JPH06503354A - アシアロ糖蛋白抱合薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アシアロ糖蛋白抱合薬剤 ［技術分野］ 本発明は肝に特異に作用する医薬成分などをアシアロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）と結合 させて、製造された新規の抱合薬剤に関するものであり、組換えインターフェロ ン（ＩＮＦ）とアンアロ糖蛋白を結合させて製造された新規の抱合インターフェ ロン抗ウィルス剤を含む。本発明は特に、ウィルス性肝炎を治療することにおい て効果的な新規の抱合インターフェロンに関するものである。本発明の抱合イン ターフェロンは肝炎ウィルスが主に繁殖する肝のみにて選択的に分布及び摂取さ れ、Ｂ型及びＣ型肝炎の治療をするための治療剤としての潜在的有効性を表す。

尚、本発明は抱合薬剤の製造方法、薬剤学的組成物及びその用途に関するもので ある。

［背景技術］ 慢性ウィルス性肝炎は世界的に非常にありふれた疾患である。全人口の約５％及 び韓国人口の約１０％が慢性ウィルス性肝炎に感染していると推算される。尚、 慢性ウィルス性肝炎が医学的、社会的に関心を集めている理由はその疾患が生活 、特に生活の買及び生産的な面で有害な影響を与える為である。慢性肝炎は一般 的に肝硬変症に進行し、更には原発性肝癌を引き起こし、死亡に至ることがある 。

即ち、慢性ウィルス性肝炎は肝炎の主要原因であり、致命率の高い疾患である。

従って、効果的な抗ウイルス製剤の開発が急を要している。しかし、最近まで慢 性ウィルス性肝炎に確実な抗ウイルス剤治療法はない。幾つかの薬剤が慢性ウィ ルス性肝炎の治療に部分的に有効なものとして立証されているが副作用を始め、 諸般の問題点が解決されなければならない実情である。

過去、広く利用されてきた抗ウイルス製剤の中の一つであるアデノシンアラビノ シド　−燐酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ　ｍｏｎｏｐｈｏ ｓｐｈａｔｅ）　（Ａｒａ−ＡＭＰ）はＤＮＡ重合酵素の活性度を抑制し、強力 な抗ウィルス作用を表すプリン系製剤である。１９８０年代始めには慢性Ｂ型肝 炎に対するＡｒａ−ＡＭＰの治療効果は１０乃至１７％であると報告されている 。しかし、１９８７年ガルシア（ガルシアＧ　、スミス　ＣＬ、ワイスパーグ　 Ｊｌ、ら：　慢性Ｂ型肝炎の治療におけるひと白血球インターフェロンと組み合 わせたアデニンアラビノシドー燐酸：任意の二重盲検ブラセボによる試験、アン ナルス・インターナル・メディシン、１０７：２７８−２８５．１９８７）等は Ａｒａ−ＡＭＰ治療群は対照群に比ヘテ数等、優れた効果を得ることはできなか ったと報告している。尚、Ａｒａ−ＡＭＰの投与は時々骨髄抑制作用と非可逆的 な神経筋肉系の痛みのような非常に深刻な副作用をひきおこす。従って、Ａｒａ −ＡＭＰは現在は慢性Ｂ型つィルス性肝炎の治療に使用されていない。

一般的に、動物細胞内で生産される、即ち自然型インターフェロンは慢性Ｂ型つ ィルス性肝炎の治療に効果的なものであることが知られている。自然室インター フェロンは糖蛋白質群、即ち、非−蛋白質部分が低分子量の炭水化物である抱合 蛋白質として１９５７年抗ウイルス活性を有する物質であることが明らかになっ た。インターフェロンの抗ウィルス剤及び抗癌剤としての有用性により、産業界 及び学界においてこれらの作用効果、作用メカニズム及び純品の分離方法、大量 生産方法等について多くの研究が進行されている。現在知られているインターフ ェロンとしては１）白血球においてウィルス感染によって誘導生産され、抗ウィ ルス作用と自然殺細胞活性化作用を有するα−インターフェロン、２）繊維芽細 胞においてウィルス感染、特に二重鎖ＲＮＡウィルス感染により誘導生産され抗 ウィルス作用を有するβ−インターフェロン、及び３）リンパ球において分裂誘 発因子又は抗原による免疫学的刺激により誘導生産されて免疫調節活性を有する γ−インターフェロンがある。γ−インターフェロンはα−及びβ−インターフ ェロンに比べて抗癌効果及び抗ウィルス活性が優れていると報告されている。

今日は遺伝子組換え方法により組換えインターフェロンの大量生産が可能となっ て組換えインターフェロンは抗ウィルス剤及び免疫調節薬剤として広範囲に利用 されている。

組換え形インターフェロンの慢性Ｂ型肝炎に対する治療効果を見れば、慢性Ｂ型 肝炎の罹患率が相対的に低い西欧においては３０乃至４０％であると報告されて いるが対照群の自然緩解率である１５乃至２５％と比較して見れば組換えインタ ーフェロンはわずか約１０乃至１５％の慢性Ｂ型肝炎患者のみに臨床的効果があ るものと判断される。全世界人口の中、肝炎Ｂ表面抗原保有者は約３億であると 推算され、この中、アジア人が８０％を占める。これらアジア人を組換えインタ ーフェロンで治療したとき、治療率は肝炎ｅ抗原の年間自然消失率である１６乃 至１７％と同程度の１０乃至１５％に過ぎない。従って、組換えインターフェロ ンは韓国人を含むアジア人にはその効果が認められていない。

インターフェロンは慢性Ｂ型肝炎患者の血清内のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を 消滅もしくは減少させることができるが、一部慢性肝炎患者等にはＨＢＶ　ＤＮ Ａが肝細胞内に持続的に存在していることが知られている。従って、インターフ ェロン治療の中断後に再発の可能性が高いと推測される。

一方、慢性Ｃ型肝炎に対してはインターフェロン容量及び治療期間により多少の 差はあるが、生化学的肝機能検査によって得た血清アラニンアミノ移転酵素（Ａ ｌａｎｉｎｅ　Ａｍ１ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）値の減少を臨床的治療効果 判定の基準でみる時、組換えインターフェロンの使用により、２８乃至７１％ま で治療効果があると報告されている。

しかし、組換えインターフェロンによる治療後、約半数の患者から再び臨床的再 発を確認されたので、Ｃ型肝炎に対する組換えインターフェロンの治療効果は一 時的であるとしか見られない。従って、現在商品化されている組換えインターフ ェロンは一部のＢ型及びＣ型慢性肝炎患者に単に、一時的な効果のみを提供する 。

最近、Ｂ型及びＣ型慢性肝炎患者の数人に投与して一時的な効果を示している組 換え型インターフェロンは、自然型インターフェロンとは異なり、糖（Ｓ　ｕｇ ａｒ）は投与直後腎臓を経て尿に排出されるので肝細胞摂取率が自然型インター フェロンよりも劣り、従って、その効果が非常に制限的なものであると知られて いる。

実際にＢ型及びＣ型慢性肝炎に対する組換えインターフェロンの臨床的効果は一 部を者にて一時的にのみ現れ、治療失敗率及び治療中止後の再発率が全て相当に 高いことが確認された。尚、治療効果を高める為にはインターフェロンを多量投 与しなければならない。しかし、多量を使用すれば必然的に発熱、筋肉痛、及び 関節痛、及び骨髄抑制等の副作用が伴う。

上記の通り、既存の組換えインターフェロンは慢性肝炎治療剤として高い効能が 期待できないので、副作用を最少にしつつ、高い治療効果を示すことのできる新 たな慢性肝炎治療剤の開発が切実に要求されてきた。

インターフェロンの効果がこのように、一時的に現れる理由はインターフェロン が血清においてはウィルスＤＮＡの量を減少させることができたが、肝細胞内の ウィルスに対しては効果的に作用することができず、従って、肝細胞内でウィル スが持続的に増殖して治療終了後にさらに悪化することがあるためである。

従って、最も理想的な治療方法は最も効果的な抗ウィルス剤を目的とする肝細胞 内に直接投入する薬物標的治療法である。

先行技術においては、肝細胞内に存在するウィルスの増殖を抑制するために肝細 胞のみに特異的に存在する受容体を通じて抗ウィルス剤を投入する方法等が試み られてきた。ヒラメン等（バイオケミカル・ファーマコロジー、３５：９６７゜ １９８６）は抗ウィルス剤である９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−アデニル− せて合成した新規の蛋白であるラクトーサミネーティド血清アルブミン（Ｌ−５ Ａ）に結合させたＬ−８Ａ−ａｒａ−ＡＭＰを合成させてこの物質が肝内に特異 的に高濃度で摂取され得るということを確認した。しかし、この過程はラクトー サミネーティド血清アルブミンの生産過程が非常に複雑であるのみならず、高価 なアルブミンを使用し、尚、Ｌ　−Ｓ　Ａ　−ａｒａ　−ＡＭ　Ｐは人体に存在 する天然物質でない合成糖蛋白を使用し、Ｂ型慢性肝炎治療に効果のないことが 確認されていたａｒａ−ＡＭＰを結合させて製造したという点で肝炎治療におい ては高い効果が期待できなかった。

血液内の血漿蛋白はアルブミンを除いては全てシアル酸残基で終わる炭水化物鏑 を含む糖蛋白である。この血漿蛋白類は種々の酵素等によってシアル酸残基が離 脱することによって循環血液より一連の過程を経て除去される。ノイラミン酸分 解酵素は哺乳動物血清において糖蛋白からシアル酸残基を除去する酵素としての その活性度を示す。［シエングルント　Ａ、ＣＬ・シアリダーゼ、ローゼンバー グ　Ａ、／エングルント　ＣＬ　（ＪＲ）ニジアル酸の生物学的役割、ニューヨ ーク、ブレラム、１９７６］。血液内を循環し、可溶性である血漿蛋白は一定期 間後にはその溶解度や固有の生理的作用を喪失する。このような作用メカニズム は肝細胞に存在する。即ち、肝細胞よりの糖蛋白除去メカニズムに障害のある肝 硬変や肝炎患者の場合に正常血漿からは検出されない循環アシアロ糖蛋白がこれ らの患者の血漿内に存在するという事実から１１蛋白の除去は肝の機能に属する ことがわかる。

実際にアジアロセルロブラスミンを兎に注射した時、アジアロセルロブラスミン の半減期は自然のセルロブラスミンの５５時間と比べて２分と顕著に短い。この ような現象は他の血漿蛋白の場合にも共通に観察される。

即ち、糖蛋白の末端に位置するンアーリル基を除去すればガラクトース基が露出 され、このガラクトース基が肝細胞膜に存在する受容体に認識され、即時に受容 体媒介性エンドサイト−シス（ＲＭＥ）を経て肝細胞に急速に取り込まれ、循環 血液から無Ｘなる。

モーレル（Ｍｏｒｅｌｌ）とアシュウエル（Ａｓｈｗｅｌｌ）等は１９６０年代 に、セルロブラスミンのンアーリル基をノイラミニダーゼで除去すれば、この血 漿蛋白が血漿からより早く去るのを確認し、この現象が肝細胞に存在するＡＳＧ Ｐ受容体によって摂取される為であることを明らかにした（ジャーナル・オフ・ バイオロジカル・ケミストリー、２４３＋１５５．１９６８）。その後このＡＳ ＧＰ受容体は肝細胞にのみ存在することが明らかになった（Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍ ｏｌ、４１　：９９．１９７４）。

このような肝細胞への特異な摂取は、実験的にトリチウムを付したアジアロセル ロプラスミンやアジアロオロソムコイド（ｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ）を生体内に 注射すれば、同位元素が肝細胞内のみにて選択的に発見されることによって確認 された（シェンベルク　ＩＨ，モレル　ＡＧ、ストツヵート　ＲＪ　循環蛋白の 肝臓薬、ダビッドソン　Ｃ３Ｗ、肝臓病における問題点、２７９−２８５頁、ニ ューヨーク、ストラットン社、１９７９）。尚、この受容体は最後糖基がＤ−ガ ラクトースもしくはＮ−アセチル力ラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙ１ｇａｌａｃ ｔｏｓａ田ｉｎ）の糖蛋白を特異的に認知し、摂取することが明らかになった（ Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、５１：５３１．　．１９８２）。肝細胞の 細胞膜にはガラクトースで終わるアシアロ糖蛋白と結合する細胞構造があり、こ の細胞構造は最初には肝結合蛋白（ＨＢＰ）と呼ばれてきたが、現在はアシアロ 糖蛋白受容体と呼ばれている。尚、種々のアシアロ糖蛋白の中でもアシアロ−α １−酸糖蛋白であるアジアロオロソムフィド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃａ ｉｄ）を注入した時、血清内で最も早く無くなることが観察されることによって アシアロ−α、−酸糖蛋白が肝細胞内に特異的に最も良く摂取されることが明ら かになった（第１図）（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー、２ ４５；４３９７．１９７０）。

顕著な抗ウイルス効果のある自然型インターフェロンも炭水化物鎖の端にシアル 酸を含んでいる糖蛋白で、静脈内注射の後、血液内から迅速に除去される。自然 産（Ｎａｔｉｖｅ）インターフェロンを酵素処理して末端のシアリル基を除去し てガラクトースで終わるアシアロインターフェロンを作ればセルロブラスミン等 の他の糖蛋白の場合のように自然産インターフェロンに比べて早く循環血液から 除去される。

しかし、グリコシダーゼで処理してインターフェロン分子より８５％以上の炭水 化物基を除去して、ポリペプチド部分のみを残した場合にはインターフェロンの 抗ウイルス効果は変わらないが、肝細胞内への摂取が減少しても血液内での半減 期が長くなる（ポース　Ｓ１ヒツクマン　Ｊ：循環系におけるインターフェロン の残存量の定量における炭水化物部分の役割、ジャーナル・オフ・バイオロジカ ル・ケミストリー、２５２：８３３６．１９７７、第２図）。従って、アシアロ インターフェロンも他のアシアロ血漿糖蛋白等と同様にアシアロ糖蛋白受容体を 通じて選択的に肝細胞内に取り込まれて循環血液より除去される過程を経ること になることと推定された。

組換えインターフェロンは１９８０年にバイスマン（Ｗｅｉｓｓ■ａｎｎ）等が 人体の白血球のＩＮＦ−αハ遺伝子をエンエリキア・コリ内で操作することによ って製造された。組換えインターフェロンは炭水化物鎖を含まず、１６５個のア ミノ酸のみにて構成されているので組換えインターフェロンの肝細胞内への浸透 能力は、自然産インターフェロンをグリコンダーゼで処理して形成されたポリペ プチドインターフェロンと同じく非常に不良である。

従って、本発明の目的は殆ど肝細胞内にて主に増殖する肝炎ウィルスに対する組 換えインターフェロンの抗ウィルス活性を増進するために肝細胞内において特異 的に存在するアー・アロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）受容体に対して組換えインターフェ ロンを標的にさせることである。

本発明の他の目的は肝炎の臨床的、血清学的及び分子生物学的症状を示す人間を 含む哺乳動物に投与し、Ｂ、　Ｃ，及びＤ型肝炎を含むウィルス性肝炎が治療で きるインターフェロン−抱合体を提供することにある。

本発明の追加的目的は患者の肝細胞に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制するに 充分な量の後述する一般式（１）の抱合インターフェロンを必要とする患者に投 与してウィルス性肝炎を治療する方法を提供する。

本発明の他の目的は肝細胞に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制するのに有効な 量の後述する一般式（１）の抱合インターフェロン及び薬剤学的に許容される担 体、補助剤又は賦形剤を含むウィルス性肝炎治療用組成物を提供するものである 。

本発明の追加の他の目的はアシアロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）と組換えインターフェロ ン（ＩＮＦ）を結合させて、患者に非経口的に投与した時、肝細胞内に特異的に 存在するＡＳＧＰ受容体に結合するインターフェロン−抱合体を生成させる新規 の抱合抗インターフェロン剤の製造方法を提供することにある。

本発明の利点は組換えインターフェロン単独使用時の副作用発現度に比べて副作 用の発現を減少させたインターフェロン−抱合体を提供することである。

前述したものは本発明の更に適切な目的中の一部を概略的に示したものである。

これら４目的は本発明の更に適切な特徴及び適用方法中の一部を単純に例示する ためのものである。その他多数の有益な結果が本発明を他の方法に適用するか、 本発明を記述された内容の範囲内で変形させることによって得ることができる。

従って、本発明の他の目的及び更に詳細なことは、添付図面とともに請求の範囲 で定義された発明の範囲と発明の要約及び望ましい具体例とを記述した詳細な説 明を参考にして理解することができる。

［発明の開示］ 一つの観点において、本発明は次の一般式（Ｉ）に示す新規の抱合薬剤に関する ものである。

Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−Ｒ（１）［式中、 Ｐ　は人体の血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓ　は人体の血清糖蛋白の糖残 基であり、Ｇａｌ　はガラクトース残基であり、 ＧＡ　はグルタルアルデヒド残基であり、Ｘ　は１又はそれ以上の整数を示し、 Ｒは下記で定義したような医薬成分を意味する。〕アシアロ糖蛋白と結合させて 上記一般式（１）の抱合薬剤を製造するに適合した医薬成分は実質的に肝に特異 的に作用する全ての薬剤である。望ましくは医薬成分はＢ型及びＣ型慢性ウィル ス性肝炎治療用抗ウィルス剤、例えばインターフェロンナトリウム、アサイクロ ビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　ｓｏｄｉｕｍ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ）、ビダラビ：ｚ（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ；アデノンン　アラビノサイド）、ジ ドブヂン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ：ＡＺＴ）、スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）、ア ンチ−センスオリゴヌクレオタイド（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅｏｌｉｇｉｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅ）及びリボザイム（触媒的　ＲＮＡ５）：抗癌剤化学療法による毒 性を防止する生物学的調節物質、例えばメトツレックセイトの毒性を軽減させる カルシウムロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ　ｃａｌｃｉｕｍ）；診断的肝 映像化用放射線照映削、例えば、ナトリウム−メグルミンディアトリゾエイト及 びガドリニュームーＤＴＰＡ：肝細胞保護剤、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ） 及びプロスタグランヂン、及び肝スキャニング用放射仕同位元素、例えば”ｍＴ ｃ（テクネチウム）及び＋３１１−である。本発明による一般式ＣＩ）の抱合薬 剤の医薬成分から更に望ましいのは憧性ウィルス性肝炎の治療に最も効果的なイ ンターフェロン（ＩＮＦ）である。従って、以下においては本発明をアシアロ糖 蛋白とインターフェロンとを結合させて製造した抱合インターフェロンと関連し て具体的に説明する。

本発明はウィルス性肝炎に臀病（３ている轡者に抗ウイルス効果を示し、肝を通 じて流れる血流から肝細胞によって選択的に吸収されるように標的化された抱合 ４＞ターフェ［コンに関するものである。本発明による抱合インターフェロンに は下記一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンを含む。

Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−ＩＮＦ　（１）［式中、 Ｐ　は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓ　は人体の血清糖蛋白の糖残基 であり、Ｇａｌ　はガラクトース残基であり、 ＧＡ　はグルタルアルデヒド残基であり、Ｘ　は１又はそれ以上の定数を示し、 ＩＮＦ　はインターフェロンであり、望ましくはＩＮＦは組換えインターフェロ ンである。］ インターフェロン（ＩＮＦ）はα−インターフェロン、β−インターフェロン又 はγ−インターフェロンであり、最も望ましくはα−インターフェロンである。

望ましい人間血清糖蛋白はα（１）−酸糖蛋白（オロソムコイド）、フェツイン 、セルロブラスミン、ハプトグロブリン、サイログロブリン、マクログロブリン である。

一般式（Ｉ）のＰ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−残基は望ましくはアノアロオロソムコイ ド、アンアロフェツイン、アンアロセルロブラスミン、アシアロノ＾ブトグロブ リン、ア７アロサイログロブリン及びアソアロマクログロブリンから成る群から 選ばれるアンアロ化ひと血清糖蛋白である。

本発明の又他の観点は肝炎治療用薬剤学的組成物である。この組成物はウィルス 性肝炎に感染した患者の肝細胞に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制するに充分 な量の一般式（Ｉ）の抱合インターフェロン及び薬剤学的に許容する担体、補助 剤又は賦形剤を含む。望ましくは薬剤学的組成物は静脈投与に適合したものであ る。

本発明の他の観点はウィルス性肝炎に罹病している患者の肝細胞に存在する肝炎 ウィルスの増殖を抑制するのに充分な量の一般式（Ｉ）の抱合インターフェロン を投与してウィルス性肝炎に罹病している患者のウィルス性肝炎を治療する方法 である。望ましくは抱合インターフェロンは静脈内投与される。

本発明の又他の観点は一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンを製造する方法であ る。

Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−ＩＮＦ　（Ｉ）［式中、 Ｐ　は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓ　は人体の血清糖蛋白の糖残基 であり、Ｇａｌ　はガラクトース残基であり、 ＧＡ　はグルタルアルデヒド残基であり、Ｘ　は１又はそれ以上の定数を示す。

］この方法は糖部分の末端から二番目残基がＤ−ガラクトース（Ｇａｌ）であり 、最後の残基がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）又は（シアル酸）である ことを特徴とする一般式蛋白質一（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡの糖蛋白を有する 人体血清を提供する段階を含む。その後人体血清を処理して人体血清から蛋白質 −（糖）ｘ−Ｇａ１−ＮＡＮＡを分離させ、Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡを 回収する。その後、Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡをニュラミダーゼで処理し てＮＡＮＡを除去し、アシアロ糖蛋白（Ａ　Ｓ　Ｇ　Ｐ）であるＰ−（Ｓ）ｘ− Ｇａｌ残基を得て、これが脱シアル化された人体血清糖蛋白残基である。アシア ロ糖蛋白であるＰ　（Ｓ）ｘ−Ｇａｌはその後にグルタルアルデヒド（ＧＡ）交 差結合方法（レインニリン　Ｍ蛋白およびペプチドの結合剤としてのグルタルア ルデヒドの使用、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　７０　１５９−１６５．１ ９８０）を使用してインターフェロンと結合させる。その後、一般式Ｐ−（Ｓ） ｘ−Ｇａｌ−ＩＮＦ（１）の抱合インター７　ｓ　Ｏ：／を得る。

望ましくは人体血清は人体血清のコーン（Ｃｏｈｎ）分画■上清液であり、これ をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファデクス又はＣＭ−セルローズクロマトグラフィによっ て通常な公知の方法で処理してコーン分画Ｖｌ清液から蛋白質−（糖）ｘ　−Ｇ ａｌ　−Ｎ　Ａ　Ｎ　Ａを分離させる。

一般式（１）の抱合インターフェロンを製造する更に具体的な方法は人体血清の コーン分画〜ｒ上清液を提供する段階を含む。

Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ　−ＩＮＦ　（Ｉ）［式中、 Ｐ　は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓ　は人体の血清糖蛋白の糖残基 であり、Ｇａｌ　はガラクトース残基であり、 ＧＡ　はグルタルアルデヒド残基であり、Ｘ　は１又はその以上の定数を示し、 ＩＮＦ　はインターフェロンであり、望ましくはＩＮＦは組換えインターフェロ ンである。

人体血清のコーン分画■上清液を処理してそれから蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ− ＮＡＮＡ糖蛋白を分離及び回収させて、これをニュラミダーゼで処理して糖蛋白 を脱アンル化させて蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ構造を有するアンアロ糖蛋白（Ａ ＳＧＰ）である糖蛋白残基を得る。アシアロ糖蛋白はグルタルアルデヒド（ＧＡ ）交差結合方法を使用してインターフェロンと結合させる。その後、蛋白質−（ 糖）Ｘ−Ｇａｌ−ＩＮＦ構造を有する抱合インターフェロンを回収する。

望ましくは人体血清のコーン分画■上清液を通常の方法でＤＥＡＥ−セファデク ス又はＣＭ−セルローズクロマトグラフィによって処理してコーンＶ分画から蛋 白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡのα（１）−酸糖蛋白を分離する。

本発明の更に適切、かつ重要な特徴は以下の発明の詳細な説明が更に良く理解さ れ得、本技術分野に対する進歩性が充分に理解できるように上記で要約、記述し た。後述した本発明の追加の特徴は本発明の特許請求範囲の対象を構成する。

当業者は本明細書において記述された概念及び具体例が本発明の同一の目的を行 うために他の構造物を変形させるか、設計変更するための基礎として利用できる ことは当該技術分野の専門家に理解できることである。尚、このような等価構造 物が特許請求範囲に記述した本発明の意義及び範−を脱しないことも当該記述分 野の専門家に理解できることである。

［図面の簡単な説明］ 本発明の特徴及び目的の完全な理解をするために添付図面に関連させて次の詳細 な説明を参考にする。

第１図は静脈注射したアシアロ血漿蛋白質等の血漿内残存率を示すグラフであり 、 第２図は静脈内投与後の自然度インターフェロン、ノイラミニダーゼ処理したイ ンターフェロン及びグリコシダーゼ処理したインターフェロンの消失率を示し、 第３図は分離精製したα１−酸糖蛋白とアシアロ糖蛋白との電気泳動写真であり 、 第４図はアノアロ糖蛋白とインターフェロンとの抱合体合成後行った電気泳動写 真であり、 第５図は牛血清アルブミンとアシアロ糖蛋白との肝内摂取を比較したγカメラ像 及び放射能値グラフであり、 第６図はインターフェロンと新規の抱合インターフェロンとの肝内摂取を比較し たγカメラ像及び放射能値グラフであり、第７図はインターフェロンと新規の抱 合インターフェロンとの投与３時間後生体内生物学的分布図を示すグラフであり 、第８図はインターフェロンと新規の抱合インターフェロンとの時間経過による 相対的な肝内生物学的分布図を示すグラフである。

［発明の好ましい実施形ｆｉ］ 先行技術の組換えインターフェロンに関する上記の問題点を解決するためにはイ ンターフェロンを肝細胞内に浸透させなければならない。従って、本発明は組換 えインターフェロンを直接肝細胞内に浸透させるために組換えインターフェロン を肝細胞に選択的に運搬し得る、即ち、ノイラミニダーゼによって血漿糖蛋白を 処理してンアル酸残基を除去し、ガラクトース残基を露出させて、即ち、アシ７ 口糖蛋白（ＡＳＧＰ）を形成させる。

その後、抗ウィルス剤である組換えインターフェロンを糖蛋白（ＡＳＧＰ）の露 出したガラクトース残基と結合させることによって、この様に結合した薬剤は肝 細胞に特異に存在するＡＳＧＰ受容体に結合することができる。この際、結合さ せる抗ウィルス剤としては現在までＢ型及びＣ型慢性肝炎治療に最も効果的であ るとして知られた組換えα−１β−及びγ−ＩＮＦが含まれる。ここで特に驚（ べき事実はα−１β−１γ−インターフェロンを肝炎治療に単独に使用する場合 にはα−インターフェロンのみが治療効果があるが本発明によってα−１β−１ γ−インターフェロンをアンアロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）と結合させればα−１β− １γ−インターフェロン全て肝炎治療に効果があるという点である。

尚、本発明の新規の抱合インターフェロンは肝細胞のみによって特異的に吸収さ れた後に肝細胞内に長時間残留するので最適投与容量を減少させることができる 。

従って、インターフェロンの頻繁な投与又は多量投与による副作用が一般的に軽 減する。抱合インターフェロンの製造に使用される糖蛋白は特別の制限はないが 、第１図に示すように肝への吸収の早いものであることが明らかになったα１− 酸糖蛋白、即ち、オロソムコイドやフェツイン、セルロブラスミン、ハプトグロ ブリン、サイログロブリン及びマクログロブリン等が望ましい。

本発明の抱合インターフェロンは下記のような方法で製造できる。先ず、人体血 清のコーン分画Ｖ上清液から蛋白質（ＩＩ）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡ（ＮＡＮＡは Ｎ−アセデルノイラミン酸である）構造を有するα、−酸糖蛋白をＤＥＡＥ−セ ファデクス又はＣＭ−セルローズクロマトグラフィによって通常の方法で分離し た後（ハオ　Ｙ−Ｌ、ウイッカーハウザー　Ｍ、・グリコプロティン、Ｂｉｏｃ ｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙ　’ｓ、Ａｃｔａ　３２２：９９．Ｌ９７３）、ノイラミ ン酸ゼによってシアル酸を除去して蛋白−（糖）ｘ−Ｇａｌの構造を有するアシ アロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）を得て、このアノアロ糖蛋白とインターフェロンとをグ ルタルアルデヒド交差結合方法を利用して結合させ、蛋白−（糖）Ｘ−Ｇａｌ− ＧＡ　−Ｉ　ＮＦの構造を有する抱合体を合成する。

上記のような本発明の工程を要約すれば次のようである。

人体血清中コーン分画　Ｖ　上清液 α、−酸糖蛋白 アシアロ糖蛋白 アシアロ糖蛋白−インターフェロン抱合系上記製造方法において使用される糖蛋 白は人体の血漿内に存在する糖蛋白である。本発明の目的のためには糖蛋白の糖 部分の末端から二番目残基がＤ−がラクトースてあり末端残基がＮ−アセチルノ イラミン酸（シアル酸）である限り、α。

−酸糖蛋白（オロソムコイド）のような如何なる糖蛋白も使用ができ、例えば、 フェツイン（ｆｅｔｕｉｎ）、セルロブラスミン（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ ）、ノーブトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌ。

ｂｉｎ）のような糖蛋白が且つ使用できる。

オロソムコイド、フェツイン、セルロプラスミン、ヘトグロビン、チログロブリ ン及びマクログロブリン糖蛋白が脱シアル化した場合には各々アジアロオロソム コイド、アンアロフェツイン、アジアロセルロプラスミン、アシアロへトグロビ ン、アンアロサイログロブリン及びアシアロマクログロブリンと呼ばれ、本発明 の抱合インターフェロンに使用できる。これらのアシアロ糖蛋白はα（１）−酸 糖蛋白、即ち、アジアロオロソムコイドの脱ンアル化方法と同一の工程によって 製造できる。

しかし、最も望ましいのはα（１）−酸糖蛋白（アジアロオロソムコイド）であ るが、その理由は第１図に示すように、注射後に血漿内に残留するアジアロオロ ゛ツムコイドの比率は血漿ｍ１当たり釣り１８％であるからである。静脈内注射 した脱シアル化した血漿蛋白質の残存率を測定するために体重的２００ｇの雄ア ルピノラットの尾静脈に注射（１ｍｌ）を投与した。各注射液１ｍｌは次に相応 する：３Ｈ−アンアロトランスペリン、０．　３ｍｇ、　６．　６Ｘ１０’ｄｐ ＋＊；６１（：Ｕ−セルローズプラスミン、０．　３ｍｇ：３８−アシアログロ ブリン、０、　３ｍｇ、１２．６Ｘ１０’ｄｐｍ；’Ｈ−アシアロ−α２−マク ログロブリン、０．１９ｍｇ、１１．２Ｘ１０’ｄｐｍ；’Ｈ−アシアロノ１ブ トグロビン、０．１２ｍｇ、９．５Ｘ１０６ｄｐｍ：３Ｈ−アンアロセルロブラ スミン、０．　３ｍｇ、　６．　７　ＸＩ　Ｑ’ｄｐｍ；３Ｈ−アンアロフェツ イン、０．　１１ｍｇ、　２Ｘ１０’ｄｐｍ；３Ｈ−７ン７ｏオロソムコイＦ、 領　１３ｍｇ、１４．４Ｘ１０’ｄｐｅ＋血液の見本は尾静脈から種々の時間間 隔にしてヘパリン処理した試験管に入れて遠心分離した後、血漿放射能を測定す る。動物を殺した後、指示された時間に肝を摘出し、湿潤組織的２０ｍｇの分取 量を放射能測定に使用する。結果は第１図に提示した。

第１図においては血液内にアシアロα１−酸糖蛋白（アシアロオロソムコイド） 、アノアロフェツイン、アジアロセルロブラスミン及びアシアロハプトグロビン を静脈内注射した後１２分後に血液中に残している量の百分率が各々０．１８、 領３７．０６及び１．２であることを図示している。即ち、アシアロα１−酸糖 蛋白が血液から最も早く去るということが分かり、即ちこれが他のものに比べて 最も早し・速度で肝細胞に吸収されるということを示している。

本発明の抱合インターフェロンの製造のための第１段階工程でコーン分画Ｖ上清 液はアルブミン製造方法として知られている通常の方法（コーン　Ｅ、Ｊ、ら、 ジャーナル・オフ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ、６８：４５９．１９ ４６）によって人間血清より分離させて得ることができる。コーン分画Ｖ上清液 からα１−酸糖蛋白を大規模で分離精製する方法は以下で略述する公知の方法（ ハオ　Ｙ−Ｌ、ウイノカーハウザー　Ｍ９．α１−酸糖蛋白の大規模調製の簡便 法、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、３２２：９９．１９７３） によって行う。

表２ コーン分画Ｖ　上清液（ＩＩＬ） ＤＥＡＥケーキ　上清液捨てる 緩衝液＋１．Ｍ　ＮａＣ１洗滌液捨てる６０分間撹拌 ＤＥＡＥ溶出物（１，２Ｌ） 濃縮物（０，０６Ｌ） α、−酸糖蛋白（０，８２ｇ） 分離精製されたα宜−酸糖蛋白を下記反応図式による脱シアル化反応に適用させ 、アンアロ糖蛋白を得る。

回収したアシアロ糖蛋白は第３図のカラムＣに示すような電気泳動図を示す。

第３図においてカラムＡは蛋白質の分子量標識であり、カラムＢは分離された４ ３ｋｄ（ｋｄはキロダルトンを意味する）の大きさのシアル酸が切断されていな いＣ１−酸糖蛋白の単一バンドであり、カラムＣは１．７ｋｄの大きさのシアル 酸残基を切断した約４１ｋｄのアシアロα１−酸糖蛋白の単一バンドである。

脱ンアルロ糖蛋白とインターフェロンとの抱合体を製造する最終工程は最も穏や かな交差結合反応の一つであるグルタルアルデヒド（ＧＡ）交差結合方法を利用 する。グルタルアルデヒドは４℃乃至４０℃にて中性ｐＨ（６，Ｏ−８，０）で 、広い緩衝領域を有する緩衝液中で露出したアミノ基と結合する。この反応は蛋 白質のアミノ基とアルデヒド基との間にシッフ塩基を形成することによって達成 される。この反応において、グルタルアルデヒドは二つのアルデヒド基を持って いるので次に示すようにこれらが二つのアミノ基と直接結合するようになる（ボ ズマンスキー　Ｍ、Ｊ、および　ジュリアノ　Ｒ，Ｌ、・薬物の制御送達への生 物学的検討クリティカル・レビュー、ファーマコロンカル・レビューズ　３６： ２７７−３３６．１９８４）。

担体−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ２）３　Ｃ＝Ｎ＝薬物／酵素この抱合体はまずヨードアン（ Ｉ　ｏｄｏｇｅｎ）法で抱合体のインターフェロン部分にてＩｌｌ　ｌで標識し てＩ３１■−インターフェロン−アシアロ糖蛋白抱合体を合成して、これを電気 泳動し、クマノブル−（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　Ｂ　１ｕｅ）で染めた後、自動放射 装置を通じて確認することができる（第４図：Ｂ及びＣ）。

第４図で、カラムＣは蛋白質の分子量標識マーカーであり、カラムＢで６７ｋｄ のバンドは抱合体、４１ｋｄのバンドは抱合体合成反応後の未反応のアシアロ糖 蛋白を示している。又、カラムＡはカラムＢの電気泳動ゲルを自動放射記録（ａ ｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｔ＋ｙ）　したものであり、＋３１１−インターフェ ロン−アシアロ糖蛋白抱合体に相応する６７ｋｄのバンドを示す。

本発明において、インターフェロンの運搬体として用いられるアシアロ糖蛋白が 肝に特異に吸収されるということを証明するために次の様な動物実験を実施した 。

実験は下記のようにその目的に従って二つに分類し、各実験で対照群を設定して 行った。

アノアローα１−酸糖蛋白の組織特異度に対する実験兎（家兎） １３’１−ＢＳＡ　’！＋１−ＡＳＧＰ」 ａ　ガンマカメラ映像 ｂ　時間変化による肝内放射能値測定 ＋３１１−標識されたアンアロ糖蛋白を家兎に注入して得たガンマカメラ映像と 時間による放射能値の変化を１３１１−牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　５ｅ ｒｕ■　ａｌｂｕ■ｌｎ・ＢＳＡ）から得た結果と比較した。その結果は第５図 に示した通り人体血清より分離精製されたアンアロ糖蛋白が肝内に特異に摂取さ れるということが明らかになった。第５図において上段のガンマカメラ映像は兎 を横たえた状態で各臓器から放出する放射線写真である。この写真から時間の経 過によって兎の臓器に存在するアシアロ糖蛋白の量を比較確認できる。即ち、＋ ３１１−生血清アルブミンに比べて１３１　Ｎ−アシアロ糖蛋白がさらに特異的 に肝に摂取され、かつ更に長時間肝に残留しているのが確認できる。下段グラフ で横軸（Ｘ軸）は時間を、縦軸（Ｙ軸）は各々肝と心臓内、即ち血中放射能値を 示す。第５図の映像からアシアロ糖蛋白がアルブミンより顕著に特異に肝内に摂 取されているのがわかる。

抱合インターフェロンの肝細胞選択能に対する実験兎（家兎） ａ　ガンマカメラ映像 ｂ　時間変化による肝内放射能値 Ｃ主要臓器の放射能分布測定 １３１１−標識したインターフェロンを家兎に注射して得たガンマカメラ映像と 時間経過による肝、心臓及び膀胱にての放射能値を１３１１−標識した本発明の 抱合インターフェロンの場合と比較した結果を第６図に示した。

第６図のガンマカメラ映像から、インターフェロンは注射後３０分迄は主に肝に 残留しているが、腎臓を通じて既に膀胱へ排出され始め、３時間が経過するとイ ンターフェロンは狂的には殆ど無く、主に膀胱内のみに存在することがわかる。

一方、本発明のアシアロ糖蛋白−インターフェロン抱合体は注射後、３０分、２ 時間及び３時間目に主に狂的に持続的に残留し、膀胱内への排出は観察されなか った。このような現像は下段の時間による放射能値の変化とも一致する。即ち、 インターフェロンの場合には最上線の肝内放射能値及び中間線の血中放射能値が 全て注射後、３０分内に漸次減少し、一番下線の膀胱的放射能値が増加すること を示しているのに比べてアシアロ糖蛋白−インターフェロン投与群では肝内放射 能値が持続的に維持され、膀胱の放射能増加は現れなかった。

インターフェロンと新規の抱合インターフェロンとの組織特異性を比較するため にインターフェロンとアシアロ糖蛋白−インターフェロン抱合体とを各々家兎に 注入し、３時間後に家兎をと殺して各臓器内の放射能値を測定し、第７図で示す ように兎組織内分布を比較した。

その結果として、肝、腎臓、肺、膵臓、心臓及び甲状腺の６種の臓器に残留する 全ての放射能値の合計を１００とするとき、各臓器に残留する放射能値各々の相 対的比率を見れば、アシアロ糖蛋白−インターフェロン抱合体の狂的残留量は全 臓器内残留量の約８５％に達し、腎臓、肺、心臓での残留量は各々只７％、５％ 、１％であった。これに比べてインターフェロンの場合には狂的の残留量が５３ ％に過ぎない反面、腎臓、肺、心臓では相対的に多い３２％、１１％、２％を各 々示した。

第８図は時間の経過によるインターフェロンと新規の抱合インターフェロンとの 肝内残存量の相対的な比率を示すグラフである。このグラフよりアシアロ糖蛋白 インターフェロン抱合体の肝内残存率はインターフェロンより顕著に更に高く、 且つ更に長いことがわかる。即ち、注入後、３０分、３時間及び１２時間からア ンアロ糖蛋白−インターフェロン抱合体の残存率はインターフェロンより各々１ ゜５倍、４．３倍及び６倍更に高い。

本発明のインターフェロン抱合体はインターフェロン製剤に通常使用される補助 剤安定化剤、緩衝剤等製薬学的に許容される担体とともに肝炎治療用注射剤組成 物として製造することができる。このような目的に適合した緩衝剤として１大燐 酸ナトリウム、燐酸カリウム等が望ましい。本発明の組成物は尚フェノールのよ うな保存剤、アルブミン、Ｌ−シイティン塩酸塩、マルトス、塩化ナトリウム又 は塩化カリウムのような安定化剤等を含むことができる。

投与量は患者の年齢及び体重、症状等によって増減できるが、大体に本発明のイ ンターフェロン抱合体をインターフェロン基準によって体表面積−ｚ当たり２０ 〜２００百万ＩＵ、を１〜２日に一回ずつ静脈投与する。しかし、その他既存の インターフェロン投与方法に準じて投与期間や投与量を調節することができる。

本発明の抱合インターフェロンは肝細胞によって特異に吸収され、狂的に持続的 に残留する。従って、抱合インターフェロンの投与量は通常的なインターフェロ ン製剤に比べて顕著に減少させることができる。このように減少させた投与量に よって、対象磨者等からインターフェロン自体に基づ（発熱、筋肉痛、骨髄抑制 等のような副作用が除去できる。従って、本発明の抱合インターフェロンは通常 のインターフェロンに比べて人体に対し顕著に優れた耐性を有する。

薬剤はウィルス性肝炎の臨床的、血清学的及び分子生物学的症状を表す患者に投 与する。ＨＢｓＡｇ及びアンチ−ＨＣＶに対する陽性反応は各々慢性Ｂ型及びＣ 型肝炎の帳票である。薬剤組成物は上述したところの通りであり、静脈内投与の 結果は第７図及び第８図で示す。

下記実施例等は本発明を更に詳細に説明するために与えられたものであり、本発 明の範囲がこの実施例等によって何ら制限されるものではない。

下記実施例においてインターフェロンは特別に指定しない限り組換えα−インタ ーフェロンである。

アシアロ糖蛋白（蛋白−（糖）Ｘ−ガラクトース）の製造１）　トレシル化支持 体（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ　５ｕｐｐｏｒｔ）の製造湿潤状態のセパロース４　 Ｂ　（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　１０　ｇを硝子濾過器に移した後、これを１０ ０ｍ１の３０％、６０％、８０％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液及び１００％無水ア セトンで順次に洗滌する。洗滌したセファロース４Ｂゲルを磁石棒で撹拌しなが ら３Ｑｍｌの無水アセトンと１５０μｌのトレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ　ｃ ｈｌｏｒｉｄｅ）　（Ｆｕｌｋａ　、４Ｇ、　Ｂｕｃｈｓ、スイス）が入ってい る乾燥したビーカーに入れる。ビーカーを室温で１０分間放置した後、全体の混 合物を再び硝子濾過器に移した後、５０−ＭＨＣＬに溶解したアセトンの７０％ 、５０％及び３０％（Ｖ／Ｖ）溶液で洗滌し、最後に１ｍＭ　ＨＣＬで洗滌する 。得られた生成物を４℃で貯蔵するか、又はアセトンで処理した後、乾燥させて 室温で保管する。このようにして得た支持体は乾燥ゲル剤１ｇ当たり約４５０μ モルの酵素を支持することができる。

Ｕ）　ノイラミニダーゼとトレシル化支持体の結合ノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍ、）１ｍｌ（０，４ｍｇ／＋ａｌ）をＮＡＰＴＭ−１０カラム（フ ァルマンア）を通過させた後、１５ｍｌの０．２Ｍ燐酸ナトリウム−０，５ＭＮ ａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解させて（Ａ２ａｏ＝０．５３４）、ここに１ ｇの活性化されたトレシル−セファローズ４Ｂを加える。混合物を４℃で１６時 間ゆるやかに振蕩して１．　５ｍｌの０．５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）を加 える。全体の混合物を４℃で５時間放置して、反応を終了させる。得られたゲル を０．１．Ｍ燐酸ナトリウム−０，１５Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ５，５）で洗滌して ノイラミニダーゼ−セファロース４Ｂを得て、これを４℃で保管する（Ａｚａ。

＝０．４５）（緩衝液中のノイラミニダーゼ収率・ＯＤ　０．０８４１０Ｄ　０ ．５３４＝０．０６４ｍｇ１０４ｍｇ＝１６％）。

伍）アンアロα１−酸糖蛋白の製造 ０．１５Ｍ　ＮａＣ１−０，１Ｍナトリウムアセテート緩衝液（ｐＨ５，５）２ ５ｍｌにＣ１−酸糖蛋白２５０ｍｇを溶解させて得た溶液を同一の緩衝液２ｍｌ に２００＋ｇのノイラミニダーゼ−セファロース４Ｂを溶解させた溶液と混合さ せる。該混合物を３７℃に一晩反応させる。

溶出液を得てチオバルビッル酸分析法（ウォレン　し、二ンアル酸のチオバルビ ッル酸の測定、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー、２３４：１ ９７１−１９７５　（１９５９））によって脱シアリル化の反応の効率を測定す る。

即ち、ノイラミニダーゼ−セファ０−ス４Ｂで処理されたＣ１−酸糖蛋白溶液（ １０口ｇ／ｍｌ）１ｍｌをＮＡＰ”−１０カラムで処理して塩を除去した後、溶 出液ｌｌ１ｌにＩＮ　Ｈ２Ｓ０４５０μＩを加えて、混合物を振蕩し８０℃で１ 時間培養した後冷却させることによってノイラミニダーゼ処理後にもシアル酸基 を保有しているα、−酸糖蛋白からシアル酸基を除去する。試料０．　２ｍｌと 過ヨード酸塩０．　１１１１を良く混合し、混合物を２０分間放置した後、亜砒 酸塩１．０＋１を加えて黄褐色の色調が無くなるまで振蕩する。この溶液にチオ バルビッル酸３＋ａｌを加えて１５分間沸かし、次いで５分間氷水で冷却して、 この中２＋ａｌを取って２＋１＋１のンクロヘキサノンと混合する。混合物を３ 分間遠心分離した後、赤い色土層液の吸光度を波長５４９ＮＭで測定する。対照 群α、−酸糖蛋白の吸収率はｏ、ｏｏｓ、試料アシアロ−α菫−酸糖蛋白の吸収 率は０．１１８であるので純粋なシアル酸の吸収率０．１１０（０，１ｉ８−０ ．００８）Ｏ，Ｄ、である。シアル酸の分子吸光係数は５７０００であり、遊離 したシアル酸の量（μｍｏｌ　）は次の方程式からめることができる。

＝０．　０７５　ｘ　Ｏ，Ｄ、　ｓａｗここで、■はチオバルビッル酸の量を表 し、Ｘ１００Ｏはｍｌを１で換算するためのものであり、ＯＤ、は吸光度を意味 する。アシアロ糖蛋白で硫酸により；１ｍしたシアル酸の量は０．００８２５μ モル（０，０７５ＸＯ，１１０）である。α、−酸糖蛋白（Ｉ　ｌｌ１ｇ／ｅ１ 月１１にはシアル酸が０．３６９μモルが含まれでいるが、実験に使用されたα 、−酸糖蛋白量は２ＩＩ１ｇであったのでシアル酸の総量は０．　７３８μモル （＝０．３６９μモルＸ２ンでありノイラミニダーゼで遊離させたシアル酸の量 は０．７２９８μモル（＝０．７３８−０．００８２）であるしたがって、アシ アル化効率は０．７２９８１０．７３８Ｘ１００＝９９％である。

実施例２ α１−酸糖蛋白の代わりにフェツイン（ｆｅｔｕｉｎ）、セルロブラスミン（ｃ ｅｒｕｌｏｐｌａｓｗｉｎ）、ハプトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）、サ イログロブリンを使用し、実施例１と同一方法を利用して各々アンアロフェツイ ン、アジアロセルロブラスミン、アシアロハプトグロビン又はアンアログロブリ ンを製造した。

実施例３ アンアロαカー酸糖蛋白と組換えインターフェロンの抱合体（蛋白−（糖）Ｘ− ガラクトース−グルタルアルデヒド−インターフェロン）の製造抱合体の合成は バーロー（ｈａｒＬｏｗ）とレイン（１ａｎｅ）（１９８８）の単一工程方法を 利用して次の通り行う。＋１１−標識されたインターフェロン（１５０μｇ／ｍ ｌ）　１゜ＯｍｌをＮＡＰ”−１０カラムを使用して緩衝液０．５Ｍ燐酸ナトリ ウム、ｐＨ７゜５をＯ，１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６，８に変える。得られた溶 液を小さい磁石棒を入れたチューブに移し、ここに１００μｍ（０，６ｍｇ）の アシアロα２−酸糖蛋白を加える。フード内でチューブの混合溶液を撹拌しなが ら１００μｍの１％グルタルアルデヒドを約１分間にわたつて滴下する。全体混 合物を室温で３時間培養した後１００μｌの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ７，２ ）を加える。その上混合物を再び室温で１時間培養し、セファロース１２カラム を利用して、液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）で分離し、２１４ｎｍで二個の 分画を得る。最初に１３１Ｔ−標識されたインターフェロンの同位元素量は８６ １μＣｉであり、第１の分画の同位元素量は６μＣ１１第２の分画は６μＣｉで ある。

電気泳動をすれば三つのバンドを得ることが出来る。重合した抱合体を示す７０ ｋｄ以上の濃度が薄くて幅が広いバンドと６７ｋｄの抱合体バンド、４１ｋｄの 反応後、残余のアシアロ糖蛋白バンドを確認することができる。この電気泳動後 のゲルを自家放射記録して二つのバンド、即ち７０ｋｄ以上の重合抱合体の濃く て広いバンドと６７ｋｄの抱合体バンドを確認することができる。本実験で家兎 に使用したアシアロ糖蛋白と１３１１−標識されたインターフェロンの抱合体は ＦＰＬＣで分離された６７ｋｄの最初の分画に該当する。

実施例４ アシアロα１−酸糖蛋白の代わりにアシアロフェツイン、アジアロセルロプラス ミン、アシアロハプトグロビン又はアシアログロブリンを使用し、実施例３に記 述された方法で実施して上記アシアロ糖蛋白血漿蛋白質とインターフェロンとを 製造する。

実験例 アンアロα１−酸糖蛋白の組織特異性を確認して本発明の抱合インターフェロン の肝細胞選択能を比較するために次のような動物実験を実施した。

イ　比較実験用試料の製造 フランカー（Ｆ　ｒａｎｋｅｒ）及びスペック（Ｓ　ｐｅｃｋ）の方法（バイオ ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシュン、８０：８４９− ８５７）によってインターフェロン、牛血清アルブミン及びアンアロα１−酸糖 蛋白をヨード化して次のような比活性を持つ放射線ヨード化された（ＩＩＩ■） 自然度インターフェロン、牛血清アルブミン及びアンアロα１−酸糖蛋白を製造 して動物実験試料として使用した。

０　ヨード化されたインターフェロンの比活性３５９μＣｉ／１５μｇ＝２３． ９μＣｉ／μｇＯヨード化された牛血清アルブミンの比活性：４００μＣｉ／３ ０μｇ＝１３．３μＣｉ／μｇＯヨード化されたアンアロαカー酸糖蛋白の比活 性・■６０７μＣｉ／６０μｇ＝２６．８μＣｉ／μｇ口　実験方法及び結果 実験１．アノアロα１−酸糖蛋白の組織特異性実験体重１６５〜２．　０ｋｇの 家兎を全身麻酔して耳の静脈を通じてＮｌ　１−標識ヨード化牛血清アルブミン 又はヨード化アンアロα１−酸糖蛋白を投入して映像コンピューターによって設 定された検討区間を５秒毎にガンマカメラによって撮影できるようｌこし、各臓 器での放射能を測定した。カメラは高解像コルリメーター（Ｃｏｌｌｉｍａｔｏ ｒ）が装置されたオハイオニュクリア（Ｏｈｉｏ　Ｎｕｃｌｅａｒ　ＴＭ）４１ ０ガンマカメラを使用し、写真は５分毎に写して３０分間６枚の写真を得た。そ の結果、得られた映像写真は第５図の通りである。第５図の上部パネル（Ｐａｎ ｎｅｌ）の映像写真は１３１１−生血清アルブミンに比べて＋３１１−アシアロ 引−酸糖蛋白が肝に更に特異的に摂取されるのを示しており、第５図の下部パネ ルで上部ラインは針内の放射能値、下部ラインは心臓、即ち、血中放射能値を示 している。このグラフよりアシアロα１−酸糖蛋白が肝に特異的に摂取されるこ とが証明できる。

実験２．インターフェロンと本発明の抱合インターフェロンとの肝細胞選択能比 較実験 上記実験１と同様の方法でＤＩ　Ｉ−インターフェロンと＋３１１−インターフ ェロン−アシアロα１−酸糖蛋白抱合体とを家兎の耳静脈に投入して針内での放 射能を比較測定するために３０万カウントずつを３０分毎に写して３時間に６枚 の写真を撮影した。その結果、得られた映像写真は第６図の通りである。第６図 のガンマカメラ映像においてインターフェロンは３０分迄は主に肝に残留してい るが、その後は、腎臓を通じて膀胱へ排泄されていることがわかる。尚、注射し た後３時間後にインターフェロンは針内には殆ど存在せず、王に膀胱のみに存在 することが確認できた。しかし、アシアロα１−酸糖蛋白−インターフェロン抱 合体の場合には３０分、２時間、３時間が経過しても針内に残留しており、膀胱 内でのその存在は観察できなかった。

第６図の下部パネル等を比較して見れば、インターフェロンにおいて最上線であ る針内の放射能、中間線である血中放射能値が３０分内に漸次減少を示しながら 下段線である膀胱内の放射能値が増加することを示しているが、アシアロα１− 酸糖蛋白抱合体の場合には針内の放射能値が持続的に維持されながら膀胱の放射 能値の増加は観察されない。

上記のような実験より本発明のインターフェロン抱合体は自然インターフェロン に比べて狂的滞留時間が顕著に長いということが確認できる。

実験３・インターフェロンと本発明の抱合インターフェロンとの組織内吸収分布 比較 上記実験２を終えた後、家兎をと殺して肝、腎臓、肺、膵臓、心臓及び甲状腺を 摘出して各臓器に分布している放射能を測定することによって各臓器に分布して いるインターフェロンの量を計算した。その計算結果を図表で示すと第７図の通 りである。

以上の実験から本発明のインターフェロン抱合体は既存のインターフェロンに比 べて肝浸透力が強く、かつ顕著に長時間狂的に残留するので、薬効が長時間持続 することがわかる。

製剤例１ 塩化ナトリウム　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・E・・・・・・・・ ・・８．　０ｍｇ 二塩二塩基酸燐酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・川・・・・・・ ・・・・川・凹曲・・・・・・・・・・１．７４■ｇ−塩基性燐酸カリウム　・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・E・・・・０．　２１ｇ 塩化カリウム　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・　・・・・・・・・・・・・・・・・E・・・・・・・・ ０．　２＋ｏｇ フエノル　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・E・・・・・・・・ ・・・・・３．３ａ＋ｇアルブミン（ひと）　・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・E１．ｏｍｇ 上紀成分等を溶液を形成させるに充分な滅菌蒸留水に溶解させ、生成された溶液 を１ｍｌの滅菌バイアルに充填させて２℃〜１０℃で保管する。

本　インターフェロン活性の国際単位 製剤例２乃至４ 製剤例１において使用されたアジアロオロソムコイドーα−インターフェロン抱 合体代わりにアンアロフェツイン−インターフェロン抱合体５００．０００１゜ Ｕ　１アノアロセルロブラスミン一インターフエロン抱合体６００．０００１゜ Ｕ　又はアシアロハプトグロビン−インターフェロン抱合体１．０００．０Ｏ０ １゜Ｕ　を使用し製剤例１で使用したものと同一の保存剤、緩衝剤、安定化剤を 混合させる。混合物を注射用滅菌蒸留水に溶解させ、溶液を１ｍｌ注射用滅菌バ イアルに充填させ、製剤例１のように貯蔵する。

製剤例５ ア／アロオロソムコイドーβ−インターフェロン抱合体　・・・１．０００．０ ＯＯ１，１１゜塩化ナトリウム　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・E・ ・・・・・・・・・９．　０ｍｇ アルブミン（ひと）　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・E・・・・・・５． 　０ｍｇ フェノル　−−−−−−−−−３，０ｍｇ上記成分等を溶液の調製に充分な注射 用滅菌蒸留水に溶解させ、生成した溶液を滅菌バイアル（１ｍｌ）充填させて２ ℃〜１０℃で保管する。

製剤例６ 上記製剤例５でアジアロオロソムコイドーβ−インターフェロン抱合体の代わり にアンアロオロソムコイドーγ−インターフェロン抱合体５００．０００１゜Ｕ 、を使用し、同一の補助剤を混合して、生成された溶液を注射用滅菌バイアルに 充填させる。

上記製剤例において製造された組成物等は静脈内注射に適合する。

本発明には前述した内容等だけでなく添イ」シた請求の範囲に記述されている内 容も含まれる。本発明はある程度具体的に望ましい例について記述したが７．望 ましい例に対する本記述内容は単に例示されたものであり、本発明の意義及び範 躊を脱しない構成の範囲を逸脱しない範囲で、細部においての多数の変形及び部 分の組合及び修飾が可能であることが理解されなければならない。

分 注射後経過時間（分） ６７０００−一臨一− Ａ：　蛋白分子量のためのマーカー Ｂ：　α１−酸糖蛋白 Ｃ：　アシアロ糖蛋白 、−０： Ａ：電気泳動ゲルのオートラジオグラフィー。

Ｂ　：　１３１１−ＩＮＦ−ＡＳＧＰ抱合体抱合体量白分子量のためのマーカー ＦＩＧ、５ １３１１ｆｓｓＡ１３１ｘ−Ａｓｃｐ ５分　１０分　５分　１０分 ２０分　３０分　２０分・　３０分 ＦＩＧ、６ １３１エーエＮｒ　”Ｉ−ＩＮＦ−Ａｓ（Ｊ３０　分　２時間　３時間　３０分 　２時間　３時間注射後経過時間 手続補正書 平成　５年　２月１８日−

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．下記一般式（Ｉ）のアシアロ糖蛋白−抱合薬剤。 Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−Ｒ（Ｉ）［式中、 Ｐはひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓはひと血清糖蛋白の糖残基であり 、 Ｇａｌはガラクトース残基を示し、 ＧＡはグルタルアルデヒド残基を示し、ｘは１又はそれ以上の定数を示し、 Ｒはインターフェロン、ナトリウムアサイクロビル、リバビリン、ビダラビン、 ジドブヂン、スラミン、アンチ−センスオリゴヌクレオレオチド、リボザイム、 カルシウムロイコポリン、ナトリウム−メグルミンディアトリゾエート、ガドリ ニュム−ＤＴＰＡ、グルタチオン、ブロスタグランディン、９９ｍＴｃ及び１３ １Ｉからなる群からえらばれる医薬成分である。］
2. ２．次の一般式（Ｉ）を有する、請求項１記載のアシアロ糖蛋白−抱合薬剤。 Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−ＩＮＦ（Ｉ）［式中、 Ｐはひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓはひと血清糖蛋白の糖残基であり 、 Ｇａｌはガラクトース残基であり、 ＧＡはグルタルアルデヒド残基であり、Ｘは１又はそれ以上の定数であり、 ＩＮＦはインターフェロンを示す。］
3. ３．ＩＮＦがα−インターフェロンである、請求項２記載の抱合薬剤。
4. ４．ＩＮＦがβ−インターフェロンである、請求項２記載の抱合薬剤。
5. ５．ＩＮＦがγ−インターフェロンである、請求項２記載の抱合薬剤。
6. ６．Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−（式中、Ｐはひと血清糖蛋白のペプチド残基であり 、Ｓはひと血清糖蛋白の糖残基であり、ＧａｌはＤ−ガラクトースである）が脱 シアル化されたひと血清糖蛋白の残基である、請求項２記載の抱合薬剤。
7. ７．脱シアル化されたひと血清糖蛋白がアシアロオロソムコイド、アシアロフェ ツイン、アシアロプラスミン、アシアロハプトグロブリン、アシアログロブリン 及びアシアロマクログロブリンからなる群から選ばれる、請求項６記載の抱合薬 剤。
8. ８．ＩＮＦが組換えインターフェロンである、請求項２記載の抱合薬剤。
9. ９．ウィルス性肝炎患者の肝細胞内に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制させる に充分な量の請求項２記載の一般式（Ｉ）を有する抱合インターフェロン及び製 薬学的に許容される担体、補助剤又は賦型剤を含む肝炎治療用医薬組成物。
10. １０．静脈内投与に適する、請求項９記載の医薬組成物。
11. １１．ウィルス性肝炎患者にその肝細胞内に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制 させるに充分な量の請求項２記載の一般式（Ｉ）を有する抱合インターフェロン を投与して、ウィルス性肝炎患者におけるウィルス性肝炎を治療する方法。
12. １２．抱合インターフェロンが静脈内投与によって投与される、請求項１１記載 の方法。
13. １３．ウィルス性肝炎患者の肝細胞内に存在する肝炎ウィルスの増殖を抑制させ るに充分な請求項２記載の一般式（Ｉ）を有する抱合インターフェロンの量がイ ンターフェロンを基準にして１または２日に一回、体表面積ｍ２当たり２０〜２ ００百万Ｉ．Ｕ．である、請求項１２記載の方法。
14. １４．ひと血清のコーン分画Ｖ上清液を用い；ひと血清のコーン分画Ｖ上清液か ら一般式蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡの構造を有するａ１−酸糖蛋白を 分離して回収し；α１−酸糖蛋白をノイラミニダーゼで処理することによってシ アル酸を除去し、アシアロ糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ）を得；得られた アシアロ糖蛋白をグルタルアルデヒド（ＧＡ）交差結合方法によって、インター フェロンと結合させ； 生成した下記一般式（Ｉ）の構造を有する抱合インターフェロンを回収すること を特徴とする、一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンの製造方法。 Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−ＩＮＦ（Ｉ）［式中、 Ｐはひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓはひと血清糖蛋白の糖残基であり 、 Ｇａｌはガラクトース残基であり、 ＧＡはグルタルアルデヒド残基であり、ｘは１又はそれ以上の定数であり、 ＩＮＦはインターフェロンを示す。〕
15. １５．ひと血清のコーン分画Ｖ上清液を通常の方法にてＤＥＡＥ−セファデクス 又はＣＭ−セルローズクロマトグラフィーにより処理し、コーン分画Ｖ上清液か ら一般式蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡの構造を有するα１−酸糖蛋白を 分離するものである、請求項１４記載の方法。
16. １６．α１−酸糖蛋白がオロソムコイドである、請求項１４記載の方法。
17. １７．糖部分の末端から二番目の残基がＤ−ガラクトース（Ｇａｌ）であり、末 端残基がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である、一般式蛋白質−（糖） ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡの構造を有するひと血清糖蛋白を含むひと血清を用い；ひ と血清を処理してそれよりひと血清糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮ Ａ）を分離させて回収し； 得られた糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡ）をノイラミニダーゼで 処理してＮＡＮＡを除去することによってアシアロ糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ− Ｇａｌ）を得； 生成したアシアロ糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ）をグルタルアルデヒド（ ＧＡ）交差結合方法によりインターフェロンと結合させ；生成した一般式（Ｉ） の抱合インターフェロンを回収することを特徴とする一般式（Ｉ）の抱合インタ ーフェロンの製造方法。 Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ−ＧＡ−ＩＮＦ（Ｉ）［式中、 Ｐはひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓはひと血清糖蛋白の糖残基であり 、 Ｇａｌはガラクトース残基であり、 ＧＡはグルタルアルデヒド残基であり、Ｘは１又はそれ以上の定数であり、 ＩＮＦはインターフェロンを示す。］
18. １８．ひと血清がひと血清のコーン分画Ｖ上清液であり、これを通常の方法でＤ ＥＡＥ−セファデクス又はＣＭ−セルローズクロマトグラフィーによって処理し 、コーン分画Ｖ上清液から一般式蛋白質−（糖）ｘ−Ｇａｌ−ＮＡＮＡの構造を 有するひと血清糖蛋白を分離させる、請求項１７記載の方法。