CZ301833B6

CZ301833B6 - Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ301833B6
Application number: CZ20014682A
Authority: CZ
Inventors: Burg@Josef; Hilger@Bernd; Josel@Hans-Peter
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2010-07-07
Also published as: TR200103782T2; KR100510624B1; AU768452B2; PE20010288A1; CN1359392A; PT1196443E; TWI266637B; AU6429900A; KR20020026514A; HK1047597B; GC0000196A; HU228478B1; NZ516170A; DK1196443T3; NO20016304L; EP1196443A2; CA2378533A1; MXPA01012974A; RS50117B; ES2220501T3

Abstract

Konjugát obsahující erytropoetinový (EPO) glykoprotein mající alespon jednu volnou aminoskupinu a zvyšující produkci retikulocytu a erytrocytu bunkami kostní drene, kde EPO glykoprotein je vybrán z lidského EPO a jeho analogu, které mají primární strukturu lidského EPO modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylacních míst nebo prestavbou alespon jednoho glykosylacního místa; jež spocívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-pripojeným sacharidem v lidském EPO a adici místa s N-pripojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského EPO; kde uvedený glykoprotein je kovalentne navázán na jednu až tri (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkoxy poly(ethylenglykolové) skupiny, z nichž každá je kovalentne pripojena ke glykoproteinu pres spojovník -C(O)-X-S-Y-, kde C(O) spojovníku tvorí amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin, X je -(CH.sub.2.n.).sub.k.n.- nebo -CH.sub.2.n.(O-CH.sub.2.n.-CH.sub.2.n.).sub.k.n.-, k je císlo od 1 do 10, Y je skupina vzorce i, ii, iii nebo iv, prumerná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je 20 až 40 kDa, a molekulová hmotnost konjugátu je 51 až 175 kDa. Zpusob jeho prípravy a lécivo pro lécení anemie s jeho obsahem.

Description

Konjugát erytropoetinu s polyethylenglykolem, způsob jeho přípravy a léčivo pro léčení anemie s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynalez se týká konjugátu erytropoetinu s polyethylenglykolem, způsobu jeho přípravy a kompozic a léčiv pro léčení onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.

to

Dosavadní stav techniky

Erythropoesa je produkce erytrocytů, která probíhá za účelem náhrady destruovaných buněk. i5 Erythropoesa je kontrolovaným fyziologickým mechanismem, který produkuje dostatek erytrocytů pro řádné okysličení tkání. Přirozený lidský erytropoetin (HEPO) je glykoprotein obsahující

165 aminokyselin, který je produkován ledvinách a který je humorálním plazmatíckým faktorem, který stimuluje produkci erytrocytů (Camot, P. a Deflandre, C, (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser,

E, Freid, W a Plazak, LF (1957) Nátuře 179: 6331-4). Lidský EPO stimuluje dělení a diferenciací erytroidních progenitorů v kostní dřeni. Lidský EPO projevuje svou biologickou aktivitu vazbou na receptory na erytroidních prekursorech (Kratz, BS (1991) Blod 77: 419). Přirozený lidský erytropoetin je acidícký glykoprotein přítomný v nízkých koncentracích v plazmě, který stimuluje nahrazování erytrocytů, které jsou zkráceny v důsledku stárnutí.

Erytropoetin byl vyroben synteticky za použití technologie re kombi nantní DNA (Egrie, JC, Strickland, TW, Lané, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) a je produktem íonovaného lidského EPO genu insertovaného do a exprimovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO buňkách), Přirozený lidský EPO je nejprve translatován na polypeptid obsahující 166 aminokyselin sargininem 166. Při postranslačních modifikacích je arginin 166 odštěpen karboxypeptidázou. Primární struktura lidského EPO (165 aa) je uvedena na obr. 1. Primární struktura lidského EPO (166 aa) je uvedena na obr. 2. Polypeptid obsahuje dva disulfidové můstky mezi Cys⁷-Cys'⁶¹ a Cys²⁹-Cys³³. Molekulová hmotnost polypeptidového řetězce lidského EPO bez sacharidových skupin je 18236 Da. V intaktní EPO molekule je přibližně 40 % moleku35 lové hmotnosti tvořeno karbohydrátovými skupinami (Sasaki, H,, Hothner, B, Dell, A a Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Jelikož je erytropoetin zásadní pro tvorbu erytrocytů, je hormon použitelný pro léčbu hematologických onemocnění charakterizován nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů. Klinicky je EPO používán například při léčbě anemie u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF) (Eschbach, 1W, Egri, IC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, 1W, Abdulhadi, MH, Browne, JK et aí. (1989) Ann. Intem. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intem. Med. 110:108-114) a u pacientů s AIDS a nádorovým onemocněním během chemoterapie (Danna, RP, Rudnick, SA, Abls, Rl, IN: MB, Gamick, Ed. Erytropoetin in Clinical Applications-An International Perspektivě. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: str. 301-324). Nicméně, biologická dostupnost současných proteinových terapeutik, jako je EPO, je omezená jejich krátkým plazmatíckým poločasem a citlivostí na degradací proteasami. Tyto nevýhody brání dosažení maximálního klinického účinku.

Podstata vynálezu

Proto se předpokládaný vynález týká nové třídy PEG derivátů EPO. Konkrétně je předmětem vynálezu konjugát obsahující erytropoetinový glykoprotein mající alespoň jednu vojnou amino-1 CZ 301833 B6 skupinu a vykazující in vivo biologickou aktivitu, kterou je zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů buňkami kostní dřeně, kde erytropoetinový glykoprotein je vybrán ze souboru sestávajícího z lidského erytropoetinu a jeho analogů, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst nebo přestavbu alespoň jednoho glyko5 sylačního místa, jež spočívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-připojeným sacharidem v lidském erytropoetinu a adici místa s N-připojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu; kde uvedený glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tři (CjC₆)alkoxy poly(ethylengiykolové) skupiny, přičemž každá póly (ethylenglykolová) skupina je kovalentně připojena ke glykoproteinu přes spojovací skupinu vzorce -C(O)-X-S-Y-, kde io zbytek C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených skupin,

X je 4CH₂)_k nebo -CH₂(O-CH₂-CH₂)_kk je číslo od 1 do 10,

Y je skupina vzorce

průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové skupiny) je od 20 do 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od 51 do 175 kilodaltonů.

Ve srovnání s nemodifikovaným EPO (tj,, EPO bez navázaného PEG) a běžnými PEG-EPO konjugáty, mají konjugáty podle předkládaného vynálezu delší cirkulační poločas a dobu setrvání v plazmě, nižší klírens a vyšší klinickou aktivitu in vivo. Konjugáty podle předkládaného vynálezu mají stejné použití jako EPO. Konkrétně, konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou použili tělně pro stimulaci dělení a diferenciace kmenových erytroidních progenitorů v kostní dřeni stejně jako EPO.

Předmětem vynálezu je také kompozice, která obsahuje konjugát podle vynálezu. Přednostně takové kompozice obsahuje konjugát s alespoň 90% nebo vyšším podílem konjugátu, v nichž n je číslo I.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutická kompozice, která obsahuje konjugát nebo kompozici vynálezu a farmaceuticky přijatelný excípient.

Předkládaný vynález také zahrnuje použití konjugátu nebo kompozice podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.

Konečně je předmětem vynálezu také způsob přípravy konjugátu nebo kompozice podle vynálezu, který zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoetinový glykoprotein a

-2CZ 301833 B6 kopulaci vzniklého aktivovaného erytropoetinového glykoproteinu s poly(ethylenglykolovým) (PEG) derivátem.

Pri tomto způsobu se konkrétně postupuje tak, že se a-aminoskupina lysinu erytropoetinového proteinu podrobí kovalentní reakci s bifunkčním činidlem za vzniku meziproduktu s amidovou vazbou. Použití bifunkční Činidlo obsahuje reaktivní skupinu a chráněno thiolovou skupinu. Meziprodukt vázaný na amid se potom podrobí kovalentní reakci s aktivovaným polyethylenglykolovým derivátem za vzniku erytropoetinového glykoproteinového produktu podle vynálezu.

io

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1: Primární struktura lidského EPO (165 aminokyselin).

Obr. 2: Primární struktura lidského EPO (166 aminokyselin).

Obr. 3: In vivo aktivita pegylovaného EPO určená testem na normocytemických myších. Následuje podrobný popis vynálezu.

Používané termíny mají významy definované dále.

Termín „erytropoetinový protein“, „erytropoietin“, „EPO“, nebo „erytropoetinový glykoprotein“ označuje glykoprotein mající sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO:2), nebo protein nebo polypeptid v podstatě homologní k uvedenému proteinu, jehož biologické vlastnosti souvisí se stimulací produkce erytrocytů a stimulací dělení a diferenciace kmenových erytroidních progenitorů v kostní dřeni. Termín „EPO protein“ zahrnuje takové proteiny libovolně modifikované, například místně cíleno mutagenezí nebo náhodnými mutacemi. Tyto termíny také zahrnují analogy obsahující od 1 do 6 dalších glykosylačních míst, analogy obsahující ales30 ροή jednu další aminokyselinu na karboxylovém konci proteinu, kde tato další ekvivalentní obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, a analogy obsahující sekvence, které obsahují přestavbu alespoň jednoho v Evropské patentové přihlášce a. 640619. Tyto termín zahrnují jak přirozený, tak rekombinantně produkovaný lidský erytropoetin,

Termín „v podstatě homologní“ označuje konkrétní sekvence, například mutantní sekvence, které se liší referenční sekvence jednou nebo více dalšími substitucemi, delecemi nebo adicemi, které nezpůsobují nežádoucí funkční odlišnosti od referenční sekvence. Pro účely předkládaného vynálezu jsou sekvence mající vyšší než 95% homologii, ekvivalentní biologické vlastnosti a ekvivalentní expresní charakteristiky považovány za v podstatě homologní. Pro stanovení homologie nesmí být zkrácení zralé sekvence bráno v úvahu. Sekvence mající menší stupně homologie, srovnatelnou bioaktivitu a ekvivalentní charakteristiky exprese jsou považovány za v podstatě ekvivalentní.

Termín „fragment“ EPO proteinu označuje jakýkoliv protein nebo póly peptide mající amino45 kyselinovou sekvenci části nebo fragmentu EPO proteinu, a biologickou aktivitu EPO. Fragmenty zahrnující proteiny nebo polypeptidy produkované proteolytickou degradací EPO proteinu nebo produkované chemickou syntézou způsobenou běžným v oboru. EPO protein nebo jeho fragment je biologicky aktivní, když podání proteinu nebo jeho fragmentu člověku vede ke stimulaci produkce erytrocytů a stimulaci dělení a diferenciace kmenových erytroidních proge50 nitorů v kostní dření. Stanovení takové biologické aktivity EPO proteinu může být provedeno běžnými, dobře zavedenými tedy používanými pro tento účel, které jsou prováděny na jednom nebo více druzích savců. Vhodný test, který může být použit pro stanovení biologické aktivity, je zde popsán.

-3CZ 301833 B6

Termín „terapeuticky účinné množství“ označuje množství erytropoetinového glykoproteinu nutné pro in vivo biologickou aktivitu spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a erytrocytů. Přesné množství erytropoetinového glykoproteinu závisí na faktorech jako je konkrétní léčení onemocnění, stav léčeného pacienta a složení prostředku. Farmaceutické prostředky obsahující erytropoetinový glykoprotein mohou být připraveny v síle účinné při podání různými způsoby lidskému jedinci s onemocněním krve charakterizovaným nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů. Průměrné terapeuticky účinné množství erytropoetinového glykoproteinového produktu může být různé a mělo by být určeno kvalifikovaným lékařem podle uvedených doporučení.

Předkládaný vynález se týká erytropoetinových glykoproteinových produktů majících biologickou aktivitu in vivo, která stimuluje buňky kostní dřeně v produkci retikulocytů a erytrocytů, které mají vzorec 1:

P-[NH^O-X-S-Y4OCH₂CH₃)_mOR]_n i, kde X a Y jsou stejné, jak jsou definovány výše, m je od 450 do 900, n je od 1 do 3, R je nižší alkyl a P je erytropoetinový glykoprotein bez amino skupiny nebo amino skupin, které tvoří amidovou vazbu s Y. Jak je podrobněji uvedeno dále, je příprava a přečištění EPO dobře známá v oboru. Termínem EPO je označován přirozený nebo rekombinantní protein, výhodně lidský, který' je získaný z jakéhokoliv zdroje, jako je tkáň, buněčná kultura pro syntézu proteinů s přirozenými nebo rekombinantními buňkami. Jakýkoliv protein mající aktivitu EPO, jako například mutein nebo jinak modifikovaný protein, spadá do tohoto rozsahu. Rekombinantní EPO může být připraven expresí v CHO-, BHK- nebo HeLa buněčných liniích, rekombinantní DNA techno25 logií nebo aktivace endogenních genů, tj. expresí erytropoetinového glykoproteinu po aktivaci endogenního genu. Výhodné druhy EPO pro přípravu erytropoeti n-glykoprote i nových produktů jsou lidské druhy EPO. Výhodněji jsou EPO lidské EPO mající aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo obr. 2 (SEQ ID NO: 2), a nejvýhodnější je lidský EPO mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: I).

Lidský erytropoetinový protein může být také modifikován tak, aby obsahoval alespoň jednou další místo pro glykosylaci, například 1 až 6 dalších glykosylačních míst, jak je tomu, například, v aminokyselinových sekvencích, uvedených dále. Výrazy uvedené dále znamenají, že sekvence uvedená na obr. 1 byla modifikována substitucí přirozené aminokyseliny v pozici označené číslem v horním indexu za aminokyselinu uvedenou vlevo od horního indexu.

Asn³⁰Thr³² Obr. 1;

Asn⁵¹Thr⁵³ Obr. 1;

-4CZ 301833 B6

Asn⁵⁷Thr⁵⁹ Obr.	1;
Asn⁶⁹ Obr. 1;
Asn⁶⁹Thr⁷¹ Obr.	, i;
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹	Obr. 1;
Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	Obr. 1;
Ser⁸¹Asn⁸⁸Thr^so	Obr. 1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁹⁰Thr⁹² Obr. 1, Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² Obr. 1 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹²Ala¹⁶² Obr. 1, Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ Obr. 1; Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ Obr. 1; Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr⁹¹ Obr. 1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁸Thr⁹¹ Obr. Asn¹³⁶Thr¹³⁸ Obr. 1; Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰ Obr. 1; Thr¹²² Obr. 1; a Pro¹²⁴Thr¹²⁵ Obr. 1.

1;

Lidský erytropoetinový protein může být také analog obsahující alespoň jednu další aminokyselinu na karboxylovém konci glykoproteinu, kde další aminokyselina obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, tj. glykoprotein má sekvenci obsahující sekvenci lidského erytropoetinu a druhou sekvenci na karboxylovém konci sekvence lidského erytropoetinu, kde druhá sekvence obsahuje alespoň jedno glykosylační místo.

Další aminokyselina může obsahovat peptidový fragment získaný z karboxylového konce lidského choriogonadotropinu. Výhodně je glykoprotein analog vybraný ze skupiny zahrnující (a) ío lidský erytropoetín mající aminokyselinovou sekvenci Ser Ser Ser Ser Lys Ala pro Pro Pro Ser

Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO:3), která je navázána na karboxylový konec; (b) analog podle (a) dále obsahující Ser Asn Thr EPO; a (c) analog podle (a) dále obsahující Asn³⁰ Thr³ Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Lidský erytropoetín protein může být také analog obsahující aminokyselinové sekvence, které mají přestavbu alespoň jednoho místa pro glykosylaci. Přestavba může obsahovat deleci jakéhokoliv N-vázaného uhlovodíkového místa v lidském erytropoetinu a adici N-vázaného uhlovodíkového místa v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu. Výhodně je glykoprotein analog vybrán ze skupiny zahrnující Gin²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gin³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰

EPO; a Gin⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸³ Th/° EPO.

Erytropoetinové analogy s dalšími glykosylačními místy jsou popsány v Evropské patentové přihlášce 640619, Elliot, publikované 1.3,1995, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.

Ve vzorci 1 může R znamenat jakékoliv nižší alkyl, to znamená lineární nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku, jako je methyl, ethyl, isopropyl atd. Výhodným alkylem je methyl.

-5CZ 301833 B6

Ve vzorci 1 X znamená 4CH₂\- nebo -CH₂(O-CH₂-CH2)i<- kde kje od 1 do přibližně 10. Výhodně je k od 1 do přibližně 4, výhodněji je k 1 nebo 2. Nej výhodněji je X - (CH₂).

Ve vzorci 1 Y znamená

Nejvýhodněji je Y

io Ve vzorci 1 je m vybrán tak, že výsledný konjugát vzorce I má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s EPO, kde tato aktivita může být stejná, větší nebo menší než aktivita nemodifikovaného EPO. m. označuje počet ethylenoxidovýcb zbytků v PEG jednotce. Jedna PEG podjednotka -(CH₂CH₂)- má molekulovou hmotnost přibližně 44 daltonů. Proto závisí molekulová hmotnost konjugátu (bez molekulové hmotnosti EPO) na číslu m. Molekulová hmotnost „přibližná“ určitému číslu znamená, že je v rozumném rozmezí od daného čísla, jak je určeno běžnými analytickými technikami, m je celé číslo v rozmezí od přibližně 450 do přibližně 900 (což odpovídá molekulové hmotnosti od 20 do 40 kDa) výhodně je m od přibližně 550 do přibližně 800 (přibližně 24 až 35 kDa), a nejvýhodněji je m od přibližně 650 do přibližně 700 (přibližně 29 až přibližně 31 kDa).

Ve vzorci 1 je číslo n počet amino-skupin lysínů v erytropoetinovém proteinu kovalentně navázaných na PEG jednotku amidovou vazbou. Konjugát podle předkládaného vynálezu může obsahovat jednu, dvě nebo tři PEG jednotky na molekulu EPO. n je celé číslo od 1 do 3, výhodně je n 1 nebo 2, a ještě lépe je n“l.

-6CZ 3U1833 B6

Výhodné erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:

-H

Y^x's 0

OR ar

>

kde P, R, X, m a n jsou stejné, jak jsou definovány výše.

Nej výhodnější erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:

O

H

kde P, R, X, M a n jsou stejné, jak jsou definovány výše.

Další výhodné erytropoetin-glykoproteinové produkty mají vzorec:

kde Pje na jsou stejné, jak jsou definovány výše.

Výhodné sloučeniny jsou ty, kde X znamená -(ίΤ-ύΧ-, zejména ty, kde k je od 1 do 4, nejvýhodněji ty, kde X je -CH2-.

Vynález také zahrnuje konjugáty, kde m je celé číslo do 550 do 800, výhodně je m celé číslo od 650 do 700.

-7CZ 301833 B6

Výhodné sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou ty, kde n je 1 a/nebo Rje methyl.

Dále se předkládaný vynález týká výše uvedených sloučenin, kde průměrná molekulová hmot5 nost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od přibližně 24 kilodaltonů do přibližně 35 kilodaltonů, výhodněji od přibližně 30 kilodaltonů.

Dále se předkládaný vynález týká výše uvedených sloučenin, kde glykoprotein je kovalentně navázán na jednu nebo dvě poly(ethylenglykolové skupiny) s navázanou nižší alkoxy skupinou, io výhodněji na jednu poly(ethylenglykolovou) skupinu s navázanou nižší alkoxy skupinou.

Ve výhodném provedení jsou poly(ethylenglykolové) skupiny navázané na methoxy skupinu.

V nej výhodnějším provedení se vynález týká sloučenin uvedených výše, kde X je -CH₃- mje celé číslo od 650 do 700, n je 1, Rje methyl a průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je přibližně 30 kilodaltonů.

V ještě jiném provedení se vynález týká způsobu léčby anemie u člověka, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství erytropoetin-glykoproteinového produktu vzorce 1.

V ještě jiném provedení se vynález týká způsobu přípravy erytropoetin-glykoproteinového produktu majícího biologickou aktivitu in vivo, která stimuluje buňky kostní dřeně k zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů, kde uvedený způsob zahrnuje kroky:

(a) kovalentní reakce s ε-amino skupinou lysinu erytropoetinového proteinu vzorce P-fNPTE, s bi-funkčním činidlem vzorce Z-CO-X-S-Q, za zisku meziproduktu s amidovou vazbou vzorce:

P-[NH-CO-X-S“Q]_n kde P je erytropoeti nový protein bez amino skupiny, která tvoří amidovou vazbu; n je celé číslo do 1 do 3; Z je reaktivní skupina, například karboxyl-NHS ester; X je -(CH₂)-r- nebo -CH^O-CH^-Chl·))—. kde kje od 1 do přibližně lé; a Q je chránící skupina, jako je alkanoyl, například acetyl.

(b) kovalentní reakci meziproduktu s amidovou vazbou z kroku (a) s aktivovaným polyethylenglykolovým derivátem vzorce W-[OCH₂CH₂]_m-OR, za zisku erytropoetin-glykoproteinového produktu vzorce:

-8CZ 301833 B6 kde W je sulfhydrylová reakce forma Y; m je celé číslo od přibližně 450 do přibližně 900; R je nižší alkyl; a Y je

nebo

V tomto provedení je bifunkčním činidlem výhodně N-sukcínimidyl-S-acetylthiopropionat nebo 5 N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát, Z je výhodně N-hydroxysukcinimid a aktivovaný polyethylenglykolový derivát W-[OCH₂CH₂]_m-OR je výhodně vybrán ze skupiny zahrnující jod-acetyl-methoxy-PEG, methoxy-PEG-vinylsulfon a methoxy-PEG-maleimid.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká prostředku obsahujícího konjugáty, kde každý io z uvedených konjugátu obsahuje erytropoetin-glykoprotein obsahující alespoň jednu volnou amino skupinu a mající biologickou aktivitu in vivo stimulující buňky kostní dřeně ke zvýšené produkci retikulocytů a erytrocytů, které je vybrán ze skupiny zahrnující lidský erytropoetin a jeho analogy, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí od 1 do glykosylačních míst nebo přestavbou alespoň jednoho glykosylačního místa; kde uvedený 15 glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tři nižší-alkoxy-poly(ethylenglykolové) skupiny, kde každá poly(ethylenglykolová) skupina je kovalentně navázaná na glykoprotein prostřednictvím spojovací skupiny vzorce -C(0)-X-S-Y- kde C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených amino skupin,

X je 4CHA- nebo -CH₂(O-CH₂-CH₂\-; k je od 1 do 10,

Y je nebo

průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od přibližně 20 kilodalton do přibližně 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od přibližně 51 kilodaltonů do přibližně 175 kilodaltonů; a procento konjugátů, kde n je 1, je alespoň 90%. Výhodně obsahují prostředky konjugátu definované výše, kde n je 1 v alespoň 90%, výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 92%, ještě výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 96% a nej výhodněji takové konjugáty, kde n je 1 v alespoň 90% až 96%.

-9CZ 301833 B6

Dále předkládaný vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující konjugát nebo přípravek definovaný výše a farmaceuticky přijatelné přísady a použití konjugátu nebo prostředků definovaných výše pro přípravu léčiv pro léčbu nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a pro léčbu pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie. Dále vynález zahrnuje způsob léčby nebo profylaxe onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a léčby pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie, který zahrnuje krok podání prostředků definovaných výše pacientům.

Vynález se také týká způsobu přípravy konjugátu nebo prostředků definovaných výše, které zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoetin-glykoprotein a navázání výsledného aktivovaného erytropoetin-glykoproteinu na derivát poly(ethylengykolu) (PEG). Dále vynález poskytuje konjugáty a prostředky definované výše připravené způsobem popsaným výše, a konjugáty a prostředky definované výše pro léčbu nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým renálním selháním (CRF), AIDS a pro léčbu pacientů s nádorovým onemocněním během chemoterapie.

Způsob exprese EPO proteinů

Erytropoetin (EPO) je lidský glukoprotein, který stimuluje tvorbu erytrocytů. Jeho příprava a terapeutické aplikace jsou popsány podrobně například v U.S. patentech 5,547,933 a 5,621,080, EP-B 0148605, Huang, S.L., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0205564, EP-B 0209539 a EP-B 0411678, stejně jako v Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986)

3116-3121, Sasaki, H. Et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Erytropoetin pro terapeutické použití může být produkován rekombinantně (EP-B 0148605, EP-B 0209539 a Egrit, J.C. Strickland, T.W., Lané, J. et al (1986) Immunobiol. 72: 213-224). Exprese proteinů, včetně EPO, aktivací endogenního genu, je dobře známá v oboru a je popsána v, například, U.S. Patentech 5,733,761, 5,641,670 a 5,733,746, a Mezinárodní patentové přihlášce WO 93/09222,

3() WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 a WO 91/09955, jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

Způsoby pro expresi a přípravu erytropoetinu v bezsérovém mediu jsou popsány například ve WO 96/35718, Burg, publikované 14.11. 1996, a v Evropské patentové přihlášce 53738, Koch, publikované 12.6.1992.

Způsoby pro přečištění lidského EPO proteinu

Kromě výše uvedených odkazů je známo, že může být provedena bezsérová fermentace rekombinantntch CHO buněk, které obsahují EPO gen. Takové způsoby jsou popsány například EP-A 0513738, EP-A 0267678 a obecněji v Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. a Franěk, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0481 791, EP-A 0307247, EP-A 0343635, WO 88/00967.

V EP-A 0267678 je popsána iontoměničová chromatografie na S-Sepharose, preparativní HPLC s reverzní fází na C₈ koloně a gelová filtrační chromatografie pro čištění EPO produkovaného v bezsérové kultuře po dialýze. V této souvislosti může být krok gelové filtrační chromatografie nahrazen iontoměničovou chromatografíí na S-Sepharose s rychlým průtokem. Také může být před iontoměničovou chromatografíí provedena chromatografíí na Blue Trisacryl koloně.

Způsob pro přečištění rekombinantního EPO je popsán v Nobuo, L et al, J. Biochem. 107 (1990) 352-359. V tomto způsobu je EPO zpracován roztokem Tween^ÍR) 20, fenylmethylsulfonylfluoridem, ethyl maleimidern, pepstatinem A, síranem měďnatým a kyselinou oxamovou před stupni přečišťování.

- 10CZ 301833 B6

Různé odkazy, jako například WO 96/35718, Burg, publikovaná 14.11. 1996, popisuji způsob přípravy erytropoetinu v bezsérovém fermentačním procesu (EPOsf). Jeden způsob přípravy EPO jako výchozího materiálu pro pegylaci je popsán dále.

Biologický test pro stanovení specifické aktivity EPO a EPO konjugátů

Specifická aktivita EPO nebo EPO konjugátů podle předkládaného vynálezu může být stanovena různými testy známými v oboru. Biologická aktivita přečištěných EPO proteinů podle předkláío daného vynálezu je taková, že po podání EPO proteinu injekcí člověku dojde je stimulaci buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a erytrocytů ve srovnání s netečenou nebo kontrolní skupinou jedinců. Biologická aktivita EPO proteinů nebo jejich fragmentů, získaných a přečištěných způsobem podle předkládaného vynálezu, může být testována způsobem podle Pharm. Europa

Spec. Issue Erytropoetin BRP Bio 1997 (2). Další biologický test pro určení aktivity EPO proteinu, test na normocytemických myších, je popsán v příkladu 4.

Způsoby přípravy pegylovaného EPO

Způsoby přípravy erytropoetin-glykoprote i nových produktů vzorce I zahrnují kovalentní navázá20 ní thiolových skupin na EPO („aktivace“) a kondenzace získaného aktivovaného EPO s polyethylen gly kolovým) (PEG) derivátem. Prvním stupněm při přípravě pegylovaného EPO podle předkládaného vynálezu zahrnuje navázání thiolových skupin pres NEL-skupinu EPO. Tato aktivace EPO je provedena za použití bi-funkčních Činidel, které obsahují aktivovanou chráněnou thiolovou skupinu a další reaktivní skupiny, jako jsou aktivní estery (například sukcinimidyl25 ester), anhydridy, estery kyseliny sulfonové, halogenidy karboxylových a sulfonových kyselin, v příslušném pořadí. Thiolova skupina je chráněna skupina známými v oboru, například acetylovými skupinami. Tato bifunkční činidla jsou schopna reagovat s amino skupinami lysinu za vzniku amidové vazby. První stupeň reakce je uvedena dále:

EP0fNHj + YX-SY

O^Z CH,

kde EPO, n a X jsou stejné, jako jsou definovány výše a Z je reaktivní skupina známá v oboru, například N-hydroxysukcinimidový (NHS) substituent vzorce

O

Ve výhodném provedení je aktivace ε-amino skupiny lysinu provedena reakcí s bifunkční činidlem obsahujícím sukcinimidylovou skupinu. Bifunkční činidla mohou obsahovat různé oddělovací skupiny, například -(CHiX- nebo -CH₂-(O-CH2-CH2-), kde k je od 1 do přibližně 10, výhodně od 1 do přibližně 4, a výhodněji 1 nebo 2, s nejvýhodněji 1. Příklady takových činidel jsou N-sukcinimidyl-S-acetylthioproipionat (SATP) a N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (ŠATA)

O

- II CZ 301833 B6 acetylthioalkyl-karboxylová kyselina-NHS-ester

2-(acetylthio)~ethoxy)_k-kyselina octová-NHS-ester kde k je stejný, jakje definován výše.

Příprava bifunkčního činidla je známá v oboru. Prekursory 2-(acetylthio)-(ethoxy)k-kyselína octová-NHS-esterů jsou popsány v DE-3 924705, a derivatizace na acetyl thio- sloučeninu je popsána v March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill 1977, 375-376. ŠATA je dostupná komerčně (Molecular Probes, Eurogene, OR, USA a Pierce, Rockford, IL).

ío Počet thiolových skupin, které mají být přidány k EPO molekule, může být vybrán pomocí úpravy reakčních parametrů, tj, koncentrace EPO proteinů (EPO) a poměru protein/bifimkční činidlo. Výhodně je EPO aktivován kovalentním navázáním od 1 do 5 thiolových skupin na EPO molekulu, výhodněji od 1,5 do 3 thiolových skupin a EPO molekulu. Tyto rozmezí označují statistickou distribuci thiolových skupin v populaci EPO proteinů.

Reakce se provede, například, ve vodném pufrovacím roztoku, pH 6,5 až 8,0, například v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCl, pH 7,3. Bifunkční činidlo může být přidáno v DMSO. Po dokončení reakce, výhodně po 30 minutách, se reakce ukončí přidáním lysinu. Nadbytek bifunkčního činidla může být separován způsoby známými v oboru, například dialýzou nebo filtrací na koloně. Průměrný počet thiolových skupin přidaných na EPO může být stanoven fotometrickou metodou, která je popsána například v Grasetti, D.R. a Murray, J.F., vj. Apl. Biochem. Biotechnol. 199,41-49 (1967).

Po výše uvedené reakci následuje kovalentní navázání aktivovaného polyethylenglykolového 25 (PEG) derivátu. Vhodné PEG deriváty jsou aktivované PEG molekuly s průměrnou molekulovou hmotností od přibližně 20 do přibližně 40 kDA, výhodněji od přibližně 24 do přibližně 35 kDA a nejvýhodněji přibližně 30 kDa.

Aktivované PEG deriváty jsou známé v oboru a jsou popsány, například, v Morpurgo, M. et al. 30 J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 ff pro PEG-vinylsulfon. PEG s lineárním a rozvětveným řetězcem jsou vhodné pro přípravu sloučeniny vzorce 1.

Příklady reaktivních PEG činidel jsou jod-acetyl-methoxy-PEG a methoxy-PEG-vinylsulfon:

nebo

Použití jodem-aktivovaných substancí je známé v oboru a je popsané například v Hermanson, G. T. v Biokonjugát Techniquess Academie Press, San Diego (1996) p. 147-148.

- 12CZ 301833 B6

Nejvýhodněji jsou PEG aktivovaném maleimidem za použití (Alkoxy-PEG-maleímidu), jako je methoxy-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, lne.). Struktura alkoxy-PEGmaleimidu je následující:

_ncbo

í H ^m kde Ra m jsou stejné, jak jsou definovány výše.

Nejvýhodnějším derivátem je

kde R a m jsou stejné, jak jsou definovány výše.

OR

Kondenzační reakce s alkoxy-PEG-maleimidem probíhá po in šitu štěpení skupiny chránící thiol ve vodném pufrovacím roztoku, například v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6,2. Štěpení chránící skupiny může být provedeno, například, za použití hydroxylaminu v DMSO při teplotě 25 °C, pH 6,2 po dobu přibližně 90 minut. Pro modifikaci PEG by měl být molámí poměr aktivovaného EPO/alkoxy-PEG-maleimidu od přibližně 1:3 do přibližně 1:6, a výhodně 1:4. Reakce může být ukončena přidáním cysteinu a reakcí zbývajících thiol (-SH) skupin s N-methylmaleimidem nebo jinou vhodnou sloučeninou schopnou tvořit disulfidové vazby. Z důvodu reakce jakékoliv zbývající aktivní thiolové skupiny s chránící skupinou, jako je N-methylmaleimid nebo jiná chránící skupina, mohou EPO glykoproteiny v konjugátech podle předkládaného vynálezu může obsahovat takové chránící skupiny. Zde popsaný obecný postup bude produkovat směs molekul majících různý počet thiolů chráněných různým počtem chránících skupin, v závislosti na počtu aktivovaných thiolových skupin na glykoproteinu, které nebyly konjugovány na PEG-maleimid.

Zatímco N-methylmaleimid tvoří stejný typ kovalentní vazby, když je použit pro blokování zbývajících thiolových skupin nebo pegylovaném proteinu, disulfidové sloučeniny způsobují intermolekulovou sulfid/disulfid výměnou reakci vedoucí ke kondenzaci blokovacího činidla prostřednictvím disulfidových můstků. Výhodné blokovací činidla pro tento typ blokací reakce jsou oxidovaný glutathion (GSSG), cystein a cystamin. Zatímco cystein nepřidává pegylovanému proteinu žádný další náboj, použití blokovacího činidla GSSG nebo cystaminu vede k přidání dalšího negativního nebo pozitivního náboje.

Další přečištění sloučeniny vzorce I, včetně separace mono-, di- a tri-pegylovaných EPO, může 35 být provedeno způsoby známými v oboru, například, chromatografií na koloně.

- 13 CZ 301833 B6

Farmaceutické produkty

Eritropoetín-glykoproteinové produkty připravené podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny ve farmaceutických prostředcích nebo vehikulem za použití způsobů známých v oboru. Vhodné prostředky jsou popsány například ve WO97/09996, W097/40850, WO98/58660 a W 99/07401. Mezi výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče pro přípravu produktů podle předkládaného vynálezu patří lidský sérový albumin, lidské plazmatické proteiny, atd. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny v 10 mM fosforečnan sodný/draselný pufru při pH 7 obsahujícím činidlo upravující tonicitu, například 132 mM chlorid sodný, io Volitelně mohou farmaceutické prostředky obsahovat konzervační činidlo. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat různá množství erytropoetinu, například 10-1000 gg/ml, například μg nebo 400 μg.

Léčba hematologie kých onemocnění charakterizovaných nízkou nebo defektní produkcí erytro15 cytů

Podávání erytropoetin-glykoproteinových produktů podle předkládaného vynálezu vede u člověka k tvorbě erytrocytů. Tak nahrazuje podávání erytropoetin-glykoproteinových produktů tento EPO protein, který je významný pro produkci erytrocytů. Farmaceutické prostředky obsahující erytropoetin-glykoproteinové produkty mohou být připraveny v dávce účinné pro podávání různými způsoby lidskému pacientovi s hematologickým onemocněním charakterizovaným nízkou nebo defektní produkcí erytrocytů, samostatným nebo jako součást jiného onemocnění. Farmaceutické prostředky mohou být podávány injekcí, jako je podkožní nebo nitrožilní injekce. Průměrné množství erytropoetin-glykoproteinových produktů mohou být různá a závisí na doporučení ošetřujícího lékaře, Přesné množství konjugátu závisí na faktorech jako je přesný typ léčeného onemocnění, stav léčeného pacienta, a další složky v prostředku. Například může být 0,01 až 10 μg na kg tělesné hmotnosti, výhodně 0,1 až 1 μg na kg tělesné hmotnosti, podáváno například jednou týdně.

jo V uvedeném popisu byly citovány různé odkazy. Tyto odkazy jsou zde uvedeny ve své úplnosti pro podrobnější popis stavu oboru.

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ilustrují, ale neomezují, přípravu sloučenin a prostředků podle předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Fermentace a přečištění lidského EPO a) Příprava inokula a fermentace

Jedna zkumavek Working Cell Bank, pocházející z CHO buněčné linie produkující EPO (ATCC

CRL8696, popsaná v EP 411678 (Genetics Instritute)) se vezme z plynné fáze skladovacího zásobníku s tekutým dusíkem. Buňky se přenesou do skleněných odstřeďovacích zkumavek a kultivují se v mediu pufrovaném hydrogenuhličitanem ve zvlhčovaném CO₂ inkubátoru, typické bezsérové médium použití pro přípravu inokula a fermentace je popsáno v Evropské patentové přihlášce 513738, Koch, publikované 12.6.1992, nebo WO 96/35718, Burg, publikované 14.11.

1 996, které například obsahuje jako médium DMEM/F12 (například JRH Biosciences/Hazleton

Biologics, Denver, US, pořadové č. 57-736) a dále hydrogenuhličitan sodný, L+glutamin, D+glukózu, rekombinantní insulin, selenin sodný, diaminobutan, hydrokortison, síran železnatý, asparagin, kyselinu asparagovou, serin a stabilizační činidlo pro savčí buňky, jako je například polyvinylalkohol, methy lcelulóza, polydextran, polethylenglykol, Pluronic F68, plasmatický expander polygelin (HEMACCEL^(R)) nebo polyvinylpyrrolidon (WO 96/35718).

-14CZ 301833 B6

V kulturách se mikroskopicky ověří nepřítomnost kontaminujících mikroorganismů a stanoví se buněčné density. Tyto testy se provedou při každém dělení kultury.

Po iniciální růstové periodě se buněčná kultura naředí Čerstvým mediem na výchozí buněčnou hustotu a nechá se proběhnout další růstový cyklus. Tento postup se opakuje do té doby, než se získají přibližně 2 1 na skleněnou odstřeďovací zkumavku. Po přibližně 12 děleních se získá 1 až 5 litrů této kultury, která se použije jako inokulum pro 10 l fermentační tank.

io Po 3-5 dnech může být kultura v 10 1 fermentačním tanku použita jako inokulum pro 100 1 fermentační tank.

Po dalších 3-5 dnech kultivace může být kultura v 1001 fermentačním tanku použita jako inokulum pro 1000 1 produkční fermentační tank.

b) Odběr a separace buněk

Použije se proces s obnovenou vsádkou, tj. když se dosáhne požadovaná densita buněk, odebere se přibližně 80 % kultury. Zbývající kultura se doplní čerstvým kultivačním mediem a kultivuje se do dalšího odběru. Jedno kolo produkce se skládá z maximálně 10 následujících odběrů; 9 částečných odběrů a 1 celkového odběru na konci fermentace. Odběry se provádí každé 3 až 4 dny.

Daný odebraný objem se přenese do chladné zkumavky. Buňky se odstraní odstředěním nebo filtrací. Supematant obsahující EPO získaný při odstředění se přímo filtruje a odebírá do druhé chladné zkumavky. Každý odběr se přečišťuje samostatně.

Typický proces pro přečištění EPO-proteinu je popsán ve WO 96/357 18, Burg, publikované 14.11. 1996, Přečištění se provede následovně.

a) Chromatografie na Blue Sepharose

Blue Sepharosa (Pharmacia) se skládá ze Sepharosových korálků, na jejichž povrch je kovalentně navázáno Cibacron modré barvivo. Protože se EPO váže silněji na Blue Sepharosu než na většinu neprote i nových kontaminujících složek, některé proteinové nečistoty a PVA, může být EPO v tomto stupni přečištěn. Eluce Blue Sepharosové kolony se provede zvýšení koncentrace solí a pH.

Kolona se naplní 80 ž 100 1 Blue Sepharosy, regeneruje se NaOH a uvede se do rovnováhy pomocí ekvilibračního pufru (chlorid sodný/vápenatý a octan sodný). Kolona se naplní okysele40 ným a přefiltrovaným supematantem z fermentace. Po naplnění se kolona nejprve promyje pufrem podobným ekvilibračnímu pufru obsahujícím vyšší koncentraci chloridu sodného, a potom pufrem na bázi Tris. Produkt se eluuje pufrem na bázi Tris a odebírá se v jedné frakci podle daného elučního profilu.

b) Chromatografie na Butyl-Toyopearl

Butyl Toyopearl 650 C (TosHaas) je matrice na bází polystyrenu, na kterou jsou kovalentně navázané alifatické butylové zbytky. Protože se EPO váže na tento geo silněji než většina nečistot a PVA, byl gel eluován pufrem obsahujícím isopropanol.

Kolona se naplní 30 až 40 1 Butyl Toyopearl 650 C, regeneruje se NaOH, promyje se pufrem na bázi Tris a uvede se do rovnováhy pufrem na bázi Tris obsahujícím isopropanol.

Eluát z Blue Sepharosy se zpracuje pro koncentrování isopropanolu v koloně naplněné ekviiib55 račním pufrem a plní se do kolony. Potom se kolona promyje ekvilibračním pufrem se stoupající

-15CZ 301833 B6 koncentrací isopropanolu. Produkt se eluuje elučním pufrem (pufr na bázi Tris s vysokým obsahem isopropanolu) a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profilu.

c) Chromatografie na hydroxyapatitovém ultragelu

Hydroxyapatitový Ultrogel (Biosepra) se skládá z hydroxyapatitu, který je inkorporován do agarózové matrice pro zlepšení mechanických vlastností. EPO má nízkou afinitu k hydroxyapatitu a může být proto eluován při nižší koncentraci fosfátu než proteinové nečistoty.

ío Kolona se naplní 30 až 40 1 hydroxyapatitového ultragelu a regeneruje se fosforečnane draselný/chlorid sodný pufrem a NaOH a potom pufrem na bázi Tris. Potom se kolona uvede do rovnováhy pufrem na bázi Tris obsahujícím nízké množství isopropanolu a chloridu sodného.

Eluát obsahující EPO z Butyl Toyopearl-chromatografie se naplní do kolony. Potom se kolona promyje ekvilibračním pufrem a pufrem na bází Tris bez isopropanolu a chloridu sodného. Produkt se eluuje pufrem na bázi Tris obsahující a nízkou koncentraci fosforečnanu sodného a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profitu,

d) HPLC s reverzní fází na Vydac C4

RP-HPLC materiál Vydac C4 (Vydac) se skládá ze silikagelových částic, které obsahují na svém povrchu C4-alkylové řetězce. Separatin EPO od proteinových nečistot je založena na různé síle hydrofobních interakcí. Eluce se provede za použití acetonitrilového gradientu v ředěné kyselině trifluoroctové.

Preparatívní HPLC se provede za použití ocelové kolony (naplněné 2,8 až 3,2 litry Vydac C4 silikagelu). Eluát z hydroxyapatitového ultragelu se okyselí přidání kyseliny trifluoroctové a naplní se do Vydac C4 kolony. Po promytí a eluci se použije aceton itr i lovy gradient v ředěné kyseliny trifluoroctové. Frakce se odeberou a ihned se neutralizují fosfátovým pufrem. Frakce obsahující PO spadající do IPC se kombinují,

e) DEAE sepharosová chromatografie

DEAE Sepharosa (Pharmacia) se skládá z diethylaminoethylových (DEAE) skupin, které jsou kovalentně navázané na povrch Sepharosových korálků. Vazba EPO a DEAE skupin je zprostředkována iontovými interakcemi. Acetonitril a kyselina trifluoroctová procházejí kolonou bez toho, že by byly zachyceny. Po vymytí těchto substancí se stopové nečistoty odstraní promytím kolony acetátovým pufrem pri nízkém pH. Kolona se promyje neutrálním fosfátovým pufrem a EPO se eluuje pufrem se stoupající iontovou koncentrací.

Kolona se naplní DEAE Sepharose fast flow. Objem kolony se upraví tak, aby bylo dosaženo náplně EPO v rozmezí 3 až 10 mg EPG/ml gelu. Kolona se promyje vodou a ekvilibračním pufrem (fosforečnan sodný/draselný). Kombinované frakce HPLC eluátu se vnesou do kolony a kolona se promyje ekvilibračním pufrem. Potom se kolona promyje promývacím pufrem (pufr tvořený octanem sodným) a potom ekvilibračním pufrem. Potom se EPO eluuje z kolony elučním pufrem (chlorid sodný, fosforečnan sodný/draselný) a odebere se v jedné frakci podle vzorového elučního profilu.

Eluát z DEAE Sepharosové kolony se upraví na určitou specifikovanou vodivost. Získané léčivo se sterilně přefiltruje do Teflonových zkumavek a uskladní se při teplotě 70 °C.

- 16CZ 301833 B6

Příklad 2: Kovalentní navázání thiolových skupin na EPO

Tento příklad popisuje určení reakčních podmínek pro kovalentní navázání thiolových skupin na EPO. Po stanovení podmínek se různá množství činidel obsahujících blokovanou thiolovou skupinu, zde ŠATA nebo SATP (rozpuštěné v DMSO v koncentraci 10 mg/ml) přidají k roztoku EPO, zde k 1 ml 5 mg/ml EPO v 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl, pH 7,3. Reakční směs se mísí po dobu přibližně 3 minut (25 °C) a reakce se ukončí přidáním 1 M roztoku lysinu v koncentraci 10 mM. Nadbytečné množství ŠATA a SATP se odstraní dialýzou proti 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl a 2 mM EDTA, pH 6,2. Po odstranění chránící acetylové io skupiny hydroxylaminem se počet thiolových skupin kovalentně navázaných na EPO určí fotometricky za použití dithiodipyridinu způsobem podle Grasetti, D.R. a Murray, J.F. v J. Appl.

Biochem. Bitechnol. 119, str. 41-49 (1967).

Počet thiolových skupin kovalentně navázaných na molekulu EPO je uveden dále.

Molární poměr EPO:ŠATA nebo SATP	Mol thiolových skupin / mol EPO
EPO:SATA - 1;3	1,5
EPO:ŠATA = 1:5	2,4
EPO:SATA = 1:6	3,2
EPO:SATP =1:3	1,3
EPO:SATP = 1:4	2,5
EPO:SATP = 1:6	3,7

—--—

Příklad 3: Modifikace aktivovaného EPO methoxy-PEG-maleimidem

A) Aktivace EPO:

100 mg EPO připraveného podle příkladu 1 (190,00 IU/mg jak se stanoví testem na normocytemických myších) se aktivuje ŠATA (molámí poměr EPO/SATA = 1/5) podle příkladu 2. Získaný EPO („aktivovaný EPO“) obsahující kovalentně navázané blokované thiolové skupiny se separuje od vedlejších produktů jako je N-hydroxy-sukcinimid nebo nereagovaný ŠATA dialýzou, jak je popsáno v příkladu 1. Získá se roztok 4,5 mg/ml aktivovaného EPO v 10 mM fosforečnanu draselného, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2.

B) Pegylace aktivovaného EPO:

380 mg methoxy-PEG-maleimidu s nejvýhodnější strukturou, jak je ilustrována výše, (Mol.

hmot. 3000; Shearwater Polymers, lne., Huntsville (Alabama, USA)) se rozpustí ve výše uvedeném roztoku obsahujícím 95 mg aktivovaného EPO (4,5 mg/ml v 10 mM fosforečnanu draselném, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2). Získaný molámí poměr mezi aktivovaným EPO a methoxy-PEG-maleimidem v roztoku je 1:4. Přidáním 1 M vodného roztoku, se odblokují kovalentně navázané blokové thiolové skupiny aktivovaného EPO. Získaný aktivovaný EPO v reakční směsi obsahuje volné thiolové (-SH) skupiny. Deblokování thiolových skupin se provede ihned po kondenzační reakci mezi aktivovaným EPO nyní obsahujícím volné thiolové (-SH) skupiny a methoxy-PEG-maleimidem trvající 90 minut (míšení, 25 °C). Kondenzační reakce se ukončí přidáním 0,2 M vodného roztoku cysteinu v koncentraci 2 mM do reakční směsi. Po 30 minutách se nadbytek volných thiolových skupin aktivovaného EPO, které nereagovaly s methoxy-PEG-maleimidem, blokuje přidáním 0,5 M roztoku N-methylmaleimidu

- 17CZ 301833 B6 v DMSO za dosažení koncentrace 5 mM. Po 30 minutách se získaná reakční směs nyní obsahující pegylovaný EPO dialyzuje proti 10 mM fosforečnanu draselného, pH 7,5, po dobu 15 hodin. C) Přečištění pegylovaného EPO:

Pro separaci pegy lovaného EPO od reakční směsi se provede následující přečištění: 50 ml Q-Sepharosová ff kolona se uvede do rovnováhy 10 mM fosforečnanem draselným, pH 7,5. Reakční směs získaná ve stupni B) se naplní do kolony (průtok: 3 objemy kolony (CV) za hodinu). Pro odseparování nezreago váného methoxy-PEG-rnaleimidového činidla se kolona io promyje 5 CV 10 mM fosforečnanu draselného, pH 7,5. Pegylovaný EPO se separuje elucí roztokem se stoupajícím gradientem solí obsahujícím, 5 CV pufru A (10 mM fosforečnan draselný, pH 7,5) a 5 CV pufru B (10 mM fosforečnan draselný, 500 mM NaCl, pH 7,5) s průtokem 3 CV za hodinu. Podle gradientu NaCL se pegylovaný EPO (tri- bi- a monopegylovaný EPO) eluuje nejdříve a po něm se eluuje nepegylovaný EPO. Frakce eluátu obsahu15 jící pegylovaný EPO (tri, di- a mono-pegylovaný EPO) se odeberou a přefiltrují se (sterilní filtrace přes 0,2 ptm filtr).

Obsah a čistota tri- di- a mono-pegylovaného EPO se hodnotí na Coomassie-barvených SDS-PAA gelech (Laemmli, Nátuře 227, 680-685 (1970)), zatímco koncentrace protein se měří při 280 nm podle Beer-Lambertova pravidla. Zřetelná molekulová hmotnost EPO se určí SDS-PAA elektroforesou a je přibližně 68 kDA (mono-pegylovaný EPO), přibližně 98 kDa (di-pegylovaný EPO) a přibližně 128 kDa (tri-pegyl ováný EPO).

Další separace tri-, di a mono-pegylovaného EPO může být provedena za použití chromát o25 grafíe, například chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (Superdex, pg 200; Pharmacia).

Stanovení biologické aktivity eluátu obsahujícího tri-, di- a mono-pegylované EPO in vivo se provede způsobem popsaným v příkladu 4.

Příklad 4: Určení tn-vivo aktivity pegylovaného EPO testem na normocytemických myších

Test na normocytemických myších je známý v oboru (Pharm. Europa Spec. Issue Erytropoetin

BRP Bio 1997(2)) a monografie erytropoeti nu Ph. Eur. BRP. Vzorky se naředí BSA-PBS. Normálním zdravým myším věku 7 až 15 týdnů se podá s.c. 0,2 ml EPO-frakce obsahující tri-, di- a monopegylované EPO, jak jsou popsány v příkladu 2 během 4 denního období začínajícího 72 hodin po podání se odebírá krev punkcí ocasní žíly a naředí se tak, že 1 μΐ krve je přítomen v 1 ml barvicího roztoku obsahujícího 0,15 μηιοΙ akridinového oranže. Doba barvení je 3 až

10 minut. Recticulocyty se počítají mikrofluorometrícky v průtokové cytometru analýzou histogramu červené fluorescence. Počty retikulocytů jsou uvedeny jako absolutní čísla (na 30 000 analyzovaných erytrocytů). Pro prezentovaná data se každá skupina skládá z 5 myší na den a myším byla odebírána krev pouze jednou.

Myším se podá methoxy-PEG-maleimid navázaný na EPO podle příkladu 3, nemodifikovaný EPO a pufrovaný roztok, Výsledky jsou uvedené na obr. 3. Výsledky ukazují lepší aktivitu a prodloužený poločas pegylovaného EPO, což ukazuje signifikantně zvýšené množství retikulocytů a posuv maximálního počtu retikulocytů za použití stejné dávky na myš.

-18CZ 301833 B6

Seznam sekvencí (l) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: F. Hoffmann - La Roche AG (B) Ulice: 124 Greazacherstrasse (C) Město: Basel (E) Stát: Switzerland io (F) Poštovní kok (ZIP): CH-W70 (G) Telefon: (61)6881111 (H) Telefax: (61)6881395 (I) Telex: 962292 hlrch (ii) Název vynálezu: Konjugáty erytropoetinu s polyethylenglykolem (iii) Počet sekvencí: 3 (iv) Počítačové čtecí médium:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: WORD (D) Software: PatenIN Release 2.0 <170> Patentln ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo Sapiens

<400> 1

Leu 5

Ile Cys Asp

Ser Arg Val 10

Leu Glu Arg Tyr 15

Leu

Ala Pro 1

Pro

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Giy

Cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

35

40

45

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

SO

Leu

Val

Asn

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu

Kís

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Lsu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Glu

Ala

Tle

Ser

Pro

Asp

Ala

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Pne

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr Gly Asp

165

-19CZ 301833 B6 <210>2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

1

5

10

15

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gly

cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

40 <5

Tyr Ala 50

Trp Lys

Arg

Met

Glu Val 55

Gly Gin Gin

Ala 60

Val Glu

Val Trp

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

6S

70

7S

80

Leu

Val

Asn

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser

Pro

Asp

Ala

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Are

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly Asp Arg

155

<210>3 <21)> 28 io <212>PRT <213> Homo sapiens <400>3

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg I 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin 20 25

-20CZ 301833 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Konjugát obsahující erytropoetinový glykoprotein mající alespoň jednu volnou aminoskupinu a vykazující in vivo biologickou aktivitu, kterou je zvýšení produkce retikulocytů a erytrocytů buňkami kostní dřeně, kde erytropoetinový glykoprotein je vybrán ze souboru sestávající z lidského erytropoetinu a jeho analogů, které mají primární strukturu lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst nebo přestavbou alespoň jednoho glykoío sylačního místa, jež spočívá v deleci kteréhokoliv z míst s N-připojeným sacharidem v lidském erytropoetinu a adici místa s N-připojeným sacharidem v pozici 88 aminokyselinové sekvence lidského erytropoetinu; kde uvedený glykoprotein je kovalentně navázán na jednu až tri (C|C₆)alkoxy poly(ethylenglykolové) skupiny, přičemž každá poly(ethylenglykolová) skupina je kovalentně připojena ke glykoproteinu přes spojovací skupinu vzorce -C(O)~X-S-Y-, kde

15 zbytek C(O) spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin,

X je 4CH₂)k- nebo -€Η₂(Ο-€Η₂-ΰΗ₂χk je Číslo od 1 do 10,

Y je skupina vzorce průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od 20 do 40 kilodaltonů, a molekulová hmotnost konjugátu je od 51 do 175 kilodaltonů.
2. Konjugát podle nároku 1 obecného vzorce

P-[NH-CO-X-S~Y-<OCH₂CH₂)_m-OR]_n

30 kde X a Y mají stejný význam jako v nároku 1, m je číslo od 450 do 900, n je číslo od 1 do 3, R je (C|-C₆)alkyl a P je erytropoetinový glykoprotein bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X.
3. Konjugát podle nároku l nebo 2 obecného vzorce

-21 CZ 301833 B6 kde P,R,X,man mají stejný význam jako v nároku 2.
4. Konjugát podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce
5 kde P, R, X, m a n mají stejný význam jako v nároku 2.

5. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X, je skupina --(C H₂)k“
6. Konjugát podle nároku 5, kde k je číslo od 1 do 4.
7. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X je skupina -CHr-.
8. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde m je celé číslo od 550 do 800.

15
9. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde m je celé číslo od 650 do 700.
10. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde n je číslo 1.
11. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde R je methyl.
12. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykolové) skupiny je od 24 do 35 kilodaltonů.
13. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde průměrná molekulová hmotnost 25 každé poly(ethylenglykol) skupiny je 30 kilodaltonů.
14. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde glykoprotein je kovalentně navázán najednu nebo dvě poly(ethylenglykolové) skupiny blokové (C|-C₆)alkoxyskupinou.

30 15. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde poly(ethylenglykolové) skupiny jsou blokovány methoxyskupínu.

16. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde X je skupina -CHr-, m je celé číslo od 650 do 700, n je číslo 1, R je methyl, a průměrná molekulová hmotnost každé poly(ethylen35 glykolové) skupiny je 30 kilodaltonů.

17. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetí novým glykoproteinem je lidský erytropoetín.

40 18. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetinový glykoprotein je exprimován aktivací endogenního genu.

19. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde erytropoetinový glykoporotein má sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo na obr. 2 (SEQ ID NO: 2).

20. Konjugát podle nároku 19, kde erytropoetinový glykoprotein má sekvenci uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO; 1).

-22CZ 3U1&U B6

21. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků I až 16, kde glykoprotein má sekvenci lidského erytropoetinu modifikovanou adicí 1 až 6 glykosylačních míst.

22. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků I až 6, 8 a 10, kde glykoprotein má modifikovanou 5 sekvenci lidského erytropoetinu, přičemž modifikace je vybrána ze souboru sestávajícího z

Asr?°Thr³² ;

Asn⁹¹Thr⁵³ ;

Asn⁵¹Thr⁵⁹ ;

Asn⁵⁹ ;

Asn⁶⁹?hr⁷³ ;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹ ;

Val³⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ ;

Ssr⁸⁷Asn⁸⁸Thr^so ;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁹⁰Thr⁹⁰Ser^3,Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²Ser^s7Asn⁸⁸Thr⁹²Ala^3G2 ; Asn^G9Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ ; Asn^3cThr³²Val⁹⁷Asn^8SThr⁹⁰ ;

Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr⁹¹ ;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ ;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸ ;

Asn^13BThr¹⁴⁰ ;

Thr¹²⁵ ; a Pro¹²⁴Thr¹²⁵ .

23. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde glykoprotein má sekvenci obsahující sekvenci lidského erytropoetinu a druhou sekvenci na karboxylovém konci sekvence lidského io erytropoetinu, kde druhá sekvence obsahuje alespoň jedno giykosylační místo.

24. Konjugát podle nároku 23, kde druhá sekvence obsahuje sekvenci získanou zkarboxyterminální sekvence lidského choriogonadotropinu.
15 25. Konjugát podle nároku 24, vyznačující se tím, že glykoprotein obsahuje sekvenci vybranou ze souboru sestávajícího z

a) lidského erytropoetinu mající aminokyselinovou sekvenci Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu pro Gin (SEQ ID
20 NO: 3), umístěnou na karboxylovém konci;

b) sekvence uvedenou v odstavci a) modifikované Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; a

c) sekvence uvedenou v odstavci a) modifikované Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰.

-23CZ 301833 B6

26. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, kde glykoprotein má sekvencí lidského erytropoetinu modifikovanou přestavbou alespoň jednoho glykosylačního místa definovanou v nároku 1.

5 27. Konjugát podle nároku 14, kde glykoprotein má sekvenci lidského erytropoetinu modifikovanou modifikací vybranou ze souboru sestávajícího z

Gin²⁴ Ser⁸⁷ Asn Thr⁹⁰ EPO;

Gin³⁹ Ser⁹⁷ Asn⁹⁹ Thr⁹⁰ EPO; a

Gin⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

28. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27.“ io

29. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 90% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.

30. Kompozice podle nároku, 29 vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle

15 kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 92% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.

31. Kompozice podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s alespoň 96% podílem konjugátu, v nichž n je číslo 1.

20 32. Kompozice podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 2 až 27 s 90 až 96% podílem konjugátu, v nichž je Číslo 1.

33. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozici podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 a farmaceu25 ticky přijatelný excipient.

34. Použití konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 pro výrobu léčiva pro léčení nebo profylaxi onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým

30 onemocněním léčených chemoterapií.

35. Způsob přípravy konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32, vyznačující se tím, že zahrnuje kovalentní navázání thiolových skupin na erytropoeti nový glykoprotein a kopulaci vzniklého aktivovaného erytro35 poetinového glykoproteinu s poly(ethylenglykolovým) (PEG) derivátem.

36. Konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32 připravené způsobem podle nároku 35.

40 37. Konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků

28 až 32 pro použití pro léčení onemocnění spojených s anemií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a pro léčení pacientů s nádorovým onemocněním léčených chemoterapií.