PL201754B1 - Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów - Google Patents

Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów

Info

Publication number
PL201754B1
PL201754B1 PL356065A PL35606500A PL201754B1 PL 201754 B1 PL201754 B1 PL 201754B1 PL 356065 A PL356065 A PL 356065A PL 35606500 A PL35606500 A PL 35606500A PL 201754 B1 PL201754 B1 PL 201754B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
conjugate
thr
asn
glycoprotein
erythropoietin
Prior art date
Application number
PL356065A
Other languages
English (en)
Other versions
PL356065A1 (pl
Inventor
Josef Burg
Bernd Hilger
Hans-Peter Josel
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of PL356065A1 publication Critical patent/PL356065A1/pl
Publication of PL201754B1 publication Critical patent/PL201754B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy koniugatu zawieraj acego glikoprotein e erytropoetyn e z co najmniej jedn a woln a grup a aminow a, wykazuj ac a in vivo dzia lanie biologiczne powoduj ace zwi ekszenie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, wybrana z grupy obejmuj acej ludzk a ery- tropoetyn e i jej analogi o podstawowej strukturze ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez doda- nie 1 - 6 miejsc glikozylacji lub przez przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji, który cha- rakteryzuje si e tym, ze t a glikoproteina jest kowalencyjnie zwi azana z 1 - 3 ugrupowaniami C 1 -C 6 -alko- ksypoli(glikolu etylenowego), a ka zde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie zwi a- zane z glikoprotein a poprzez lacznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wi azanie ami- dowe z jedn a z grup aminowych, X i Y maj a znaczenie podane w opisie, przy czym srednia masa cz a- steczkowa ka zdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 20000-40000, a masa cz asteczkowa koniugatu wynosi 51000-175000. Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji koniugatów, srodka farma- ceutycznego zawieraj acego koniugat lub kompozycj e koniugatów, zastosowania koniugatu lub kom- pozycji koniugatów do wytwarzania leków do leczenia lub profilaktyki chorób zwi azanych z niedokrwi- stoscia u pacjentów z przewlekla niewydolno scia nerek (CRF), AIDS i do leczenia pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii, oraz sposobu wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów.
Erytropoeza jest procesem wytwarzania erytrocytów, który równoważy proces niszczenia komórek. Erytropoeza jest kontrolowanym mechanizmem fizjologicznym zapewniającym dostępność erytrocytów w ilości wystarczającej do odpowiedniego natlenienia tkanek. Naturalnie występująca ludzka erytropoetyna (hEPO) jest glikoproteiną składającą się ze 165 aminokwasów, jest wytwarzana w nerkach i jest humoralnym czynnikiem osoczowym stymulującym wytwarzanie erytrocytów (Carnot, P i Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson LO, Goldwasser E. Freid, W i Plzak LF (1957) Nature 179: 6331-4). Ludzka EPO stymuluje podziały i różnicowanie zaangażowanych prekursorów erytroidowych w szpiku kostnym. Ludzka EPO wywiera działanie biologiczne przez wiązanie się z receptorami na prekursorach erytroidowych (Krantz BS (1991) Blood 77: 419). Naturalnie występująca ludzka erytropoetyna jest kwaśną glikoproteiną obecną w niskim stężeniu w osoczu krwi i stymuluje zastępowanie erytrocytów traconych w wyniku starzenia.
Erytropoetynę wytwarza się drogą biosyntezy z użyciem metod rekombinacji DNA (Egrie JC, Strickland TW, Lane J i inni (1986) Immunobiol. 72: 213-224) i jest ona produktem sklonowanego ludzkiego genu EPO wstawionego do komórek tkanki jajnika chomika chińskiego (komórkach CHO) i ulegającego w nich ekspresji. Naturalnie występująca ludzka EPO pierwotnie ulega translacji do łańcucha polipeptydowego zawierającego 166 aminokwasów z argininą w pozycji 166. Podczas modyfikacji posttranslacyjnych arginina w pozycji 166 jest odcinana przez karboksypeptydazę. Pierwotną strukturę ludzkiej EPO (165 aminokwasów) przedstawiono na fig. 1. Pierwotną strukturę ludzkiej EPO (166 aminokwasów) przedstawiono na fig. 2. Występują w niej dwa mostki disulfidowe, pomiędzy Cys7-Cys161 i Cys29-Cys33. Masa cząsteczkowa łańcucha polipeptydowego ludzkiej EPO bez grup cukrowych wynosi 18236. W nienaruszonej cząsteczce EPO około 40% masy cząsteczkowej stanowią ugrupowania węglowodanowe (Sasaki H, Bothner B, Dell A i Fukuda M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
Ze względu na to, że erytropoetyna jest niezbędna do tworzenia erytrocytów, hormon ten jest użyteczny w leczeniu zaburzeń krwi charakteryzujących się niskim lub zaburzonym wytwarzaniem erytrocytów. Klinicznie EPO stosuje się w leczeniu niedokrwistości u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF) (Eschbach JW, Egri JC, Downing MR i inni (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach JW, Abdulhadi MH, Browne JK i inni (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie JC, Eschbach JW, Mc-Guire T, Adamson JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim VS, Degowin RL, Zavala D i inni (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) oraz u pacjentów z AIDS i u pacjentów z rakiem poddawanych chemioterapii (Danna RP, Rudnick SA, Abels RI In: MB, Garnick, red. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: str. 301-324). Jednakże biodostępność obecnie dostępnych w handlu leków białkowych, takich jak EPO, jest ograniczona z uwagi na ich krótki okres półtrwania w osoczu oraz podatność na rozkład przez proteazy. Wady te nie pozwalają na osiągnięcie maksymalnej skuteczności działania przy klinicznym stosowaniu tych leków.
Wynalazek dotyczy nowej grupy PEG-pochodnych EPO. Fizjologicznie czynny koniugat PEG-EPO według wynalazku zawiera glikoproteinę erytropoetynę z co najmniej jedną wolną grupą aminową, wykazującą in vivo działanie biologiczne powodujące zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi o podstawowej strukturze ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez dodanie 1-6 miejsc glikozylacji lub przez przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji, charakteryzuje się tym, że ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 3 ugrupowaniami C1-C6-alkoksy-poli(glikolu etylenowego), a każde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie związane z glikoproteiną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych,
X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, k oznacza 1-10,
Y oznacza
PL 201 754 B1
przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 20000 - 40000, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi 51000 - 175000.
W porównaniu z niemodyfikowaną EPO (to jest EPO bez przyłączonego PEG) oraz ze znanymi koniugatami PEG-EPO, koniugaty według wynalazku wykazują dłuższy okres półtrwania w krążeniu oraz okres występowania w osoczu, obniżony klirens oraz podwyższone działanie kliniczne in vivo. Koniugaty według wynalazku mają takie same zastosowania co EPO. W szczególności koniugaty według wynalazku są użyteczne w leczeniu pacjentów przez stymulację podziałów oraz różnicowania zaangażowanych prekursorów erytroidowych w szpiku kostnym, tak samo jak w przypadku stosowania EPO w leczeniu pacjentów.
Korzystnym koniugatem według wynalazku jest związek o wzorze: P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n w którym X i Y mają wyż ej podane znaczenie, m oznacza 450 -900, n oznacza 1 - 3, R oznacza C1-C6-alkil, a P oznacza glikoproteinę erytropoetynę bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązania amidowe z X.
Korzystniejszym koniugatem według wynalazku jest związek o wzorze:
oraz związek o wzorze:
w których to wzorach P, R, X, m i n mają znaczenie jak podano dla powyż szego wzoru.
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są powyżej zdefiniowane związki, w których X oznacza -(CH2)k-, szczególnie te, w których k oznacza 1 - 4, a najkorzystniej te, w których X oznacza -CH2-.
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których m oznacza liczbę całkowitą 550 - 800, korzystniejszymi zaś te związki, w których m oznacza liczbą całkowitą 650 - 700.
Korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których n oznacza 1 i/lub R oznacza metyl.
PL 201 754 B1
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 24000 - 35000, korzystniejszymi zaś są te związki, w których średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 30000.
Korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 2 ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) zakończonymi C1-C6-alkoksylem, korzystniej jest kowalencyjnie związana z jednym ugrupowaniem poli(glikolu etylenowego) zakończonym C1-C6-alkoksylem.
Korzystniejszymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina jest kowalencyjnie związana z ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) zakończonymi metoksylem.
Najkorzystniejszymi koniugatami według wynalazku są związki, w których X oznacza -CH2-, m oznacza liczbę całkowitą 650 - 700, n oznacza 1, R oznacza metyl, a ś rednia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 30000.
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina erytropoetyna jest ludzką erytropoetyną.
Innymi korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina erytropoetyna jest eksprymowana przez endogenną aktywację genów.
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina erytropoetyna ma sekwencję SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2, korzystniejszymi zaś są te związki, w których glikoproteina erytropoetyna ma sekwencję SEQ ID NO:1.
Korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1-6 miejsc glikozylacji.
Innymi korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez modyfikację wybraną z grupy obejmującej:
Asn30Thr32;
Asn 51Thr53,
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn 136Thr138;
Asn 138Thr140;
Thr125; oraz Pro 124Thr125.
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina ma sekwencję zawierającą sekwencję ludzkiej erytropoetyny oraz drugą sekwencję na końcu karboksylowym sekwencji ludzkiej erytropoetyny, przy czym ta druga sekwencja zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji, korzystniej druga sekwencja stanowi sekwencję pochodzącą z końca karboksylowego sekwencji ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.
Korzystniejszymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina ma sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
(a) ludzką erytropoetynę mającą sekwencję aminokwasów Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO:3), przyłączoną do końca karboksylowego;
88 90 (b) sekwencję (a) zmodyfikowaną przez Ser87 Asn88 Thr90; oraz (c) sekwencję (a) zmodyfikowaną przez Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90.
PL 201 754 B1
Ponadto korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki, w których glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji.
Korzystniejszymi koniugatami według wynalazku są związki, w których przegrupowanie obejmuje delecję któregokolwiek z miejsc przyłączania węglowodanu do N w ludzkiej erytropoetynie oraz addycję miejsca przyłączania węglowodanu do N w pozycji 88 sekwencji aminokwasów ludzkiej erytropoetyny.
Korzystnymi koniugatami według wynalazku są związki w których glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez modyfikację wybraną z grupy obejmującej:
Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO;
Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; oraz
Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
Wynalazek dotyczy także kompozycji koniugatów charakteryzującej się tym, że zawiera zdefiniowane powyżej koniugaty, przy czym udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 90%.
Korzystnie kompozycja koniugatów według wynalazku zawiera koniugaty zdefiniowane powyżej, w których udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 92%, korzystniej, w których udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 96%, a najkorzystniej, w których udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi 90 - 96%.
Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego zawierającego koniugat lub kompozycję koniugatów, oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, którego cechą jest to, że zawiera koniugat lub kompozycję koniugatów, zdefiniowane powyżej.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania koniugatu lub kompozycji koniugatów, zdefiniowanych powyżej, do wytwarzania leków do leczenia lub profilaktyki chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS i do leczenia pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów, zdefiniowanych powyżej, który charakteryzuje się tym, że kowalencyjnie łączy się grupy tiolowe z glikoproteiną erytropoetyną i powstałą zaktywowaną glikopropteinę erytropoetynę sprzęga się z pochodną poli(glikolu etylenowego) (PEG).
Zgodnie ze sposobem według wynalazku grupę ε-aminową aminokwasu lizyny białka erytropoetyny poddaje się reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z dwufunkcyjnym reagentem, z wytworzeniem związku pośredniego z wiązaniem amidowym. Reagent dwufunkcyjny zawiera grupę reaktywną i zabezpieczoną grupę tiolową. Następnie związek pośredni z wiązaniem amidowym poddaje się reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego ze zaktywowaną pochodną poli(glikolu etylenowego), z wytworzeniem glikoproteinowego produktu erytropoetynowego według wynalazku.
Na fig. 1. przedstawiono podstawową strukturę ludzkiej EPO (165 aminokwasów).
Na fig. 2. przedstawiono podstawową strukturę ludzkiej EPO (166 aminokwasów).
Na fig. 3. przedstawiono aktywność in vivo PEG-ilowanej EPO określoną w normocytemicznym teście na myszach.
Poniższe terminy zdefiniowano w następujący sposób:
Określenie „białko erytropoetyna, „erytropoetyna, „EPO lub „glikoproteina erytropoetyna oznacza glikoproteinę o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub 2 (SEQ ID NO: 2) lub białko lub polipeptyd zasadniczo homologiczne do nich, których właściwości biologiczne odnoszą się do stymulacji wytwarzania erytrocytów i różnicowania zaangażowanych prekursorów erytroidowych w szpiku kostnym. Stosowane tu określenie białko EPO obejmuje takie białka modyfikowane celowo, np. przez ukierunkowaną mutagenezę, oraz przypadkowo, drogą mutacji. Określenia te obejmują także analogi zawierające 1-6 dodatkowych miejsc glikozylacji, analogi o co najmniej jednym aminokwasie przyłączonym do końca karboksylowego glikoproteiny, przy czym dodatkowe aminokwasy zawierają co najmniej jedno miejsce glikozylacji, oraz analogi o sekwencji aminokwasów obejmującej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji, takie jak np. analogi ujawnione w publikacji EP nr 640619. Określenia te obejmują zarówno naturalną, jak i zrekombinowaną ludzką erytropoetynę.
Określenie „zasadniczo homologiczny oznacza, że konkretna sekwencja, np. zmutowana sekwencja, różni się od sekwencji odniesienia jednym lub większą liczbą podstawień, delecji lub addycji, których końcowy efekt nie zmienia niekorzystnie funkcjonowania konkretnej sekwencji w porównaniu z sekwencją odniesienia. Dla celów wynalazku sekwencje wykazujące więcej niż 95% homologii, takie
PL 201 754 B1 same właściwości biologiczne i taką samą charakterystykę ekspresji, uważa się za zasadniczo homologiczne. Przy określaniu homologii należy pominąć skrócenie dojrzałej sekwencji. Sekwencje o niższym stopniu homologii, porównywalnej bioaktywności i takiej samej charakterystyce ekspresji uważa się za zasadniczo równoważne.
Określenie „fragment białka EPO oznacza jakiekolwiek 'białko lub polipeptyd o sekwencji aminokwasów stanowiącej część lub fragment białka EPO, który wykazuje aktywność biologiczną EPO. Fragmenty obejmują białka lub polipeptydy powstałe na skutek degradacji proteolitycznej białka EPO lub wytworzone znanymi sposobami syntezy chemicznej. Białko EPO lub jego fragment są biologicznie aktywne przy podawaniu białka lub fragmentu człowiekowi i wywołują stymulację wytwarzania erytrocytów oraz stymulację podziałów i różnicowania zaangażowanych prekursorów erytroidowych w szpiku kostnym. Taką aktywność biologiczną białka EPO można określić z użyciem standardowych, dobrze znanych testów, stosowanych w takim celu w badaniach na jednym lub większej liczbie gatunków ssaków. Odpowiedni test, który można stosować w celu wykazania takiej aktywności biologicznej opisano w opisie.
Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość jest ilością glikoproteinowego produktu erytropoetynowego niezbędnego do osiągnięcia aktywności biologicznej in vivo, powodującej zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego. Dokładna ilość glikoproteinowego produktu erytropoetynowego zależy od takich czynników w przypadku danego pacjenta, jak konkretny rodzaj leczonego stanu, stan leczonego pacjenta, a także od innych składników kompozycji. Środki farmaceutyczne zawierające glikoproteinowe produkty erytropoetynowe można formułować tak, by były one skuteczne przy podawaniu różnymi drogami pacjentowi będącemu człowiekiem cierpiącemu na zaburzenie krwi charakteryzujące się niskim lub zaburzonym wytwarzaniem erytrocytów. Średnia terapeutycznie skuteczna ilość glikoproteinowego produktu erytropoetynowego może być różna, a w szczególności powinna być ona oparta na zaleceniach i wskazówkach doświadczonego lekarza.
Jak podano powyżej, wynalazek dotyczy glikoproteinowych produktów erytropoetynowych, wykazujących in vivo działanie biologiczne wywołujące zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, o wzorze 1:
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n 1 w którym X i Y mają wyż ej podane znaczenie, m oznacza 450-900, n oznacza 1 - 3, R oznacza C1-C6-alkil, a P oznacza glikoproteinę erytropoetynę bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X. Tak jak opisano szczegółowo poniżej, wytwarzanie i oczyszczanie EPO są dobrze znane. EPO stanowi naturalne lub zrekombinowane białko, korzystnie ludzkie, które można uzyskiwać z jakiegokolwiek standardowego źródła, takiego jak tkanki, drogą syntezy białka, hodowli komórkowej z użyciem naturalnych lub zrekombinowanych komórek. Wynalazek dotyczy dowolnego białka o aktywności EPO, takiego jak białka zmutowane lub w inny sposób zmodyfikowane. Zrekombinowaną EPO można wytwarzać drogą ekspresji w liniach komórkowych CHO, BHK lub HeLa, z użyciem technologii rekombinacji DNA lub drogą aktywacji endogennych genów, tak że glikoproteina erytropoetyna jest eksprymowana przez aktywację endogennych genów. Korzystnym rodzajem EPO do wytwarzania glikoproteinowych produktów erytropoetynowych jest ludzka EPO. Korzystniej jest to ludzka EPO o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO:1) lub na fig. 2 (SEQ ID NO:2), a najkorzystniej o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO:1).
Ludzkie białko erytropoetynę można także modyfikować dodając co najmniej jedno dodatkowe miejsce glikozylacji, np. 1- 6 dodatkowych miejsc glikozylacji, takich jak, ale nie tylko, sekwencje aminokwasów podane poniżej. Zapis poniżej oznacza, że sekwencja przedstawiona na fig. 1 została zmodyfikowana przez podstawienie natywnego aminokwasu w pozycji wymienionej w podanych indeksach górnych na aminokwas wskazany po lewej stronie numeru w indeksie górnym.
Asn30Thr32 fig. 1 ;
Asn 51Thr53 fig. 1 ;
Asn57Thr59 fig. 1 ;
Asn69 fig. 1 ;
Asn69Thr71 fig. 1
Ser68Asn69 Thr71 fig
Val87Asn88Thr90 fig.
Ser87Asn88 Thr90 fig
1;
1;
1;
Ser87Asn88Gly89Thr90 fig. 1;
PL 201 754 B1
Ser87Asn88Thr90Thr92 fig. 1;
Ser87Asn88Thr90Ala162 fig. 1;
Asn69Thr71ser87Asn88Thr90 fig. 1; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 fig. 1; Asn89Ile90Thr91fig. 1;
Ser87Asn89Ile90Thr91 fig. 1;
Asn136Thr138 fig. 1;
Asn138Thr140 fig. 1;
Thr125 fig. 1 oraz
Pro124Thr125 fig. 1
Ludzkie białko erytropoetyna może także stanowić analog mający co najmniej jeden dodatkowy aminokwas na końcu karboksylowym glikoproteiny, przy czym dodatkowy aminokwas zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji, to jest glikoproteina ma sekwencję zawierającą sekwencję aminokwasów ludzkiej erytropoetyny oraz drugą sekwencję na końcu karboksylowym sekwencji ludzkiej erytropoetyny, przy czym druga sekwencja zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji.
Dodatkowy aminokwas może zawierać fragment peptydowy pochodzący z końca karboksylowego sekwencji ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej. Korzystnie glikoproteina jest analogiem wybranym z grupy obejmującej (a) ludzką erytropoetynę mającą sekwencję aminokwasów Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), przyłączoną do końca karboksylowego; (b) analog (a) zawierający ponadto Ser87 Asn88 Thr90 EPO; oraz (c) analog (a) zawierający ponadto Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
Ludzkie białko erytropoetyna może także stanowić analog o sekwencji aminokwasów obejmującej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Przegrupowanie może obejmować delecję któregokolwiek z miejsc przyłączania węglowodanu do N w ludzkiej erytropoetynie oraz addycję miejsca wiązania węglowodanu do N w pozycji 88 sekwencji aminokwasów ludzkiej erytropoetyny. Korzystnie glikoproteina jest analogiem wybranym z grupy obejmującej Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO i Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
Analogi erytropoetyny z jednym dodatkowym miejscem glikozylacji ujawniono w publikacji EP nr 640619 (Elliot), z 1 marca 1995 r.
We wzorze 1, R oznacza dowolny C1-C6-alkil, który oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 - 6 atomach węgla, taką jak metyl, etyl i izopropyl itd. Korzystnym alkilem jest metyl.
We wzorze 1, X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k - gdzie k oznacza 1-10. Korzystnie k oznacza 1-4, korzystniej k oznacza 1 lub 2. Najkorzystniej X oznacza -(CH2).
We wzorze 1, Y oznacza
Korzystnie Y oznacza
PL 201 754 B1
We wzorze 1, liczba m jest wybrana tak, że powstały koniugat o wzorze 1 wykazuje aktywność fizjologiczną porównywalną z niemodyfikowaną EPO, przy czym ta aktywność może być taka sama, wyższa lub być częścią odpowiadającej aktywności niemodyfikowanej EPO. Liczba m oznacza liczbę ugrupowań tlenku etylenu w jednostce PEG. Pojedyncza jednostka PEG (OCH2CH2)- ma masę cząsteczkową 44. Zatem masa cząsteczkowa koniugatu (bez masy cząsteczkowej EPO) zależy od liczby m.
Liczba m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900 (co odpowiada masie cząsteczkowej 20000 - 40000), korzystnie 550 - 800 (24000 - 35000), a najkorzystniej 650 - 700 (29000 - 31000).
We wzorze 1, liczba n oznacza liczbę grup ε-aminowych aminokwasu lizyny w białku erytropoetynie, kowalencyjnie związanych z jednostką PEG wiązaniem amidowym. Koniugat według wynalazku może zawierać jedną, dwie lub trzy jednostki PEG na cząsteczkę EPO. Liczba n oznacza liczbę całkowitą 1 -3, korzystnie n oznacza 1 lub 2, a najkorzystniej n oznacza 1.
Jak podano powyżej, korzystne glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorami:
w których P, R, X, m i n mają wyżej podane znaczenie.
Najkorzystniejsze glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorem:
w którym P, R, X, M i n mają wyżej podane znaczenie.
Inne korzystne glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorami:
PL 201 754 B1
w których P i n mają wyż ej podane znaczenie.
Korzystniejsze glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorem:
w którym P i n mają wyżej podane znaczenie.
Sposób wytwarzania według wynalazku glikoproteinowego produktu erytropoetynowego, wykazującego in vivo aktywność biologiczną powodującą zwiększoną produkcję retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, obejmuje następujące etapy:
(a) poddawania grupy ε-aminowej aminokwasu lizyny białka erytropoetyny o wzorze P-[NH2]n reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z dwufunkcyjnym reagentem o wzorze Z-CO-X-S-Q, z wytworzeniem związku pośredniego z wiązaniem amidowym, o wzorze:
P-[NH-CO-X-S-Q]n w którym P oznacza białko erytropoetynę bez grupy aminowej tworzącej wiązanie amidowe, n oznacza liczbę całkowitą 1-3; Z oznacza grupę reaktywną, np. ugrupowanie estru karboksylo-NHS; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k -, gdzie k oznacza 1 - 10, a Q oznacza grupę zabezpieczającą, taką jak alkanoil, np. acetyl.
(b) poddawania związku pośredniego z wiązaniem amidowym z etapu (a) reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego ze zaktywowaną pochodną poli(glikolu etylenowego) o wzorze W- [OCH2CH2]m-OR, z wytworzeniem glikoproteinowego produktu erytropoetynowego o wzorze:
m w którym W oznacza postać Y reagującą z grupą sulfhydrylową; m oznacza liczbę całkowitą w zakresie 450 - 900; R oznacza C1-C6 a Y oznacza
PL 201 754 B1
W tej postaci wynalazku dwufunkcyjnym reagentem jest korzystnie N-sukcynoimidylo-S-acetylotiopropionian lub N-sukcynoimidylo-S-acetylotiooctan, Z korzystnie oznacza N-hydroksysukcynoimid, a zaktywowana pochodna poli(glikolu etylenowego) W-[OCH2CH2]m-OR jest korzystnie wybrana z grupy obejmują cej jodo-acetylo-metoksy-PEG, metoksy-PEG-winylosulfon i metoksy-PEG-maleimid.
Sposoby ekspresji białek EPO
Ludzka erytropoetyna (EPO) jest ludzką glikoproteiną stymulującą tworzenie erytrocytów. Jej wytwarzanie i zastosowanie terapeutyczne opisano szczegółowo w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5547933 i 5621080, EP-B 0148605, Huang S.L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0205564, EP-B 0209539 i EP-B 0411678, a także w Lai P.H. i inni, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, Sasaki H. i inni, J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Erytropoetynę do zastosowań terapeutycznych można wytworzyć metodami rekombinacji (EP-B 0148605, EP-B 0209539 i Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. i inni (1986) Immunobiol. 72: 213-224). Ekspresja białek, w tym EPO, przez endogenną aktywację genów, jest dobrze znana i ujawniona, np. w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5733761, 5641670 i 5733746 oraz międzynarodowych publikacjach patentowych nr WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 i WO 91/09955.
Sposoby ekspresji i wytwarzania erytropoetyny w pożywce wolnej od surowicy opisano np. w WO 96/35718 (Burg) z 14 listopada 1996 r. i w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 513738 (Koch) z 12 czerwca 1992 r.
Sposoby oczyszczania ludzkiego białka EPO
Ponadto oprócz publikacji wymienionych powyżej wiadomo, że można przeprowadzić fermentację zrekombinowanych komórek CHO zawierających gen EPO, bez surowicy. Takie sposoby opisano np. w EP-A 0513738, EP-A 0267678 oraz w ogólnej formie w Kawamoto T. i inni Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0248656, Kowar J. i Franek F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0481791, EP-A 0307247, EP-A 0343635, WO 88/00967.
W EP-A 0267678 w celu oczyszczenia EPO wytworzonej w hodowlach bez surowicy po dializie przeprowadzono chromatografię jonowymienną na S-Sepharose, preparatywną HPLC w odwróconym układzie faz przy użyciu kolumny C8 oraz chromatografię żelową. Etap chromatografii żelowej można zastąpić chromatografią jonowymienną na S-Sepharose z szybkim przepływem. Proponuje się także przeprowadzenie chromatografii z barwnikiem przy użyciu kolumny Blue Trisacryl przed chromatografią jonowymienną.
Sposób oczyszczania zrekombinowanej EPO opisano w Nobuo, I. i inni J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Jednakże zgodnie z tym sposobem EPO poddaje się przed etapami oczyszczania działaniu roztworu Tween® 20, fluorku fenylometylosulfonylu, etylomaleimidu, pepstatyny A, siarczanu miedzi i kwasu oksamowego.
W wielu publikacjach, w tym w WO 96/35718 (Burg) z 14 listopada 1996 r., ujawniono sposób wytwarzania erytropoetyny w procesie fermentacji w pożywce wolnej od surowicy (EPOsf). Jeden ze sposobów wytwarzania EPO jako materiału wyjściowego do PEG-ilowania opisano przykładowo poniżej.
PL 201 754 B1
Test biologiczny do określania specyficznej aktywności EPO i koniugatów EPO
Specyficzną aktywność EPO lub koniugatów EPO według wynalazku można określić w różnych znanych testach. Aktywność biologiczna oczyszczonych białek EPO według wynalazku jest taka, że podanie ich pacjentowi drogą iniekcji powoduje zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów w komórkach szpiku kostnego w porównaniu z pacjentami, którym ich nie podawano, czyli z grup kontrolnych. Aktywność biologiczną białek EPO lub ich fragmentów, otrzymanych i oczyszczonych zgodnie z wynalazkiem, można zbadać metodami według Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).
Inny sposób określania aktywności białka EPO, test normocytemiczny na myszach, opisano w przykładzie 4.
Sposoby wytwarzania PEG-ilowanej EPO
Sposoby wytwarzania glikoproteinowych produktów erytropoetynowych o wzorze 1 polegają na kowalencyjnym połączeniu grup tiolowych z EPO („aktywacja) i sprzęganiu powstałej zaktywowanej EPO z pochodną poli(glikolu etylenowego) (PEG). Pierwszy etap wytwarzania PEG-ilowanej EPO według wynalazku polega na kowalencyjnym połączeniu grup tiolowych przez grupy NH2- EPO. Aktywację tę prowadzi się z użyciem dwufunkcyjnych reagentów mających zabezpieczoną grupę tiolową i dodatkową grupę reaktywną , taką jak odpowiednio aktywne ugrupowania estrów (np. estru sukcynoimidylowego), bezwodników, estrów kwasów sulfonowych, halogenków kwasów karboksylowych i kwasów sulfonowych. Grupa tiolowa jest zabezpieczona znanymi grupami, np. grupą acetylową .
Te reagenty dwufunkcyjne mogą reagować z grupami ξ-aminowymi lizyny, tworząc wiązanie amidowe. Pierwszy etap reakcji przedstawiono poniżej:
EPO, n i X mają wyżej podane znaczenie, a Z oznacza znaną reaktywną grupę, np. podstawnik N-hydroksysukcynoimidowy (NHS) o wzorze:
W korzystnej postaci wynalazku aktywację grup ε-aminowych lizyny prowadzi się drogą reakcji z dwufunkcyjnymi reagentami mającymi grupę sukcynoimidylową. Reagenty dwufunkcyjne mogą zawierać różne rodzaje łączników, np. grupę -(CH2)k - lub -CH2-(O-CH2-CH2-)]k -, gdzie k oznacza 1 - 10, korzystnie 1 - 4, korzystniej 1 lub 2, a najkorzystniej 1. Przykładami takich reagentów są N-sukcynoimidylo-S-acetylo-tiopropionian (SATP) i N-sucynoimidylo-S-acetylotioctan (SATA)
ester acetylotioalkilo-karboksylo-NHS, taki jak
PL 201 754 B1
ester 2-(acetylotio)-(etoksylowy)k-kwasu octowego-NHS, gdzie k ma wyżej podane znaczenie.
Wytwarzanie reagentów dwufunkcyjnych jest znane. Prekursory estrów NHS 2-(acetylotio)-(etoksylo)k - kwasu octowego opisano w DE-3924705, natomiast wytwarzanie pochodnych związku acetylotiolowego opisano w March J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA jest dostępny w handlu (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL).
Liczbę grup tiolowych przyłączanych do cząsteczki EPO można wybrać ustalając parametry reakcji, to jest stężenie białka (EPO) i stosunek białko/reagent dwufunkcyjny. Korzystnie EPO jest aktywowana przez kowalencyjne połączenie z 1 - 5 grupami tiolowymi na cząsteczkę EPO, korzystniej z 1,5 - 3 grupami tiolowymi na czą steczkę EPO. Zakresy te odnoszą się do statystycznego rozmieszczenia grup tiolowych w całej populacji białka EPO.
Reakcję prowadzi się np. w wodnym buforowanym roztworze, pH 6,5-8,0, np. w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, pH 7,3. Reagent dwufunkcyjny można dodać w DMSO. Po zakończeniu reakcji, korzystnie po 30 minutach, reakcję przerywa się przez dodanie lizyny. Nadmiar reagenta dwufunkcyjnego można oddzielić znanymi sposobami, np. przez dializę lub filtrację kolumnową. Średnią liczbę grup tiolowych przyłączonych do EPO można określić metodami fotometrycznymi opisanymi np. w Grasetti D. R. i Murray J. F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41 - 49 (1967).
Po powyższej reakcji prowadzi się kowalencyjne sprzęganie zaktywowanej pochodnej poli (glikolu etylenowego) (PEG). Odpowiednie pochodne PEG są zaktywowanymi cząsteczkami PEG o ś redniej masie cząsteczkowej 20000 - 40000, korzystniej 24000 - 35000, a najkorzystniej 30000.
Zaktywowane pochodne PEG są znane i opisano je np. w Morpurgo M. i inni, J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 i następne, w odniesieniu do PEG-winylosulfonu. Do wytwarzania związków o wzorze 1 nadają się PEG o łańcuchach liniowych lub rozgałęzionych. Przykłady reaktywnych reagentów PEG to jodo-acetylo-metoksy-PEG i metoksy-PEG-winylosulfon:
Stosowanie tych jodo-aktywowanych substancji jest znane w dziedzinie wynalazku i opisane, np. Hermanson G. T. w Bioconjugate Technigues, Academic Press, San Diego (1996) str. 147-148.
Najkorzystniej cząsteczki PEG aktywuje się maleimidem stosując (alkoksy-PEG-maleimid), taki jak metoksy-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Struktura alkoksy-PEG-maleimidu jest następująca:
PL 201 754 B1 gdzie R i m mają wyżej podane znaczenie. Najkorzystniejszą pochodną jest
gdzie R i m mają wyżej podane znaczenie.
Reakcja sprzęgania z alkoksy-PEG-maleimidem zachodzi po odszczepieniu in situ grupy zabezpieczającej grupę tiolową w wodnym buforowanym roztworze, np. 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. Reakcję odszczepiania grupy zabezpieczającej można prowadzić np. za pomocą hydroksyloaminy w DMSO w 25°C, pH 6,2, przez około 90 minut. Dla modyfikacji PEG molowy stosunek aktywowanego EPO/alkoksy-PEG-maleimidu powinien wynosić od około 1:3 do około 1:6, a korzystnie 1:4. Reakcję można przerwać przez dodanie cysteiny i przereagowanie pozostałych grup tiolowych (-SH) z N-metylomaleimidem lub innymi odpowiednimi związkami zdolnymi do tworzenia wiązań disulfidowych. Ze względu na reakcję jakichkolwiek pozostałych aktywnych grup tiolowych z grupami zabezpieczającymi, takimi jak ugrupowanie N-metylomaleimidu, lub inną odpowiednią grupą zabezpieczającą, glikoproteiny EPO w koniugatach według wynalazku mogą zawierać takie grupy zabezpieczające. Ogólnie w wyniku opisanej tu procedury otrzymuje się mieszaninę cząsteczek o różnej liczbie grup tiolowych zabezpieczonych przez różną liczbę grup zabezpieczających, zależnie od liczby zaktywowanych grup tiolowych glikoproteiny, które nie zostały związane z PEG-maleimidem.
N-Metylomaleimid tworzy taki sam typ wiązań kowalencyjnych gdy stosuje się go do blokowania pozostałych grup tiolowych PEG-ilowanego białka, natomiast w związkach disulfidowych będzie zachodzić wewnątrzcząsteczkowa reakcja wymiany sulfid/disulfid prowadząca do sprzęgania przez mostki disulfidowe reagenta blokującego. Korzystne reagenty blokujące dla tego typu reakcji blokowania to utleniony glutation (GSSG), cysteina i cystamina. Podczas gdy z cysteiną nie wprowadza się do PEG-ilowanego białka dodatkowego ładunku, w przypadku stosowania takich reagentów blokujących jak GSSG lub cystamina, zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni lub ujemy.
Dalsze oczyszczanie związków o wzorze 1, w tym rozdział mono-, di- i tri-PEG-ilowanych EPO, można prowadzić sposobami znanymi fachowcom, np. metodą chromatografii kolumnowej.
Środki farmaceutyczne
Glikoproteinowe produkty erytropoetynowe wytworzone zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać w postaci odpowiednich do iniekcji środków farmaceutycznych z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, ogólnie znanymi sposobami. Przykładowo odpowiednie kompozycje opisano w W097/09996, W097/40850, W098/58660 i W099/07401. Wśród korzystnych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników do formułowania środków według wynalazku można wymienić albuminę ludzkiej surowicy, białka ludzkiego osocza itd. Środki według wynalazku można formułować w 10 mM buforze, fosforanie sodu/fosforanie potasu o pH 7 zawierającym środek tonizujący, np. 132 mM chlorek sodu. Ponadto środek farmaceutyczny może zawierać środek konserwujący. Środek farmaceutyczny może zawierać różne ilości erytropoetyny, np. 10 - 1000 μg/ml, np. 50 μg lub 400 μg.
Leczenie zaburzeń krwi charakteryzujących się niskim lub zaburzonym wytwarzaniem erytrocytów
Podawanie glikoproteinowych produktów erytropoetynowych według wynalazku wywołuje tworzenie u ludzi erytrocytów. Zatem podawanie glikoproteinowych produktów erytropoetynowych uzupełnia to białko EPO, które jest istotne w wytwarzaniu erytrocytów. Środki farmaceutyczne zawierające glikoproteinowe produkty erytropoetynowe można formułować tak, by ich działanie było skuteczne przy podawaniu różnymi drogami pacjentowi cierpiącemu na zaburzenie krwi charakteryzujące się występowaniem niskiego lub zaburzonego wytwarzania erytrocytów, samodzielnie lub jako część stanu lub choroby. Kompozycje farmaceutyczne można podawać drogą iniekcji, takiej jak iniekcja podskórna lub dożylna. Średnie ilości glikoproteinowego produktu erytropoetynowego mogą różnić się i w szczególności powinny one być oparte na zaleceniach i wskazówkach doświadczonego lekarza. Dokładna ilość koniugatu zależy od obserwowanych u pacjenta takich czynników, jak dokładny typu leczonego stanu, stan leczonego pacjenta, a także od innych składników kompozycji. Przykładowo można podawać np. raz na tydzień, 0,01 - 10 μg na kg masy ciała, korzystnie 0,1 - 1 μg na kg masy ciała.
PL 201 754 B1
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, które podano tu w celu przedstawienia wytwarzania związków i kompozycji według wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Fermentacja i oczyszczanie ludzkiej EPO
a) Wytwarzanie i fermentacja materiału inokulacyjnego
Z Working Celi Bank, z fazy gazowej w zbiorniku do przechowywania w ciekłym azocie, pobrano jedną fiolkę zawierającą linię komórkową CHO produkującą EPO (można stosować ATCC CRL8695, ujawnioną w EP 411678 (Genetics Institute)). Komórki przeniesiono do szklanych butelek do wirowania i hodowano w pożywce buforowanej wodorowęglanem w inkubatorze w atmosferze wilgotnego CO2. Standardowa pożywka, wolna od surowicy, stosowana do wytwarzania i fermentacji materiału inokulacyjnego, ujawniona w europejskim zgłoszeniu patentowym 513738 (Koch), z 12 czerwca 1992 r., lub WO 96/35718 (Burg), z 14 listopada 1996 r., zawiera np. jako poż ywkę DMEM/F12 (np. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, zamówienie nr 57-736) i dodatkowo wodorowęglan sodu, L-(+)-glutaminę, D-(+)-glukozę, zrekombinowaną insulinę, selenin sodu, diaminobutan, hydrokortyzon, siarczan żelaza(II), asparaginę, kwas asparaginowy, serynę i stabilizator komórek ssaczych, taki jak np. polialkohol winylowy, metyloceluloza, polidekstran, glikol polietylenowy, Pluronic F68, środek zwiększający objętość osocza poligelinę (HEMACCEL®) lub poliwinylopirolidon (WO 96/35718).
Pod mikroskopem sprawdzono czy hodowle nie zawierają organizmów zanieczyszczających je oraz określono gęstość komórek. Testy te przeprowadzano po każdym etapie podziału.
Po okresie początkowego wzrostu hodowlę rozcieńczono świeżą pożywką do początkowej gęstości komórek i poddano jeszcze jednemu cyklowi wzrostu. Procedurę tę powtarzano do momentu otrzymania objętości około 2 litrów hodowli na każde szklane naczynie do wirowania. Po około 12 powtórzeniach uzyskano 1-5 litrów hodowli, której następnie użyto jako materiału inokulacyjnego w 10 litrowym fermentorze do inokulacji.
Po 3 - 5 dniach, hodowle z 10 litrowego fermentora można zastosować jako materiał inokulacyjny w 100 litrowym fermentorze do inokulacji.
Po dalszych 3-5 dniach hodowli, hodowle ze 100 litrowego fermentora można stosować jako materiał inokulacyjny w 1000 litrowym fermentorze produkcyjnym.
b) Zbieranie hodowli i rozdzielanie komórek
Zastosowano proces periodycznego powtórnego uzupełniania, czyli gdy hodowla osiągała wymaganą gęstość, zbierano około 80% hodowli. Pozostałą część hodowli uzupełniano świeżą pożywką i hodowano do czasu nastę pnego zbioru. Jeden etap produkcyjny sk ł adał się z maksymalnie 10 następujących po sobie zbiorów: 9 częściowych zbiorów i 1 całkowitego zbioru pod koniec fermentacji. Zbieranie wykonywano co 3 - 4 dni.
Określoną objętość zbioru przenoszono do ochłodzonego naczynia. Komórki usuwano przez wirowanie lub filtrację i odrzucano. Supernatant otrzymany po wirowaniu, zawierający EPO, kolejno sączono i zbierano w drugim ochłodzonym naczyniu. Każdy ze zbiorów podczas oczyszczania poddawano obróbce osobno.
Typowy sposób oczyszczania białka EPO ujawniono w WO 96/35718 (Burg), z 14 listopada 1996 r. Proces oczyszczania objaśniono poniżej.
a) Chromatografia na Blue Sepharose
Blue Sepharose (Pharmacia) składa się z ziaren Sepharose, które mają na powierzchni kowalencyjnie związany barwnik, błękit Cibacron. Ze względu na to, że EPO wiąże się z Blue Sepharose mocniej niż większość niebiałkowych zanieczyszczeń, niektóre zanieczyszczenia białkowe i PVA, EPO można w tym etapie wzbogacić. Elucję z kolumny Blue Sepharose prowadzi się zwiększając stężenie soli, a także pH.
Kolumnę wypełniono 80 - 100 litrami Blue Sepharose, zregenerowanej NaOH i zrównoważono buforem do równoważenia (chlorek sodu/chlorek wapnia i octan sodu). Wprowadzono zakwaszony i przesą czony supernatant fermentacyjny. Po zakoń czeniu wprowadzania kolumnę przemyto najpierw buforem podobnym do buforu równoważącego, o wyższym stężeniu chlorku sodu, a następnie buforem Tris-zasada. Produkt wyeluowano buforem Tris-zasada i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.
PL 201 754 B1
b) Chromatografia na Butyl Toyopearl
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) to złoże polistyrenowe z kowalencyjnie przyłączonymi alifatycznymi grupami butylowymi. EPO wiąże się z żelem mocniej niż większość zanieczyszczeń i PVA, tak więc należy ja eluować buforem zawierającym izopropanol.
Kolumnę wypełniono 30 - 40 litrami złoża Butyl Toyopearl 650 C, zregenerowanego NaOH, przemyto buforem Tris i równoważono buforem Tris-zasada zawierającym izopropanol.
Eluat z Blue Sepharose doprowadzono z użyciem izopropanolu do osiągnięcia jego stężenia w buforze do równoważenia kolumny i wprowadzono do kolumny. Następnie kolumnę przemyto buforem do równoważenia, o wzrastającym stężeniu izopropanolu. Produkt wyeluowano buforem do elucji (bufor Tris-zasada o dużej zawartości izopropanolu) i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.
c) Chromatografia na hydroksyapatycie Ultrogel
Hydroksyapatyt Ultrogel (Biosepra) to hydroksyapatyt włączony w matrycę agarozową dla polepszenia właściwości mechanicznych. EPO ma niskie powinowactwo do hydroksyapatytu, a zatem może być wyeluowana przy niższym stężeniu fosforanu niż inne zanieczyszczenia białkowe.
Kolumnę wypełniono 30 - 40 litrami hydroksyapatytu Ultrogel i zregenerowano buforem fosforan potasu/chlorek wapnia i NaOH, a następnie buforem Tris-zasada. Następnie kolumnę równoważono buforem Tris-zasada o niskim stężeniu izpropanolu i chlorku sodu.
Eluat z chromatografii Butyl Toyopearl zawierający EPO wprowadzono do kolumny. Następnie kolumnę przemyto buforem do równoważenia i buforem Tris-zasada z izopropanolem i chlorkiem sodu. Produkt wyeluowano buforem Tris-zasada zawierającym fosforan potasu i zebrano w jedną frakcję, zgodnie z wzorcowym profilem elucji.
d) HPLC Vydac C4 w odwróconym układzie faz
Złoże RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) składa się z cząstek żelu krzemionkowego, mających na powierzchni przyłączone łańcuchy C4-alkilowe. Oddzielanie EPO od zanieczyszczeń białkowych jest oparte na różnicach siły oddziaływań hydrofobowych. Białko eluuje się gradientowo z użyciem acetonitrylu w rozcieńczonym kwasie trifluorooctowym.
Preparatywną HPLC prowadzono z użyciem kolumny ze stali nierdzewnej (wypełnionej 2,8 - 3,2 litra żelu krzemionkowego Vydac C4). Eluat z kolumny ze złożem hydroksyapatytu Ultrogel zakwaszono dodawszy kwasu trifluorooctowego i wprowadzono do kolumny Vydac C4. Do przemywania i elucji gradientowej stosowano roztwory acetonitrylu w rozcieńczonym kwasie trifluorooctowym. Frakcje zbierano i od razu zobojętniano buforem fosforanowym. Zebrano frakcje EPO pozostające w zakresach IPC.
e) Chromatografia na DEAE Sepharose
Złoże DEAE Sepharose (Pharmacia) zawiera grupy dietyloaminoetylowe (DEAE) kowalencyjnie związane z powierzchnią ziaren Sepharose. W wiązaniu EPO z grupami DEAE biorą udział oddziaływania jonowe. Acetonitryl i kwas trifluorooctowy przepływają przez kolumnę bez zatrzymywania. Po wyeluowaniu tych substancji usuwa się śladowe zanieczyszczenia przemywając kolumnę buforem octanowym o niskim pH. Kolumnę przemywa się obojętnym buforem fosforanowym, a EPO eluuje się buforem zwiększonej sile jonowej.
Kolumnę wypełniono DEAE Sepharose do szybkiego przepływu. Objętość kolumny ustalono tak, żeby umożliwić wprowadzanie EPO w zakresie 3 - 10 mg EPO/ml żelu. Kolumnę przemyto wodą i zrównoważono buforem (fosforan sodu/fosforan potasu). Wprowadzono połączone frakcje eluatu z HPLC i kolumnę przemyto buforem do równoważenia. Następnie kolumnę przemyto buforem do przemywania (bufor z octanu sodu), po czym przemyto buforem do równoważenia. Następnie EPO wyeluowano z kolumny buforem do elucji (chlorek sodu, fosforan sodu/fosforan potasu) i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.
Eluat z kolumny DEAE Sepharose doprowadzono do określonego przewodnictwa. Otrzymany lek wyjałowiono przez przesączenie do butelek z teflonu i przechowywano w -70°C.
P r z y k ł a d 2. Kowalencyjne łączenie grup tiolowych z EPO
Przykład ten ujawnia ustalanie warunków reakcji kowalencyjnego wiązania grup tiolowych z EPO. W celu ustalenia warunków różne ilości reagentów zawierających zablokowane grupy tiolowe, w danym przypadku SATA lub SATP (rozpuszczone w DMSO, 10 mg/ml) dodano do roztworu EPO, w danym przypadku do 1 ml EPO w stężeniu 5 mg/ml, w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, pH 7,3. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez około 30 minut (25°C) i reakcję przerwano przez dodanie 1M roztworu lizyny do osiągnięcia stężenia 10 mM. Nadmiar SATA i SATP usunięto przez dializę wobec 10 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl i 2 mM EDTA, pH 6,2. Po usunięciu zabezpieczającej grupy
PL 201 754 B1 acetylowej za pomocą hydroksyloaminy, fotometrycznie określono liczbę grup tiolowych kowalencyjnie związanych z EPO za pomocą ditiodipirydyny, według metody opisanej przez Graset-ti'ego D.R. i Murray'ego J. F. w J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, str. 41-49 (1967).
Liczbę grup tiolowych kowalencyjnie związanych z cząsteczką EPO podano poniżej.
Stosunek molowy EPO:SATA lub SATP Mole grup tiolowych/mol EPO
EPO:SATA = 1:3 1,5
EPO:SATA = 1:5 2,4
EPO:SATA = 1:6 3,2
EPO:SATP = 1:3 1,3
EPO:SATP = 1:4 2,5
EPO:SATP = 1:6 3,7
P r z y k ł a d 3. Modyfikacja aktywowanej EPO metoksy-PEG-maleimidem
A) Aktywacja EPO
EPO (100 mg) wytworzoną według przykładu 1 (190000 IU/mg jak określono w normocytemicznym teście na myszach) zaktywowano z użyciem SATA (stosunek molowy: EPO/SATA = 1/5) według przykładu 2. Powstałą EPO („aktywowaną EPO) mającą kowalencyjnie przyłączone zablokowane grupy tiolowe oddzielono od produktów ubocznych, takich jak N-hydroksysukcynoimid lub nieprzereagowany SATA, drogą dializy opisanej w przykładzie 1. Otrzymano roztwór 4,5 mg/ml aktywowanej EPO w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2.
B) PEG-ilowanie aktywowanej EPO
W powyższym roztworze zawierającym 95 mg aktywowanej EPO (4,5 mg/ml w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2) rozpuszczono 380 mg metoksy-PEG-maleimidu o „najkorzystniejszej strukturze zilustrowanej powyżej (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)). Otrzymano roztwór o stosunku molowym zaktywowanej EPO do metoksy-PEGmaleimidu wynoszącym 1:4. W wyniku dodania do powyższego roztworu 1M wodnego roztworu hydroksyloaminy do stężenia 30 mM, pH 6,2, odblokowano kowalencyjnie związane zablokowane grupy tiolowe zaktywowanej EPO. Powstała zaktywowana EPO w mieszaninie reakcyjnej zawierała wolne grupy tiolowe (-SH). Po odblokowaniu grup tiolowych natychmiast zaszła reakcja sprzęgania pomiędzy zaktywowaną EPO zawierającą teraz wolne grupy tiolowe (-SH), a metoksy-PEG-maleimidem przez 90 minut (mieszanie, 25°C). Reakcję sprzęgania przerwano przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 0,2M wodnego roztworu cysteiny do stężenia 2 mM. Po 30 minutach nadmiar wolnych grup tiolowych zaktywowanej EPO, które nie przereagowały z metoksy-PEG-maleimidem, zablokowano przez dodanie 0,5M roztworu N-metylomaleimidu w DMSO do stężenia 5 mM. Po 30 minutach powstałą mieszaninę reakcyjną zawierającą teraz PEG-ilowaną EPO poddano dializie wobec 10 mM fosforanu sodu, pH 7,5, przez > 15 godzin.
C) Oczyszczanie PEG-ilowanych postacie EPO
W celu oczyszczenia PEG-ilowanych postacie EPO z mieszaniny reakcyjnej, wykonano następujące czynności: 50 ml kolumnę Q-Sepharose ff zrównoważono 10 mM fosforanem potasu, pH 7,5. Mieszaninę reakcyjną otrzymaną w etapie B) wprowadzono do kolumny (przepływ: 3 objętości kolumny (CV) na godzinę). W celu oddzielenia nieprzereagowanego reagenta metoksy-PEG-maleimidowego kolumnę przemyto 5 CV 10 mM fosforanu potasu, pH 7,5. PEG-ilowane postacie EPO rozdzielono przez przemywanie roztworami o wzrastającym gradiencie soli, zawierającymi 5 CV buforu A (10 mM fosforan potasu, pH 7,5) i 5 CV buforu B (10 mM fosforan potasu, 500 mM NaCl, pH 7,5) przy przepływie 3 CV na godzinę. W oparciu o gradient NaCl, PEG-ilowane postacie EPO (tri-, bi- i mono-PEG-ilowane EPO) zostały wyeluowane najpierw, a następnie zostały wyeluowane nie-PEG-ilowane postacie EPO. Frakcję wycieku z kolumny zawierającą PEG-ilowane postacie EPO (tri-, di- i mono-PEGilowane EPO) zebrano i przesączono (filtracja sterylizacyjna na filtrze 0,2 um).
Zawartość oraz czystość tri-, di- i mono-PEG-ilowanych postaci EPO określono na barwionych Coomassie żelach SDS-PAA (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)), a stężenia białka określono przy 280 nm, zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Pozorna masa cząsteczkowa różnych postaci EPO okrePL 201 754 B1 ślona metodą elektoforezy SDS-PAA wynosiła około 68000 (mono-PEG-ilowane postacie EPO), około 98000 (di-PEG-ilowane postacie EPO) i około 128000 (tri-PEG-ilowane postacie EPO).
Dalsze rozdzielenie tri-, di i mono-PEG-ilowanych postaci EPO można osiągnąć metodą chromatografii, np. chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek (Superdex, pg 200; Pharmacia).
Aktywność biologiczną in vivo eluatu zawierającego tri-di- i mono-PEG-ilowane postacie EPO określono według metody opisanej w przykładzie 4.
P r z y k ł a d 4. Aktywność in vivo PEG-ilowanej EPO określona w teście normocytemicznym na myszach
Biologiczny test normocytetniczny na myszach jest znany (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)), a sposób jest opisany w monografii dotyczącej erytropoetyny, Ph. Eur. BRP. Próbki rozcieńczono z użyciem BSA-PBS. Normalnym zdrowym myszom, w wieku 7-15 tygodni, podano podskórnie 0,2 ml frakcji EPO zawierającej tri-, di- albo mono-PEG-ilowaną EPO z przykładu 2. Przez okres 4 dni, zaczynając 72 godziny po podaniu, pobierano krew przez nakłucie żyły ogonowej i rozcieńczano tak, aby 1 μl krwi był obecny w 1 ml roztworu wybarwiającego z 0,15 μmol oranżu akrydynowego. Czas wybarwiania wynosił 3-10 minut. Retykulocyty policzono mikrofluorometrycznie w cytometrze przepływowym analizując histogram czerwonej fluorescencji. Ilości retykulocytów podano w postaci liczb bezwzględnych (na 30000 analizowanych komórek krwi). W przedstawionych danych każda grupa składała się z 5 myszy na dzień, i od każdej myszy pobierano krew tylko raz.
Myszom podano metoksy-PEG-maleimid sprzężony z EPO według przykładu 3, niemodyfikowaną EPO i buforowany roztwór. Wyniki przedstawiono na fig. 3. Wyniki wykazują wyższą aktywność oraz dłuższy okres półtrwania PEG-ilowanych EPO, co wskazuje znacznie podwyższona liczba retykulocytów i przesunięcie maksymalnego zliczenia retykulocytów przy użyciu takiej samej dawki na mysz.
PL 201 754 B1
Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający (A) Nazwa: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulica: 124 Grenzacherstrasse (C) Miasto: Bazylea (E) Kraj: Szwajcaria (F) Kod pocztowy (ZIP) : CH-4070 (G) Telefon: (61) 688 11 11 (H) Telefax: (61) 688 13 95 (I) Telex: 962 292 hlr ch (ii) Tytuł wynalazku: Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów (iii) Liczba sekwencji: 3 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: WORD (D) Oprogramowanie: Patentln Release 2.0 <170> Patentln Wersja 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Al 3 I Pro Pro Arę Leu £ 11* C ys Asp Ser Ί r, V Leu Glu Arg Tvr 15 LfSU
Leu Glu Ala Lys 20 Glu Ars Glu Asn 11= ~Ί-Π -r- ł Ł 2. T -i »- *s= - V Cys Ala 3 0· Glu His
Cys Ser Leu 0 Asn Glu Asr. Ile Thr Val 40 ?r c Asp Thr Lys Val Asn Phe
Tyr Ala 50 Trp Lys Arg Ker Glu 55 Val Giy Gin Gin A-i d 60 Vc 1 Glu V£l Trp
Gin 65 Gly Leu Ala Leu Leu 70 Ser Glu Ala Val Leu 7 5 Arc Gly Gin A.J. 5. 80
Leu Val Asn Ser Ser C-ln Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
90 95
Lys Ala Val Ser Gly Len Arg Ser Leu Thr Thr Leu Lec A.rg A.ls Leu ' 100 ’ 105 110
Gly Ala Gin 115 Lys Glu Ala Ile Ser 120 Pro Pro ΑΞΟ Ala Ala 125 Ser Ala Ala
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lvs Leu Phe Arg Val
130 .135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys 7.g ij. Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 150
PL 201 754 B1
Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2 Ala Pro 1 Pro Arg Leu 5 Ile Cys Asp Ser Arg 10 Val Leu Glu Arg Tyr Leu 15
Leu Glu Ala Lys 20 Glu A-l a Glu Asn Ile 25 Thr Thr Gly Cys Ala 30 Glu His
Cys Ser Leu 35 Asn Glu A.sn Ile Thr 40 Val Prc Asp Thr Lys 4 5 Vsl Asn Phe
Tyr Ala 50 Trp Lys Arg Met Glu 55 Val Gly Gin Gin Ala 60 Val Glu Val Trp
Gin 65 Gly Leu Ala Leu Leu 70 Ser Glu Ala Val Leu Arc 75 ' Gly Gin Ala Leu 60
Leu Val Asn Se- Ser 85 Gin Pro Trp Glu Pro cp. Leu Gin Leu H i. s Val Asp S 5
Lys Ala Val Ser 100 C-ly Leu Arg Ser Leu 105 Thr Thr Leu Leu Arg 110 Ala Leu
Gly Ala Gin 115 Lys Glu Ala Ile Ser 120 Pro Pro Asp Ala Ala 125 Ser Ala Ais
Pro Leu 130 Arg Thr Ile Thr Al a 135 Asp Thr Phe Arg Lys 140 Leu Phe Arg Val
Tyr 14 5 Ser As n Phe Leu .Arg 150 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr C-iy Glu Ala 160
Cys Arc Thr Gly Aso 165 Arg
<2I0> 3 <211> 2E <212> PF.T <213> Homo sapiens <400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser =ro Se- A-c 1 5 10 15 '
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Le” F-o Gir 20 25

Claims (35)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę z co najmniej jedną wolną grupą aminową, wykazującą in vivo działanie biologiczne powodujące zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi o podstawowej strukturze ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez dodanie 1-6 miejsc glikozylacji lub przez przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji, znamienny tym, że ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 3 ugrupowaniami C1-C6-alkoksy-poli(glikolu etylenowego), a każde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie związane z glikoproteiną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych,
    X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k -, k oznacza 1-10,
    Y oznacza przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 20000 - 40000, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi 51000 - 175000.
  2. 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że ma wzór:
    P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n w którym X i Y mają znaczenie podane w zastrz. 1, m oznacza 450 - 900, n oznacza 1 - 3, R oznacza C1-C6-alkil, a P oznacza glikoproteinę erytropoetynę bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązania amidowe z X.
  3. 3. Koniugat według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ma wzór:
    w którym P, R, X, m i n mają znaczenie podane w zastrz. 2.
  4. 4. Koniugat według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ma wzór:
    PL 201 754 B1 w którym P, R, X, m i n mają znaczenie podane w zastrz. 2.
  5. 5. Koniugat według zastrz. 1-4, znamienny tym, że X oznacza -(CH2)k -.
  6. 6. Koniugat według zastrz. 5, znamienny tym, że k oznacza 1 - 4.
  7. 7. Koniugat według zastrz. 1-6, znamienny tym, że X oznacza -CH2-.
  8. 8. Koniugat według zastrz. 1-7, znamienny tym, że m oznacza liczbę całkowitą 550 - 800.
  9. 9. Koniugat według zastrz. 1-8, znamienny tym, że m oznacza liczbę całkowitą 650 - 700.
  10. 10. Koniugat według zastrz. 1-9, znamienny tym, że n oznacza 1.
  11. 11. Koniugat według zastrz. 1-10, znamienny tym, że R oznacza metyl.
  12. 12. Koniugat według zastrz. 1-11, znamienny tym, że średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 24000 - 35000.
  13. 13. Koniugat według zastrz. 1-12, znamienny tym, że średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 30000.
  14. 14. Koniugat według zastrz. 1-13, znamienny tym, że glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 2 ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) zakończonymi C1-C6-alkoksylem.
  15. 15. Koniugat według zastrz. 1-14, znamienny tym, że ugrupowania poli(glikolu etylenowego) są zakończone metoksylem.
  16. 16. Koniugat według zastrz. 1-15, znamienny tym, że X oznacza -CH2-, m oznacza liczbę całkowitą 650 - 700, n oznacza 1, R oznacza metyl, a średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi 30000.
  17. 17. Koniugat według zastrz. 1-16, znamienny tym, że glikoproteina erytropoetyna jest ludzką erytropoetyną.
  18. 18. Koniugat według zastrz. 1-17, znamienny tym, że glikoproteina erytropoetyna jest eksprymowana przez endogenną aktywację genów.
  19. 19. Koniugat według zastrz. 1-18, znamienny tym, że glikoproteina erytropoetyna ma sekwencję SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
  20. 20. Koniugat według zastrz. 19, znamienny tym, że glikoproteina erytropoetyna ma sekwencję SEQ ID NO: 1.
  21. 21. Koniugat według zastrz. 1-16, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1-6 miejsc glikozylacji.
  22. 22. Koniugat według zastrz. 1-6, 8 albo 10, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez modyfikację wybraną z grupy obejmującej:
    Asn30Thr32;
    Asn 51Thr53,
    Asn57Thr59;
    Asn69;
    Asn69;Thr71;
    Ser68Asn69Thr71;
    Val87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Gly89Thr90.
    Ser87Asn88Thr90Thr92;
    Ser87Asn88Thr90Ala162.
    Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
    Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
    Asn89Ile90Thr91;
    Ser87Asn89Ile90Thr91;
    Asn 136Thr138;
    Asn 138Thr140;
    Thr125; oraz Pro 124Thr125.
  23. 23. Koniugat według zastrz. 1-22, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję zawierającą sekwencję ludzkiej erytropoetyny oraz drugą sekwencję na końcu karboksylowym sekwencji ludzkiej erytropoetyny, przy czym ta druga sekwencja zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji.
  24. 24. Koniugat według zastrz. 23, znamienny tym, że druga sekwencja stanowi sekwencję pochodzącą z końca karboksylowego sekwencji ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.
    PL 201 754 B1
  25. 25. Koniugat według zastrz. 24, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję wybraną z grupy obejmują cej:
    (a) ludzką erytropoetynę mającą sekwencję aminokwasów Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), przyłączoną do końca karboksylowego;
    87 88 90 (b) sekwencję (a) zmodyfikowaną przez Ser87 Asn88 Thr90; oraz (c) sekwencję (a) zmodyfikowaną przez Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90.
  26. 26. Koniugat według zastrz. 1-16, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji.
  27. 27. Koniugat według zastrz. 25, znamienny tym, że przegrupowanie obejmuje delecję któregokolwiek z miejsc przyłączania węglowodanu do N w ludzkiej erytropoetynie oraz addycję miejsca przyłączania węglowodanu do N w pozycji 88 sekwencji aminokwasów ludzkiej erytropoetyny.
  28. 28. Koniugat według zastrz. 14, znamienny tym, że glikoproteina ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez modyfikację wybraną z grupy obejmującej:
    Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO;
    Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; oraz
    Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
  29. 29. Kompozycja koniugatów, znamienna tym, że zawiera koniugaty zdefiniowane w zastrz. 1-28, przy czym udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 90%.
  30. 30. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 92%.
  31. 31. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 96%.
  32. 32. Kompozycja według zastrz. 29 albo 31, znamienna tym, że udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi 90 - 96%.
  33. 33. Środek farmaceutyczny zawierający koniugat lub kompozycję koniugatów, oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, znamienny tym, że zawiera koniugat zdefiniowany w zastrz. 1-28 lub kompozycję koniugatów zdefiniowaną w zastrz. 29 -32.
  34. 34. Zastosowanie koniugatu zdefiniowanego w zastrz. 1 - 28 lub kompozycji koniugatów zdefiniowanej w zastrz. 29 - 32, do wytwarzania leków do leczenia lub profilaktyki chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS i do leczenia pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii.
  35. 35. Sposób wytwarzania koniugatu zdefiniowanego w zastrz. 1 - 28 lub kompozycji koniugatów zdefiniowanej w zastrz. 29 - 32, znamienny tym, że kowalencyjnie łączy się grupy tiolowe z glikoproteiną erytropoetyną i powstałą zaktywowaną glikopropteinę erytropoetynę sprzęga się z pochodną poli(glikolu etylenowego) (PEG).
PL356065A 1999-07-02 2000-06-28 Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów PL201754B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14224399P 1999-07-02 1999-07-02
US14745299P 1999-08-05 1999-08-05
US15145499P 1999-08-30 1999-08-30
PCT/EP2000/006009 WO2001002017A2 (en) 1999-07-02 2000-06-28 Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL356065A1 PL356065A1 (pl) 2004-06-14
PL201754B1 true PL201754B1 (pl) 2009-05-29

Family

ID=27385779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL356065A PL201754B1 (pl) 1999-07-02 2000-06-28 Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów

Country Status (33)

Country Link
US (1) US6340742B1 (pl)
EP (1) EP1196443B1 (pl)
JP (1) JP4190184B2 (pl)
KR (1) KR100510624B1 (pl)
CN (1) CN1194014C (pl)
AR (1) AR024879A1 (pl)
AT (1) ATE267840T1 (pl)
AU (1) AU768452B2 (pl)
BR (1) BRPI0012138B8 (pl)
CA (1) CA2378533C (pl)
CO (1) CO5180621A1 (pl)
CZ (1) CZ301833B6 (pl)
DE (1) DE60011087T2 (pl)
DK (1) DK1196443T3 (pl)
ES (1) ES2220501T3 (pl)
GC (1) GC0000196A (pl)
HK (1) HK1047597B (pl)
HR (1) HRP20010966B1 (pl)
HU (1) HU228478B1 (pl)
IL (2) IL146956A0 (pl)
JO (1) JO2291B1 (pl)
MA (1) MA26806A1 (pl)
MX (1) MXPA01012974A (pl)
MY (1) MY126776A (pl)
NO (1) NO20016304L (pl)
NZ (1) NZ516170A (pl)
PE (1) PE20010288A1 (pl)
PL (1) PL201754B1 (pl)
PT (1) PT1196443E (pl)
RS (1) RS50117B (pl)
TR (1) TR200103782T2 (pl)
TW (1) TWI266637B (pl)
WO (1) WO2001002017A2 (pl)

Families Citing this family (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
ES2267263T3 (es) * 1998-04-15 2007-03-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.
US7304150B1 (en) * 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US6958212B1 (en) 1999-02-01 2005-10-25 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
DK1181323T3 (da) 1999-02-01 2011-10-17 Eidgenoess Tech Hochschule Biomaterialer dannet med nukleofil additionsreaktion med konjugerede uimættede grupper
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
HUP0204475A2 (en) * 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ME00673B (me) * 2000-05-15 2011-12-20 Hoffmann La Roche Nova farmaceutska smjesa
MXPA02011891A (es) * 2000-06-02 2004-04-02 Eidgenoess Tech Hochschule Reacciones de adicion conjugadas para la entrega controlada de compuestos farmaceuticamente activos.
US7291673B2 (en) 2000-06-02 2007-11-06 Eidgenossiche Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
KR20030064275A (ko) * 2000-06-29 2003-07-31 메르크 파텐트 게엠베하 면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강
WO2002032957A1 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
WO2002055185A2 (en) 2000-10-19 2002-07-18 Eidgenoess Tech Hochschule Block copolymers for multifunctional self-assembled systems
EP1342730B1 (en) * 2000-12-11 2006-03-15 Cheil Jedang Corporation Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
KR101229995B1 (ko) * 2000-12-11 2013-02-06 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
AU2002233230B2 (en) 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
EP1345628B1 (en) * 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
RU2003129528A (ru) * 2001-03-07 2005-04-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1383785B1 (en) 2001-05-03 2011-03-16 Merck Patent GmbH Recombinant tumor specific antibody and use thereof
WO2002097038A2 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine beta-1 fusion proteins
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
ES2411007T3 (es) * 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
KR100467751B1 (ko) * 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100480423B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 에리트로포이에틴과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
DK1454138T3 (da) * 2001-12-04 2012-02-13 Merck Patent Gmbh Immunocytokiner med moduleret selektivitet
DK2298301T3 (en) * 2001-12-06 2018-10-01 Fibrogen Inc MEDICINALS FOR TREATMENT OF ANEMIA ASSOCIATED WITH Kidney Disease
WO2003059934A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003055526A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2002364586A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Delta Biotechnology Limited Albumin fusion proteins
US7300915B2 (en) 2002-06-05 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain
WO2004013165A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated t1249 polypeptide
ATE344289T1 (de) * 2002-07-24 2006-11-15 Hoffmann La Roche Polyethylenglykol-aldehydderivate
HRP20050024A2 (en) * 2002-07-24 2006-02-28 F. Hoffmann - La Roche Ag Pegylated t20 polypeptide
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
WO2005025606A1 (en) * 2003-09-09 2005-03-24 Warren Pharmaceuticals, Inc. Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
WO2004022577A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Warren Pharmaceuticals, Inc. Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
WO2004055056A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
GEP20084487B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof
JP5207590B2 (ja) * 2002-12-26 2013-06-12 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 増強された生物学的能力を有するインターフェロン−βのポリマー結合体
EP1616003A4 (en) * 2002-12-30 2007-06-20 Gryphon Therapeutics Inc WATER-SOLUBLE THIOESTER AND SELENOESTER COMPOUNDS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
JP4490369B2 (ja) 2002-12-31 2010-06-23 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション マレアミド酸ポリマー誘導体及びこれらの生物学的複合体
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
NZ542873A (en) * 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
NZ542094A (en) 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
US7587286B2 (en) * 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
PL1615945T3 (pl) * 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
JP2007523630A (ja) 2003-05-09 2007-08-23 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド ヒト成長ホルモングリコシル化突然変異体の組成と調合法
US7919118B2 (en) * 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
ATE428727T1 (de) 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
CN1820024B (zh) * 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
AU2004238868B2 (en) * 2003-05-12 2010-01-21 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
CA2527665A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Centocor, Inc. Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase
EP1491554A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-29 CONARIS research institute AG PEGylated soluble gp130-dimers useful as a medicament
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
WO2005032467A2 (en) * 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
EP1675871A2 (en) 2003-10-10 2006-07-05 Xencor Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2383300T3 (es) * 2003-11-13 2012-06-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Fragmento Fc de IgG para un vehículo de fármacos y procedimiento para su preparación
US7842661B2 (en) 2003-11-24 2010-11-30 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin formulations
EP1694347B1 (en) * 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
WO2005058366A2 (en) * 2003-12-10 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates
SI1696947T1 (sl) * 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
ATE469654T1 (de) 2003-12-30 2010-06-15 Augustinus Bader Verwendung des erythropoietins zur regeneration von lebergewebe
RU2370276C2 (ru) * 2003-12-31 2009-10-20 Мерк Патент Гмбх Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
ZA200606225B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
CA2563874A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Cambridge Antibody Technology Limited Erythropoietin protein variants
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
BRPI0518025A (pt) * 2004-11-10 2008-10-28 Aplagen Gmbh moléculas que promovem hematopoiese
US7589063B2 (en) * 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US7714114B2 (en) 2005-02-16 2010-05-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an EPO moiety and a polymer
WO2006121569A2 (en) * 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP2385061A3 (en) * 2005-05-10 2012-02-22 Neoloch Aps Neuritogenic peptides
US9988427B2 (en) 2005-05-13 2018-06-05 Charite Universitaetsmedizen-Berlin Erythropoietin variants
EP2975135A1 (en) 2005-05-25 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2007008300A2 (en) 2005-05-31 2007-01-18 ECOLE POLYTECHNIQUE FéDéRALE DE LAUSANNE Triblock copolymers for cytoplasmic delivery of gene-based drugs
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2006136450A2 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Aplagen Gmbh Supravalent compounds
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP5198747B2 (ja) * 2005-08-31 2013-05-15 株式会社カネカ ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法
EP1929860A4 (en) * 2005-08-31 2010-12-29 Kaneka Corp TRANSGENER BIRD WITH FREMDGEN CONTAINS A SEQUENCE CODING FOR A PROTEIN DERIVED FROM THE CAT, AND METHOD FOR ITS MANUFACTURE
AU2006304856A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Synageva Biopharma Corp. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US7553941B2 (en) 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8304386B2 (en) * 2006-02-03 2012-11-06 Prolor Biotech, Inc. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
EP2049144B8 (en) * 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
PL2054074T3 (pl) * 2006-08-04 2015-03-31 Prolong Pharmaceuticals Llc Zmodyfikowana erytropoetyna
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As PROCESS FOR CLEANING POLYPEPTIDE CONJUGATES
ES2655734T3 (es) * 2006-10-04 2018-02-21 Novo Nordisk A/S Glicopéptidos y azúcares pegilados unidos a glicerol
US20080083154A1 (en) * 2006-10-05 2008-04-10 Timothy M Gregory Bait retention fish hook
WO2008057537A2 (en) * 2006-11-08 2008-05-15 Maine Medical Center Research System and method for identifying erythropoietin-responsive genes
WO2008058942A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Charite - Universitätsmedezin Berlin Method of cell culture and method of treatment comprising a vepo protein variant
HRP20130382T1 (hr) * 2007-04-03 2013-05-31 Biogenerix Ag Postupci lijeäśenja pomoä†u glikopegiliranog g-csf
CA2690611C (en) 2007-06-12 2015-12-08 Novo Nordisk A/S Improved process for the production of nucleotide sugars
EP2018835B1 (de) 2007-07-09 2014-03-05 Augustinus Bader Wirkstoff abgebendes Pflaster
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
CL2008002092A1 (es) 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
CN101381412B (zh) * 2007-09-30 2012-02-22 深圳赛保尔生物药业有限公司 聚合物/重组人促红素偶联物
CN101455844B (zh) * 2007-12-10 2011-09-14 江苏豪森药业股份有限公司 聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物和其制备方法与用途
CA2711503A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
JP5514736B2 (ja) 2008-01-11 2014-06-04 セリナ・セラピユーテイツクス・インコーポレーテツド ポリオキサゾリン共重合体の多機能形態およびそれを含む薬物組成物
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
PL2257311T3 (pl) 2008-02-27 2014-09-30 Novo Nordisk As Koniugaty cząsteczek czynnika VIII
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
KR20130116386A (ko) 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
MX344559B (es) 2008-04-29 2016-12-20 Ascendis Pharma As Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante unidos al peg.
EP2161031A1 (en) 2008-09-05 2010-03-10 SuppreMol GmbH Fc gamma receptor for the treatment of B cell mediated multiple sclerosis
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
US9271929B2 (en) 2008-11-25 2016-03-01 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Block copolymers and uses thereof
EA022752B1 (ru) 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
GB0922354D0 (en) 2009-12-21 2010-02-03 Polytherics Ltd Novel polymer conjugates
CA2755336C (en) 2009-03-20 2015-07-14 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
HUE028832T2 (en) 2009-09-17 2017-01-30 Baxalta Inc Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, as well as a process for its preparation
MX337432B (es) 2009-12-15 2016-03-04 Ascendis Pharma As Composicion de la hormona del crecimiento seca enlazada transitoriamente a un portador del polimero.
WO2012003960A1 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for the treatment of eye disorders and injuries
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
CN103118708B (zh) 2010-09-14 2015-08-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法
MX360946B (es) 2010-09-22 2018-10-29 Amgen Inc Star Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
CN102453087B (zh) * 2010-10-22 2013-12-25 广东赛保尔生物医药技术有限公司 一种单取代peg-epo的纯化及制备方法
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CA2839512C (en) 2011-06-17 2018-01-02 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan-degrading enzyme
WO2013040501A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
WO2013102144A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof
CN108686203A (zh) 2012-04-04 2018-10-23 哈洛齐梅公司 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
HK1207564A1 (en) 2012-04-19 2016-02-05 Opko Biologics Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
HUE055348T2 (hu) 2012-11-20 2021-11-29 Opko Biologics Ltd Eljárás polipeptidek hidrodinamikus térfogatának növelésére gonadotropin karboxil-terminális peptidekhez való kapcsolással
EP2740805B1 (en) 2012-12-07 2019-02-20 SuppreMol GmbH Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
WO2015013510A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Epfl High aspect ratio nanofibril materials
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
PT3186281T (pt) 2014-08-28 2019-07-10 Halozyme Inc Terapia de combinação com uma enzima de degradação de hialuronano e um inibidor de pontos de verificação imunológica
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
SG11201703870UA (en) 2014-11-18 2017-06-29 Ascendis Pharma Endocrinology Div As Novel polymeric hgh prodrugs
PT3220892T (pt) 2014-11-21 2021-11-05 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Formas de dosagem de hormona do crescimento de longa ação
EP3230309B1 (en) 2014-12-10 2023-03-29 OPKO Biologics Ltd. Methods of producing long acting ctp-modified growth hormone polypeptides
PL3310347T3 (pl) 2015-06-19 2021-12-27 Opko Biologics Ltd. Długo działające czynniki krzepnięcia i sposoby wytwarzania
JP6937773B2 (ja) 2016-03-07 2021-09-22 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド ポリエチレングリコール誘導体及びその用途
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
MY206271A (en) 2016-07-11 2024-12-06 Opko Biologics Ltd Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same
KR102470282B1 (ko) 2016-07-15 2022-11-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
WO2018132768A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Sanna Pietro P Methods and compositions for treating hpa hyperactivity
KR102268647B1 (ko) 2017-06-12 2021-06-23 한국코러스 주식회사 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법
CA3177086A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
US20200362002A1 (en) * 2017-12-29 2020-11-19 Hoffmann-La Roche Inc. Process for providing pegylated protein composition
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CA3123872A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Catalyst Biosciences, Inc. Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CN111375068B (zh) * 2018-12-29 2024-04-16 江苏豪森药业集团有限公司 聚乙二醇化多肽药物的制备方法
AU2020233198B2 (en) 2019-03-04 2025-05-15 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin
EP3950703A4 (en) * 2019-03-29 2023-01-04 NOF Corporation Branched degradable polyethylene glycol binder
US20230331798A1 (en) * 2020-09-22 2023-10-19 Jecho Laboratories, Inc. Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof
WO2025227129A2 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Starrock Pharma Llc Delivery vehicles comprising proglucagon derived polypeptides and anabolic polypeptides and uses thereof
US20250341516A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 BioLegend, Inc. Compositions for use with multiple fluorophores and methods of using

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
JP2520681B2 (ja) 1986-08-04 1996-07-31 ザ ユニバーシティ オブ ニュー サウス ウェールズ 生合成のヒトの成長ホルモン製品
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
EP0343635B1 (en) 1988-05-25 1994-08-24 Teijin Limited Process for continuously culturing adherent animal cells
US6225449B1 (en) * 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions
DE3924705A1 (de) 1989-07-26 1991-01-31 Boehringer Mannheim Gmbh Heterobifunktionelle verbindungen
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5674534A (en) 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
ATE214940T1 (de) 1993-11-10 2002-04-15 Enzon Inc Verbesserte interferon-polymerkonjugate
DE69521880T2 (de) 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc., Thousand Oaks Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
ES2093593T1 (es) 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
IL118201A (en) 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof
US6025324A (en) 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions

Also Published As

Publication number Publication date
AR024879A1 (es) 2002-10-30
DE60011087T2 (de) 2005-06-16
GC0000196A (en) 2006-03-29
WO2001002017A2 (en) 2001-01-11
HK1047597A1 (en) 2003-02-28
IL146956A (en) 2006-10-31
BR0012138A (pt) 2002-05-07
TWI266637B (en) 2006-11-21
PL356065A1 (pl) 2004-06-14
NO20016304L (no) 2002-02-19
EP1196443B1 (en) 2004-05-26
CO5180621A1 (es) 2002-07-30
CA2378533C (en) 2006-02-14
HRP20010966B1 (en) 2006-02-28
ES2220501T3 (es) 2004-12-16
JP4190184B2 (ja) 2008-12-03
EP1196443A2 (en) 2002-04-17
CN1359392A (zh) 2002-07-17
CN1194014C (zh) 2005-03-23
CZ20014682A3 (cs) 2002-11-13
PT1196443E (pt) 2004-09-30
BRPI0012138B1 (pt) 2015-09-15
NO20016304D0 (no) 2001-12-21
JP2003503464A (ja) 2003-01-28
HUP0201971A2 (en) 2002-09-28
CA2378533A1 (en) 2001-01-11
AU768452B2 (en) 2003-12-11
IL146956A0 (en) 2002-08-14
ATE267840T1 (de) 2004-06-15
MA26806A1 (fr) 2004-12-20
TR200103782T2 (tr) 2002-05-21
DK1196443T3 (da) 2004-10-04
BRPI0012138B8 (pt) 2021-05-25
PE20010288A1 (es) 2001-03-07
RS50117B (sr) 2009-03-25
HRP20010966A2 (en) 2005-02-28
HU228478B1 (en) 2013-03-28
DE60011087D1 (de) 2004-07-01
HK1047597B (zh) 2005-08-12
NZ516170A (en) 2004-02-27
CZ301833B6 (cs) 2010-07-07
KR100510624B1 (ko) 2005-08-31
US6340742B1 (en) 2002-01-22
MY126776A (en) 2006-10-31
KR20020026514A (ko) 2002-04-10
YU89901A (sh) 2004-05-12
JO2291B1 (en) 2005-09-12
WO2001002017A3 (en) 2001-08-09
HUP0201971A3 (en) 2010-01-28
AU6429900A (en) 2001-01-22
MXPA01012974A (es) 2002-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1196443B1 (en) Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol
US6583272B1 (en) Erythropoietin conjugates
EP1432802B1 (en) Pegylated and diglycosylated erythropoietin
RU2232163C2 (ru) Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20110628