JPH01102099A

JPH01102099A - 生理活性を有する糖タンパク質

Info

Publication number: JPH01102099A
Application number: JP62258575A
Authority: JP
Inventors: Yuichiro Sato; 雄一郎佐藤; Jun Uchiumi; 潤内海; Yasuhiro Kagawa; 香川　康浩
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1987-10-14
Filing date: 1987-10-14
Publication date: 1989-04-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、医薬あるいは診断薬として利用し得る生理活
性を有する糖タンパク質に関する。

［従来の技術］近年、生体由来の生理活性を有する糖タンパク質を医薬
あるいは診断薬として利用する試みがなされている。こ
の対象となる糖タンパク質を生産する手段としては、該
糖タンパク質を有する組織からの抽出の他、該糖タンパ
ク質を産生ずる細胞の大量培養、あるいは該糖タンパク
質の遺伝子操作による組換え型タンパク質の大量生産な
どが挙げられる。しかしながら、得られた糖タンパク質
の同一性として、アミノ酸組成分析に代表されるように
、そのポリペプチド部分によってその生理活性成分とし
て特徴づけることが一般に行われており、その生理活性
発現の重要要素としてその糖鎖構造を特徴づける報告は
見当たらない。しかし、最近、糖タンパク質の生理活性
発現上、糖鎖が重要な役割を果たしていることが明らか
にされつつあり、それらは、たとえばタンパク質の安定
化、代謝におけるシグナル作用、細胞内局所のシグナル
作用およびレセプターや標的細胞に対する認識としての
シグナル作用などである（たとえば、高崎域−１細胞工
学、Ｖｏｌ、５．　ｐ４２７．１９８６．秀潤社）。

このように、糖タンパク質を医薬あるいは診断薬として
有効かつ特異的に利用するためには、糖鎖構造を目的に
そって規定する要件も重要となってくる。

すなわち、糖鎖構造を修飾することにより、生理活性糖
タンパク質の医薬あるいは診断薬利用の際に問題となる
、該糖タンパク質の血中安定性を高めることや、シグナ
ル作用を強調して標的細胞あるいは標的臓器への取込み
を促進させること、また、本来−付与された生理活性を
増大させることなどを解決し、さらには新たな生理活性
の付与なども期待することができる。

［発明が解決しようとする問題点］上記の問題点のうち、標的臓器としての肝とガラクトー
スとの親和性が報告されている（Ｋａｗａｓａｋｌ、　
Ｔ　＆　Ａｓｈｗｅｌｌ、Ｇ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　
Ｃｈｅｗ、、　２５１．１２９６．１９７６およびＬｅ
ｅ、Ｙ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｔｔｈ、。

２５８、１９９．１９８３　）。すなわち、肝実質細胞
にはガラクトース結合性タンパク質が存在するために、
ガラクトース残基が多いほど肝に親和性があるという知
見である。この知見から類推すれば、肝腫瘍、肝硬変、
肝炎などの肝疾患に有効な生理活性糖タンパク質の糖鎖
のガラクトース含量を増加させることによって、より効
果的に肝への該糖タンパク質の取込みを増大させ、治療
効果を高めることができる。しかしながら、本効果はも
とより、ガラクトース修飾による糖タンパク質の肝への
取込み、あるいは移行性、体内分布などを指標として検
討した例は未だなく、この件に関する糖タンパク質の医
薬あるいは診断薬利用の際の問題点は何ら解決されてい
ない。

本発明は、医薬あるいは診断薬の可能性のある生理活性
を有する糖タンパク質の糖鎖を修飾することにより、上
記の問題点を解決することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］上記目的は以下の本発明により達成される。すなわち本
発明は、少なくとも１つの末端にガラクトース・ガラク
トースの結合を有する糖鎖が全糖鎖の２０％以上である
ことを特徴とする生理活性を有する糖タンパク質である
。

本発明の糖タンパク質は生理活性を有するものであれば
特に限定されないが、インターフェロン、特にヒト・イ
ンターフェロンβが好ましい。

本発明は、１本の糖鎖中の少なくとも１つの末端にガラ
クトース・ガラクトースの結合を有する糖鎖の数が、全
糖鎖の２０％以上、好ましくは３０％以上である糖タン
パク質であり、ここで末端にガラクトース・ガラクトー
スの結合を有するとは、ガラクトースが２個以上連結し
た結合を末端に含んでいることを意味する。−たとえば
、インターフェロンβ（以下、ＩＦＮ−βト略ス）の場
合は、ＩＦＮ−β１分子に糖鎖が１氷結合しているので
、少なくとも１つの末端にガラクトース−ガラクトース
の結合を有する糖鎖を有するＩ　ＦＮ−β分子がＩＦＮ
を構成する分子のうち２０％以上存在しているというこ
とを意味する。

ガラクトース・ガラクトースの結合を有する糖鎖はヒド
ラジン分解法（続生化学実験講座、第４巻、１４２頁）
により分析する。

本発明の糖タンパク質の糖鎖指標はいかなるものでも良
いが、たとえば、複合型アスパラギン結合型糖鎖、混成
型アスパラギン結合型糖鎖およびムチン型糖鎖などが挙
げられる。

本発明の糖タンパク質を得る方法はいかなるものでも良
いが、たとえば、末端にガラクトース・ガラクトースの
結合を有する糖鎖が全糖鎖の２０％以上である糖タンパ
ク質を生産する能力のある細胞により生産する方法、あ
るいは既存の糖タンパク質の糖鎖に化学合成的に修飾す
る方法などが挙げられる。

細胞による生産では、該糖タンパク質を自然生産する真
該細胞、あるいはマイト−ジエン、発ガンプロモーター
、レクチン、リボ多糖鎖、カルシウムイオノフオアなど
の刺激によって該糖タンパク質を産生ずる真該細胞など
が用いられる。化学合成的に修飾する場合には、糖鎖の
非還元末端にさらに単糖あるいはオリゴ糖を還元的に結
合させることで行われる。

また、遺伝子操作によって、適当な真該細胞に該糖タン
パク質の構造遺伝子に組込んで発現させることによって
も得られる。遺伝子操作による手法は、本発明の糖タン
パク質を製造する方法として好ましい手法である。具体
的には例えば、ＳＶ４０ベクター／サルＣＯＳ細胞系、
ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）ベクター／ハムスタ
ーＣＨＯ細胞系、ＢＰＶ　（牛パピローマウィルス）ベ
クター／マウスＣ１２７細胞系、ＭＭＴｖ（マウス乳ガ
ンウィルス）ベクター／ヒトＰＣ１２細胞系あるいはＭ
ＭＴＶベクター／ヒトＰＣ８細胞系などの発現ベクター
／宿主細胞系を用いて、遺伝子組換え型糖タンパク質と
して得ることができる。

本発明では宿主としてマウスＣ１２７を用いるのが特に
好ましい。

本発明のガラクトース修飾糖タンパク質は、肝腫瘍、肝
硬変、肝炎など肝疾患に有効な生理活性を有する糖タン
パク質を、医薬あるいは診断薬として用いるときに利用
することができる。すなわち、ガラクトースに親和性を
もつ肝実質細胞の特性を利用して、該糖タンパク質を選
択的かつ効果的に肝組織に到達させ、治療効果あるいは
診断効果を高めることができる。

本発明のガラクトース修飾鎖タンパク質は、精製後、タ
ンパク質製剤としてそのまま粉末として、また薬理学的
に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成
物（例、注射薬、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）とし
て、ヒトなどの温血動物に対して非経口的あるいは経口
的に安全に投与することができる。このように、本ガラ
スドース修飾糖タンパク質はこれまで有効な剤型、投与
法が少なかった当該分野に、新規で有用な薬剤として提
供することができる。

［実　施　例］以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ヒト・インターフェロンβ１の構造遺伝子をＢｐｖベク
ター（Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　ＳＣｉ、、　ｔｌｓ＾、　８１　５０８６
　（１９８４）　　：］に組込み、マウスＣ１２７細胞
（前記と同誌）に感染させた。

この組換えＣ１２７，ｍ胞を培養すると、３７℃、３日
間で、培養上清上に約２０，０００単位／　ｍｌのヒト
・インターフェロンβ１　（Ｃ１２７−ＩＦＮ−β１）
が構成的に産生された。この培養上清４２．１！を集め
、２０ｍ１’“ブルーセファ−ロース′。

（ファルマシア社）にかけ、１Ｍ塩化ナトリウムと３０
％エチレングリコール（ＥＧ）を含むリン酸緩衝液（ｐ
ｔ１７　、４　＞　２００ｍｌでカラムを洗浄した後、
１Ｍ塩化ナトリウムと６０％ＥＧを含むリン酸緩衝液（
ｐＨ７、４＞　４０ｍｌ’？：’ＰＣ８−Ｉ　Ｆ　Ｎ−
β１を溶出した。次にＣ１２７−ＩＦＮ−β１両分を４
ｍｌ抗ヒトＩＦＮ−β１抗体（ＹＳＢ−１”）カラムに
かけ、１５ｍＭ塩酸（ｐＨ２，ｏ＞　１２ｍ１で溶出し
た。さらに、この塩酸溶出画分を“’　ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ　　５Ｃ１８−３００カラム”　　（８Ｘ２５Ｏｎｏ
ｎ、牛丼化学）にかけ、０．１％トリフルオロ酢酸（ｐ
Ｈ２，０＞存在下、０〜７０％アセトニトリルの濃度匂
配によりタンパク質を溶出した。Ｃ１２７−ＩＦＮ−β
１は約５０％アセトニトリル濃度で２．９ｍｌで溶出さ
れた。精製されたＣ１２７−ＩＦＮ−β１は５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分子量２３゜０００のほぼ均一なバンドとして
検出された。精製されたＣ１２７−ＩＦＮ−β１のアミ
ノ酸組成、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸配列、またペプ
チドマツプは、ヒト線維芽細胞が産生ずる天然型ＩＦＮ
−β１のそれらと同一であったことから、Ｃ１２７−Ｉ
ＦＮ−β１のポリペプチド部分は天然型ＩＦＮ−β１の
それと同一である。

また、Ｃ１２７−ＩＦＮ−β１の糖鎖構造をヒドラジン
分解法により分析したところ、少なくとも１つの末端に
ガラクトース・ガラクトースの結合を有する糖鎖が、全
糖鎖の３５％存在していた。

このＣ１２７−ＩＦＮ−β１を、すでにＩＦＮ−β１に
おいて、その臓器移行性から肝での代謝が推定された（
たとえば佐藤雄一部、化学療法の領域、Ｖｏｌ、３．　
ｐ７１．１９８７＞ウサギ、ラット等の動物に静脈注射
で投与したところ、゛その血中濃度はＣ１２７−ＩＦＮ
−β１は天然型ＩＦＮ−βに比べて３時間目で５０％低
く、また血中での半減期は約１．５倍短く、速やかに肝
等の臓器へ移行して代謝されたことが認められた。

［発明の効果］ガラクトース残基の多い本発明の糖タンパク質は、肝組
織への取込みが速いため、本来肝疾患に有効な生理活性
糖タンパク質の治療効果および診断効果を高めることが
できる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも１つの末端にガラクトース・ガラクト
ースの結合を有する糖鎖が全糖鎖の２０％以上であるこ
とを特徴とする生理活性を有する糖タンパク質。