＰＬ−ＡＳＯ Ｒ結合体の濃度の増加の効果を示すグラフである。 図３は、ＨＢＶ ＤＮＡ感染した２．２．１５細胞からの培養培地中でのＨＢ Ｖ ＤＮＡの細胞外蓄積に対する遊離のＡＣＶ及びＡＣＶＭＰ−ＰＬ−ＡＳＯＲ 結合体の濃度の増加の効果を示すグラフである。 図４は、ＨＢＶ ＤＮＡ感染した２．２．１５細胞における弛緩した環状のＨ ＢＶ ＤＮＡの細胞内蓄積に対するｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ結合体の濃度の増 加の効果を示すグラフである。発明の詳細な説明 この発明は、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的 とすることのできる結合体に関するものである。この治療剤をアシアロ糖蛋白質 レセプ ター（以下、ＡＳＧＲ）に対するリガンドに結合することにより、ＡＳＧＲをそ の標的とする。このリガンドは、アシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を治 療剤の標的とし、結合体がレセプター媒介のエンドサイトーシスにより細胞によ って取り込まれるのを促進するように作用する。この発明の結合体が細胞を治療 剤の標的とする効果を達成するので、所望の治療効果を達成するのに必要な結合 体の投与量は、未結合の治療剤と比較して少ない。更に、これらの結合体は、ア シアロ糖蛋白質レセプターを発現していない細胞から離れるよう方向付けられる ので、治療剤の非特異的細胞毒性がイン・ビボで減少することが予想される。 用語「結合体」は、互いに共有結合した２つ以上の分子種を含むことを意図す る。この発明の結合体は、少なくとも一の治療剤と一のＡＳＧＲに対するリガン ド及び通常はこの治療剤とリガンドとの間の橋掛け剤として機能する少なくとも 一の更なる分子種とからなる。従って、本質的に、この結合体の３つの成分が考 えられる：即ち、治療剤、リガンド及びこれら２者を一つに結合させる手段（即 ち、橋掛け剤）であり、以下の節において一層詳細に論じることとする。Ｉ．治療剤 用語「治療剤」は、患者の生理的機能を有益に変化させる目的、又は患者の病 気若しくは障害を有益に治療す る目的をもって患者に投与される分子を含むことを意図する。治療剤には、薬物 、慣用の抗ウイルス剤（ヌクレオシドアナログを含む）、慣用の抗腫瘍剤、逆転 写酵素阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、真核生 物ＤＮＡジャイレース阻害剤、ＤＮＡ結合剤、ホルモン、成長因子、ビタミン、 蛋白質及びペプチド及びそれらのアナログ、核酸及びそれらのアナログ、並びに 他の生物活性分子が含まれる。例えば、この治療剤は、ＡＳＧＲを発現している ウイルス感染細胞を標的とする、ウイルス感染治療手段としての薬物であってよ い。 治療剤の標的である好適なＡＳＧＲ発現細胞型は、肝細胞である。従って、肝 細胞のウイルス感染に有効な抗ウイルス性薬物をＡＳＧＲに対するリガンドに結 合してウイルス感染した肝細胞をその抗ウイルス性薬物の標的とすることができ る。肝細胞のウイルス感染は、如何なる向肝臓性ウイルスによる感染であっても よい。向肝臓性ウイルスの例には、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型 肝炎ウイルス及びＤ型肝炎ウイルスが含まれる。治療剤が向けられる好適な向肝 臓ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。 ウイルス感染例えばＢ型肝炎ウイルスを治療する一つの治療アプローチは、ウ イルスＤＮＡ合成を邪魔する薬物例えばヌクレオシドアナログを用いることであ る。例えば、２つのヌクレオシドアナログ、９−β−Ｄ−アラ ビノフラノシルアデニン（ａｒａＡ）及び９−（２−ヒドロキシエチオキシメチ ル）グアニン（アシクロバー；ＡＣＶとしても知られている）が、慢性Ｂ型肝炎 ウイルス感染の患者において試験された（Hoofnagle，J.H.(1984)Gastroenterol ogy 86:150-157; Weller，I.V.D.等、(1985)Gut 26:745-751; Sacks，S.L．等、 (1979)JAMA 241:28; Weller，I.V.D．等、(1983)J Antimicrob.Chemother．11:2 23-231; Alexander，G.J.M.等、(1986)J．Hepatol．3(補遺 2):S123-S127）。遊 離のヌクレオシドアナログは、ウイルスの増殖をブロックする効果を示したが、 投与量に関係した副作用が認められた。この発明の結合体中へのヌクレオシドア ナログの取り込みは、この薬物の治療活性を増大させ、それにより、治療効果に 必要な薬物の投与量を減少させることができる。従って、一具体例において、こ の結合体の治療剤は、ヌクレオシドアナログである。ここで用いる場合、用語「 ヌクレオシドアナログ」は、下記の一般式を有する分子を含むことを意図する： （式中、Ｚは酸素、硫黄又は炭素であり、Ｂはヌクレオ シド塩基又はアナログであり、Ｘ及びＹは置換基例えばＯＨ、Ｈ、Ｎ₃、Ｆ等で あり、そしてＲは、ヌクレオシドアナログの架橋剤及び／又はキャリアー分子へ の共有結合による結合を可能にする官能基である）。適当な官能基の例には、遊 離の−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＯＯＨ又は−ＳＨ部分を与えるものが含まれる。 用語「ヌクレオシドアナログ」は又、下記の一般式を有する非環状ヌクレオシ ドを含むことも意図する： （式中、Ｂはヌクレオシド塩基又はアナログであり、Ｚは酸素、硫黄又は炭素で あり、そしてＲは、ヌクレオシドアナログの架橋剤及び／又はキャリアー分子へ の共有結合による結合を可能にする官能基である）。適当な官能基の例には、遊 離の−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＯＯＨ又は−ＳＨ部分を与えるものが含まれる。こ の発明の結合体において使用することのできる有効な抗ウイルス剤である非環状 ヌクレオチドの例は、Schaeffer による米国特許第４，１９９，５７４号に記載 されている。 この発明の結合体で用いるための好適なヌクレオシドアナログには、９−β− Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシ ルシトシン（ａｒａＣ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）及び３’ −アジド−３’−デオキシチミジン （ＡＺＴ）が含まれる。好適な非環状ヌクレオシドアナログは、９−（２−ヒド ロキシエチオキシメチル）グアニン（ＡＣＶ）である。他の可能なヌクレオシド アナログには、ガンシクロバー、ファムシクロバー、ペンシクロバー、ブロモビ ニルデオキシウリジン、ホスホノホルメート、アデノシン（ｄｄＡ）、イノシン （ｄｄＩ）、グアノシン（ｄｄＧ）、チミジン（ｄｄＴ）及びウラシル（ｄｄＵ ）の２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルア デニン−エリスロ−９−（２−ヒドロキシノニル）アデニン（ＡｒａＡ−ＥＨＮ Ａ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノウロシル−５−メチルウラ シル（ＦＭＡＵ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノウロシル−５ −エチルウラシル（ＦＥＡＵ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノ シル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビ ノフラノシル−５−ヨードシチジン（ＦＩＡＣ）、３’−フルオロ−ｄｄＣ、５ −クロロ−ｄｄＣ、３’−フルオロ−５−クロロ−ｄｄＣ、３’−アジド−５− クロロ−ｄｄＣ、３’−フルオロ−ｄｄＴ、３’−フルオロ−ｄｄＵ、３’−フ ルオロ−５−クロロ−ｄｄＵ、３’−アジド−ｄｄＵ、３’−アジド−５−クロ ロ−ｄｄＵ、２’−６’−ジアミノプリン２’，３’−ジデオキシリボシド（ｄ ｄＤＡＰＲ）並びにデオキシグアノシンの炭素環式アナログ（２’−ＣＤＧ）が 含まれる。 ヌクレオシドアナログに加えて、他の型の治療剤を用いてウイルス感染例えば 肝炎ウイルス感染を阻止することができる。例えば、逆転写酵素阻害剤、トポイ ソメラーゼ阻害剤、ジャイレース阻害剤及びＤＮＡ結合剤は、Ｂ型肝炎ウイルス のＤＮＡ複製を阻止することが示された（Civitico，G.等(1990)J.Med.Virol．3 1 :90-97）。この発明の結合体において治療剤として使用することのできる治療 上有効な化合物には、トポイソメラーゼII阻害剤エリプティシン、アムサルコシ ン、アドリアマイシン及びミトロザントロン、真核生物ＤＮＡジャイレース阻害 剤クーママイシンＡ１及びＤＮＡ結合剤ネオカルジノスタチン及びクロロキン（ これらは、ＤＮＡに挿入されるか又はＤＮＡにニックを入れる）が含まれる。II．アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンド 治療剤は、それをアシアロ糖蛋白質レセプター（肝臓Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ特 異的レセプターとも呼ばれる）に対するリガンドと結合することにより、ＡＳＧ Ｒを発現している細胞を標的とする。用語「アシアロ糖蛋白質レセプターに対す るリガンド」は、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合する任意の分子を含むこと を意図する。アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドの１つの型は、クラ スター化した末端ガラクトース残基を有するアシアロ糖蛋白質である。かかるア シアロ糖蛋白質は、終から２番目のガラクトシル残基を有するシアル酸で終 る糖蛋白質から調製することができる。これらのガラクトース残基は、標準的技 術を用いて、この糖蛋白質の脱シアル化によって露出される。例えば、糖蛋白質 を、酵素ノイラミニダーゼで処理することにより脱シアル化することができる。 或は、糖蛋白質を、実施例１に記載のように、酸加水分解によって脱シアル化す ることができる。アシアロ糖蛋白質の例には、アシアロオロソムコイド、アシア ロフェチュイン、アシアロセルロプラスミン、アシアロハプトグロブリン及び脱 シアル化した水疱性口内炎ウイルスが含まれる。オロソムコイド、フェチュイン 、セルロプラスミン及びヘパトグロブリンは、血漿から得られ、次いで、脱シア ル化することができる。 この発明の結合体における使用のために好適なＡＳＧＲリガンドは、アシアロ 糖蛋白質アシアロオロソムコイド（以下、ＡＳＯＲ）である。オロソムコイド蛋 白質若しくはその蛋白質の誘導体又は結合した炭水化物部分のある種の変化（例 えば、アミノ酸欠失又は点突然変異）は、その糖蛋白質のＡＳＧＲへの結合能力 を破壊せずになし得るということも又、認めるべきである。かかるＡＳＯＲの変 化した又は誘導体化した形態は、ここで用いる場合、用語「アシアロオロソムコ イド」の範囲内にあることを意図する。ＡＳＯＲは、ヒト血漿から単離されたオ ロソムコイド（α−１−酸糖蛋白質とも呼ばれる）から、その単離したオロソム コイドを脱シアル化して終 から２番目のガラクトース基を露出させることによって調製することができる（ 実施例１に記載）。幾つかの放射性標識した血漿由来のアシアロ糖蛋白質をイン ・ビボで循環中へ同時に注入すると、アシアロオロソムコイドは、最も急速に循 環から取り除かれ、ＡＳＯＲが肝臓に急速に取り込まれることを示すということ が見出されている（J.Biol.Chem.(1970)245:4397; 及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／２ ２３１０を参照されたい）。更に、ＡＳＯＲは、治療剤又は橋掛け剤がＡＳＯＲ に結合することを可能にするカルボン酸基に富んでいる。 他の型のＡＳＧＲに対するリガンドは、ネオ糖蛋白質、ＡＳＧＲに対するリガ ンドとなるように改変された蛋白質である。例えば、末端ガラクトシル残基を蛋 白質に結合させてそれをＡＳＧＲに対するリガンドに変換させることができる。 例えば、ガラクトース末端炭水化物例えばラクトースを還元的アミノ化により蛋 白質に結合させることができる。 この発明の結合体において使用することのできる他の型のリガンドは、ＡＳＧ Ｒに結合した炭水化物である。例えば、末端ガラクトース残基を有する多糖類を 用いてＡＳＧＲを治療剤の標的とすることができる。好適な炭水化物リガンドは 、アラビノガラクタンである。アラビノガラクタンは、多くの樹木及び植物種の 細胞壁の成分である。構造的には、アラビノガラクタンは、アラビノース及びガ ラクトースの分岐鎖を有するガラクトース主 鎖からなる。一般に、ガラクトース対アラビノースの比率は、５：１〜１０：１ である（Glickman編 (1982)FoodHydrocolloids，CRC Pressを参照されたい）。 アラビノガラクタンの治療剤、架橋剤又は多官能性キャリアー分子への結合を可 能にする官能基を与えるアラビノガラクタンの誘導体を調製することができる。 例えば、アラビノガラクタンのアミノ誘導体又はカルボキシる誘導体を用いて、 アラビノガラクタンがＡＳＧＲに対するリガンドとして働くこの発明の結合体を 調製することができる。 この発明の結合体において使用することのできる他の型のリガンドは、ＡＳＧ Ｒに対する合成リガンドである。この合成リガンドは、アミド結合を介してペプ チドと結合されたＡＳＧＲに対する結合特異性を有する炭水化物部分を含む。好 適な炭水化物部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミンである。例えば、２つ以上の 炭水化物部分をジ−若しくはトリペプチドに結合して、ＡＳＧＲに特異的なクラ スターリガンドを形成することができる。この合成リガンドは又、治療剤、架橋 剤又は多官能性キャリアー分子との共有結合を形成するために利用することので きる官能基を有する有機構造をも含む。好適な合成リガンドは、チロシル（グル タミル）グルタメートのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシル グリコシド）アミドであり、ここではＹＥＥ（ＧａｌＮＡｃＡＨ）₃と呼ぶ。Ｙ ＥＥ（ＧａｌＮＡｃＡＨ）₃ は、Lee等(1987)Glycoconjugate Journal 3:317に記載されたようにして、又はF indeis 等による米国特許出願第０８／０４５，９８５号に記載されたようにし て合成することができ、その内容を参考として本明細書中に援用する。ＹＥＥ（ ＧａｌＮＡｃＡＨ）₃の構造は、下記式により表すことができる： （式中、Ｒは、Ｈ又はＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである）。III．治療剤のＡＳＧＲのリガンドへの結合：橋掛け剤 治療剤を、治療剤をリガンドに結合する橋掛け剤として機能する中間物によっ てアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドに結合する。橋掛け剤は、治療 剤の治療活性又はリガンドの結合活性の何れも破壊せずに治療剤をリガンドに結 合させなければならず且つイン・ビボ の循環中で安定であるべきである。更に、橋掛け剤は、絶対的要求ではないが、 好ましくは、治療剤を細胞内で活性な機能的形態で放出すべきである。橋掛け剤 及び結合機構は、結合体が活性であるか否かを決定する際に主要な役割を演ずる 結合体の重要な要素である（即ち、治療剤及び／又はリガンドが不適当な様式で 橋掛け剤に共有結合している結合体は、機能的活性を保持し得ない）。例えば、 ＡＣＶＭＰ−Ｌ−ＨＳＡ結合体は、肝細胞を標的とし且つ抗ウイルス活性を示し た（Fiume，L.(1989)Naturwissenschaften 76:74-76；米国特許第４，７２５， ６７２号）が、ＡＣＶＭＰ−ポリリジン−ガラクトース結合体は不活性であった （Fiume，L．等(1986)FEBS Letters 203:203-206）。 ここで用いる場合、用語「橋掛け剤」は、治療剤をＡＳＧＲのリガンドに結合 させる分子を含むことを意図する。この発明の結合体で使用する橋掛け剤は、架 橋剤、多官能性キャリアー分子又は架橋剤と多官能性キャリアー分子の両者であ ってよい。従って、この発明の一具体例において、この結合体は、一般式Ａ−Ｂ −Ｃ−Ｄを有する（式中、Ａは治療剤、Ｂは架橋剤、Ｃは多官能性キャリアー分 子であり、Ｄはアシアロオロソムコイドである）。他の具体例において、この結 合体は、一般式Ａ−Ｃ−Ｄを有する（式中、Ａは治療剤、Ｃは多官能性キャリア ー分子であり、Ｄはアシアロオロソムコイドである）。更に他の具体例において 、この結合体は、一般 式Ａ−Ｂ−Ｄを有する（式中、Ａは治療剤、Ｂは架橋剤であり、Ｄはアシアロオ ロソムコイドである）。 用語「架橋剤」は、２つの反応性の官能基であって、その一方は第１の分子と 反応して共有結合を形成し且つ他方は第２の分子と反応して共有結合を形成し、 それにより、２つの分子を効果的に１つに繋げる反応性官能基を有することによ って２つの異なる分子間の橋掛け分子として機能し得る分子を含むことを意図す る。好ましくは、架橋剤は、異なる官能性部分の２つの反応性官能基を有する。 適当な官能基の例には、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基及びヒド ロキシ基が含まれる。架橋剤の１つの官能基が分子（例えば、治療剤）と反応す る際に、必要ならば、他の官能基を、その架橋剤の第２の官能基がその分子と反 応できないように修飾する保護基によって、その分子と反応することを防ぐこと ができる。第１の反応が完了した後に、保護基を除去して第２の官能基をもとに 戻し、次いで、第２の官能基を他の分子（例えば、アシアロオロソムコイド等の ＡＳＧＲリガンド）と反応させることができる。 用語「多官能性キャリアー分子」は、多数の（即ち、２つより多い）反応性の 官能基であって、他の分子と共有結合を形成し、それにより、それらの他の分子 を効果的に１つに繋げる反応性官能基を有することによって２つ以上の異なる分 子間の橋掛け分子として機能し得る分子を含むことを意図する。一般に、多官能 性キャリアー は、高分子構造を有し、好ましくは、多官能性キャリアーの多数の官能基は、同 じ官能性部分のものである。適当な官能基の例には、アミノ基、カルボキシル基 及びアルデヒド基が含まれる。多官能性キャリアー分子上に存在する多数の反応 性官能基の故に、多数の分子をそれに結合することができる（即ち、治療剤及び ／又はリガンドの多くの分子を単一のキャリアー分子に結合させることができる ）。従って、多官能性キャリアー分子を含む結合体の分子置換率は、一般に、多 官能性キャリアー分子を含まない結合体と比較して増大している。結合体の分子 置換率を増大させることは、結合体の治療インデックス（即ち、治療活性）を増 大させる手段を与える。 この発明により、幾つかの異なる結合戦略を用いて、治療剤をアシアロオロソ ムコイドその他のＡＳＧＲに対するリガンドに、種々の架橋剤及び／又は多官能 性キャリアー分子を用いて結合することができる。これらの戦略及び反応は、実 施例に詳述する。使用可能な異なる型の架橋剤及び多官能性キャリアー分子を以 下の節にて簡単にまとめる：Ａ．アシル架橋剤 治療剤のアシル誘導体であって、リガンド又はキャリアー−リガンド複合体上 の他の官能基と反応し得る官能基を有するアシル誘導体を調製することにより、 その治療剤をリガンド（又は、キャリアー−リガンド複合体） に結合することができる。このアシル誘導体の官能基は、例えば、カルボキシル 基（これは、次いで、リガンド又はキャリアー上のアミノ基と反応してアミド結 合を形成することができる）、アミノ基（これは、次いで、リガンド又はキャリ アー上のカルボキシル基と反応してアミド結合を形成することができる）又はリ ン酸基（これは、次いで、リガンド又はキャリアー上のアミノ基と反応してホス ホアミド結合を形成することができる）であってよい。カルボキシアシル架橋剤 ： 治療剤のカルボキシアシル誘導体を反応性アミノ基を有するリガンド又はキャ リアー−リガンドに活性エステル結合することにより、その治療剤をリガンド（ 又は、キャリアー−リガンド複合体）に結合することができる。簡単に言えば、 治療剤を、アミノ基又はヒドロキシ基にてアシル化してアシル誘導体を形成する 。好適なアシル誘導体は、グルタリル誘導体及びスクシニル誘導体である。治療 剤（例えば、ヌクレオシドアナログ）のカルボキシアシル誘導体を、以前に記載 されたようにして（例えば、Erlanger，B.F.等(1967)Methods Immun.Immunochem ．1:144を参照されたい）並びに実施例１及び２に詳述するようにして調製する ことができる。治療剤の誘導カルボキシル基は、治療剤のリガンド又はキャリア ー−リガンド複合体への結合を可能にする架橋剤と して機能する。この薬剤のカルボキシル誘導体は、活性化されて（例えば、Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドで）活性エステルを形成する。この活性化カルボキシ アシル化合物を、次いで、官能性アミノ基を有するリガンド又はキャリアー（例 えば、ポリリジン−ＡＳＯＲ等のキャリアー−リガンド複合体）と反応させてカ ルボキシアシル架橋剤とキャリアー又はリガンドのアミノ基との間のアミド結合 を形成し、それにより、この薬剤をキャリアー又はリガンドに結合させる。この カルボキシアシル誘導体を、実施例１及び２に詳述するようにキャリアー又はリ ガンドに結合することができる。治療剤のカルボキシアシル誘導体を結合するこ とのできる好適な高分子のキャリアー分子は、反応性アミノ基を有するポリアミ ノ酸例えばポリリジン又はポリオルニチンである。高分子のキャリアー分子を、 先ず、実施例１に記載のように、ＡＳＯＲ等のリガンドに結合させ、次いで、治 療剤のカルボキシアシル誘導体をキャリアー−リガンド複合体に結合することが できる。例えば、ヌクレオシドアナログａｒａＣのカルボキシアシル誘導体を、 下記のようにポリリジン−ＡＳＯＲに結合することができる： アミノアシル架橋剤 治療剤のアミノ誘導体を、反応性カルボキシル基を有するリガンド又はキャリ アー−リガンド複合体に、この誘導体化した治療剤のアミノ基とリガンド又はキ ャリアーのカルボキシル基との間のアミド結合形成によって結合することができ る。この治療剤のアミノ誘導体を、カルボジイミドカップリングによりリガンド 又はキャリアーに結合する。治療剤の好適なアミノ誘導体は、アミノアシル誘導 体である。例えば、治療剤のアミノメチルシクロヘキサンカルボキシル又は４− アミノブチリル誘導体を調製して、実施例４に記載のようにしてリガンド又はキ ャリアー−リガンドに結合させることができる。治療剤のアミノアシル誘導体を 調製するためには、アミノカルボン酸（例えば、アミノメチルシクロヘキサンカ ルボン酸（ＡＭＣＣ）又はアミノブタン酸（ＧＡＢＡ））のアミノ基を、例えば Schotten-Baumanのカルバミル化により保護し、この保護したアミノカルボン 酸を、カルボジイミド促進されたエステル化により治療剤と反応させる。この反 応に続いて、保護基を水素化分解(Brown，C.A.及びBrown，H.C.(1966)J.Org.Che m.31:3989-3995)により除去し、この薬剤のアミノアシル誘導体を、反応性カル ボキシル基を有するリガンド又はキャリアー−リガンド複合体に、カルボジイミ ドカップリング（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ ルボジイミドヒドロクロリドを使用）により結合させ る。例えば、一般のヌクレオシドアナログのアミノメチルシクロヘキサンカルボ キシル（ＡＭＣＣ）誘導体を、下記のようにＡＳＯＲに結合することができる： アミノアシル基を、反応性ヒドロキシル基（例えば、上記のようなヌクレオシ ドアナログの５’−ＯＨ）によって又は反応性アミノ基（例えば、ａｒａＣ及び ｄｄＣ等のシトシン由来のヌクレオシドアナログのＮ⁴基）によって治療剤に結 合することができる。もし治療剤が反応性ヒドロキシル基と反応性アミノ基の両 者を有するならば、アミノアシル化の間、一方の基を保護することができる。例 えば、シトシンヌクレオシドアナログの５’−ＯＨを、アミノアシル化の間、ト リチル基で保護し、次いで、脱トリチル化することができる（実施例４を参照さ れたい）。Ｂ．リン酸架橋剤 治療剤のリン酸誘導体を、反応性アミノ基を有するリガンド又はキャリアー− リガンド複合体に、治療剤のリン酸基とリガンド又はキャリアーのアミノ基との 間のホスホアミド結合の形成によって結合することができる。 治療剤を、標準的手順によってホスホリル化することができ、又はこの薬剤のリ ン酸誘導体は市販品を得ることができる。例えば、あるヌクレオシドアナログの ５’モノホスフェート誘導体は市販さている（例えば、ａｒａＡ−モノホスフェ ート；ａｒａＣ−モノホスフェート）。ヌクレオシドアナログをホスホリル化す るための適当な手順は、Fiume，L．等(1989)Naturewissen schaften 76:74-76及 びSowa，T.及びOuchi，S.(1975)Bulletin of the Chemical Society of Japan 4 8 :2084-2090並びに実施例３に記載されている。この治療剤のリン酸誘導体を、 次いで、反応性アミノ基を有するリガンド又はキャリアー−リガンド複合体（例 えば、ポリリジン−ＡＳＯＲ）に結合することができる。例えば、ポリリジン及 びポリオルニチン等のポリアミノ酸をキャリアー分子として使用することができ る。この治療剤のリン酸誘導体を、実施例３に詳述するように、カルボジイミド カップリング（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル ボジイミドヒドロクロリド、ＥＤＣを使用）によりリガンド又はキャリアー−リ ガンド複合体に結合してホスホアミド結合を形成する。例えば、一般のヌクレオ シドアナログの５’モノホスフェート誘導体を、下記のように、ポリリジン−Ａ ＳＯＲ（実施例１に記載のようにして調製）に結合することができる： Ｃ．ペプチド架橋剤 この結合体での使用に好適な型の架橋剤は、細胞内で加水分解（例えば、リソ ソーム酵素による）されてこの結合体から治療剤を遊離させるペプチド架橋剤で ある。ペプチド架橋剤を用いて調製した薬物結合体は、イン・ビボで血清中で安 定であり、リソソームの加水分解酵素の作用によって薬物を細胞内で活性形態で 遊離することが見出されている（Trouet，A.等（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:626-629）。好適なペプチドは、アミノ酸配列ロイシン−アラニン−ロイシ ン（ＬＡＬ）を含み、少なくともトリペプチド又はテトラペプチドである。構造 的に、ペプチドは、反応性アミノ基（即ち、Ｎ−末端）及び反応性カルボキシ基 （即ち、Ｃ末端）の両者を有する。好適具体例において、このペプチドを、治療 剤とリガンド（又は、キャリアー−リガンド）との間の架橋剤として、Ｃ末端か らＮ末端の向きで用いる（即ち、このペプチドのＣ末端を治療剤と結合させ、Ｎ 末端をリガンド又はキャリアー−リガンドと結合させる）。 従って、ペプチドを、反応性アミノ基を有する治療剤 に、実施例５で詳述するように、治療剤のアミノ基とペプチドのＣ末端カルポキ シル基との間のアミド結合の形成によって結合することができる。例えば、ペプ チドをシトシン由来のヌクレオシドアナログ例えばａｒａＣ及びｄｄＣのＮ⁴基 に結合することができる。治療剤及びペプチド上の他の反応性基（例えば、Ｎ末 端アミノ基）を、保護基の使用により反応させないことができる。例えば、ペプ チドのアミノ基を当分野で公知の標準的技術を用いてカーバメートとして保護す ることができ、ヌクレオシドアナログの反応性ヒドロキシ基（例えば、３’及び ５’−ＯＨ基）をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護することができる。ペプチ ド及び治療剤を、活性エステル結合又はカルボジイミドカップリングにより結合 して治療剤のペプチド誘導体を作成することができる。治療剤のペプチド誘導体 を、反応性カルボキシル基を有するリガンド又はキャリアー−リガンド複合体に 、このペプチドの（脱保護した）Ｎ末端アミノ基とリガンド又はキャリアーのカ ルボキシル基との間のアミド結合の形成によって結合することができる。この治 療剤のペプチド誘導体を、カルボキシル基を有するリガンド又はキャリアーに、 実施例５に詳述するように、カルボジイミドカップリングによって結合すること ができる。例えば、治療剤のロイシン−アラニン−ロイシン（ＬＡＬ）トリペプ チド誘導体を、ＡＳＯＲ又はキャリアー−ＡＳＯＲ複合体例えばポリグルタミン 酸−ＡＳＯＲ又は ポリアスパラギン酸−ＡＳＯＲ複合体に結合することができる。更に、治療剤の ペプチド誘導体を、アルデヒドを含有するリガンド又はキャリアー−リガンド複 合体（例えば、ポリアルデヒドデキストラン−ＡＳＯＲ）に、還元的アミノ化に より結合することができる。 或は、治療剤が反応性カルボキシ基を有し、リガンド又はキャリアーが反応性 アミノ基を有する（例えば、ポリリジン）場合等には、ペプチドを、Ｎ末端から Ｃ末端の向きで（即ち、ペプチドのＮ末端を治療剤に結合し、Ｃ末端をリガンド 又はキャリアー−リガンドに結合する）、治療剤とリガンド（又は、キャリアー −リガンド）との間の架橋剤として使用することができよう。更に、ジアミンペ プチド又はジカルボン酸ペプチドを、適当な治療剤、リガンド及びキャリアーと 用いることができよう。 好適具体例において、ペプチドは、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含 む。更なるアミノ酸残基をこのトリペプチドのＮ末端又はＣ末端に加えることが できる。例えば、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓを用いることができよう。こ のペプチドに含まれるアミノ酸側鎖も又、結合目的に利用することができる。例 えば、ペプチド内に含まれるＬｙｓの側鎖のアミノ基を（例えば、ポリグルタミ ン酸上の）カルボキシ基に結合するために利用することができ、又はペプチド内 に含まれるＧｌｕの側鎖のカルボキシ基を（例えば、ポリリジン上 の）アミノ基と結合するために利用することができる。Ｄ．還元的に不安定な架橋剤 還元的に不安定な架橋剤を治療剤に結合し、次いで、この複合体を、ＡＳＧＲ のリガンドのアミノ酸側鎖のスルフヒドリル基を介してそのＡＳＧＲのリガンド に結合して、実施例６に詳述するように、架橋剤とリガンドとの間のジスルフィ ド結合を形成することができる。例えば、治療剤の３−（２−ピリジルジチオ） プロピオニル（ＰＤＰ）誘導体を、治療剤上に存在する反応性のアミノ基又はヒ ドロキシ基（例えば、ヌクレオシドアナログのＮ⁴アミノ基又は５’ヒドロキシ 基）を介して調製することができる。治療剤のＰＤＰ誘導体を、次いで、ＡＳＧ Ｒのリガンド又はチオール基と反応するその誘導体と結合する。例えば、一般的 ヌクレオシドアナログのＰＤＰ誘導体を、下記のようにＡＳＯＲと結合すること ができる： 治療剤のチオール誘導体も又、反応性チオール基を有する多官能性キャリアー 分子に結合することができる。例えば、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン又は ポリアスパラギン酸）のチオール化誘導体を、ポリアミノ酸を ＳＰＤＰと反応させることにより調製してそのポリアミノ酸のＰＤＰ−誘導体を 形成することができる。このポリアミノ酸のＰＤＰ誘導体を、次いで、結合させ たいＰＤＰ−誘導体の一方を還元し、その後チオール交換反応を行なうことによ り、治療剤のＰＤＰ−誘導体に結合することができる。或は、チオール化多糖類 例えばチオール化デキストランを、多官能性キャリアー分子として、チオール含 有架橋剤と用いることができる。Ｅ．多数のアミノ基を有する多官能性キャリアー 多数のアミノ基を有する多官能性キャリアー分子を、カルボジイミドカップリ ングによりＡＳＧＲリガンドに結合して、キャリアーのアミノ基とリガンドのカ ルボキシル側鎖又はＣ末端との間のアミド結合を形成することができる。或は、 多官能性キャリアー分子又はリガンドを誘導体化して、キャリアーのアミノ基及 びリガンドのカルボキシル基以外の官能基を介してキャリアーとリガンドとを結 合させることができる。例えば、キャリアーのチオール誘導体を作成してチオ− エーテル結合によりリガンドに結合することができる。或は、ヒドラジド誘導体 を用いることができる。 多数のアミノ基を有する好適なキャリアー分子は、ポリアミノ酸例えばポリリ ジン及びポリオルニチンである。好ましくは、このポリマーのアミノ酸は、天然 のＬアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｌ− オルニチン等のポリ−Ｌ−アミノ酸）である。例えば、ポリ−Ｌ−リジンを、実 施例１及びFindeis 等による米国特許出願第０８／０４３，００８号に記載のよ うに、ＡＳＯＲに結合することができ、該記載を参考として本明細書中に援用す る。治療剤をキャリアーを介してリガンドに結合するために、キャリアー−リガ ンド複合体を治療剤と又はアミノ基と反応する架橋剤−治療剤複合体と反応させ ることができる。例えば、治療剤のホスフェート、グルタレート又はスクシネー ト誘導体を、上記及び実施例１〜３に記載のように多数のアミノ基を有するキャ リアーに結合することができる。 好ましくは、多数のアミノ基を有する多官能性キャリアー分子は、反復するア ミノ酸残基を有するポリアミノ酸等の高分子である。多官能性キャリアー分子の 運搬容量（即ち、そのキャリアーに結合し得る分子の数）は、その分子上に存在 する反応性の基の数の関数であり、その高分子のサイズが増すにつれて増大する 。それ故に、キャリアー分子の運搬容量は、より大きい（即ち、より大きい分子 量の）キャリアーを用いることにより増大させることができる。例えば、約４０ ００ダルトンのポリ−Ｌ−リジンをこの発明の結合体において使用することがで き、一層大きい運搬容量のためには、１０，０００ダルトンのポリ−Ｌ−リジン を使用することができる。これらの結合体において、最大で約６０，０００ダル トンまでのポリ−Ｌ−リジンを使用することができる。従 って、キャリアー含有結合体の分子置換率は、キャリアーのサイズを増すことに より増大させることができる（実施例９、表１を参照されたい）。Ｆ．多数のカルボキシル基を有する多官能性キャリアー 多数のカルボキシル基を有する多官能性キャリアー分子も又、この発明の結合 体において使用することができる。多数のカルボキシル基を有する好適なキャリ アー分子は、ポリアミノ酸例えばポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸であ る。好ましくは、ポリアミノ酸は、ポリ−Ｌ−アミノ酸例えばポリ−Ｌ−グルタ ミン酸又はポリ−Ｌ−アスパラギン酸である。例えば、反応性アミノ基を有する 治療剤（例えば、ａｒａＣ）をポリ−Ｌ−グルタミン酸キャリアーに結合するこ とができ、実施例７に記載のように、この治療剤−ＰＬＧＡ複合体をＡＳＯＲに 結合することができる。多数のカルボキシ基を有する多官能性キャリアー分子を 、カルボジイミドカップリングによってＡＳＧＲリガンドに結合してキャリアー のカルボキシル基とリガンドのアミノ側鎖との間のアミド結合を形成することが できる。或は、カルボキシル基と反応する架橋剤を、多数の反応性カルボキシ基 を有する治療剤とキャリアーとの間の中間物として使用することができる。例え ば、治療剤のアミノアシル又はペプチド誘導体を、多数のカルボキシル基を有す るキャリアーに結合することができる。 多数のアミノ基を有するキャリアーについて上述したように、多数のカルボキ シル基を有するキャリアー分子の運搬容量は、より大きい（即ち、より大きい分 子量の）キャリアーを使用することにより増大させることができ、従って、キャ リアー含有結合体の分子置換率は、キャリアーのサイズを増すことにより増大さ せることができる。例えば、約１４，０００ダルトンのポリ−Ｌ−グルタミン酸 を結合体で用いることができ、このサイズのキャリアーを用いて分子置換率（薬 物：キャリアー）２９を達成することができる（実施例７を参照されたい）。約 ６０，０００ダルトンまでのポリ−Ｌ−グルタミン酸をこれらの結合体において 使用することができる。Ｇ．多数のアルデヒド基を有する多官能性キャリアー ある種の高分子キャリアー分子は、薬剤とキャリアーの間の橋掛け剤としての 架橋剤分子を必要とせずに、治療剤とリガンドの両者を直接キャリアー分子に結 合することを可能にする。例えば、反応性アミノ基を有する治療剤を、多数のア ルデヒド残基を有するキャリアーに、還元的アミノ化によって結合することがで きる。更に、ヒドラゾン又はヒドラジド基を有する治療剤を、多数のアルデヒド 残基を有するキャリアーに結合することができる。リガンドを、リガンド上に存 在するアミノ基（例えば、ＡＳＯＲ等の糖蛋白質のリジン側鎖のアミノ基） を介して、還元的アミノ化によって、キャリアー上のポリアルデヒド残基を用い てキャリアーに結合することもできる。ポリアルデヒド基を有する好適な高分子 のキャリアー分子は、多糖類例えばポリアルデヒドデキストランである。ポリア ルデヒドデキストランは、実施例７に記載のように、標準的手順（Bernstein，K ．等(1978)J．Natl.Cancer Inst.60(2):379-384; Foster，R.L.(1975)Experient ia,772-773）により、デキストランから調製することができる。次いで、治療剤 例えばヌクレオシドアナログ及びリガンド例えばＡＳＯＲを、実施例８に記載の ように、ポリアルデヒドデキストランに結合することができる。例えば、ａｒａ Ｃ及びＡＳＯＲを、下記のようにポリアルデヒドデキストランに結合することが できる： 治療剤を多数のアルデヒド基を有するキャリアーに直接結合する代りに、架橋 剤を、治療剤とキャリアーとの 間の中間物として利用することができる。例えば、反応性アミノ基（即ち、アミ ノアシル化合物等のアミノ誘導体）、反応性ヒドラジン基又は反応性ヒドラジド 基を与える治療剤の誘導体を用いて、治療剤を、多数の反応性アルデヒド基を有 するキャリアーに架橋することができる。IV．カップリング戦略 この発明の結合体を調製するために用いた特定のカップリング戦略、即ち、治 療剤をＡＳＧＲに対するリガンド（例えば、ＡＳＯＲ）に結合するために用いた 特定の架橋剤及び／又は他官能性キャリアー分子は、部分的に、結合すべき治療 剤の化学構造に依存し、従って、種々の治療剤によって変わり得る。しかしなが ら、この発明で用いたカップリング戦略は、広範囲の治療剤に適用することがで きる。反応性のアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシルアミノ 基、ヒドラゾ基又はスルフヒドリル基を有する治療剤を、この発明に記載の１つ 以上のカップリング戦略に従って架橋剤又はキャリアー分子に結合することがで きる。治療剤が多数の反応性の基を有する場合には、（上記及び実施例に記載の ように）保護基を用いて、カップリング反応を特定の反応性の基に向けさせ、次 いで、保護剤を除去することができる。結合体において使用すべきＡＳＧＲリガ ンドが糖蛋白質例えばＡＳＯＲである場合には、このリガ ンドは、その糖蛋白質のアミノ酸側鎖並びにＮ及びＣ末端由来の反応性のアミノ 基及びカルボキシル基、並びに恐らくは反応性のスルフヒドリル基を有する。従 って、これらの官能基の何れとも反応する架橋剤は、このリガンドに結合するこ とができる。同様に、多数のアミノ基、多数のカルボキシル基又は多数のアルデ ヒド基の何れかを有する多官能性キャリアー分子は、このリガンドに結合するこ とができる（例えば、ＡＳＯＲは、実施例に記載のように、ポリリジン、ポリグ ルタミン酸又はポリアルデヒドデキストランに結合することができる）。架橋剤 とキャリアー分子の両者をこの結合体で用いる場合には、架橋剤とキャリアーの 適当な組合せを選択する。例えば、アミノ基と反応する架橋剤を、多数のアミノ 基を有するキャリアー分子と用いる。適当な組合せは、下記の架橋剤とキャリア ーの群から選択することができる： アミノ反応性架橋剤 ポリアミノキャリアー カルボキシアシル(グルタメート、スクシネート等) ポリ-L-リジン ホスフェート ポリ-L-オルニチン 或は、カルボキシル基と反応する架橋剤を、多数のカルボキシル基を有するキ ャリアー分子と用いる。適当な組合せは、下記の架橋剤とキャリアーの群から選 択することができる： カルボキシル反応性架橋剤 ポリカルボキシルキャリアー アミノアシル (AMCC、GABA等) ポリ-L-グルタミン 酸 ペプチド(Leu-Ala-Leu等) ポリ-L-アスパラギン 酸Ｖ．結合体の活性 この発明の結合体の活性は、本質的に、２つの要素を有する：即ち、リガンド の標的を定める活性（target-ing activity）と治療剤の治療活性である。リガ ンドの標的を定める活性は、結合体を患者（例えば、哺乳動物）に静脈投与し、 次いで、その結合体の循環からのクリアランス速度を測定し及び／又はこの結合 体のアシアロ糖蛋白質を発現している標的細胞例えば肝細胞との結合を測定する ことにより、イン・ビボで評価することができる。結合体の循環からのクリアラ ンス及び標的細胞との結合は、結合体化してない治療剤と比較することができ、 且つこの結合体の他の器官との結合と比較することができる。結合体は、それを 検出可能な物質例えば放射性同位体で標識することにより直接検出して患者内の その分布を追跡することができる。例えば、治療剤を、放射性同位体例えばトリ チウム若しくは¹⁴Ｃで標識し、又はリガンドを¹²⁵Ｉで標識することができる。 或は、結合体の分布を、他のアシアロ糖蛋白質のＡＳＧＲへの結合を競争的に 阻害するその能力により評価することができる（例えば、Keenan-Rogers，V．及 びWu，G.Y.(1990)Cancer Chemother.Pharmacol.26:93-96を参 照されたい）。この場合には、未標識の結合体を標識したアシアロ糖蛋白質と同 時投与する。例えば、未標識のＡＳＯＲ含有結合体を標識したアシアロフェチュ インと同時投与することができる。標識したアシアロ糖蛋白質の循環からのクリ アランス及び／又は標識した糖蛋白質の肝臓への結合を、この結合体の同時投与 を伴って及び伴わないで測定する。効果的に肝細胞を標的とする結合体は、肝細 胞上のアシアロ糖蛋白質レセプターへの結合について標識したアシアロ糖蛋白質 と競争することにより、標識したアシアロ糖蛋白質の循環からのクリアランス速 度を減じ、標識したアシアロ糖蛋白質の肝臓への結合を減じる。 更に、循環中の結合体の量は、免疫学的又は化学的方法により評価することが できる。例えば、血漿試料を結合体の静脈注入後様々な時間で採取し、その中に 存在する結合体の量をＨＰＬＣにより又は免疫学的アッセイ例えば放射免疫アッ セイ若しくはＥＬＩＳＡ（例えば、結合体のリガンド又はキャリアー部分に対す る抗体を使用）により測定することができる。更に、結合体の分布を、放射性標 識した結合体（例えば、リガンドを¹²⁵Ｉで標識した結合体）を用いるオートラ ジオグラフィー又は核イメージング法により評価することができる。 結合体中の治療剤の活性は、適当なアッセイを用いて、その治療剤により治療 されるべき病気又は障害に対する結合体の治療効果を測定することにより評価す るこ とができる。例えば、抗ウイルス剤の抗ウイルス活性を、結合体化してない治療 剤に関して、この結合体の存在下又は非存在下で起きるウイルスＤＮＡ複製又は ウイルス粒子（又はマーカー）産生の量を測定することにより測定することがで きる。ウイルスＤＮＡ複製に対する結合体の効果を、アシアロ糖蛋白質レセプタ ーを発現しているウイルス感染細胞株を用いてイン・ビトロで評価することがで きる。例えば、肝細胞株を用いることができる。肝細胞株は、ＨＢＶ遺伝子を転 写し、ＨＢＶタンパク質を翻訳し且つＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体を蓄積する安定 な細胞株を創るためにＢ型肝炎ウイルスＤＮＡでトランスフェクトしたものであ る。かかる細胞株を用いて、結合体の抗ウイルス活性を評価することができる。 使用可能な適当なＨＢＶ ＤＮＡ含有細胞株には、ヒト肝芽細胞腫（２．２．１ ５）由来細胞株（Sells，M.A．等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:1005-1009 ; Sells，M.A.等（1988）J.Virol.62:2336-2344）及びヒト肝芽細胞腫（Ｈｕｈ ６）由来細胞株ＨＢ６１１（Tsurimoto，T．等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 4 :444-448）が含まれる。 ウイルスＤＮＡ含有細胞を、イン・ビトロで、種々の濃度の結合体及び対応す る結合体化してない治療剤で処理し、その処理の細胞内及び／又は細胞外ウイル スＤＮＡ産生に対する効果を測定することができる。細胞内ＤＮＡを細胞から単 離し、細胞外ＤＮＡを培養培地か ら単離することができる。次いで、ＤＮＡをハイブリダイセーション手順（例え ば、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザーンブロット等）又は他の適 当なＤＮＡ分析手順によって分析することができる。例えば、Korba，B.E．及び Gerin，J.L．（（1992）Anti-viral Research 19:55-70）及びUeda等（(1989)Vi rology 169:213-216）により記載されたようなアッセイを用いることができる。 Ｂ型肝炎ウイルスの場合には、遊離の及び結合体化した薬剤の種々の型のＨＢＶ ＤＮＡに対する効果を測定することができる。例えば、弛緩した環状ＤＮＡ、 複製中間体及びインテグレートされたＨＢＶＤＮＡの蓄積を、実施例１０に記載 のようにして測定することができる。インテグレートされた（即ち、非複製型の ）ＨＢＶ ＤＮＡの量は、遊離の又は結合体化の薬剤の何れの治療においても変 わらないはずなので、このＤＮＡは、内部対照として使用することができる。Ｉ Ｄ₅₀（即ち、ウイルスＤＮＡ複製の５０％を阻止するのに必要な投与量）を、結 合体化した及び結合体化してない薬剤について測定して、この結合体の治療効果 を評価することができる。更に、イン・ビトロでのウイルス抗原の産生を評価し て、この結合体の治療効果を測定することができる。 アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的とするこの発 明の結合体の能力は、培養細胞を用いて、これらの結合体のＡＳＧＲ⁺細胞に対 する細 胞毒性をＡＳＧＲ^-細胞に対する毒性と比較することにより評価することができ る。（これを、次いで、ＡＳＧＲ⁺細胞及び対照のＡＳＧＲ^-細胞に対する結合体 化してない治療剤の細胞毒性と比較することができる）。所定の投与量において 、効果的にＡＳＧＲ⁺細胞を標的とする結合体は、ＡＳＧＲ^-細胞よりもＡＳＧＲ⁺ 細胞によって一層よく取り込まれるであろう。従って、効果的にＡＳＧＲ⁺細胞 を治療剤の標的とする結合体は、ＡＳＧＲ⁺細胞に対して、ＡＳＧＲ^-細胞を殺す のに必要な投与量より低い投与量で細胞毒性となるであろう。この発明の結合体 の細胞毒性は、実施例１０に記載のように、ＡＳＧＲ⁺及びＡＳＧＲ^-細胞を用い て測定することができる。 ウイルス性のヒトの病気の適当な動物モデルを用いて、抗ウイルス剤結合体の 抗ウイルス活性をイン・ビボで評価することもできる。例えば、結合体化した抗 ウイルス剤の効果を、Ectromeliaウイルス感染マウスにて評価することができる （例えば、Fiume，L．等(1981)FEBS Letters 129:261-264を参照されたい）。ヒ トの肝炎ウイルスの感染についての適当な動物モデルがある。例えば、ヒトの肝 炎に対する１つの動物モデル系は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）感染 したウッドチャックである。ヒトと同様に、イースタンウッドチャック（Marmot a monax）は、慢性的にＷＨＶに感染することができる。ＷＨＶのゲノム構成は 、ＨＢＶと同じで あり、これらの２つの病気のウイルス学的特徴は類似している（Summers，J．等 （1975）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:4533-4537; Galibert，F.等(1982)J.Virol .41:51-65; Wong，D.C．等（1982）J.Clin.Microbiol.15:484-490; Ponzetto，A ．等(1984)J.Virol.52:70-76；Ponzetto，A.等（1985）Virus Res．2:301-315） 。ウイルス感染した動物に、結合体又は対応する遊離の薬物を静脈注射すること ができる。この結合体の血漿レベルを上記のように測定することができる。ウイ ルスＤＮＡ複製に対する結合体化した薬剤の効果と結合体化してない薬剤の効果 とを、例えば、ウイルスＤＮＡの血清レベルを測定することにより測定すること ができる。ヒトの肝炎ウイルス感染についての他の適当な動物モデルには、アヒ ル肝炎ウイルス感染（Civitico，G.等(1990)J.Med.Virol.31:90-97）、ジリス肝 炎ウイルス感染（Marion，P.L.等（1983）Hepatology 3:519-527）及び、最も好 ましくは、チンパンジーのヒト肝炎ウイルス感染（Thung，S.N.等（1981）Am.J. Pathology 105:328-332; Shouval，D.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:6147 -6151）が含まれる。 結合体の治療活性は、ヒトの患者においてイン・ビボでも評価することができ る。例えば、慢性的にＨＢＶに感染したヒトを、結合体又は対応する結合体化し てない薬剤で治療することができる。この結合体のＨＢＶ感染に対する効果は、 結合体の、治療過程における１種以上 のＨＢＶマーカー例えばＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ、抗ＨＢ ｃ又はＨＢＶ ＤＮＡに対する効果を測定することにより測定することができる 。VI．結合体の利用 この発明の結合体を用いて、関心ある細胞、即ちアシアロ糖蛋白質レセプター を発現している細胞であって、その細胞への治療剤の送達が治療目的のために望 ましい細胞を治療剤の標的にすることができる。アシアロ糖蛋白質レセプターは 、肝細胞上で発現されており、従って、結合体は、肝細胞を治療剤の標的とする ことができる。ガラクトシルレセプターがラット精巣細胞上に存在することが報 告されている（Abdullah，M.等(1989)J.Cell Biol.108:367-375）が、これらの レセプターは、肝臓のＡＳＧＲと構造的に異なると考えられる（即ち、一局部の みのレセプターである）。従って、この発明の結合体が精巣細胞を標的とするこ とはありそうにないことである。従って、この発明の結合体を用いて、選択的に 肝細胞を治療剤の標的とすることができる。例えば、ウイルス感染した肝細胞を 抗ウイルス性薬物を含む結合体の標的とすることができる。或は、例えば、細胞 表面でのＡＳＧＲの発現に適した形態のアシアロ糖蛋白質レセプターをコードす る核酸を細胞に導入することにより細胞に処理を施してＡＳＧＲを発現させ、そ の細胞をこの発明の結合体の標的細胞にすることができる。 これらの結合体を用いて、患者において所望の治療効果を誘出することもでき る。例えば、抗ウイルス性薬物を含む結合体を用いて、ウイルス感染を治療し、 ウイルスＤＮＡの複製を減じ、ウイルス粒子の複製及び産生を阻止し、ウイルス 感染の症状を軽減すること等ができる。これらの結合体は、関心ある組織を標的 とし且つ影響を受けない組織（例えば、肝臓以外の組織）から遠ざかるので、治 療剤の非特異的毒性は、結合体化してない薬剤と比べて減少される。或は、治療 剤のターゲッティングリガンドへの結合は、結合されてない薬剤と比較して、そ の薬剤の関心ある細胞への増大された送達を生じるので、その薬剤の治療インデ ックスが増大し、それにより、結合してない薬剤で必要とされるより低濃度で治 療上有効な投与量を与える。 この発明の結合体を、イン・ビボでの薬剤投与に適した生物学的に適合性の形 態で患者に投与して、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤 の標的とすることができる。「イン・ビボでの投与に適した生物学的に適合性の 形態」とは、投与すべき結合体の如何なる毒性効果よりもその結合体の治療効果 が勝る形態を意味する。用語「患者」は、アシアロ糖蛋白質レセプターを発現し ている細胞が治療剤の標的となり得る生きた生物例えば哺乳動物を含むことを意 図する。患者の例には、ヒト、ウッドチャック、イヌ、ネコ、マウス、ラット及 びこれらのトランスジェニック種が含まれる。ここ に記載の結合体の投与は、治療上活性な量の単独の又は他の治療剤及び製薬上許 容し得るキャリアーと組み合わせた結合体を含む任意の薬理学的形態であってよ い。例えば、この発明の結合体を、治療すべき特定の病気又は状態に対して有効 な他の治療剤と同時投与することができる。例えば、インターフェロンもＢ型肝 炎ウイルス感染に対する治療活性を示すので、Ｂ型肝炎ウイルスに対して有効な 抗ウイルス剤（例えば、ヌクレオシドアナログ）を含む結合体を、インターフェ ロンと一緒に投与することができる。 この発明の結合体の治療上活性な量の投与を、投薬時及び期間にわたって所望 の結果を生じるのに必要な有効量と定義する。例えば、結合体の治療上活性な量 は、個体の病気の状態、年齢、性別及び体重等の因子及びその個体において所望 の応答を誘出する結合体の能力によって変わり得る。投薬養生法は、最良の治療 応答を与えるように調節することができる。例えば、幾つかに分けた投与量を毎 日投与することができ、或は、投与量を、治療状況の緊急性の示すところに釣り 合わせて減らすことができる。 活性な化合物（例えば、結合体）を、好ましくは、静脈投与する（例えば、注 射により）。この活性な結合体は、この結合体を酵素、酸及びその他のこの結合 体を不活性化し得る天然条件から保護する物質で被覆し又は該物質と同時投与す ることができる。例えば、結合体を、 個体に、適当なキャリアー又は希釈剤にて投与することができ、又、酵素阻害剤 と同時投与することができる。製薬上許容し得る希釈剤には、塩溶液及び緩衝剤 水溶液が含まれる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混 合物並びに油中にて分散を調製することもできる。通常の貯蔵及び使用条件下で 、これらの調製物は、防腐剤を含ませて微生物の成育を防ぐことができる。 注射用途に適した製薬組成物には、無菌の注射用溶液又は分散を即座に調製す るための無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散、及び無菌の粉末が含まれる。 すべての場合に、この組成物は、無菌でなければならず且つ容易に注射できる程 度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければ ならず且つ微生物例えば細菌及びカビの夾雑作用から保護されなければならない 。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール 、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適当 な混合物を含む溶剤又は分散媒であってよい。適当な流動性を、例えば、レシチ ン等の被覆の利用、分散の場合の必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使 用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗 カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメ ロサール等により達成することができる。これらの組成物の浸 透性は、組成物中に糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール又はソルビト ール）又は塩化ナトリウム等の化合物の適当量を含むことによって生理学的範囲 に維持することができる。これらの注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅 らせる薬剤例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物中に含有 させることにより達成することができる。 この結合体を、必要な量で、上に列挙した成分の１つ又は組合せを有する適当 な溶剤に加え、必要ならば、フィルター除菌することにより無菌の注射溶液を調 製することができる。一般に、分散は、活性化合物を、基礎的分散媒及び上に列 挙したものからの必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに加えることにより調製 する。無菌の注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好適調製方法は、真 空乾燥及び凍結乾燥であり、これは、活性成分（例えば、結合体）及び任意の所 望の追加成分の粉末を予め無菌濾過したそれらの溶液から生成する。 投与を容易にし及び均一な投薬のために投薬単位形態で非経口組成物を配合す ることは、特に有益である。投薬単位形態とは、ここで用いる場合、治療すべき 哺乳動物患者への単位投薬に適した物理的に分離した単位をいい；各単位は、所 望の治療効果を生じるように計算された予め決めた量の活性化合物を必要な製薬 用キャリアーと結合して含む。この発明の投薬単位形態の仕様は、（ａ）活性化 合物の独特の特性及び達成すべき特定の治 療効果、並びに（ｂ）個体の感受性を治療するための活性化合物等を混合する技 術における本来的な限界により指示され且つ直接依存する。 この発明を、更に、後述の実施例により説明するが、制限するものと解釈すべ きではない。この出願中のすべての特許、参考文献及び引用された特許出願公開 の内容を、参考として本明細書中に援用する。 下記の一般的方法論をこれらの実施例で使用した。一般的方法 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、ガラスで裏打ちされたBake r（商標）SI250Fシリカゲルプレートを用いて実施した。紫外線照射により又は ４．８％ アンモニウムモリブデン、０．２％ 硝酸セリウム（IV）アンモニウ ム及び１０％ 硫酸の水溶液に浸してから加熱することにより可視化した。融点 を、Mel-Temp器具を用いてキャピラリーチューブにて測定したが補正はしてない 。透析を、Spectrapor 12,000-14,000 MWCO管にて、別途記載した場合を除いて ４℃で行なった。紫外線／可視光線のスペクトルは、Beckman DU70分光光度計に て得た。オロソムコイドは、アメリカ赤十字血液銀行（American Red Cross Blo od Bank）から得た古くなった血漿から精製した。それを、８０℃で、ｐＨ１〜 ２で６０分間脱シアル化した。ゲル電気泳動は、別途記載した場合を除いて、No vex Xcell II（商標）のミニゲルシステムにて、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性 非還元ゲルを用いて行なった。 ポリリジン、デキストラン、ＥＤＣ及び抗ウイルス性薬物ａｒａＡ、ａｒａＣ 、ｄｄＣ、アシクロバー、ａｒａＡＭＰ、ａｒａＣＭＰ及びＡＺＴをSigma 社よ り得た。他の試薬は、Aldrich 社より得た。 下記の略語を実施例及びこの出願中で使用する： ＡＣＶ アシクロバー ＡＣＶＭＰ アシクロバーモノホスフェート ＡＭＣＣ アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸 ａｒａＡ アデノシンアラビノシド ａｒａＡＭＰ アデノシンアラビノシドモノホスフェート ａｒａＣ シトシンアラビノシド ＡＳＯＲ アシアロオロソムコイド ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド ｄｄＣ ジデオキシシチジン ＤＭＡＰ ジメチルアミノピリジン ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＥＤＣ １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルホジイミドヒド ロクロリド ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＦＡＢＭＳ ファーストアトムボンバードメント質量分析 ＨＢＶ Ｂ型肝炎ウイルス ＭＥＳ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸 ＭＳＲ 分子置換率 ＭＷＣＯ 分子量カットオフ ＰＡＤ ポリアルデヒドデキストラン ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＢＳ リン酸緩衝塩溶液 ＰＬＬ ポリ−Ｌ−リジン ＰＬＧＡ ポリ−Ｌ−グルタミン酸 ＰＭＳ フェナジンメトスルフェート ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＰＤＰ Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー トリス トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＸＴＴ ２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェノール）− ５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド実施例１： グルタレート架橋剤及びポリリジンキャリ アーを用いる薬物結合体の調製 この実施例において、アシアロオロソムコイドをオロソムコイドから調製し、 次いで、反応性アミノ基を有する多官能性キャリアー分子、ポリリジンに結合し た。種々のヌクレオシドアナログのグルタレート誘導体を調 製して、アミノ基と反応してヌクレオシドアナログのポリリジン−アシアロオロ ソムコイド複合体への結合を可能にする架橋剤を与えた。ヌクレオシドアナログ のグルタレート誘導体を活性エステルカップリングによりポリリジン−アシアロ オロソムコイドに結合した。ヌクレオシドアナログａｒａＣ及びａｒａＡのグル タレート誘導体を、前に記載した手順の変法により調製し、ポリリジン−アシア ロオロソムコイドに結合した。ヌクレオシドアナログｄｄＣ、ＡＣＶ及びＡＺＴ のグルタレート誘導体をここに記載のように調製し、ポリリジン−アシアロオロ ソムコイドに結合した。オロソムコイド（ａ−１−酸糖蛋白質） オロソムコイド（ＯＲ）をヒト血漿か ら単離した。ヒト血漿は、コネチカット、Farmington在、American Red Cross Blood S ervicesから得た。プールしたヒト血漿（４単位、〜１．１Ｌ）を透析チューブ （１２〜１４Ｋｄ ＭＷＣＯ）に移して２０Ｌの緩衝液１（緩衝液１：０．０５ Ｍ ＮａＯＡｃｐＨ４．５）に対して、４℃で一晩透析した。透析した血漿を、 次いで、１０，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で、４℃で１０分間遠心分離 した。その上清を、次いで、Whatman ＃1紙を通して濾過し、沈殿は捨てた。こ の透析し且つ濾過した血漿を、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに加えた。このカラ ムは、ＤＥＡＥ−セルロース（８４ｇ）を水中に懸濁させてそれを２時間膨潤さ せ、次いで、０．５Ｎ ＨＣｌ、０．５Ｎ ＮａＯＨ及び ０．０１Ｍ ＥＤＴＡで連続的に洗浄することにより調製したものである。ＤＥ ＡＥ−セルロースを、Waters AP-5カラム中の５ｃｍ×２５ｃｍのベッドボリュ ームに注いだ。このカラムを、蠕動ポンプ（流速１０ｍＬ／分）を用いて、カラ ム溶出液のｐＨが４．５になるまで緩衝液１で平衡化した。この透析し且つ濾過 した血漿をこのカラムに加えた後、緩衝液１で、溶出液の２８０ｎｍでの吸光度 が０．１０未満になるまで洗った。このカラムを、次いで、緩衝液２（緩衝液２ ：０．１０ＭＮａＡｃ、ｐＨ４．０）で溶出した。この溶出液を集めた（Ａ₂₈₀ が増加し始めたときに採取を開始し、Ａ₂₈₀がピークを過ぎて０．１０より小さ くなったときに終了した）。オロソムコイドに富む画分が溶出されて採取された 後に、カラムを緩衝液３（緩衝液３：０．０５Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ３．０；１Ｌ ）で洗い、緩衝液１で再平衡化した。 このオロソムコイドに富む溶出液を硫安（溶出液１Ｌ当り３１３ｇ）で５０％ 飽和にし、一晩４℃で撹拌した。次いで、この溶液を遠心分離（１４，０００ｒ ｐｍ×１５分間、４℃）し、上清を保持した。硫安（５０％飽和の上清の１Ｌ当 り３２０ｇ）をゆっくり加えて、この溶液を９２％飽和にした。次いで、この溶 液を少なくとも４時間４℃で撹拌し、次いで、遠心分離した（４℃で、１０，０ ００ｒｐｍ×３０分間）。ペレットを保持して最小容積の水に溶解させ、透析チ ューブに移して （透析物の膨張のために３倍容積を残す）、２日間、４℃で、２０Ｌの水に対し て透析した（１日後に水を取り換えた）。その結果の透析物を凍結乾燥して、− ２０℃で保存した。このＯＲをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、クーマシーブルー で染色してＭＷ＝４４Ｋｄに単一バンドを示した（ＯＲは、ＭＷ４１，０００を 有するが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは増加した見かけＭＷを有するように泳動される ）。この手順を用いて凍結乾燥した無塩ＯＲの典型的収量は、３５０〜４００ｍ ｇである。アシアロオロソムコイド アシアロオロソムコイドを、上記のようにして単離し たＯＲから調製した。ＯＲを水に溶解させ（１０ｍｇ／ｍｌ）、このＯＲ溶液に 等容の０．１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を加え、その結果生成した混合物を水浴中で１時間８ ０℃に加熱してこの蛋白質からシアル酸を加水分解した。この酸加水分解混合物 を水浴から取り出してＮａＯＨで中和し、水に対して２日間透析し、次いで、凍 結乾燥した。次いで、Warrenのチオバルビツール酸アッセイを用いて、ＯＲの脱 シアル化を確認した（Sambrook，J.等（1989）Molecular Cloning 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor.第６章）。ＡＳＯＲ試 料のターゲッティング可能性を、¹²⁵Ｉで標識して、ラット／マウスにおける肝 臓の取込みを測定することにより確認した（Cristiano，R.J．等(1993)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA，90:2122-2126）。ポリ−Ｌ−リジン−アシアロオロソムコイド結合体（ＰＬＬ−ＡＳＯＲ） ポリ −Ｌ−リジン−アシアロオロソムコイド結合体（ＰＬＬ−ＡＳＯＲ）を、下記の ように、カルボジイミドカップリングにより調製した。アシアロオロソムコイド （２００ｍｇ、上記のようにして調製）及びポリ−Ｌ−リジン（１６０ｍｇ）を 水（２０ｍＬ）に溶解して、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調節した。この 溶液を、２５℃で１６時間攪拌した。４Ｋｄのポリリジンを用いて作成した結合 体を、次いで、順に、４Ｌの１Ｍ グアニジン、４Ｌの１Ｍ 塩化ナトリウム及 び２×２０Ｌの水に対して透析し、そして凍結乾燥した。１０Ｋｄのポリリジン を用いて作成した結合体を、調製用酸−尿素ゲル電気泳動により精製し、次いで 、４Ｌの１Ｍ 塩化ナトリウム、２０Ｌの水に対して透析し、そして凍結乾燥し た。（Ｎ⁴−（４−カルボキシブチリル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシ ン（ａｒａＣグルタレート） ａｒａＣグルタレートを、Ishida，T.等、米国特 許第３，９９１，０４５号に従って調製した。簡単に言えば、３００ｍｇの１− β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンを１．６ｍｌの水に溶解させて５ｍｌのジ オキサンを加え、その後、更に、４１５ｍｇのグルタル酸無水物を加えた。反応 混合物を減圧下で６０℃で濃縮して、固体残留物を得た。この残留物を真空デシ ケーター中で乾燥して無色透明のゼリー状物質を得た。酢酸エチル−メ タノール−酢酸を用いるフラッシュシリカゲル上のクロマトグラフィーは、生成 物を与えた（３０％）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ１．７６（ｍ，２Ｈ），２ ．１０（ｔ，２Ｈ），２．３５（ｔ，２Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），４．２８ （ｍ，３Ｈ），５．９１（ｄ，１Ｈ），６．０８（ｄ，１Ｈ），７．５６（ｄ， １Ｈ）。ａｒａＣグルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ ａｒａＣグルタレート（１０ｍｇ、 ０．０３ミリモル；上記のようにして調製）を、次いで、ＤＭＳＯ（０．２５ｍ Ｌ）に溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４ｍｇ、０．０３ミリモル ）及びＥＤＣ（７ｍｇ、０．０３６ミリモル）を加え、この溶液を１６時間攪拌 した。この溶液を、次いで、直接、フラッシュシリカゲルカラム（直径１０ｍｍ ）に加え、クロロホルム：メタノール（８５：１５）で溶出した。こうして得ら れた部分精製したＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（クロロホルム−メ タノール−酢酸 ８０：１５：５のＴＬＣ、Ｒ_f＝０．２４）（２０μモル）を ＤＭＳＯ（３００μＬ）に溶解させ、ＰＬＬ−ＡＳＯＲ溶液（４００μＬ中の１ ０ｍｇ、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節）に、激しく攪拌しながら、４℃ で滴下した。４時間後に、この溶液をSephadex G25カラムに加えてＰＢＳ（ｐＨ ＝６．８）で溶出した。溶出液の吸光度を２６０ｎｍでモニターし、最初の溶出 ピークを水（２×２Ｌ） に対して透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥生成物のアリコートを水に１ｍｇ ／ｍＬに溶解させ、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した：λ_max３ ０５、２８５、２５０ｎｍ。５’−Ｏ−（３−カルボキシブチリル）−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデ ニン（ａｒａＡ−グルタレート） ａｒａＡ−グルタレートを、Fiume，L．(198 0)FEBS Letters 116:185-188に従って、僅かに改変した手順を用いて調製した。 ａｒａＡ（４８９ｍｇ、１．８ミリモル）を、加温しながらＤＭＦ（１５ｍｌ） に溶解させた。グルタル酸無水物（２６１ｍｇ、２．３ミリモル）及びＤＭＡＰ （２２ｍｇ、０．２ミリモル）を加え、その溶液を１８時間２５℃で攪拌した。 溶媒を真空中で除去し、こうして得られた油を、クロロホルム−メタノール−酢 酸（８０：２０：５）を用いるフラッシュシリカゲル上でのクロマトグラフィー にかけて２３２ｍｇ（３３％）のａｒａＡグルタレートを与えた。分析：¹Ｈ− ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１．４１（ｍ，２Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），２ ．０４（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｍ，２Ｈ），２．５２（ｓ，１Ｈ），３．７０ （ｍ，２Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），４．４９（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ， １Ｈ）５．２２（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｄ，１Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ）， ７．２９（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）；¹³Ｃ− ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）ｄ１８，３０，３１，５９，７０，７６，７９，８１ ，１１７，１３８，１４７，１５１，１５４，１７０，１７２。ａｒａＡ−グルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ ａｒａＡ−グルタレート（２０ｍ ｇ、０．０５ミリモル）を、次いで、ＤＭＳＯ（０．７ｍＬ）に溶解させた。Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ、０．０５ミリモル）及びＥＤＣ（３１ｍ ｇ、０．１６ミリモル）を加え、この溶液を１６時間攪拌した。次いで、この溶 液を、直接、フラッシュシリカゲルカラム（直径１０ｍｍ）に加え、クロロホル ム：メタノール（８０：２０）で溶出した。こうしてＤＭＳＯ（１７０μＬ）に て得られた部分精製したＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（クロロホル ム−メタノール−酢酸 ８０：２０：５のＴＬＣ、Ｒ_f＝０．５６）（１３μモ ル）の一部を、激しく攪拌しながら、４℃でＰＬＬ−ＡＳＯＲ溶液（３７８μＬ 中の１０ｍｇ、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節）に滴下した。４時間後に 、この溶液を、Sephadex G25カラムに加え、ＰＢＳ（ｐＨ＝６．８）で溶出した 。溶出液の吸光度を２６０ｎｍでモニターした。結合体を含む画分をプールし、 水（２×２Ｌ）に対して透析し、そして凍結乾燥した。この凍結乾燥した生成物 のアリコートを水に１ｍｇ／ｍＬに溶解させ、紫外線／可視光線の吸収の分光測 光によって分析した：λ_max２６２ｎｍ。Ｎ⁴−（４−カルボキシブチリル）−ジデオキシシチジ ン（ｄｄＣグルタレート） ｄｄＣグルタレートを、下記のように調製した。無 水グルタル酸（１２３ｍｇ、１．０８ミリモル）をＤＭＦ（８ｍＬ）中の２’， ３’−ジデオキシシチジン（１８９ｍｇ、０．９０ミリモル）の溶液に加え、こ の溶液を２５℃で１６時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、結晶状のガムを与 えた。９５％エタノールからの結晶化は、１５７ｍｇの生成物を少量の不純物（ ＴＬＣで測定）を伴って与えた。再結晶は、１２９ｍｇ（４４％）の純粋なＮ⁴ −（４−カルボキシブチリル）−２’，３’−ジデオキシシチジンを与えた。分 析：ＴＬＣ、Ｒ_f（クロロホルム−メタノール−酢酸、８０：２０：５）：０． ２６；融点：１４９〜１５１℃；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ）δ１． ７５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ，２．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２ ．４２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．５８（ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１２ ．１Ｈｚ），３．７５（ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１２．１Ｈｚ），４．１１（ｍ ，１Ｈ），５．９２（ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），８．４７（ｄ，７．５Ｈｚ，１Ｈ）；ＩＲ：３４ ０８，２９３３，１７３０，１６９６，１６４１，１５８３，１５０６，１３９ ４，１３２１，１２７８，１０９７，８２１，７９２ｃｍ^-1；ＵＶ：λ_max３１ ０，２７３ｎｍ。ｄｄＣグルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ Ｎ⁴−（４−カルボキシブチリル）− ジデオキシシチジン（７ｍｇ、２０μモル）の溶液（ＤＭＳＯ（１８０μＬ）中 で、上記のように調製）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３ｍｇ、０．０３ ｍモル）及びＥＤＣ（６ｍｇ、０．０３ｍモル）を加えた。この溶液を２時間攪 拌し、次いで、上記のように調製したＰＬＬ−ＡＳＯＲの溶液（水４００μＬ中 の２８ｍｇＮ０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節）に直接加えた。カップ リング反応を一晩４℃で行ない、次いで、２ｍＬに希釈し、そして２×２ＬのＰ ＢＳに対して透析し、その後、１×３Ｌの水に対して透析した。生成物を凍結乾 燥し、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した。λ_max２９５、２４５ ｎｍ。９−（２−（４−カルボキシブチリルオキシ）−エトキシメチル）グアニン（Ａ ＣＶグルタレート） グルタル酸無水物（１９６ｍｇ、１．７０ｍモル）及びＤ ＭＡＰ（１３ｍｇ、０．１１ｍモル）を、ＤＭＦ（２２ｍＬ９中の９−（２−ヒ ドロキシエチオキシメチル）グアニン（１８９ｍｇ、０．９０ｍモル）の懸濁液 に加えた。この懸濁液を１６時間５０℃で攪拌した。更なる１０ｍｇ（０．１ｍ モル）のＤＭＡＰを加え、この混合物を６５℃に加熱し、その点で澄んだ溶液が 形成された。反応を１８時間継続し、次いで、溶媒を真空中で除去し、濃厚な油 を与えた。この油を熱エタノールに懸濁させ、次い で、冷やし、濾過し、冷エタノールで洗って、白色固体３００ｍｇ（８１％）を 産出した。分析：ＴＬＣ：Ｒ_f（クロロホルム−メタノール−酢酸、８０：２０ ：５）０．４１；融点：２００〜２０２℃；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂ Ｏ）δ１．６９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ ，２Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｂｓ，２Ｈ）， ４．０８（ｂｓ，２Ｈ），５．３６（ｓ，２Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ）；ＩＲ （ＫＢｒ）：３３１８，３１４２，２９６０，２６４６，１７３１，１４１３， １２１３，１１７８，１１３６，１１０４，７５２，６９３ｃｍ^-1；ＵＶ：λ_{ma x} ２７０，２５５ｎｍ。ＡＣＶグルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ Ｄ Ｍ Ｆ（１．０ｍＬ）中で上 記のように調製した９−（２−（４−カルボキシブチリルオキシ）−エチオキシ メチル）グアニン（４０ｍｇ、０．１２ｍモル）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスク シンイミド（１６．８ｍｇ、０．１５ｍモル）及びＤＣＣ（３５．６ｍｇ、０． １７ｍモル）を加えた。この溶液を１８時間攪拌し、濾過しそして上記のように 調製したＰＬＬ−ＡＳＯＲの溶液（水２０８μＬ中の１０ｍｇ、０．１Ｎ Ｎａ ＯＨでｐＨを７．５に調節）に加えた。カップリング反応を３時間行ない、次い で、Sephadex G25カラムにてＰＢＳ（ｐＨ＝６．８）で精製した。溶出液の吸光 度を２６０ ｎｍにてモニターした。結合体を含む画分をプールし、紫外線／可視光線吸収の 分光測光により分析した：λ_max２７５、２４５ｎｍ。５’−Ｏ−（４−カルボキシブチリルオキシ）−３’−アジド−３’−デオキシ チミジン（ＡＺＴグルタレート） ＤＭＦ（３ｍＬ）中の３’−アジド−３’− デオキシチミジン（１００ｍｇ、０．３７ｍモル）、グルタル酸無水物（９４ｍ ｇ、０．８３ｍモル）及びＤＭＡＰ（４５ｍｇ、０．３７ｍモル）の溶液を２４ 時間２５℃で攪拌した。溶媒を真空中で除去し、その結果生じた油を２０ｍｍの フラッシュシリカゲルカラムにてクロロホルム−メタノール（９：１）を溶出剤 として用いてクロマトグラフィーにかけた。生成物を油として４１％の牧率で単 離した。ＴＬＣ：クロロホルム−メタノール（８：２）、Ｒ_f０．５６；¹Ｈ−Ｎ ＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ）δ１．７３（ｔ，２Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ） ，２．１７（ｔ，１Ｈ），２．３９（ｍ，３Ｈ），３．１５（ｓ，１Ｈ），３． ９７（ｄｄ，１Ｈ），４．２５（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｄｄ，１Ｈ），６．１ ２（ψｔ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ）；ＩＲ：３５００，３２５０，２９２ ４，２１０９，１７０２，１５６０，１４６１，１４０８，１２６２，１０９６ ，８０１ｃｍ^-1；λ_max２６７ｎｍ。ＡＺＴグルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ 上記のように 調製したＤＭＳＯ（２５０μＬ）中のＡＺＴグルタレート（１１ｍｇ、３０μモ ル）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４ｍｇ、３０μモル）及びＥＤ Ｃ（７ｍｇ、３６μモル）を加えた。この溶液を１８時間攪拌し、次いで、フラ ッシュシリカゲルカラムにてクロロホルム−メタノール（９８：２）を溶出剤と して用いて精製した。こうして得た活性エステル（Ｒ_f０．３５）を２２５μＬ のＤＭＳＯに溶解させ、ＰＬ−ＡＳＯＲの溶液（水４００μＬ中の１０ｍｇ、０ ．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節）に滴下した。カップリング反応を４℃ で４時間行ない、次いで、希釈して、６ＬのＰＢＳ（ｐＨ＝６．８）に対する透 析とその後の１×２０Ｌの水に対する透析により精製した。透析物を０．４５μ のナイロン膜を通して濾過し、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した ：λ_max２６７ｎｍ。実施例２： スクシネート架橋剤及びポリリジンキャリ アーを用いる薬物結合体の調製 この実施例においては、ポリリジンを、実施例１に記載したようにアシアロオ ロソムコイドに結合した。種々のヌクレオシドアナログのスクシネート誘導体を 調製して、それらのヌクレオシドアナログのポリリジン−アシアロオロソムコイ ド複合体への結合を可能にするアミノ基と反応する架橋剤を与えた。これらのヌ クレオシドアナログのスクシネート誘導体を活性エステルカップリン グによりポリリジン−アシアロオロソムコイドに結合した。ヌクレオシドアナロ グＡＣＶのスクシネート誘導体を前に記載した手順の変法によって調製してポリ リジン−アシアロオロソムコイドに結合した。ヌクレオシドアナログａｒａＡの スクシネート誘導体をここに記載のように調製してポリリジン−アシアロオロソ ムコイドに結合した。９−（２−（３−カルボキシプロピオニル）−エチオキシメチル）グアニン（Ａ ＣＶスクシネート） ＡＣＶスクシネートをSchaeffer 等(1980)の米国特許第４ ，１９９，５７４号に記載された手順の変法により調製した。アシクロバー（２ １０ｍｇ、０．９３ｍモル）、無水コハク酸（１３９ｍｇ、１０．０９ｍモル） 及びＤＭＡＰ（１９ｍｇ、０．１６ｍモル）をＤＭＦ（１８ｍＬ）中で合わせた 。この懸濁液を６５℃に加熱し、その点ですべての成分は溶液となり、１６時間 攪拌した。溶媒を真空中で除去し、その結果生じた油を、フラッシュシリカゲル にてクロロホルム−メタノール−酢酸（８０：２０：５）を溶出剤として用いる クロマトグラフィーにかけ、ＡＣＶスクシネート（１８６ｍｇ、６１％）を与え た。分析：ＴＬＣ：Ｒ_f（クロロホルム−メタノール−酢酸、８０：２０：５） 、０．３３；融点：１９４〜１９６℃；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ） δ２．５０（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ），５． ３５（ｓ， ２Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ）；ＵＶ：λmax２７０，２５２ｎｍ。ＡＣＶスクシネート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ Ｄ Ｍ Ｆ（１．０ｍＬ）中のＡ ＣＶスクシネート（３７．５ｍｇ、０．１２ｍモル；上記のように調製）の溶液 に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ、０．１５ｍモル）及びＤＣＣ（ ３４ｍｇ、０．１６ｍモル）を加えた。この溶液を１８時間攪拌し、濾過してＰ ＬＬ−ＡＳＯＲ（水１ｍＬ中の１０ｍｇ、０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に 調節）の溶液に加えた。カップリング反応を３時間行ない、次いで、Sephadex G 25カラムにて、ＰＢＳ（ｐＨ＝６．８）を用いて精製した。この溶出液の吸光度 を２６０ｎｍにてモニターした。結合体を含む画分をプールし、紫外線／可視光 線吸収の分光測光により分析した：λ_max２７７、２５０ｎｍ。５’−Ｏ−（３−カルボキシプロピオニル）−９−β−Ｄ−アラビノフラノシル アデニン（ａｒａＡスクシネート） ａｒａＡスクシネートを下記のようにして 調製した。ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ ８２５ｍｇ、３．１０ｍモル）の溶液に、無水コハク酸（３４２ｍｇ、３．４２ ｍモル）及びＤＭＡＰ（３８ｍｇ、０．３１ｍモル）を加えた。この反応混合物 を２２時間攪拌し、更なる無水コハク酸（３４２ｍｇ）及びＤＭＡＰ（３８ｍｇ ）を加えて１８時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、その結果生じた 油を、フラッシュシリカゲルにてクロロホルム−メタノール−酢酸（８０：２０ ：５）を用いるクロマトグラフィーにかけた。こうして得られた油状残留物をメ タノールに溶解させ、エーテル中で沈殿させて灰色がかった白色の吸湿性の粉末 （３２０ｍｇ、２８％）を与えた。分析：ＴＬＣ：Ｒ_f（クロロホルム−メタノ ール−酢酸、８０：２０：５）、０．４６；ＭＰ＝１４５〜１４７℃；ＩＲ（Ｋ Ｂｒ）：２９３２（ｂｒ），１７０１，１４２０，１３１０，１２０１，９２１ ，６３９ｃｍ^-1；ＵＶ：λ_max２５９。ａｒａＡスクシネート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ 上記のように調製したＤＭＦ（４７ ５μＬ）中の５’−Ｏ−（３−カルボキシプロピオニル）−９−β−Ｄ−アラビ ノフラノシルアデニン（１９ｍｇ、５１μモル）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミド（７．６ｍｇ、６５μモル）及びＤＣＣ（１６．２ｍｇ、７８μモル）を加 えた。この溶液を１８時間攪拌し、濾過して、ＰＬＬ−ＡＳＯＲ（水４７５μＬ 中の５ｍｇ、０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節）の溶液に加えた。カッ プリング反応を３時間行ない、次いで、Sephadex G25カラムにてＰＢＳ（ｐＨ＝ ６．８）で精製した。溶出液の吸光度を２６０ｎｍでモニターした。結合体を含 む画分をプールし、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した：λ_max２ ６２ｎｍ。実施例３： ホスフェート架橋剤及びポリリジンキャリ アーを用いる薬物結合体の調製 この実施例では、ポリリジンを、実施例１に記載したようにアシアロオロソム コイドに結合した。種々のヌクレオシドアナログのモノホスフェート誘導体を得 又は調製して、これらのヌクレオシドアナログのポリリジン−アシアロオロソム コイド複合体への結合を可能にするアミノ基と反応する架橋剤を与えた。これら のヌクレオシドアナログのモノホスフェート誘導体を、カルボジイミドカップリ ングによりポリリジン−アシアロオロソムコイドに結合した。ヌクレオシドアナ ログａｒａＣ及びａｒａＡのモノホスフェート誘導体は、市販品（Sigma社）を 購入した。ＡＣＶモノホスフェートを、下記のように調製した。９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニンモノホスフェート（ＡＣＶＭ Ｐ） オキシ塩化リン（２００μＬ、２．１ｍモル）、水（２３μＬ、１．３ｍ モル）及びピリジン（２００μＬ、２．３ｍモル）を、０〜４℃で、アセトニト リル（０．５ｍＬ）中で合わせた。アシクロバー（１００ｍｇ、０．４４ｍモル ）を加えて、この溶液を４時間０〜４℃で攪拌した。次いで、この溶液を氷水に 加えて更に１時間攪拌した。ｐＨを２に調節し、この溶液を、木炭−セライト（ 各２ｇ）の予備洗浄したカラムに加えた。このカラムを、更に、５０ｍＬの水で 洗い、ヌクレオシド生成物を５０ｍＬのエタノール −水−水酸化アンモニウム（１０：９：１）で溶出させた。この画分を蒸発させ て乾燥させ、２００ｍＬの水に再懸濁させた。ｐＨを４に調節し、この溶液を、 BioRadAG1-X8樹脂、蟻酸塩の７５ｍＬカラムに加えた。このカラムを、順に、０ ．１Ｍ、１Ｍ及び２Ｍの蟻酸で洗った。１Ｍ 蟻酸の画分は、純粋なＡＣＶＭＰ （６５ｍｇ；４８％）を含有した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ）δ３ ．６６（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｍ，２Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），８．１０ （ｓ，１Ｈ）。ａｒａＣモノホスフェート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ １ −β−Ｄ−アラビノフラノ シルシトシンモノホスフェート（３．３ｍｇ、１０μモル；Sigma 社より購入） 及びＰＬＬ−ＡＳＯＲ（１０ｍｇ）を、ｐＨを７．５に調節した１６８μＬの水 に溶解させた。この反応を、４℃でＥＤＣ（２．７ｍｇ、１４μモル）の添加に より開始した。２時間後に、更なる２．７ｍｇのＥＤＣを加え、反応液を４℃で １６時間攪拌し続けた。この溶液を２ｍＬに希釈し、１×３Ｌの０．９％ Ｎａ Ｃｌに対して透析し、その後、１×３Ｌの水に対して透析しそして凍結乾燥し、 紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した：λ_max２７５ｎｍ。ａｒａＡモノホスフェート−ＰＬ−ＡＳＯＲ ９−β−Ｄ−アラビノフラノシル アデニンモノホスフェート（４ｍｇ、１０μモル；Sigma 社から購入）及びＰＬ Ｌ−Ａ ＳＯＲ（１０ｍｇ）を、ｐＨを７．５に調節した５２０μＬの水に溶解させた。 反応を、４℃で、ＥＤＣ（４ｍｇ、２０μモル）の添加により開始した。７時間 後に、この溶液を２ｍＬに希釈し、２×３Ｌの０．９％ＮａＣｌに対し、続いて １×３Ｌの水に対して透析した。生成物を凍結乾燥し（１４ｍｇ）、紫外線／可 視光線吸収の分光測光により分析した：λ_max２６０ｎｍ。ＡＣＶ−モノホスフェート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ 上記のように調製したＡＣＶ− モノホスフェート（４ｍｇ、１３μモル）及びＰＬＬ−ＡＳＯＲ（２２ｍｇ）を 、ｐＨを．５に調節した６００μＬの水に溶解させた。反応を、４℃で、ＥＤＣ （４．５ｍｇ、２３μモル）の添加により開始した。７時間後に、この溶液を２ ｍＬに希釈し、２×３Ｌの０．９％ ＮａＣｌに対し、続いて１×３Ｌの水に対 して透析した。生成物を凍結乾燥し（１８ｍｇ）、紫外線／可視光線吸収の分光 測光により分析した：λ_max２６０ｎｍ。実施例４： アミノアシル架橋剤を用いる薬物結合体の 調製 この実施例においては、ヌクレオシドアナログのアミノアシル誘導体を調製し て、これらのヌクレオシドアナログのアシアロオロソムコイド上のカルボキシル 基への結合を可能にするカルボキシル基と反応する架橋剤を与 えた。これらの使用したアミノアシル架橋剤を、アミノメチルシクロヘキサンカ ルボン酸（ＡＭＣＣ）及び４−アミノブタン酸（ＧＡＢＡ）から誘導した。これ らのヌクレオシドアナログのアミノアシル誘導体を、カルボジイミドカップリン グによりアシアロオロソムコイドに結合した。５’−Ｏ−（トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシル）−９− β−Ｄ−アラビノフラノシル−アデニン（ａｒａＡ−ＡＭＣＣ） アミノメチル シクロヘキサンカルボン酸のベンジルカルバメートを、５ｍＬの２Ｎ ＮａＯＨ に溶解させたアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（１ｇ、６．４ｍモル）を ベンジルオキシカルボニルクロリド（１ｍＬ、７．０ｍモル）で処理（追加の１ ｍＬの２Ｎ ＮａＯＨを同時添加しながら５℃でゆっくり添加）することにより 調製した。この混合物を１時間攪拌し、次いで、２５ｍＬの水で希釈し、３×１ ５ｍＬのエーテルで洗った。次いで、この水溶液をｐＨ２．５未満に酸性化した 。多量の白色沈殿が形成され、それを濾過して５００ｍＬの冷水で洗い、真空中 で乾燥した。この生成物の一部（２７ｍｇ、０．１ｍモル）を、ＤＭＦ（０．６ ｍＬ）に溶解させたａｒａＡ（２７ｍｇ、０．１ｍモル）の溶液に加えた。ＤＣ Ｃ（２９ｍｇ、０．１４ｍモル）及びＤＭＡＰ（２．５ｍｇ、０．０２ｍモル） を加えて、この溶液を１６時間攪拌した。フラッシュシリカゲルクロマトグラフ ィーに よる精製は、Ｚ−ＡＭＣＣ−ａｒａＡ（１３ｍｇ、２５％）を与えた。Ｚ−ＡＭ ＣＣ−ａｒａＡ（１８５ｍｇ、０．３４ｍモル）の水素化分解は、化合物ＡＭＣ Ｃ−ａｒａＡ（１１７ｍｇ、０．２８ｍモル）を与えた。分析：¹Ｈ−ＮＭＲ（ ＣＤＣｌ₃）ｄ０．６４−０．９９（ｍ，３Ｈ），１．０１−１．２２（ｍ，２ Ｈ），１．２９−１．４８（ｍ，３Ｈ），１．６２−１．７７（ｍ，４Ｈ），１ ．７９−１．９３（ｓ，１Ｈ），１．９６−２．０９（ｍ，１Ｈ），２．６１− ２．７３（ｄ，２Ｈ），３．８２−４．０１（ｍ，３Ｈ），４．６３−４．６９ （ｙｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３８−５．４３（ψｔ，Ｊ＝６．２，１ Ｈ），６．５１−６．５７（ｄ，Ｊ＝６．１，１Ｈ，Ｈ１’），８．１７（ｓ， １Ｈ，Ｈ８），８．３１（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）；ＵＶ：λ_max２６０ｎｍ。ａｒａＡ−ＡＭＣＣ−ＡＳＯＲ結合体 上記のようにＤＭＳＯ（６０μＬ）中で 調製したａｒａＡ−ＡＭＣＣ（８ｍｇ、０．０２ｍモル）を、２００μＬのＭＥ Ｓ（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．６）中のＡＳＯＲ（１０ｍｇ）に加えた。ＥＤＣ（１ ６ｍｇ、０．０８ｍモル）を加えて、この溶液を３．５時間４℃で攪拌した。次 いで、この溶液をSephadex G25にてＰＢＳを溶出剤としてクロマトグラフィーに かけた。最初のピークを集めて、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析し た：λ_max２６３ｎｍ。Ｎ⁴−（４−アミノブチリル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａ ｒａＣ−ＧＡＢＡ） Ｄ Ｍ Ｆ（１２．５ｍＬ）中の５’−Ｏ−トリチル−１ −β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（８３３ｍｇ、１．７２ｍモル）の溶液 に、４−（ベンジルオキシカルボニルアミド）−ブタン酸（１．３８ｇ、５．８ ２ｍモル）及びＤＣＣ（３６５ｍｇ、１．７６ｍモル）を加えた。この溶液を５ 時間攪拌し、次いで、溶媒を真空中で除去し、その結果生じた油を、フラッシュ シリカのカラム上でクロロホルム−メタノール（９：１）を溶出剤として用いる クロマトグラフィーにかけた。こうして得られた生成物（Ｒ_f０．３８）の２３ ８ｍｇのアリコートを、５０％酢酸中で９０℃で加温することにより脱トリチル 化した。同じ溶出剤を用いるクロマトグラフィーは、純粋なａｒａＣ−ＧＡＢＡ −Ｚ（１３７ｍｇ、０．３ｍモル）を与えた。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ１． ８５（ｑｕｉｎ，２Ｈ，ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＨ₂ＮＨ），２．４８（ｔ，２Ｈ，Ｃ ＯＣＨ₂ ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ），３．１８（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ ＮＨ）， ３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５＆５’），４．０２（ｍ，１Ｈ），４．１０（ψｔ， Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｄｄ，Ｊ−２．２Ｈｚ，３．５Ｈｚ，１Ｈ ），５．０５（ｓ，２Ｈ，ベンジリック），６．１９（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１ Ｈ，Ｈ１’），７．３２（ｍ，５Ｈ，フェニル），７．４２（ｄ，Ｊ＝ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ）。この化合物を５ｍＬ のエタノール：水：酢酸（３：２：０．５）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ上で、 Brown の手順（Brown，C.A．及びBrown，H.C.(1966)J.Org.Chem.31:3989-3995） を用いて、出発物質がＴＬＣにより検出可能でなくなり且つ移動しないニンヒド リン陽性スポットが現われるまで水素化分解した（約３０分間）。この混合物を セライトを通して濾過し、エタノールを２０〜３０ｍｍＨｇで除去し、その結果 生じた溶液を凍結乾燥して白色結晶物質を与えた。融点：１２０〜１２２℃；Ｉ Ｒ（ＫＢｒ）：３４０８（ｂｒ），２３５５，１６５４，１５６０，１４９８， １４０６，１３１４，１１１４，１０５４，８０４ｃｍ^-1；ＵＶ：λ_max３０５ 、２７５ｎｍ。ａｒａＣ−ＧＡＢＡ−ＡＳＯＲ ＤＭＳＯ（１００μＬ）中のａｒａＣ−ＧＡＢ Ａ（１０ｍｇ、３０μモル）を４２０μＬの０．１Ｍ Ｍ Ｅ Ｓ（ｐ Ｈ５． ６）中のＡＳＯＲ（２１ｍｇ）の溶液に加えた。ＥＤＣ（５０ｍｇ、０．２６ｍ モル）を加え、その溶液を３時間２５℃で攪拌した。その溶液をSephadex G25カ ラム上でＰＢＳ（ｐＨ６．５）を溶出剤として用いるクロマトグラフィーにかけ た。第１の溶出ピークを水に対して透析し、凍結乾燥した。実施例５： ペプチド架橋剤を用いる薬物結合体の調製 この実施例においては、ヌクレオシドアナログのトリペプチド誘導体を調製し て、このヌクレオシドアナログのアシアロオロソムコイド上のカルボキシル基へ の結合を可能にするカルボキシル基と反応する架橋剤を与えた。このトリペプチ ド誘導体をカルボジイミドカップリングによりアシアロオロソムコイドに結合し た。 ３’，５’−ジ−Ｏ−（ｔブチリルジメチルシリル）−１−β−Ｄ−アラビノフ ラノシルシトシン（ＴＢＤＭＳ−ａｒａＣ） この化合物を、Wipf,P．等(1991) Bioorganic & Medicinal Chem．Letters 1:745-750に従って調製した。１−β− Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（１ｇ、４．２ｍモル）、イミダゾール（２． ２ｇ、３４ｍモル）、ＴＢＤＭＳＣｌ（２．５ｇ、１７ｍモル）及びＤＭＡＰ（ ５３ｍｇ、０．４ｍモル）の溶液を２４時間２５℃で攪拌した。次いで、この混 合物を５０ｍＬの水で希釈し、３×５０ｍＬのエーテルで抽出した。合わせた有 機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。 その結果生じた油のフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーは、ＴＢＤＭＳ− ａｒａＣを与えた。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ０．１１，０．１２，０．１３ ，０．１５（４ｓ，１２Ｈ，メチル），０．９０，０．９６（２ｓ，１８Ｈ，ｔ ブチル），３．８５（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ ），５．４６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）， ６．１４（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ ）。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−ＬｅｕＡｌａＬｅｕ（Ｚ−ＬＡＬ−ＯＨ） ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−ＬｅｕＡｌａＯ Ｈ（２ｇ、６ｍモル）、Ｎ−メチルモルホリン（０．６７ｍＬ、６ｍモル）及び イソブチルクロロホルメート（０．８２ｍＬ、６ｍモル）の溶液に、ＴＨＦ（２ ５ｍＬ）中のＬｅｕ（ＯｔＢｕ）・ＨＣｌ（１．３ｇ、６ｍモル）及びトリエチ ルアミン（０．８７ｍＬ、６ｍモル）の溶液を−５℃で加えた。この混合物を室 温にし、固形物を濾過により除去してＴＨＦで洗った。酢酸エチルを加え、合わ せた有機相を３０ｍＬずつの水、飽和重炭酸ナトリウム、水、１％ＨＣｌ及び２ ×水で洗った。この有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃 縮して白色の泡（１．５ｇ、５０％）を与えた。ＦＡＢＭＳ［Ｍ＋Ｈ］⁺５０６ 。ジクロロメタン（３ｍＬ）中のこの物質の３００ｍｇ（０．５９ｍモル）のア リコートに、トリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を加えた。１．５時間後に、出発 物質は、クロロホルム−メタノール（９：１）を用いるＴＬＣにより判定して使 い尽くされた。溶媒の除去と、その後の、同じ溶媒を用いるフラッシュシリカゲ ルの短いカラムを通す濾過は、Ｚ−ＬＡＬ−ＯＨ（２１６ｍｇ、８０％）を与え た。ＦＡＢＭＳ［Ｍ＋Ｈ］⁺４５０。Ｎ⁴−（ＬｅｕＡｌａＬｅｕ）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａ ｒａＣ−ＬｅｕＡｌａＬｅｕ） ＴＨＦ（０．６ｍＬ）中のＺ−ＬＡＬ−ＯＨ（ １００ｍｇ、０．２２ｍモル；上記のように調製）、Ｎ−メチルモルホリン（２ ５μＬ、０．２２ｍモル）及びイソブチルクロロホルメート（３０μＬ、０．２ ２ｍモル）の溶液に、ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のＴＢＤＭＳ−ａｒａＣ（７９ｍ ｇ、０．２２ｍモル；上記のように調製）の溶液を０℃で加えた。３０分間攪拌 した後、この溶液をエーテル（１５ｍＬ）で希釈し、３×１０ｍＬの水で抽出し た。この有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して真空中で濃縮した。そ の結果生じた油を、フラッシュシリカゲル上で４％メタノール−クロロホルムを 用いるクロマトグラフィーにかけて８０ｍｇ（７２％）のＴＢＤＭＳ−ａｒａＣ （ＬｅｕＡｌａＬｅｕ−Ｚ）を与えた。ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のこの生成物の 一部（１６ｍｇ、０．０２ｍモル）を、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ １０ｍｇ、０．０４ｍモル）での１時間の処理により脱シリル化した。１３％メ タノール−クロロホルムを用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーは、 ａｒａＣ−（ＬＡＬ−Ｚ）（１０ｍｇ、７４％）を与えた。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ ＯＤ）特徴的シグナル：δ０．９１（ｍ，１２Ｈ，ＬｅｕＣＨ ₃），３．８０− ４．５５（８Ｈ，アラビノース＆ペプチドαＨ’ｓ），５．０８（２Ｈ，ベンジ リック），６．１９ （１Ｈ，Ｈ１’），７．３０（ｍ，４Ｈ，フェニル＆１シトシン），７．４０（ １Ｈ，フェニル），８．２５（１Ｈ，シトシン）。 Ｚ保護基を除去するために、この化合物を５ｍＬのエタノール：水：酢酸（３ ：２：０．５）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ上で、Brown の手順（Brown，C.A． 及びBrown，H.C.(1966)J.Org.Chem.31:3989-3995）を用いて、出発物質がＴＬＣ により検出可能でなくなり且つ移動しないニンヒドリン陽性スポットが現われる まで水素化分解した（約３０分間）。この混合物を、セライトを通して濾過し、 ２０〜３０ｍｍＨｇでエタノールを除去し、その結果生じた溶液を凍結乾燥した 。ａｒａＣ−ＬｅｕＡｌａＬｅｕ−ＡＳＯＲ ａｒａＣ−ＬｅｕＡｌａＬｅｕ−Ａ ＳＯＲを調製するために、ＤＭＳＯ（１００μＬ）中のＴＢＤＭＳ−ａｒａＣ− ＬｅｕＡｌａＬｅｕ（３０μモル；上記のように調製）を、４２０μＬの０．１ Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）中のＡＳＯＲ（２１ｍｇ）の溶液に加えた。ＥＤＣ（ ５０ｍｇ、０．２６ｍモル）を加えて、この溶液を３時間２５℃で攪拌した。こ の溶液を、Sephadex G25カラム上で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）を溶出剤としてクロ マトグラフィーにかけた。第１の溶出ピークを水に対して透析し、凍結乾燥した 。実施例６： 還元的に不安定な架橋剤を用いる薬物結合 体の調製 この実施例では、ヌクレオシドアナログを、還元的に不安定な架橋剤を介して アシアロオロソムコイドに結合した。Ｎ⁴−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル）−ジデオキシシチジン（ｄ ｄＣ−ＰＤＰ） ＤＭＦ（１ｍＬ）中で、ジデオキシシチジン（４０ｍｇ、０． ２ｍモル）及びＳＰＤＰ（６０ｍｇ、０．２ｍモル）を１７時間２５℃で攪拌し た。２０ｍｍフラッシュシリカゲルカラム上での精製は、ｄｄＣ−ＰＤＰ（１２ ｍｇ、１６％）を産出した。分析：¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）特徴的シグナ ル：δ５．９１（１Ｈ，Ｈ１’），７．１８，８．４９（２Ｈ，シトシン），７ ．２５，７．８０，８．４７（４Ｈ，ピリジル）；ＵＶ：λ_max２９５、２４５ ；ジチオスレイトールでの処理は、ピリジン−２−チオンの遊離の特徴である３ ４０ｎｍでの吸光度最大値の展開を生じた。ｄｄＣ−ＤＰ−ＡＳＯＲ 脱気した５０ｍＭ ボレート、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ Ｈ８．５）の２００μＬ中のＡＳＯＲ（４ｍｇ）を３２μＬの同じ緩衝液中の２ −イミノチオランの９ｍｇ／ｍＬ溶液と、１．５時間、２℃で反応させた。この 蛋白質を、ＰＤ１０カラムを用いて脱気したＰＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７ ．０）で溶出して、未反応の２−イミノチオランから分離した。画 分（０．５ｍＬ）６〜８をプールし、Centricon 10（商標）を用いて、１５０μ Ｌに濃縮した。８０μＬのアリコートを、照合用に保持した。この蛋白質溶液の 残りに、ｄｄＣ−ＰＤＰ（１００μＬのＤＭＦ中の２ｍｇ）を、４℃で、攪拌し ながら、滴下した。４℃で１．５時間経過後に、結合体を、ＰＤ１０カラム上で 、上記のように、未反応のｄｄＣ−ＤＰから分離した。分析：ＰＡＧＥ、クーマ シーブルー染色した蛋白質の４５％は、Ｍｒ３６，０００の単一バンドとして移 動し、１３％はＭｒ８０，０００であり、１４％はＭｒ＞１００，０００であっ た。ＵＶ：λ_max２８０ｎｍ。実施例７： ポリグルタミン酸をキャリアーとして用い る薬物結合体の調製 この実施例では、ヌクレオシドアナログをポリグルタミン酸に架橋し、次いで 、カルボジイミドカップリングによりＡＳＯＲに結合した。ａｒａＣ−ＰＬＧＡ ａｒａＣを、文献記載の手順（Kato，Y.等(1984)Cancer R esearch 44:25-30）により、ポリグルタミン酸（ＰＬＧＡ；１４ＫＤ）に結合し た。簡単に言えば、イソブチルオキシカルボニルクロリド（５５６ｍｇ）及びト リエチルアミン（３９１ｍｇ）を、乾燥ＤＭＦ（４０ｍｌ）中のＰＬＧＡ（５０ ０ｍｇ）の溶液に、−８〜−５℃で加え、この混合物を、この温度で、１時間攪 拌した。その結果生じた溶液に、 乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のａｒａＣ（９４２ｍｇ）及びトリエチルアミン（３ ９１ｍｇ）を加え、反応を、４℃で３日間行なわせ、そして室温に４時間置いた 。この反応混合物を、ｐＨ８．０の冷０．４Ｍ リン酸緩衝液（２０ｍｌ）中に 注ぎ、任意の不溶性物質を濾過により除去した。濾液を３％ＮａＣｌ溶液に対し 及び水に対して透析した。ａｒａＣ−ＰＬＧＡ−ＡＳＯＲ ａｒａＣ−ＰＬＧＡ（上記のように調製）のア リコート１０ｍｇを、水（０．５ｍＬ）中のＡＳＯＲ（１５ｍｇ）と合わせた。 ｐＨを６．０に調節し、ＥＤＣ（１１ｍｇ）を加えて、この溶液を１６時間２５ ℃で攪拌した。この混合物を、２．５×１００ｃｍのSephacryl S100カラムにて 、ＰＢＳ（ｐＨ６．７）を溶出剤として用いて、０．３ｍＬ／分で分離した。８ ｍＬの画分を集め、画分２８〜３２をプールして凍結乾燥した（６ｍｇ）。分析 ：非還元的ＰＡＧＥ、Ｍｒ４６，０００；ＵＶ：λ_max２９５ｎｍ、２４８ｎｍ ；分光測光によるａｒａＣの濃度は、結合体１ｍｇ当り９７μｇ。実施例８： ポリアルデヒドデキストランキャリアーを 用いる薬物結合体の調製 この実施例では、他官能性キャリアー分子ポリアルデヒドデキストラン（ＰＡ Ｄ）を、デキストランから調製した。ポリアルデヒドデキストラン（ＰＳＤ） ポリアルデヒドデキストランを、文献 記載の手順（Bernstein，K．等(1978)J.Natl.Cancer Inst.60:379-384; Foster ，R.L.(1975)Experientia，772-773）に従って、１：１の過ヨウ素酸塩：グルコ ースモノマーのモル比を用いて合成した。簡単に言えば、１ｇ（０．１０８ｍモ ル）のデキストラン（平均分子量９３００）を、１８６ｍＬの０．０３Ｍ 過ヨ ウ素酸ナトリウムに溶解させ、２５℃で１８時間光を当てずに攪拌した。次いで 、この溶液を３５００ＭＷＣＯの透析チューブにて、３×２０Ｌの水に対して及 びその後１×５Ｌの水に対して透析し、そして凍結乾燥した。ａｒａＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ 上記のように調製したＰＡＤ（３００μＬのＰＢ Ｓ（ｐＨ７．２）中の１６ｍｇ）に、ａｒａＣ（７５μＬのＰＢＳ中の１０ｍｇ ）を加えた。この溶液を、２５℃で２０時間攪拌し、その後、ＡＳＯＲ（２００ μＬのＰＢＳ中の６ｍｇ）を加え、更に２０時間反応を続けた。次いで、シアノ ボロヒドリドナトリウム（６ｍｇ、９０μモル）を加え、この溶液を１．５時間 ３７℃で攪拌した。次いで、結合体をSephadex G25カラムにてＰＢＳを溶出剤と して用いて、未反応の薬物から分離した。第１の溶出ピークを４Ｌの水に対して 透析して凍結乾燥し（１６ｍｇ）、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析 した：λ_max２７８ｎｍ。ｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ 上記のように調製したＰＡＤ（２７５μＬのＰＢＳ （ｐＨ７．２）中の１５ｍｇ）にｄｄＣ（１０ｍｇ、４７μモル）を加えた。こ の溶液を２５℃で２０時間攪拌し、その後、ＡＳＯＲ（２００μＬのＰＢＳ中の ６ｍｇ）を加え、更に２０時間反応を続けた。次いで、シアノボロヒドリドナト リウム（６ｍｇ、９０μモル）を加え、この溶液を１．５時間３７℃で攪拌した 。次いで、反応混合物を、Sephadex G25カラムにて、ＰＢＳを溶出剤として用い て、未反応の薬物から分離した。第１の溶出ピークを４Ｌの水に対して透析して 凍結乾燥し（１７ｍｇ）、紫外線／可視光線吸収の分光測光により分析した：λ_max ２７７ｎｍ。実施例９： 薬物結合体の分子置換率分子置換率の測定 結合体上の薬物の濃度は、下記の方程式を用いて、分光測光 的に測定した： （式中、Ｄは結合体上の薬物の濃度（μｇ／ｍＬ）であり；εは（ｍｇ／ｍＬ）^-1 であり；Ｃは用いたストック溶液中の結合体のｍｇ／ｍＬであり；ｄはキュベ ット（１ｃｍ長）中のストックの希釈である）。 次の仮定をした：１）結合した薬物の吸光度係数は、遊離の薬物のそれと同じで ある；２）結合体の乾重量は、蛋白質及びポリマーである（薬物の重量は、１０ ％未満しか寄与しない）；３）ＡＳＯＲ−ポリリジン結合体の分子量は４０Ｋｄ である（サンプルしたＡＳＯＲ−ポリリジン結合体のアミノ酸分析は、１：１の ＡＳＯＲ（３６Ｋｄ）：ポリリジン（４Ｋｄ）比を支持する）。結合体中で用い た薬物の吸光度係数は、標準的技術により測定した。 実施例１〜８において調製した薬物結合体の平均分子置換率を表１に示す。 ａｒａＣ−ＧＡＢＡ−ＡＳＯＲの分子置換率を、ＨＰＬＣにより測定した。Ｈ ＰＬＣは、４８６吸光度検出器を有し、Applied Biosystemsの４．６ｍｍ×１０ ０ｍｍＣ１８カラムを用いるWaters 600E 溶媒送達システムにて行なった。２５ 分間、１ｍＬ／分の水からアセトニトリルへの直線状勾配（それぞれ、０．１％ 酢酸を含む）を用いて、ａｒａＣを、保持時間１２分で溶出した。検出は、２６ ０ｎｍであった。Waters 743データモジュールを用いてピークを定量した。架橋 剤のＮ−ブチリル結合のアルカリ加水分解によるａｒａＣの遊離を、０．１Ｍ ボレート緩衝液（ｐＨ９．５）にて行なった。この緩衝液にてａｒａＣ−ＧＡＢ Ａ−ＡＳＯＲ結合体の１ｍｇ／ｍＬ部分を３７℃でインキュベートした。２０μ Ｌのアリコートの注入を最初に行ない、そして１、２及び５日目に行なった。最 初に結合体中で検出された遊離のａｒａＣは、３μｇ／ｍｇ未満であった。２４ 時間後には、結合体１ｍｇ当り２０μｇの遊離の薬物が放出された。最大値２５ μｇ／ｍｇ（ＭＳＲ＝２に相当）が５日後に検出された。実施例１０： 薬物結合体によるＨＢＶ ＤＮＡ複製の 阻止 ＨＢＶ−ＤＮＡでトランスフェクトしたヒト肝芽細胞腫（ＨｅｐＧ２）由来の 細胞株、２．２．１５（Sells,M.A.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1005-1 009; Sells，M.A．等(1988)J.Virol．62:2336-2344）を用いて、これらの薬物結合体 の抗ウイルス活性を評価した。細胞は、未処理か、遊離の薬物で処理したか又は 結合体化した薬物（即ち、薬物−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ）で処理したものの何れかで あった。２．２．１５細胞を薬物結合体にさらした後、ＨＢＶ ＤＮＡの存在を 、細胞外で（即ち、細胞から放出されたビリオン中のＤＮＡ）、細胞内で、弛緩 した環状ＤＮＡ、複製中間体（一本鎖ＤＮＡ及び部分的に弛緩した環）の形態で 測定し、及びインテグレートされたＨＢＶ ＤＮＡを測定してウイルスＤＮＡ複 製に対する結合体の効果を測定した。遊離の及び結合体化したａｒａＡ、アシク ロバー、ａｒａＣ、ＡＺＴ及びｄｄＣのＩＤ₅₀（ウイルスＤＮＡ複製の５０％を 阻止するのに必要な投与量）を、未処理の対照と比較して測定した。ＣＤ₅₀（細 胞の５０％を殺すのに必要な薬物の投与量）を、遊離のａｒａＣ及びｄｄＣにつ いて及び結合体の１つ（ＡＣＶＭＰ−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ）について、２．２．１ ５細胞及びＳＫＨｅｐ１細胞の両者を用いて測定した。更に、イン・ビボ投与し た場合に、肝臓への薬物結合体のクリアランスのレベルを測定するために、Ｂａ ｌｂ／Ｃマウスに¹²⁵Ｉ−放射性標識した薬物結合体１０⁶ｃｐｍ／μｇを尾静脈 注射し、これらのマウスの肝臓を摘出して５分後に標識薬物結合体の存在につい てアッセイした。 これらのＨＢＶ抗ウイルスアッセイ（ＩＤ₅₀）の結果 を、下記の表２にまとめる。肝臓クリアランスアッセイ（肝臓に対する％）及び ２．２．１５（ＡＳＧＲ＋）細胞及びＳＫＨｅｐ１（ＡＳＧＲ−）細胞を用いた ＣＤ₅₀測定の結果も、表２に示す。実験方法も又、以下に詳細に説明する。 実験方法 ａｒａＡ−グルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ、ａｒａＡ−ホスフェート−ＰＬ Ｌ−ＡＳＯＲ、アシクロバー−グルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ、アシクロバー −スクシネート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ、アシクロバー−ホスフェート−ＰＬＬ−Ａ ＳＯＲ、アシクロバー−アミノアシル−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ、ｄｄＣ−グルタレー ト−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ、ｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ，ＡＺＴ−グルタレート−Ｐ ＬＬ−ＡＳＯＲ、ａｒａＣ−グルタレート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ及びａｒａＣ−Ｐ ＡＤ−ＡＳＯＲを含む薬物結合体のＨＢＶ抗ウイルス活性をアッセイするために 、２．２．１５細胞のストック培養を、５％ウシ胎児血清及び２ｍＭ Ｌ−グル タミンを補ったＲＰＭＩ１６４０中に維持した。これらの細胞を、３７℃で、５ ％ＣＯ₂を含む湿った空気中で培養した。抗ウイルス処理のために、２．２．１ ５細胞を、コラーゲン被覆した２４ウェルプレート上に４×１０⁴細胞／ｃｍ²の 密度で接種した。集密培養（接種の６〜８日後）を、２％ウシ胎児血清を含むＲ ＰＭＩ中で、結合体又は薬物の何れかを濃度を増大させて補って培養した。薬物 含有培地を１日目（集密化後）に加え、２日毎（３、５、７及び９日目）に新鮮 な結合体又は遊離の薬物を含む培地と交換した。１０日目に、培地及び細胞を、 細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡ分析のために採取した。 薬物処理の１０日後、結合体処理した２．２．１５培 養物から全核酸を抽出し、細胞内ＨＢＶ ＤＮＡを次のように分析した。細胞を 、過剰のトリス−緩衝化塩溶液で２回洗った。単層を、２０μｇ／ｍｌのＲＮア ーゼＡを含む溶解用緩衝液（０．６％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４）４００μｌ中で溶解させ、３７℃で３０〜６０分間 インキュベートした。この溶解物を小型遠心管に移して、プロテイナーゼＫを終 濃度１００μｇ／ｍｌに加え、５０℃で少なくとも２時間インキュベートした。 次いで、溶解物を３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むように調節し、フェノール ／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１ ｖ／ｖ）で一度抽出 し、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１ ｖ／ｖ）で一度抽出した 。このＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、５０μｌの１０ｍＭ トリスＨＣ ｌ、１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、そして制限酵素Ｈｉ ｎｄＩＩＩで消化した。サザーンブロッティングのために、第３の消化したＤＮ Ａを０．８％アガロースゲル中で電気泳動にかけ、Micro Separations MagnaGra ph（登録商標）ナイロン膜に、１０×ＳＳＣトランスファー緩衝液を用いて、一 晩キャピラリートランスファーによりトランスファーした。ハイブリダイゼーシ ョンを、ＨＢＶの完全長の３．２ゲノムを含むｐＡＤＷ−ＨＴＤ（T.J.Liang提 供）の［³²Ｐ］ｄＣＴＰ−標識したＥｃｏＲＩ断片を用いて６８℃で行なった。 すべての標識反応を、 Random DNA Labeling System（BRL，Life Technologies製）を用いて行なっ た。インテグレートされたＤＮＡ、弛緩した環状ＤＮＡ及び複製中間体のレベル を、Packard Instant Imagerを用いて定量し、未処理の対照のパーセンテージと してグラフ化した。 弛緩した環、複製中間体（一本鎖ＤＮＡ及び部分的に弛緩した環）及びインテ グレートしたＨＢＶ ＤＮＡとしての細胞内のＨＢＶ ＤＮＡの存在を定量的に 比較した。インテグレートされたＤＮＡのレベルは抗ウイルス処理により影響さ れないので、弛緩した環状ＤＮＡ及び複製中間体の相対的量を、インテグレート されたＤＮＡの量に対して標準化した。特に、ａｒａＣ−グルタレート−ＰＬ− ＡＳＯＲ結合体についてのデータを、図１に未処理対照のパーセントとしてプロ ットする。ａｒａＣ−グルタレート−ＰＬ−ＡＳＯＲ結合体は、細胞内のＨＢＶ の弛緩した環の蓄積に対して投与量に依存する阻止効果を有した。弛緩した環状 ＤＮＡ（最終生成物）の蓄積に対するＩＤ₅₀（ウイルスＤＮＡ複製の５０％を阻 止するのに必要な投与量）は、約０．１μＭ（３０ｎｇ／ｍｌ）であったが、複 製中間体は、高濃度（例えば、０．５ｍＭ（１００ｎｇ／ｍｌ）の薬物において さえ蓄積し続けた。遊離のａｒａＣについてのＩＤ₅₀は、約３．５μＭ（７５０ ｎｇ／ｍｌ）であった。しかしながら、これは、我々がＣＤ₅₀（細胞の５０％を 殺すのに必要な薬物の投与量）であることを測定したのと同じ値で ある。従って、遊離のａｒａＣの抗ウイルス活性の増大は、恐らく、特異的なウ イルス阻止ではなく細胞死によるものである。他の研究者は、遊離のａｒａＣは 、２．２．１５細胞においてはＨＢＶ複製の阻害剤ではないことを示した（B．K orba、私信）。従って、アシアロ糖蛋白質レセプターにより、細胞をａｒａＣの 標的とすることによって、薬物の抗ウイルス活性を増大させることができる。 図２は、未処理の対照のパーセントとしてプロットしたアシクロバー−ホスフ ェート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ結合体の細胞内ＨＢＶ ＤＮＡに対するＨＢＶ抗ウイ ルス活性を示す。この結合体は、２３μＭ（７μｇ／ｍｌ）のＩＤ₅₀で阻止した が、遊離のアシクロバーは、細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの蓄積に対する効果を殆ど有 しなかった（１Ｍｍ（３００μｇ／ｍｌ）より大きいＩＤ₅₀）。これらの結果は 、アシクロバーは、アシアロ糖蛋白質レセプターによって細胞を標的としたなら ば、ＨＢＶ複製のずっと強力な阻止剤となることを示している。 図４は、未処理対照のパーセントとしてプロットしたｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯ Ｒ結合体の細胞内ＨＢＶ ＤＮＡに対する効果を示している。遊離のｄｄＣ及び ｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ結合体の両者は、細胞内ＨＢＶの弛緩した環及び複製 中間体の蓄積に対して約０．１μＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）のＩＤ₅₀で阻止効果を有 した。 この薬物結合体の細胞外ＨＢＶ ＤＮＡ（細胞から放 出されたビリオン中のＤＮＡを意味する）に対する効果も又、評価した。細胞外 ＤＮＡの分析のために、結合体処理した２．２．１５細胞からの培養培地を小型 遠心分離機で２分間遠心分離して細胞残骸を除去した。細胞外ＤＮＡを変性する ために、４００μｌの清澄化した培地を２０分間室温（２５℃）で、１Ｍ Ｎａ ＯＨ、１０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ ク エン酸ナトリウム、ｐＨ７．２である）中でインキュベートした。これらの試料 を、直接、２０×ＳＳＣに予め浸しておいたナイロン膜（Micron Separations S ystems MagnaGraph（登録商標））にスロットブロット装置（ＢＲＬ）を用いて 加えた。結合したＤＮＡを中和するために、スロットを、０．５ｍｌの１Ｍ ト リス（ｐＨ７．２）／２Ｍ ＮａＣｌで２回洗い、０．５ｍｌの２０×ＳＳＣで １回洗った。これらのフィルターを取り出して２×ＳＳＣにて簡単に洗い、ＵＶ 架橋（Strtalinker，Stratagene 社）してから、完全長のＨＢＶプローブ（上述 ）とハイブリダイゼーションさせた。これらの結果は、表２（上記）に示してあ るが、やはり、アシアロ糖蛋白質により肝細胞を薬物の標的とすることによって 、それらのＨＢＶに対する抗ウイルス活性が、細胞外ＨＢＶ ＤＮＡ蓄積により 測定して、有意に増大し得ることを示している。 特に、表２に示したように、ａｒａＡの両結合体（即ち、グルタレート結合体 及びホスフェート結合体）は、 遊離のａｒａＡより１０倍以上低濃度でＨＢＶ細胞外ＤＮＡの阻止を示した。同 様に、すべてのアシクロバー結合体は、遊離のアシクロバーより遙かに低いＩＤ₅₀ を有した。最も強力なアシクロバー結合体であるアシクロバー−ホスフェート −ＰＬＬ−ＡＳＯＲは、遊離の薬物より１００倍以上低濃度でＨＢＶ細胞外ＤＮ Ａの生成を阻止した。細胞外ＨＢＶ ＤＮＡ生成に対するアシクロバー−ホスフ ェート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲ結合体の効果を、未処理対照のパーセントとして図３ にプロットしてある。細胞外ＤＮＡ（細胞から放出されたビリオン中のＤＮＡを 意味する）のレベルを測定したとき、この結合体が３μＭ（１μｇ／ｍｌ）より 小さいＩＤ₅₀で阻止することが見出されたが、他方、遊離のアシクロバーは、細 胞外ＨＢＶ ＤＮＡ蓄積には殆ど効果を有しなかった。例えば、３００μＭ（１ ００μｇ／ｍｌ）で、阻止は、４０％だけであった（図３参照）。同様に、表２ に示すように、ｄｄＣ−ＰＡＤ−ＡＳＯＲ結合体及びＡＺＴ−グルタレート−Ａ ＳＯＲ結合体は、共に、遊離の薬物より１オーダー以上大きくＨＢＶを阻止した 。これらの結果は、アシアロ糖蛋白質レセプターにより細胞を抗ウイルス剤の標 的とすることにより、それらの効果が、細胞外ＨＢＶの蓄積により測定して、遊 離の薬物よりも大いに増大されることを明確に示している。 選択した遊離の及ひ結合体化した薬物の細胞毒性を、下記のように測定した。 ２．２．１５及びＳＫＨｅｐ１ 細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレート上に、３．７５×１０³細胞／ウェルの 密度で接種した。ＳＫＨｅｐ１細胞はＡＳＯＲに対するレセプターを有さず、そ れ故、対照として働く。接種の２４時間後、濃度を増大させる遊離の及び結合体 化した薬物をこれらのプレートに加えた。薬物の添加の２４時間後、培地交換に より薬物を除去した。最初の薬物施与から７２時間後に、これらのプレートを、 生細胞中で代謝的に還元されて水溶性のホルマザン生成物になるテトラゾリウム 試薬ＸＴＴとＸＴＴの細胞による還元を著しく増大させて直接吸光度の読みを可 能にするＰＭＳとの組合せを用いて染色した。染色を、Scudiero，D.A.等(1988) Cancer Research，48:4827-4833により行なった。吸光度を４５０ｎｍで読んだ 。各ウェルの吸光度を１００％生存（薬物投与なし）の吸光度で除して１００を 乗ずることにより生存パーセントを計算した。これらの結果を表２に示す。ＡＳ ＧＲを発現している２．２．１５細胞を殺すのに必要なアシクロバー−ホスフェ ート−ＰＬＬ−ＡＳＯＲの量は、ＡＳＧＲ陰性のＳＫＨｅｐ１細胞を殺すのに必 要な量の１／５より少なかった。 これらの薬物結合体の肝臓へのクリアランスのパーセントを測定するために、 イン・ビボのターゲティングアッセイをマウスについて下記のように行なった。 結合体を、クロラミン−Ｔ手順（Wood等 (1981)J.Clin.Chem.Biochem.19:1051- 1056）を用いてヨウ素化した。Ｂａｌ ｂ／Ｃマウスに、１０⁶ｃｐｍ／μｇの¹²⁵Ｉ−薬物結合体（０．５ｍｌのＰＢＳ 中）を尾静脈注射した。平均比活性は、１０⁶ｃｐｍ／μｇであった。注射の５ 分後に、動物を、頚椎脱臼により殺した。５つの主要な器官（肝、脾臓、腎臓、 心臓及び肺）を摘出し、ガンマーカウンターにて計数して放射性標識した結合体 のターゲティングを測定した。表２に示したように、すべての薬物結合体の９５ ％より多くが肝臓に浄化されており、これらの薬物結合体がイン・ビボで効果的 に肝細胞に送達されることを示している。実施例１１： コルヒチン及び還元的に不安定な架橋剤 を含む薬物結合体の調製 ＡＳＯＲに結合したコルヒチンの薬物結合体を下記のように調製した：Ｎ−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルデアセチルコルヒチン ＳＰＤ Ｐ（２９ｍｇ、０．０９２ｍモル）及びＤＭＡＰ（１１ｍｇ、０．０９２ｍモル ）を、ジクロロメタン（１ｍＬ）中のデアセチルコルヒチン（３３ｍｇ、０．０ ９２ｍモル）に加え、その溶液を２３℃で２時間攪拌した。次いで、この溶液を 、フラッシュシリカゲル上で、クロロホルム中の６％メタノールを移動相として 用いてクロマトグラフィーにかけた。最初に溶出したコルヒチン誘導体（２１ｍ ｇ、０．０３８ｍモル）を、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．２５ （ｓ，１Ｈ），１．５６（ｓ，２Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｍ， １Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），２．５３（ｍ，１Ｈ），２．６７（ｑ，２Ｈ） ，３．０３（ｍ，２Ｈ），３．６５，３．９０，３．９４，３．９８（４ｓ，１ ２Ｈ），４．６８（ｍ，１Ｈ），６．５３（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１ ０．８，１Ｈ），７．１５（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｓ ，１Ｈ，Ｈ８），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．６３（ｍ，１Ｈ）， ８．５０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）により、正しい生成物であると決定した 。コルヒチン−ＤＰ−ＡＳＯＲ ０．０６ｍＬのＤＭＳＯ中の５ｍｇのＳＰＤＰを 、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ（０．１ｍ；ｐＨ７．５）中の８ｍｇのＡＳＯＲに加 えた。この反応混合物を、２時間、０〜４℃で、激しく攪拌した。次いで、この 混合物を、３０００ｒｐｍで１０分間、小型遠心分離機にかけた。上清を、ＰＤ １０カラムにて、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）を 用いてクロマトグラフィーにかけ、巨大分子画分を、Centricon 10を用いて０． ２５ｍＬに濃縮した。０．２５ｍＬの同緩衝液中のジチオスレイトール（６ｍｇ ）を加えて、この溶液を３０分間２３℃で攪拌した。次いで、この溶液を、ＰＤ １０カラムにて、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０２％アジ化ナトリウムを含む脱気 したＰＢＳを用いてクロマトグラフィーにかけ た。この巨大分子画分に、０．０５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させたＮ−（３−（２ −ピリジルジチオ）プロピオニルデアセチルコルヒチン（２ｍｇ）を加えた。こ の混合物を、最初に０〜４℃で攪拌し、次いで、２３℃で１７時間攪拌した。Ｎ −エチルマレイミド（１ｍｇ）を加えて、この混合物を更に１時間攪拌した。次 いで、この混合物を、５０００ｒｐｍで１０分間、小型遠心分離機にかけ、その 上清を、ＰＤ１０カラム上でＰＢＳにてクロマトグラフィーにかけた。この巨大 分子画分を、コルヒチンについて、３５３ｎｍでの吸光度を測定することにより 分析し、蛋白質については、BioRad蛋白質アッセイ及びＰＡＧＥを用いて分析し た。この結合体は、ＡＳＯＲ１モル当り２モルのコルヒチンを含有した。 これらのコルヒチン−ＤＰ−ＡＳＯＲ結合体を、この発明の他の薬物含有結合 体（例えば、実施例１〜１０に記載したもの）と共に用いて、又は核酸含有結合 体と共に用いて、これらの標的を定めた薬物又は核酸の細胞への送達を増大させ ることができる。コルヒチンは、エンドソームのリソソームへの移行及び／又は 融合を阻止すると考えられている。それ故に、他の薬物又は核酸含有結合体と共 に細胞のエンドソーム中へ同時に内在化されるならば、コルヒチン−ＤＰ−ＡＳ ＯＲ結合体は、これらの薬物又は核酸含有結合体のリソソームによる分解を防止 することができる。従って、この発明の一具体例において、エンドソームのリソ ソームへの移行及び／又は 融合を阻止するコルヒチンその他の薬剤を含む結合体及びＡＳＯＲを用いて、抗 ウイルス活性を増大させ、又は肝細胞を標的とした核酸の発現レベルを増大させ ることができる。同等物 当業者は、上記したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し又 は常例的実験を用いて確かめることができるであろう。かかる同等物は、後述の 請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スピタルニー，ジョージ エル. アメリカ合衆国 06410 コネティカット, チェシア，ブルックフィールド コート ６ (72)発明者 フィンディーズ，マーク エイ. アメリカ合衆国 02114 マサチューセッ ツ，ボストン，ナンバー10，ウエスト シ ーダー ストリート 57 (72)発明者 アーンスト，マイケル エフ. アメリカ合衆国 06340 コネティカット, グロッテン，イースターン パート ロー ド 1019 (72)発明者 ロビンソン，ブレット アメリカ合衆国 06082 コネティカット, エンフィールド，フォックス ヒル レイ ン 51

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的とするため の結合体であって、その結合体は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄよりなり、式中： Ａは、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ＤＮＡ結合剤、ホルモン、成長因子、ビタミ ン及びエンドソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤よりな る群から選択する治療剤であり、それは、多官能性キャリアー分子に共有結合し 、 Ｂは、治療剤に共有結合し且つ多官能性キャリアー分子に共有結合する架橋剤 であり、 Ｃは、多官能性キャリアー分子であり、そして Ｄは、アシアロオロソムコイド、アラビノガラクタン及びチロシル（グルタミ ル）グルタメートのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリ コシド）アミドよりなる群から選択する、アシアロ糖蛋白質レセプターに対する リガンドであり、このリガンドは、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合し得るよ うに多官能性キャリアー分子に共有結合している。 ２．抗ウイルス剤を、ヌクレオシドアナログ、逆転写酵素阻害剤、トポイソメラ ーゼ阻害剤、ＤＮＡジャイレース阻害剤及びＤＮＡ結合剤よりなる群から選択す る、請求項１に記載の結合体。 ３．抗ウイルス剤が、向肝臓性ウイルスに対して有効で ある、請求項２に記載の結合体。 ４．向肝臓性ウイルスを、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイ ルス及びＤ型肝炎ウイルスよりなる群から選択する、請求項３に記載の結合体。 ５．ヌクレオシドアナログを、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒ ａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、２’，３’− デオキシシチジン（ｄｄＣ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ ）、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（ＡＣＶ）、ガンシクロ バー、ファムシクロバー、ペンシクロバー、ブロモビニルデオキシウリジン、ホ スホノホルメート、アデノシン（ｄｄＡ）、イノシン（ｄｄＩ）、グアノシン（ ｄｄＧ）、チミジン（ｄｄＴ）及びウラシル（ｄｄＵ）の２’，３’−ジデオキ シヌクレオシド、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン−エリスロ−９−（ ２−ヒドロキシノニル）アデニン（ＡｒａＡ−ＥＨＮＡ）、２’−フルオロ−１ −β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）、２’−フル オロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノウロシル−５−エチルウラシル（ＦＥＡＵ） 、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（Ｆ ＩＡＵ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードシチ ジン（ＦＩＡＣ）、３’−フルオロ−ｄｄＣ、５−クロロ−ｄｄＣ、３’−フル オロ−５−クロロ−ｄｄＣ、３’−アジド− ５−クロロ−ｄｄＣ、３’−フルオロ−ｄｄＴ、３’−フルオロ−ｄｄＵ、３’ −フルオロ−５−クロロ−ｄｄＵ、３’−アジド−ｄｄＵ、３’−アジド−５− クロロ−ｄｄＵ、２’，６’−ジアミノプリン２’，３’−ジデオキシリボシド （ｄｄＤＡＰＲ）及びデオキシグアノシンのカルボン酸アナログ（２’−ＣＤＧ ）よりなる群から選択する、請求項２に記載の結合体。 ６．ヌクレオシドアナログを、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒ ａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、ジデオキシシ チジン（ｄｄＣ）、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（アシク ロバー、ＡＣＶ）及び３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）よりな る群から選択する、請求項５に記載の結合体。 ７．架橋剤が、アミド結合を介して多官能性キャリアー分子に共有結合する、請 求項１に記載の結合体。 ８．架橋剤が、カルボキシアシル化合物から誘導される、請求項７に記載の結合 体。 ９．カルボキシアシル化合物が、グルタレート又はスクシネートである、請求項 ８に記載の結合体。 １０．架橋剤が、アミノアシル化合物から誘導される、請求項７に記載の結合体 。 １１．アミノアシル化合物が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートである、請求項１０に記載の結合体。 １２．架橋剤が、細胞内で加水分解され得る、請求項７に記載の結合体。 １３．ペプチドが、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含む、請求項１２に 記載の結合体。 １４．架橋剤が、ホスホアミド結合を介して、多官能性キャリアー分子に共有結 合する、請求項１に記載の結合体。 １５．架橋剤が、ホスフェートである、請求項１４に記載の結合体。 １６．多官能性キャリアー分子が、ポリアミノ酸である、請求項１に記載の結合 体。 １７．ポリアミノ酸が、ポリリジン又はポリオルニチンである、請求項１６に記 載の結合体。 １８．ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸である、請求 項１６に記載の結合体。 １９．多官能性キャリアー分子が、ポリアルデヒドデキストランである、請求項 １に記載の結合体。 ２０．細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の結合体。 ２１．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的とするた めの結合体であって、その結合体は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄからなり、式中： Ａは、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒａＡ）、９−β−Ｄ− アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、９ − （２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（アシクロバー；ＡＣＶ）及び３ ’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）よりなる群から選択するヌクレ オシドアナログであり、 Ｂは、治療剤に共有結合し且つ多官能性キャリアー分子に共有結合する架橋剤 であり、 Ｃは、多官能性キャリアー分子であり、そして Ｄは、アシアロオロソムコイドであり、アシアロオロソムコイドは、アシアロ 糖蛋白質レセプターに結合し得るように多官能性キャリアー分子に共有結合して いる。 ２２．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的とするた めの結合体であって、その結合体は、一般式Ａ−Ｃ−Ｄよりなり、式中： Ａは、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ＤＮＡ結合剤、ホルモン、成長因子、ビタミ ン及びエンドソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤よりな る群から選択する治療剤であり、それは、多官能性キャリアー分子に共有結合し 、 Ｃは、多官能性キャリアー分子であり、そして Ｄは、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり、このリガンドは 、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合し得るように多官能性キャリアー分子に共 有結合している。 ２３．抗ウイルス剤を、ヌクレオシドアナログ、逆転写 酵素阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡジャイレース阻害剤及びＤＮＡ結 合剤よりなる群から選択する、請求項２２に記載の結合体。 ２４．抗ウイルス剤が、向肝臓性ウイルスに対して有効である、請求項２３に記 載の結合体。 ２５．向肝臓性ウイルスを、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウ イルス及びＤ型肝炎ウイルスよりなる群から選択する、請求項２４に記載の結合 体。 ２６．ヌクレオシドアナログを、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａ ｒａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、２’，３’ −デオキシシチジン（ｄｄＣ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺ Ｔ）、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（ＡＣＶ）、ガンシク ロバー、ファムシクロバー、ペンシクロバー、ブロモビニルデオキシウリジン、 ホスホノホルメート、アデノシン（ｄｄＡ）、イノシン（ｄｄＩ）、グアノシン （ｄｄＧ）、チミジン（ｄｄＴ）及びウラシル（ｄｄＵ）の２’，３’−ジデオ キシヌクレオシド、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン−エリスロ−９− （２−ヒドロキシノニル）アデニン（ＡｒａＡ−ＥＨＮＡ）、２’−フルオロ− １−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）、２’−フ ルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノウロシル−５−エチルウラシル（ＦＥＡＵ ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシ ル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）、２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノ フラノシル−５−ヨードシチジン（ＦＩＡＣ）、３’−フルオロ−ｄｄＣ、５− クロロ−ｄｄＣ、３’−フルオロ−５−クロロ−ｄｄＣ、３’−アジド−５−ク ロロ−ｄｄＣ、３’−フルオロ−ｄｄＴ、３’−フルオロ−ｄｄＵ、３’−フル オロ−５−クロロ−ｄｄＵ、３’−アジド−ｄｄＵ、３’−アジド−５−クロロ −ｄｄＵ、２’，６’−ジアミノプリン２’，３’−ジデオキシリボシド（ｄｄ ＤＡＰＲ）及びデオキシグアノシンのカルボン酸アナログ（２’−ＣＤＧ）より なる群から選択する、請求項２３に記載の結合体。 ２７．ヌクレオシドアナログを、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａ ｒａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、ジデオキシ シチジン（ｄｄＣ）、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（アシ クロバー、ＡＣＶ）及び３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）より なる群から選択する、請求項２６に記載の結合体。 ２８．多官能性キャリアー分子が、反応性アルデヒド基を有する、請求項２２に 記載の結合体。 ２９．多官能性キャリアー分子が、ポリアルデヒドデキストランである、請求項 ２８に記載の結合体。 ３０．多官能性キャリアー分子が、ポリアミノ酸である、請求項２２に記載の結 合体。 ３１．アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドがアシアロオロソムコイド である、請求項２２に記載の結合体。 ３２．アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドがアラビノガラクタン又は チロシル（グルタミル）グルタメートのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミン アミノヘキシルグリコシド）アミドである、請求項２２に記載の結合体。 ３３．細胞が、肝細胞である、請求項２２に記載の結合体。 ３４．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を治療剤の標的とするた めの結合体であって、その結合体は、一般式Ａ−Ｂ−Ｄよりなり、式中： Ａは、ヌクレオシドアナログ、逆転写酵素阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、 ＤＮＡジャイレース阻害剤及びＤＮＡ結合剤よりなる群から選択する治療剤であ り、 Ｂは、治療剤に共有結合し且つアシアロオロソムコイドに共有結合する架橋剤 であり、そして Ｄは、アシアロオロソムコイドであり、アシアロオロソムコイドは、アシアロ 糖蛋白質レセプターに結合し得るように架橋剤に共有結合している。 ３５．治療剤が、向肝臓性ウイルスに対して有効である、請求項３４に記載の結 合体。 ３６．向肝臓性ウイルスを、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝 炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＤ型肝炎ウイルスよりなる群から選択する、 請求項３５に記載の結合体。 ３７．ヌクレオシドアナログを、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａ ｒａＡ）、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、ジデオキシ シチジン（ｄｄＣ）、９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（アシ クロバー、ＡＣＶ）及び３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）より なる群から選択する、請求項３４に記載の結合体。 ３８．架橋剤が、アミド結合を介してアシアロオロソムコイドに共有結合する、 請求項３４に記載の結合体。 ３９．架橋剤が、アミノアシル化合物から誘導される、請求項３８に記載の結合 体。 ４０．アミノアシル結合体が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートである、請求項３９に記載の結合体。 ４１．架橋剤が、細胞内で加水分解され得る、請求項３８に記載の結合体。 ４２．ペプチドが、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含む、請求項４１に 記載の結合体。 ４３．架橋剤が、ジスルフィド結合を介してアシアロオロソムコイドに共有結合 する、請求項３４に記載の結合体。 ４４．架橋剤が、（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートから誘導される 、請求項４３に記載の結合体。 ４５．細胞が、肝細胞である、請求項３４に記載の結合体。 ４６．９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）及びアシアロ糖蛋 白質レセプターに対するリガンドを含む結合体であって、ａｒａＣが、架橋剤、 多官能性キャリアー分子又は架橋剤及び多官能性キャリアー分子によってリガン ドに結合している、上記の結合体。 ４７．リガンドが、アシアロオロソムコイドである、請求項４６に記載の結合体 。 ４８．リガンドが、アラビノガラクタン又はチロシル（グルタミル）グルタメー トのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミド である、請求項４６に記載の結合体。 ４９．ａｒａＣが、ホスフェート、グルタレート及びスクシネートよりなる群か ら選択する架橋剤に共有結合しており、架橋剤はａｒａＣに共有結合し且つポリ リジン及びポリオルニチンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共 有結合し、そして多官能性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合 している、請求項４７に記載の結合体。 ５０．ａｒａＣ及びアシアロオロソムコイドが、ポリアルデヒドデキストランに 共有結合している、請求項４７に記載の結合体。 ５１．ａｒａＣはアミノアシル架橋剤に共有結合し、架橋剤はａｒａＣに共有結 合し且つポリグルタミン酸、ポ リアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストランよりなる群から選択する多官 能性キャリアー分子に共有結合し、そして多官能性キャリアー分子はアシアロオ ロソムコイドに共有結合している、請求項４７に記載の結合体。 ５２．アミノアシル架橋剤が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートから誘導される、請求項５１に記載の結 合体。 ５３．アミノアシル架橋剤が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプ チドである、請求項５１に記載の結合体。 ５４．請求項４７に記載の結合体の溶液及び生理学的に許容し得るキャリアーを 含む製薬組成物。 ５５．９−（２−ヒドロキシエチオキシメチル）グアニン（アシクロバー；ＡＣ Ｖ）及びアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドを含む結合体であって、 ＡＣＶが、多官能性キャリアー分子又は架橋剤及び多官能性キャリアー分子によ ってリガンドに結合している、上記の結合体。 ５６．リガンドが、アシアロオロソムコイドである、請求項５５に記載の結合体 。 ５７．リガンドが、アラビノガラクタン又はチロシル（グルタミル）グルタメー トのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミド である、請求項５５に記載の結合体。 ５８．ＡＣＶがホスフェート、グルタレート及びスクシネートよりなる群から選 択する架橋剤に共有結合し、架橋剤はＡＣＶに共有結合し且つポリリジン及びポ リオルニチンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し、そ して多官能性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請 求項５６に記載の結合体。 ５９．ＡＣＶがアミノアシル架橋剤に共有結合し、架橋剤はＡＣＶに共有結合し 且つポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストランよ りなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し、そして多官能性キ ャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請求項５６に記載 の結合体。 ６０．アミノアシル架橋剤が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートから誘導される、請求項５９に記載の結 合体。 ６１．アミノアシル架橋剤が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプ チドである、請求項５９に記載の結合体。 ６２．請求項５６に記載の結合体の溶液及び生理学的に許容し得るキャリアーを 含む製薬組成物。 ６３．ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）及びアシアロ糖蛋白質レセプターに対する リガンドを含む結合体であって、ｄｄＣが、架橋剤、多官能性キャリアー分子又 は架橋剤及び多官能性キャリアー分子によってリガンドに結 合している、上記の結合体。 ６４．リガンドが、アシアロオロソムコイドである、請求項６３に記載の結合体 。 ６５．リガンドが、アラビノガラクタン又はチロシル（グルタミル）グルタメー トのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミド である、請求項６３に記載の結合体。 ６６．ｄｄＣがホスフェート、グルタレート及びスクシネートよりなる群から選 択する架橋剤に共有結合し、架橋剤はｄｄＣに共有結合し且つポリリジン及びポ リオルニチンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し、そ して多官能性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請 求項６４に記載の結合体。 ６７．ｄｄＣ及びアシアロオロソムコイドが、ポリアルデヒドデキストランに共 有結合する、請求項６４に記載の結合体。 ６８．ｄｄＣがアミノアシル架橋剤に共有結合し、架橋剤はｄｄＣに共有結合し 且つポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストランよ りなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し、そして多官能性キ ャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合する、請求項６４に記載の結 合体。 ６９．アミノアシル架橋剤が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブ チレートから誘導される、請求項６８に記載の結合体。 ７０．アミノアシル架橋剤が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプ チドである、請求項６８に記載の結合体。 ７１．架橋剤が、（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートから誘導される 、請求項６４に記載の結合体。 ７２．請求項６４に記載の結合体の溶液及び生理学的に許容し得るキャリアーを 含む製薬組成物。 ７３．９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒａＡ）並びにアシアロオ ロソムコイド、アラビノガラクタン及びチロシル（グルタミル）グルタメートの トリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミドより なる群から選択するアシアロ糖蛋白質レセプターのリガンドを含む結合体であっ て、ａｒａＡが、架橋剤、多官能性キャリアー分子又は架橋剤及び多官能性キャ リアー分子によってリガンドに結合している、上記の結合体。 ７４．リガンドが、アシアロオロソムコイドである、請求項７３に記載の結合体 。 ７５．ａｒａＡがホスフェート、グルタレート及びスクシネートよりなる群から 選択する架橋剤と共有結合し、架橋剤はａｒａＡに共有結合し且つポリリジン及 びポリオルニチンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し 、そして多官能性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している 、請求項 ７４に記載の結合体。 ７６．ａｒａＡがアミノアシル架橋剤に共有結合し、架橋剤はａｒａＡに共有結 合し且つポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストラ ンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子に共有結合し、そして多官能 性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請求項７４に 記載の結合体。 ７７．アミノアシル架橋剤が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートから誘導される、請求項７６に記載の結 合体。 ７８．アミノアシル架橋剤が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプ チドである、請求項７６に記載の結合体。 ７９．請求項７４に記載の結合体の溶液及び生理学的に許容し得るキャリアーを 含む製薬組成物。 ８０．３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）及びアシアロ糖蛋白質 レセプターのリガンドを含む結合体であって、ＡＺＴが、架橋剤、多官能性キャ リアー分子又は架橋剤及び多官能性キャリアー分子によってリガンドに結合して いる、上記の結合体。 ８１．リガンドが、アシアロオロソムコイドである、請求項８０に記載の結合体 。 ８２．リガンドが、アラビノガラクタン又はチロシル（グルタミル）グルタメー トのトリス−（Ｎ−アセチル ガラクトサミンアミノヘキシルグリコシド）アミドである、請求項８０に記載の 結合体。 ８３．ＡＺＴがホスフェート、グルタレート及びスクシネートよりなる群から選 択する架橋剤と共有結合し、架橋剤はＡＺＴと共有結合し且つポリリジン及びポ リオルニチンよりなる群から選択する多官能性キャリアー分子と共有結合し、そ して多官能性キャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請 求項８１に記載の結合体。 ８４．ＡＺＴがアミノアシル架橋剤に共有結合し、架橋剤はＡＺＴに共有結合し 且つポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びポリアルデヒドデキストランよ りなる群から選択する多官能性キャリアー分子と共有結合し、そして多官能性キ ャリアー分子はアシアロオロソムコイドに共有結合している、請求項８１に記載 の結合体。 ８５．アミノアシル架橋剤が、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカル ボキシレート又は４−アミノブチレートから誘導される、請求項８４に記載の結 合体。 ８６．アミノアシル架橋剤が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含むペプ チドである、請求項８４に記載の結合体。 ８７．請求項８１に記載の結合体の溶液及び生理学的に許容し得るキャリアーを 含む製薬組成物。 ８８．患者中のアシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を治療剤の標的にする 方法であって、 (a) 一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄよりなる結合体を形成し、 式中： Ａは、治療剤であり、 Ｂは、治療剤に共有結合し且つ多官能性キャリアー分子に共有結合する架橋剤 であり、 Ｃは、多官能性キャリアー分子であり、 Ｄは、アシアロオロソムコイド、アラビノガラクタン及びチロシル（グルタミ ル）グルタメートのトリス−（Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルグリ コシド）アミドよりなる群から選択するアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリ ガンドであり、このリガンドは、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合し得るよう に多官能性キャリアー分子に共有結合しており、そして (b) この結合体を生理学的に許容し得るキャリアーにて患者に投与する ことを含む、上記の方法。 ８９．患者中のアシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を治療剤の標的とする 方法であって、 (a) 一般式Ａ−Ｃ−Ｄよりなる結合体を形成し、 式中： Ａは、多官能性キャリアー分子に共有結合する治療剤であり、 Ｃは、多官能性キャリアー分子であり、 Ｄは、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり、このリガンドは 、アシアロ糖蛋白質レセプタ ーに結合し得るように、多官能性キャリアー分子に共有結合し、そして (b) この結合体を、生理学的に許容し得るキャリアーにて患者に投与する ことを含む、上記の方法。 ９０．患者中のアシアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を治療剤の標的とする 方法であって、 (a) 一般式Ａ−Ｂ−Ｄよりなる結合体を形成し、 式中： Ａは、ヌクレオシドアナログ、逆転写酵素阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、 ＤＮＡジャイレース阻害剤及びＤＮＡ結合剤よりなる群から選択する治療剤であ り、 Ｂは、治療剤に共有結合し且つアシアロオロソムコイドに共有結合する架橋剤 であり、 Ｄは、アシアロオロソムコイドであり、アシアロオロソムコイドは、アシアロ 糖蛋白質レセプターに結合し得るように、架橋剤に共有結合しており、そして (b) この結合体を、生理学的に許容し得るキャリアーにて患者に投与する ことを含む、上記の方法。 ９１．請求項５４に記載の製薬組成物を患者に投与することを含む、患者中のア シアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を９−β−Ｄ−アラビノフラノシルシト シン（ａｒａＣ）の標的とする方法。 ９２．請求項６２に記載の製薬組成物を患者に投与することを含む、患者中のア シアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を９−（２−ヒドロキシエチオキシメチ ル）グアニン（ＡＣＶ）の標的とする方法。 ９３．請求項７２に記載の製薬組成物を患者に投与することを含む、患者中のア シアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞をジデオキシシチジン（ｄｄＣ）の標的 とする方法。 ９４．請求項７９に記載の製薬組成物を患者に投与することを含む、患者中のア シアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデ ニン（ａｒａＡ）の標的とする方法。 ９５．請求項８７に記載の製薬組成物を患者に投与することを含む、患者中のア シアロ糖蛋白質レセプターを有する細胞を３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン（ＡＺＴ）の標的とする方法。 ９６．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞を該細胞においてエンド ソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤の標的とするための 結合体であって、その結合体は、一般式Ａ−Ｂ−Ｄよりなり、式中： Ａは、エンドソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤であ り、 Ｂは、エンドソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤に共 有結合した還元的に不安定な 架橋剤であり、そして Ｄは、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり、このリガンドは 、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合し得るように、架橋剤に共有結合している 。 ９７．エンドソームのリソソームへの移動及び／又は融合を阻止する薬剤がコル ヒチンである、請求項９６に記載の結合体。 ９８．還元的に不安定な架橋剤が、ジチオプロピオニルである、請求項９７に記 載の結合体。 ９９．アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドが、アシアロ糖蛋白質であ る、請求項９６に記載の結合体。 １００．アシアロ糖蛋白質が、アシアロオロソムコイドである、請求項９９に記 載の結合体。 １０１．アシアロ糖蛋白質レセプターを発現している細胞をコルヒチンの標的と するための結合体であって、一般式Ａ−Ｂ−Ｄよりなり、式中： Ａは、コルヒチンであり、 Ｂは、コルヒチンに共有結合する還元的に不安定な架橋剤であり、そして Ｄは、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり、このリガンドは 、アシアロ糖蛋白質レセプターに結合し得るように、架橋剤に共有結合している 。 １０２．還元的に不安定な架橋剤が、ジチオプロピオニルである、請求項１０１ に記載の結合体。 １０３．アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドが、アシアロ糖蛋白質で ある、請求項１０１に記載の結合体。 １０４．アシアロ糖蛋白質が、アシアロオロソムコイドである、請求項１０３に 記載の結合体。