BR122012024318A2 - Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos - Google Patents

Abstract

polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos. a presente invenção provê polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos.

Description

“POLIPEPTÍDEOS MODIFICADOS DE ERITROPOETINA ANIMAL E SEUS USOS” (Pedido dividido do PI 0919403-7, depositado em 25/09/2009)

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se a polipeptídeos modificados de eritropoetina felina, canina e equina com pelo menos um aminoácido não codificado naturalmente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A família supergene do hormônio de crescimento (GH) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991); Mott, H. R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N. (1996) Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors) representa um conjunto de proteínas com características estruturais semelhantes. Embora existam ainda mais membros da família que não foram identificados até agora, alguns destes incluem os seguintes: hormônio de crescimento, prolactina, lactogênio placentário, eritropoetina (EPO), trombopoetina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibidor de leucemia, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interferon ômega, interferon tau, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) (a família supergene GH). Membros da família supergene GH possuem estruturas secundárias e terciárias semelhantes, apesar do fato de sua identidade de sequência de aminoácidos ou de DNA ser limitada. Os atributos estruturais compartilhados permitem que novos membros da família de genes sejam identificados.

Um membro da família supergene GH é a eritropoetina felina (fEPO). A eritropoetina (EPO) natural é um hormônio glicoprotéico com peso molecular de 34 quiloDaltons (kDa) que é produzido nos rins e fígado de mamíferos. A EPO é um componente essencial na eritropoiese, induzindo a proliferação e a diferenciação de progenitores de hemácias. A atividade da EPO está associada também com a ativação de alguns genes eritróide-específos, incluindo globina e anidrase carbônica. Consultar, por exemplo, Bondurant et al., Mol. Cell Biol. 5:675-683 (1985); Koury et al., J. Cell. Physiol. 126: 259-265 (1986).

O receptor de eritropoetina (EpoR) faz parte da família de receptores hematopoiéticos/citocinas/fator de crescimento, a qual inclui diversos outros receptores de fator de crescimento, tais como os receptores de interleucina (IL)-3, 4 e 6, o receptor do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), bem como os receptores de prolactina e do hormônio de crescimento. Consultar, Bazan, Proc. Natl. Acad. Sei USA 87: 6934-6938 (1990). Membros da família de receptores de citocinas contêm quatro resíduos conservados de cisteína e um motivo triptofano-serina-X-triptofano-serina posicionados nos arredores da região transmembrana. Acredita-se que as sequências conservadas estejam envolvidas em

2/238 interações proteína-proteína. Consultar, por exemplo, Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992).

A Patente U.S. Nos. 5 441 868, 5 547 933, 5 618 698 e 5 621 080 descrevem sequências de DNA que codificam EPO humana e o polipeptídeo purificado e isolado com parte ou toda a conformação estrutural primária e as propriedades biológicas da EPO natural.

Os efeitos biológicos da EPO derivam de sua interação com receptores celulares específicos. A interação entre EPO e o domínio extracelular de seu receptor (EPObp) é bem entendida. Dados obtidos por cristalografia de raios-x de alta resolução demonstraram que a EPO possui dois sítios de ligação a receptor e que liga em sequência duas moléculas do receptor usando sítios distintos na molécula. Os dois sítios de ligação a receptor são referidos como Sítio I e Sítio II. O Sítio I inclui a extremidade carbóxi terminal da hélice D e partes da hélice A e da alça A-B, enquanto que o Sítio II engloba a região amino terminal da hélice A e uma porção da hélice C. A ligação de EPO ao seu receptor ocorre em sequência, sendo a primeira ligação ao Sítio I. O Sítio II envolve então um segundo receptor de EPO, resultando em dimerização do receptor e ativação de vias intracelulares de sinalização que levam a respostas celulares ao hormônio.

EPO humana recombinante é utilizada como agente terapêutico e foi aprovada para o tratamento de pacientes humanos. A deficiência de EPO leva à anemia, por exemplo, cujo tratamento tem sido bem sucedido por administração exógena do hormônio.

Anemias podem ser divididas amplamente em duas categorias: regenerativa e não regenerativa. Anemias regenerativas tendem a ser causadas pela perda de sangue ou são resultantes da destruição celular de hemácias pelo sistema imune. Anemias não regenerativas, por outro lado, são aquelas nas quais a medula óssea não responde ou não consegue responder à anemia. Uma causa comum de anemia é a insuficiência renal crônica (CRF), sendo a maioria dos demais casos decorrentes de infecção pelo vírus da leucemia felina (FeLV). Esses dois transtornos representam a primeira (FeLV) e a segunda (CRF) causa de morte em gatos domésticos. hEPO foi utilizada no tratamento de anemia felina. Infelizmente, existem motivos de preocupação no que diz respeito à imunogenicidade quando se usa hEPO para tratar anemia felina, e em torno de 25% a 33% de gatos tratados com hEPO desenvolveram aplasia de hemácias (RCA). Estudos foram realizados, incluindo um estudo de 11 gatos e 6 cachorros com CRF tratados com hEPO recombinante, e embora tenha sido demonstrada certa capacidade para aumentar as contagens de hemácias (RBC) e de reticulócitos, 5/11 gatos desenvolveram anticorpo anti-r-hEPO (LD Cowgill, et al., J Am Vet Med Assoe. 1998 Feb 15;212(4):521 -8). Um estudo sobre a segurança e a eficácia de eritropoetina felina recombinante (rfEPO) foi realizado com 26 submetidos ao teste e constatou que, embora novamente as contagens de RBC e de reticulócitos tenham se elevado, oito dos 26 gatos (ou seja, mais de 30%) desenvolveram anticorpos anti-r-fEPO (JE Randolph, et al.,

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Am J Vet Res. 2004 Oct;65(10):1355-66). Em outro estudo, um vetor do sorotipo 2 do vírus adenoassociado recombinante (rAAV2), contendo cDNA de eritropoetina felina, foi administrado a um grupo do estudo formado por 10 gatos, tendo sido constatado que anticorpos contra rAAV2 foram detectados em todos os gatos tratados com o vetor, um gato sofreu de aplasia pura de RBC e que gatos tratados com quantidades menores não exibiram qualquer efeito (MC Walker, et al., Am J Vet Res. 2005 Mar;66(3):450-6).

A ligação covalente ao polímero hidrofílico poli(etilenoglicol), abreviado PEG, é um método para aumentar solubilidade em água, biodisponibilidade, aumentar a meia-vida no soro, modular imunogenicidade, modular atividade biológica ou ampliar o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos e, especialmente, moléculas hidrofóbicas. O uso de PEG tem sido amplo em substâncias farmacêuticas, sobre implantes artificiais e em outras aplicações em que biocompatibilidade, ausência de toxicidade e ausência de imunogenicidade são de importância. A fim de maximizar as propriedades desejadas de PEG, o peso molecular total e o estado de hidratação do polímero ou polímeros de PEG ligados à molécula biologicamente ativa precisam ser suficientemente altos para transmitir as características vantajosas tipicamente associadas com ligação a polímero PEG, tais como maior solubilidade em água e meia-vida circulante, ao mesmo tempo em que sem afetar desfavoravelmente a bioatividade da molécula precursora.

Derivados de PEG são frequentemente ligados a moléculas biologicamente ativas por meio de funcionalidades químicas reativas, tais como resíduos de lisina, cisteína, os grupos N-terminal e carboidratos. O número de sítios reativos disponíveis para ligação a polímeros de proteínas e outras moléculas é muitas vezes limitado. Com frequência, os sítios mais adequados para modificação por ligação a polímero participam de modo significativo na ligação ao receptor e são necessários para que a atividade biológica da molécula seja retida. Como resultado, a ligação indiscriminada de cadeias poliméricas a estes sítios reativos muitas vezes leva a uma redução significativa ou mesmo perda total da atividade biológica da molécula modificada pelo polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Abordagens empregadas pelo estado da técnica anterior para formação de conjugados com peso molecular suficiente para transmitir as vantagens desejadas a uma molécula-alvo têm envolvido tipicamente a ligação aleatória de inúmeros braços de polímeros à molécula, aumentando com isso o risco de redução ou mesmo perda total em bioatividade da molécula precursora.

Sítios reativos que formam o lócus para ligação de derivados de PEG a proteínas são ditados pela estrutura da proteína. Proteínas, incluindo enzimas, são construídas a partir de várias sequências de alfa-aminoácidos com a estrutura geral H₂N-CHR-COOH. O grupo alfa-amino (H₂N--) de um aminoácido une-se ao grupo carboxila (-COOH) de um aminoácido adjacente para formar ligações amida, as quais podem ser representadas como -(NH-4/238

CHR--CO)ⁿ em que o “n” subscrito pode equivaler a centenas ou milhares. O fragmento representado por R pode conter sítios reativos para atividade biológica da proteína e para ligação de derivados de PEG.

Por exemplo, no caso do aminoácido lisina, existe um grupo -NH₂ na posição epsilon, bem como na posição alfa. O -NH₂ de epsilon está livre para reagir sob condições de pH básico. Muito do estado da técnica no campo de derivação protéica com PEG tem sido direcionado para desenvolver derivados de PEG que se ligam ao grupo -NH₂ epsilon de resíduos de lisina presentes em proteínas. “Polietileno Glicol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Estes derivados de PEG possuem, todos eles, a limitação em comum, no entanto, de que não podem ser instalados seletivamente entre os frequentemente inúmeros resíduos de lisina, presentes sobre as superfícies de proteínas. Esta limitação pode ser relevante em situações nas quais um resíduo de lisina é importante para a atividade da proteína, existente em um sítio enzimático ativo, por exemplo, ou em casos nos quais um resíduo de lisina contribui para mediação da interação da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso de sítios de ligação a receptores.

Uma segunda e igualmente importante complicação de métodos existentes para PEGuilação de proteínas é a de que os derivados de PEG podem sofrer reações colaterais indesejadas com outros resíduos diferentes daqueles desejados. Histidina contém um grupo imino reativo, representado estruturalmente como --N(H)--, porém muitos derivados que reagem com -NH₂ epsilon podem reagir também com --N(H)--. Igualmente, a cadeia lateral do aminoácido cisteína carreia um grupo sulfidrila livre, representado estruturalmente por-SH. Em algumas situações, os derivados PEG direcionados para o grupo --NH₂ epsilon de lisina reagem também com cisteína, histidina ou outros resíduos. Dessa forma, podem ser criadas misturas heterogêneas complexas de moléculas bioativas com derivação PEG, além de haver riscos de destruir a atividade da molécula bioativa selecionada como alvo. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitissem a introdução de um grupo químico funcional em um único sítio dentro da proteína que possibilitasse, então, o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à molécula bioativa em sítios específicos sobre a superfície protéica que fosse bem definido e previsível.

Além de resíduos de lisina, esforços consideráveis no estado da técnica têm sido direcionados para o desenvolvimento de reagentes PEG ativados que tenham como alvo cadeias de outros aminoácidos, incluindo cisteína, histidina e o N-terminal. Patente U.S. N° 6 610281. “Polietileno Glicol and Derivatives for Advanced PEGylation, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido seletivamente em sítio na estrutura de proteínas empregando técnicas de mutagênese sítio-dirigida e outras conhecidas no estado da técnica, e o grupo sulfidrila livre resultante pode ser reagido

5/238 com derivados de PEG que carreiam grupos reativos com função tiol. Essa abordagem, no entanto, é complicada em que a introdução de grupo sulfidrila livre pode dificultar a expressão, enovelamento e estabilidade da proteína resultante. Por conseguinte, seria desejável contar com meios para introduzir um grupo químico funcional em moléculas bioativas que possibilitasse o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG, ao mesmo tempo em que sendo simultaneamente compatível (ou seja, não se envolvendo em reações colaterais indesejadas) com sulfidrilas e outros grupos químicos funcionais tipicamente encontrados em proteínas.

Como pode ser visto a partir de uma amostragem do estado da técnica, a síntese e o uso de muitos destes derivados que foram desenvolvidos para ligação às cadeias laterais de proteínas, em especial, o grupo -- NH₂ na cadeia lateral do aminoácido lisina e o grupo SH na cadeia lateral de cisteína, provaram ser problemáticas. Alguns formam ligações instáveis com a proteína que estão sujeitas à hidrólise e, portanto, se decompõem, degradam ou, de outra forma, são instáveis em meios aquosos como, por exemplo, a corrente sanguínea. Alguns formam ligações mais estáveis, porém estão sujeitos à hidrólise antes que a ligação seja formada, o que significa que o grupo reativo no derivado de PEG pode ser inativado antes que a proteína possa ser ligada. Alguns são um pouco tóxicos e, portanto, menos adequados para uso in vivo. Outros são muito lentos para reagirem e serem praticamente úteis. Outros resultam em perda de atividade protéica ao se ligarem a sítios responsáveis pela atividade da proteína. Alguns não são específicos para os sítios aos quais irão se ligar, o que pode resultar também em perda de atividade desejável e ausência de reprodutibilidade de resultados. A fim superar os desafios associados com modificar proteínas com grupos poli(etilenoglicol), foram desenvolvidos derivados de PEG mais estáveis (por exemplo, Patente U.S. 6 602 498) ou que reagem seletivamente com grupos tiol em moléculas e superfícies (por exemplo, Patente U.S. 6 610 281). Existe claramente necessidade no estado da técnica por derivados de PEG que sejam clinicamente inertes em meios fisiológicos até que instados para reagirem seletivamente e formarem ligações químicas estáveis.

Recentemente, uma tecnologia inteiramente nova na ciência relativa a proteínas foi relatada com a promessa de superar muitas das limitações associadas com modificações sítio-específicas de proteínas. Especificamente, novos componentes foram adicionados ao mecanismo protéico biossintético do procarioto Escherichia coli (E. coli) (por exemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) e do eucarioto Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que possibilitam a incorporação in vivo de aminoácidos não geneticamente codificados a proteínas. Alguns novos aminoácidos com propriedades químicas, físicas ou biológicas inovadoras, incluindo marcações para fotoafinidade e aminoácidos fotoisomeráveis, cetoaminoácidos e aminoácidos glicosilados foram incorporados com eficiência e alta fidelidade em proteínas de E. coli e

6/238 levedura em resposta ao códon âmbar, TAG, usando essa metodologia. Consultar, por exemplo, J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, etal., (2002), PNAS United States of América 99:11020-11024 e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10. Esses estudos demonstraram que é possível introduzir seletivamente e de rotina grupos químicos funcionais, tais como grupos alcino e grupos azida, não encontrados em proteínas, que são quimicamente inertes para todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados e que podem ser utilizados para reagir eficiente e seletivamente na formação de ligações covalentes estáveis.

A capacidade para incorporar aminoácidos não geneticamente codificados em proteínas permite a introdução de grupos químicos funcionais que ofereceríam alternativas valiosas para os grupos funcionais naturais, tais como o -NH₂ epsilon de lisina, a sulfidrila -SH de cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Certos grupos químicos funcionais são conhecidos como inertes para os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados, porém reagem de forma limpa e eficiente para formar ligações estáveis. Grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos no estado da técnica por sofrerem reação de cicloadição [3+2] de Huisgen em condições aquosas na presença de quantidade catalítica de cobre. Consultar, por exemplo, Tornoe, etal., (2002) Org. Chem. Q7.30573064 e Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. A introdução de um grupo azida na estrutura de uma proteína, por exemplo, possibilita incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte para aminas, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, grupos hidroxila, encontrados em proteínas, porém que também reage sem dificuldade e eficientemente com grupo acetileno para formar um produto de cicloadição. De modo importante, na ausência do grupo acetileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteínas e sob condições fisiológicas.

A presente invenção aborda, mas não está limitada a, questões associadas com a atividade e a produção de EPO, além de ser dirigida também à produção de um polipeptídeo de hEPO com propriedades biológicas ou farmacológicas melhoradas, tais como melhor meia-vida terapêutica.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Esta invenção provê polipeptídeos de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO está ligado a um segundo polipeptídeo de fEPO.

Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupo poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, a molécula de po7/238 li(etilenoglicol) é um polímero bifuncional. Em algumas modalidades, o polímero bifuncional está ligado a um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo de fEPO.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO contém pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo um grupo poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido é um aminoácido não codificado naturalmente.

Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das seguintes regiões correspondentes a estruturas secundárias em fEPO como segue: 1-7 (N-terminal), 8-26 (hélice A), 27-54 (região entre hélice A e hélice B) 55-83 (hélice B), 84-89 (região entre hélice B e hélice C), 90-112 (hélice C), 113-137 (região entre hélice C e hélice D), 138-161 (hélice D), 162-166 (C-terminal), 39-41 (folha beta 1), 133-135 (folha beta 2), 47-52 (mini alça B), 1 ΜΙΣΙ (mini alça C), 34-38 (alça entre hélice A e a folha beta 1 anti-paralela), 51-57 (extremidade C-terminal da hélice B’, alça entre hélice B’ e hélice B e extremidade N-terminal da hélice B), 82-92 (região entre a hélice B e a hélice C) e 120-133 (região entre a hélice Cea folha beta 2 anti-paralela 2). Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma das seguintes posições em fEPO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 e 166. Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma das seguintes posições em fEPO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23,

24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,47,

48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71,

72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95,

96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,114,

115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,132,

133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,150,

151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 e 166. Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma das seguintes posições em fEPO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17,21, 24, 27, 28, 30, 31,

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32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 113, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,136, 162, 163, 164, 165 e 166. Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma das seguintes posições em fEPO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 113, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,136, 162, 163, 164, 165 e 166. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais em uma ou mais das seguintes posições: 21, 24, 27, 28, 30, 31, 34, 36, 37, 38, 40, 55, 68, 72, 76, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,136 e 162. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural nestas ou em outras posições está ligado a uma molécula solúvel em água, incluindo, mas não limitado as posições 21, 24, 38, 83, 85, 116 e 119. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais em uma ou mais das seguintes posições: 18, 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55 e 60. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais em uma ou mais das seguintes posições: 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55 e 60. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais em uma ou mais das seguintes posições: 18, 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55 e 60. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural nestas ou em outras posições está ligado a uma molécula solúvel em água, incluindo, mas não limitado as posições 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55 e 60. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais em uma ou mais das seguintes posições: 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e 130. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural nestas ou em outras posições está ligado a uma molécula solúvel em água, incluindo, mas não limitado as posições 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e 130.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta sua afinidade por um receptor de eritropoetina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta sua estabilidade. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta sua solubilidade aquosa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade do polipeptídeo de fEPO produzido em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição de um amino9/238 ácido selecionado a partir do grupo constituído por, entre outros, N24, N36, N38, Q58, Q65, N83, Q86, G113, Q115 e S126 e uma combinação destes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreende uma substituição de um aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por, entre outros N24, N36, N38, Q58, Q65, N83, Q86, G113, Q115 e S126 e uma combinação destes na SEQ ID NO: 4.

Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos no polipeptídeo de fEPO podem ser com aminoácidos naturais ou não naturais, contanto que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido não codificado naturalmente.

Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende grupo carbonila, grupo acetila, grupo aminóxi, grupo hidrazina, grupo hidrazida, grupo semicarbazida, grupo azida ou grupo Alcino.

Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonila. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente possui a estrutura:

r₃hn cor₄

Em que n é 0-10; é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído; R₂ é H, alquila, arila, alquila substituído e arila substituído; e R₃ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em amino terminal e R₄ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em carbóxi terminal.

Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo aminóxi. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo hidrazida. Em algumas modalidades, the aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo hidrazina. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo semicarbazida.

Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo azida. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente possui a estrutura:

r₂hn cor₃

Em que n é 0-10; Ri é alquila, arila, alquila substituído, arila substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10; R₂ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em carbóxi terminal.

Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo Alcino. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente possui a estrutura:

10/238 (ÇH^nR^CH^CCH

R₂HI\T X3OR₃

Em que n é 0-10; é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10, R₂ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação em carbóxi terminal.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo é agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de eritropoetina. Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de eritropoetina compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupo poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água está presente dentro da região do Sítio 2 (a região da proteína abrangendo a face do feixe helicoidal AC) de fEPO. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água impede a dimerização do receptor de fEPO ao impedir que o antagonista de fEPO se ligue a uma segunda molécula de receptor de fEPO. Em algumas modalidades, um aminoácido diferente de leucina é substituído para L108 na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, arginina ou lisina é substituída para L108 na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um aminoácido não codificado naturalmente é substituído para L108 na SEQ ID NO: 2.

A presente invenção provê também ácidos nucléicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições rigorosas com a SEQ ID NO: 24, 25, 26 ou 27, em que o polinucleotídeo compreende pelo menos um códon seletor. Em algumas modalidades, o códon seletor códon é selecionado a partir do grupo constituído por códon âmbar, códon ocre, códon opala, códon único, códon raro e códon de quatro bases.

A presente invenção provê também métodos para produzir um polipeptídeo de fEPO ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o método compreende por em contato um polipeptídeo isolado de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente, com um polímero solúvel em água contendo um grupo que reaja com o aminoácido não codificado naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente incorporado em fEPO é reativo frente a um polímero solúvel em água que, de contrário, não é reativo frente a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO ligado ao polímero solúvel em água é produzido reagindo-se um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo carbonila, com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo aminóxi, hidroxilamina, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o gru11/238 po aminóxi, hidroxilamina, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula de poli(etilenoglicol) por meio de ligação amida.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO ligado ao polímero solúvel em água é produzido reagindo-se uma molécula de poli(etilenoglicol), compreendendo um grupo carbonila, com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente que compreende um grupo hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO ligado ao polímero solúvel em água é produzido reagindo-se um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo alcino, com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo azida. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino é ligado à molécula de poli(etilenoglicol) por meio de ligação amida.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO ligado ao polímero solúvel em água é produzido reagindo-se um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo azida, com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo alcino. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino é ligado à molécula de poli(etilenoglicol) por meio de ligação amida.

Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) possui peso molecular entre aproximadamente 1 e aproximadamente 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) possui peso molecular entre 1 kDa e 50 kDa.

Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um polímero ramificado. Em algumas modalidades, cada ramificação do polímero ramificado de poli(etilenoglicol) possui peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa.

Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água ligado a fEPO compreende um grupo polialquileno glicol. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado em fEPO compreende grupo carbonila, grupo acetila, grupo aminóxi, grupo hidrazida, grupo semicarbazida, grupo azida ou grupo alcino. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado em fEPO compreende um grupo carbonila e o polímero solúvel em água compreende grupo aminóxi, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado em fEPO compreende um grupo alcino e o polímero solúvel em água compreende um grupo azida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado em fEPO compreende um grupo azida e o polímero solúvel em água compreende um grupo alcino.

A presente invenção provê também composições contendo um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.

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A presente invenção provê também células contendo um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de fEPO compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem RNA sintetase ortogonal e/ou tRNA ortogonal para substituir um aminoácido não codificado naturalmente no polipeptídeo de fEPO.

A presente invenção provê também métodos para produzir um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente. Em algumas modalidades, os métodos compreendem cultivar células contendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificadores de um polipeptídeo de fEPO, RNA sintetase ortogonal e tRNA ortogonal sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo de fEPO; e purificar o polipeptídeo de fEPO das células e/ou do meio de cultura.

A presente invenção provê também métodos para aumentar a meia-vida terapêutica, meia-vida sérica ou o tempo de circulação de fEPO. Em algumas modalidades, os métodos compreendem substituir um ou mais aminoácidos naturais de fEPO por um aminoácido não codificado naturalmente e/ou ligar o polipeptídeo de fEPO a um polímero solúvel em água.

A presente invenção provê também métodos para tratar um paciente em necessidade de tal tratamento com quantidade eficaz de uma molécula de fEPO da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica contendo um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.

A presente invenção provê também polipeptídeos de fEPO compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, exceto que pelo menos um aminoácido está substituído por um aminoácido não codificado naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupo poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente está substituído em uma posição selecionada a partir do grupo constituído por resíduos incluindo, entre outros, 1-6, 21-40, 68-89, 116-136, 162-166 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou a posição correspondente de aminoácido da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonila, grupo aminóxi, grupo hidrazida, grupo hidrazina, grupo semicarbazida, grupo azida ou grupo alcino.

A presente invenção provê também composições farmacêuticas contendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de fEPO compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, em que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente. A presente invenção provê também composi13/238 ções farmacêuticas contendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de fEPO compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 ou 4, em que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido não codificado naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo sacarídeo. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água está ligado ao polipeptídeo por meio de um grupo sacarídeo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Figura 1 - Diagrama do alinhamento de sequências da eritropoetina humana e felina.

Figura 2 - Diagrama destacando a diferença entre as duas sequências depositadas no Genbank (N° de acesso do Genbank: U00685 e N° de acesso do Genbank: L10606), a sequência de consenso.

Figura 3 - Um diagrama da estrutura geral da proteína eritropoetina (EPO) de quatro feixes helicoidais é mostrado com receptores de alta e de baixa afinidade.

Figura 4 - Um diagrama de visão alternativa da estrutura geral da proteína eritropoetina (EPO) de quatro feixes helicoidais é mostrado com receptores de alta e de baixa afinidade.

Figura 5 - Diagrama mostrando alguns sítios selecionados para incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente.

Figura 6 - Diagrama mostrando uma visão de cima de alguns sítios selecionados para incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente.

Figura 7 - Diagrama mostrando uma visão lateral de alguns sítios selecionados para incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente, e destacando quaisquer destes sítios estão próximos de sítios de glicosilação.

Figura 8 - Tabela apresentando alguns sítios selecionados para incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente, o aminoácido natural e a posição do aminoácido da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 e o Cx médio para estes sítios.

Figura 9 - Tabela apresentando alguns sítios selecionados para incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente, o aminoácido natural e a posição do aminoácido da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 e o Cx médio para estes sítios.

Figura 10a - A densidade óptica a 450 nm inserida em gráfico contra a concentração de tampão de formulação.

Figura 10b - A densidade óptica a 450 nm inserida em gráfico contra a concentração de endotoxina.

Figura 11 - Diagrama do ensaio de proliferação de TF-1.

Figura 12 - Diagrama de receptores de fEPO homodimerizando quando da ligação a ligantes.

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Figura 13 - A OD a 450 nm registrada em função de concentrações crescentes de fEPO mostrando uma curva de dose-resposta em forma de sino.

Figura 14 - Apresentação de diferentes densidades de semeadura de células TF-1. Este gráfico mostra que, dado, por exemplo, a via de transdução de sinal JAK-STAT, para atividade ótima em resposta a fEPO, a razão entre fEPO e receptor de fEPO é de 1:2.

Figura 15 - Gráfico dos resultados de experimentos para determinar se a privação celular de nutrientes sincronizaria a divisão celular e resultaria em intervalo dinâmico maior os resultados revelaram que a privação não foi especialmente vantajosa.

Figura 16 - Gráfico de condições utilizadas para o ensaio de TF-1 com densidade de semeadura de 20.000, tempo de incubação de 72 horas, concentração inicial de fEPO de 500 ng/ml e diluição de 2,5x.

Figura 17 - Tabela apresentando a robustez mensurada de ensaios, dados sobre o número de passagens de células, EC50, intervalos de OD e dinâmicos.

Figura 18 - Tabela e gráfico do desempenho de ensaios de TF-1 com fEPO do tipo selvagem e tampão de formulação.

Figura 19 - Gráfico comparando o desempenho de ensaios entre EPOs do tipo selvagem para humana e felina.

Figura 20 - Gráfico de ODs medidas contra concentrações de meio condicionado e não condicionado de CHO com fEPO do tipo selvagem como controle.

Figura 21 - Gráfico comparando fEPO do tipo selvagem, CHO/PEI + 1.25 ng/mL de fEPO e apenas CHO/PEI em concentrações decrescentes e as ODs medidas.

Figura 22 - Tabela e gráficos da atividade relativa de variantes de fEPO com aminoácido não natural incorporado, pAF, em comparação a fEPO do tipo selvagem.

Figura 23 - Gráfico em barras de diferentes variantes de fEPO com pAF incorporado em sítios específicos e cada uma de suas medições de ED50 em ng/ml_.

Figura 24 - Gráfico do variante E72 de fEPO armazenado a quatro graus e a menos de oito graus durante cinco semanas, em comparação a fEPO do tipo selvagem, e suas ODs.

Figura 25 - Desenho esquemático do vetor Lucy F e o sítio dos tRNAs, elemento transcricional do gene de interesse, e da tRNA sintetase.

Figura 26 - Desenho esquemático do vetor Irwin e o sítio dos tRNAs, elemento transcricional do gene de interesse, e da tRNA sintetase.

Figura 27 - Desenho esquemático da construção de supressão de expressão, Nat L BB-Opti FEPO, em Lucy F para eritropoetina felina.

Figura 28 - Desenho esquemático da construção de supressão de expressão, Nat L BB-Opti FEPO, em Irwin para eritropoetina felina.

Figura 29 - Desenho esquemático retratando uma construção de supressão de ex15/238 pressão de acordo com a invenção codificando um anticorpo genérico com genes de cadeia leve e pesada.

Figura 30 - Gráfico em barras mostrando os níveis de supressão de variantes de fEPO, na presença de pAF, medidos por ELISA (OD-50).

Figura 31 - Comparação da migração de fEPO PEGuilada por SDS-PAGE. Bandas 1-3: Reações de PEG de 20 kDa com o variante de fEPO R53 pAF. Banda 1: R53, carga de 8 pg de fEPO, sem PEG. Banda 2: PEGuilação de R53, carga de 2 pg de fEPO. Banda 3: PEGuilação de R53, carga de 8 pg de fEPO. Bandas 4-6: Reações de PEG de 30 kDa com o variante de fEPO P129 pAF. Banda 4: P129, carga de 8 pg fEPO, sem PEG. Banda 5: PEGuilação de P129, carga de 2 pg de fEPO. Banda 6: PEGuilação de P129, carga de 8 pg de fEPO. Bandas 7-9: Reações de PEG de 40 kDa com o variante de fEPO Y49 pAF. Banda 7: Y49, carga de 8 pg de fEPO, sem PEG. Banda 9: PEGuilação de Y49, carga de 8 pg de fEPO. Banda 9: PEGuilação de Y49, carga de 2 pg de fEPO. A seta horizontal em 38 kDa indica o local de migração de fEPO não PEGuilada. O retângulo indica a região de migração de fEPO PEGuilada.

Figura 32 - Gel de SDS-PAGE mostrando as reações de PEGuilação (30 kDa) para os variantes de fEPO, D55 e P129 pAF, exibindo estes dois variantes PEGuilados. Banda 1: D55, sem PEG. Banda 2: PEGuilação de D55. Banda 3: fEPO do tipo selvagem, sem incubação. Banda 4: P129, carga de 8 pg de fEPO, sem PEG. Banda 5: PEGuilação de P129, carga de 2 pg de fEPO. Banda 6: PEGuilação de P129, carga de 8 pg de fEPO. A seta horizontal em 38 kDa indica o local de migração de fEPO não PEGuilada. O retângulo indica a região de migração de fEPO PEGuilada.

Figura 33 - Gel de SDS-PAGE mostrando a reação bem sucedida de peguilação (30 kDa) para o variante de fEPO A1 pAF. A banda 1 mostra fEPO do tipo selvagem, carga de 8 pg, sem incubação e a banda 2: mostra A1 PEGuilado.

Figura 34 - Comparação entre as sequências de aminoácidos de cEPO (SEQ ID NO: 31) e fEPO (SEQ ID NO: 4) mostrando 94% de homologia entre as duas.

Figura 35 - Comparação entre as sequências de aminoácidos de eEPO (SEQ ID NO: 33) e fEPO (SEQ ID NO: 4) mostrando 94% de homologia entre as duas.

Figura 36 - Gráfico mostrando os efeitos de vários tratamentos sobre hematócritos e contagens de hemácias (RBC) a partir do experimento no Exemplo 32.

DEFINIÇÕES

Deverá ser entendido que esta invenção não é limitada pela metodologia, protocolos, linhagens celulares, construções e reagentes especificamente descritos neste pedido de patente e, como tal, podem variar. Deverá ser entendido também que a terminologia utilizada neste pedido de patente tem como finalidade somente descrever modalidades específicas e não se destina a limitar a abrangência da presente invenção, a qual será limitada so16/238 mente pelas reivindicações anexadas.

Neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas em singular “um”, “uma” e “o” e “a” incluem referências no plural, a não ser que o contexto indique claramente em contrário. Portanto, por exemplo, referência a uma “fEPO” é uma referência a uma ou mais de tais proteínas e inclui seus equivalentes conhecidos daqueles versados no estado da técnica, e assim por diante.

A não ser se definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendidos por qualquer um versado no estado da técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, aparelhos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou para testar a invenção, os métodos, aparelhos e materiais preferidos estão descritos abaixo.

Todas as publicações e patentes aqui citadas são incorporadas neste pedido de patente por referência para fins de descrever e expor, por exemplo, as construções e metodologias que estão descritas nas publicações, as quais poderiam ser utilizadas com relação à invenção presentemente descrita. As publicações são aqui discutidas exclusivamente por sua divulgação antes que a data de depósito do presente pedido de patente. Nada neste pedido de patente deverá ser interpretado como admissão de que os inventores não tenham adquirido o direito de antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior ou por qualquer outro motivo.

O termo “substancialmente purificado” refere-se à fEPO que pode estar substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interajam com a proteína conforme encontrada em seu ambiente natural, ou seja, célula nativa ou célula hospedeira no caso de fEPO produzida por recombinação. fEPO que pode estar substancialmente livre de material celular inclui preparados protéicos com menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% ou menos de aproximadamente l% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando a fEPO ou seu variante são produzidos por recombinação pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente em aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2% ou aproximadamente 1% ou menos do peso seco das células. Quando a fEPO ou seu variante é produzido por recombinação pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura em aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 500 mg/L,

17/238 aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 10 mg/L ou aproximadamente 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Por conseguinte, fEPO “substancialmente purificada” como produzida pelos métodos da presente invenção pode exibir nível de pureza de pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, especificamente, nível de pureza de pelo menos aproximadamente 75%, 80%, 85% e, mais especificamente, nível de pureza de pelo menos aproximadamente 90%, nível de pureza de pelo menos aproximadamente 95%, nível de pureza de pelo menos aproximadamente 99% ou maior como determinado por métodos apropriados como análise por SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC e eletroforese capilar.

“Célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira” refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, independentemente do método usado para inserção, por exemplo, captação direta, transdução, f-mating (acasalamento entre homozigotos), ou outros métodos conhecidos no estado da técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como vetor não integrado, por exemplo, plasmídeo, ou alternativamente, pode estar integrado no genoma do hospedeiro.

Neste relatório descritivo, o termo “meio” ou “meios” inclui qualquer meio de cultura, solução, suporte sólido, semi-sólido ou rígido que possa sustentar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de leveduras, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras de plantas, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamíferos, células CHO ou de E. coli e conteúdo celular. Portanto, o termo pode abranger meio no qual a célula hospedeira foi cultivada, por exemplo, meio no qual a fEPO foi secretada, incluindo meio antes ou depois de uma etapa de proliferação. O termo pode abranger também tampões ou reagentes que contenham lisados de células hospedeiras, tal como no caso em a produção de fEPO é intracelular e as células hospedeiras são lisadas ou rompidas para liberar a fEPO.

Neste relatório descritivo, IRES ou sítio interno de entrada do ribossomo, é conhecido daqueles versados no estado da técnica. IRES é uma região de uma molécula de ácido nucléico, por exemplo, molécula de mRNA, que permite o acesso interno de ribossomos/ligação suficiente para iniciar a tradução em um ensaio para tradução independente de cap, tal como ensaio de repórter bicistrônico descrito na Patente U.S. N° 6 715 821. A presença de IRES dentro de uma molécula de mRNA permite a tradução independente de cap de uma sequência ligada codificadora de proteína que, do contrário, não seria traduzida. Os IRES foram identificados pela primeira vez em picomavírus, e são considerados o paradigma para tradução independente de cap. As 5' UTRS de todos os picomavírus são longas e

18/238 mediam o início da tradução ao recrutarem e ligarem diretamente ribossomos, evitando com isso a etapa inicial de ligação ao cap.

Elementos de IRES são frequentemente encontrados em mRNAs virais e raramente em mRNAs não virais. Até esta data, os mRNAs não virais que demonstram conter elementos funcionais IRES em suas respectivas 5' UTRS incluem aqueles que codificam a proteína de ligação da cadeia pesada da imunoglobulina (BIP) (Macejak, D. J. et al., Nature 353:9094 (1991)); Drosophila Antennapedia (Oh, S. K. et al., Genes Dev. 6:1643-53 (1992)); e Ultrabithoran (Ye, X. et al., Mol. Cell. Biol. 17:1714-21 (1997)); fator 2 de crescimento de fibroblastos (Vagner et al., Mol. Cell. Biol. 15:35-47 (1915); fator de iniciação (Gan et al., J. Biol. Chem. 273:5006-12 (1992)); proteína oncogênica c-myc (Nambru et al., J. Biol. Chem. 272:32061-6 (1995)); Stonely M. Oncogene 16:423-8 (1998)); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Stein J. et al., Mol. Cell. Biol. 18:3112-9 (1998)). Elementos celulares de IRES não exibem similaridade óbvia de sequência ou estrutural às sequências de elementos de IRES ou entre si e, portanto, são identificadas usando ensaios de tradução. Outro IRES conhecido é o IRES XIAP descrito na Patente U.S. N° 6 171 821, aqui incorporada em sua totalidade por referência neste pedido de patente.

Agente redutor, neste relatório descritivo com respeito ao renove lamento protéico, é definido como qualquer composto ou material que mantenha grupos sulfidrila no estado reduzido e que reduza pontes dissulfeto intra ou intermoleculares. Agentes redutores adequados incluem, entre outros, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol) e glutationa reduzida. É rapidamente evidente para aqueles versados no estado da técnica que uma ampla variedade de agentes redutores é adequada para uso nos métodos da presente invenção.

Agente oxidante, neste relatório descritivo com respeito ao renove lamento protéico, é definido como qualquer composto ou material capaz de remover um elétron de um composto em vias de oxidação. Agentes oxidantes adequados incluem, entre outros agentes, glutationa oxidada, cisteína, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigênio. É rapidamente evidente para aqueles versados no estado da técnica que uma ampla variedade de agentes oxidantes é adequada para uso nos métodos da presente invenção.

Agentes desnaturante ou desnaturante”, neste relatório descritivo, é definido como qualquer composto ou material que causará desenovelamento reversível de uma proteína. A força de um agente desnaturante ou desnaturante será determinada pelas propriedades e pela concentração do agente desnaturante ou desnaturante específico. Agentes desnaturantes ou desnaturantes adequados podem ser caotrópicos, detergentes, solventes orgânicos miscíveis em água, fosfolipídios ou uma combinação de dois mais destes agentes. Caotrópicos adequados incluem, entre outros, ureia, guanidina e tiocianato de sódio. Detergentes úteis podem incluir, entre outros, detergentes fortes como dodecil sulfato de sódio,

19/238 ou éteres de polioxietileno (por exemplo, detergentes Tween ou Triton), Sarkosyl, detergentes não iônicos leves (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos leves como N->2,3(Dioleioxi)-propil-N,N,N-trimetilamônio, detergentes iônicos leves (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwitteriônicos incluindo, entre outros, sulfobetaínas (Zwittergente), sulfato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamônio-1-propano (CHAPS) e sulfonato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamônio-2-hidróxi-1-propano (CHAPSO). Solventes orgânicos miscíveis em água como acetonitrila, alcanóis baixos (especialmente C₂ - C₄ alcanóis como etanol ou isopropanol) ou alcandióis baixos (especialmente C₂ - C₄ alcandióis como etilenoglicol) podem ser usados como desnaturantes. Fosfolipídios úteis na presente invenção podem ser fosfolipídios naturais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidilinositol ou derivados sintéticos de fosfolipídios ou variantes como dihexanoilfosfatidilcolina ou diheptanoilfosfatidilcolina.

Renovelamento, neste relatório descritivo, descreve qualquer processo, reação ou método que transforma polipeptídeos contendo pontes dissulfeto de um estado inadequadamente enovelado ou não enovelado para uma conformação nativa ou adequadamente enovelada com respeito a pontes dissulfeto.

Co-enovelamento, neste relatório descritivo, refere-se especificamente a processos, reações ou métodos de renovelamento que empregam pelo menos dois polipeptídeos que interagem entre si e que resultam na transformação de polipeptídeos não enovelados ou inadequadamente enovelados com relação a polipeptídeos nativos adequadamente enovelados.

Neste relatório descritivo, eritropoetina ou EPO incluirá aqueles polipeptídeos e proteínas com pelo menos uma atividade biológica de eritropoetina felina (fEPO), bem como análogos de eritropoetina, isoformas de eritropoetina (tais como aqueles descritas na Patente U.S. N° 5 856 298, aqui incorporada por referência neste pedido de patente), miméticos de eritropoetina (tais como aqueles descritos na Patente U.S.N⁰ 6 310 078, aqui incorporada por referência neste pedido de patente), fragmentos de eritropoetina, proteínas híbridas de eritropoetina, oligômeros e multímeros de proteínas de fusão, homólogos, variantes de padrão de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica das mesmas, e ainda independentemente de seu método de síntese ou produção, incluindo, mas não limitado a, métodos de recombinação (quer produzidas a partir de cDNA ou DNA genômico), sintéticos, transgênicos ou com gene ativado. Exemplos específicos de eritropoetina incluem, entre outros, epoetina alfa (tais como aquelas descritas nas Patentes U.S. N° 4 667 016, 4 703 008, 5 441 868, 5 547 933, 5 618 698, 5 621 080, 5 756 349 e 5 955 422, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente), darbepoetina alfa (tais como descrita no pedido de patente europeia EP640619), DYNEPO™ (epoetina delta), análogo de eritropoetina humana (tal como as proteínas de fusão com albumina sérica humana, descritas no

20/238 pedido de patente internacional WO9966054 e na Patente U.S. N° 6 548 653 e 5 888 772, aqui incorporados por referência neste pedido de patente), mutantes de eritropoetina (tais como aqueles descritos no pedido de patente internacional WO9938890 e na Patente U.S. N° 6 489 293, 5 888 772, 5 614 184 e 5 457 089, aqui incorporados por referência neste pedido de patente), eritropoetina ômega (que pode ser produzida a partir do fragmento de restrição Apa I do gene da eritropoetina humana, descrito na Patente U.S. N° 5 688 679, 6 099 830, 6 316 254 e 6 682 910, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente), eritropoetina humana alterada glicosilada (tal como aquelas descritas no pedido de patente internacional WO9911781 e EP1064951) e análogos conjugados de eritropoetina PEG (tais como aquelas descritas em WO9805363 e Patente U.S. N° 5 643 575, 6 583 272, 6 340 742 e 6 586 398, aqui incorporados por referência neste pedido de patente). Exemplos específicos de linhagens celulares modificadas para expressar eritropoetina humana endógena estão descritos nos pedidos de patente internacional WO9905268 e WO9412650 e na Patente U.S. N° 6 376 218, aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

O termo eritropoetina felina (fEPO) ou polipeptídeo de fEPO refere-se à eritropoetina ou EPO conforme descrita acima, bem como a um polipeptídeo que retenha pelo menos uma atividade biológica de fEPO natural. Polipeptídeos de fEPO incluem os sais e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativos e estereoisômeros da eritropoetina felina natural, bem como variantes agonistas, miméticos e antagonistas da Eritropoetina humana natural e fusões de polipeptídeos desta. Exemplos de polipeptídeos de fEPO e miméticos incluem aqueles descritos na Patente U.S. N° 6 310 078, 5 106 954, 6 703 480, 6 642 353, 5 986 047 e 5 712 370, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente. Fusões compreendendo aminoácidos adicional no terminal amino, terminal caboxila, ou ambos, são abrangidos pelo termo polipeptídeo de fEPO. Fusões exemplares incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, metionil eritropoetina na qual uma metionina está ligada ao N-terminal de fEPO, fusões para fins de purificação (incluindo, mas não limitado a, para poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com peptídeos de ligação à albumina sérica e fusões com proteínas séricas tais como albumina sérica. As sequências de ácido nucléico e de aminoácidos da fEPO natural são conhecidas. Para a sequência completa de aminoácidos de fEPO natural, bem como para a sequência de aminoácidos de hEPO madura, consultar SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente, neste pedido de patente. Para a sequência completa de consenso de aminoácidos de fEPO, bem como a sequência de consenso de aminoácidos de fEPO madura, consultar SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente, neste pedido de patente. Em algumas modalidades, polipeptídeos de fEPO da invenção são substancialmente idênticos a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4. Moléculas de ácido nucléico codificadores de fEPO

21/238 mutantes e polipeptídeos mutantes de fEPO são bem conhecidas também. Exemplos de fEPO mutantes incluem aqueles expostos na Patente U.S. N° 6 489 293; 6 153 407, 6 048 971, 5 614 184 e 5 457 089, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente.

Eritropoetina ou fEPO possui uma variedade de atividades biológicas, incluindo, mas não limitado a, ligação a seu receptor, causar dimerização de seu receptor, estimulação da produção de hemácias e estimular proliferação celular. Exemplos de algumas atividades biológicas de eritropoetina e hEPO estão descritos na Patente U.S. N° 6 676 947, 6 579 525, 6 531 121, 6 521 245, 6 489 293, 6 368 854, 6 316 254, 6 268 336, 6 239 109, 6 165 283, 5 986 047, 5 830 851 e 5 773 569, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente.

Fragmentos/variantes biologicamente ativos de fEPO incluem o produto do gene contendo 192 aminoácidos, dos quais os primeiros 26 são clivados durante a secreção, bem como a retirada de um ou mais dos últimos quatro aminoácidos durante a formação da forma madura de eritropoetina (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2). O termo “polipeptídeo de fEPO” inclui também formas glicosiladas, com sítios de glicosilação N-ligados na posição 24, 38 e 83 e sítio de glicosilação O-ligado na posição 126 (Takeuchi et al. (1988) JBC 263: 36573663; Saski et al. (1988) Biochemistry 27: 8618-8626). Variantes contendo alterações em único nucleotídeo (ou seja, S104N e L105F, P122Q, E13Q, Q58->QQ, G113R) são considerados também variantes biologicamente ativos de hEPO (Jacobs et al., (1985) Nature 313: 806-810; Funakoshi et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 195: 717-722). O termo “polipeptídeo de fEPO” inclui também heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros ou homomultídemos de fEPO ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, pequena molécula, ligante ou outra molécula ativa de qualquer tipo, ligada por meios químicos ou expressos como proteína de fusão (Sytkowski et al., (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(3):1184-8 e Sytkowski et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(35):24773-8, e Patente U.S. N° 6 187 564, 6 703 480, 5 767 078, aqui incorporados por referência neste pedido de patente), bem como análogos de polipeptídeos contendo deleções específicas, embora mantendo atividade biológica (Boissel et al., (1993) JBC 268: 15983-15993; Wen et al., (1994) JBC 269: 22839-22846; Bittorf et al., (1993) FEBS 336: 133-136; e Patente U.S. N° 6 153 407, aqui incorporados por referência neste pedido de patente).

Todas as referências a posições de aminoácidos em fEPO, neste relatório descritivo, têm como base a posição na SEQ ID NO: 2, a não ser que especificado de outra forma (ou seja, quando afirmado que a incorporação tem como base a SEQ ID NO: 3). Aqueles versados no estado da técnica apreciarão que posições de aminoácido correspondentes a posições na SEQ ID NO: 2 podem ser rapidamente identificadas em fusões, variantes ou fragmentos, etc. de fEPO. Por exemplo, programas de alinhamento de sequências como BLAST podem ser utilizados para alinhar e identificar uma posição específica em uma proteína que corresponda a uma posição na SEQ ID NO:2. Substituições, deleções ou adições de

22/238 aminoácidos descritos neste pedido de patente em referência a SEQ ID NO: 2 destinam-se a se referirem também a substituições, deleções ou adições em posições correspondentes em fusões, variantes, fragmentos, etc. de fEPO aqui descritos ou conhecidos no estado da técnica, e são expressamente abrangidas pela presente invenção.

O termo “polipeptídeo de fEPO” abrange polipeptídeos de fEPO compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Substituições exemplares em uma ampla variedade de posições de aminoácido em fEPO natural foram descritas, incluindo, mas não limitado a, substituições que aumentam atividade agonista, aumentam a solubilidade do polipeptídeo, convertem o polipeptídeo em antagonista, etc., e são abrangidas pelo termo polipeptídeo de fEPO.

Antagonistas de EPO felina incluem, entre outros, aqueles com substituições em V11, R14, Y15, D96, K97, S100, R103, S104, T107, L108 e R110 (incluindo, entre outros, V11S, R14Q, Y15I, S100E, R103A, S104I e L108K, consultar Elliot et al. 1993), encontradas no sítio de ligação a receptor de baixa afinidade (sítio 2). Em algumas modalidades, antagonistas de fEPO compreendem pelo menos uma substituição nas regiões 10-15 ou 100-108 que faz com que fEPO atue como antagonista. Consultar, por exemplo, Elliot et al. 1993 e Cheetham et al. 1998. Em algumas modalidades, o antagonista de fEPO compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente na região de ligação do Sítio 2 da molécula de hEPO. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fEPO é ainda modificado para conter as seguintes substituições: V11S, R14Q, Y15I, S100E, R103A, S104I e L108K.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO compreendem ainda uma adição, substituição ou deleção que modula a atividade biológica de fEPO. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor de fEPO, modular (incluindo, entre outros, aumentar ou diminuir) a dimerização do receptor, estabilizar dímeros do receptor, modular a meia-vida circulante, modular a meia-vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídeo, modular a dose, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação ou melhorar ou alterar uma via de administração em particular. Igualmente, polipeptídeos de fEPO podem compreender sequências de divagem por proteases, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, entre outros, FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base em afinidade (incluindo, entre outros, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou com moléculas ligadas (incluindo, entre outros, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, entre outros, GFP), purificação ou outros traços do polipeptídeo.

O termo “polipeptídeo de fEPO” abrange também homodímeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros de fEPO ligados diretamente por cadeias laterais de aminoácido não codificado naturalmente, às cadeias laterais de aminoácidos naturais, ou indiretamente por meio de ligante. Ligantes exemplares incluem, entre outros, polímeros

23/238 solúveis em água como poli(etilenoglicol) ou polidextrano ou um polipeptídeo.

Aminoácido não codificado naturalmente refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína. O termo aminoácido não codificado naturalmente inclui, entre outros, aminoácidos que ocorrem naturalmente por modificação de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, entre outros, os 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína), porém não são os próprios incorporados em uma cadeia polipeptídica em crescimento pelo complexo de tradução. Exemplos de aminoácidos naturais que não são naturalmente codificados incluem, entre outros, Nacetilglicosaminil-L-serina, N-acetilglicosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.

Grupo com modificação em amino terminal refere-se a qualquer molécula que pode ser unida ao amino terminal de um polipeptídeo. Igualmente, grupo com modificação em carbóxi terminal refere-se a qualquer molécula que pode ser unida ao carbóxi terminal de um polipeptídeo. Grupos com modificação em terminal incluem, entre outros, vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas, como albumina sérica, ou outros grupos que ampliam a meia-vida sérica de peptídeos.

Os termos “grupo ativo”, “grupo ativo”, “grupo de ativação”, “grupo de saída”, “sítio reativo”, “grupo quimicamente reativo” e “grupamento quimicamente reativo” são utilizados no estado da técnica e neste relatório descritivo para referir-se a partes ou unidades distintas definíveis de uma molécula. Os termos são sinônimos de certa forma no estado das técnicas químicas e são aqui utilizados para indicar as partes de moléculas que executam alguma função ou atividade e que reagem com outras moléculas.

O termo “ligação” ou “ligante” é utilizado neste relatório descritivo para fazer referência a grupos ou uniões normalmente são formados como o resultado de uma reação química e que são tipicamente ligações covalentes. Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e que não reagem com água em valores úteis de pH, incluindo, entre outros, sob condições fisiológicas por período prolongado de temo, talvez até mesmo indefinidamente. Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degrada por um ou mais enzimas. Como entendido no estado da técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal (backbone) polimérica ou no grupo ligante entre a cadeia principal polimérica e um ou mais grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Por exemplo, ligações éster, formadas pela reação de ácidos carboxílicos PEG ou ácidos carboxílicos PEG ativados com grupos alcoólicos em um agente biologicamente ativo, geralmente se hidrolisam sob condições fisiológicas e liberam o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não estão limitadas a, ligações carbonato, ligações imina resultantes da reação de uma

24/238 amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formadas por reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são produto da um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto da reação de um formato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, mas não limitado a, em uma extremidade de um polímero como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não limitado a, na extremidade de um polímero, e um grupo 5' hidroxila de um oligonucleotídeo.

O termo “molécula biologicamente ativa”, “grupo biologicamente ativo” ou “agente biologicamente ativo”, quando utilizado neste relatório descritivo, significa qualquer substância capaz de afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um organismo biológico, incluindo, entre outros, vírus, bactérias, fungos, plantas, animais e seres humanos. Especificamente, neste relatório descritivo, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer substância pretendida para diagnóstico, cura, atenuação, tratamento ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais ou, de outra forma, para aperfeiçoar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, entre outros, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de pequena molécula, corantes, lipídios, nucleosídeos, oligonucleotídeos, células, vírus, lipossomos, micropartículas e micelas. Classes de agentes biologicamente ativos cujo uso é adequado com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes ansiolíticos, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroidais e as semelhantes.

Polímero bifuncional refere-se a um polímero compreendendo dois grupos funcionais distintos que são capazes de reagir especificamente com outros grupos (incluindo, entre outros, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um ligante bifuncional, contendo um grupo funcional reativo com um grupo em um determinado componente biologicamente ativo, e outro grupo reativo com um grupo em um segundo componente biológico, pode ser utilizado para formar um conjugado que inclua o primeiro componente biologicamente ativo, o ligante bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. Muitos procedimentos e moléculas ligantes para unir vários compostos e formar peptídeos são conhecidos. Consultar, por exemplo, o Pedido de Patente Européia N° 188 256; as Patentes U.S. N^os 4 671 958, 4 659 839, 4 414 148, 4 699 784, 4 680 338, 4 569 789 e 4 589 071, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Polímero multifuncional refere-se a um polímero compreendendo dois ou mais grupos funcionais distintos capazes de reagir especificamente com outros grupos (incluindo, entre outros, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes.

Quando especificados por suas formulas químicas convencionais, escritos da es25/238 querda para direita, os grupos substituintes abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da estrutura ser escrita da direita para a esquerda, por exemplo, -CH2O- é equivalente de -OCH2-.

O termo “substituinte” inclui, entre outros, “substituintes não interferentes”. “Substituintes não interferentes” são aqueles grupos que rendem compostos estáveis. Substituintes não interferentes adequados ou radicais incluem, entre outros, halo, Ct -C₁₀ alquila, C₂-C₁₀ alquenila, C₂-C₁₀ alquinila, C_rC₁₀ alcoxi, C_rCi2 aralquila, C_rC₁₂ alcarila, C₃-Ci₂ cicloalquila, C₃-C₁₂ cicloalquenila, fenila, fenila substituído, toluíla, xilenila, bifenila, C₂-C₁₂ alcoxialquila, C₂-C₁₂ alcoxiarila, C₇-Ci₂ ariloxialquila, C7-C12 oxiarila, Ci-C₆ alquilsulfinila, Cí-Cw alquilsulfonila, --(CH₂)_m --O--(CrC₁₀ alquila), em que m é de 1 a 8, arila, arila substituído, alcoxi substituído, fluoralquila, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, -NO₂, --CN, --NRC/Oj-ÍCrCw alquila), -0(0)-(0^0^ alquila), C₂-Ci₀ alquil tioalquila, 0(0)0-( Ct-Ck) alquila), -OH, -S0₂, =S, -COOH, -NR₂, carbonila, -0(0)-(0^0^ alquil)CF₃, —C(O)-CF_3i —C(O)NR_2j —(C-|-Cio aril)-S—(Οθ-Οιο arila), —C(0)—(C1-C10 arila), — (CH₂)m — 0-(-(CH₂)_rn-0-(C₁-C₁o alquila), em que cada m é de 1 a 8, -C(O)NR₂, -C(S)NR₂, SO₂NR₂, -NRC(O) NR₂, -NRC(S) NR₂, sais destes e os semelhantes. Todo R neste relatório descritivo é H, alquila ou alquila substituído, arila ou arila substituído, aralquila ou alcarila.

O termo “halogênio” inclui flúor, cloro, iodo e bromo.

O termo “alquila”, por si só ou como parte de outro substituinte, significa, a não ser se afirmado de outra forma, radical hidrocarboneto com cadeia linear ou ramificada ou é cíclico, ou combinação destes, que pode estar inteiramente saturado, mono ou poliinsaturado e podendo incluir radicais di e multivalentes com o número designado de átomos de carbono (ou seja, CrC₁₀ significa um a dez carbonos). Exemplos de radicais hidrocarbonetos saturados incluem, entre outros, grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, nbutila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclohexila, (ciclohexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila e os semelhantes. Grupo alquila insaturado é aquele com uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupo alquila insaturado incluem, mas não estão limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), etinila, 1 e 3propinila, 3-butinila e os homólogos e isômeros maiores. O termo “alquila”, a não ser se notado de outra forma, destina-se também a incluir aqueles derivados de alquila definidos mais detalhadamente abaixo, tal como “heteroalquila”. Grupos alquila que se limitam a grupos hidrocarbonetos são denominados “homoalquila”.

O termo “alquileno”, por si só ou como parte de outro substituinte, significa um radical divalente derivado de alcano, como exemplificado, mas não limitado, pelas estruturas CH₂CH₂- e -CH₂CH₂CH₂CH₂-, e inclui ainda aqueles grupos descritos abaixo como “heteroalquileno”. Tipicamente, grupo alquila (ou alquileno) conterá de 1 a 24 átomos de carbono,

26/238 com aqueles grupos contendo 10 ou menos átomos de carbono sendo preferidos na presente invenção. “Alquila baixo” ou “alquileno baixo” é um grupo alquila ou alquileno com cadeia mais curta, geralmente com oito ou menos átomos de carbono.

Os termos “alcóxi”, “alquilamino” e “alquiltio” (ou tioalcóxi) são utilizados em seu sentido convencional, e referem-se àqueles grupos alquila que estão unidos ao resto da molécula por meio de átomo de oxigênio, grupo amino ou átomo de enxofre, respectivamente.

O termo “heteroalquila”, por si só ou combinado a outro termo, significa, a não ser se afirmado de outra forma, um radical hidrocarboneto estável com cadeia linear ou ramificada, ou é cíclico, ou combinações destes, constituído pelo número informado de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo formado por O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e de enxofre podem estar opcionalmente oxidados e o heteroátomo nitrogênio pode ser opcionalmente quaternário. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si pode estar posicionados em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição na qual o grupo alquila está unido ao resto da molécula. Exemplos incluem, entre outros, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH₃)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH₂CH_2i -S(O)-CH_3i -CH2-GH₂-S(O)2-CH₃, -CH=CH-O-CH_3i -Sí(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ e CH=CH-N(CH₃)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, como, por exemplo, CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-Si(CH₃)₃. Igualmente, o termo “heteroalquileno”, por si só ou como parte de outro substituinte, significa um radical divalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, entre outros, por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, o mesmo ou diferentes heteroátomos podem ocupar também qualquer uma ou ambas as terminações da cadeia (incluindo, entre outros, alquilenóxi, alquilenodioxi, alquileno-amino, alquilenodiamino, aminoxi-alquileno e os semelhantes). Adicionalmente, para grupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação está implícita pela direção na qual a fórmula do grupo de ligação é escrito. Por exemplo, a fórmula -C(O)₂R’- representa -C(O)₂R’- e -R’C(O)2-.

Os termos “cicloalquila” e “heterocicloalquila”, por si mesmos ou combinados com outros termos, representam, a não ser se afirmado de outra forma, versões cíclicas de “alquila” e “heteroalquila”, respectivamente. Portanto, cicloalquila ou heterocicloalquila incluem ligações em anel saturadas e insaturadas. Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual 0 heterociclo está unido ao resto da molécula. Exemplos de cicloalquila incluem, entre outros, ciclopentila, ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3ciclohexenila, cicloheptila e os semelhantes. Exemplos de heterocicloalquila incluem, entre outros, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetrahidrofuran-2-ila, tetrahidrofuran-3-ila, tetrahidrotien-2-ila, tetrahidrotien-3ila, 1-piperazinila, 2-piperazinila e os semelhantes.

Neste relatório descritivo, 0 termo “polímero solúvel em água” refere-se a qualquer

27/238 polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a fEPO pode resultar em alterações incluindo, mas não limitado a, meia-vida sérica aumentada ou modulada ou meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, características moduladas de associação física tais como agregação e formação de multímero, ligação alterada ao receptor e dimerização ou multimerização alterada do receptor. O polímero solúvel em água pode ou não ter sua própria atividade biológica. Polímeros adequados incluem, entre outros, polietilenoglicol, polietilenoglicol propinaldeído, derivados mono CrCio alcóxi ou arilóxi destes (descritos na Patente U.S.N⁰ 5 252 714, aqui incorporada por referência neste pedido de patente), monometoxipolietilenoglicol, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, anidrido maléico de divinil éter, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropilenoglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilenado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, entre outros, metilcelulose e carboximetilcelulose, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquileno glicol e seus derivados, copolímeros de polialquileno glicóis e seus derivados, polivinil etil éteres e alfa-betapoli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e os semelhantes ou misturas destes. Exemplos destes polímeros solúveis em água incluem, entre outros, polietilenoglicol e albumina sérica.

Neste relatório descritivo, o termo polialquileno glicol refere-se ao polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polibutilenoglicol e derivados destes. O termo “polialquileno glicol” abrange polímeros lineares e ramificados com peso molecular médio entre 1 kDa e 100 kDa. Outras modalidades exemplares estão listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, tais como o catálogo da Shearwater Corporation Polyethylene Glycol and Derívatives for Biomedical Applications (2001).

O termo “arila” significa, a não ser que afirmado de outra forma, um substituinte hidrocarboneto aromático poli-insaturado que pode ser formado por um único anel ou múltiplos aneis (de preferência de 1 a 3 aneis), os quais estão fundidos ou ligados covalentemente. O termo “heteroarila” refere-se a grupos arila (ou aneis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, em que os átomos de nitrogênio e de enxofre estão opcionalmente oxidados e o(s) átomo(s) de nitrogênio ser(em) opcionalmente quaternário(s). Um grupo heteroarila pode estar unido ao resto da molécula por um heteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolil, 3-isoxazolila, 4-isoxazolil, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila e 6-quinolila. Substitu28/238 intes para cada um dos sistemas arila e heteroarila em anel acima são selecionados a partir do grupo constituído por substituintes aceitáveis descritos abaixo.

Resumidamente, o termo “arila” quando utilizado em combinação com outros termos (incluindo, entre outros, arilóxi, ariltioxi, arilalquila) inclui aneis arila e heteroarila como definidos acima. Portanto, o termo “arilalquila” destina-se a incluir aqueles radicais nos quais um grupo arila está unido a um grupo alquila (incluindo, entre outros, benzila, fenetila, piridilmetila e os semelhantes), inclusive aqueles grupos alqulila nos quais um átomo de carbono (incluindo, entre outros, grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (incluindo, entre outros, fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1-naftiloxi)propila e os semelhantes).

Cada um dos termos acima (incluindo, entre outros, “alquila”, “heteroalquila”, “arila” e “heteroarila”) destina-se a incluir formas substituídas e não substituídas do radical indicado. Substituintes exemplares para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.

Substituintes para os radicais alquila e heteroalquila (incluindo aqueles grupos frequentemente referidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados a partir de, entre outros: -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO₂R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R’”, -NR”C(O)₂R’, -NR-C(NR’R”R’”)=NR””, -NR-C(NR’R”)=NR’”, S(O)R’, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -NRSO₂R’, -CN e -NO₂ em número variando de zero a (2m’+1), em que m’ é o número total de átomos de carbono neste radical. R’, R”, R’” e R”” referem-se cada um independentemente a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo, entre outros, arila substituído com 1-3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção incluir mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente, como o é cada um dos grupos R’, R”, R’” e R”” quando mais de um destes grupos estiver presente. Quando unidos ao mesmo átomo de nitrogênio, R’ e R” podem se combinar com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou de 7 membros. Por exemplo, -NR’R” pretende incluir, entre outros, 1pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir da discussão acima sobre substituintes, qualquer técnico versado no assunto entenderá que o termo “alquila” destina-se a incluir grupos incluindo átomos de carbono unidos a outros grupos diferentes de hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, entre outros, -CF₃ e -CH₂CF₃) e acila (incluindo, entre outros, -C(O)CH₃, C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ e os semelhantes).

Semelhantemente aos substituintes descritos para o radical alquila, substituintes para os grupos arila e heteroarila são variados e selecionados a partir de, entre outros: halogênio, -OR’, =0, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -SiR’R”R’”, -OC(O)R’, -C(O)R’,

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-CO₂R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)₂R’, -NRC(NR’R”R”’)=NR””, -NR-C(NR’R”)=NR”’, -S(O)R’, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -NRSO₂R’, -CN e NO₂, -R’, -N_3j -CH(Ph)₂, flúoríCrC^alcóxi e flúor(Ci-C₄)alquila, em número variando de zero ao número total de valências abertas no sistema aromático em anel, e em que R’, R”, R’” e R”” são selecionados independentemente a partir de hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila. Quando um composto da invenção incluir mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como o são cada um dos grupos R’, R”, R’” e R” quando mais de um destes grupos estiver presente.

Neste relatório descritivo, o termo modular a meia-vida sérica significa alterar negativa ou positivamente a meia-vida circulante de uma molécula biologicamente ativa modificada em relação à sua forma não modificada. Meia-vida sérica é mensurada por amostras de sangue coletadas em vários momentos após administração da molécula biologicamente ativa, e determinação da concentração daquela molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permitir calcular a meia-vida sérica. Aumentar meia-vida sérica significa desejadamente aumento de pelo menos aproximadamente o dobro, porém menor aumento pode ser útil, por exemplo, se este possibilita um regime de administração satisfatório ou se evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, o aumento é de pelo menos aproximadamente três vezes, pelo menos aproximadamente cinco vezes ou pelo menos aproximadamente dez vezes.

O termo “modular a meia-vida terapêutica”, neste relatório descritivo, significa alterar positiva ou negativamente a meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula biologicamente ativa modificada, em relação à sua forma não modificada. Meiavida terapêutica é mensurada medindo-se propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas da molécula em vários momentos após a administração. Aumentar a meia-vida terapêutica desejavelmente possibilita um determinado regime de administração benéfico, uma determinada dose total benéfica ou evita um efeito indesejado. Em algumas modalidades, a meia-vida terapêutica aumentada resulta de potência aumentada, ligação aumentada ou diminuída da molécula modificada a seu alvo, ou aumento ou diminuição em outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada.

O termo isolado, quando aplicado a um ácido nucléico ou proteína, indica que o ácido nucléico ou a proteína está substancialmente livre de outros componentes celulares com os quais está associado no estado natural. Este pode estar em estado homogêneo. Substâncias isoladas podem estar em estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo, mas não limitado a, solução aquosa. Pureza e homogeneidade são determinadas tipicamente por técnicas químicas analíticas tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em um preparado está substancialmente purificada. Especificamente, um gene isola30/238 do é separado de quadros de leitura aberta que ladeiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo purificado indica que um ácido nucléico ou proteína dá origem a substancialmente uma única banda em gel eletroforético. Especialmente, significa que o ácido nucléico ou a proteína é pelo menos 85% pura, pelo menos 90% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 99% pura ou é mais pura.

O termo ácido nucléico refere-se aos desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros em forma de fita simples ou fita dupla. A não ser que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucléicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais com propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucléico de referência, e são metabolizados em maneira semelhante aos nucleotídeos naturais. A não ser se indicado em contrário, uma sequência específica de ácido nucléico abrange também implicitamente seus variantes modificados de maneira conservadora (incluindo, entre outros, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, códons degenerados podem ser substituídos gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída com resíduos de bases mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Cassol et al. (1992); Rossolini etal., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Os termos “polipeptídeo,” “peptídeo” e “proteína” são usados alternadamente, neste relatório descritivo, para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos naturais, bem como polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido não codificado naturalmente. Neste relatório descritivo, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer extensão, incluindo proteínas completas (ou seja, antígenos), em que os resíduos de aminoácidos estão unidos por ligações peptídicas covalentes.

Anticorpos são proteínas que exibem especificidade de ligação a um antígeno específico. Anticorpos nativos são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está unida a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve possui também pontes dissulfeto regularmente espaçadas dentro da cadeia. Cada cadeia pesada possui em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por alguns domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos específicos de aminoácidos

31/238 formem uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da pesada.

O termo variável refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente em sequência entre anticorpos, e são responsáveis pela especificidade de ligação de cada anticorpo em particular por seu antígeno em particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis de anticorpos. Esta se concentra em três segmentos denominados Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) tanto nos domínios variáveis da cadeia leve como da pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões framework (FR). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas compreendem cada quatro regiões FR, adotando em grande parte a configuração de folha-β, conectadas por três ou quatro CDRs, que formam alças que se conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura em folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de Um anticorpo a um antígeno, porém exibem várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, anticorpos ou imunoglobulinas podem ser designados para diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4; lgA1 e lgA2. As regiões constantes da cadeia pesada correspondentes às diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. Das várias classes de imunoglobulinas humanas, somente lgG1, lgG2, lgG3 e IgM humanas são conhecidas por ativarem complemento.

In vivo, a maturação de afinidade de anticorpos é direcionada para seleção por antígenos de variantes de anticorpo com afinidade mais alta, os quais são feitos primariamente por hipermutagênese somática. Um deslocamento de repertório ocorre também frequentemente, no qual os genes de linhagens germinativas predominantes da resposta secundária ou terciária são vistos como diferentes daqueles da resposta primária ou secundária.

O processo de maturação de afinidade do sistema imune pode ser replicado pela introdução in vitro de mutações em genes de anticorpos e usando seleção por afinidade para isolar mutantes com afinidade melhorada. Estes anticorpos mutantes podem ser exibidos na superfície de bacteriófagos filamentosos ou microrganismos tais como leveduras, e anticorpos podem ser selecionados por sua afinidade pelo antígeno ou por sua cinética de dissociação (off-rate) do antígeno. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). Mutagênese induzida pela técnica de CDR walking (caminhada de CDR) foi empregada para maturar a

32/238 afinidade de anticorpos humanos que ligam a glicoproteína humana do envelope gp120 do vírus tipo da imunodeficiência humana (HIV-1) (Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994); e Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)); e um fragmento Fv de cadeia única anti-c-erbB-2 (Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)). Empilhamento (shuffling) de cadeias de anticorpos e mutagênese de CDR foram utilizados para maturar a afinidade de um anticorpo humano de alta afinidade direcionado contra a Terceira alça hipervariável de HIV (Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)). Balint e Larrick Gene 137:109-118 (1993) descrevem mutagênese com varredura direcionada para oligodesoxirribonubleotídeos assistida por computador, pela qual todas as CDRs de um gene de região variável são simultânea e completamente pesquisadas para detecção de variantes melhores. A maturação da afinidade de um anticorpo humanizado específico contra ανβ3 foi obtida usando uma estratégia inicial de mutagênese limitada na qual foi introduzida mutação em cada posição de todas as seis CDRs, seguida pela expressão e varredura de uma biblioteca combinatorial, incluindo os mutantes com afinidade mais alta (Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)). Anticorpos exibidos em fagos são revisados em Chiswell e McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); e Rader e Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508 (1997). Em cada caso em que anticorpos mutantes com melhor afinidade, em comparação a um anticorpo precursor, são relatados nas referências acima, o anticorpo mutante apresenta substituições de aminoácidos em uma CDR.

Maturação de afinidade, neste relatório descritivo, significa o processo de intensificar a afinidade de um anticorpo por seu antígeno. Métodos para maturação de afinidade incluem, entre outros, métodos de varredura computacional e métodos experimentais.

Anticorpo, neste relatório descritivo, significa uma proteína constituída por um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por todos ou por parte dos genes do anticorpo. Os genes de imunoglobulinas incluem, entre outros, os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama (lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), delta, epsilon e um, bem como os genes da região variável de uma miríade de imunoglobulinas. Anticorpo, neste relatório descritivo, destina-se a incluir anticorpos completos e fragmentos de anticorpos, além de anticorpos que existem naturalmente em qualquer organismo ou aqueles construídos (por exemplo, são variantes).

Fragmento de anticorpo significa qualquer forma de um anticorpo diferente da forma completa. Fragmentos de anticorpo, neste relatório descritivo, incluem anticorpos que são fragmentos menores que existem dentro de anticorpos completos e anticorpos que foram construídos por engenharia. Fragmentos de anticorpos incluem, entre outros, Fv, Fc, Fab e (Fab')₂, Fv de cadeia única (scFv), diabodies, triabodies, tetrabodies, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões framework, regiões constantes e os semelhantes (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev.

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Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402).

O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos de ocorrência natural ou não, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam em maneira semelhante aos aminoácidos naturais. Aminoácidos naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos cuja estrutura química básica é igual à de um aminoácido natural, ou seja, um carbono α ligado a hidrogênio, grupo carboxila, grupo amino e grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil-metionina-sulfônio. Estes análogos possuem grupos R modificados (tal como, norleucina) ou cadeias peptídicas principais modificadas, porém retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural.

Aminoácidos podem ser referidos, neste relatório descritivo, por seus símbolos comumente conhecido de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos comumente aceitos de uma única letra.

“Variantes modificados de maneira conservadora” aplicam-se a sequências de aminoácidos e de ácido nucléico. No que diz respeito a determinadas sequências de ácido nucléico, “variantes modificados de maneira conservadora” refere-se àqueles ácidos nucléicos que codificam sequências idênticas ou essencialmente idênticas de aminoácidos, ou em que o ácido nucléico não codifica uma sequência de aminoácidos para sequências essencialmente idênticas. Dado à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam, todos eles, o aminoácido alanina. Portanto, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Essas variações de ácidos nucléicos são “variações silenciosas”, as quais são uma espécie de variações modificadas de maneira conservadora. Toda sequência de ácido nucléico, neste relatório descritivo, que codifica um polipeptídeo descreve também toda possível variação silenciosa do ácido nucléico. Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, o qual é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, o qual é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Dessa forma, cada variação silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

Quanto às sequências de aminoácidos, aqueles versados no estado da técnica re34/238 conhecerão que substituições, deleções ou adições individuais a um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência protéica que altere, adicione ou delete um único aminoácido ou um percentual pequeno de aminoácidos na sequência codificada é um “variante modificado de maneira conservadora”, no sentido de que a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituição conservadora, fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes, são bem conhecidas no estado da técnica. Estes variantes modificados de maneira conservadora se acrescentam e não excluem variantes polimórficos, homólogos entre espécies e alelos da invenção.

Os oito grupos a seguir, cada um, contêm aminoácidos que são substituições conservadoras para outro:

)Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) lsoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); e

8) Cisteína (C), Metionina (M) (Consultar, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (\N H Freeman & Co.; 2^a edição (Dezembro 1993)

Os termos “idênticos” ou percentuais de “identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucléico ou polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subseqüências que são as mesmas. Sequências são substancialmente idênticas se apresentarem percentual igual de resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos (ou seja, aproximadamente 60% de identidade, opcionalmente aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% ou com aproximadamente 95% de identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual. Essa definição refere-se também ao complemento de uma sequência em teste. A identidade pode existir sobre uma região formada por pelo menos aproximadamente 50 aminoácidos ou nucleotídeos em extensão, ou sobre uma região formada por 75-100 aminoácidos ou nucleotídeos em extensão, ou, quando não especificado, na sequência inteira ou um polinucleotídeo ou polipeptídeo.

Para comparação de sequências, uma sequência atua tipicamente como sequência de referência para a qual sequências testadas são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequências, sequências em teste e de referência são introduzidas em

35/238 um computador, coordenadas de subsequências são designadas, se necessário, e parâmetros do programa de algoritmo de sequências são designados. Parâmetros padrão do programa podem ser utilizados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então o percentual de identidades de sequência para as sequências em teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

“Janela de comparação”, neste relatório descritivo, inclui referência a um segmento de qualquer número de posições contíguas, selecionado a partir do grupo constituído por 20 a 600, geralmente em torno de 50 a em torno de 200, mais geralmente em torno de 100 a em torno de 150, no qual uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências são alinhadas do modo mais adequado. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido por, incluindo, entre outros, o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 85:2444, por implementações informatizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Softwares da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) ou por alinhamento manual e inspeção visual (consultar, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).

Um exemplo de algoritmo adequado para determinar percentual de identidade de sequência e similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Software para realizar análises com BLAST é disponibilizado para o público pelo National Center for Biotechnology Information. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X, determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão extensão de palavra (W) de 11, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão extensão de palavra de 3 e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915) de alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e comparação de ambas as fitas. O algoritmo BLAST é executado tipicamente com o filtro de baixa complexidade desligado.

O algoritmo BLAST executa também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a pro36/238 habilidade de menor soma (P(N)), a qual indica a probabilidade pela qual um pareamento entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria ao acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de menor soma, em comparação do ácido nucléico testado frente ao ácido nucléico de referência, for inferior a aproximadamente 0,2, mais preferivelmente inferior a aproximadamente 0,01 e, o mais preferível, inferior a aproximadamente 0,001.

A expressão “hibridiza-se seletivamente (ou especificamente) com” refere-se à ligação, formação de duplex ou hibridização de uma molécula somente com uma sequência específica de nucleotídeos sob condições rigorosas de hibridização, quando aquela sequência está presente em uma mistura de complexos (incluindo, entre outros, DNA ou RNA total celular ou de biblioteca).

A expressão “condições rigorosas de hibridização” refere-se a condições de baixa força iônica e alta temperatura conforme é conhecido no estado da técnica. Tipicamente, sob condições rigorosas, uma sonda se hibridizará com sua subsequência-alvo em uma mistura de complexos de ácido nucléico (incluindo, entre outros, DNA ou RNA total celular ou de biblioteca), porém não se hibridiza com outras sequências na mistura de complexos. Condições rigorosas são sequência-dependentes e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Geralmente, condições rigorosas são selecionadas para serem aproximadamente 5-10 °C mais baixo do que o ponto de fusão térmica (Tm) da sequência específica em força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica, pH e concentração nucléica definidos) no qual 50% das sondas complementares ao alvo se hibridizam com a sequência-alvo em equilíbrio (como as sequências-alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Condições rigorosas podem ser aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a em torno de 1,0 M de íon de sódio, tipicamente em torno de 0,01 a 1.0 M de concentração de íon de sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos em torno de 30°C, para sondas curtas (incluindo, mas não limitado a, de 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos em torno de 60°C para sondas longas (incluindo, mas não limitado a, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições rigorosas podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser de pelo menos duas vezes a hibridização histórica, opcionalmente 10 vezes a hibridização histórica. Condições rigorosas exemplares de hibridização podem ser as seguintes: formamida 50%, 5X SSC e SDS 1%, incubação a 42 °C, ou 5Χ SSC, SDS 1%, incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2X SSC e SDS 0,1% a 65 °C. Estas

37/238 lavagens podem ser realizadas por 5, 15, 30, 60,120 ou mais minutos.

Neste relatório descritivo, o termo “eucarioto” refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya tais como animais (incluindo, entre outros, mamíferos, insetos, répteis, pássaros, etc.), ciliados, plantas (incluindo, mas não limitado a, monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporídeos, protistas, etc.

“Célula eucariótica” e células eucarióticas incluem, a título de exemplo, células de mamíferos, tais como CHO, de mieloma, BHK, células imunes, células de inseto, células de aves, células de anfíbios, por exemplo, oócitos de sapo, células de fungos e de leveduras. Leveduras incluem, a título de exemplo, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Yarrowia, Pichia, et al. Leveduras especialmente preferidas para expressão incluem cepas metilotróficas de leveduras, por exemplo, Pichia pastoris, Hansenula, polymorpha, Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera, et al. (Consultar, por exemplo, as Patentes U.S. N^os 4 812 405, 4 818 700, 4 929 555, 5 736 383, 5 955 349, 5 888 768 e 6 258 559, cada uma destas aqui incorporadas por referência para todos os fins). Estas e outras patentes descrevem ainda sequências promotoras, terminadoras, intensificadoras, sinalizadoras e outras sequências reguladoras úteis para facilitar a expressão de gene heterólogo em leveduras, por exemplo, genes de proteína como na presente invenção.

Neste relatório descritivo, o termo transformação será utilizado em sentido amplo para referir-se a qualquer introdução de DNA em célula hospedeira receptora que altera o genótipo e consequentemente resulta em alteração na célula receptora.

Neste relatório descritivo, o termo “não eucarioto” refere-se a organismos não eucarióticos. Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (incluindo, entre outros, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, etc.), ou Archaea (incluindo, entre outros, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tais como Haloferax volcanii e NRC-1 da espécie Halobacterium, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).

O termo sujeito, neste relatório descritivo, refere-se a um animal, de preferência, mamífero, mais preferivelmente um ser humano, que é objeto de tratamento, observação ou experimento.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Aqueles versados no estado da técnica serão capazes de desenvolver e utilizar os mesmos métodos fornecidos abaixo para a composição de eritropoetina felina, e métodos correlatos para composições, e métodos relacionados à eritropoetina canina (cEPO) (SEQ ID NO: 31 sequência madura de aminoácidos, SEQ ID NO: 30 sequência completa de aminoácidos) e eritropoetina equina (eEPO) (SEQ ID NO: 33 sequência madura de aminoáci38/238 dos, SEQ ID NO: 32 sequência completa de aminoácidos), para cEPO e eEPO com um aminoácido artificial, não natural e/ou não codificado naturalmente incorporado nos polipeptídeos de cEPO e eEPO; Estes polipeptídeos podem ser usados como aqui descritos para tratamento de felinos e animais em necessidade deste, ou podem ser utilizados no tratamento de caninos ou equinos. As Figuras 34 e 35 fornecem comparações entre cada uma das sequências de 166 aminoácidos, para cEPO e eEPO, em relação à fEPO (166 aminoácidos), a qual é discutida mais detalhadamente neste relatório descritivo, porém a descrição fornece suporte também para a substituição, adição ou deleção de um aminoácido não codificado naturalmente para SEQ ID NO.s 31 e 33, cEPO e eEPO respectivamente.

I.Introdução

Moléculas de EPO felina compreendendo pelo menos um aminoácido não-natural são providas na invenção. Em certas modalidades da invenção, a EPO com pelo menos um aminoácido não-natural inclui pelo menos uma modificação pós-traducional. Em uma modalidade, a pelo menos única modificação pós-traducional compreende a ligação de uma molécula (incluindo, entre outros, corante, polímero, incluindo, entre outros, derivado de polietilenoglicol, foto-reticulante, composto citotóxico, marcador de afinidade, derivado de biotina, resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, quelante de metal, co-fator, ácido graxo, carboidrato, polinucleotídeo (incluindo, entre outros, DNA, RNA, etc.), compreendendo um segundo grupo reativo, ao pelo menos único aminoácido não-natural compreendendo um primeiro grupo reativo, utilizando metodologia química conhecida para aqueles versados no estado da técnica como adequada para os grupos reativos em especial. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é um grupo alquila (incluindo, entre outros, no aminoácido não-natural p-propargiloxifenilalanina, em que o grupo propargila é também às vezes referido como grupo acetileno) e o segundo grupo reativo é um grupo azido, e metodologias químicas de cicloadição [3+2] são utilizadas. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupo azido (incluindo, entre outros, no aminoácido não-natural pazido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo, o grupo alquinila. Em certas modalidades da fEPO modificada da presente invenção, pelo menos um aminoácido não-natural (incluindo, entre outros, aminoácido não-natural contendo grupo funcional ceto), compreendendo pelo menos uma modificação pós-traducional, é utilizado, em que a pelo menos única modificação pós-traducional compreende um grupo sacarídico. Em certas modalidades, a modificação pós-traducional é feita in vivo em célula eucariótica ou célula não eucariótica.

Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação póstraducional que é feita in vivo por uma célula hospedeira, em que a modificação póstraducional não é normalmente feita por outro tipo de célula hospedeira. Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-traducional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que a modificação pós-traducional não é normalmente feita por

39/238 uma célula não eucariótica. Exemplos de modificações pós-traducionais incluem, mas não estão limitados a, acetilação, acilação, modificação lipídica, palmitoilação adição de palmitato, fosforilação, modificação em ligação de glicolipídios e as semelhantes. Em uma modalidade, a modificação pós-traducional compreende unir um oligossacarídeo a uma asparagina por ligação GlcNAc-asparagina (incluindo, entre outros, em que o oligossacarídeo compreende (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc, e os semelhantes). Em outra modalidade, a modificação pós-traducional compreende unir um oligossacarídeo (incluindo, entre outros, Gal-GaINAc, Gal-GIcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por ligação GaINAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina. Em certas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo da invenção pode compreender sequência de secreção ou de localização, tag (etiqueta) de epítopo, tag FLAG, tag de polihistidina, fusão GST e/ou os semelhantes.

A proteína ou polipeptídeo de interesse pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não-naturais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais diferentes sítios na proteína que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais diferentes aminoácidos não-naturais. Em certas modalidades, pelo menos um, porém menos do que todos, de um determinado aminoácido presente em uma versão natural da proteína está substituído com um aminoácido não-natural.

A presente invenção provê métodos e composições à base de membros da família supergene GH, especialmente fEPO, compreendendo pelo menos um aminoácido não codificado naturalmente. A introdução de pelo menos um aminoácido não codificado naturalmente em um membro da família supergene GH, tal como fEPO, pode possibilitar a aplicação de técnicas químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas, incluindo, mas não limitado a, com um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, embora sem reagir com os 20 aminoácidos comumente existentes. Em algumas modalidades, o membro da família supergene GH, tal como fEPO, compreendendo o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol (PEG), por intermédio da cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Esta invenção provê um método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, o qual envolve a incorporação seletiva de aminoácidos não codificados geneticamente, incluindo, entre outros, aqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados nos 20 aminoácidos naturalmente incorporados, incluindo, entre outros, grupo azida ou acetileno, em proteínas em resposta a um códon seletor e a modificação subsequente daqueles aminoácidos com um derivado de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporado, as cadeias laterais do aminoácido podem ser então modificadas por metodologias químicas conhecidas por qualquer técnico versado no assunto como

40/238 adequadas para os grupos funcionais ou substituintes em especial, presentes no aminoácido naturalmente codificado. Metodologias químicas conhecidas de uma ampla variedade são adequadas para uso na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína. Estas metodologias incluem, mas não estão limitadas a, reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (consultar, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cicloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) com, incluindo, entre outros, derivados de acetileno ou azida, respectivamente.

O método de cicloadição [3+2] de Huisgen [3+2] envolve uma cicloadição mais do que uma reação de substituição nucleofílica, portanto, é possível modificar proteínas com seletividade extremamente alta. A reação pode ser conduzida a temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) bela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(l) à mistura da reação.Consultar, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; e WO 03/101972. Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção por meio de cicloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com grupo funcional ou substituinte adequado, incluindo, entre outros, derivado azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não-natural com grupo acetileno, incluindo, entre outros, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, entre outros, pazido-fenilalanina, respectivamente.

O anel de cinco membros resultante da cicloadição [3+2] de Huisgen não é geralmente reversível em ambientes redutores e é estável contra hidrólise por períodos prolongados em ambientes aquosos. Consequentemente, as características físicas e químicas de uma ampla variedade de substâncias podem ser modificadas sob exigentes condições aquosas com os derivados PEG ativos da presente invenção. De modo mais importante ainda, pelo fato de os grupos azida e acetileno serem mutuamente específicos (e não reagirem, por exemplo, com qualquer um dos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados), proteínas podem ser modificadas em um ou mais sítios específicos com seletividade extremamente alta.

A invenção provê também derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e de polímeros hidrofílicos relacionados com um ou mais grupos acetileno ou azida. Os derivados de polímero PEG que contêm grupos acetileno são altamente seletivos para acoplamento com grupos azida que foram introduzidos seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor. Igualmente, derivados de polímero PEG que contêm grupos azida são altamente seletivos para acoplamento com grupos acetileno que foram introduzidos seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor.

Mais especificamente, os grupos azida compreendem, entre outros, alquil azidas,

41/238 aril azidas e derivados destas azidas. Os derivados das alquil e aril azidas podem incluir outros substituintes de modo que a reatividade específica para acetileno seja mantida. Os grupos acetileno compreendem alquil e aril acetilenos e derivados de cada um. Os derivados dos alquil e aril acetilenos podem incluir outros substituintes desde que a reatividade específica para azida seja mantida.

A presente invenção provê conjugados de substâncias com uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou grupos, com outras substâncias incluindo, mas não limitadas a, polímeros solúveis em água tais como PEG, proteínas, fármacos, pequenas moléculas, biomateriais ou qualquer outro composto ou substância desejável. A presente invenção inclui também conjugados de substâncias contendo grupos azida ou acetileno com derivados de polímero PEG contendo os grupos correspondentes acetileno ou azida. Por exemplo, um polímero PEG contendo grupo azida pode ser acoplado a uma molécula biologicamente ativa em uma posição na proteína que contenha um aminoácido não geneticamente codificado carreando uma funcionalidade acetileno. A ligação pela qual o PEG e a molécula biologicamente ativa são acoplados inclui, mas não é limitado a, o produto de cicloadição [3+2] de Huisgen.

Está bem estabelecido no estado da técnica que PEG pode ser utilizado para modificar as superfícies de biomateriais (consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6 610 281; Mehvar, R., J.Pharmaceut. Sei., 3(1):125-136 (2000), a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente). A invenção inclui também biomateriais, compreendendo uma superfície com um ou mais sítios reativos azida ou acetileno, e um ou mais dos polímeros contendo azida ou acetileno da invenção, acoplados à superfície por meio de ligação de cicloadição [3+2] de Huisgen. É possível também acoplar biomateriais e outras substâncias aos derivados de polímeros ativados com azida ou acetileno por meio de ligação diferente daquela de azida ou acetileno, tal como por meio de uma ligação compreendendo ácido carboxílico, amina, álcool ou grupo tiol, para deixar o grupo azida ou acetileno disponível para reações subsequentes.

A invenção inclui um método para sintetizar os polímeros contendo azida e acetileno da invenção. No caso de derivado de PEG contendo azida, a azida pode ser unida diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo azida pode ser preparado unindo um agente de ligação com grupo azida em uma terminação a um polímero convencional ativado de modo que o polímero resultante tenha o grupo azida em sua terminação. No caso de derivado de PEG contendo acetileno, o acetileno pode ser unido diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo acetileno pode ser preparado unindo um agente de ligação com o grupo acetileno em uma terminação a um polímero convencional ativado de modo que o polímero resultante tenha o grupo acetileno em sua terminação.

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Mais especificamente, no caso de derivado de PEG contendo azida, um polímero solúvel em água, carreando pelo menos um grupo hidroxila ativo, sofre uma reação para produzir um polímero substituído com um grupo mais reativo, tal como um grupo de saída mesilato, tresilato, tosilato ou halogênio, no mesmo. O preparo e o uso de derivados de PEG contendo haletos ácidos de sulfonila, átomos de halogênio e outros grupos de saída são bem conhecidos do técnico versado no assunto. O polímero substituído resultante é então submetido a uma reação para substituir o grupo mais reativo por um grupo azida na terminação do polímero. Alternativamente, um polímero solúvel em água com pelo menos um grupo nucleofílico ou eletrofílico ativo é submetido a uma reação com um agente de ligação que tenha azida em uma terminação, de modo que seja formada uma ligação covalente entre o polímero de PEG e o agente de ligação e que o grupo azida se posicione na terminação do polímero. Grupos nucleofílicos e eletrofílicos, incluindo aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, alcoóis, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e os semelhantes, são bem conhecidos para o técnico versado no assunto.

Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo acetileno, um polímero solúvel em água, carreando pelo menos um grupo hidroxila ativo, é submetido a uma reação para deslocar um halogênio ou outro grupo de saída de um precursor que contenha um grupo acetileno. Alternativamente, um polímero solúvel em água com pelo menos grupo nucleofílico ou eletrofílico ativo é submetido a uma reação com um agente de ligação que tenha acetileno em uma terminação de modo que seja formada uma ligação dupla entre o polímero de PEG e o agente de ligação e que o grupo acetileno se posicione na terminação do polímero. O uso de grupos halogênio, grupo de saída ativado, grupos nucleofílicos e eletrofílicos no contexto de síntese orgânica e o preparo e o uso de derivados de PEG estão bem estabelecidos para praticantes do estado da técnica.

A invenção provê também um método para a modificação seletiva de proteínas para adicionar outras substâncias à proteína modificada, incluindo, mas não limitado a, polímeros solúveis em água tais como PEG e derivados de PEG contendo grupo azida ou acetileno. Os derivados de PEG, contendo azida e acetileno, podem ser utilizados para modificar as propriedades de superfícies e moléculas, quando biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e ausência de imunogenicidade são importantes, ao mesmo tempo em que oferecendo um meio mais seletivo para unir os derivados de PEG a proteínas do que previamente conhecido no estado da técnica.

II.Família supergene de hormônio do crescimento

As seguintes proteínas incluem aquelas codificadas por genes da família supergene de hormônio do crescimento (GH) (Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in

Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., Signalling by the He43/238 matopoietic Cytokine Receptors (1996)): hormônio do crescimento, prolactina, lactogênio placentário, eritropoetina (EPO), trombopoetina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibidor de leucemia, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interferon ômega, interferon tau, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos(M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) (a família supergene GH). Prevê-se que membros adicionais desta família de genes serão identificados no futuro através de clonagem e sequênciamento de genes. Membros da família supergene GH exibem estruturas secundárias e terciárias semelhantes, apesar de apresentarem geralmente identidade de sequência de aminoácidos e de DNA limitada. Os atributos estruturais compartilhados permitem que novos membros da família de genes sejam rapidamente identificados. Dado à extensão da homologia estrutural entre os membros da família supergene GH, aminoácidos não codificados naturalmente podem ser incorporados em quaisquer membros da família supergene GH usando a presente invenção.

Estruturas de algumas citocinas, incluindo G-CSF (Hill, C. P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5167-5171 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K„ et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412 (1992)), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 1102911035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)) e IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) foram determinadas por estudos de difração de raios-x e de NMR e revelaram uma conservação acentuada com a estrutura do GH, apesar de ausente homologia primária significativa de sequência. EPO é considerada membro desta família com base em estudos com modelos e de mutagênese (Boissel et al., J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wen et al., J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)). Um grande número de citocinas e fatores de crescimento adicionais, incluindo fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator inibidor de leucemia (LIF), trombopoetina (TPO), oncostatina M, fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 e interferon alfa, beta, ômega, tau e gama, pertence a esta família (revisado em Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and Ihle (1996) Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors). Todas as citocinas e os fatores de crescimento acima são agora considerados compreendidos em uma grande família de genes.

Além de compartilharem estruturas secundárias e terciárias semelhantes, membros desta família compartilham a propriedade de que precisam oligomerizar receptores da superfície celular para ativar vias de sinalização intracelular. Alguns membros da família, incluindo, entre outros, GH e EPO, se ligam a um único tipo de receptor e fazem com que este forme homodímeros. Outros membros da família, incluindo, entre outros, IL-2, IL4. e IL-6, se

44/238 ligam a mais de um tipo de receptor e fazem com que os receptores formem heterodímeros ou agregados de ordem mais alta (Davis etal., (1993) Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural BioIogy5: 114-121 (1995)). Estudos de mutagênese mostraram que, semelhantemente ao GH, estas outras citocinas e fatores de crescimento contêm múltiplos sítios de ligação a receptor, tipicamente dois, e se ligame aos seus receptores cognatos em sequência (Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 9471-9476). De forma semelhante ao GH, os sítios primários de ligação a receptor destes outros membros da família estão situados primariamente nas quatro hélices alfa e na alça A-B. Os aminoácidos específicos nos feixes helicoidais que participam na ligação ao receptor diferem entre os membros da família. A maioria dos receptores de superfície celular que interagem com membros da família supergene GH é estruturalmente relacionada e compreende uma segunda grande família multi-gene. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6 608 183.

Uma conclusão geral alcançada a partir de estudos sobre mutações de vários membros da família supergene GH é a de que as alças unindo as hélices alfa tendem geralmente a não estarem envolvidas na ligação ao receptor. Em especial, a alça curta B-C parece não ser essencial para ligação ao receptor na maioria, se não em todos os membros da família. Por esse motivo, a alça B-C pode ser substituída com aminoácidos não codificados naturalmente, como descrito neste relatório descritivo, em membros da família supergene GH. A alça A-B, a alça C-D (e a alça D-E de interferon/ membros do tipo IL-10 da superfamília GH) podem também ser substituídas com um aminoácido que não ocorra naturalmente. Aminoácidos proximais à hélice A e distais à hélice final tendem a não estarem envolvidos na ligação ao receptor e podem ser também sítios para introduzir aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, um aminoácido não codificado naturalmente está substituído em qualquer posição dentro de uma região de alça, incluindo, entre outros, nas primeiras posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais de aminoácidos da alça A-B, BC, C-D ou alça D-E. Em algumas modalidades, a aminoácido não codificado naturalmente está substituído dentro das últimas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais de aminoácidos da alça A-B, B-C, C-D ou alça D-E.

Certos membros da família GH, incluindo, entre outros, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, p35 de IL-12, IL-13, IL-15 e interferon beta contêm açúcares N-ligados e O-ligados. Os sítios de glicosilação nas proteínas estão situados quase que exclusivamente nas regiões de alça e não nos feixes alfa-helicoidais. As regiões de alças geralmente não estão envolvidas na ligação ao receptor e são sítios para ligação covalente de grupos açúcar, podendo, portanto, servir como sítios para introduzir substituições com aminoácidos não naturais nas proteínas. Aminoácidos N e O-ligados que compreendem os sí45/238 tios de glicosilação nas proteínas podem ser sítios para substituições com aminoácidos não naturais porque estes aminoácidos estão expostos na superfície. Consequentemente, a proteína natural pode tolerar grupos de açúcar volumoso unidos a proteínas nestes sítios, e os sítios de glicosilação tendem a estar situados distantes dos sítios de ligação ao receptor.

Membros adicionais da família gênica GH possivelmente serão descobertos no futuro. Novos membros da família supergene GH podem ser identificados por análises de estruturas secundárias e terciárias das sequências protéicas preditas com auxílio de computador. Membros da família supergene GH possuem tipicamente quatro ou cinco hélices anfipáticas unidas por aminoácidos não helicoidais (as regiões de alças). As proteínas podem conter uma sequência hidrofóbica de sinalização em seu N-terminal para promover secreção a partir da célula. Estes membros descobertos mais tarde da família supergene estão incluídos também dentro desta invenção.

Referência a polipeptídeos de fEPO, neste pedido de patente, destina-se a usar fEPO como exemplo de membro da família supergene GH. Portanto, deve ser entendido que as modificações e as metodologias químicas aqui descritas com referência a fEPO podem ser igualmente aplicadas a quaisquer outros membros da família supergene GH, incluindo aqueles especificamente listados neste pedido de patente.

lll.Sistema de expressão para produtos de interesse de um único ou de múltiplos genes a partir de uma única construção de expressão e usado com a presente invenção

Este pedido de patente descreve novos sistemas de expressão para produzir produtos de interesse de um único ou de múltiplos genes a partir de uma única construção de expressão ou de múltiplas construções de expressão. Em uma modalidade, a presente invenção inclui um sistema eucariótico de supressão de expressão, no qual genes de interesse de proteínas estão suprimidos e são transcritos a partir de um único vetor que codifica todos os elementos necessários para supressão e inclusão de um aminoácido artificial. Em especial, o sistema de expressão contém um vetor capaz de expressar proteínas em células hospedeiras eucarióticas de modo que a(s) referida(s) proteína(s) contenha(m) um aminoácido artificial. O sistema de expressão contém um vetor capaz de expressar proteínas em células hospedeiras eucarióticas de modo que a(s) referida(s) proteína(s) contenha(m) um aminoácido não-natural ou aminoácido artificial. O sistema de expressão contém um vetor capaz de expressar proteínas em células hospedeiras eucarióticas de modo que a(s) referida(s) proteína(s) contenha(m) um aminoácido não codificado naturalmente, tal como, entre outros, p-acetilfenilalanina (pAF). Os vetores de expressão podem compreender os seguintes elementos operacionalmente ligados: cópias únicas ou múltiplas de uma sequência de tRNA supressor, incluindo promotores e terminadores de transcrição operáveis em célula eucariótica; um promotor ligado a uma sequência de DNA que codifica qualquer gene de interesse a ser expresso (ou suprimido) e um promotor ligado a uma região codificadora de

46/238 tRNA sintetase funcional de mamíferos. Uma modalidade da presente invenção são células de mamíferos contendo o vetor de supressão de expressão, e um método para suprimir proteínas funcionais em células de mamíferos transfectadas com o vetor de supressão de expressão.

Esta invenção pertence também à supressão de expressão de proteínas funcionais em níveis adequados de expressão por meio de um sistema de expressão em célula hospedeira eucariótica. Em uma modalidade, a invenção refere-se à supressão de expressão de proteínas funcionais em células eucarióticas, de preferência células de mamíferos, fungos ou de leveduras e ainda mais preferivelmente células CHO (Ovário de Hamster Chinês), usando um sistema de supressão de expressão.

Mais especificamente, uma modalidade da presente invenção refere-se à supressão de expressão de proteínas funcionais em células eucarióticas, por exemplo, células de mamíferos, fungos ou de leveduras usando um sistema de supressão de expressão, em que todos os elementos de supressão estão contidos em um único vetor. Uma modalidade da presente invenção refere-se à supressão de expressão de proteínas funcionais em células CHO (Ovário de Hamster Chinês) (células depositadas no banco da ATCC, bem como variantes conhecidos e células e/ou linhagens celulares que aqueles versados no estado da técnica saberíam que podería ser utilizado no lugar de células CHO), usando um sistema de supressão de expressão em que todos os elementos de supressão estão contidos em um único vetor. Em um aspecto desta modalidade da invenção, a supressão de expressão de proteínas funcionais em células de mamíferos compreende usar um sistema de supressão de expressão compreendendo tRNA, tRNA sintetase e elementos de transcrição/tradução da proteína de interesse.

Outra modalidade da invenção oferece a opção de incluir um único ou múltiplos elementos de tRNA em orientação transcricional independente para modular efetivamente níveis de expressão intracelular. Em outra modalidade, a invenção oferece a opção de incluir uma única unidade transcricional que codifica uma única proteína de interesse na qual o aminoácido artificial deve ser introduzido. Outra modalidade da invenção oferece a opção de incluir múltiplas unidades transcricionais que codificam múltiplas proteínas de interesse ou suas subunidades (tal como cadeias leves e pesadas de anticorpo) nas quais o aminoácido artificial deve ser introduzido em qualquer uma ou em ambas as proteínas.

Outra modalidade da invenção é uma linhagem de célula eucariótica, tal como linhagem de célula CHO, que secreta a proteína suprimida, em que a expressão da referida proteína é efetuada por intermédio do sistema de supressão de expressão descrito neste pedido de patente. Em algumas modalidades, a célula eucariótica é célula CHO ou célula de levedura, por exemplo, Pichia. Outra modalidade da invenção é uma cultura de células de mamífero ou de levedura, compreendendo um sistema de supressão de expressão capaz de

47/238 produzir proteínas funcionais suprimidas. Vetores contendo sequências de supressão de expressão de acordo com a invenção podem ser introduzidos em células de mamíferos ou de leveduras. Durante o cultivo de células, sequências desejadas de DNA exógeno podem ser introduzidas de modo a serem direcionadas para células de mamíferos ou de leveduras, de modo que aquele DNA exógeno é inserido no genoma das células de mamíferos ou de leveduras aleatoriamente ou por recombinação homóloga. Dependendo das sequências empregadas, proteínas funcionais suprimidas podem ser recuperadas a partir da biomassa da cultura celular ou do meio da cultura celular.

Ainda outra modalidade da presente invenção é um método de produzir proteínas funcionais suprimidas, compreendendo células eucarióticas cultivadas, de preferência células de mamíferos ou de leveduras contendo um sistema de supressão de expressão que expressa sequências de cadeias leves e pesadas de anticorpo, e recuperação de anticorpos funcionais a partir da cultura celular. Os anticorpos funcionais podem ser produzidos em culturas celulares em batelada em níveis adequados para uso terapêutico sob condições otimizadas para rendimento comercial máximo. Por exemplo, células CHO que são cultivadas em batelada, nas quais níveis de glicose são continuamente controlados, são capazes de produzir proteína recombinante por pelo menos 12 dias ou mais. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6 180 401 para uma discussão relativa ao rendimento de proteína recombinante por células cultivadas em culturas de batelada.

Uma variedade de diferentes tipos de proteínas pode ser expressa de acordo com a presente invenção. Tipos de proteínas incluem polipeptídeos únicos ou múltiplos polipeptídeos organizados, tais como, entre outros, anticorpos. Para fins desta invenção, inúmeros sistemas de vetor de supressão de expressão podem ser empregados. Por exemplo, um vetor de supressão de expressão pode conter elementos de DNA que são derivados de bactérias, tais como, mas não limitado a: E. coli, Bacillus, Salmonella; vírus de animais tais como papilomavírus bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus Vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Adicionalmente, células que integraram a construção de DNA de supressão de expressão em seus cromossomos podem ser selecionadas pela introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode proporcionar qualquer meio conhecido daqueles versados no estado da técnica para seleção, incluindo, entre outros, prototrofia para hospedeiro auxotrófico, resistência biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados, tais como cobre. O gene marcador selecionável pode ser ligado diretamente às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Elementos adicionais que podem ser usados para otimizar a síntese de mRNA podem sinais de splicing (recomposição), bem como promotores transcricionais, intensificadores e sinais de terminação.

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Mais geralmente, uma vez preparado o vetor ou sequência de DNA codificadora da subunidade protéica, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Ou seja, as células hospedeiras podem ser transformadas. O plasmídeo pode ser introduzido na célula hospedeira por várias técnicas conhecidas daqueles versados no estado da técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas a, transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fusão protoplástica, precipitação com fosfato de cálcio, fusão de célula com envelope de DNA, microinjeção, PEI e infecção com vírus intacto. Consultar, Ridgway, A. A. G. Mammalian Expression Vectors Capítulo 24.2, pág. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). O mais preferível para integração estável de vetores é a introdução no hospedeiro por eletroporação. As células transformadas são cultivadas sob condições apropriadas para a produção da proteína e analisadas quanto às proteínas sintetizadas. Técnicas exemplares de ensaio para identificar e para quantificar produtos gênicos de interesse incluem ensaio imunoenzimático (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou análise por separados de células ativadas por fluorescência (FACS), imunohistoquímica ou as semelhantes.

Em uma modalidade da presente invenção, a linhagem celular hospedeira usada para expressão de proteínas é de origem mamífera. Aqueles versados no estado da técnica são capazes de determinar rapidamente células hospedeiras ou linhagens celulares que seriam adequadas para expressão de um produto gênico desejado. Exemplos de linhagens de células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, DHFR menos), derivadas de CHO-K1, CHO-S, HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (derivada de CVI com antígeno T de SV40), R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3.times.63Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Células CHO são especialmente preferidas. Células hospedeiras ou linhagens celulares são disponibilizadas tipicamente por serviços comerciais, a coleção American Tissue Culture Collection ou a partir da literatura publicada.

A produção in vitro pode ser incrementada para fornecer grandes quantidades do polipeptídeo produzido, usando o sistema de supressão de expressão. Técnicas para o cultivo de células eucarióticas, por exemplo, de mamíferos ou leveduras, sob condições conhecidas no estado da técnica para cultura de tecidos, e incluem cultura em suspensão homogênea, por exemplo, em reator tipo airlift ou em reator misturador contínuo, ou cultura de células imobilizadas ou aprisionadas, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, sobre microesferas de agarose ou cartuchos cerâmicos. Para isolamento e recuperação dos anticorpos, as imunoglobulinas nos sobrenadantes da cultura podem ser primeiramente concentradas, por exemplo, por precipitação com sulfato de amônio, diálise contra material higros49/238 cópico, tal como PEG, filtração através de membranas seletivas, ou os semelhantes. Se necessário e/ou desejado, as soluções concentradas de anticorpos multivalentes são purificadas pelos métodos habituais de cromatografia, por exemplo, filtração em gel, cromatografia por troca iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia por (imuno)afinidade.

Em uma modalidade da presente invenção, as células eucarióticas utilizadas para expressão células de mamíferos ou de leveduras. Em outra modalidade da presente invenção, as células eucarióticas utilizadas para expressão são células CHO. Em uma modalidade adicional da presente invenção, as células eucarióticas utilizadas para expressão são outras células que podem ser eficientemente cultivadas para produção protéica em alto nível. Como notado acima, a obtenção e a clonagem de genes de proteínas para incorporação em sistemas de supressão de expressão de acordo com a invenção estão ao alcance de qualquer técnico versado no assunto. Como notado, estes genes de proteínas podem codificar genes maduros, proteínas completas, ou os genes podem ser modificados, por exemplo, por quimerização, humanização, deleção de domínios ou mutagênese sítio-específica. Proteínas produzidas pelo sistema da presente invenção incluem proteínas completas, proteínas maduras, proteínas clivadas, proteínas não clivadas, proteínas aqui descritas, anticorpos, fragmentos de anticorpo inclusive, entre outros, Fv, Fc, Fab e (Fab')₂, FV de cadeia única (scFv), diabodies, tríabodies, tetrabodies, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões framework, regiões constantes e as semelhantes.

Em uma modalidade da presente invenção, o sistema de expressão produz proteínas em células eucarióticas (exemplo não limitante, células de mamíferos tais como de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster jovem (BHK), linhagens celulares de fibroblastos e células de mieloma). Em uma modalidade, células CHO são empregadas como hospedeiras para um sistema de supressão de expressão, compreendendo um cistron incluindo as seguintes sequências: gene de sequência de tRNA, sequência de promotor eucariótico que é funcional na célula eucariótica específica utilizada para expressão tal como sequências de promotor inicial ou de actina de CMV, SV40, preferivelmente de CMV; sequência de DNA codificadora de uma proteína de interesse, preferivelmente em sua extremidade 5’, sequência líder secretória eucariótica e ladeada por códon 5’ inicial e códon 3’ de parada e sequência poli A em sua terminação 3’.

Em geral, proteínas suprimidas e expressas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em qualquer um de algumas formas conjugadas (ou seja, imunoconjugado) ou não conjugadas. Em especial, as proteínas da presente invenção podem ser conjugadas a citotoxinas tais como radioisótopos, agentes terapêuticos, agentes citostáticos, toxinas biológicas ou pró-fármacos. Em modalidades especialmente preferidas, as proteínas

50/238 produzidas de acordo com o sistema de expressão da presente invenção podem ser modificadas, tal como por conjugação a radioisótopos ou peptídeos bioativos. Exemplos de radioisótopos úteis de acordo com a invenção incluem .sup.90Y, .sup.1251, .sup.1311, .sup.1231, .sup.111ln, ,sup.105Rh, .sup.153Sm, .sup.67Cu, ,sup.67Ga, .sup.166Ho, .sup.177Lu, ,sup.186Re e .sup.188Re, usando qualquer um dos quelantes bem conhecidos ou marcação direta. Em uma modalidade, proteínas conjugadas ou não conjugadas podem ser utilizadas junto no mesmo regime terapêutico, por exemplo, como utilizadas no regime terapêutico correntemente aprovado empregando Zevalin para o tratamento de certos linfomas não Hodgkin.

Em outras modalidades, as proteínas da invenção podem ser incluídas em composições que compreendam proteínas modificadas acopladas a fármacos, pró-fármacos ou modificadores de resposta biológica tais como metotrexato, adriamicina e linfocinas, tais como interferon. Ainda outras modalidades da presente invenção compreendem o uso de proteínas modificadas conjugadas a biotoxinas específicas, tais como ricina ou toxina diftérica. Em ainda outras modalidades, as proteínas modificadas podem estar sob a forma de complexos com outros ligantes imunologicamente ativos (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos), em que a molécula resultante liga-se a uma célula neoplásica e, opcionalmente, célula efetora como, por célula T. A seleção de qual proteína modificada conjugada e/ou não conjugada usar dependerá do tipo e do estágio de câncer, uso de tratamento adjuvante (por exemplo, quimioterapia ou radiação externa) e condição do paciente. Será apreciado que aquele versado no estado da técnica poderia efetuar tal seleção em vista dos ensinamentos neste relatório descritivo.

A invenção é ilustrada mais detalhadamente pelos Exemplos 2, 3 e 4 não limitantes.

IV.Métodos gerais de recombinação de ácidos nucléicos para uso com a invenção

Em inúmeras modalidades da presente invenção, ácidos nucléicos que codificam uma fEPO de interesse serão isolados, clonados e frequentemente alterados usando métodos recombinantes. Estas modalidades são usadas, incluindo, entre outros, para expressão protéica ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão ou outras sequências derivadas de um polipeptídeo de fEPO. Em algumas modalidades, as sequências codificadoras dos polipeptídeos da invenção estão operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo. O isolamento de hEPO é descrito em, por exemplo, as Patentes U.S. N⁰³ 5 441 868, 5 547 933, 5 618 698, 5 621 080 e 6,544,748, e a produção de EPO em células humanas é descrita em WO 93/09222, cada relatório descritivo aqui incorporado por referência neste pedido de patente, e estas técnicas podem ser aplicadas por aquele versado no estado da técnica para isolar e produzir fEPO.

Uma sequência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo de fEPO compreendendo aminoácido não codificado naturalmente pode ser sintetizada com base na sequência

51/238 de aminoácidos do polipeptídeo precursor, incluindo, mas não limitado a, com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 4, ou sequência alternativa conhecida ou SNPs, se desejado), e em seguida alterando a sequência de nucleotídeos de modo a dar efeito à introdução (ou seja, incorporação ou substituição) ou remoção (ou seja, deleção ou substiuição) do(s) resíduo(s) pertinente(s) de aminoácidos. A sequência de nucleotídeos pode ser convenientemente modificada por mutagênese sítio-dirigida de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, incluindo, entre outros, usando um sintetizador de oligonucleotídeo, em que oligonucleotídeos são desenhados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e, preferivelmente, selecionando aqueles códons que estão favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante será produzido. Por exemplo, diferentes pequenos oligonucleotídeos codificando partes do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e montados por PCR, ligação ou reação em cadeia de ligação. Consultar, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 189-193 (1991); U.S. 6 521 427, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

Esta invenção utilize técnicas de rotina no campo de recombinação gênica. Textos básicos expondo os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular incluem Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”) e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado até 1999) (“Ausubel”)). Estes textos descrevem mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos pertinentes relacionados, incluindo, entre outros, a geração de genes que incluem códon seletores para produção de proteínas que incluem aminoácidos artificiais, tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais e seus pares.

Vários tipos de mutagênese são utilizados na invenção para uma variedade de finalidades, incluindo, mas não limitado a, produzir bibliotecas de tRNAs, produzir bibliotecas de sintetases, produzir códons seletores, inserir códons seletores que codificam aminoácidos artificiais em uma proteína ou polipeptídeo de interesse. Estes incluem, mas não estão limitados a, mutagênese pontual aleatória, sítio-dirigida, recombinação homóloga, empilhamento (shuffling) DNA ou outros métodos recursivos de mutagênese, construção quimérica, mu52/238 tagênese usando modelos contendo uracila, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese de DNA modificado por fosforotioato, mutagênese usando lacuna de duplex de DNA ou os semelhantes, ou qualquer combinação destes. Métodos adicionais adequados incluem reparo pontual de erro de pareamento, mutagênese usando linhagens de hospedeiro com deficiência de reparo, seleção com restrição e purificação com restrição, mutagênese por deleção, mutagênese por síntese gênica total, reparo de ruptura de fita dupla e os semelhantes. Mutagênese envolvendo construções quiméricas são abrangidas mas não limitadas também pela presente invenção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informação conhecida da molécula natural ou molécula alterada ou naturalmente mutante, incluindo, mas não limitado a, sequência, comparações de sequência, propriedades físicas, estrutura de cristal ou as semelhantes.

Os textos e exemplos constantes neste pedido de patente descrevem esses procedimentos. Informação adicional é encontrada nas seguintes publicações e referências citadas em: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorotioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications ofin vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492 (1985); Kunkel etal., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the produetion of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorotioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorotioatemodified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorotioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers etal., Y53/238

T Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorotioatecontaining DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hidrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar etal., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrõm et al., Oligonucleotidedirected mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 33053316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); e, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Detalhes adicionais sobre muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methods in Enzymology Volume 154, o qual descreve também controles úteis para resolução de problemas em vários métodos de mutagênese.

A invenção refere-se também a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido nãonatural via pares de tRNA ortogonal/RS. Células hospedeiras são construídas por engenharia genética (incluindo, entre outros, transformadas, traduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou construções que incluem um polinucleotídeo da invenção, incluindo, entre outros, um vetor da invenção, o qual pode ser, por exemplo, vetor de clona54/238 gem ou vetor de expressão. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de plasmídeo, bactéria, vírus, polinucleotídeo desprotegido (naked) ou polinucleotídeo conjugado. Os vetores são introduzidos em células e/ou microrganismos por métodos padrão, incluindo eletroporação (From et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 5824 (1985), infecção por vetores virais, penetração balística em alta velocidade por pequenas partículas com o ácido nucléico dentro da matriz de pequenas esferas ou partículas ou sobre a superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)).

As células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meios nutritivos convencionais, modificados conforme apropriado para atividades como, por exemplo, etapas de varredura, ativação de promotores ou seleção de transformantes. Estas células podem ser opcionalmente cultivadas em organismos transgênicos. Outras referências úteis, incluindo, entre outros, para isolamento e cultura de células (por exemplo, para isolamento subsequente de ácido nucléico) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York e as referências citadas neste; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods, Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Vários métodos bem conhecidos para introduzir ácidos nucléicos-alvo em células estão disponíveis, qualquer um destes podendo ser utilizado na invenção. Estes incluem: fusão das células receptoras com protoplastos bacterianos contendo o DNA, eletroporação, biobalística e infecção com vetores virais (discutido mais detalhadamente abaixo), etc. Células bacterianas podem ser utilizadas para amplificar alguns plasmídeos contendo construções de DNA desta invenção. As bactérias são cultivadas para fase logarítmica de crescimento, e os plasmídeos no interior das bactérias podem ser isolados por uma variedade de fase métodos conhecidos no estado da técnica (consultar, por exemplo, Sambrook). Adicionalmente, existe disponível comercialmente uma pletora de kits para a purificação de plasmídeos de bactérias (consultar, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos da Pharmacia Biotech; StrataClean™, da Stratagene; e, QIAprep™ da Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são então manipulados adicionalmente para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar células ou serem incorporados em vetores relacionados para infectar organismos. Vetores típicos contêm terminadores de transcrição e de tradução, sequências de iniciação de transcrição e de tradução e promotores úteis para regulação da expressão do ácido nucléico especialmente desejado. Os vetores compreendem opcionalmente cassetes genéricos de expressão contendo pelo menos pelo menos uma sequência terminadora independente, sequências que permitem replicação do cassete em eucariotos, ou ambas (incluindo, entre outros, vetores de transporte (shuttle)) e marcadores de seleção

55/238 para sistemas procarióticos e eucarióticos. Vetores são adequados para replicação e integração em procariotos, eucariotos ou, preferivelmente, em ambos. Consultar, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Puríf. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos estes supra). Um catálo5 go de Bactérias e Bacteriófagos, úteis para clonagem é fornecido, por exemplo, pela ATCC, por exemplo, The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds), publicado pela ATCC. Procedimentos básicos adicionais para sequenciamento, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes são encontrados também em Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific 10 American Books, NY. Adicionalmente, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico marcado, seja padrão ou não) pode ser obtido por pedido personalizado ou padrão para uma variedade de fornecedores comerciais, tais como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, disponibilizada na Internet no endereço www.mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponibilizada na In15 ternet no endereço www.qenco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponibilizada na Internet no endereço www.expressqen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.

Códons seletores

Códons seletores da invenção ampliam a estrutura de códons genéticos de meca20 nismos biossintéticos protéicos. Por exemplo, um códon seletor inclui, entre outros, códon único de três bases, códon nonsense, tal como códon de parada, incluindo, entre outros, códon âmbar (UAG) ou códon opala (UGA), códon artificial, códon de quatro ou mais bases, códon raro ou os semelhantes. É rapidamente evidente para aqueles versados no estado da técnica que existe amplo intervalo no número de códons seletores que podem ser introduzi25 dos em um gene desejado, incluindo, entre outros, um ou mais, dois ou mais, mais de três,

4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais em um único polinucleotídeo codificando pelo menos uma parte de fEPO.

Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor, que é de parada, para a incorporação de aminoácidos não-naturais in vivo em célula eucariótica. Por 30 exemplo, é produzido O-tRNA que reconhece o códon de parada, incluindo, entre outros,

UAG, e é aminocilado por uma O-RS com um aminoácido não-natural desejado. Este OtRNA não é reconhecido pelas aminoacil-tRNA sintetases naturais do hospedeiro. Mutagênese sítio-dirigidas convencional pode ser utilizada para produzir o códon de parada, incluindo, entre outros, TAG, no sítio de interesse em um polipeptídeo de interesse. Consultar, 35 por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5',3' Exonuclease in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802. Quando a O-RS, o O-tRNA e o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse são combinados in vivo, o ami56/238 noácido não-natural é incorporado em resposta ao códon UAG para fornecer um polipeptídeo contendo o aminoácido artificial na posição especificada.

Aminoácidos não-naturais podem ser incorporados in vivo sem causar grande alteração à célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, a eficiência da supressão para o códon UAG depende da competição entre o O-tRNA, incluindo, entre outros, o tRNA âmbar supressor e um fator eucariótico de liberação (incluindo, entre outros, eRF) (que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo em crescimento do ribossomo) e, por esse motivo, esta pode ser modulada por, incluindo, entre outros, aumentando-se o nível de expressão de Ο-tRNA e/ou do tRNA supressor.

Códons seletores compreendem também códons ampliados, incluindo, entre outros, códons de quatro ou mais bases, tais como códons de quatro, cinco, seis ou mais bases. Exemplos de códons de quatro bases incluem, entre outros, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU e os semelhantes. Exemplos de códons de cinco bases incluem, entre outros, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e os semelhantes. Um aspecto da invenção inclui usar códons ampliados com base em supressão do tipo frameshift (deslocamento de janela de leitura). Códons de quatro ou mais bases podem inserir, entre outros, um ou múltiplos aminoácidos artificiais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-tRNAs mutantes, incluindo, entre outros, tRNAs supressores com frameshift especial, com alças anticódon, por exemplo, com alças anticódon contendo pelo menos 8-10 nt, o códon de quatro ou mais bases é lido como um único aminoácido. Em outras modalidades, as alças anticódon podem decodificar, entre outros, um códon de pelo menos quatro bases, um códon de pelo menos cinco bases ou um códon de pelo menos seis bases. Como existem 256 possíveis códons de quatro bases, múltiplos aminoácidos artificiais podem ser codificados na mesma célula usando um códon de quatro ou mais bases. Consultar, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Fourbase Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769.

Por exemplo, códons de quatro bases são utilizados para incorporar aminoácidos artificiais em proteínas por métodos biossintéticos in vitro. Consultar, por exemplo, Ma etal., (1993) Biochemistry, 32:7939; e Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. CGGG e AGGU foram utilizados para incorporar simultaneamente in vitro 2-naftilalanina e um derivado NBD de lisina em estreptavidina com dois tRNAs supressores com frameshift quimicamente acilados. Consultar, por exemplo, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. Em um estudo in vivo, Moore et al. examinaram a capacidade de derivados de tRNALeu com anticódons NCUA suprimirem códons UAGN (N pode ser U, A, G ou C), e descobriram que o quadrupleto UAGA pode ser decodificado por tRNALeu contendo anticó57/238 don UCUA com eficiência de 13 a 26% e pouca decodificação no quadro de leitura 0 ou -1. Consultar, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. Em uma modalidade, códons ampliados com base em códons raros ou códons nonsense podem ser utilizados na presente invenção, o que pode reduzir a leitura contínua, na qual trechos de sentido contrário (missense) são desconsiderados (yeadthrough) e supressão de frameshift em outros sítios indesejados.

Para um determinado sistema, códon seletor pode incluir também um dos códons naturais de três bases, em que o sistema endógeno não usa (ou usa raramente) o códon natural das bases. Por exemplo, estes sistemas incluem aquele desprovido de tRNA que reconheça o códon natural de três bases e/ou um sistema no qual o códon de três bases é raro.

Códons seletores incluem opcionalmente pares de bases artificiais. Estes pares de bases artificiais ampliam mais ainda o alfabeto genético existente. Um par extra de bases aumenta o número de códon tripletos de 64 para 125. Propriedades de pares de três bases incluem pareamento estável e seletivo de bases, incorporação enzimática eficiente no DNA com alta afinidade por uma polimerase, e a extensão continuada do primer (iniciador) após a síntese do par de base nascente artificial. Descrições de pares de bases artificiais que podem ser adaptados para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Outras publicações importantes estão relacionadas abaixo.

Para uso in vivo, o nucleosídeo não-natural é permeável à membrana e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Adicionalmente, a informação genética aumentada é estável e não é destruída por enzimas celulares. Tentativas anteriores por Benner e outros fizeram uso de padrões de ligação a hidrogênio que são diferentes daqueles em pares canônicos de Watson-Crick, sendo o exemplo mais digno de nota o par iso-C:iso-G. Consultar, por exemplo, Switzer etal., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; e Piccirilli ef al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Três bases em geral impariam erradamente em algum grau com bases naturais e não podem ser enzimaticamente replicadas. Kool e colaboradores demonstraram que interações de empacotamento hidrofóbico entre bases podem substituir ligação ao hidrogênio e direcionar a formação de par de bases. Consultar, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; e Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. Em uma tentativa para desenvolver um par de bases não-natural que satisfizesse todos os requisitos acima, Schultz, Romesberg e colaboradores sintetizaram sistematicamente e estudaram uma série de bases hidrofóbicas não-naturais. Um auto-par PICS:PICS demonstrou ser mais estável do que pares de bases naturais, e pode ser incorporado eficientemente em DNA pelo fragmento de Klenow da DNA polimerase I de Escherichia coli (KF). Consultar, por exemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc.,

58/238

121:11586; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. Um auto-par 3MN:3MN pode ser sintetizado pela KF com eficiência e seletividade suficientes para função biológica. Consultar, por exemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. No entanto, ambas as bases atuam como terminador de cadeia para replicação posterior. Uma DNA polimerase mutante foi recentemente desenvolvida e que pode ser usada para replicar o auto-par PICS. Além disso, um auto-par 7AI pode ser replicado. Consultar, por exemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. Um novo par metalobásico, Dipic:Py, foi também desenvolvido que forma um par estável ao se ligar a Cu(ll). Consultar, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Dado que códons amplificados e códons não-naturais são intrinsecamente ortogonais em relação a códons naturais, os métodos da invenção podem fazer uso dessa propriedade para gerar tRNAs ortogonais para estes.

Um sistema de desvio de tradução pode também ser usado para incorporar um aminoácido não-natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema de desvio tradução, uma grande sequência é incorporada em um gene, porém não traduzida em proteína. A sequência contém uma estrutura que serve como sinal para induzir o ribossomo a desconsiderar a sequência e reiniciar a tradução em sentido descendente à inserção.

Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou parte deste), nos métodos e/ou composições da invenção, é codificado por um ácido nucléico. Tipicamente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos dois códons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.

Genes codificadores de proteínas ou polipeptídeos de interesse podem transformados em mutantes utilizando métodos bem conhecidos por aquele versado na técnica e aqui descritos abaixo de “Mutagenêse e outras técnicas de biologia molecular” que incluam, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido não-natural. Por exemplo, um ácido nucléico para uma proteína de interesse é transformado em mutante para que inclua um ou mais códons seletores, possibilitando a incorporação de um ou mais aminoácidos não-naturais. A invenção abrange qualquer um desses variantes, incluindo, entre outros, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, contendo pelo menos um aminoácido não-natural. Igualmente, a invenção abrange também ácidos nucléicos correspondentes, ou seja, qualquer ácido nucléico com um ou mais códons seletores que codifiquem um ou mais aminoácidos não-naturais.

Moléculas de ácido nucléico que codifica uma proteína de interesse, tal como fEPO, podem ser rapidamente transformadas em mutantes para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipeptídeo. Cisteína é amplamente utilizada para introduzir mo59/238 léculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas ou ampla variedade de outras moléculas em uma proteína de interesse. Métodos adequados para a incorporação de cisteína em uma posição desejada do polipeptídeo de fEPO são bem conhecidos no estado da técnica, tais como aqueles descritos na Patente U.S. N° 6 608 183, a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente, e técnicas padrão de mutagênese.

V.Aminoácidos não codificados naturalmente

Uma variedade muito ampla de aminoácidos não codificados naturalmente é adequada para uso na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos não codificados naturalmente pode ser introduzido em fEPO. Em geral, os aminoácidos não codificados naturalmente introduzidos são substancialmente inertes quimicamente frente aos 20 aminoácidos comuns codificados geneticamente (ou seja, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Em algumas modalidades, os aminoácidos não codificados naturalmente incluem grupos funcionais na cadeia lateral que reagem eficiente e seietivamente com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, entre outros, grupos azido, cetona, aldeído e aminóxi) e formam conjugados estáveis. Por exemplo, um polipeptídeo de fEPO que inclua um aminoácido não codificado naturalmente contendo grupo funcional azido pode ser reagido com um polímero (incluindo, entre outros, poli(etilenoglicol) ou, alternativamente, um segundo polipeptídeo contendo um grupo alcino e formando um conjugado estável resultante para a reação seletiva dos grupos funcionais azida e alcino e formação de um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen [3+2].

A estrutura genérica de um alfa-aminoácido está ilustrada abaixo:

R h₂n

COOH

Aminoácido não codificado naturalmente é tipicamente qualquer estrutura com a fórmula listada acima, em que o grupo R é qualquer substituinte diferente daquele utilizado nos vinte aminoácidos naturais, cujo uso pode ser adequado na presente invenção. Os aminoácidos não codificados naturalmente da invenção diferem tipicamente dos aminoácidos naturais somente na estrutura da cadeia lateral, por esse motivo, os aminoácidos não codificados naturalmente formam ligações amida com outros aminoácidos, incluindo, entre outros, codificados naturalmente ou não, na mesma maneira na qual são formadas em polipeptídeos naturais. No entanto, os aminoácidos não codificados naturalmente possuem grupos na cadeia lateral que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R compreende opcionalmente um grupo alquila, arila, acila, ceto, azido, hidroxila, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tiol, seleno, sulfonila, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino ou os se60/238 melhantes, ou qualquer combinação destes. Outros aminoácidos de ocorrência não natural de interesse, cujo uso pode ser adequado na presente invenção incluem, entre outros, aminoácidos compreendendo reticulante foto-ativável, aminoácidos marcados por rotação interna (sp/n), aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação a metais, aminoácidos contendo metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não com outras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados e/ou foto-isomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tais como serina açúcar-substituída, outros aminoácidos modificados com carboidratos, aminoácidos contendo grupo ceto, aminoácidos compreendendo polietilenoglicol ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente clivados e/ou foto-cliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação a aminoácidos naturais, incluindo, entre outros, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo, entre outros, maiores do que em torno de 5 ou maiores do que em torno de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligado a carbono, aminoácidos redox-ativos, aminoácidos contendo amino tioácido e aminoácidos compreendendo um ou mais grupos tóxicos.

Exemplos de aminoácidos não codificados naturalmente cujo uso pode ser adequado na presente invenção e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, entre outros, aqueles com grupos reativos carbonila, aminóxi, hidroxilamina, hidrazida, semicarbazida, azida e alcino. Em algumas modalidades, aminoácidos não codificados naturalmente compreendem um grupo sacarídico. Exemplos destes aminoácidos incluem Nacetil-L-glicosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glicosaminil-Ltreonina, N-acetil-L-glicosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Exemplos destes aminoácidos incluem também aqueles em que a ligação natural ao N ou O entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por ligação covalente não comumente encontrada na natureza - incluindo, mas não limitado a, alceno, oxima, tioéter, amida e as semelhantes. Exemplos destes aminoácidos incluem também sacarídeos que não são encontrados comumente em proteínas naturais, tais como 2-desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e os semelhantes.

Muitos dos aminoácidos não codificados naturalmente aqui providos são disponibilizados comercialmente, por exemplo, pela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha) ou Peptech (Burlington, MA, EUA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como exposto neste relatório descritivo ou usando métodos padrão conhecidos por aqueles versados no estado da técnica. Para técnicas de síntese orgânica, consultar, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova York); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira edi61/238 ção, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova York). Consultar, também, as Publicações dos Pedidos de Patente U.S. 2003/0082575 e 2003/0108885, aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

Além de aminoácidos não-naturais que contêm novas cadeias laterais, outros cujo uso pode ser adequado na presente invenção compreendem opcionalmente estruturas modificadas de cadeia principal, incluindo, mas não limitado a, como ilustradas pelas estruturas das Fórmulas II e III:

II

R

X

ΠΙ

R R’

em que Z compreende tipicamente OH, NH₂, SH, NH-R' ou S-R'; X e Y, os quais podem ser iguais ou diferentes, compreendem tipicamente S ou O, e R e R¹, os quais são opcionalmente iguais ou diferentes, são selecionados tipicamente a partir da mesma lista de constituintes para o grupo R descrita acima para os aminoácidos não-naturais com a Fórmula, bem como hidrogênio. Por exemplo, aminoácidos não-naturais da invenção compreendem opcionalmente substituições no grupo amino ou carboxila como ilustrado pelas Fórmulas II e 111. Aminoácidos não-naturais desse tipo incluem, entre outros, ácidos α-hidróxi, atioácidos, α-aminotiocarboxilatos, incluindo, entre outros, com cadeias laterais correspondentes às cadeias laterais dos vinte aminoácidos comuns ou não-naturais. Além disso, substituições no carbono-α incluem opcionalmente, mas não estão limitados a, aminoácidos L, D ou α-α-dissubstituídos tais como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico e os semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina, bem como análogos de prolina com anel de 3,4,6,7,8 e 9 membros, β e γ aminoácidos, tais como β-alanina e ácido γ-aminobutírico substituídos.

Muitos aminoácidos não-naturais têm como base aminoácidos naturais, tais como tirosina, glutamina, fenilalanina e os semelhantes, e são adequados para uso na presente invenção. Análogos de tirosina incluem, entre outros, tirosinas para-substituídas, tirosinas orto-substituídas e tirosinas meta-substituídas, em que a tirosina substituída compreende, entre outros, grupo ceto (incluindo, entre outros, grupo acetila), grupo benzoíla, grupo amino, hidrazina, hidroxiamina, grupo tiol, grupo carbóxi, grupo isopropila, grupo metila, hidrocarboneto C₆ - C₂o de cadeia linear ou ramificada, hidrocarboneto saturado ou insaturado, grupo O-metila, grupo poliéter, gurpo nitro, grupo alquinila ou semelhantes. Adicionalmente,

62/238 anéis arila múltiplos substituídos são também contemplados. Análogos de glutamina cujo uso pode ser adequado na presente invenção incluem, entre outros, derivados a-hidróxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos e derivados de glutamina amida substituídos. Exemplos de análogos de fenilalanina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fenilalaninas para-substituídas, fenilalaninas orto-substituídas e fenilalaninas meta-substituídas, em que o substituinte compreende, entre outros, grupo hidróxi, grupo metóxi, grupo metila, grupo alila, aldeído, azido, iodo, bromo, grupo ceto (incluindo, entre outros, grupo acetila), grupo benzoíla, alquinila ou os semelhantes. Exemplos específicos de aminoácidos não-naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, entre outros, p-acetil-L- fenilalanina, ppropargiloxifenilalanina, O-metil-L-tirosina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, Ο-4-alilL-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GIcNAcp-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, Lfosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-aminoL-fenilalanina e isopropil-L-fenilalanina, p-propargiloxi-fenilalanina e os semelhantes. Exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não-naturais que podem ser adequadas para uso na presente invenção estão descritos em, por exemplo, WO 2002/085923, intitulado “In vivo incorporation ofunnatural amino acids”. Consultar também Kiick et al., (2002) Incorporation of azidas into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation, PNAS 99:19-24, para análogos adicionais de metionina.

Em uma modalidade, composições de fEPO que incluem um aminoácido nãonatural (como p-(propargiloxi)-fenilalanina) são providas. Várias composições compreendendo p-(propargiloxi)-fenilalanina e incluindo, entre outros, proteínas e/ou células, são também providas. Em um aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não-natural p(propargiloxi)-fenilalanina inclui ainda um tRNA ortogonal. O aminoácido não-natural pode estar ligado (incluindo, entre outros, covalentemente) ao tRNA ortogonal, incluindo, entre outros, ligado covalentemente ao tRNA ortogonal através de ligação amino-acila, covalentemente ligado a 3ΌΗ ou 2ΌΗ de um açúcar ribose terminal do tRNA ortogonal, etc.

Os grupos químicos pelos quais aminoácidos não-naturais podem ser incorporados em proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína. Por exemplo, a reatividade única de um grupo funcional ceto permite a modificação seletiva de proteínas com alguns reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina, in vitro e in vivo. Um aminoácido não-natural com átomo pesado pode ser útil, por exemplo, para dados sobre determinação por raio-x de fases estruturais. A introdução sítio-específica de átomos pesados usando aminoácidos não-naturais permite a escolha seletiva e flexível de posições para átomos pesados. Aminoácidos não naturais foto-reativos (incluindo, entre outros, aminoácidos cadeias laterais com benzofenona e arilazidas (incluindo, entre outros, fenilazida)), por

63/238 exemplo, possibilita foto-reticulação eficiente in vivo e in vitro de proteínas. Exemplos de aminoácidos não-naturais foto-reativos incluem, entre outros, p-azido-fenilalanina e pbenzoil-fenilalanina. A proteína com os aminoácidos não-naturais foto-reativos podem então ser reticuladas à vontade por excitação do grupo foto-reativo que permite controle temporal. Em um exemplo, o grupo metila de um aminoácido não-natural pode ser substituído com grupo metila, entre outros, isotopicamente marcado, em uma sonda de estrutura local e dinâmica, incluindo, entre outros, com o uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional. Grupos funcionais alquinila ou azido permitem, por exemplo, a modificação seletiva de proteínas com moléculas através de uma reação de cicloadição [3+2].

Síntese química de aminoácidos não-naturais

Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para uso na presente invenção são disponibilizados comercialmente, por exemplo, pela Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, Wl, EUA). Aqueles que não se encontram disponíveis comercialmente são opcionalmente sintetizados como exposto neste pedido de patente ou como descrito em várias publicações ou usando métodos conhecidos por aqueles versados no estado da técnica. Para técnicas de síntese orgânica, consultar, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova York); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira edição; Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova York). Publicações adicionais descrevendo a síntese de aminoácidos não-naturais incluem, por exemplo, o documento WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of unnatural amino acids”, Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials,. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)Apovincamine through Amino Acid Decarbonilation and Iminium lon Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-aaminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:42974308; e, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic

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2-aminopropanoic acid derívatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Consultar também, o pedido de patente intitulado “Protein Arrays,” número de processo P1001US00, depositado em 22 de dezembro de 2002.

A.Grupos reativos carbonila

Aminoácidos com grupo reativo carbonila possibilitam uma variedade de reações ligar moléculas (incluindo, mas não limitado a, PEG ou outras moléculas solúveis em água) por meio de reações de adição nucleofílica e de condensação de indol entre outras.

Exemplos de aminoácidos contendo carbonila podem ser representados como segue:

r₃hn cor₄

Em que n é 0-10; Ri é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído; R₂ é H, alquila, arila, alquila substituído e arila substituído; e R₃ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em amino terminal, e R4 é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, R₁ é fenila e R₂ é alquila simples (ou seja, metila, etila ou propila) e o grupo cetona está posicionado na posição para em relação à cadeia lateral alquila. Em algumas modalidades, n é 1, Ri é fenila e R₂ é alquila simples (ou seja, metila, etila ou propila) e o grupo cetona está posicionado na posição meta em relação à cadeia lateral alquila.

A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina está descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Outros aminoácidos contendo carbonila podem ser igualmente preparados por aquele versado no estado de técnica.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente é modificado quimicamente para gerar um grupo funcional carbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído, útil para reações de conjugação, pode ser gerada a partir de uma funcionalidade com grupos amino e hidroxila adjacentes. Quando a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, serina ou treonina em Nterminal (que podem estar normalmente presentes ou serem expostas por digestão química ou enzimática) podem ser usadas para gerar uma funcionalidade aldeído sob condições oxidantes leves de divagem usando periodato. Consultar, por exemplo, Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). No entanto, métodos conhecidos no estado da técnica estão restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou da proteína.

Na presente invenção, um aminoácido não codificado naturalmente carreando grupos hidroxila e amino adjacentes podem ser incorporados no polipeptídeo em forma de fun65/238 cionalidade aldeído “mascarada”. Por exemplo, 5-hidroxililina carreia um grupo hidroxila adjacente à amina épsilon. Condições de reação para gerar o aldeído envolvem tipicamente a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições leves para evitar oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é tipicamente em torno de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de excesso molar em torno de 1,5 de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipeptídeo, seguido por incubação por aproximadamente 10 minutos no escuro. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6 423 685.

A funcionalidade carbonila pode ser reagida seletivamente com reagente contendo hidrazina-hidrazida, hidroxilamina ou semicarbazida sob condições leves em solução aquosa para formar as ligações correspondentes hidrazona, oxima ou semicarbazona, respectivamente, que são estáveis sob condições fisiológicas. Consultar, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade única do grupo carbonila possibilita modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos. Consultar, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., etal., Science 276:1125-1128 (1997).

B.Grupos reativos hidrazina, hidrazida ou semicarbazida

Aminoácidos não codificados naturalmente contendo grupo nucleofílico, tal como hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, entre outros, com PEG ou outros polímeros solúveis em água).

Exemplos de aminoácidos contendo hidrazina, hidrazida ou semicarbazida podem ser representados como segue:

(CH2)_nR-|X-C(O)-NH-HN₂

Em que n é 0-10; Ri é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído ou não está presente; X é O, N ou S ou não está presente; R₂ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em carbóxi terminal.

Em algumas modalidades, n é 4, Ri não está presente e X é N. Em algumas modalidades, n é 2, Ri não está presente e X não está presente. Em algumas modalidades, n é 1,

Ri é fenila, X é O, e o átomo de oxigênio está em posição para em relação ao grupo alifático no anel arila.

Aminoácidos contendo hidrazida, hidrazina e semicarbazida são disponibilizados

66/238 por fornecedores comerciais. Por exemplo, L-glutamato-il-hidrazida é disponibilizado pela Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outros aminoácidos não disponibilizados comercialmente podem ser preparados por aquele versado na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6 281 211.

Polipeptídeos contendo aminoácidos não codificados naturalmente que carreiam funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida podem ser reagidos eficiente e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Consultar, por exemplo, Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reatividade única de grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida os torna significativamente mais reativos frente a aldeídos, cetonas e outros grupos eletrofílicos, em comparação aos grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, entre outros, o grupo hidroxila de serina ou treonina ou os aminoácidos de lisina e do N-terminal).

C.Aminoácidos contendo aminóxi

Aminoácidos não codificados naturalmente contendo grupo aminóxi (também denominados hidroxilamina) possibilitam a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, entre outros, com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Da mesma forma que hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade intensificada do grupo aminóxi permite que este reaja eficiente e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Consultar, por exemplo, Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Enquanto que o resultado da reação com grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, oxima resulta, no entanto, geralmente da reação de um grupo aminóxi com um grupo contendo carbonila tal como cetona.

Exemplos de aminoácidos contendo grupos aminóxi podem ser representados como segue:

r₂hn cor₃

Em que n é 0-10; Ri é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10; Y = C(O) ou não está presente; R₂ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, Ri é fenila, X é O, m é 1 e Y está presente. Em algumas modalidades, n é 2, Ri e X não estão presentes, m é 0, e Y não está presente.

Aminoácidos contendo aminóxi podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos rapidamente disponíveis (homoserina, serina e treonina). Consultar, por exem67/238 pio, M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Certos aminoácidos contendo aminóxi, tal como L-2-amino-4-(ácido (aminóxi)butírico), foram isolados a partir de fontes naturais (Rosenthal, G. et al., Life Sei. 60: 1635-1641 (1997). Outros aminoácidos contendo aminóxi podem ser preparados por aquele versado na técnica.

D.Grupos reativos azida e alcino

A reatividade única de grupos funcionais azida e alcino os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e de outras moléculas biológicas. Azidas orgânicas, especialmente azidas alifáticas, e alcinos permanecem geralmente estáveis frente a condições químicas reativas comuns. Em especial, ambos os grupos funcionais, azida e alcino, são inertes frente às cadeias laterais (ou seja, grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipeptídeos naturais. Quando levados à grande proximidade, a natureza “spring-loaded” (carga com mola) dos grupos azida e alcino é revelada e estes reagem seletiva e eficientemente, por meio de reação de cicloadição [3+2] de Huisgen, para gerar o triazol correspondente. Consultar, por exemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., etal., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., etal., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

Pelo fato de a reação de cicloadição de Huisgen envolver uma reação seletiva de cicloadição (consultar, por exemplo, Padwa, A., em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cicloaddition Chemistry, (ed. Padwa, A., 1984) , p. 1-176 ) em vez de substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente carreando cadeias laterais contendo azida e alcino permite que os polipeptídeos resultantes sejam modificados seletivamente na posição do aminoácido não codificado naturalmente. A reação de cicloadição envolvendo fEPO contendo azida ou alcino pode ser conduzida a temperatura ambiente sob condições aquosas pela adição de Cu(ll) (incluindo, entre outros, na forma de CuSO₄ em quantidade catalítica) na presença de agente redutor para reduzir Cu(ll) para Cu(l), in situ, em quantidade catalítica. Consultar, por exemplo, Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Exemplos de agentes redutores incluem, entre outros, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe²⁺, Co²⁺ e potencial elétrico aplicado.

Em alguns casos, quando a reação de cicloadição [3+2] de Huisgen entre azida e alcino é desejada, o polipeptídeo de fEPO compreende um aminoácido não codificado naturalmente contendo grupo alcino e o polímero solúvel em água a ser unido ao aminoácido compreende grupo azida. Alternativamente, a reação inversa (ou seja, com o grupo azida no aminoácido e o grupo alcino presente no polímero solúvel em água) pode também ser realizada.

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O grupo funcional azida pode ser reagido também seletivamente com um polímero solúvel em água contendo aril éster e, apropriadamente funcionalizado com grupo aril fosfino para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfino reduz a azida in situ, e a amina resultante reage então eficientemente com uma ligação éster proximal para gerar a amida correspondente. Consultar, por exemplo, E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). O aminoácido contendo azida pode ser alquil azida (incluindo, entre outros, ácido 2amino-6-azido-1-hexanóico) ou aril azida (p-azido-fenilalanina).

Exemplos de polímeros solúveis em água, contendo aril éster e grupo fosfino, podem ser representados como segue:

Em que X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, grupos alquila, arila, alquila substituído e arila substituído. Exemplos de grupos R incluem, entre outros, -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -C(O)R’, -CONR’R”, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -CN e -NO₂. R’, R”, R’” e R”” referem-se, cada um independentemente, a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo, entre outros, arila substituído com 1-3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção incluir mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como o é cada um dos grupos R’, R”, R’” e R”” quando mais de um destes grupos estiver presente. Quando unidos ao mesmo átomo de nitrogênio, R’ e R” podem se combinar com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR’R” pretende incluir, entre outros, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir da discussão acima sobre substituintes, aquele versado na técnica entenderá que o termo “alquila” destina-se a incluir grupos com átomos de carbono unidos a outros grupos diferentes de hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, entre outros, -CF₃ e -CH₂CF₃) e acila (incluindo, entre outros, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ e os semelhantes).

O grupo funcional azida pode também ser reagido seletivamente com um polímero solúvel em água contendo tioéster e apropriadamente funcionalizado com grupo aril fosfino para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfino reduz a azida in situ, e a amina resultante reage então eficientemente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente. Exemplos de polímeros solúveis em água, contendo tioéster e grupo fosfino, podem ser representados como segue:

.X.

Ph₂P(H₂C)U γ W

O

Em que n é 1-10; X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila e W é um polímero solúvel em água.

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Exemplos de aminoácidos contendo alcino podem ser representados como segue:

(ÇH^R^CH^CCH r₂hnt ^cor₃

Em que n é 0-10; Ri é alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído ou não está presente; X é O, N, S não está presente; m é 0-10, R₂ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, Ri é fenila, X não está presente, m é 0 e o gurpo acetileno está na posição para em relação à cadeia lateral alquila. Em algumas modalidades, n é 1, Ri é fenila, X é O, m é 1 e o grupo propargiloxi está na posição para em relação à cadeia lateral alquila (ou seja, O-propargil-tirosina). Em algumas modalidades, n é 1, Ri e X não estão presente e m é 0 (ou seja, proparilglicina).

Aminoácidos contendo alcino encontram-se disponíveis comercialmente. Por exemplo, propargilglicina é disponibilizada comercialmente pela Peptech (Burlington, MA). Alternativamente, aminoácidos contendo alcino podem ser preparados de acordo com métodos padrão. Por exemplo, p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, como descrito em Deiters, A., et a/., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e 4alquinil-L-fenilalanina pode ser sintetizada como descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alcino podem ser preparados por aquele versado na técnica.

Exemplos de aminoácidos contendo azida podem ser representados como segue: (ÇH^R^CH^Ns

R₂HI\T ^cor₃

Em que n é 0-10; R-ι é alquila, arila, alquila substituído, arila substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10; R₂ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em amino terminal, e R₃ é H, aminoácido, polipeptídeo ou grupo com modificação em carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, R-ι é fenila, X não está presente, m é 0 e o grupo azida está em posição para em relação à cadeia lateral alquila. Em algumas modalidades, n é 0-4e e X não estão presentes e m = 0. Em algumas modalidades, n é 1, Ri é fenila, XéO, m é 2 e o grupo β-azidoetóxi está na posição para em relação à cadeia lateral alquila.

Aminoácidos contendo azida são disponibilizados por fornecedores comerciais. Por exemplo, 4-azidofenilalanina pode ser obtido da Chem-lmpex International, Inc. (Wood Dale,

IL). Para aqueles aminoácidos contendo azida que não se encontram comercialmente disponíveis, o grupo azida pode ser preparado relativamente rápido por métodos conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo, entre outros, por meio de deslocamento de um gurpo de partida adequado (incluindo, entre outros, haleto, mesilato, tosilato) ou pela abertu70/238 ra de uma lactona adequadamente protegida. Consultar, por exemplo, Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova York).

E.Grupos reativos aminotiol

A reatividade única de grupos funcionais aminotiol beta-substituídos os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e de outras moléculas biológicas que contenham grupos aldeídos por meio de formação da tiozolidina. Consultar, por exemplo, J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. Em algumas modalidades, aminoácidos aminotiol beta-substituídos podem ser incorporados em polipeptídeos de fEPO e em seguida reagidos com polímeros solúveis em água compreendendo funcionalidade aldeído. Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água, conjugado de fármaco ou outra carga útil pode ser acoplado a um polipeptídeo de fEPO compreendendo aminoácido aminiotol beta-substituído por meio de formação da tiozolidina.

Captação celular de aminoácidos não-naturais

A captação de aminoácidos não-naturais por uma célula eucariótica é uma das questões tipicamente consideradas quando se desenha e seleciona aminoácidos nãonaturais, incluindo, entre outros, para incorporação em proteína. Por exemplo, a densidade de carga alta de α-aminoácidos sugere que esses compostos possivelmente não serão permeáveis à célula. Aminoácidos naturais são internalizados na célula eucariótica por meio de um conjunto de sistemas de transporte à base de proteínas. Uma pesquisa rápida pode ser realizada para analisar quais aminoácidos não-naturais são internalizados, se algum, por células. Consultar, por exemplo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, o pedido de patente intitulado “Protein Arrays”, número de processo P1001US00, depositado em 22 de dezembro de 2002; e Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Embora a captação seja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa para desenhar aminoácidos não-naturais que são receptivos a vias de captação celular é prover vias biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.

Biossíntese de aminoácidos não-naturais

Muitas vias biossintéticas já existem em células para a produção de aminoácidos e de outros compostos. Embora um método biossintético para um determinado aminoácido não-natural possa não existir na natureza, incluindo, entre outros, em célula eucariótica, a invenção provê estes métodos. Por exemplo, vias biossintéticas para aminoácidos nãonaturais são opcionalmente geradas em célula hospedeira adicionando-se novas enzimas ou modificando-se vias existentes na célula hospedeira. Novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas naturais ou são desenvolvidas artificialmente. Por exemplo, a biossíntese de p-aminofenilalanina (como apresentada em, por exemplo, o documento WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of unnatural amino acids”) está fundamentada

71/238 na adição de enzimas conhecidas combinadas provenientes de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula eucariótica pela transformação da célula com um plasmídeo compreendendo os genes. Os genes, quando expressos na célula, fornecem uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. Sequências adicionais de enzimas são encontradas, por exemplo, no Genbank. Enzimas desenvolvidas artificialmente são também opcionalmente adicionadas em uma célula na mesma maneira. Nesta maneira, o mecanismo celular e os recursos de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não-naturais.

Existe disponível uma variedade de métodos para produzir novas enzimas para uso em vias biossintéticas ou para evolução de vias existentes. Por exemplo, recombinação recursiva, incluindo, entre outros, como desenvolvida pela Maxygen, Inc. (disponibilizada na Internet no endereço www.maxyqen.com), é opcionalmente usada para desenvolver novas enzimas e vias. Consultar, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; e Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 91:10747-10751. Igualmente, DesignPath™, desenvolvido pela Genencor (disponibilizado na Internet no endereço www.qenencor.com) é opcionalmente usado para construção de vias metabólicas, incluindo, entre outros, construir uma via para criar O-metilL-tirosina em uma célula. Essa tecnologia reconstrói vias existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de novos genes, incluindo, entre outros, identificados através de genômica funcional e evolução e desenho molecular. A Diversa Corporation (disponível na Internet no endereço www.diversa.com) oferece também tecnologia para bibliotecas rapidamente pesquisadas de genes e vias gênicas, incluindo, entre outros, para criar novas vias.

Tipicamente, o aminoácido não-natural, gerado por uma via biossintética construída da invenção, é produzido em concentração suficiente para biossíntese protéica eficiente, incluindo, entre outros, uma quantidade celular natural, porém não em tal grau que afete a concentração de outros aminoácidos ou que esgote os recursos celulares. Concentrações típicas produzidas in vivo nessa maneira são em torno de 10 mM a em torno de 0,05 mM. Uma vez uma célula seja transformada com plasmídeo, contendo os genes usados para produzir enzimas desejadas para determina via específica, e um aminoácido não natural tenha sido gerado, seleções in vivo são opcionalmente utilizadas para otimizar mais ainda a produção do aminoácido não-natural para síntese protéica ribossômica e crescimento celular.

Polipeptídeos com aminoácidos não-naturais

Um aminoácido não-natural pode ser incorporado para uma variedade de finalida72/238 des, incluindo, entre outros, adequar alterações em estrutura e/ou função protéica, alterar tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação a hidrogênio, acessibilidade de sítios direcionados para proteases, direcionamento contra um grupo (incluindo, entre outros, para arranjo protéico), etc. Proteínas que incluem um aminoácido não-natural podem apresentar propriedades catalíticas ou biofísicas aperfeiçoadas ou mesmo inteiramente novas. Por exemplo, as propriedades a seguir são opcionalmente modificadas por inclusão de um aminoácido nãonatural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meiavida (incluindo, mas não limitado a, meia-vida sérica), capacidade para reagir com outras moléculas, incluindo, entre outros, covalentemente ou não, e as semelhantes. As composições com proteínas que incluem pelo menos um aminoácido não-natural são úteis para, incluindo, entre outros, novos agentes terapêuticos, agentes diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, mas não limitado a, anticorpos), além de, entre outros, o estudo de estrutura e função protéica. Consultar, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural amino acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.

Em um aspecto da invenção, uma composição contém pelo menos uma proteína com pelo menos um, incluindo, entre outros, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez ou mais aminoácidos não-naturais. Os aminoácidos não-naturais podem ser iguais ou diferentes, incluindo, entre outros, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais diferentes aminoácidos não-naturais. Em outro aspecto, uma composição contém uma proteína com pelo menos um, porém com menos do que todos, de um aminoácido específico presente na proteína substituído com o aminoácido não-natural. Para uma dada proteína com mais de um aminoácido não-natural, os aminoácidos não-naturais podem ser idênticos ou diferentes (incluindo, entre outros, a proteína pode incluir dois ou mais diferentes tipos de aminoácidos não-naturais, ou pode incluir dois do mesmo aminoácido não-natural). Para uma dada proteína com mais de dois aminoácidos não-naturais, os aminoácidos nãonaturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de múltiplos aminoácidos nãonaturais do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido não natural diferente.

Proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido nãonatural representam um aspecto da invenção. A invenção inclui também polipeptídeos ou proteínas com pelo menos um aminoácido não-natural produzido com as composições e métodos da invenção. Um excipiente (incluindo, entre outros, excipiente farmaceuticamente aceitável) pode estar presente também com a proteína.

Pela produção de proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um ami73/238 noácido não-natural em células eucarióticas, estes incluirão tipicamente modificações póstraducionais eucarióticas. Em certas modalidades, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não-natural e pelo menos uma modificação pós-traducional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que a modificação pós-traducional não é feita por uma célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, mas não está limitada a, acetilação, acilação, modificação em lipídio, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação a glicolipídio, glicosilação e as semelhantes. Em um aspecto, a modificação pós-traducional inclui unir um oligossacarídeo (incluindo, entre outros, (GlcNAcMan)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) a uma asparagina por ligação, GlcNAc-asparagina. Consultar também a Tabela 1 que relaciona alguns exemplos de oligossacarídeos N-ligados de proteínas eucarióticas (resíduos adicionais podem estar presentes também, porém, não são mostrados). Em outro aspecto, a modificação pós-traducional inclui unir um oligossacarídeo (incluindo, entre outros, Gal-GaINAc, Gal-GIcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por ligação GaINAc-serina ou GaINAc-treonina, ou ligação GlcNAc-serina ou a GlcNAc-treonina.

Tabela 1: Exemplos de oligossacarídeos através de ligação GlcNAc

Tipo	Estrutura básica
Alto teor de manose	Mana1-6~^ Manaí-e^ Mana1-3^ J> Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcp1-Asi Manod-3^
Híbrido	Manal-6^. Manp1-4GlcNAcp1-4GlcNAcpi-As GlcNAcp1-2----Mana1-3^
Complexo	GlcNAcpi-2-----Mana1-6>. Manpi-4GlcNAcp1-4GlcNAcp1-As GlcNAcp1-2----Mana1-3-^
Xilose	Mana 1-6-. J> Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcp1-Asn Xylp1-2^

Em ainda outra característica, a modificação pós-traducional inclui processamento proteolítico de precursores (incluindo, entre outros, precursor de calcitonina, precursor de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, hormônio pré-pró-paratireoide, pré-próinsulina, pró-insulina, pré-pró-opiomelanocortina, pró-opiomelanocortina e os semelhantes), montagem em proteína de múltiplas subunidades ou montagem macromolecular, tradução para outro sítio na célula (incluindo, entre outros, para organelas, tais como retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, o núcleo, lisossomos, peroxissomos, mitocôndrias, cloro74/238 plastos, vacúolos, etc., ou através da via secretora). Em certas modalidades, a proteína compreende sequência de secreção ou localização, tag de epítopo, tag FLAG, tag de polihistidina, fusão GST ou os semelhantes.

Uma vantagem de um aminoácido não-natural é a de que este apresenta grupos químicos adicionais que podem ser usados para adicionais moléculas adicionais. Essas modificações podem ser feitas in vivo em célula eucariótica ou não, ou in vitro. Dessa forma, em certas modalidades, a modificação pós-traducional é através do aminoácido não-natural. Por exemplo, a modificação pós-traducional pode ser através de reação nucleofílicaeletrofílica. A maioria das reações correntemente utilizadas para a modificação seletiva de proteínas envolve formação de ligações covalentes entre parceiros nucleofílicos e eletrofílicos de reação, incluindo, mas não limitado a, a reação de α-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade nesses casos é determinada pelo número e pela acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Em proteínas da invenção, outras reações mais seletivas podem ser utilizadas, tal como a reação de um ceto-aminoácido nãonatural com hidrazidas ou com compostos aminóxi, in vitro e in vivo. Consultar, por exemplo, Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc., 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sei., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sei., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:67356746; e Chin, et al., (2003) Science, in press. Dessa forma, é possível a marcação seletiva de virtualmente qualquer proteína com hospedeiro de reagentes incluindo fluoróforos, agentes reticulantes, derivados de sacarídeos e moléculas citotóxicas. Consultar também, o Pedido de Patente Serial N° 10/686 944, intitulado “Glycoprotein synthesis” e depositado em 16 de janeiro de 2003, o qual é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Modificação pós-traducionais, incluindo, mas não limitado a, através de azido aminoácido, pode ser efetuada também através de ligação de Staudinger (incluindo, entre outros, com reagentes triarilfosfinos). Consultar, por exemplo, Kiick et al., (2002) Incorporation of azidas into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation, PNAS 99:19-24.

Esta invenção provê outro método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas, o qual envolve a incorporação genética de aminoácidos não-naturais, incluindo, entre outros, contendo grupo azida ou alquinila, em proteínas em resposta a um códon seletor. Estas cadeias laterais de aminoácidos podem ser então modificadas por, incluindo, entre outros, reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (consultar, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, Β. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e Huisgen, R. em ),3-Dipolar Cicloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova York, p. 1-176) com, incluindo, entre outros, derivados alquinila ou azida, res75/238 pectivamente. Pelo fato de este método envolver cicloadição em vez de substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta. Esta reação pode ser conduzida a temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(l) à mistura da 5 reação. Consultar, por exemplo, Tornoe, etal., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; e Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Outro método que pode ser usado é a troca de ligante em composto bis arsênico com motivo tetracisteína, por exemplo, Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272.

Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de ci10 cloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com derivado azido ou alquinila. Moléculas incluem, mas não estão limitadas a, corantes, fluoróforos, agentes reticulantes, derivados de sacarídeos, polímeros (incluindo, entre outros, derivados de polietilenoglicol), fotoreticulantes, compostos citotóxicos, marcadores de afinidade, derivados de biotina, resinas, esferas, uma segunda proteína ou polipeptídeo (ou mais), polinucleotídeo(s) (incluindo, en15 tre outros, DNA, RNA, etc.), quelantes de metal, co-fatores, ácidos graxos, carboidratos e as semelhantes. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não-natural com grupo alquinila, incluindo, entre outros, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, entre outros, p-azido-fenilalanina, respectivamente.

VI.Geração in vivo de of fEPO compreendendo aminoácidos não codificados gene20 ticamente

Os polipeptídeos de fEPO da invenção podem ser gerados in vivo, utilizando tRNA ou tRNA sintetases modificados para adicionar ou substituir aminoácidos que não são codificados em sistemas naturais.

Métodos para gerar tRNAs e tRNA sintetases que fazem uso de aminoácidos não codificados em sistemas naturais estão descritos em, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (serial no. 10/126,927) e 2003/0108885 (serial n° 10/126 931), as quais são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente. Estes métodos envolvem gerar um mecanismo de tradução que funcione independentemente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema de tradução (e são, portanto, às vezes referidos como 30 “ortogonal”). Tipicamente, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS). Tipicamente, a O-RS de preferência aminoacila o O-tRNA com pelo menos um aminoácido não natural no sistema de tradução e o O-tRNA reconhece pelo menos um códon seletor que não é reconhecido por outros tRNAs no sistema. O sistema de tradução insere, portanto, o aminoácido não codificado natural35 mente em uma proteína produzida no sistema, em resposta a um códon seletor codificado, “substituindo” com isso um aminoácido em uma posição no polipeptídeo codificado.

Uma ampla variedade de tRNAs e aminoacil tRNA sintetase ortogonais foi descrita

76/238 no estado da técnica para inserir aminoácidos sintéticos especificados em polipeptídeos, e estes são geralmente adequados para uso na presente invenção. Por exemplo, OtRNA/aminoacill-tRNA sintetases ceto-específicos estão descritos em Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003). O-RS exemplares, ou partes desta, são codificadas por sequências de polinucleotídeos e incluem sequências de aminoácidos descritas nas Publicações dos Pedidos de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927) e 2003/0108885 (serial n° 10/126 931), as quais são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente. Moléculas correspondentes de O-tRNA para uso com as O-RSs estão descritas também nas Publicações dos Pedidos de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927) e 2003/0108885 (serial n° 10/126 931), as quais são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente.

Um exemplo de sistema de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase azida-específico está descrito em Chin, J. W., etal., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Sequências exemplares de O-RS para p-azido-L-Phe incluem, mas não estão limitadas, as sequências de nucleotídeos SEQ ID NOs: 14-16 e 29-32, e sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 46-48 e 61-64 descritas na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0108885 (serial n° 10/126 931), a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente. Sequências exemplares de O-tRNA, adequadas para uso na presente invenção, incluem, mas não estão limitadas, as sequências de nucleotídeos SEQ ID NOs: 1-3 descritas na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927), a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente. Outros exemplos pares de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específicos para aminoácidos não codificados naturalmente em particular estão descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927), a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente. O-RS e O-tRNA que incorporam tanto aminoácidos contendo ceto como contendo azida em S. cerevisiae estão descritos em Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003).

O uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido não codificado naturalmente. Embora qualquer códon possa ser usado, é geralmente desejável selecionar um códon que é raramente ou nunca usado na célula na qual o O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase é expresso. Por exemplo, códons exemplares incluem códon nonsense códon, como códons de parada (âmbar, ocre e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons naturais de três bases que são raramente ou não usados.

Códon(s) seletor(es) específico(s) pode(m) ser introduzido(s) em posições apropriadas na sequência de codificação do polinucleotídeo de fEPO usando métodos de mutagênese conhecidos no estado da técnica (incluindo, entre outros, mutagênese sítio-específica, mutagênese de cassete, mutâgenese com seleção de restrição, etc.).

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Métodos para gerar componentes do mecanismo de biossintética protéica, tais como O-RSs, O-tRNAs e pares de O-tRNA/O-RS ortogonais que podem ser usados para incorporar um aminoácido não codificado naturalmente estão descritos em Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W„ et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Métodos e composições para a incorporação in vivo de aminoácidos não codificados naturalmente estão descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927), a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente. Métodos para selecionar um par de tRNA-tRNA sintetase ortogonal para uso em sistema de tradução in vivo de um organismo são descritos nas Publicações dos Pedidos de Patente U.S. 2003/0082575 (serial n° 10/126 927) e 2003/0108885 (serial n° 10/126 931), as quais são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente.

Métodos para produzir pelo menos uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) recombinante compreendem: (a) gerar uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de pelo menos uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) de um primeiro organismo, incluindo, entre outros, organismo procariótico, tais como Methanococcus jannaschii, Methanobacteríum thermoautotrophicum, Halobacteríum, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furíosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou os semelhantes, ou organismo eucariótico; (b) selecionar (e/ou efetuar varredura) na biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) membros que aminoacilam tRNA ortogonal (Ο-tRNA) na presença de aminoácido não codificado naturalmente e aminoácido natural, e formar, pelo mesmo, um pool de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e/ou, (c) selecionar (opcionalmente por seleção negativa), no pool, RSs ativas (incluindo, mas não limitado a, RSs mutantes) que de preferência aminoacilem o Ο-tRNA na ausência do aminoácido não codificado naturalmente, fornecendo com isso a pelo menos única O-RS recombinante; em que a pelo menos única O-RS recombinante aminoacile de preferência o Ο-tRNA com o aminoácido não codificado naturalmente.

Em uma modalidade, a RS é inativa. A RS inativa pode ser gerada fazendo que uma RS ativa sofra mutação. Por exemplo, a RS inativa pode ser gerada por mutação em pelo menos aproximadamente 1, pelo menos aproximadamente 2, pelo menos aproximadamente 3, pelo menos aproximadamente 4, pelo menos aproximadamente 5, pelo menos aproximadamente 6 ou pelo menos aproximadamente 10 ou em mais aminoácidos para diferentes aminoácidos, incluindo, entre outros, alanina.

Bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas usando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo, mas não limitado a, desenho racional com base em estrutura protéica tridimensional de RS, ou mutagênese de nucleotídeos de RS em técnica de desenho aleatório ou racional. Por exemplo, as RSs mutantes podem ser geradas por mutações sítio-específicas, mutações aleatórias, mutações de recombinações gerando diversida78/238 de, construções quiméricas e por outros métodos aqui descritos ou conhecidos no estado da técnica.

Em uma modalidade, selecionar (e/ou efetuar varredura) a biblioteca de RSs (opcionalmente de RSs mutantes) quanto a membros que sejam ativos, incluindo, entre outros, 5 aqueles que aminoacilam tRNA ortogonal (Ο-tRNA) na presença de aminoácido não codificado naturalmente e aminoácido natural, inclui: introduzir um marcador de seleção ou pesquisa positiva, incluindo, entre outros, gene de resistência a antibióticos, ou os semelhantes, e a biblioteca de RSS (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células, em que o marcador de seleção e/ou varredura positiva compreende pelo menos um códon seletor, 10 incluindo, entre outros, códon âmbar, ocre ou opala; cultivar a pluralidade de células na presença de um agente de seleção; identificar células que sobrevivam (ou que exibam uma resposta específica) na presença do agente de seleção e/ou de varredura, suprimindo o pelo menos único códon seletor no marcador positivo de seleção ou varredura, sendo formado com isso um subconjunto de células positivamente selecionadas que contêm o pool de RSs 15 ativas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, a concentração do agente de seleção e/ou varredura pode ser variada.

Em um aspecto, o marcador de seleção positiva é um gene que codifica cloranfenicol acetiltransferase (CAT) e o códon seletor é códon âmbar de parada no gene CAT. Opcionalmente, o marcador de seleção positiva é um gene que codifica β-lactamase e o códon 20 seletor é códon âmbar de parada no gene de β-lactamase. Em outro aspecto, o marcador de seleção positiva compreende um marcador fluorescente ou luminescente de varredura, ou marcador de varredura com base em afinidade (incluindo, entre outros, marcador de superfície celular).

Em uma modalidade, selecionar negativamente ou efetuar varredura negativa no 25 pool quanto a RSs ativas (opcionalmente mutantes) que aminoacilam o Ο-tRNA de preferência na ausência do aminoácido não codificado naturalmente inclui: introduzir um marcador de seleção ou varredura negativa com o pool de RSs ativas (opcionalmente mutantes) da seleção ou varredura positiva, ou efetuar varredura em uma pluralidade de células de um segundo organismo, em que o marcador de seleção ou varredura negativa compreende pelo 30 menos um códon seletor (incluindo, entre outros, gene de resistência a antibióticos, incluindo, entre outros, gene que codifica cloranfenicol acetiltransferase (CAT)); e identificar células que sobrevivam ou que exibam uma resposta específica à varredura em um primeiro meio suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente e um agente de varredura ou seleção, porém que não consigam sobreviver ou exibir a resposta específica em um 35 segundo meio não suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente e o agente de seleção ou varredura, sendo proporcionado com isso células sobreviventes ou células detectadas na varredura que contêm a pelo menos única O-RS recombinante. Por exemplo,

79/238 um protocolo de identificação de CAT atua opcionalmente como seleção positiva e/ou varredura negativa na determinação de O-RS recombinantes apropriadas. Por exemplo, um pool de clones é opcionalmente replicado em placas de cultura contendo CAT (o qual compreende pelo menos um códon seletor), com ou sem um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. Colônias crescendo exclusivamente nas placas contendo aminoácidos não codificados naturalmente são consideradas, portanto, contendo O-RS combinante. Em um aspecto, a concentração do agente de seleção (e/ou varredura) é variada. Em alguns aspectos, o primeiro e o segundo organismo são diferentes. Dessa forma, o primeiro e/ou o segundo organismo opcionalmente compreendem: procarioto, eucarioto, mamífero, Escherichia coli, fungo, levedura, Archaebacterium, Eubacteríum, planta, inseto, protista, etc. Em outras modalidades, o marcador de varredura compreende um agente fluorescente ou luminescente de varredura ou agente de varredura com base em afinidade.

Em outra modalidade, efetuar varredura ou selecionar (incluindo, entre outros, selecionar negativamente) o pool quanto a RSs ativas (opcionalmente mutantes) inclui: isolar o pool de RSs ativas mutantes provenientes da etapa de seleção positiva (b); introduzir um marcador de seleção ou varredura negativa, em que o marcador de seleção ou varredura negativa compreende pelo menos um códon seletor (incluindo, entre outros, gene marcador tóxico, incluindo, entre outros, gene de ribonuclease barnase, compreendendo pelo menos um códon seletor), e o pool de RSs ativas (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células de um segundo organismo; e identificar células que sobrevivem ou exibem uma resposta específica à varredura em um primeiro meio não suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente, porém que não conseguem sobreviver ou exibir uma resposta específica à varredura em um segundo meio suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente, proporcionando com isso células sobreviventes ou detectadas na varredura contendo a pelo menos única O-RS recombinante, em que a pelo menos única O-RS recombinante é específica para o aminoácido não codificado naturalmente. Em um aspecto, o pelo menos único códon seletor compreende aproximadamente dois ou mais códons seletores. Estas modalidades podem opcionalmente incluir modalidades em que o pelo menos único códon seletor compreende dois ou mais códons seletores e em que o primeiro e o segundo organismos são diferentes (incluindo, entre outros, cada organismo sendo opcionalmente, entre outros, procarioto, eucarioto, mamífero, Escherichia coli, fundo, levedura, Archaebacteria, Eubacteria, planta, inseto, protista, etc.). Adicionalmente, alguns aspectos incluem em que o marcador de seleção negativa compreende um gene ribonuclease barnase (o qual compreende pelo menos um códon seletor). Outros aspectos incluem em que o marcador de seleção opcionalmente compreende um marcador fluorescente ou luminescente de varredura ou um marcador de varredura com base em afinidade. Nas modalidades neste pedido de patente, as varreduras e/ou seleções incluem opcionalmente variação do

80/238 rigor da varredura e/ou da seleção.

Em uma modalidade, os métodos para produzir a pelo menos única aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) recombinante podem compreender ainda: (d) isolar a pelo menos única O-RS recombinante; (e) gerar um segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutan5 tes) derivado da pelo menos única O-RS recombinante; e (f) repetir as etapas (b) e (c) até se obter uma O-RS mutante que compreenda capacidade para preferivelmente aminoacilar o O-tRNA. Opcionalmente, as etapas (d)-(f) são repetidas, incluindo, entre outros, pelo menos em torno de duas vezes. Em um aspecto, o segundo conjunto de O-RS mutantes derivado da pelo menos única O-RS recombinante pode ser gerado por mutagênese, incluindo, 10 mas não limitado a, por mutagênese aleatória, mutagênese sítio-específica, recombinação ou uma combinação destas.

O rigor das etapas de seleção/varredura, incluindo, mas não limitado a, a etapa (b) de seleção/varredura positiva, a etapa (c) de seleção/varredura negativa ou as duas etapas de seleção/varredura positiva e negativa (b) e (c), nos métodos descritos acima, inclui op15 cionalmente variar o rigor da seleção/varredura. Em outra modalidade, a etapa (b) de seleção/varredura positiva, a etapa (c) de seleção/varredura negativa ou as duas etapas de seleção/varredura positiva e negativa (b) e (c) compreendem usar um repórter, em que o repórter é detectado por separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou em que o repórter é detectado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é exibido sobre superfície 20 celular, por exibição em fagos ou os semelhantes, e selecionado com base em afinidade ou atividade catalítica envolvendo o aminoácido não codificado naturalmente ou um análogo. Em uma modalidade, a sintetase mutante é exibida sobre superfície celular, por exibição em fagos ou os semelhantes.

Métodos para produzir um tRNA ortogonal (O-tRNA) recombinante inclui: (a) gerar 25 uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA, incluindo, entre outros, tRNA supressor, proveniente de um primeiro organismo; (b) selecionar (incluindo, entre outros, selecionar negativamente) ou efetuar varredura da biblioteca quanto a tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) de um segundo organismo na ausência de uma RS do primeiro organismo, formando com isso um 30 pool de tRNAs (opcionalmente mutantes); e (c) selecionar ou efetuar varredura do pool de tRNAs (opcionalmente mutantes) quanto a membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, proporcionando com isso pelo menos um O-tRNA recombinante; em que o pelo menos único O-tRNA recombinante reconhece um códon seletor e não é eficientemente reconhecido pela RS do segundo organismo e é preferivelmente aminoaci35 lado pela O-RS. Em algumas modalidades, o pelo menos único tRNA é tRNA supressor e/ou compreende um códon único de três bases de bases naturais e/ou não-naturais, ou é códon nonsense, códon raro, códon não-natural, códon compreendendo pelo menos 4 bases, có81/238 don âmbar, códon ocre ou códon opala. Em uma modalidade, o O-tRNA recombinante possui melhora de ortogonalidade. Será apreciado que, em algumas modalidades, O-tRNA é opcionalmente importado para um primeiro organismo a partir de um segundo organismo sem a necessidade de modificação. Em várias modalidades, o primeiro e o segundo organismo são iguais ou diferentes, e são opcionalmente escolhidos a partir de, entre outros, procariotos (incluindo, entre outros, Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, etc.), eucariotos, mamíferos, fungos, leveduras, Archaebacteria, Eubactería, plantas, insetos, protistas, etc. Adicionalmente, o tRNA recombinante é opcionalmente aminoacilado por um aminoácido não codificado naturalmente, em que o aminoácido não codificado naturalmente é biossintetizado in vivo quer naturalmente quer por manipulação genética. O aminoácido não codificado naturalmente é opcionalmente adicionado a um meio de crescimento para pelo menos o primeiro ou o segundo organismo.

Em um aspecto, selecionar (incluindo, entre outros, selecionar negativamente) ou efetuar varredura na biblioteca quanto a tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-tRNA sintetase (etapa (b)) inclui: introduzir um gene marcador tóxico, em que o gene marcador tóxico compreende pelo menos um dos códons seletores (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático ou um gene essencial para o organismo em que este gene marcador compreende pelo menos um códon seletor) e a biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células do segundo organismo; e selecionar células sobreviventes, em que as células sobreviventes contêm o pool de tRNAs (opcionalmente mutantes) compreendendo o pelo menos único tRNA ortogonal ou tRNA não funcional. Por exemplo, células sobreviventes podem ser selecionadas por ensaio comparativo de razão da densidade celular.

Em outro aspecto, o gene marcador tóxico pode incluir dois ou mais códons seletores. Em outra modalidade dos métodos, o gene marcador tóxico é um gene de ribonuclease barnase, em que o gene de ribonuclease barnase compreende pelo menos um códon âmbar. Opcionalmente, o gene de ribonuclease barnase pode incluir dois ou mais códons âmbar.

Em uma modalidade, selecionar ou efetuar varredura do pool de tRNAs (opcionalmente mutantes) quanto a membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida pode incluir: introduzir um gene marcador de seleção ou varredura positiva, em que o gene marcador positivo compreende um gene de resistência a fármacos (incluindo, entre outros, gene de β-lactamase, compreendendo pelo menos um dos códons seletores, tais como pelo menos um códon de parada âmbar) ou um gene essencial para o organismo, ou um gene que leva à detoxificação de um agente tóxico, junto com a O-RS, e o pool de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células do segundo organismo; e

82/238 identificar células sobreviventes ou detectadas na varredura que cresceram na presença de um agente de seleção ou varredura, incluindo, entre outros, antibiótico, formando com isso um pool de células possuindo o pelo menos único tRNA recombinante, em que o pelo menos único tRNA recombinante é aminoacilado pela O-RS e insere um aminoácido em um produto de tradução codificado pelo gene marcador positivo, em resposta ao pelo menos único dos códons seletores. Em outra modalidade, a concentração do agente de seleção e/ou varredura é variada.

Métodos para gerar pares específicos de O-tRNA/O-RS são providos. Os métodos incluem: (a) gerar uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA de um primeiro organismo; (b) selecionar neçjativamente ou efetuar varredura da biblioteca quanto a tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) de um segundo organismo na ausência de uma RS do primeiro organismo, sendo formado com isso um pool de tRNAs (opcionalmente mutantes); (c) selecionar ou efetuar varredura do pool de tRNAs (opcionalmente mutantes) quanto a membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, proporcionado com isso pelo menos um Ο-tRNA recombinante. O pelo menos único Ο-tRNA recombinante reconhece um códon seletor e não é eficientemente reconhecido pela RS do segundo organismo e é preferivelmente aminoacilado pela O-RS. O método inclui também (d) gerar uma biblioteca de RSs (opcionaímente mutantes) a partir de pelo menos uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) de um terceiro organismo; (e) selecionar ou efetuar varredura da biblioteca de RSs mutantes quanto a membros que preferivelmente aminoacilam o pelo menos único Ο-tRNA recombinante na presença de um aminoácido não codificado naturalmente e um aminoácido natural, sendo formado com isso um pool de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e (f) selecionar negativamente ou efetuar varredura negativa do pool quanto a RSs ativas (opcionalmente mutantes) que preferivelmente aminoacilam o pelo menos único Ο-tRNA recombinante na ausência do aminoácido não codificado naturalmente, fornecendo com isso o pelo menos único par específico de O-tRNA/O-RS, em que o pelo menos único par específico de OtRNA/O-RS compreende a pelo menos única O-RS recombinante que é específica para o aminoácido não codificado naturalmente e o pelo menos único Ο-tRNA recombinante. Pares específicos de O-tRNA/O-RS produzidos pelos métodos estão incluídos. Por exemplo, o par específico de O-tRNA/O-RS pode incluir, entre outros, par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como par mutRNATyr-SS12TyrRS, par mutRNALeu-mutLeuRS, par mutRNAThr-mutThrRS, par mutRNAGIu-mutGluRS ou os semelhantes. Adicionalmente, estes métodos incluem em que o primeiro e o terceiro organismo são os mesmos (incluindo, entre outros, Methanococcus jannaschii).

Métodos para selecionar um par de tRNA-tRNA sintetase ortogonais para uso em sistema de tradução in vivo de um segundo organismo estão também incluídos na presente

83/238 invenção. Os métodos incluem: introduzir um gene marcador, um tRNA e uma aminoaciltRNA sintetase (RS) isolados ou derivados de um primeiro organismo em um primeiro conjunto de células de um segundo organismo; introduzir o gene marcador e o tRNA em duplicata de conjunto de células de um segundo organismo; e selecionar células sobreviventes 5 no primeiro conjunto que não conseguem sobreviver na duplicata do conjunto de células, ou efetuar varredura quanto a células que exibem uma resposta específica à varredura que não conseguem fornecer esta resposta na duplicata do conjunto de células, em que o primeiro conjunto e a duplicata do conjunto de células são cultivados na presença de um agente de seleção ou varredura, em que as células sobreviventes ou detectadas na varredura compre10 endem o par de tRNA-tRNA sintetase ortogonais para uso no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Em uma modalidade, comparar e selecionar ou efetuar varredura inclui um ensaio de complementação in vivo. A concentração do agente de seleção ou varredura pode ser variada.

Os organismos da presente invenção compreendem uma variedade de organismos 15 e uma variedade de combinações. Por exemplo, o primeiro e o segundo organismo dos métodos da presente invenção podem ser os mesmos ou diferentes. Em uma modalidade, os organismos são opcionalmente organismo procariótico, incluindo, entre outros, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horíkoshii, A. pernix, T. thermophilus ou os semelhantes. Alternati20 vamente, os organismos opcionalmente compreendem organismo eucariótico, incluindo, entre outros, plantas (incluindo, entre outros, plantas complexas tais como monocotiledôneas ou dicotiledôneas), algas, protistas, fungos (incluindo, entre outros, levedura, etc.), animais (incluindo, entre outros, mamíferos, insetos, artrópodes, etc.) ou os semelhantes. Em outra modalidade, o segundo organismo é procariótico, incluindo, entre outros, Methanococ25 cus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A.

fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horíkoshii, A. pernix, T. thermophilus ou os semelhantes. Alternativamente, o segundo organismo pode ser eucariótico, incluindo, entre outros, levedura, célula de animal, célula de planta, célula de mamífero ou os semelhantes. Em várias modalidades, o primeiro e o segundo organismo são diferentes.

VII.Localização de aminoácidos que não ocorrem naturalmente em fEPO

A presente invenção contempla incorporar um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente em fEPO. Um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente podem ser incorporados em uma determinada posição que não altere a atividade do polipeptídeo. Isso pode ser conseguido efetuando-se substituições conservadoras, incluindo, mas 35 não limitado a, substituindo aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos volumosos para aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrofílicos para aminoácidos hidrofílicos e/ou inserindo o aminoácido que não ocorre naturalmente em um local que

84/238 não é necessário para atividade.

Regiões de fEPO podem ser ilustradas como segue, em que as posições de aminoácidos na fEPO estão indicadas na linha do meio:

Hélice A mini B’ Hélice B Hélice C mini C’ Hélice D [1-7]-[8-26]-[27-46]-[47-52]-[55-83]-[84-89]-[90-112]-[113-121]-[122-137]-[138-161][162-166]

N-term alça A-B alça B-C alça C-D C-term

Uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais pode ser empregada para selecionar os sítios desejados para substituição com um aminoácido não codificado natu10 ralmente dentro do polipeptídeo de fEPO. É rapidamente evidente para aqueles versados no estado da técnica que qualquer posição na cadeia polipeptídica é adequada para seleção e incorporação de um aminoácido não codificado naturalmente, e a seleção pode ter como base desenho racional ou pode ser seleção aleatória para qualquer ou nenhuma finalidade especial desejada. A seleção de sítios desejados pode ser para produzir uma molécula de 15 fEPO com qualquer propriedade ou atividade desejada, incluindo, entre outros, agonistas, super-agonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de ligação ao receptor, moduladores de atividade de receptor, formação de dímero ou multímero, nenhuma alteração à atividade ou propriedade comparado à molécula nativa, ou para manipular qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo tais como solubilidade, agregação ou estabilidade. 20 Por exemplo, locais no polipeptídeo necessários para atividade biológica de fEPO podem ser identificados usando métodos de varredura (scanning) de alanina ou varredura de homólogos conhecidos no estado da técnica. Consultar, por exemplo, Bittorf, T. et al. FEBS, 336:133-136 (1993) (identificando resíduos críticos para atividade de EPO), Wen, D., et al. JBC, 269:22839-22846 (1994) (mutagênese com mapeamento de alanina empregado para 25 identificar domínios funcionalmente de hEPO), e Elliot, S. et al. Blood, 89:493-502 (1997) (identificando interações eletrostáticas importantes entre hEPO e receptor de EPO humana). Resíduos diferentes daqueles identificados como fundamentais para atividade biológica por mutagênese com mapeamento de alanina ou de homólogos podem ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não codificado naturalmente, dependendo da ativida30 de desejada buscada para o polipeptídeo. Alternativamente, os sítios identificados como fundamentais para atividade biológica podem ser também bons candidatos para substituição com um aminoácido não codificado naturalmente, novamente dependendo da atividade desejada para o polipeptídeo. Outra alternativa seria efetuar simplesmente substituições em série em cada posição na cadeia polipeptídica com um aminoácido não codificado natural35 mente e observar o efeito sobre as atividades do polipeptídeo. É rapidamente evidente para aqueles versados no estado da técnica que quaisquer meios, técnica ou método para selecionar uma posição para substituição com aminoácido não-natural em qualquer polipeptídeo

85/238 é adequado para uso na presente invenção.

A estrutura e a atividade de mutantes de fEPO que ocorrem naturalmente e que contêm deleções podem também ser examinadas para determinar regiões da proteína que possivelmente tolerarão substituição com um aminoácido não codificado naturalmente. Con5 sultar, por exemplo, Bittorf et al., FEBS, 336:133 (1993); Wen et al, JBC, 269:22839 (1994). Uma vez tenham eliminados resíduos que possivelmente são intolerantes à substituição com aminoácidos não codificados naturalmente, o impacto de substituições propostas em cada uma das demais posições pode ser examinado a partir da estrutura tridimensional de fEPO e de suas proteínas de ligação. Consultar, Syed et al., Nature, 395: 511 (1998) e Che10 etham et al., Nature Structural Biology, 5:861 (1998); estruturas de hEPO por cristalografia de raios-x e NMR encontram-se disponíveis em Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org com ID do PDB: 1CN4, 1EER e 1BUY), um banco de dados centralizado contendo dados sobre estruturas tridimensionais de grandes moléculas de proteínas e ácidos nucléicos. Por conseguinte, com o uso de informações conhecidas referentes à hEPO, aqueles versados no 15 estado da técnica podem identificar rapidamente posições de aminoácidos em fEPO (consultara Figura 1) que podem ser substituídas com aminoácidos não codificados naturalmente.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de EPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente posicionados em uma região da proteí20 na que não afeta as hélices ou a estrutura secundária de folha beta de EPO. Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados ou substituídos em uma ou mais das seguintes regiões correspondentes a estruturas secundárias na EPO como segue: 1-7 (N-terminal), 8-26 (hélice A), 27-38 (região entre hélice A e hélice B), 39-41 (folha beta 1), 42-46 (região entre folha beta 1 e mini hélice B'), 47-52 (mini 25 hélice B’), 53-54 (região entre mini hélice B’ e hélice B), 55-83 (hélice B), 84-89 (região entre hélice B e hélice C), 90-113 (hélice C), 114-121 (mini hélice C’), 122-132 (região entre mini hélice C’ e folha beta 2), 133- 135 (folha beta 2), 136-137 (região entre folha beta 2 e hélice D), 138-161 (hélice D), 162-166 (C-terminal). Em algumas modalidades, o único ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma das seguintes posi30 ções na EPO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 17, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 107, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,136, 154, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165 e 166. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de EPO da in35 venção compreendem um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente em uma ou mais das seguintes posições: 21, 24, 27, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128,129, 130 e 162. Em algumas modali86/238 dades, ο aminoácido que não ocorre naturalmente nestas ou outras posições estão ligados a uma molécula solúvel em água, incluindo, mas não limitado a, as posições 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127 e 128.

Sítios exemplares de incorporação de aminoácido não codificado naturalmente incluem, entre outros, aqueles que estão excluídos do Sítio I e Sítio II, que podem ser completa ou parcialmente expostos a solventes, possuem interações mínimas ou nenhuma de ligação a hidrogênios com resíduos próximos, podem ser minimamente expostos a resíduos próximos reativos e que podem estar em regiões que são altamente flexíveis (incluindo, mas não limitado a, alça C-D) ou estruturalmente rígidas (incluindo, mas não limitado a, hélice B) conforme predito pela estrutura tridimensional em cristal de hEPO com seu receptor.

Uma ampla variedade de aminoácidos não codificados naturalmente pode ser substituída ou incorporada em determinada posição em fEPO. Em geral, um aminoácido não codificado naturalmente em particular é selecionado para incorporação com base em exame da estrutura tridimensional em cristal de fEPO com seu receptor, preferência por substituições conservadoras (ou seja, aminoácidos não codificados naturalmente à base de arila, tais como p-acetilfenilalanina ou O-propargiltirosina substituídos no lugar de Phe, Tyr ou Trp) e a química da conjugação específica que se deseja introduzir no polipeptídeo de fEPO (incluindo, entre outros, a introdução de 4-azidofenilalanina quando se quer o efeito de cicloadição [3+2] de Huisgen [3+2] com um polímero solúvel em água carreando um grupo alcino, ou formação de ligação amida com um polímero solúvel em água que carreia um aril éster que, por sua vez, incorpora um grupo fosfino).

Em uma modalidade, o método inclui ainda incorporar na proteína o aminoácido não-natural, em que o aminoácido não-natural compreende um primeiro grupo reativo; e por a proteína em contato com uma molécula (incluindo, mas não limitado a, corante, polímero, incluindo, entre outros, derivado de polietilenoglicol, foto-reticulante, composto citotóxico, marcador de afinidade, derivado de biotina, resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo, quelante de metal, co-fator, ácido graxo, carboidrato, polinucleotídeo (incluindo, entre outros, DNA, RNA, etc.), etc.) que compreenda um segundo grupo reativo. O primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para unir a molécula ao aminoácido não natural por meio de cicloadição [3+2]. Em uma modalidade, o primeiro grupo reativo é grupo alquinila ou azido e o segundo grupo reativo é grupo azido ou alquinila. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupo alquinila (incluindo, entre outros, em aminoácido não-natural ppropargiloxifenilalanina), e o segundo grupo reativo, o grupo azido. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupo azido (incluindo, entre outros, no aminoácido não-natural pazido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo, o grupo alquinila.

Um subconjunto de sítios exemplares para incorporação de aminoácido não codificado naturalmente inclui, entre outros, 1, 2, 4, 17, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38,

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40, 50, 53, 55, 58, 65, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 136 e 162. Um exame da estrutura em cristal de hEPO e suas interações com o receptor de hEPO, bem como a modelagem molecular fornecida junto com o pedido de patente presentemente depositado de fEPO indicam que as cadeias laterais destes resíduos de aminoácidos são completa ou parcialmente acessíveis a solvente e que a cadeia lateral de um aminoácido não codificado naturalmente pode se situar distante da superfície da estrutura e estar projetada externamente em direção ao solvente.

Posições exemplares para incorporação de aminoácido não codificado naturalmente em fEPO incluem 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 e 162. Um exame da estrutura em cristal de hEPO e suas interações com o receptor de hEPO indica que as cadeias laterais destes resíduos de aminoácido estão inteiramente expostas ao solvente e a cadeia lateral do resíduo nativo situa-se externamente em direção ao solvente.

Em alguns casos, a(s) substituição(ões) ou incorporação(ões) de aminoácidos não codificados naturalmente serão combinadas com outras adições, substituições ou deleções dentro do polipeptídeo de fEPO para afetar outros traços biológicos da fEPO. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, entre outros, resistência à degradação proteolítica) do polipeptídeo de fEPO ou aumentar a afinidade do polipeptídeo de fEPO por um receptor de eritropoetina. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, entre outros, quando expresso em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo de fEPO. Em algumas modalidades, os sítios são selecionados para substituição com um aminoácido codificado naturalmente ou não, além de em outro sítio para incorporação de um aminoácido não codificado naturalmente com a finalidade de aumentar a solubilidade de fEPO após a expressão em células hospedeiras recombinantes de E. coli. Exemplos destes sítios em fEPO para substituição de aminoácidos visando aumentar a solubilidade são N36, Q86, G113 e/ou Q115, os quais podem ser substituídos com Lys, Arg, Glu ou qualquer outro aminoácido codificado naturalmente ou não que tenha carga. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fEPO compreendem outra adição, substituição ou deleção que modula a afinidade pelo receptor de fEPO, modula (incluindo, entre outros, aumenta ou diminui) a dimerização de receptores, estabiliza dímeros do receptor, modula a meia-vida circulante, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma determina via de administração. Igualmente, polipeptídeos de fEPO podem compreender sequências de divagem por proteases, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, entre outros, FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base em afinidade (incluindo, entre outros, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não

88/238 limitado a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, entre outros, GFP), purificação ou outros traços do polipeptídeo.

Por exemplo, além de introduzir um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente como descrito neste pedido de patente, uma ou mais das seguintes substituições são introduzidas: S9A, F48S, Y49S, A50S, Q59A, A73G, G101A, T106A, L108A, T132A, R139A,

K140A, R143A, S146A, N147A, R150A e K154A para aumentar a afinidade da fEPO variante por seu receptor (Wen etal., (1994) JBC 269:22839-22846).

Em algumas modalidades, a substituição de um aminoácido não codificado naturalmente gera um antagonista de fEPO. Um subconjunto de sítios exemplares para incorporação de aminoácido não codificado naturalmente incluem: 10, 11, 14, 15, 96, 97, 100, 103, 104, 107, 110. (Elliot et al. (1997) Blood 89: 493-502; e Cheetham et al. (1998) Nature Structural Biology 5: 861-866). Em outras modalidades, os sítios exemplares para incorporação de aminoácido não codificado naturalmente incluem resíduos dentro da região amino terminal da hélice A e uma parte da hélice u. Em cutm mcdcüdsdc ikzx+ϊ+ι ιΐ/xzxrx I 1f)O rx/xrr» ι ι wn aminoácido não codificado naturalmente tal como p-azido-L-fenilalanina ou O-propargil-L tirosina. Em outras modalidades, substituições relacionadas acima combinadas com substi tuições adicionais que fazem com o polipeptídeo de fEPO seja antagonista de fEPO. Por exemplo, um aminoácido não codificado naturalmente é substituído em uma das posições aqui identificadas e uma substituição simultânea é introduzida em L108 (incluindo, entre outros, L108K, L108R, L108H, L108D ou L108E).

Em alguns casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos são substituídos com um aminoácido não codificado naturalmente. Em alguns casos, o polipeptídeo de fEPO inclui ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de um aminoácido não codifica do naturalmente para um aminoácido que ocorre naturalmente. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos dois resíduos nas seguintes regiões de fEPO são substituídos com um aminoácido não codificado naturalmente: 1-7 (N-terminal), 8-26 (hélice A), 27-38 (região entre hélice A e hélice B), 39-41 (folha beta 1), 42-46 (região entre folha beta 1 e mini hélice B’), 47-52 (mini hélice B’), 53-54 (região entre mini hélice B’ e hélice B), 55-83 (hélice B), 84-89 (região entre hélice B e hélice C), 90-113 (hélice C), 114-121 (mini hélice C’), 122-132 (região entre mini hélice C’ e folha beta 2), 133- 135 (folha beta 2), 136-137 (região entre folha beta 2 e hélice D), 138-161 (hélice D), 162-166 (C-terminal). Em alguns casos, os dois ou mais resíduos não codificados naturalmente estão ligados a um ou mais PEGs lineares ou ramificados de baixo peso molecular (aproximadamente ~ 5-20 kDa em massa), aumentando com isso a afinidade de ligação e meia-vida sérica comparável em relação às espécies unidas a um único PEG de peso molecular mais alto.

Em algumas modalidades, até dois dos seguintes resíduos são substituídos com um aminoácido não codificado naturalmente na posição: 1, 2, 4, 17, 21, 24, 27, 28, 30, 31,

λ.

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32, 34, 36, 37, 38, 40, 50, 53, 55, 58, 65, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 136 e 162. Por conseguinte, em alguns casos, os seguintes pares de substituições são feitos: N24X* e G113X*; N38X* e Q115X*; N36X* e S85X*; N36X* e A125X*; N36X* e A128X*; Q86X* e S126X*, em que X* representa um aminoácido não codificado naturalmente. Sítios preferidos para incorporação de dois ou mais aminoácidos não codificados naturalmente incluem combinações dos seguintes resíduos: 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 e 162. Sítios especialmente preferidos para incorporação de dois ou mais aminoácidos não codificados naturalmente incluem combinações dos seguintes resíduos: 21, 24, 38, 83, 86, 89, 116, 119, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 e 162.

VIII.Expressão em não-eucariotos e eucariotos

A fim de obter alto nível de expressão de polinucleotídeo clonado de fEPO, são subclonados, tipicamente polinucleotídeos que codificam um polipeptídec dc fEPO d? venção em um vetor de expressão que contenha um promotor forte para direcionar a transcrição, um terminador de transcrição/tradução e, se for um ácido nucléico codificando uma proteína, um sítio de ligação a ribossomo para dar início à tradução. Promotores bacterianos adequados são bem conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Sambrook et al. e Ausubel et al.

Existem disponíveis sistemas bacterianos de expressão para expressar polipeptídeos de fEPO da invenção em, incluindo, entre outros, E. coli, Bacillus sp., e Salmonella (Paiva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983). Kits para estes sistemas de expressão estão disponíveis comercialmente. Sistemas eucarióticos de expressão para células de mamíferos, leveduras e de insetos são bem conhecidos no estado da técnica e também se encontram comercialmente disponíveis. Em casos em que tRNAs e aminoacil tRNA sintetases ortogonais (descritos acima) são usados para expressar os polipeptídeos de fEPO da invenção, células hospedeiras para expressão são selecionadas com base em sua capacidade para usar os componentes ortogonais. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias Gram-positivas (incluindo, mas não limitado a, B. brevis ou B. subtilis, Pseudomonas ou Streptomyces) e bactéias Gram-negativas (E. coli), bem como leveduras e outras células eucarióticas. Células compreendendo pares de O-tRNA/O-RS podem ser utilizadas como descrito neste pedido de patente.

Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção são capazes de sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos nãonaturais em grandes quantidades úteis. Em um aspecto, a composição inclui opcionalmente, entre outros, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250

90/238 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos uma grama ou mais da proteína que compreende um aminoácido não-natural, ou uma quantidade que pode ser conseguida com métodos de produção in vivo (detalhes sobre produção e purificação de proteínas recombinantes são fornecidos neste relatório descritivo). Em outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição em concentração de, incluindo, entre outros, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais em, incluindo, entre outros, lisado celular, tampão, tampão farmacêutico ou outra suspensão líquida (incluindo, entre outros, em volume de, incluindo, entre outros, algo em torno de 1 nl a em torno de 100 L). A produção de grandes quantidades (incluindo, mas não limitado a, acima daquela que é tipicamente possível com outros métodos, incluindo, entre outros, tradução in vitro) de uma proteína em uma célula eucariótica incluindo pelo menos um aminoácido nãonatural é uma característica da invenção.

Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção é capaz de biossintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não-naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, proteínas compreendendo um aminoácido nãonatural podem ser produzidas em concentração de, incluindo, mas não limitado a, pelo menos 10 pg/litro, pelo menos 50 pg/litro, pelo menos 75 pg/litro, pelo menos 100 pg/litro, pelo menos 200 pg/litro, pelo menos 250 pg/litro ou pelo menos 500 pg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mg/litro, pelo menos 6 mg/litro, pelo menos 7 mg/litro, pelo menos 8 mg/litro, pelo menos 9 mg/litro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteína em extrato celular, lisado celular, meio de cultura, tampão e/ou os semelhantes.

Sistemas de expressão, cultura e isolamento fEPO pode ser expressa em alguns sistemas adequados de expressão, incluindo, por exemplo, levedura, células de inseto, células de mamíferos e bactérias. Uma descrição de sistemas exemplares de expressão é fornecida abaixo.

Levedura: Neste relatório descritivo, o termo “levedura” inclui qualquer uma das várias leveduras capazes de expressar um gene codificador de fEPO. Estas leveduras incluem, mas não estão limitadas a, leveduras ascosporogênicas (Endomycetales), leveduras basidiosporogênicas e leveduras pertencentes ao grupo de Fungi imperfecti (Blastomycetes). As leveduras ascosporogênicas são divididas em duas famílias, Spermophthoraceae e

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Saccharomycetaceae. A última é compreendida por quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (por exemplo, gênero Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (por exemplo, gêneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces). As leveduras basidiosporogênicas incluem os gêneros Leucosporidium, Rhodosporídium, Sporídiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. Leveduras pertencentes ao grupo de Fungi Imperfecti (Blastomycetes) são divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (por exemplo, gêneros Sporobolomyces e Bullera) e Cryptococcaceae (por exemplo, gênero Candida).

De particular interesse para uso com a presente invenção são espécies dentro dos gêneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis e Candida, inclusive, entre outros, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carIsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa e H. polymorpha.

A seleção de leveduras adequadas para expressão de fEPO está ao alcance do conhecimento de qualquer técnico versado no estado da técnica. Na seleção de leveduras como hospedeiro para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles que mostram ter, por exemplo, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e robustez no geral. Leveduras são geralmente disponibilizadas a partir de uma variedade de fontes inclusive, entre outros, o Yeast Genetic Stock Center, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da Califórnia (Berkeley, CA), e a American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA).

O termo “hospedeiro de levedura” ou “célula hospedeira de levedura” inclui a levedura que pode ser, ou foi usada como receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira original da levedura que recebeu os vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula precursora pode não ser necessária e completamente idêntica em morfologia ou em DNA genômico ou total complementar à célula precursora, devido à mutação acidental ou intencional. Progênie da célula precursora que é suficientemente semelhante à precursora para ser caracterizada pela propriedade pertinente, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos codificadora de fEPO, está incluída na progênie pretendida por essa definição.

Vetores de expressão e de transformação, incluindo replicons extracromossômicos ou vetores de integração, foram desenvolvidos para transformação em muitos hospedeiros de leveduras. Por exemplo, vetores de expressão foram desenvolvidos para S. cerevisiae (Sikorski et al., Genetics (1998) 112:19; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986)

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202:302); K. fragilis (Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. Basíc Microbiol. (1985) 25:141); P. pastoris (Patentes U.S. N^os 5 324 639, 4 929 555 e 4 837 148; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706); e Y. lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49); A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., Gene (1983) 26:205-221; e Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81:1470-74); A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479); T. reesia (EP 0 244 234); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357).

Sequências de controle para vetores de leveduras são bem conhecidos de qualquer um versado no estado da técnica e incluem, mas não estão limitadas a, regiões promotoras de genes tais como de álcool desidrogenase (ADH) (EP 0 284 044); enolase; glicoquinase; glicose-6-fosfato isomerase; gliceraldeídos-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH); hexoquinase; fosfofrutoquinase; 3-fosfoglicerato mutase e piruvato quinase (PyK) (EP 0 329 203). O gene PHO5 de leveduras, que codifica fosfatase ácida, pode também oferecer sequências promotoras úteis (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80:1). Outras sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de leveduras podem incluir os promotores para 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073); e outras enzimas glicolíticas como piruvato descarboxilase, triosefosfato isomerase e fosfoglicose isomerase (Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900; Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149). Promotores induzíveis de leveduras com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2; isocitocromo C; fosfatase ácida, metalotioneína; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; enzimas de degradação associadas com metabolismo de nitrogênio e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão em leveduras estão ainda descritos no documento EP 0 073 657.

Intensificadores de leveduras podem também ser usados junto com promotores de leveduras. Adicionalmente, promotores sintéticos podem funcionar também como promotores de leveduras. Por exemplo, as sequências de ativação em sentido ascendente (UAS) de um promotor de levedura podem ser unidas com a região de ativação de transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos destes promotores híbridos incluem a sequência reguladora de ADH ligada à região de ativação de transcrição de GAP. Consultar as Patentes U.S. N^os 4 880 734 e 4 876 197. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PHO5, combinados com a região de ativação transcricional

93/238 de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK. Consultar EP 0 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores naturais cuja origem não é de levedura e que são capazes de ligar RNA polimerase de levedura e iniciar transcrição.

Outros elementos de controle que podem compreender parte dos vetores de expressão em leveduras incluem terminadores, por exemplo, de genes de GAPDH ou da enolase (Holland etal., J. Biol. Chem. (1981) 256:1385). Adicionalmente, a origem de replicação a partir da origem de plasmídeo de 2 μ é adequada para levedura. Uma seleção adequada par uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura. Consultar Tschemper etal., Gene(1980) 10:157; Kingsman etal., Gene (1979) 7:141. O gene trp1 proporciona um marcador de seleção para cepa mutante de levedura desprovida da capacidade de crescer em triptofano. Igualmente, cepas de leveduras deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos carreando o gene Leu2.

Métodos para introduzir DNA exógeno em hospedeiros de leveduras são bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica e incluem, tipicamente, entre outros, a transformação de esferoplastos ou de células hospedeiras intactas de leveduras tratadas com cátions alcalinos. Por exemplo, a transformação de leveduras pode ser conduzida de acordo com o método descrito em Hsiao etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979) 76:3829 e Van Solingen et al., J. Bact. (1977) 130:946. No entanto, outros métodos para introduzir DNA em células tais como injeção nuclear, eltroporação ou fusão protoplástica podem também ser usado como descritos geralmente em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lab. Manual (2001). Células hospedeiras de leveduras podem então ser cultivadas usando técnicas padrão conhecidas daqueles versados no estado da técnica.

Outros métodos para expressar proteínas heterólogas em células hospedeiras de leveduras são bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica. Consultar, em geral, o Pedido de Patente U.S. N° 20020055169, as Patentes U.S. N^os 6 361 969; 6 312 923; 6 183 985; 6 083 723; 6 017 731; 5 674 706; 5 629 203; 5 602 034 e 5 089 398; as Patentes U.S. Re-examinadas N^os RE37 343 e RE35 749; as Publicações de Pedidos de Patente PCT WO 99/078621; WO 98/37208 e WO 98/26080; os Pedidos de Patente Européia EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274 e EP 0 164 556. Consultar também Gellissen et al., Antonie Van Leeuwenhoek (1992) 62(1-2):79-93; Romanos etal., Yeast(1992) 8(6):423-488; Goeddel, Methodsin Enzymology (1990) 185:3-7.

As cepas hospedeiras de leveduras podem ser cultivadas em fermentadores durante o estágio de amplificação usando métodos padrão de fermentação em batelada, bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica. Os métodos de fermentação podem ser adaptados para levar em consideração diferenças em uma via específica de utilização de carbono do hospedeiro de levedura ou modo de controle de expressão. Por exemplo, a fer94/238 mentação de um hospedeiro de levedura Saccharomyces pode requerer uma única alimentação de glicose, fonte complexa de nitrogênio (por exemplo, hidrolisados de caseína) e suplementação de múltiplas vitaminas. Por outro lado, a levedura metilotrófica P. pastoris pode requerer alimentações de glicerol, metanol e minerais traço, porém somente sais simples de amônio (nitrogênio) para crescimento e expressão ótimos. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 5 324 639; Elliott et al., J. Protein Chem. (1990) 9:95; e Fieschko et al., Biotech. Bioeng. (1987) 29:1113.

Estes métodos de fermentação, no entanto, podem exibir certas características comuns independentes da cepa de hospedeiro de levedura empregada. Por exemplo, um nutriente limitante de crescimento, tipicamente carbono, pode ser adicionado ao fermentador durante a fase de amplificação para possibilitar crescimento máximo. Além disso, métodos de fermentação empregam geralmente um meio de fermentação criado para conter quantidades adequadas de carbono, nitrogênio, sais básicos, fósforo e outros nutrientes menos importantes (vitaminas, minerais traço e sais, etc.). Exemplos de meios de fermentação adequados para uso com Pichia estão descritos nas Patentes U.S. N^os 5 324 639 e 5 231 178.

Células de inseto infectadas por baculovírus: O termo “hospedeiro de inseto” ou “célula hospedeira de inseto” refere-se a um inseto que é ou foi usado como receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira original de inseto que foi transfectada. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula precursora pode não ser necessária e completamente idêntica em morfologia ou DNA genômico ou total complementar ao precursor original devido à mutação acidental ou intencional. Progênie da célula precursora que é suficientemente semelhante à precursora para ser caracterizada pela propriedade pertinente, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo de fEPO, está incluída na progênie pretendida por essa definição.

A seleção de células adequadas de inseto para expressão de fEPO é bem conhecida daqueles versados no estado da técnica. Várias espécies de inseto estão bem descritas no estado da técnica e encontram-se comercialmente disponíveis, incluindo Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Na seleção de hospedeiros de inseto para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles que demonstram ter, inter alia, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e robustez no geral. Insetos são disponibilizados geralmente por uma variedade de fontes, incluindo, mas não limitado a, o Insect Genetic Stock Center, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da Califórnia (Berkeley, CA); e a American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA).

Geralmente, os componentes de um sistema de expressão de inseto infectado por

95/238 baculovírus incluem vetor de transferência, habitualmente um plasmídeo bacteriano, que contém um fragmento do genoma do baculovírus e um sítio conveniente de restrição para inserção do gene heterólogo a ser expresso; baculovírus do tipo selvagem com sequências homólogas ao fragmento específico do baculovírus no vetor de transferência (possibilitando a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e células hospedeiras adequadas de inseto e meios de crescimento. Os materiais, métodos e técnicas usados na construção de vetores, transfecção de células, escolha de placas, crescimento de células em cultura e os semelhantes são conhecidos no estado da técnica, havendo manuais disponíveis que descrevem estas técnicas.

Após inserir o gene heterólogo no vetor de transferência, o vetor e o genoma viral do tipo selvagem são transfectados em uma célula hospedeira de inseto, onde o vetor e genoma viral se recombinam. O vírus recombinante empacotado é expresso, e placas recombinantes são identificadas e purificadas. Materiais e métodos para sistemas de expressão em célula de inseto/baculovírus são disponibilizados comercialmente na forma de kit, por exemplo, pela Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas são geralmente conhecidas daqueles versados no estado da técnica, estando integralmente descritas em Summers and Smith, Texas Agricultural Experíment Station Bulletin No. 1555 (1987), aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Consultar também, Richardson, 39 Methods in Molecular Biology: Baculovirus Expression Protocols (1995); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology 16.9-16.11 (1994); King and Posconsultar, The Baculovirus System: A Laboratory Guide (1992); e O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992).

De fato, a produção de várias proteínas heterólogas usando sistemas de expressão baculovírus/célula de inseto é bem conhecida no estado da técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes U.S. N^os 6 368 825; 6 342 216; 6 338 846; 6 261 805; 6 245 528, 6 225 060; 6

183 987; 6 168 932; 6 126 944; 6 096 304; 6 013 433; 5 965 393; 5 939 285; 5 891 676; 5

871 986; 5 861 279; 5 858 368; 5 843 733; 5 762 939; 5 753 220; 5 605 827; 5 583 023; 5

571 709; 5 516 657; 5 290 686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515;

WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672;

WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078;

WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082.

Vetores úteis em sistemas de expressão baculovírus/célula de inseto são conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, vetores de transferência e expressão em insetos derivados do baculovírus vírus da poliedrose nuclear de Autographa Californica (AcNPV), o qual é um vetor de expressão viral independente de ajuda. Vetores de expressão viral derivados deste sistema geralmente usam o forte promotor do gene poliedrina viral para

96/238 direcionar a expressão de genes heterólogos. Consultar, em geral, Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992).

Antes de inserir o gene estranho no genoma do baculovirus, os componentes descritos acima, compreendendo promotor, líder (se desejado), sequência codificadora de interesse e sequência de terminação de transcrição, são tipicamente montados em uma construção de translocalização (transplacement) intermediária (vetor de transferência). Construções de translocalização intermediária são mantidos muitas vezes em um replicon, tal como um elemento extra cromossômico (por exemplo, plasmídeos) capaz de manutenção estável em um hospedeiro, tal como bactérias. O replicon possui um sistema de replicação, possibilitando dessa forma que este seja mantido em um hospedeiro adequado para clonagem e amplificação. Mais especificamente, o plasmídeo pode conter o sinal de poliadenilação de poliedrina (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para seleção e propagação em E. coli.

Um vetor de transferência comumente utilizado para introduzir genes estranhos em AcNPV é pAc373. Muitos outros vetores, conhecidos daqueles versados no estado da técnica, foram também criados, incluindo, por exemplo, pVL985 que altera o códon de partida de poliedrina de ATG para ATT e que introduz um sítio de clonagem BamHI de 32 pares de base em sentido descendente do ATT. Consultar Luckow and Summers, 17 Virology 31 (1989). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, PBIueBac4.5/V5His; pBlueBacHis2; pMeIBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Após inserção do gene heterólogo, o vetor de transferência e o genoma baculoviral do tipo selvagem são co-transfectados em uma célula hospedeira de inseto. Métodos para introduzir DNA heterólogo no sítio desejado o baculovirus são conhecidos no estado da técnica. Consultar Summers and Smith, Texas Agricultural Experíment Station Bulletin No. 1555 (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31. Por exemplo, a inserção pode ser em um gene tal como gene da poliedrina, por recombinação homóloga dupla cruzada; a inserção pode ser também em um sítio de restrição enzimática, construído no gene do baculovirus. Consultar Miller et al., Bioessays (1989) 4:91.

A transfecção pode ser conseguida por eletroporação. Consultar Trotter and Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995); Mann and King, J. Gen. Virol. (1989) 70:3501. Alternativamente, lipossomos podem ser utilizados para transfectar as células de inseto com o vetor de expressão recombinante e o baculovirus. Consultar, por exemplo, Liebman et al., Biotechniques (1999) 26(1 ):36; Graves et al., Biochemistry (1998) 37:6050; Nomura et al., J. Biol. Chem. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., Protein Expression and Purification (1998) 12:323; Siffert et al., Nature Genetics (1998) 18:45; Tilkins et al., Cell Biology: A Laboratory Handbook 145-154 (1998); Cai et al., Protein Expression and Purification (1997) 10:263;

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Dolphin et al., Nature Genetics (1997) 17:491; Kost et al., Gene (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. Biol. Chem. (1996) 271(37):22376; Reversey et a!., J. Biol. Chem. (1996) 271 (39):23607-10; Stanley et al., J. Biol. Chem. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. Virol. (1994) 68(2):766; e Peng et al., BioTechniques (1993) 14.2:274. Lipossomos comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Cellfectin® e Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). Além disso, transfecção com fosfato de cálcio pode ser utilizada. Consultar Trotter and Wood, 39 Methods in Molecular Bioiogy (1995); Kitts, A/AR(1990) 18(19):5667; e Mann and King, J. Gen. Virol. (1989) 70:3501.

Vetores de expressão de baculovírus contêm geralmente um promotor de baculovírus. Promotor de baculovírus é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar a uma RNA polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição em sentido descendente (3’) de uma sequência de codificação (por exemplo, gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição cuja localização é proximal à extremidade 5’ da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição inclui tipicamente um sítio de ligação à RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de baculovírus pode conter também um segundo domínio denominado intensificador, o qual, se presente, está geralmente distai ao gene estrutural. Além disso, a expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Genes estruturais, abundantemente transcritos em tempos tardios no ciclo da infecção, fornecem sequências promotoras especialmente úteis. Exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína viral poliedrina (Friesen et al., The Regulation of Baculovírus Gene Expression in The Molecular Bioiogy of Baculoviruses (1986); EP 0 127 839 e 0 155 476) e o gene que codifica a proteína p10 (Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:765.

O vetor de expressão de baculovírus recentemente formado é empacotado em um baculovírus recombinante infeccioso e, subsequentemente, placas de cultura podem ser purificadas por técnicas conhecidas daqueles versados no estado da técnica. Consultar Miller et al., Bioessays (1989) 4:91; Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987).

Vetores de expressão de baculovírus recombinante foram desenvolvidos para infectar várias células de inseto. Por exemplo, baculovírus recombinantes foram desenvolvidos para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC N° CCL-125), Bombyx mori (ATCC N° CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC N° 1963), Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Consultar W0 89/046,699; Wright, Nature (1986) 321:718; Carbonell et al., J. Virol. (1985) 56:153; Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156. Consultar geralmente, Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. (1989) 25:225. Mais especificamente, as linhagens celulares utilizadas para sistemas de expressão de baculovírus incluem comumente, entre outros, Sf9 (Spodoptera fru98/238 giperda) (ATCC N° CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. N° 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni) e High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).

Células e meios de cultura encontram-se disponíveis comercialmente para expressão direta ou de fusão de polipeptídeos heterólogos em baculovírus/expressão, e a tecnologia de cultura celular é geralmente conhecida daqueles versados no estado da técnica.

E. Coli: Técnicas para expressão bacteriana são bem conhecidas no estado da técnica. Uma ampla variedade de vetores encontra-se disponível para uso em hospedeiros bacterianos. Os vetores podem ser de uma única cópia ou número baixo ou alto de múltiplas cópias. Vetores podem servir para clonagem e/ou expressão. Em vista da ampla literatura referente a vetores, disponibilidade comercial de muitos vetores e mesmo manuais descrevendo vetores e seus mapas de restrição e características, nenhuma discussão extensa é aqui exigida. Como bem conhecido, os vetores envolvem normalmente marcadores que possibilitam a seleção, estes marcadores fornecendo resistência a agente citotóxico, prototrofia ou imunidade. Frequentemente, uma pluralidade de marcadores está presente, proporcionando diferentes características.

Promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de ligar-se à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição em sentido descendente (3) de uma sequência de codificação (por exemplo, gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição cuja localização é proximal à extremidade 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição inclui tipicamente um sítio de ligação à RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor bacteriano pode conter também um seguindo domínio denominado operador, que pode se sobrepor a um sítio de ligação adjacente à RNA polimerase no qual a síntese de RNA se inicia. O operador permite transcrição regulada negativa (induzível), uma vez que uma proteína repressora do gene pode se ligar ao operador e com isso inibir a transcrição de um gene específico. Expressão constitutivo pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Além disso, regulação positiva pode ser conseguida por uma sequência de ligação à proteína ativadora de gene, a qual, se presente, está geralmente em localização proximal (5') à sequência de ligação à RNA polimerase. Um exemplo de proteína ativadora de gene é a proteína ativadora de catabólito (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operon lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. (1984) 18:173]. A expressão regulada pode ser, portanto, positiva ou negativa e, com isso, intensificar ou reduzir a transcrição.

Sequências codificadoras de enzimas de vias metabólicas fornecem sequências promotoras especialmente úteis. Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas que metabolizam açúcar, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al., Nature

99/238 (1977) 198:1056] e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas, tais como triptofano (trp) [Goeddel et al., Nuc. Acids Res. (1980) 8:4057; Yelverton etal., Nucl. Acids Res. (1981) 9:731; Patente U.S. N° 4 738 921; Publicações EPO N^os 036 776 e 121 775], O sistemas promotores de β-galactosidase (bla) [Weissmann (1981) The cloning ofinterferon and other mistakes. In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., Nature (1981) 292:128] e T5 [Patente U.S. N° 4 689 406] também proporcionam sequências promotoras úteis. Métodos preferidos da presente invenção utilizem promotores fortes, tais como o promotor de T7 para induzir fEPO em altos níveis. Exemplos destes vetores são bem conhecidos no estado da técnica e incluem a série pET29 da Novagen, e os vetores pPOP descritos em WO99/05297. Estes sistemas de expressão produzem altos níveis de fEPO no hospedeiro sem comprometer parâmetros de viabilidade ou de crescimento da célula hospedeira.

Adicionalmente, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza podem funcionar também como promotores bacterianos. Por exemplo, sequências de ativação de transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago podem ser unidas com as sequências do operon de outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [Patente U.S. N° 4 551 433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac, compreendido pelas sequências de promotor trp e de operon lac que é regulado pelo repressor lac [Amann etal., Gene (1983) 25:167; de Boer etal., Proc. Natl. Acad. Sei. (1983) 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores naturais cuja origem não é bacteriana e que são capazes de se ligarem à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor natural de origem não bacteriana pode ser acoplado também a uma RNA polimerase compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariotos. O sistema bacteriofase T7 RNA polimerase/promotor é um exemplo de sistema acoplado de promotor [Studier et al., J. Mol. Biol. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sei. (1985) 82:1074]. Adicionalmente, um promotor híbrido pode compreender também um promotor de bacteriófago e uma região de operador de E. coli (Publicação EPO N° 267 851).

Além de uma sequência promotora funcionando, um sítio eficiente de ligação a ribossomo é útil também para a expressão de genes estranhos em procariotos. Em E. coli, o sítio eficiente de ligação a ribossomo é denominado sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleotídeos de extensão situada a 3-11 nucleotídeos em sentido ascendente ao códon de iniciação [Shine et al., Nature (1975) 254:34]. Acredita-se que a sequência SD promova a ligação de mRNA ao ribossomo pelo pareamento de bases entre a sequência SD e 3' e o rRNA 16S de E. coli [Steitz et al. Genetic signals and nucleotides sequences in messenger RNA, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expressar genes

100/238 eucarióticos e genes procarióticos com sítio fraco de ligação a ribossomo [Sambrook et al. Expression of cloned genes in Escheríchia coli, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].

O termo “hospedeiro bacteriano” ou “célula hospedeira bacteriana” refere-se a uma bactéria que pode ser ou que foi usada como receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira bacteriana original que foi transfectada. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula precursora pode não ser necessária e completamente idêntica em morfologia ou DNA genômico ou total complementar à precursora original devido à mutação acidental ou intencional. Progênie da célula precursora que é suficientemente semelhante à precursora para ser caracterizada pela propriedade pertinente, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos codificando uma fEPO, está incluída na progênie pretendida por essa definição.

A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para expressão de fEPO é bem conhecida daqueles versados no estado da técnica. Na seleção de hospedeiros bacterianos para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles que demonstram ter, inter alia, boa capacidade de formação de corpos de inclusão, baixa atividade proteolítica e robustez no geral. Hospedeiros bacterianos são disponibilizados geralmente por uma variedade de fontes, inclusive, entre outros, o Bacterial Genetic Stock Center, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da Califórnia (Berkeley, CA); e a American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA). Fermentação industrial/farmacêutica faz uso geralmente de bactérias derivadas de cepas K (por exemplo, W3110) ou de bactérias derivadas de cepas B (por exemplo, BL21). Estas cepas são especialmente úteis porque seus parâmetros de crescimento são extremamente conhecidos e robustos. Adicionalmente, estas cepas não são patogênicas, o que é comercialmente importante por motivos de segurança e ambientais. Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro E. coli é uma cepa de BL21. Em outra modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro E. coli é uma cepa protease menos, incluindo, mas não limitado a, OMP- e LONUma vez uma cepa de célula hospedeira recombinante tenha sido estabelecida (ou seja, a construção de expressão tenha sido introduzida na célula hospedeira e células hospedeiras com a construção apropriada de expressão são selecionadas), a cepa de célula hospedeira recombinante é cultivada sob condições apropriadas para produção de fEPO. Como será evidente para qualquer um versado no estado da técnica, o método de cultura da cepa de célula hospedeira recombinante depedenderá da natureza da construção de expressão utilizada e da identidade da célula hospedeira. Cepas de hospedeiros recombinantes são normalmente cultivadas usando métodos bem conhecidos no estado da técnica. Células hospedeiras recombinantes são cultivadas tipicamente em meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos e, opcionalmente, contendo

101/238 vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento e outros suplementos proteináceos de cultura bem conhecidos no estado da técnica. Meios líquidos para cultura de células hospedeiras podem conter opcionalmente antibióticos ou antifúngicos para impedir o crescimento de microrganismos e/ou compostos indesejados, inclusive, entre outros, antibióticos para selecionar células hospedeiras contendo o vetor de expressão.

Células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em formatos em batelada ou contínuo, com colheita celular (no caso em que fEPO se acumula no meio intracelular) ou por colheita do sobrenadante da cultura em formatos em batelada ou contínuos. Para produção em células hospedeiras procarióticas, é preferido cultura em batelada e colheita de células.

A fEPO da invenção é purificada normalmente após sua expressão em sistemas recombinantes. fEPO pode ser purificada de células hospedeiras por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Normalmente, fEPO produzida em células hospedeiras bacterianas é pouco solúvel ou insolúvel (na forma de corpos de inclusão). Em uma modalidade da presente invenção, substituições de aminoácidos podem ser imediatamente feitas no polipeptídeo de fEPO que são selecionadas com a finalidade de aumentar a solubilidade da proteína produzida por recombinação, utilizando os métodos aqui descritos, bem como aqueles conhecidos no estado da técnica. No caso de proteína insolúvel, a proteína pode ser coletada de lisados de célula hospedeira por centrifugação e pode ainda ser seguido por homogeneização das células. No caso de proteína pouco solúvel, compostos, incluindo, entre outros, polietilenoimina (PEI), podem ser adicionados para induzir a precipitação de proteína parcialmente solúvel. A proteína precipitada pode então ser convenientemente coletada por centrifugação. Células hospedeiras recombinantes podem ser rompidas ou homogeneizadas para liberar os corpos de inclusão do interior das células, usando uma variedade de métodos bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica. A ruptura ou homogeneização de células hospedeiras pode ser realizada por técnicas bem conhecidas, incluindo, mas não limitado a, ruptura celular enzimática, sonicação, homogeneização em homogeneizados tipo Dounce ou ruptura para liberação sob alta pressão. Em uma modalidade do método da presente invenção, a técnica de liberação sob alta pressão é utilizada para romper as células hospedeiras de E. coli e liberar os corpos de inclusão de fEPO. Foi constatado que o rendimento de fEPO insolúvel na forma de corpos de inclusão pode ser aumentado utilizando uma única passagem das células hospedeiras de E. coli através do homogeneizador. Ao se manipular corpos de inclusão de fEPO, é vantajoso minimizar o tempo de homogeneização em repetições a fim de maximizar o rendimento de corpos de inclusão sem perda decorrente de fatores tais como solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise.

fEPO insolúvel ou precipitada pode então ser solubilizada empregando alguns a102/238 gentes adequados de solubilização conhecidos no estado da técnica. De preferência, fEPO é solubilizada com ureia ou cloridrato de guanidina. O volume da fEPO-BP solubilizado deve ser minimizado de modo que grandes bateladas possam ser produzidas usando tamanhos de batelada que possam ser controlados convenientemente. Esse fator pode ser importante em cenário comercial de grande escala, em que o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em batelada cujo volume é de milhares de litros. Adicionalmente, quando se fabrica fEPO em cenário comercial em grande escala, especialmente para usos farmacêuticos em seres humanos, deve ser evitado usar substâncias químicas pesadas que possam danificar o equipamento e recipiente, ou o próprio produto protéico, se possível. Foi demonstrado no método da presente invenção que o agente desnaturante mais leve ureia pode ser utilizado para solubilizar os corpos de inclusão de fEPO em vez do agente desnaturante mais forte cloridrato de guanidina. O uso de ureia reduz significativamente o risco de dano a equipamento de aço inoxidável utilizado no processo de fabricação e purificação de fEPO, ao mesmo tempo em que solubiliza eficientemente os corpos de inclusão de fEPO.

Quando fEPO é produzida em forma de proteína de fusão, a sequência de fusão é preferivelmente removida. A remoção de uma sequência de fusão pode ser conseguida por divagem enzimática ou química, de preferência, por divagem enzimática. A remoção enzimática de sequências de fusão pode ser conseguida com métodos bem conhecidos no estado da técnica. A escolha de enzima para remoção da sequência de fusão será determinada pela identidade da fusão, e as condições da reação serão especificadas pela escolha da enzima conforme será evidente para aqueles versados no estado da técnica. A fEPO clivada é purificada de preferência da sequência de fusão clivada por métodos bem conhecidos. Estes métodos serão determinados pela identidade e propriedades da sequência de fusão e da fEPO, como será evidente para qualquer um versado no estado da técnica. Métodos para purificação podem incluir, entre outros, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica ou diálise ou qualquer combinação destes.

fEPO é também preferivelmente purificada para remover DNA da solução contendo a proteína. DNA pode ser removido por qualquer método adequado conhecido no estado da técnica, tal como precipitação ou cromatografia de troca iônica, porém é preferível que seja removido por precipitação com agente que promova precipitação de ácido nucléico, tal como, entre outros, sulfato de protamina. fEPO pode ser separado do DNA precipitado usando métodos padrão bem conhecidos, inclusive, entre outros, centrifugação ou filtração. A remoção de moléculas de ácido nucléico do hospedeiro é um fator importante em cenário no qual a fEPO deverá ser usada para tratar seres humanos, e os métodos da presente invenção reduzem DNA de células hospedeiras ara níveis farmaceuticamente aceitáveis.

Métodos para fermentação em pequena ou grande escala podem ser também utili103/238 zados para expressar proteínas, incluindo, entre outros, o uso de fermentadores, frascos agitados, biorreatores de leito fluidizado, biorreatores de fibra oca, sistemas de cultura em frascos rolantes e sistemas de biorreator de tanque agitado. Cada um destes métodos pode ser realizado em processo em batelada, em batelada alimentada ou em modo contínuo.

Polipeptídeos de EPO felina da invenção podem ser em geral recuperados usando métodos padrão no estado da técnica. Por exemplo, meio de cultura ou lisado celular pode ser centrifugado ou filtrado para remover resíduos celulares. O sobrenadante pode ser concentrado ou diluído até um volume desejado, ou diafiltrado em tampão adequado para condicionar o preparado para purificação posterior. A purificação posterior da fEPO da presente invenção inclui separar formas sem amida e cortadas da fEPO variante da forma intacta.

Qualquer um dos procedimentos exemplares seguintes podem ser empregados para purificação de polipeptídeos de fEPO da invenção: cromatografia por afinidade; cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando, entre outros, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC de fase reversa; filtração em gel (usando, entre outros, SEPHADEX G-75); cromatografia por interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia por quelação de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; enfoque cromático; cromatografia por deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, entre outros, enfoque isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial (incluindo, entre outros, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração.

Proteínas da presente invenção, incluindo, mas não limitado a, proteínas compreendendo aminoácidos não-naturais, anticorpos contra proteínas compreendendo aminoácidos não-naturais, parceiros de ligação para proteínas compreendendo aminoácidos nãonaturais, etc., podem ser purificadas, quer parcial ou substancialmente até homogeneidade, de acordo com procedimentos padrão conhecidos e usados por aqueles versados no estado da técnica. Dessa forma, polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados por alguns métodos bem conhecidos no estado da técnica, incluindo, entre outros, precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração ácida ou básica, cromatografia em coluna, cromatografia em coluna por afinidade, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia em hidroxilapatita, cromatografia em lectina, eletroforese em gel e os semelhantes. As técnicas de renovelamento protéico podem ser utilizadas, como desejado, para produzir proteínas maduras corretamente enoveladas. Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia por afinidade ou outros métodos adequados podem ser empregados em etapas finais de purificação, quando alta pureza for desejada. Em uma modalidade, anticorpos produzidos contra aminoácidos não-naturais (ou proteínas compreendendo aminoácidos não-naturais) são utilizados como reagentes de purificação, incluindo, entre outros, para purificação de

104/238 proteínas à base de afinidade de proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos nãonaturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até homogeneidade, como desejado, os polipeptídeos são opcionalmente utilizados para uma ampla variedade de utilidades, incluindo, mas não limitado a, para servirem de componentes de ensaio, agentes terapêuticos, profilaxia, diagnóstico, reagentes de pesquisa e/ou como imunógenos para produção de anticorpos.

Além de outras referências citadas neste relatório descritivo, uma variedade de métodos de purificação/enovalmento protéico é bem conhecida no estado da técnica, inclusive, entre outros, aqueles descritos em R. Scopes, Protein Purífication, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Métodos in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; e Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências citadas nos mesmos.

Uma vantagem de produzir uma proteína ou polipeptídeo de interesse com um aminoácido não natural em célula hospedeira eucariótica ou não eucariótica é a de que as proteínas ou os polipeptídeos se enovelarão tipicamente em suas conformações nativas. No entanto, em certas modalidades da invenção, aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que, após a síntese, expressão e/ou purificação, as proteínas podem possuir conformação diferente daquelas desejadas dos polipeptídeos pertinentes. Em um aspecto da invenção, a proteína expressada é opcionalmente desnaturada e então novamente naturada, por meio de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo, entre outros, por adição de chaperonina à proteína ou ao polipeptídeo de interesse, por solubilização das proteínas em agente caotrópico tal como guanidina HCI, pelo uso de proteína dissulfeto isomerase, etc.

Em geral, é ocasionalmente desejável desnaturar e reduzir polipeptídeos expressados e, então, fazer com que os polipeptídeos voltem a enovelar na conformação preferida. Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE e/ou uma chaperonina pode ser adicionado a um produto traduzido de interesse. Métodos para reduzir, desnaturar e renaturar proteínas são bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica (consultar, as referências acima e Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem.,4: 581-585; e Buchner, et aí, (1992) Ana/. Biochem., 205: 263-270). Debins105/238 ki, et al., por exemplo, descrevem a desnaturação e a redução de proteínas com corpos de inclusão em guanidina-DTE. As proteínas podem ser renoveladas em tampão redox contendo, entre outros componentes, glutationa oxidada e L-arginina. Reagentes de renovelamento podem ser fluídos ou movidos em contato com o único ou mais polipeptídeos ou outro produto expressado, ou vice-versa;

No caso de produção procariótica de fEPO, a fEPO assim produzida pode ser desenovelada e, dessa forma, carecer ou ter reduzida a atividade biológica. A bioatividade da proteína pode ser restaurada por “renovelamento”. Em geral, fEPO incorretamente enovelada é novamente enovelada solubilizando (quando a fEPO for também insolúvel), desenovelando e reduzindo a cadeia polipeptídica usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, ureia e/ou guanidina) e um agente redutor capaz de reduzir pontes dissulfeto (por exemplo, ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). Em concentração moderada de caotrópico, um agente oxidante é então adicionado (por exemplo, oxigênio, cistina ou cistamina), possibilitando a nova formação de pontes dissulfeto. fEPO pode ser renovelada usando métodos padrão conhecidos no estado da técnica, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. N^os 4 511 502, 4 511 503 e 4 512 922. A fEPO pode ser também coenovelada com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros. Após renovelamento ou co-enoveíamento, a fEPO é preferivelmente ainda purificada.

Métodos gerais de purificação: Qualquer uma de uma variedade de etapas de isolamento pode ser realizada sobre o lisado celular compreendendo fEPO ou quaisquer misturas de fEPO resultantes de quaisquer etapas de isolamento, incluindo, mas não limitado a, cromatografia por afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”), HPLC de fase reversa (“RP-HPLC”), adsorção em leito expandido ou qualquer combinação e/ou repetição destes e em qualquer ordem apropriada.

O equipamento e outros materiais necessários usados nas técnicas aqui descritas encontram-se comercialmente disponíveis. Bombas, coletores de fração, monitores, registradoras e sistemas completos são disponibilizados, por exemplo, por Applied Biosystems (Foster City, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) e Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ). Materiais para cromatografia, inclusive, entre outros, materiais de matriz de troca, meios e tampões também são disponibilizados por estas empresas.

Equilibração e outras etapas nos processos de cromatografia em coluna aqui descritos tais como de lavagem e eluição, podem ser rapidamente conseguidas usando equipamento especializado tais como bombas. Bombas comercialmente disponíveis incluem, mas não estão limitadas a, Bomba P-50 HILOAD®, Bomba Peristáltica P-1, Bomba P-901 e Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Exemplos de coletores de fração incluem Coletor de Fração RediFrac, Coletores de

106/238

Fração FRAC-100 e FRAC-200 e Coletor de Fração SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Misturadores estão também disponíveis para formar gradientes de pH e de concentração linear. Misturadores comercialmente disponíveis incluem Misturador de Gradientes GM-1 e Misturadores em Linha (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

O processo cromatográfico pode ser monitorado por qualquer monitor comercialmente disponível. Estes monitores podem ser usados para reunião informação do tipo sobre UV, pH e condutividade. Exemplos de detectores incluem Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 e Monitor de Condutividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). De fato, sistemas completos encontramse comercialmente disponíveis, incluindo os vários sistemas AKTA® da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Em uma modalidade da presente invenção, por exemplo, a fEPO pode ser reduzida e desnaturada, primeiramente, desnaturando a fEPO purificada resultante em ureia, seguido por diluição em tampão TRIS contendo um agente redutor (tal como DTT) em pH adequado. Em outra modalidade, a fEPO é desnaturada em ureia em intervalo de concentração entre aproximadamente 2 M e aproximadamente 9 M, seguido por diluição em tampão TRIS em pH no intervalo entre aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. A mistura de renovelamento desta modalidade pode então ser incubada. Em uma modalidade, a mistura de renovelamento é incubada em temperatura ambiente por quatro a vinte e quatro horas. A mistura de fEPO reduzida e desnaturada pode então ser ainda isolada ou purificada.

Como informado neste relatório descritivo, o pH da primeira mistura de fEPO pode ser ajustado antes que quaisquer etapas subsequentes de isolamento sejam realizadas. Adicionalmente, a primeira mistura de fEPO ou qualquer mistura subsequente desta pode ser concentrada usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Ademais, o tampão de eluição, compreendendo a primeira mistura de fEPO ou qualquer mistura subsequente desta, pode ser trocado por um tampão adequado para a próxima etapa de isolamento, usando técnicas bem conhecidas daqueles versados no estado da técnica.

Cromatografia de troca iônica: Em uma modalidade e, como etapa opcional e adicional, cromatografia de troca iônica pode ser realizada sobre a primeira mistura de fEPO. Consultar em geral, lon Exchange Chromatography: Principies and Methods (Cat. N° 181114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). Colunas comercialmente disponíveis de troca iônica incluem Colunas HITRAP®, HIPREP®, e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Estas colunas utilizam trocadores iônicos fortes tais como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance e Q SEPHAROSE® XL; trocadores catiônicos fortes tais como SP SEPHAROSE® High Performance SP SEPHAROSE® Fast Flow e SP SEPHAROSE® XL; trocadores aniônicos fracos tais como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; e trocadores catiônicos fracos tais como CM

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SEPHAROSE® Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Cromatografia em coluna de troca catiônica pode ser realizada sobre a fEPO, em qualquer estágio do processo de purificação, para isolar fEPO substancialmente purificada. A etapa de cromatografia de troca catiônica pode ser realizada usando qualquer matriz adequada de troca catiônica. Matrizes úteis para troca catiônica incluem, mas não estão limitadas a, materiais de matriz fibrosa, porosa, não porosa, microgranular, com esferas ou reticulada de troca catiônica. Estes materiais de matriz de troca catiônica incluem, entre outros, celulose, agarose, dextrano, poliacrilato, polivinil, poliestireno, sílica, poliéter ou compósitos de qualquer um dos precedentes. Após adsorção da fEPO à matriz de troca catiônica, fEPO substancialmente purificada pode ser eluída pelo contacto com a matriz contendo um tampão com pH ou força iônica suficientemente alta para deslocar a fEPO da matriz. Tampões cujo uso é adequado para eluição em alto pH de fEPO substancialmente purificada incluem, entre outros, tampão citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES e MES com concentração variando de pelo menos aproximadamente 5 mM a pelo menos aproximadamente 100 mM.

Cromatografia de fase reversa: RP-HPLC pode ser realizada para purificar proteínas, seguindo protocolos adequados conhecidos daqueles versados no estado da técnica. Consultar, por exemplo, Pearson et al., Anal Biochem. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. Chrom. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. Chrom. (1986) 359:391-402. RP-HPLC pode ser realizada sobre a fEPO para isolar fEPO substancialmente purificada. A este respeito, resinas derivadas de sílica exibindo funcionalidades alquila com cumprimentos variáveis, inclusive, entre outros, de pelo menos aproximadamente C₃ a pelo menos aproximadamente C₃₀, de pelo menos aproximadamente C₃ a pelo menos aproximadamente C₂o ou de pelo menos aproximadamente C₃ a pelo menos aproximadamente C₁₈, podem ser utilizadas. Alternativamente, uma resina polimérica pode ser usada. Por exemplo, resina TosoHaas Amberchrome CG1000sd pode ser utilizada, sendo esta uma resina de polímero de estireno. Resinas de ciano ou poliméricas com grande variedade de comprimentos de cadeia alquila podem também ser utilizadas. Além disso, a coluna de RP-HPLC pode ser lavada com solvente, tal como etanol. Um tampão adequado de eluição, contendo um agente de pareamento iônico e um modificador orgânico, tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrila ou etanol, pode ser usado para eluir a fEPO da coluna de RP-HPLC. Os agentes de pareamento iônico mais comumente utilizados incluem, entre outros, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoracético, ácido heptafluorbutírico, trietilamina, acetato de tetrametilamônio, tetrabutilamônio e de trietilamônio. A eluição pode ser realizada com um único ou mais gradientes ou condições isocráticas, sendo preferidas condições de gradiente que reduzam o tempo de separação e diminuam a largura de picos. Outro método envolve o uso de dois gradientes com diferentes intervalos de concentração de solvente. Exemplos de tampões adequados de eluição para uso, neste relatório

108/238 descritivo, podem incluir, entre outros, soluções de acetato de amônio e acetonitrila.

Técnicas de purificação por cromatografia de interação hidrofóbica: A cromatografia por interação hidrofóbica (HIC) pode ser realizada sobre a fEPO. Consultar geralmente Hidrophobic Interaction Chromatography Handbook: Principies and Methods (Cat. N° 18-102090, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), o qual é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Matrizes adequadas para HIC podem incluir, mas não é limitado a, matrizes de alquila ou arila substituído, tais como matrizes de butila, hexila, octila ou fenila substituído, incluindo matrizes de agarose, agarose reticulado, sefarose, celulose, sílica, dextrano, poliestireno, poli(metacrilato), e resinas de modo misto, incluindo, mas não limitado a, resina de polietilenoamina ou matriz de poli(metacrilato) butil ou fenil substituído. Fontes comercialmente disponíveis para coluna de cromatografia por interação hidrofóbica incluem, mas não estão limitadas a, colunas HITRAP®, HIPREP® e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Resumidamente, antes de ser carregada, a coluna de HIC pode ser equilibrada usando tampões padrão conhecidos daqueles versados no estado da técnica, tais como solução de ácido acético/cloreto de sódio ou HEPES contendo sulfato de amônio. Depois que a fEPO é carregada, a coluna pode ser então lavada com tampões e sob condições padrão para remover materiais indesejados, porém retendo a fEPO sobre a coluna de HIC. fEPO pode ser eluída com aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volumes de um tampão padrão, tal como tampão HEPES contendo EDTA e concentração mais baixa de sulfato de amônio que a do tampão de equilibração, ou tampão de ácido acético/cloreto de sódio, entre outros. Gradiente linear decrescente de sal, usando, por exemplo, gradiente de fosfato de potássio, pode ser utilizado também para eluir as moléculas de fEPO. O eluído pode então ser concentrado, por exemplo, por filtração, tal como diafiltração ou ultrafiltração. Diafiltração pode ser utilizada para remover o sal utilizado para eluir fEPO.

Outras técnicas de purificação: Ainda outra etapa de isolamento utilizando, por exemplo, filtração em gel (Gel Filtration: Principies and Methods, Cat. N° 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), o qual é aqui incorporado por referência neste pedido de patente, HPLC, adsorção em leito expandido, ultrafiltração, diafiltração, liofilização e os semelhantes, pode ser realizada sobre a primeira mistura de fEPO ou qualquer mistura subsequente desta, para remover excessos de sal e para substituir o tampão por outro adequado para a etapa seguinte de isolamento ou mesmo para formulação do medicamento final. O rendimento de fEPO, inclusive de fEPO substancialmente purificada, pode ser monitorado em cada etapa aqui descrita, usando técnicas conhecidas daqueles versados no estado da técnica. Estas técnicas podem ser utilizadas também para avaliar o rendimento de fEPO substancialmente purificada após a última etapa de purificação. Por exemplo, o rendimento de fEPO pode ser monitorado por qualquer uma das várias colunas de cromatografia líquida de alto desempenho sob alta pressão, com grande variedade de comprimentos de cadeia

109/238 alquila, tais como ciano RP-HPLC, C₁₈ RP-HPLC; bem como HPLC de troca catiônica e HPLC de filtração em gel.

A pureza pode ser determinada por técnicas padrão, tais como SDS-PAGE, ou medindo-se fEPO utilizando ensaios pela técnica de Western Blotting e ELISA. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser gerados contra proteínas provenientes de fermentação de levedura com controle negativo e a recuperação por troca catiônica. Os anticorpos podem ser utilizados também como sondas para detectar a presença de proteínas contaminantes da célula hospedeira.

Procedimentos adicionais de purificação incluem aqueles descritos na Patente U.S. N° 4 612 367 e incluem, entre outros, (1) aplicar uma mistura compreendendo um polipeptídeo de fEPO a um suporte de resina macroporosa de fase reversa formada por copolímero de éster de acrilato em pH em torno de 7 a em torno de 9; e (2) eluir o polipeptídeo de fEPO do referido suporte com eluente aquoso cujo pH varia de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 e contendo de aproximadamente 20% aproximadamente 80% em volume de um diluente orgânico selecionado a partir do grupo constituído ou acetona, acetonitrila e uma combinação de acetona e acetonitrila.

Um processo típico para a purificação de proteína EPO é exposto em WO 96/35718, por Burg, publicado em 14 de novembro de 1996 e é descrito abaixo. A resina Blue Sepharose (Pharmacia) consiste em esferas de sefarose, em cuja superfície o corante azul Cibacron está ligado covalentemente. Dado que EPO se liga mais fortemente ao Blue Sepharose do que a maioria dos contaminantes de origem não protéica, algumas impurezas de origem protéica e PVA, a EPO pode ser enriquecida nesta etapa. A eluição da coluna Blue Sepharose é realizada aumentando-se a concentração de sal, bem como o pH. A coluna é preenchida com 80-100 litros de Blue Sepharose, regenerada com NaOH e equilibrada com tampão de equilibração (cloreto de sódio/cálcio e acetato de sódio). O sobrenadante fermentado acidificado e filtrado é carregado. Depois de concluído o carregamento, a coluna é lavada primeiramente com um tampão semelhante ao de equilibração, contendo concentração mais alta de cloreto de sódio, e consecutivamente com tampão TRIS-base. O produto é eluído com tampão TRIS-base e coletado em uma única fração de acordo com o perfil mestre de eluição.

A resina Butil Toyopearl 650 C (Toso Haas) é uma matriz à base de poliestireno, à qual estão acoplados resíduos de butila alifático. Dado que EPO se liga mais fortemente a esse gel do que a maioria das impurezas e PVA, esta precisa ser eluída com tampão contendo isopropanol. A coluna é preenchida com 30-40 litros de Butil Toyopearl 650 C, regenerada com NaOH, lavada com tampão TRIS-base e equilibrada com tampão TRIS-base contendo isopropanol. O eluído da resina Blue Sepharose é ajustado para a concentração de isopropanol no tampão de equilibração da coluna e carregado na coluna. Em seguida, a co110/238 luna é lavada com tampão de equilibração com concentração aumentada de isopropanol. O produto é eluído com tampão de eluição (tampão TRIS-base com alto teor de isopropanol) e coletado em uma única fração de acordo com o perfil mestre de eluição.

Hidroxiapatita Ultrogel (Biosepra) consiste em hidroxiapatita incorporada em matriz de agarose para melhorar as propriedades mecânicas. EPO exibe baixa afinidade por hidroxiapatita e pode, portanto, ser eluída em concentrações mais baixas de fosfato do que impurezas protéicas. A coluna é preenchida com 30-40 litros de Hidroxiapatita Ultrogel e regenerada com tampão de fosfato de potássio/cloreto de sódio e NaOH, seguido por tampão TRIS-base. Em seguida, é equilibrada com tampão TRIS-base contendo baixa quantidade de isopropanol e cloreto de sódio. O eluído contendo EPO da cromatografia em Butil Toyopearl é carregado na coluna. Subsequentemente, a coluna é lavada com tampão de equilibração e tampão TRIS-base sem isopropanol e cloreto de sódio. O produto é eluído com tampão TRIS-base buffer contendo baixa concentração de fosfato de potássio e coletado em uma única fração de acordo com o perfil mestre de eluição.

O material Vydac C4 (Vydac) de RP-HPLC consiste em partículas de sílica gel, cuja superfície carreia cadeias de C4 alquila. A separação de EPO das impurezas de origem protéica tem como base diferenças na força de interações hidrofóbicas. A eluição é realizada com gradiente de acetonitrila em ácido trifluoracético diluído. HPLC preparativa é realizada com coluna de aço inoxidável (preenchida com 2,8 a 3,2 litros de Vydac C4 sílica gel). O eluído em Hidroxiapatita Ultrogel é acidificado adicionando-se ácido trifluoracético e carregado na coluna Vydac C4. Para lavagem e eluição, usa-se gradiente de acetonitrila em ácido trifluoracético diluído. Frações são coletadas e imediatamente neutralizadas com tampão fosfato. As frações de EPO, incluídas nos limites de IPC, são agrupadas.

O material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste em grupos de dietilaminoetila (DEAE) ligados covalentemente à superfície de esferas de sefarose. A ligação de EPO aos grupos de DEAE é mediada por interações iônicas. Acetonitrila e ácido trifluoracético atravessam a coluna sem ficarem retidos. Depois que estas substâncias são lavadas e retiradas, impurezas traço são removidas por lavagem da coluna com tampão acetato em baixo pH. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de fosfato neutro, e EPO é eluída com tampão de maior força iônica. A coluna é preenchida com DEAE Sepharose de fluxo rápido. O voluma da coluna é ajustado para garantir carga de EPO no intervalo de 3-10 mg de EPO/ml de gel. A coluna é lavada com água e tampão de equilibração (fosfato de sódio/cálcio). As frações agrupadas do eluído de HPLC são carregadas, e a coluna é lavada com tampão de equilibração. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão de acetato de sódio), seguido por lavagem com tampão de equilibração. Subsequentemente, EPO é eluída da coluna com tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/potássio) e coletada em uma única fração com o perfil mestre de eluição. O eluído na coluna de DEAE Sepharose é

111/238 ajustado para a condutividade especificada. O princípio ativo resultante é filtrado estéril para frascos de Teflon e armazenado a -70 °C.

Uma ampla variedade de métodos e procedimentos pode ser utilizada para avaliar o rendimento e a pureza de uma proteína fEPO contendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, incluindo, entre outros, o ensaio de Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE corado com prata, SDS-PAGE corado com coumassie, espectrometria de massa (incluindo, entre outros, MALDI-TOF) e outros métodos para caracterizar proteínas, conhecidos daquele versado no estado da técnica.

IX.Expressão em sistemas alternativos

Várias estratégias foram empregadas para introduzir aminoácidos não-naturais em proteínas em células hospedeiras não recombinantes, células hospedeiras mutagenizadas ou em sistemas sem células. O uso destes sistemas é adequado também para produzir os polipeptídeos de fEPO da presente invenção. A derivatização de aminoácidos com cadeias laterais reativas, como Lys, Cys e Tyr, resultou na conversão de lisina para N2-acetil-lisina. A síntese química também oferece um método direto para incorporar aminoácidos nãonaturais. Com o recente desenvolvimento de ligação enzimática e ligação química nativa de fragmentos peptídicos, é possível produzir proteínas maiores. Consultar, por exemplo, P. E. Dawson and S. Β. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69:923 (2000). Um método biossintético geral in vitro, no qual um tRNA supressor quimicamente acilado com o aminoácido nãonatural desejado é adicionado a um extrato in vitro capaz de sustentar biossíntese protéica, foi utilizado para incorporar sítio-especificamente mais de 100 aminoácidos não-naturais em proteínas variadas de virtualmente qualquer tamanho. Consultar, por exemplo, V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188 (1989); e J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989). Uma ampla gama de grupos funcionais foi introduzida em proteínas para estudos de estabilidade de proteínas, enovelamento de proteínas, mecanismo enzimático e transdução de sinal.

Um método in vivo, denominado incorporação por pressão seletiva, foi desenvolvido para explorar a promiscuidade de sintetases do tipo selvagem. Consultar, por exemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEBJ., 13:41 (1999). Uma cepa auxotrófica, na qual a via metabólica pertinente suprindo a célula com um determinado aminoácido natural está desligada, é cultivada em meios mínimos contendo concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene-alvo é reprimida. No início de uma fase estacionária de crescimento, o aminoácido natural é de112/238 pletado e substituído com o aminoácido não-natural análogo. A indução de expressão da proteína recombinante resulta no acúmulo de uma proteína contendo o análogo não-natural. Por exemplo, usando esta estratégica, o, m e p-fluorfenilalaninas foram incorporadas em proteínas, e exibiram duas alças características no espectro UV que podem ser facilmente identificadas, consultar, por exemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); trifluormetionina foi utilizada para substituir metionina em lisozima T4 de bacteriófagos para estudar sua interação com ligantes quito-oligossacarídicos por ¹⁹F NMR, consultar, por exemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); e trifluorleucina foi incorporada no lugar de leucina, resultando em maior estabilidade térmica e química de uma proteína zíper de leucina. Consultar, por exemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Além disso, selenometionina e telurometionina são incoporadas em várias proteínas recombinantes para facilitar a solução de fases em cristalografia de raios-X. Consultar, por exemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); e N. Budisa, W. Kambrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997). Análogos de metionina com funcionalidades alceno ou alcino foram também incorporados eficientemente, possibilitando modificação adicional de proteínas por meios químicos. Consultar, por exemplo, J. C. M. vanHest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente U.S. N° 6 586 207; Publicação de Patente U.S. 2002/0042097, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

O êxito deste método depende do reconhecimento dos análogos não-naturais de aminoácidos por aminoacil-tRNA sintetases, o que geralmente requer alta seletividade para assegurar a fidelidade da tradução protéica. Uma maneira para ampliar a abrangência deste método é flexibilizar a especificidade do substrato de aminoacil-tRNA sintetases, resultado alcançado em número limitado de casos. Por exemplo, a substituição de Ala²⁹⁴ por Gly em fenilalanil-tRNA sintetase (PheRS) de Escherichia Coli aumenta o tamanho de bolso de ligação do substrato e resulta na acilação de tRNAPhe por p-CI-fenilalanina (p-CI-Phe). Consultar, M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994).Uma cepa de Escherichia coli abrigando esta PheRS mutante possibilita incorporar p-CI-fenilalanina ou p-Brfenilalanina no lugar de fenilalanina. Consultar, por exemplo, M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); e N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Igualmente, uma mutação pontual em Phe130Ser próxima do sítio de ligação

113/238 a aminoácido de tirosil-tRNA sintetase de Escherichia coli demonstrou possibilitar que azatirosina fosse incorporada mais eficientemente do que tirosina. Consultar, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000).

Outra estratégia para incorporar aminoácidos não-naturais em proteínas in vivo é modificar sintetases que possuem mecanismos de revisão de leitura. Estas sintetases não conseguem descriminar e, portanto, ativam aminoácidos que são estruturalmente semelhantes aos aminoácidos naturais cognatos. Esse erro é corrigido em sítio separado, que desacila o aminoácido com carga incorreta tRNA para manter a fidelidade da tradução protéica. Se a atividade de revisão for desabilitada, análogos estruturais ativados incorretamente podem escapar da função de edição e serem incorporados. Essa abordagem foi demonstrada recentemente com a valil-tRNA sintetase (VaIRS). Consultar, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001). VaIRS consegue aminoacilar incorretamente tRNAVai com Cys, Thro ou aminobutirato (Abu); estes aminoácidos não cognatos são subsequentemente hidrolisados pelo domínio editor. Após mutagênese aleatória do cromossomo de Escherichia coli, uma cepa mutante de Escherichia coli foi selecionada que apresentasse mutação no sítio de edição de VaIRS. Esta VaIRS com defeito em edição carrega incorretamente tRNAVal com Cys. Pelo fato de Abu assemelhar-se estericamente com Cys (grupo -SH de Cys está substituído com -CH₃ em Abu), a VaIRS mutante pode incorporar também Abu em proteínas quando esta cepa mutante de Escherichia coli é cultivada na presença de Abu. Análise por espectrometria de massa demonstra que em torno de 24% de valinas estão substituídas por Abu em cada posição de valina na proteína nativa.

Métodos de síntese em fase sólida e semi-sintéticos possibilitaram também a síntese de algumas proteínas contendo novos aminoácidos. Por exemplo, consultar as seguintes publicações e referências nelas citadas, as quais são como segue: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 12271232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazoleimidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem , 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme tiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 151-157 (1987); e Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed

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Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 243 (1994).

Modificação química foi utilizada para introduzir uma variedade de cadeias laterais não-naturais, incluindo co-fatores, marcações spin e oligonucleotídeos em proteínas in vitro. Consultar, por exemplo, Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation ofa hybrid sequence-specific single-stranded deoxiribonuclease, Science, 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Rev Biochem, 565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of tiol-subtilisin, J Biol. Chem, 6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Tiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 3153-3154 (1966); e Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 1038-1040 (1988).

Alternativamente, métodos biossintéticos que empregam aminoacil-tRNAs quimicamente modificados foram utilizados para incorporar várias sondas biofísicas em proteínas sintetizada in vitro. Consultar as seguintes publicações e referências nelas citadas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 483-514 (1993); e Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sei, 8604-8608 (1986).

Foi demonstrado, previamente, que aminoácidos não-naturais podem ser incorporados sítio-especificamente em proteínas in vitro pela adição de tRNAs supressores aminoacilados quimicamente para reações de síntese protéica programadas com um gene contendo uma mutação nonsense âmbar desejada. Usando essas abordagens, é possível substituir alguns dos vinte aminoácidos comuns com homólogos estruturais próximos, por exemplo, fluorfenilalanina para fenilalanina, usando cepas auxotróficas para um determinado aminoácido. Consultar, por exemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation ofa non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); e Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struet. 24, 435-62 (1995).

Por exemplo, um tRNA supressor foi preparado que reconhecia o códon de parada

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UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não-natural. Mutagênese convencional sítio-dirigida foi usada para introduzir o códon de parada TAG, no sítio de interesse no gene da proteína. Consultar, por exemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in phosphorotioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 791-802 (1988). Quando o tRNA supressor acilado e o gene mutante foram combinados em sistema in vitro de transcrição/tradução, o aminoácido não-natural foi incorporado em resposta ao códon UAG o que resultou em uma proteína contendo aquele aminoácido naquela posição especificada. Experimentos usando [^3H]-Phe e experimentos com a-hidróxi ácidos demonstraram que somente o aminoácido desejado está incorporado na posição especificada pelo códon UAG e que este aminoácido não está incorporado em qualquer outro sítio na proteína. Consultar, por exemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; e Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Sitespecific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 197-200 (1992).

Técnicas de microinjeção foram também utilizadas para incorporar aminoácidos não-naturais em proteínas. Consultar, por exemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, Μ. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and Η. A. Lester, Science, 268:439 (1995); e D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Um oócito de Xenopus foi coinjetado com duas espécies de RNA produzidas in vitro: um mRNA codificando a proteínaalvo com códon de parada UAG na posição de aminoácido de interesse e um tRNA supressor âmbar aminoacilado com o aminoácido não-natural desejado. O mecanismo de tradução do oócito insere então o aminoácido não-natural na posição especificada pelo UAG. Este método permitiu estudos in vivo de estrutura-função de proteínas integrantes da membrana, as quais não são geralmente acessíveis a sistemas de expressão in vitro. Exemplos incluem a incorporação de um aminoácido fluorescente em receptor de taquicinina neurocinina-2 para medir distâncias por transferência de energia por ressonância de fluorescência, consultar, por exemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogei and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); a incorporação de aminoácidos biotinilados para identificar resíduos expostos na superfície em canais iônicos, consultar, por exemplo, J. P. Gallivan, Η. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); o uso de análogos enjaulados de tirosina para monitorar alterações em conformação em canal iônico em tempo real, consultar, por exemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and Η. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); e o uso de alfa hidróxi aminoácidos para alterar cadeias principais de canais iônicos para sondar seus mecanismos de ativação (gating). Consultar, por exemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and Η. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); e T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001).

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A capacidade para incorporar aminoácidos não-naturais diretamente em proteínas in vivo oferece as vantagens de altos rendimentos de proteínas mutantes, facilidade técnica, o potencial para estudar as proteínas mutantes em células ou possivelmente em organismos vivos e o uso destas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos. A capacidade para incluir aminoácidos não-naturais com vários tamanhos, níveis de acidez, nucleofilicidades, hidrofobicidades e outras propriedades em proteínas pode ampliar em grande medida nossa capacidade para manipular racional e sistematicamente as estruturas de proteínas, não só para sondar a função protéica, mas também para criar novas proteínas ou organismos com novas propriedades. No entanto, o processo é difícil por causa da natureza completa de interações de tRNA-sintetase, necessárias para alcançar alto grau de fidelidade na tradução de proteínas.

Em uma tentativa para incorporar sítio-especificamente para-F-Phe, um par de tRNAPheCUA supressor âmbar/fenilalanil-tRNA sintetase de levedura foi utilizado em uma cepa Phe auxotrófica, p-F-Phe resistente de Escherichia coli. Consultar, por exemplo, R. Furter, Protein Sei., 7:419 (1998).

É possível também obter expressão de um polinucleotídeo de fEPO da presente invenção usando um sistema de tradução sem células (in vitro). Nestes sistemas, que podem incluir mRNA como modelo (tradução in vitro) ou DNA como modelo (transcrição combinada à tradução in vitro), a síntese in vitro é direcionada pelos ribossomos. Esforço considerável tem sido aplicado para o desenvolvimento de sistemas de expressão protéica sem células. Consultar, por exemplo, Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); e Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente U.S. N° 6 337 191; Publicação de Patente U.S. N° 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Outra abordagem que pode ser aplicada à expressão de polipeptídeos de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente incluem a técnica de fusão de mRNA-peptídeo. Consultar, por exemplo, R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sei. (USA) 94 12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10, 1043-1050 (2003). Nesta abordagem, um modelo de mRNA ligado à puromicina é traduzido em peptídeo no ribossomo. Se uma ou mais moléculas de tRNA forem modificadas, aminoácidos não-naturais podem ser também incorporados no peptídeo. Após que o último códon do mRNA foi lido, puromicina captura o C-terminal do peptídeo. Se o conjugado resultante formado pelo mRNA-peptídeo demonstrar propriedades interessantes em ensaio in vitro, sua identidade pode ser facilmente revelada a partir da sequência de mRNA. Nessa maneira, é possível efetuar varreduras em bibliotecas de polipeptídeos de fEPO,

117/238 compreendendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, para identificar polipeptídeos com as propriedades desejadas. Mais recentemente, foram relatadas traduções in vitro em ribossomos com componentes purificados que permitem a síntese de peptídeos substituídos com aminoácidos não codificados naturalmente. Consultar, por exemplo, A. Forster et al., Proc. NatlAcad. Sei. (USA) 100 6353 (2003).

X.Polímeros macromoleculares acoplados à fEPO

Uma ampla variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas pode ser ligada a polipeptídeos de fEPO da presente invenção para modular propriedades biológicas de fEPO e/ou oferecer novas propriedades biológicas à molécula de fEPO. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados à fEPO por meio de um aminoácido naturalmente codificado, por meio de um aminoácido não codificado naturalmente ou por qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou não-natural, ou por qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não-natural.

A presente invenção provê preparados substancialmente homogêneos de conjugados polímero:proteína. “Substancialmente homogêneo”, neste relatório descritivo, significa que as moléculas de conjugado polímero:proteína são observadas como maiores do que a metade da proteína total. O conjugado polímero-.proteína possui atividade biológica, e os presentes preparados “substancialmente homogêneos” de fEPO PEGuilada, aqui providos, são aqueles que são suficientemente homogêneos para exibir as vantagens de um preparado homogêneo, por exemplo, facilidade em aplicação clínica, em previsibilidade da farmacocinética de cada lote individual.

É possível também escolher preparar uma mistura de moléculas de conjugados de polímero:proteína, e a vantagem, oferecida neste pedido de patente, é a de que é possível selecionar a proporção de conjugado de monopolímero:proteína para incluir na mistura. Por conseguinte, se desejado, é possível preparar uma mistura de várias proteínas com vários números de grupos poliméricos unidos (ou seja, di, tri, tetra, etc.), e combinar os referidos conjugados com o conjugado de monopolímero:proteína, preparado com os métodos da presente invenção, e obter um mistura com um proporção pré-determinada de conjugados de monopolímero:proteína.

O polímero selecionado pode ser solúvel em água de modo que a proteína à qual está unido não se precipite em ambiente aquoso, tal como ambiente fisiológico. O polímero pode ser ramificado ou não. De preferência, para uso terapêutico do preparado final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

A proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína variará, assim como variarão suas concentrações na mistura da reação. Em geral, a razão ótima (em termos de eficiência de reação em que o excedente não reagido de proteína ou polímero é mínimo) pode ser determinada pelo peso molecular do polietilenoglicol selecionado e

118/238 sobre o número disponível de grupos reativos disponíveis. Por estar relacionado a peso molecular, tipicamente, quanto mais alto o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas de polímero que pode ser unido à proteína. Igualmente, a ramificação do polímero deve ser levada em conta quando estes parâmetros são otimizados. Geralmente, quando mais alto o peso molecular (ou mais ramificações), mais alta é a razão do polímero:proteína.

Neste relatório descritivo e quando contemplando conjugados de PEGíEPO, o termo quantidade terapeuticamente eficaz refere-se àquela que resulta em aumento em hematócrito, benéfico para um paciente. A quantidade variará pessoalmente e dependerá de alguns fatores, incluindo a condição física geral do paciente e a causa subjacente de anemia. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de fEPO para um paciente sofrendo de insuficiência renal crônica é de 50 a 150 unidades/kg, três vezes por semana. A quantidade de fEPO usada para terapia fornece uma taxa aceitável de aumento de hematócrito e mantém o hematócrito em nível benéfico (habitualmente de pelo menos aproximadamente 30% e tipicamente em intervalo de 30% a 36%). Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser rapidamente apurada por aquele versado no estado da técnica, usando materiais e procedimentos disponíveis ao público.

O polímero solúvel em água pode estar em qualquer forma estrutural, incluindo, mas não limitado a, linear, bifurcada ou ramificada. Tipicamente, o polímero solúvel em água é de polialquileno glicol), como poli(etilenoglicol) (PEG), porém outros polímeros solúveis em água podem também ser empregados. A título de exemplo, PEG é utilizado para descrever certas modalidades desta invenção.

PEG é um polímero solúvel em água bem conhecido que se encontra comercialmente disponível ou pode ser preparado por polimerização com abertura de anel de etilenoglicol de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). O termo PEG é usado amplamente para abranger qualquer molécula de polietilenoglicol, sem considerar tamanho ou modificação em uma extremidade do PEG, e pode ser representado ligado à fEPO pela fórmula:

Χ0-(0Η₂0Η20)η-0Η₂0Η2-Υ onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo, entre outros, Ci_4 alquila.

Em alguns casos, um PEG utilizado na invenção termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi, ou seja, X é H ou CH₃ (PEG metóxi). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, formando, pelo mesmo, um polímero bifuncional. Grupos reativos típicos podem incluir aqueles grupos reativos que são comumente usados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, entre outros, grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, entre outros, p-nitrofenil éster), ésteres

119/238 ativados (incluindo, entre outros, N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) e aldeídos), bem como grupos funcionais que são inertes frentes aos 20 aminoácidos comuns, porém que reagem especificamente com grupos funcionais complementares, presentes em aminoácidos não codificados naturalmente (incluindo, entre outros, grupos azida, grupos alcino). Cabe notar que, na outra extremidade do PEG, mostra na fórmula Y por Y, se unirá direta ou indiretamente a um polipeptídeo de fEPO por meio de um aminoácido que não ocorre naturalmente ou aminoácido não codificado naturalmente. Por exemplo, Y pode ser uma ligação de amida, carbamato ou ureia a um grupo amina (incluindo, entre outros, a amina epsilon de lisina ou o N-terminal) do polipeptídeo. Alternativamente, Y pode ser ligação de maleimida a um grupo tiol (incluindo, entre outros, o grupo tiol de cisteína). Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comumente acessível por meio dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser reagido com um grupo alcino no polipeptídeo de fEPO para formar um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen. Alternativamente, um grupo alcino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente em um aminoácido não codificado naturalmente para formar um produto semelhante. Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, entre outros, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente em um aminoácido não codificado naturalmente para formar hidrazona, oxima ou semicarbazona, conforme aplicável, a qual, em alguns casos, pode ser adicionalmente reduzida por tratamento com agente redutor apropriado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipeptídeo de fEPO por meio de um aminoácido não codificado naturalmente e usado para reagir preferivelmente com um grupo cetona ou aldeído presente no polímero solúvel em água.

Qualquer massa molecular de um PEG pode ser usada conforme praticamente desejado, incluindo, mas não limitado a, de aproximadamente 1.000 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais, conforme desejado (incluindo, entre outros, às vezes 1-50 kDa ou 10-40 kDa). PEGs de cadeia ramificada, incluindo, entre outros, PEGs com cada cadeia com MW variando de 10-40 kDa (incluindo, entre outros, 5-20 kDa) podem ser também utilizados. Uma ampla variedade de moléculas de PEG está descrita em, incluindo, entre outros, o catálogo Shearwater Polymers, Inc., o catálogo da Nektar Theraoeutics, aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

Em geral, pelo menos uma terminação da molécula de PEG está disponível para reação com o aminoácido não codificado naturalmente. Por exemplo, derivados de PEG carreando grupos alcino e azida para reação com cadeias laterais de aminoácidos podem ser utilizados para unir PEG a aminoácidos não codificados naturalmente como descrito neste pedido de patente. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreender uma azida, então o PEG conterá tipicamente um grupo alcino para que o produto de cicloadição [3+2] seja formado, ou uma espécie ativada de PEG (ou seja, éster, carbonato) contendo um

120/238 grupo fosfino para que a ligação amida seja formada. Alternativamente, se o aminoácido não codificado naturalmente compreender um alcino, então o PEG conterá tipicamente um grupo azida para que o produto de cicloadição [3+2] de Huisgen seja formado. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreender um grupo carbonila, o PEG compreenderá tipicamente um nucleófilo potente (incluindo, entre outros, funcionalidade hidrazida, hidroxilamina ou semicarbazida) a fim de que ligações correspondentes de hidrazona, oxima e semicarbona sejam formadas, respectivamente. Em outras alternativas, os grupos reativos descritos acima em orientação invertida podem ser utilizados, ou seja, um grupo azida no aminoácido não codificado naturalmente pode ser reagido com um derivado de PEG contendo alcino.

Em algumas modalidades, a fEPO variante com um derivado de PEG contém funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente.

A invenção provê, em algumas modalidades, derivados de polímeros contendo azida e acetileno, compreendendo uma cadeia principal (backbone) de polímero solúvel em água com peso molecular variando de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da. A cadeia principal polimérica solúvel em água pode ser poli(etilenoglicol). No entanto, deve ser entendido que uma ampla variedade de polímeros solúveis em água incluindo, entre outros, poli(etileno)glicol e outros polímeros relacionados, incluindo poli(dextrano) e poli(propilenoglicol), são adequadas também para uso na prática desta invenção e que o uso do termo PEG ou poli(etilenoglicol) destina-se a abrange e incluir todas estas moléculas. O termo PEG inclui, entre outros, poli(etilenoglicol) em quaisquer de suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG de múltiplos braços, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (ou seja, PEG ou polímeros relacionados com um ou mais grupos funcionais pendentes na cadeia principal polimérica) ou PEG com ligações degradáveis no mesmo.

PEG é tipicamente claro, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte frente a muitos agentes químicos, não se hidrolisa ou deteriora e, geralmente, não é tóxico. Poli(etilenoglicol) é considerado biocompatível, em outras palavras, significa que PEG é capaz de co-existir com tecidos ou organismos vivos sem causar lesão. Mais especificamente, PEG é substancialmente não imunogênico, em outras palavras, significando que PEG não tende a produzir resposta imune no corpo. Quando unido a uma molécula com alguma função desejável no corpo, tal como agente biologicamente ativo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune de modo que um organismo possa tolerar a presença do agente. Conjugados de PEG tendem a não produzir resposta imune substancial ou causar obstrução ou outros efeitos indesejáveis. PEG com a fórmula -CH2CH₂O--(CH₂CH2O)n -- CH₂CH₂-, onde n é de aproximadamente 3 a aproximadamente

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4000, tipicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, é adequado para uso na presente invenção. PEG com peso molecular de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da são, em algumas modalidades da presente invenção, especialmente úteis como a cadeia principal polimérica.

A cadeia principal polimérica pode ser linear ou ramificada. Cadeias poliméricas ramificadas são geralmente conhecidas no estado da técnica. Tipicamente, um polímero ramificado possui um grupo central de núcleo com ramificações e uma pluralidade de cadeias poliméricas lineares ligadas ao núcleo central com ramificações. PEG é comumente usado em formas ramificadas que podem ser preparadas pela adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligômeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. O grupo central com ramificações pode também ser derivado de vários aminoácidos, tais como lisina. O poli(etilenoglicol) ramificado podes ser representado em forma geral como R(-PEG-OH)_m, em que R é derivado de um grupo de núcleo, tal como glicerol, oligômeros de glicerol ou pentaeritritol, e m representa o número de braços. Moléculas de PEG com múltiplos braços, como aquelas descritas nas Patentes U.S. N^os 5 932 462 5 643 575; 5 229 490; 4 289 872; Pedido de Patente U.S. 2003/0143596; WO 96/21469 e WO 93/21259, cada um dos quais, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente, podem também ser utilizados como a cadeia principal polimérica.

PEG ramificado pode estar também na forma de PEG bifurcado, representado por PEG(-YCHZ₂)_n, onde Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.

Ainda outra forma ramificada, o PEG pendente, possui grupos reativos, tais como carboxila, ao longo da cadeia principal de PEG em vez de na extremidade das cadeias do PEG.

Além de estas formas de PEG, o polímero pode ser preparado também com ligações fracas ou degradáveis na cadeia principal. Por exemplo, PEG pode ser preparado com ligações éster na cadeia principal polimérica que estão sujeitas à hidrólise. Como mostrado abaixo, esta hidrólise resulta em divagem do polímero em fragmento de menor peso molecular:

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O PEG-CO₂H+HO-PEGÉ entendido por aqueles versados no estado da técnica que o termo poli(etilenoglicol) ou PEG representa ou inclui todas as forma conhecidas no estado da técnica, incluindo, mas não limitado a, aquelas expostas neste relatório descritivo.

Muitos outros polímeros são também adequados para uso na presente invenção. Em algumas modalidades, cadeias principais de polímeros que são solúveis em água, com de 2 a aproximadamente 300 terminações, são especialmente úteis na invenção. Exemplos de polímeros adequados incluem, entre outros, outros poli(alquileno glicóis), tais como po122/238 li(propilenoglicol) (“PPG”), copolímeros destes (incluindo, entre outros, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol), terpolímeros destes, misturas destes e os semelhantes. Embora possa variar, o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal polimérica está incluída tipicamente no intervalo de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, frequentemente de aproximadamente 6.000 Da a aproximadamente 80.000 Da.

Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que a lista precedente para cadeias principais substancialmente solúveis em água não é, de forma alguma, completa, sendo meramente ilustrativa, e que os materiais poliméricos com as qualidades descritas acima são cogitados como adequados para uso na presente invenção.

Em algumas modalidades da presente invenção, os derivados de polímeros são “multifuncionais”, significando que a cadeia principal polimérica possui pelo menos duas terminações e, possivelmente, até aproximadamente 300 terminações funcionalizadas ou ativadas com grupo funcional. Derivados multifuncionais de polímeros incluem, entre outros polímeros lineares com duas terminações, cada terminação estando ligada a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.

Em uma modalidade, o derivado de polímeros possui a estrutura abaixo:

X—A—POLI— B—N=N=N

Em que:

N=N=N é um grupo azida;

B é um grupo de ligação, que pode estar presente ou ausente;

POLI é um polímero solúvel em água não antigênico;

A é um grupo de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser o mesmo que B ou diferente; e

X é um segundo grupo funcional.

Exemplos de grupo de ligação para A e B incluem, entre outros, grupo alquila multifuncionalizado, contendo até 18 e, mais preferivelmente, entre 1-10 átomos de carbono. Heteroátomo, como nitrogênio, oxigênio ou enxofre, pode também estar incluído com a cadeia alquila. A cadeia alquila pode estar também ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de grupo de ligação para A e B incluem, entre outros, grupo arila múltiplo funcionalizado, contendo até 10 e, mais preferivelmente, 5-6 átomos de carbono. O grupo arila pode estar substituído com um ou mais átomos de carbono, átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Outros exemplos de grupos adequados de ligação incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. N^os 5 932 462 e 5 643 575; e Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0143596, cada um dos tais, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que a lista precedente para grupos de ligação não é, de forma alguma completa, sendo meramente ilustrativa, e que todos os grupos de ligação com as qualidades descritas acima são cogitados co123/238 mo adequados para uso na presente invenção.

Exemplos de grupos de ligação adequados para uso como X incluem, entre outros, hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster ativo, tal como N-hidroxisuccinimidil ésteres e 1benzotriazolil ésteres, carbonato ativo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos e 1benzotriazolil carbonatos, acetal, aldeído, aldeídos hidratados, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona e azida. Como entendido por aqueles versados no estado da técnica, o grupo X selecionado deve ser compatível com o grupo azida de modo que reação com o grupo azida não ocorra. Os derivados de polímeros contendo azida podem ser homo-bifuncionais, significando que o segundo grupo funcional (ou seja, X) é também um grupo azida, ou hetero-bifuncional, significando que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

O termo “protegido” refere-se à presença de um grupo de proteção que impede a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação. O grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo for amina ou hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado a partir do grupo constituído por tert-butiloxicarbonila (t-Boc) e 9fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo for tiol, o grupo de proteção pode ser dissulfeto de ortopiridila. Se o grupo quimicamente reativo for ácido carboxílico, como ácido butanóico ou ácido propiônico, ou hidroxila, o grupo de proteção pode ser benzila ou um grupo alquila, como metila, etila ou tert-butil. Outros grupos de proteção conhecidos no estado da técnica podem também ser usados na presente invenção.

Exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, entre outros, N-succinimidil carbonato (consultar, por exemplo, as Patentes U.S. N^os 5 281 698; 5 468 478), amina (consultar, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Consultar, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionato e succinimidil butanoato (consultar, por exemplo, Olson et al. em Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; consultar também Patente U.S. N° 5 672 662), succinimidil succinato (Consultar, por exemplo, Abuchowski et al. Câncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Macrolol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (consultar, por exemplo, Patente U.S. N° 4 670 417), benzotriazol carbonato (consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 5 650 234), glicidil éter (consultar, por exemplo, Pitha etal. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling etal., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonil imidazol (consultar, por exemplo, Beauchamp, et al.,

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Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli etal. J. ControlledRelease 1:251 (1985)), p-nitrofenil carbonato (consultar, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (consultar, por exemplo, Harris et al. J. Polym. Sei. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente U.S. N° 5 824 784, Patente U.S. N° 5 252 714), maleimida (consultar, por exemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. em Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)) e Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-dissulfeto (consultar, por exemplo, Woghiren, etal. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (consultar, por exemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (consultar, por exemplo, Patente U.S. N° 5 900 461). Todas as referências acima são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente.

Em certas modalidades da presente invenção, os derivados de polímero da invenção compreendem uma cadeia principal de polímero com a estrutura:

X—CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n -CH₂CH₂ -N=N=N

Em que:

X é um grupo funcional como descrito acima; e n é aproximadamente 20 a aproximadamente 4000.

Em outra modalidade, os derivados de polímero da invenção compreendem uma cadeia principal de polímero com a estrutura:

X—CH₂CH₂O—(CH₂CH₂O)_n -CH₂CH₂ - O-(CH₂)_m-W-N=N=N

Em que:

W é um grupo ligante alifático ou aromático compreendendo entre 1-10 átomos de carbono;

n é aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; e

X é um grupo funcional como descrito acima.

Os derivados de PEG contendo azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica e/ou aqui descritos. Em um método, mostrado abaixo, uma cadeia principal de polímero solúvel em água com peso molecular médio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, a cadeia principal polimérica com uma primeira terminação unida a um primeiro grupo funcional e uma segunda terminação unida a um grupo de saída adequado, é reagida com ânion azida (o qual pode ser pareado com alguns contra-íons adequados, incluindo sódio, potássio, tert-butilamônio e assim por diante). O grupo de saída sofre deslocamento nucleofílico e é substituído pelo grupo azida, fornecendo o polímero PEG desejado contendo azida.

X-PEG-L + N₃- -» X-PEG- N₃

Como mostrado, uma cadeia principal adequada de polímero para uso na presente invenção possui a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo fun125/238 cional que não reage com grupos azida eLéum grupo de saída adequado. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, entre outros, hidroxila, hidroxila protegida, acetal, alquenila, amina, aminóxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina e vinilpiridina e cetona. Exemplos de grupos de saída adequados incluem, entre outros, cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato.

Em outro método para preparar os derivados de polímero contendo azida da presente invenção, um agente de ligação carreando funcionalidade azida é posto em contato com uma cadeia principal de polímero solúvel em água com peso molecular médio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, em que o agente de ligação carreia uma funcionalidade química que reagirá seletivamente com uma funcionalidade química no polímero PEG, para formar um produto derivado de polímero contendo azida, em que a azida está separada da cadeia principal polimérica por um grupo de ligação.

Um esquema exemplar da reação é mostrado abaixo:

X-PEG-M + N-ligante-N=N=N PG-X-PEG-ligante-N=N=N

Em que:

PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de cobertura, como alcóxi, ou um grupo funcional como descrito acima; e

M é um grupo funcional que não é reativo com a funcionalidade azida, porém que reagirá eficiente e seletivamente o grupo N funcional.

Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, entre outros, M sendo ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo, se N for amina; M sendo cetona se N for hidrazida ou grupo; M sendo um grupo de saída se N for nucleófilo.

O produto bruto pode ser purificado por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, por precipitação do produto seguida por cromatografia, se necessário.

Um exemplo mais específico é mostrado abaixo no caso de PEG diamina, no qual uma das aminas está protegida por um grupo de proteção como tert-butil-Boc, e o PEG diamina mono-protegido resultante é reagido com um grupo de ligação que carreia a funcionalidade azida:

BocHN-PEG-NH₂ + HO₂C-(CH₂)₃-N=N=N

Nesta circunstância, o grupo amina pode ser acoplado ao grupo ácido carboxílico, usando uma variedade de agentes de ativação, como cloreto de tionila ou reagentes carbodiimida e N-hidróxi-succinimida ou N-hidróxi-benzotriazol para criar uma ligação amida entre o derivado PEG monoamina e o grupo ligante carreando azida. Depois de formação bem sucedida de ligação amida, o derivado resultante N-tert-butil-Boc-protegido contendo azida pode ser utilizado diretamente para modificar moléculas bioativas, ou pode ser ainda elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser

126/238 hidrolisado por tratamento com ácido forte para gerar um ômega-amino-PEG-azida. A amina resultante pode Sr utilizada como alça sintética para instalar outra funcionalidade útil como grupos maleimida, dissulfetos ativados, ésteres ativados e assim por diante, para criar reagentes hetero-bifuncionais de valor.

Derivados hetero-bifuncionais são especialmente úteis quando se deseja unir diferentes moléculas a cada terminação do polímero. Por exemplo, o PEG ômega-N-amino-Nazido permitiría unir uma molécula com grupo eletrofílico ativado, como aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e assim por diante, a uma terminação do PEG, e uma molécula com grupo acetileno na outra terminação do PEG.

Em outra modalidade da invenção, o derivado de polímero possui a estrutura:

X—A—POLI— B—C^C-R

Em que:

R pode ser H ou grupo alquila, alceno, aril ou arila substituído;

B é um grupo de ligação, que pode estar presente ou ausente;

POLI é um polímero solúvel em água não antigênico;

A é um grupo de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser o mesmo que B ou diferente; e

X é um segundo grupo funcional.

Exemplos de grupos de ligação para A e B incluem, entre outros, grupo alquila multifuncionalizado contendo até 18 e, mais preferivelmente, entre 1-10 átomos de carbono. Heteroátomo, como nitrogênio, oxigênio ou enxofre, pode também estar incluído com a cadeia alquila. A cadeia alquila pode estar também ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de grupo de ligação para A e B incluem, entre outros, grupo arila múltiplo funcionalizado, contendo até 10 e, mais preferivelmente, 5-6 átomos de carbono. O grupo arila pode estar substituído com um ou mais átomos de carbono, átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Outros exemplos de grupos adequados de ligação incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. N^os 5 932 462 e 5 643 575; e Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0143596, cada um dos tais, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que a lista precedente para grupos de ligação não é, de forma alguma completa e que se destina a ser meramente ilustrativa, e que todos os grupos de ligação com as qualidades descritas acima são cogitados como úteis na presente invenção.

Exemplos de grupos de ligação adequados para uso como X incluem, entre outros, hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster ativo, tal como N-hidroxisuccinimidil ésteres e 1benzotriazolil ésteres, carbonato ativo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatas e 1benzotriazolil carbonatas, acetal, aldeído, aldeídos hidratados, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sultana ativa, amina, aminóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida,

127/238 tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona e azida. Como seria entendido, o grupo X selecionado deve ser compatível com o grupo acetileno de modo que reação com o grupo acetileno não ocorra. Os derivados de polímeros contendo acetileno podem ser homo-bifuncionais, significando que o segundo grupo funcional (ou seja, X) é também um grupo acetileno, ou heterobifuncional, significando que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente..

Em outra modalidade da presente invenção, os derivados de polímero compreendem uma cadeia principal de polímero com a estrutura:

X—CH₂CH₂O—(CH₂CH₂O)_n -CH₂CH₂ - O-(CH₂)_m-C=CH

Em que:

X é um grupo funcional como descrito acima;

n é aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; e m é entre 1 e 10.

Exemplos específicos de cada um dos polímeros PEG hetero-bifuncionais são mostrados abaixo.

Os derivados de PEG contendo acetileno da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica e/ou aqui descritos. Em um método, uma cadeia principal de polímero solúvel em água com peso molecular médio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, a cadeia principal polimérica com uma primeira terminação unida a um primeiro grupo funcional e uma segunda terminação unida a um grupo nucleofílico adequado, é reagida com um composto que carreia uma funcionalidade acetileno e um grupo de saída que é adequado para reação com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG carreando o grupo nucleofílico e a molécula carreando o grupo de saída são combinados, o grupo de saída sofre deslocamento nucleofílico e é substituído pelo grupo nucleofílico, fornecendo o polímero PEG desejado contendo acetileno.

X-PEG-Nu + L-A-C X-PEG-Nu-A-OCR’

Como mostrado, uma cadeia principal polimérica preferida para uso na reação possui a fórmula X-PEG-Nu, em que PEG é poli(etilenoglicol), Nu é um grupo nucleofílico e X é um grupo funcional que não reage com Nu, L ou a funcionalidade acetileno.

Exemplos de Nu incluem, entre outros, amina, alcóxi, arilóxi, sulfidrila, imino, carboxilato, hidrazida, grupos aminóxi que reagiríam primariamente via um mecanismo tipo SN2. Exemplos adicionais de grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que reagiríam primariamente via uma reação de adição nucleofílica. Exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato e outros grupos previstos para sofrerem deslocamento nucleofílico, bem como cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos alfa-beta

128/238 carbonila insaturados, carbonatos e outros grupos eletrofílicos previstos para sofrerem adição por nucleófilos.

Em outra modalidade da presente invenção, A é um ligante alifático com entre 1-10 átomos de carbono ou anel arila substituído com entre 6-14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado

Em outro método para preparar os derivados de polímero contendo acetileno da invenção, um polímero de PEG com peso molecular médio entre aproximadamente 800 Da e aproximadamente 100.000 Da, carreando um grupo funcional protegido ou um agente de cobertura em uma terminação e um grupo de saída na outra, entra em contato com ânion acetileno.

Um esquema exemplar de reação é mostrado abaixo:

X-PEG-L + -C=CR’ X-PEG-C=CR’

Em que:

PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de cobertura, como alcóxi, ou um grupo funcional como descrito acima; e

R’ é H, grupo alquila, alcóxi, arila ou arilóxi ou grupo alquila substituído, alcóxil, aril ou arilóxi.

No exemplo acima, o grupo de saída L deve ser suficientemente reativo para sofrer deslocamento tipo SN2 quando em contato com concentração suficiente do ânion acetileno. As condições de reação exigidas para que ocorra deslocamento de SN2 de grupos de saída por ânions acetileno são bem conhecidas no estado da técnica.

O produto bruto pode ser purificado por métodos conhecidos no estado da técnica incluindo, entre outros, por precipitação do produto seguido por cromatografia, se necessário.

Polímeros solúveis em água podem ser ligados aos polipeptídeos de fEPO da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados por intermédio de um aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipeptídeo de fEPO, ou por qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido codificado naturalmente ou não, ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido codificado naturalmente ou não. Alternativamente, os polímeros solúveis em água são ligados a um polipeptídeo de fEPO, incorporando um aminoácido não codificado naturalmente, por intermédio de um aminoácido que ocorre naturalmente (incluindo, entre outros, cisteína, lisina ou outro grupo amina no resíduo N-terminal). Em alguns casos, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, em que um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente estão ligados a polímeros solúveis em água (incluindo, entre outros, PEG e/ou oligossacarídeos). Em alguns casos, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos codificados naturalmente ligados a polímeros solú129/238 veis em água. Em alguns casos, os polipeptídeos de fEPO da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente ligados a polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos naturais ligados a polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água, utilizados na presente invenção, melhoram a meiavida sérica do polipeptídeo de fEPO em relação à forma não conjugada.

O número de polímeros solúveis em água ligados a um polipeptídeo de fEPO (ou seja, a extensão de PEGuilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para alterar (incluindo, entre outros, aumentar ou diminuir) características farmacológicas, farmacocinéticas ou farmacodinâmicas, tais como meia-vida in vivo. Em algumas modalidades, a meia-vida de fEPO é aumentada em pelo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, duas vezes, cinco vezes, 10 vezes, 50 vezes ou pelo menos aproximadamente 100 vezes mais a de um polipeptídeo não modificado.

Derivados de PEG contendo um grupo nucleofílico forte (ou seja, hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida)

Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo carbonila, é modificado com um derivado de PEG que contenha grupo terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida ligado diretamente à cadeia principal de PEG.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com hidroxilamina terminal terá a estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, com peso molecular médio entre 5-40 kDa).

Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo hidrazina ou hidrazida terá a estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo semicarbazida terá a estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n -O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000.

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo aminoácido contendo carbonila, é modificado com um derivado de PEG que contenha grupo terminal hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida, ligado à cadeia principal de PEG por meio de uma ligação amida.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG com hidroxilamina terminal têm a

130/238 estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, com peso molecular médio entre 5-40 kDa).

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo hidrazina ou hidrazida têm a estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo semicarbazida têm a estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000.

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo carbonila, é modificado com um derivado de PEG ramificado que contenha grupo terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida, com cada cadeia do PEG ramificado apresentando MW variando de 10-40 kDa e, mais preferivelmente, de 520 kDa.

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo aminoácido não codificado naturalmente, é modificado com derivados de PEG com estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG com hidrazina ou hidrazida terminal terão a seguinte estrutura:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo grupo semicarbazida terão a estrutura:

[RO-(CH₂CH₂O)n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1.000.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo grupo hidroxilamina terão a estrutura:

[RO-(CH₂CH₂O)n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1.000.

O grau e sítios nos quais os polímeros solúveis em água estão ligados à fEPO podem modular a ligação de fEPO ao receptor de fEPO no Sítio 1. Em algumas modalidades,

131/238 as ligações estão de tal modo dispostas que o polipeptídeo de fEPO se liga ao receptor de fEPO no Sítio 1 com Kd de aproximadamente 400 nM ou mais baixa, com Kd de 150 nM ou mais baixa e, em alguns casos, com Kd de 100 nM ou mais baixa, medidas por ensaio de ligação em equilíbrio, como aquele descrito em Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:78627867(1988).

Métodos e química para ativação de polímeros, bem como para conjugação de peptídeos estão descritos na literatura e são conhecidos no estado da técnica. Métodos comumente utilizados para ativação de polímeros incluem, entre outros, ativação de grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloridrina, divinilsulfona, carbodiimida, sulfonil haletos, triclorotriazina, etc. (consultar, R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilisation. Fundamental and Applications, Marcei Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

Existem disponíveis várias revisões e monografias sobre funcionalização e conjugação de PEG. Consultar, por exemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems9: 249-304(1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995).

Métodos para ativação de polímeros podem ser encontrados também em WO 94/17039, Patente U.S. N° 5 324 844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente U.S. N° 5 219 564, Patente U.S. N° 5 122 614, WO 90/13540, Patente U.S. N° 5 281 698, além de em WO 93/15189, e para conjugação entre polímeros ativados e enzimas, incluindo entre outros, Fator de Coagulação VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula transportadora de oxigênio (Patente U.S. N° 4 412 989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).

A PEGuilação (ou seja, adição de qualquer polímero solúvel em água) de polipeptídeos de fEPO contendo um aminoácido não codificado naturalmente, como p-azido-Lfenilalanina, é realizada por qualquer método conveniente. Por exemplo, polipeptídeo de fEPO é PEGuilado com derivado mPEG terminado com alcino. Resumidamente, mPEG(5000)-0-CH₂-C=CH sólido em excesso é adicionado, sob agitação, a uma solução aquosa de fEPO contendo p-azido-L-Phe em temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com tampão com pK_a próximo do pH na qual a reação deverá ser conduzida (geralmente pH em torno de 4-10). Exemplos de tampões adequados para PEGuilação em pH 7,5 incluem, por exemplo, entre outros, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCI, EPPS e TES. O pH é continuamente monitorado e ajustado, se necessário. A reação é tipicamente

132/238 permitida prosseguir por entre aproximadamente 1-48 horas.

Os produtos da reação são subsequentemente submetidos à cromatografia por interação hidrofóbica para separar variantes PEGuilados de fEPO do mPEG(5000)-0-CH₂CsCH livre de quaisquer complexos de alto peso molecular do polipeptídeo peguilado de fEPO que possam se formar quando PEG não bloqueado é ativado em ambas as extremidades, reticulando, pelo mesmo, moléculas variantes de fEPO. As condições durante a cromatografia por interação hidrofóbica são tais que mPEG(5000)-0-CH₂-C=CH livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos de variantes de fEPO PEGuilada reticulada eluem após as formas desejadas, os quais contêm uma molécula variante de fEPO conjugada a um ou mais grupos PEG. Condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados em comparação aos conjugados desejados, e são rapidamente determinadas por aqueles versados no estado da técnica. O eluente contendo os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalgado por diafiltração.

Se necessário, a fEPO PEGuilada obtida da cromatografia hidrofóbica pode ser ainda purificada por um ou mais procedimentos conhecidos daqueles versados no estado da técnica, incluindo, entre outros, cromatografia por afinidade, cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando, entre outros, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC de fase reversa; filtração em gel (usando, entre outros, SEPHADEX G-75); cromatografia por interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia por quelação de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; enfoque cromático; cromatografia por deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, entre outros, enfoque isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial (incluindo, entre outros, precipitação com sulfato de amônio) ou extração. O peso molecular aparente pode ser estimado por GPC por comparação a padrões de proteínas globulares (Protein purification methods, a practical approach (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). A pureza do conjugado fEPO-PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo, entre outros, divagem com tripsina), seguido por análise de espectrometria de massa. Pepinsky B., et.al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001).

Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipeptídeo de fEPO da invenção pode ser ainda derivatizado ou substituído sem limitação.

Derivados de PEG contendo azida

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO é modificado com um derivado de PEG que contenha um grupo azida que reagirá com um grupo alcino presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados de PEG terão peso molecular médio variando de 1-100 kDa e, em algumas modalidades, de 10-40 kDa.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com azida terminal terá a estrutura:

133/238

RO-(CH₂CH₂O)n-O-(CH₂)m-N₃ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, com peso molecular médio entre 5-40 kDa).

Em outra modalidade, o derivado de PEG com azida terminal terá a estrutura: RO-(CH₂CH₂O)_n -O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 , p é 2-10 e n é 1001.000 (ou seja, com peso molecular médio entre 5-40 kDa).

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo alcino, é modificado com um derivado de PEG ramificado que contenha um grupo azida terminal, com cada cadeia do PEG ramificado com MW variando de 1040 kDa e, mais preferivelmente, de 5-20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG com azida terminal terá a seguinte estrutura:

[RO-(CH₂CH₂O)n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃ onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 , p é 2-10 e n é 1001.000 e X é opcionalmente O, N, S ou grupo carbonila (C=O), em cada caso, que pode estar presente ou ausente.

Derivados de PEG contendo alcino

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO é modificado com um derivado de PEG que contenha um grupo alcino que reagirá com grupo azida presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com alcino terminal terá a seguinte estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C=CH onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, com peso molecular médio entre 5-40 kDa).

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo alcino, é modificado com um derivado de PEG que contenha grupo azida terminal ou grupo alcino terminal, ligado à cadeia principal de PEG por meio de ligação amida.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com alcino terminal terá a seguinte estrutura:

RO-(CH₂CH₂O)_n -O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-CsCH onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000.

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido contendo azida, é modificado com um derivado de PEG ramificado que contenha um grupo alcino terminal, com cada cadeia do PEG ramificado com MW variando de 1040 kDa e, mais preferivelmente, de 5-20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o

134/238 derivado de PEG com alcino terminal terá a seguinte estrutura:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)p OCH onde R é alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2-10 e n é 100-1.000 e X é opcionalmente O, N, S ou grupo carbonila (C=O), ou não está presente.

Derivados de PEG contendo fosfino

Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de fEPO é modificado com um derivado de PEG que contenha um grupo funcional ativado (incluindo, entre outros, éster, carbonato), compreendendo ainda um grupo aril fosfino que reagirá com um grupo azida presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados de PEG terão peso molecular médio variando de 1-100 kDa e, em algumas modalidades, de 10-40 kDa.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura:

,X.

Ph₂P(H₂C)_n^ γ W

O

Em que n é 1-10; X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila e W é um polímero solúvel em água.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura:

Em que X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, grupos alquila, arila, alquila substituído e arila substituído. Grupos R exemplares incluem, entre outros, -CH₂, -Ο(ΟΗ₃)₃, -OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -C(O)R’, -CONR’R”, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -CN e -NO₂. R’, R”, R”’ e R””, cada um independentemente, referem-se a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo, entre outros, arila substituído com 1-3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção incluir mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente, como o é cada um dos grupos R’, R”, R”’ e R”” quando mais de um destes grupos estiverem presentes. Quando unidos ao mesmo átomo de nitrogênio, R’ e R” podem se combinar com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 6, 6 ou Ί membros. Por exemplo, -NR’R” pretende incluir, entre outros, 1-pirrolidinila e 4morfolinila. A partir da discussão sobre substituintes, aquele versado no estado da técnica entenderá que o termo “alquila” significa incluir grupos contendo átomos de carbono ligados a outros grupos diferentes de hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, entre outros, -CF₃ e -CH₂CF₃) e acila (incluindo, entre outros, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ e os semelhantes.

Outros derivados de PEG e técnicas gerais de PEGuilação

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Outras moléculas exemplares de PEG que podem ser ligadas a polipeptídeos de fEPO, bem métodos de PEGuilação incluem aqueles descritos em, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N° 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647;

2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133;

2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076;

2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0027217;

2001/0021763; Patente U.S. N° 6 646 110; 5 824 778; 5 476 653; 5 219 564; 5 629 384; 5 736 625; 4 902 502; 5 281 698; 5 122 614; 5 473 034; 5 516 673; 5 382 657; 6 552 167; 6

610 281; 6 515 100; 6 461 603; 6 436 386; 6 214 966; 5 990 237; 5 900 461; 5 739 208; 5

672 662; 5 446 090; 5 808 096; 5 612 460; 5 324 844; 5 252 714; 6 420 339; 6 201 072; 6

451 346; 6 306 821; 5 559 213; 5 612 460; 5 747 646; 5 834 594; 5 849 860; 5 980 948; 6

004 573; 6 129 912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, , WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Qualquer uma das moléculas de PEG descritas neste pedido de patente pode ser utilizada em qualquer forma, incluindo, mas não limitado a, cadeia única, cadeia ramificada, cadeia com múltiplos braços, bifuncional único, bi-funcional, multifuncional ou qualquer combinação destas.

Aperfeiçoando a afinidade poralbumina sérica

Várias moléculas podem ser também fundidas aos polipeptídeos de fEPO da invenção para modular a meia-vida de fEPO no soro. Em algumas modalidades, moléculas são ligadas ou fundidas a polipeptídeos de fEPO da invenção para aperfeiçoar a afinidade por albumina sérica endógena em um animal.

Por exemplo, em alguns casos, é feita fusão recombinante de um polipeptídeo de fEPO e uma sequência de ligação à albumina. Sequências exemplares de ligação à albumina incluem, mas não estão limitadas a, o domínio de ligação à albumina de proteína G de estreptococos (consultar, por exemplo, Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534542 (1996) e Sjolander et al., J. Immunol. Methods 201:115-123 (1997)), ou de peptídeos de ligação à albumina, tais como aquelas descritas em, por exemplo, Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

Em outras modalidades, os polipeptídeos de fEPO da presente invenção são acilados com ácidos graxos. Em alguns casos, os ácidos graxos promovem ligação à albumina

136/238 sérica. Consultar, por exemplo, Kurtzhals, etal., Biochem. J. 312:725-731 (1995).

Em outras modalidades, os polipeptídeos de fEPO da invenção são fundidos diretamente com albumina sérica (incluindo, mas não limitado a, albumina sérica humana). Consultar, por exemplo, Patente U.S. N° 6 548 653, a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente.

Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão que uma ampla variedade de outras moléculas podem ser ligadas também à fEPO na presente invenção para modular a ligação à albumina sérica ou a outros componentes do soro.

XI. Glicosilação de fEPO

A invenção inclui polipeptídeos de fEPO incorporando um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente carreando resíduos de sacarídeo. Os resíduos de sacarídeo podem ser naturais (incluindo, entre outros, N-acetilglicosamina) ou não-naturais (incluindo, entre outros, 3-fluorgalactose). Os sacarídeos podem estar ligados aos aminoácidos não codificados naturalmente por ligação glicosídica N ou O-ligada (incluindo, entre outros, Nacetilgalactosa-L-serina) ou ligação não-natural (incluindo, entre outros, uma oxima ou o glicosídeo correspondente C ou S-ligado).

Os grupos sacarídicos (incluindo, entre outros, glicosila) podem ser adicionados a polipeptídeos de fEPO in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo carbonila, é modificado com sacarídeo derivatizado com grupo aminóxi para gerar o polipeptídeo glicosilado correspondente ligado por intermédio de ligação oxima. Uma vez unido ao aminoácido não codificado naturalmente, o sacarídeo pode ser ainda elaborado por tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gerar um oligossacarídeo ligado ao polipeptídeo de fEPO. Consultar, por exemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 17021703 (2003).

Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo carbonila, é modificado diretamente com glicano com estrutura definida preparada como derivado aminóxi. Aquele versado no estado da técnica reconhecerá que outras funcionalidades, incluindo azida, alcino, hidrazida, hidrazina e semicarbazida, podem ser utilizadas para ligar o sacarídeo ao aminoácido não codificado naturalmente.

Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de fEPO, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo azida ou alquinila, pode então ser modificado por, incluindo, entre outros, reação de cicloadição [3+2] de Huisgen [3+2] com, entre outros, derivados alquinila ou azida, respectivamente. Este método permite que proteínas sejam modificadas com seletividade extremamente alta.

XII. Dímeros e multímeros de membros da família supergene GH

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A presente invenção provê também combinações de homodímeros, heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros (ou seja, trímeros, tetrâmeros, etc.) de membros da família supergene GH (incluindo, entre outros, fEPO), em que um polipeptídeo membro da superfamília supergene GH, tal como fEPO contendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, é ligado a outro membro da família supergene GH, ou seu variante ou qualquer outro polipeptídeo que não seja membro, ou variante deste, da família supergene GH, quer diretamente à cadeia principal polipeptídica ou por meio de um ligante. Graças a seu maior peso molecular comparado a monômeros, o membro da família supergene GH, tal como fEPO, conjugados diméricos ou multímeros podem exibir novas ou desejáveis propriedades, incluindo, mas não limitado a, diferentes propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, meia-vida terapêutica modulada ou meia-vida plasmática modulada, em relação ao membro monomérico da família supergene GH. Em algumas modalidades, o membro da família supergene GH, tal como fEPO, dímeros da invenção modularão a dimerização do receptor do membro da família supergene GH. Em outras modalidades, os dímeros ou multímeros da invenção do membro da família supergene GH atuarão como antagonista, agonista ou moduladores do receptor do membro da família supergene GH.

Em algumas modalidades, uma ou mais das moléculas de fEPO, presentes em um dímero ou multímero contendo fEPO, compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente dentro da região de ligação do Sítio II. Dessa forma, cada uma das moléculas de fEPO do dímero ou multímero é acessível para ligação ao receptor de fEPO via a interface do Sítio I, porém não está disponível para ligação a um segundo receptor de fEPO via a interface do Sítio II. Por conseguinte, o dímero ou multímero pode envolver os sítios de ligação do Sítio I de cada dois diferentes receptores de fEPO, porém, como as moléculas de fEPO possuem um polímero solúvel em água unido a um aminoácido não codificado geneticamente, presente na região do Sitio II, os receptores de fEPO não conseguem envolver a região do Sítio II do ligante de fEPO e o dímero ou multímero atua como antagonista de fEPO. Em algumas modalidades, uma ou mais das moléculas de fEPO presentes em um dímero ou multímero contendo fEPO compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente dentro da região de ligação do Sítio I, possibilitando ligação à região do Sítio II. Alternativamente, em algumas modalidades, uma ou mais das moléculas de fEPO, presentes em um dímero ou multímero contendo fEPO, compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente em um sítio que não está situado dentro da região de ligação do Sítio I ou Sítio II, de modo que ambos estão disponíveis para ligação. Em algumas modalidades uma combinação de moléculas de fEPO é utilizada com Sítio I, Sítio II, ou ambos disponíveis para ligação. Uma combinação de moléculas de fEPO, em que pelo menos uma possui o Sítio I disponível para liga138/238 ção e pelo menos uma possui o Sítio II disponível para ligação, pode fornecer moléculas com uma atividade ou propriedade desejada. Adicionalmente, uma combinação de moléculas de fEPO com ambos os Sítios I e II disponíveis para ligação pode produzir uma molécula super-agonista de fEPO.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos membros da família supergene GH são ligados diretamente, incluindo, entre outros, por meio de ligação amida Asn-Lys ou ligação dissulfeto Cys-Cys. Em algumas modalidades, os polipeptídeos membros da família supergene GH ligados, e/ou o não-membro da família supergene GH ligado, compreenderão diferentes aminoácidos não codificados naturalmente para facilitar a dimerização, incluindo, entre outros, um alcino em um aminoácido não codificado naturalmente de um primeiro polipeptídeo de fEPO e um azida em um segundo aminoácido não codificado naturalmente de um segundo polipeptídeo membro da família supergene GH serão conjugados por meio de cicloadição [3+2] de Huisgen. Alternativamente, um primeiro membro da família supergene GH, e/ou o polipeptídeo não-membro da família supergene GH ligado compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo cetona, pode ser conjugado a um segundo polipeptídeo membro da família supergene GH, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente contendo hidroxilamina, e os polipeptídeos são reagidos através de formação da oxima correspondente.

Alternativamente, os dois polipeptídeos membros da família supergene GH, e/ou o não-membro da família supergene GH ligado, são ligados por meio de um ligante. Qualquer ligante hetero ou homo-bifuncional pode ser utilizado para ligar os dois polipeptídeos membros da família supergene GH, e/ou o não-membro da família supergene GH ligado, os quais podem exibir a mesma ou diferente sequência primária. Em alguns casos, o ligante utilizado para prender os polipeptídeos membros da família supergene GH supergene, e/ou o não-membro da família supergene GH ligado, pode ser um reagente PEG bifuncional.

Em algumas modalidades, a invenção provê ligantes bifuncionais solúveis em água com estrutura em forma de halteres que inclui: a) um grupo azida, alcino, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina ou grupo contendo carbonila em pelo menos uma primeira extremidade de uma cadeia principal polimérica; e b) pelo menos um segundo grupo funcional em uma segunda extremidade da cadeia principal polimérica. O segundo grupo funcional pode ser igual ou diferente do primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. A invenção provê, em algumas modalidades, compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica.

Em algumas modalidades, a invenção provê multímeros compreendendo um ou mais membros da família supergene GH, tal como fEPO, formados por reações com polímeros ativados solúveis em água que possuem a estrutura:

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R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

Em que n é de aproximadamente 5 a 3.000, m é 2-10, X pode ser azida, alcino, hidrazina, hidrazida, grupo aminóxi, hidroxilamina, grupo contendo acetila ou carbonila e R é um grupo de cobertura, grupo funcional ou grupo de saída que pode ser igual ou diferente de X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado a partir do grupo constituído por hidroxila, hidroxila protegida, alcóxil, N-hidroxisuccinimidil éster, 1-benzotriazolil éster, Nhidroxisuccinimidil carbonato, 1-benzotriazolil carbonato, acetal, aldeído, aldeídos hidratados, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno e cetona.

XIII. Mensuração de atividade de fEPO e afinidade de fEPO pelo receptor de fEPO

O receptor de fEPO pode ser preparado como descrito na Patente U.S. N° 5 387 808; 5 292 654; 5 278 065, as quais são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente. A atividade do polipeptídeo de fEPO pode ser determinada por ensaios padrão in vitro ou in vivo. Por exemplo, linhagens celulares que proliferam na presença de fEPO (incluindo, mas não limitado a, células UT-7, células TF-1, FDCP-1/mEPOR ou células de baço) podem ser utilizadas para monitorar a ligação ao receptor de fEPO. Consultar, por exemplo, Wrighton et al., (1997) Nature Biotechnology 15:1261-1265; Patente U.S. N° 5 773 569 e 5 830 851, os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Para polipeptídeo não-PEGuilado ou PEGuilado de fEPO compreendendo um aminoácido nãonatural, a afinidade do hormônio por seu receptor pode ser mensurada com biossensor BIAcore™ (Pharmacia). Modelos in vivo de animais (por exemplo, murino, etc.), bem como estudos em felinos para testar atividade de fEPO são conhecidos e incluem aqueles descritos em, por exemplo, Patente U.S. N° 6 696 056; Cotes et al., (1961) Nature 191:1065-1067; Publicação de Pedido de Patente U.S.N⁰ 2003/0198691; e Pharm Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2), os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Ensaios para capacidade de dimerização de polipeptídeos de fEPO compreendendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente podem ser conduzidos como descrito na Patente U.S. N° 6 221 608, a qual é aqui incorporada por referência neste pedido de patente.

XIV. Mensuração de potência, meia-vida funcional in vivo e de parâmetros farmacocinéticos.

A potência e a meia-vida funcional in vivo de um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente podem ser determinadas de acordo com o protocolo descrito na Patente U.S. N° 6 586 398; 5 583 272; e Publicação de Pedido de

Patente U.S. N° 2003/0198691A1, os quais são aqui incorporados por referência neste pedi-

140/238 do de patente.

Parâmetros farmacocinéticos de um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente podem ser avaliados em machos normais de rato Sprague-Dawley (N = 5 animais por grupo de tratamento). Os animais receberão uma dose única de 25 ug/rato iv ou 50 ug/rato sc, e aproximadamente 5-7 amostras de sangue serão coletadas de acordo com um cronograma pré-definido, Geralmente cobrindo cerca de 6 horas para um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente não conjugado a um polímero solúvel em água e cerca de 4 dias para um polipeptídeo de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente e conjugado a um polímero solúvel em água. Dados farmacocinéticos para fEPO estão bem estudados em várias espécies e podem ser comparados diretamente aos dados obtidos para fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente. Consultar Mordenti J., et al., Pharm. Res. 8(11):1351-59(1991).

A atividade específica de fEPO de acordo com esta invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos no estado da técnica. A atividade biológica das proteínas fEPO purificadas desta invenção é tal que a administração da proteína fEPO por injeção a pacientes humanos resulta em produção celular aumentada na medula óssea de reticulócitos e de hemácias, comparado a grupos de sujeitos não injetados ou de controle. A atividade biológica das muteínas de fEPO, ou de fragmentos destas, obtidas e purificadas de acordo com esta invenção, pode ser testada por métodos de acordo com as especificações de Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoetin BRP Bio 1997(2). Outro ensaio biológico para determinar a atividade de fEPO é o ensaio com camundongo normocitêmico (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoetin BRP Bio 1997(2)).

XV.Administração e composições farmacêuticas

Os polipeptídeos ou proteínas da invenção (incluindo, entre outros, fEPO, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não-naturais, etc.) são opcionalmente empregados para usos terapêuticos, incluindo, entre outros, em combinação com veículo farmacêutico adequado. Estas composições, por exemplo, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Este veículo ou excipiente inclui, entre outros, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e/ou combinações destes. A formulação é feita para se adequar ao modo de administração. Em geral, métodos para administrar proteínas são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser aplicados à administração dos polipeptídeos da invenção.

Composições terapêuticas compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção são opcionalmente testadas em um ou mais modelos de animais apropriados in vitro e/ou in vivo de doença, para confirmar eficácia, metabolismo em tecidos e para estimar doses, de

141/238 acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. Em especial, as doses podem ser inicialmente determinadas por atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas dos presentes aminoácidos não-naturais em comparação a aos homólogos naturais (incluindo, entre outros, comparação de uma EPO modificada incluindo um ou mais aminoácidos nãonaturais com EPO com aminoácidos naturais), ou seja, em um ensaio pertinente.

Administração é feita por qualquer um das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula em contato final com células de sangue ou de tecidos. Os polipeptídeos contendo aminoácidos não-naturais da invenção são administrados em qualquer maneira adequada, opcionalmente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Existem métodos adequados disponíveis para administrar estes polipeptídeos, no contexto da presente invenção, a um paciente e, apesar de mais de uma via poder ser utilizada para administrar uma determinada composição, uma via em particular pode frequentemente propiciar ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que outra.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição em particular sendo administrada, bem como pelo método em particular usado para administrar a composição. Por conseguinte, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.

Composições de polipeptídeos podem ser administradas por algumas vias, incluindo, mas não limitado a, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutânea, tópica, sublingual ou retal. Composições de polipeptídeos com aminoácidos nãonaturais podem também ser administradas via lipossomos. Estas vias de administração e formulações apropriadas são geralmente conhecidas daqueles versados no estado da técnica.

O polipeptídeo com aminoácidos não-naturais, isoladamente ou combinado a outros componentes adequados, pode também ser produzido em formulações de aerossol (ou seja, podem ser “nebulizados”) para ser administrado por inalação. Formulações em aerossol podem ser inclusas em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluormetano, propano, nitrogênio e os semelhantes.

Formulações adequadas para administração parenteral, como, por exemplo, por via intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, e incluem soluções isotônicas estéreis injetáveis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos para tornar a formulação isotônica ao sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações de ácido nucléico empacotado podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou doses múltiplas, tais como ampolas e frascos.

A administração parenteral e a intravenosa são métodos preferidos de administra142/238 ção. Em especial, as vias de administração já em uso para agentes terapêuticos com homólogos de aminoácido natural (incluindo, mas não limitado a, aqueles tipicamente usados para EPO, GCSF, GMCSF, IFNs, interleucinas, anticorpos e/ou qualquer outra proteínas farmaceuticamente liberada), junto com formulações em uso corrente, oferecem vias preferidas de administração e de formulação para os aminoácidos não-naturais da invenção.

A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, é suficiente para induzir uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo ou, incluindo, entre outros, para inibir infecção por agente patogênico ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vetor em particular, ou formulação, e a atividade, a estabilidade ou meia-vida sérica do polipeptídeo com aminoácido não-natural empregado e pela condição do paciente, bem como pelo peso corporal ou área de superfície do paciente a ser tratado. O tamanho da dose é determinado também pela existência, natureza e a extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um determinado vetor, formulação ou os semelhantes em um determinado paciente.

Ao determinar a quantidade eficaz do vetor ou formulação a ser administrado no tratamento ou na profilaxia de doença (incluindo, mas não limitado a, câncer, doenças hereditárias, diabetes, AIDS ou as semelhantes), o médico avalia níveis plasmáticos circulantes, toxicidades da formulação, progressão da doença e/ou, quando pertinente, a produção de anticorpos anti-polipeptídeos com aminoácido não-natural.

A dose administrada, por exemplo, para um paciente de 70 quilogramas, varia tipicamente no intervalo equivalente a doses de proteínas terapêuticas atualmente utilizadas, ajustada para a atividade alterada ou meia-vida sérica da composição pertinente. Os vetores desta invenção podem suplementar condições terapêuticas por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos com aminoácidos naturais, ácidos nucléicos, análogos de nucleotídeos, modificadores de resposta biológica e os semelhantes.

Para administração, formulações da presente invenção são administradas em taxa determinada pela LD-50 da formulação pertinente e/ou pela observação de quaisquer efeitos colaterais dos aminoácidos não-naturais em várias concentrações, incluindo, entre outros, conforme aplicados à massa e saúde geral do paciente. A administração pode ser feita com doses únicas ou divididas.

Se, quando submetido à infusão de uma formulação, desenvolver febre, calafrios ou dores musculares, o/a paciente é administrado com a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno ou outro fármaco que controle dor/febre. Pacientes com reações à infusão como febre, dores musculares e calafrios são pré-medicados 30 minutos antes nas infusões futuras com aspirina, acetaminofeno ou, incluindo, entre outros, difenidramina. Meperi143/238 dina é utilizada para calafrios e dores musculares de intensidade mais grave que não respondem rapidamente a antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão celular é desacelerada ou descontinuada dependendo da gravidade da reação.

Polipeptídeos de EPO felina da invenção podem ser administrados diretamente a um sujeito mamífero. A administração é feita por qualquer uma das vias normalmente utilizadas para introduzir fEPO em um sujeito. As composições de polipeptídeos de acordo com modalidades da presente invenção incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica, inalação (incluindo, mas não limitado a, via um aerossol), bucal (incluindo, mas não limitado a, sublingual), vaginal, parenteral (incluindo, mas não limitado a, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial ou intravenosa), tópica (ou seja, superfície cutânea e mucosa, incluindo superfícies das vias aéreas) e transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer determinado caso dependerá da natureza e da gravidade da condição em tratamento. A administração pode ser local ou sistêmica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes lacrados de dose unitária ou doses múltiplas, tais como ampolas e frascos. Os polipeptídeos de fEPO da invenção podem ser preparados em mistura em forma injetável de dose unitária (incluindo, mas não limitado a, solução, suspensão ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos de fEPO da invenção podem também ser administrados por infusão contínua (usando, entre outros, minibombas, tais como bombas osmóticas), bolus único ou formulações de depósito de liberação lenta.

Formulações adequadas para administração incluem soluções estéreis isotônicas aquosas e não aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição em particular sendo administrada, bem como pelo método em particular usado para administrar a composição. Portanto, há uma ampla variedade de formulações adequadas para composições farmacêuticas da (incluindo veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis) da invenção (consultar, por exemplo, Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985).

Veículos adequados incluem tampões contendo fosfato, borato, HEPES, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (com menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoáci144/238 dos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação como EDTA; íons de metal divalente como zinco, cobalto ou cobre; alcoóis de açúcar como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como sódio; e/ou surfactantes não iônicos como Tween™, Pluronics™ ou PEG.

Os polipeptídeos de fEPO da invenção, incluindo aqueles ligados a polímeros solúveis em água, como PEG, podem também ser administrados por ou como parte de sistemas de liberação sustentada. Composições de liberação sustentada incluem, mas não estão limitadas a, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de itens moldados, incluindo, entre outros, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada incluem aquelas de materiais biocompatíveis como poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer etal., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etileno acetato de vinila (Langer et al., supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988), polilactídeos (ácido poliláctico) (Patente U.S. N° 3 773 919; EP 58,481), poliglicolídeo (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídios, polissacarídeos, ácidos nucléicos, poliaminoácidos como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e silicone. Composições de liberação sustentada incluem também um composto encapsulado em lipossomos. Lipossomos contendo o composto são preparados por métodos por si próprios conhecidos: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77: 40304034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Patente U.S. N^os 4 485 045 e 4 544 545; e EP 102 324.

Polipeptídeos de fEPO encapsulados em lipossomos podem ser preparados por métodos descritos em, por exemplo, DE 3 218 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Patente U.S. N^os 4 485 045 e 4 544 545; e EP 102 324. Composição e tamanho de lipossomos são bem conhecidos ou podem ser rapidamente determinados empiricamente por aquele versado no estado da técnica. Alguns exemplos de lipossomos são descritos em, por exemplo, Park JW, etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): Medicai Applications of Liposomes (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for câncer therapy, in Teicher B (ed): Câncer Drug Discovery and Development (2002); Park JW, etal., Clin. Câncer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et

145/238 al., Câncer Res. 63: 3154-3161 (2003).

A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no sujeito ao longo do tempo. Em geral, a quantidade total farmaceuticamente eficaz da fEPO da presente invenção administrada por via parenteral por dose varia no intervalo de aproximadamente 0,01 pg/kg/dia a aproximadamente 100 pg/kg, ou de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg do peso corporal do paciente, embora esta esteja subordinada a critério terapêutico. A frequência de administração está também subordinada a critério terapêutico e pode ser mais ou menos frequente do que os produtos comercialmente disponíveis contendo EPO, aprovados para uso em seres humanos. Geralmente, um polipeptídeo PEGuilado de fEPO da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração descritas acima.

XVI. Usos terapêuticos de polipeptídeos de fEPO da invenção

Os polipeptídeos de fEPO da invenção são úteis para tratar uma ampla gama de transtornos. A administração de produtos com fEPO da presente invenção resulta em formação de hemácias em seres humanos. As composições farmacêuticas contendo produtos de glicoproteína fEPO podem ser formulados em potência eficaz para administração por vários meios para um paciente humano apresentando transtornos sanguíneos, caracterizados por baixa ou defeituosa produção de hemácias, quer isoladamente ou como parte de uma condição ou doença. Quantidades médias do produto de glicoproteína fEPO podem variar e, em especial, devem ter como base as recomendações e a prescrição de um médico qualificado. A quantidade exata de fEPO é material de preferência, sujeito a fatores tais como o tipo exato de condição sendo tratada, a condição do paciente sendo tratado, bem como os outros ingredientes na composição. A fEPO da presente invenção pode, portanto, ser usada para estimular a produção de hemácias e corrigir níveis deprimidos de células da série vermelha. Mais comumente, a redução de níveis de células da série vermelha é decorrente de anemia. Entre as condições tratáveis pela presente invenção, estão incluídas anemia associada com declínio ou perda de função renal (insuficiência renal crônica), anemia associada com terapia mielossupressora, como com fármacos quimioterápicos ou anti-virais (como AZT), anemia associada com a progressão de cânceres não mieloides e anemia associada com infecções virais (como HIV). Também tratáveis, são condições que podem levar à anemia em uma pessoa de outra forma saudável, como em perda prevista de sangue durante cirurgia. Em geral, qualquer condições tratável com fEPO pode também ser tratada com os conjugados PEG:fEPO da presente invenção. A invenção também provê administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ferro a fim de manter eritropoiese aumentada durante a terapia. A quantidade a ser fornecida pode ser rapidamente determinada por aquele versado no estado da técnica com base em terapia com fEPO.

XVII. EXEMPLOS

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Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1

Este exemplo descreve um dos muitos conjuntos possíveis de critérios para a seleção de sítios preferidos de incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente em fEPO.

Este exemplo demonstra o modo como sítios preferidos dentro do polipeptídeo de fEPO foram selecionados para introdução de um aminoácido não codificado naturalmente. Modelagem molecular e as informações conhecidas referentes à estrutura secundária de fEPO foram utilizadas para determinar posições preferidas nas quais um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente poderíam ser introduzidos. Outras estruturas de fEPO estruturas e as informações conhecidas sobre estrutura em cristal referentes à fEPO foram utilizadas para examinar variação potencial de elementos estruturais primários, secundários ou terciários entre conjuntos de dados de estrutura em cristal. As coordenadas para estas estruturas encontram-se disponíveis no Protein Data Bank (PDB) (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 1997, 112, pp 535) ou o Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB no endereço http://www.rcsb.org. O modelo estrutural 1CN4 contém toda a sequência de 18 kDa de fEPO madura com a exceção dos resíduos 124-130, o resíduo A1 de N-terminal, os resíduos T163, G164, D165 de C-terminal e o resíduo R166, os quais foram omitidos por provocarem alteração no cristal. Duas pontes dissulfeto estão presentes, formadas por C7 e C161 e por C29 e C33.

A numeração de sequência usada neste exemplo está de acordo com a sequência de aminoácidos de fEPO madura (variante de 18 kDa), mostrada na SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

Este exemplo descreve um dos muitos possíveis conjuntos de critérios para a seleção de sítios preferidos de incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente em fEPO. Usando os critérios descritos abaixo, as posições de aminoácidos utilizadas para incorporação sítio-específica de aminoácidos não codificados naturalmente (por exemplo, pacetil-fenilalanina (pAF)) são as posições: 53, 55, 116, 89, 72, 86, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 31, 163, 120, 76, 24, 38, 37, 49, 83, 21, 36. Várias estruturas em cristal de EPO foram utilizadas para determinas posições preferidas nas quais um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente poderíam ser introduzidos: as coordenadas para estas estruturas encontram-se disponíveis no Protein Data Bank (PDB) via The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics no endereço www.rcsb.org (PDB IDs 1CN4, 1EER e 1BUY). As informações sobre estrutura em cristal por raios-X foram utilizadas para calcular acessibilidade a solventes na molécula de fEPO, utilizando o programa Cx (Pintar et al. Bioinformatics, 2002, Vol. 18, p 980). A acessibilidade a solventes de todos os átomos foi calou147/238 lada, e um valor médio de Cx, para cada resíduo de aminoácido, foi determinado e é mostrado na Figura 8 e Figura 9. Os critérios seguintes foram utilizados para avaliar cada posição de fEPO para a introdução de um aminoácido não codificado naturalmente: o resíduo (a) não devia interferir com a ligação de qualquer fEPOpb com base em análise estrutural de fEPO e análise estrutural de fEPO e 1CN4, 1EER e 1BUY (estruturas cristalográficas de hEPO conjugada com hEPOpb), b) não devia ser afetado por mutagênese de varredura de alanina (Bittorf, T. etal. FEBS, 336:133-136 (1993), Wen, D., etal. JBC, 269:22839-22846 (1994), e Elliot, S. et al. Blood, 89:493-502 (1997), (c) deveria ser exposto na superfície e exibir Cx máximo, demonstrando interações mínimas de van der Waals ou de ligação a hidrogênio com resíduos vizinhos, (d) deveria ser deletado ou variável em variantes de fEPO (Bittorf, T. etal. FEBS, 336:133-136 (1993), Wen, D., etal. JBC, 269:22839-22846 (1994), (e) resultaria em alterações conservadoras quando da substituição com um aminoácido não codificado naturalmente e (f) poderia ser encontrado em regiões altamente flexíveis (incluindo, mas não limitado a, alça CD) ou regiões estruturalmente rígidas (incluindo, mas não limitado a, Hélice B). Adicionalmente, foram realizados outros cálculos sobre a molécula de fEPO, utilizando o programa Cx (Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980) para avaliar a extensão da protrusão de cada átomo da proteína. Como resultado, em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido está substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente em, mas não limitado a, uma ou mais das seguintes posições de fEPO: antes da posição 1 (ou seja, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 7,8, 9, 10, 13, 17, 20, 21, 24, 25, 27, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 43, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 65, 68, 69, 72, 75, 76, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 110, 111, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 139, 159, 161, 162 ,163, 164, 165, 166, 167 (ou seja, na carboxila terminal da proteína), ou combinações desta.

Alguns sítios para geração de um antagonista de fEPO incluem: 10, 11, 14, 15, 96, 97, 100, 103, 104, 107, 110. Estes sítios foram escolhidos empregando o critério c - e do desenho agonista. O desenho antagonista pode incluir também modificações sítio-dirigidas de resíduos do sítio 1 para aumentar a afinidade de ligação a fEPObp.

As Figuras 3 a 9 mostram a modelagem e seleção de posições. A Figura 8 mostra que, em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido está substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente em, mas não limitado a, uma ou mais das seguintes posições de fEPO: 53, 55, 116, 89, 72, 86, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 31, 163, 120, ou combinações desta. A Figura 9 mostra que, em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido está substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente em, mas não limitado a, uma ou mais das seguintes posições de fEPO: 53, 55, 76, 24, 116, 38, 89, 37, 72, 86, 49, 83, 21, 36, 128, 129,130, 131,132, 133, ou combinações destas.

Exemplo 2

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Este exemplo detalha a clonagem e expressão de um polipeptídeo modificado de fEPO em E. coli.

Este exemplo demonstra como um polipeptídeo de fEPO incluindo um aminoácido não codificado naturalmente pode ser expresso em E. coli. Sequências de nucleotídeos codificando fEPO são produzidas em geral como descrito em Matthews et al., (1996) PNAS 93:9471-76. Bibliotecas de cDNA de fígado fetal, fígado adulto, rim fetal e rim adulto servem como modelo para clonagem de cDNA codificador de fEPO completa e madura, sendo o melhor resultado obtido com fígado fetal. Primers utilizados para clonar fEPO completa e madura poderiam ser primers conhecidos daqueles versados no estado da técnica, incluindo:

5’cagttacatatgggagttcacgaatgtcctgcctgg3’SEQIDNO: 21; e

5’cagttacatatgctccaccaagattaatctgtg3’SEQIDNO: 22. Um exemplo de sequência de 3’ primer que poderia ser utilizado para esta clonagem é 5’ctgcaactcgagtcatctgtcccctgtcctgcag3’ SEQIDNO: 23. As condições de reação para a clonagem podem ser 94 °C por dois minutos com 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por um minuto, 72 °C por 2 minutos e 72 °C por 7 minutos, seguido por término da reação a 4 °C. São identificadas moléculas que codificam fEPO, incluindo a fEPO completa, a forma madura de fEPO desprovida da sequência sinal N-terminal, e SNPs. O cDNA codificador da fEPO completa e da madura pode ser inserido em vetores de expressão, tal como os vetores de expressão pBAD HISc e pET20b, seguido por otimização da sequência para clonagem e expressão sem alterar a sequência de aminoácidos.

Um sistema de tradução introduzido que compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS) é utilizado para expressar fEPO contendo um aminoácido não codificado naturalmente. A O-RS de preferência aminocila o O-tRNA com um aminoácido não codificado naturalmente. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido não codificado naturalmente na fEPO, em resposta a um códon seletor codificado. A Tabela seguinte (Tabela 2) inclui sequências de fEPO, tanto completa como madura, e sequências de O-RS e de O-tRNA, algumas das quais utilizadas nestes exemplos, outras que foram utilizadas com hEPO e que podem ser utilizadas ou otimizadas para uso com fEPO.

TABELA 2:

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
1	MGSCECPALLLLLSLLLLPLGLPVLGAPPRLICD SRVLERYILEAREAENVTMGCAEGCSFSENITV	Sequência de aminoácidos	Proteína

149/238

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
	PDTKVNFYTWKRMDVGQQAVEVWQGLALLSE AILRGQALLANSSQPSETLQLHVDKAVSSLRSL TSLLRALGAQKEATSLPEATSAAPLRTFTVDTL CKLFRIYSNFLRGKLTLYTGEACRRGDR	de fEPO completa
2	APPRLICDSRVLERYILEAREAENVTMGCAEGC SFSENITVPDTKVNFYTWKRMDVGQQAVEVW QGLALLSEAILRGQALLANSSQPSETLQLHVDK AVSSLRSLTSLLRALGAQKEATSLPEATSAAPL RTFTVDTLCKLFRIYSNFLRGKLTLYTGEACRR GDR	A sequência de aminoácidos de fEPO madura	Proteína
3	MGSCECPALLLLLSLLLLPLGLPVLGAPPRLICD SRVLERYILGAREAENVTMGCAEGCSFSENITV PDTKVNFYTWKRMDVGQQAVEVWQGLALLSE AILRGQALLANSSQPSETLQLHVDKAVSSLRSL TSLLRALGAQKEATSLPEATSAAPLRTFTVDTL CKLFRIYSNFLRGKLTLYTGEACRRGDR	SNP variante (E108G) Sequência de aminoácidos de fEPO completa	Proteína
4	APPRLICDSRVLERYILGAREAENVTMGCAEGC SFSENITVPDTKVNFYTWKRMDVGQQAVEVW QGLALLSEAILRGQALLANSSQPSETLQLHVDK AVSSLRSLTSLLRALGAQKEATSLPEATSAAPL RTFTVDTLCKLFRIYSNFLRGKLTLYTGEACRR GDR	SNP variante (E108G) da sequência de aminoácidos de fEPO madura	Proteína
5	CCCAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGA CGGACTCTAAATCCGTTCTCGTAGGAGTTCG AGGGTTCGAATCCCTTCCC TGGGACCA	HLAD03; tRNA supressor âmbar otimizado	tRNA
6	GCGAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGA CGGACTTCCTAATCCGTTCTCGTAGGAGTTC GAGGGTTCGAATCCCTCCCCTCGCACCA	HL325A; tRNA supressor otimizado com frameshift AGGA	tRNA

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SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
7	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azido-Lfenilalanina p-AzPheRS(6)	RS
8	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTSHYLGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-benzoil-Lfenilalanina p-BpaRS(1)	RS
9	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKAAIGF EPSGKIHLGHYLQIKKMIDL QNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNK KVFEAMGLKAKYVYGSPFQLDKDYTLNVYRLA LKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQV NAIYLAVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKWC IHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIR AKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKR PEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKN AVAEELIKILE PIRKR L	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina PropargilPheRS	RS

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SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
10	MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SPFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNIPY LPVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKWC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTI KRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina PropargilPheRS	RS
11	MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SKFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNAIY LAVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKWC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTI KRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina PropargilPheRS	RS
12	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-AzPheRS(1)	RS

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SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
13	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-AzPheRS(3)	RS
14	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPVHYQGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-AzPheRS(4)	RS
15	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPSHYQGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-AzPheRS(2)	RS
16	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY	Aminoacil tRNA sintetase para a in-	RS

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SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
	VYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGCHYRGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	corporação de p-azidofenilalanina (LW1)
17	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGTHYRGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina (LW5)	RS
18	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGGHYLGVDVIV GGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina (LW6)	RS
19	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSRFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNVIHYDGVDVAV GGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina	RS

154/238

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
	GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	(AzPheRS-5)
20	MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIG FEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADL HAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKY VYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSM ELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDVA VGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLD GEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPA GWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTV NSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEP IRKRL	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina (AzPheRS-6)	RS
21	cagttacatatgggagttcacgaatgtcctgcctgg	Prímer para clonagem de cDNA de hEPO completa
22	cagttacatatgctccaccaagattaatctgtg	Prímer para clonagem de cDNA de hEPO madura
23	ctgcaactcgagtcatctgtcccctgtcctgcag	3’Primer para clonagem de cDNA de hEPO completa e madura
24	atgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtggcttctcctgtccctgctgtcgctccctctgggcctcccagtcctgggcgccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcggg-	Sequência de nucleotídeos de cDNA de hEPO completa

155/238

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
	cagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctgcgagcccagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctcagctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagatga
25	gccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctgcgagcccagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctcagctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagatga	Sequência de nucleotídeos of cDNA de hEPO madura
26	gccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctgggagcccagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctcagctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagatga	Sequência de nucleotídeos de cDNA de G113R de hEPO

156/238

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
27	atgctccaccaagattaatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctgcgagcccagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctcagctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagatga	Otimizado para expressão de cDNA de hEPO madura em E. coli
30	mcepappkptqsawhsfpecpalllllsllllplglpvlgapprlicdsrvleryileareaenvtmgcaqgcsfsenitvpdtkvnfytwkrmdvgqqalevwqglallseailrgqallanasqpsetpqlhvdkavsslrsltsllralgaqkeamslpeeaspaplrtftvdtlcklfriysnflrgkltlytgeacrrgdr	Sequência de aminoácidos de cEPO completa	Proteína
31	apprlicdsrvleryileareaenvtmgcaqgcsfsenitvpdtkvnfytwkrmdvgqqalevwqglallseailrgqallanasqpsetpqlhvdkavsslrsltsllralgaqkeamslpeeaspaplrtftvdtlcklfriysnflrgkltlytgeacrrgdr	A sequência de aminoácidos de cEPO madura	Proteína
32	MGVRECPALLLLLSLLLPPLGLPALGAPPRLICD SRVLERYILEAREAENVTMGCAEGCSFGENVT VPDTKVNFYSWKRMEVEQQAVEVWQGLALLS EAILQGQALLANSSQPSETLRLHVDKAVSSLRS LTSLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTFAVDTL CKLFRIYSNFLRGKLKLYTGEACRRGDR	Sequência de aminoácidos de eEPO completa	Proteí- na
33	APPRLICDSRVLERYILEAREAENVTMGCAEGC SFGENVTVPDTKVNFYSWKRMEVEQQAVEVW QGLALLSEAILQGQALLANSSQPSETLRLHVDK AVSSLRSLTSLLRALGAQKEAISPPDAASAAPL RTFAVDTLCKLFRIYSNFLRGKLKLYTGEACRR GDR	A sequência de aminoácidos de eEPO madura	Proteína

157/238

SEQ ID n°	Sequência	Notas	Proteína de tRNA ou RS
34	CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCG GACTCTAAATCCGCATGGCGCTGGTTCAAAT CCGGCCCGCCGGACCA	M. jannaschii mtRNAgJ*	tRNA

TABELA 3

SEQ ID NO: 28

Sequência de nucleotídeos da construção de supressão de expressão Nat L BB-Opti em in Lucy F para eritropoetina felina

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA

AGCGCGCAAA GCCACTACTG CCACTTTTGG AGACTGTGTA CGTCGAGGGC CTCTGCCAGT

61CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG

GTCGAACAGA CATTCGCCTA CGGCCCTCGT CTGTTCGGGC AGTCCCGCGC AGTCGCCCAC

121TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC

AACCGCCCAC AGCCCCGACC GAATTGATAC GCCGTAGTCT CGTCTAACAT GACTCTCACG

181ACCATATGCC CGTCCGCGTA CCGGCGCGCC GGATGCCAAT CGATGAATTC CGGTGTGAAA

TGGTATACGG GCAGGCGCAT GGCCGCGCGG CCTACGGTTA GCTACTTAAG GCCACACTTT

241TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC

ATGGCGTGTC TACGCATTCC TCTTTTATGG CGTAGTCCGC GGTAAGCGGT AAGTCCGACG

301GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG

CGTTGACAAC CCTTCCCGCT AGCCACGCCC GGAGAAGCGA TAATGCGGTC GACCGCTTTC

361GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG

158/238

TCACGACGTT

CCCCTACACG ACGTTCCGCT AATTCAACCC ATTGCGGTCC CAAAAGGGTC

AGTGCTGCAA tRNA

H1

421GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGATGCATC CATCAATTCA TATTTGCATG TCGCTATGTG

CATTTTGCTG CCGGTCACTT AACTACGTAG GTAGTTAAGT ATAAACGTAC AGCGATACAC tRNA

H1

481TTCTGGGAAA TCACCATAAA CGTGAAATGT CTTTGGATTT GGGAATCTTA TAAGTTCTGT

AAGACCCTTT AGTGGTATTT GCACTTTACA GAAACCTAAA CCCTTAGAAT ATTCAAGACA tRNA

H1 Hyb1 tRNA

541ATGAGACCAC TCGGATCCGG TGGGGTAGCG AAGTGGCTAA ACGCGGCGGA CTCTAAATCC

TACTCTGGTG AGCCTAGGCC ACCCCATCGC TTCACCGATT TGCGCCGCCT GAGATTTAGG

Hyb1 tRNA tRNA

159/238

Term

601GCTCCCTTTG GGTTCGGCGG TTCGAATCCG TCCCCCACCA TTTTTTGGAA CCTAGGGAAT

CGAGGGAAAC CCAAGCCGCC AAGCTTAGGC AGGGGGTGGT AAAAAACCTT GGATCCCTTA

661TCCGGTGTGA AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCCATTCGC

AGGCCACACT TTATGGCGTG TCTACGCATT CCTCTTTTAT GGCGTAGTCC GCGGTAAGCG

721CATTCAGGCT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCG CTATTACGCC

GTAAGTCCGA CGCGTTGACA ACCCTTCCCG CTAGCCACGC CCGGAGAAGC GATAATGCGG

781AGCTGGCGAA AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA GGGTTTTCCC

TCGACCGCTT TCCCCCTACA CGACGTTCCG CTAATTCAAC CCATTGCGGT CCCAAAAGGG tRNA

H1

841AGTCACGACG TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AATTGATGCA TCCATCAATT CATATTTGCA

TCAGTGCTGC AACATTTTGC TGCCGGTCAC TTAACTACGT AGGTAGTTAA GTATAAACGT tRNA

H1

901TGTCGCTATG TGTTCTGGGA AATCACCATA AACGTGAAAT GTCTTTGGAT

TTGGGAATCT

160/238

ACAGCGATAC ACAAGACCCT TTAGTGGTAT TTGCACTTTA CAGAAACCTA

AACCCTTAGA tRNA

H1 Hyb1 tRNA

961TATAAGTTCT GTATGAGACC ACTCGGATCC GGTGGGGTAG CGAAGTGGCT AAACGCGGCG

ATATTCAAGA CATACTCTGG TGAGCCTAGG CCACCCCATC GCTTCACCGA TTTGCGCCGC

Term tRNA

Hyb1 tRNA

1021GACTCTAAAT CCGCTCCCTT TGGGTTCGGC GGTTCGAATC CGTCCCCCAC CATTTTTTGG

CTGAGATTTA GGCGAGGGAA ACCCAAGCCG CCAAGCTTAG GCAGGGGGTG GTAAAAAACC

1081AAGACGTCGA ATTCCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA

TTCTGCAGCT TAAGGCCACA CTTTATGGCG TGTCTACGCA TTCCTCTTTT ATGGCGTAGT

1141GGCGCCATTC GCCATTCAGG CTGCGCAACT GTTGGGAAGG GCGATCGGTG CGGGCCTCTT

CCGCGGTAAG CGGTAAGTCC GACGCGTTGA CAACCCTTCC CGCTAGCCAC GCCCGGAGAA

1201CGCTATTACG CCAGCTGGCG AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCGATTAAGT TGGGTAACGC

GCGATAATGC GGTCGACCGC TTTCCCCCTA CACGACGTTC CGCTAATTCA ACCCATTGCG

161/238

1261CAGGGTTTTC CCAGTCACGA CGTTGTAAAA CGACGGCCAG TGAATTGATG CATCCATCAA

GTCCCAAAAG GGTCAGTGCT GCAACATTTT GCTGCCGGTC ACTTAACTAC GTAGGTAGTT tRNA

H1

1321TTCATATTTG CATGTCGCTA TGTGTTCTGG GAAATCACCA TAAACGTGAA ATGTCTTTGG

AAGTATAAAC GTACAGCGAT ACACAAGACC CTTTAGTGGT ATTTGCACTT TACAGAAACC tRNA

H1 Hyb1 tRNA

1381ATTTGGGAAT CTTATAAGTT CTGTATGAGA CCACTCGGAT CCGGTGGGGT AGCGAAGTGG

TAAACCCTTA GAATATTCAA GACATACTCT GGTGAGCCTA GGCCACCCCA TCGCTTCACC tRNA

Hyb1 tRNA

1441CTAAACGCGG CGGACTCTAA ATCCGCTCCC TTTGGGTTCG GCGGTTCGAA TCCGTCCCCC

GATTTGCGCC GCCTGAGATT TAGGCGAGGG AAACCCAAGC CGCCAAGCTT AGGCAGGGGG

Term tRNA

162/238

Hyb1 tRNA

1501ACCATTTTTT GGAACATATG GAATTCCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC

GTAAGGAGAA

TGGTAAAAAA CCTTGTATAC CTTAAGGCCA CACTTTATGG CGTGTCTACG CATTCCTCTT

1561AATACCGCAT CAGGCGCCAT TCGCCATTCA GGCTGCGCAA CTGTTGGGAA GGGCGATCGG

TTATGGCGTA GTCCGCGGTA AGCGGTAAGT CCGACGCGTT GACAACCCTT

CCCGCTAGCC

1621TGCGGGCCTC TTCGCTATTA CGCCAGCTGG CGAAAGGGGG ATGTGCTGCA

AGGCGATTAA

ACGCCCGGAG AAGCGATAAT GCGGTCGACC GCTTTCCCCC TACACGACGT

TCCGCTAATT

1681GTTGGGTAAC GCCAGGGTTT TCCCAGTCAC GACGTTGTAA AACGACGGCC

AGTGAATTGA

CAACCCATTG CGGTCCCAAA AGGGTCAGTG CTGCAACATT TTGCTGCCGG

TCACTTAACT tRNA

H1

1741TGCATCCATC AATTCATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG

ACGTAGGTAG TTAAGTATAA ACGTACAGCG ATACACAAGA CCCTTTAGTG GTATTTGCAC tRNA

H1

Hyb1 tRNA

1801AAATGTCTTT GGATTTGGGA ATCTTATAAG TTCTGTATGA GACCACTCGG

ATCCGGTGGG

163/238

TTTACAGAAA CCTAAACCCT TAGAATATTC AAGACATACT CTGGTGAGCC

TAGGCCACCC tRNA

Hyb1 tRNA

1861GTAGCGAAGT GGCTAAACGC GGCGGACTCT AAATCCGCTC CCTTTGGGTT CGGCGGTTCG

CATCGCTTCA CCGATTTGCG CCGCCTGAGA TTTAGGCGAG GGAAACCCAA GCCGCCAAGC

Term tRNA

Hyb1 tRNA

1921AATCCGTCCC CCACCATTTT TTGGAACTTA ATTAAGGCGC GCCGGATGCC AATCGGCCAT

TTAGGCAGGG GGTGGTAAAA AACCTTGAAT TAATTCCGCG CGGCCTACGG TTAGCCGGTA

1981CACCATCCAA CGGGAAGGCG ATGAATTCCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG

GTGGTAGGTT GCCCTTCCGC TACTTAAGGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC

2041AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC

TTTTATGGCG TAGTCCGCGG TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG

2101GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT

CCACGCCCGG AGAAGCGATA ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA

2161AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT

TTCAACCCAT TGCGGTCCCA AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC

164/238

GGTCACTTAA tRNA

H1

2221GATGCATCCA TCAATTCATA TTTGCATGTC GCTATGTGTT CTGGGAAATC ACCATAAACG

CTACGTAGGT AGTTAAGTAT AAACGTACAG CGATACACAA GACCCTTTAG TGGTATTTGC

H1 tRNA

Hyb1 tRNA

2281TGAAATGTCT TTGGATTTGG GAATCTTATA AGTTCTGTAT GAGACCACTC GGATCCGGTG

ACTTTACAGA AACCTAAACC CTTAGAATAT TCAAGACATA CTCTGGTGAG CCTAGGCCAC tRNA

Hyb1 tRNA

2341GGGTAGCGAA GTGGCTAAAC GCGGCGGACT CTAAATCCGC TCCCTTTGGG TTCGGCGGTT

CCCATCGCTT CACCGATTTG CGCCGCCTGA GATTTAGGCG AGGGAAACCC AAGCCGCCAA

Hyb1 tRNA tRNA

165/238

Term

2401CGAATCCGTC CCCCACCATT TTTTGGAACC TAGGGAATTC CGGTGTGAAA TACCGCACAG

GCTTAGGCAG GGGGTGGTAA AAAACCTTGG ATCCCTTAAG GCCACACTTT ATGGCGTGTC

2461ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG

TACGCATTCC TCTTTTATGG CGTAGTCCGC GGTAAGCGGT AAGTCCGACG CGTTGACAAC

2521GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG GGGGATGTGC

CCTTCCCGCT AGCCACGCCC GGAGAAGCGA TAATGCGGTC GACCGCTTTC CCCCTACACG

2581TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC

ACGTTCCGCT AATTCAACCC ATTGCGGTCC CAAAAGGGTC AGTGCTGCAA CATTTTGCTG tRNA

H1

2641GGCCAGTGAA TTGATGCATC CATCAATTCA TATTTGCATG TCGCTATGTG TTCTGGGAAA

CCGGTCACTT AACTACGTAG GTAGTTAAGT ATAAACGTAC AGCGATACAC AAGACCCTTT tRNA

H1

2701TCACCATAAA CGTGAAATGT CTTTGGATTT GGGAATCTTA TAAGTTCTGT

ATGAGACCAC

166/238

AGTGGTATTT GCACTTTACA GAAACCTAAA CCCTTAGAAT ATTCAAGACA

TACTCTGGTG tRNA

H1 Hyb1 tRNA

2761TCGGATCCGG TGGGGTAGCG AAGTGGCTAA ACGCGGCGGA CTCTAAATCC GCTCCCTTTG

AGCCTAGGCC ACCCCATCGC TTCACCGATT TGCGCCGCCT GAGATTTAGG CGAGGGAAAC

Term tRNA

Hyb1 tRNA

2821GGTTCGGCGG TTCGAATCCG TCCCCCACCA TTTTTTGGAA GACGTCGAAT TCCGGTGTGA

CCAAGCCGCC AAGCTTAGGC AGGGGGTGGT AAAAAACCTT CTGCAGCTTA AGGCCACACT

2881AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCCATTCGC CATTCAGGCT

TTATGGCGTG TCTACGCATT CCTCTTTTAT GGCGTAGTCC GCGGTAAGCG GTAAGTCCGA

2941GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCG CTATTACGCC AGCTGGCGAA

CGCGTTGACA ACCCTTCCCG CTAGCCACGC CCGGAGAAGC GATAATGCGG TCGACCGCTT

3001AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA GGGTTTTCCC AGTCACGACG

TCCCCCTACA CGACGTTCCG CTAATTCAAC CCATTGCGGT CCCAAAAGGG TCAGTGCTGC tRNA

H1

167/238

3061TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AATTGATGCA TCCATCAATT CATATTTGCA TGTCGCTATG

AACATTTTGC TGCCGGTCAC TTAACTACGT AGGTAGTTAA GTATAAACGT ACAGCGATAC tRNA

H1

3121TGTTCTGGGA AATCACCATA AACGTGAAAT GTCTTTGGAT TTGGGAATCT TATAAGTTCT

ACAAGACCCT TTAGTGGTAT TTGCACTTTA CAGAAACCTA AACCCTTAGA ATATTCAAGA tRNA

H1 Hyb1 tRNA

3181GTATGAGACC ACTCGGATCC GGTGGGGTAG CGAAGTGGCT AAACGCGGCG GACTCTAAAT

CATACTCTGG TGAGCCTAGG CCACCCCATC GCTTCACCGA TTTGCGCCGC CTGAGATTTA

Term tRNA

Hyb1 tRNA

3241CCGCTCCCTT TGGGTTCGGC GGTTCGAATC CGTCCCCCAC CATTTTTTGG AACATATGGA

GGCGAGGGAA ACCCAAGCCG CCAAGCTTAG GCAGGGGGTG GTAAAAAACC TTGTATACCT

3301ATTCCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCCATTC

168/238

TAAGGCCACA CTTTATGGCG TGTCTACGCA TTCCTCTTTT ATGGCGTAGT CCGCGGTAAG

3361GCCATTCAGG CTGCGCAACT GTTGGGAAGG GCGATCGGTG CGGGCCTCTT CGCTATTACG

CGGTAAGTCC GACGCGTTGA CAACCCTTCC CGCTAGCCAC GCCCGGAGAA GCGATAATGC

3421CCAGCTGGCG AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCGATTAAGT TGGGTAACGC CAGGGTTTTC

GGTCGACCGC TTTCCCCCTA CACGACGTTC CGCTAATTCA ACCCATTGCG GTCCCAAAAG tRNA

H1

3481CCAGTCACGA CGTTGTAAAA CGACGGCCAG TGAATTGATG CATCCATCAA TTCATATTTG

GGTCAGTGCT GCAACATTTT GCTGCCGGTC ACTTAACTAC GTAGGTAGTT AAGTATAAAC tRNA

H1

3541CATGTCGCTA TGTGTTCTGG GAAATCACCA TAAACGTGAA ATGTCTTTGG ATTTGGGAAT

GTACAGCGAT ACACAAGACC CTTTAGTGGT ATTTGCACTT TACAGAAACC TAAACCCTTA tRNA

H1 Hyb1 tRNA

169/238

3601CTTATAAGTT CTGTATGAGA CCACTCGGAT CCGGTGGGGT AGCGAAGTGG CTAAACGCGG

GAATATTCAA GACATACTCT GGTGAGCCTA GGCCACCCCA TCGCTTCACC GATTTGCGCC

Term tRNA

Hyb1 tRNA

3661CGGACTCTAA ATCCGCTCCC TTTGGGTTCG GCGGTTCGAA TCCGTCCCCC ACCATTTTTT GCCTGAGATT TAGGCGAGGG AAACCCAAGC CGCCAAGCTT AGGCAGGGGG TGGTAAAAAA

SVO

3721GGAACTTAAT TAAGTACGGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG

CCTTGAATTA ATTCATGCCC GGAGGTTTTT TCGGAGGAGT GATGAAGACC TTATCGAGTC

SVO

3781AGGCAGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGGGGCGGAG

TCCGTCTCCG CCGGAGCCGG AGACGTATTT ATTTTTTTTA ATCAGTCGGT ACCCCGCCTC

SVO

3841AATGGGCGGA ACTGGGCGGA GTTAGGGGCG GGATGGGCGG AGTTAGGGGC

GGGACTATGG

TTACCCGCCT TGACCCGCCT CAATCCCCGC CCTACCCGCC TCAATCCCCG

170/238

CCCTGATACC

SVO

3901TTGCTGACTA ATTGAGATGC ATGCTTTGCA TACTTCTGCC TGCTGGGGAG CCTGGGGACT

AACGACTGAT TAACTCTACG TACGAAACGT ATGAAGACGG ACGACCCCTC

GGACCCCTGA

SVO

CMV

3961TTCCACACCT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG CATACTTCTG CCCGCGGAGT

AAGGTGTGGA CCAACGACTG ATTAACTCTA CGTACGAAAC GTATGAAGAC GGGCGCCTCA

CMV

4021TATTAATAGT AATCAATTAC GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT

ATAATTATCA TTAGTTAATG CCCCAGTAAT CAAGTATCGG GTATATACCT CAAGGCGCAA

CMV

4081ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG

TGTATTGAAT GCCATTTACC GGGCGGACCG ACTGGCGGGT TGCTGGGGGC GGGTAACTGC

CMV

4141TCAATAATGA CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG

ACGTCAATGG

AGTTATTACT GCATACAAGG GTATCATTGC GGTTATCCCT GAAAGGTAAC

TGCAGTTACC

171/238

CMV

4201GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT

CACCTCATAA ATGCCATTTG ACGGGTGAAC CGTCATGTAG TTCACATAGT ATACGGTTCA

CMV

4261ACGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG

TGCGGGGGAT AACTGCAGTT ACTGCCATTT ACCGGGCGGA CCGTAATACG GGTCATGTAC

CMV

4321ACCTTATGGG ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG

TGGAATACCC TGAAAGGATG AACCGTCATG TAGATGCATA ATCAGTAGCG ATAATGGTAC

CMV

4381GTGATGCGGT TTTGGCAGTA CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT

CACTACGCCA AAACCGTCAT GTAGTTACCC GCACCTATCG CCAAACTGAG TGCCCCTAAA

CMV

4441CCAAGCCTCC ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC

GGTTCGGAGG TGGGGTAACT GCAGTTACCC TCAAACAAAA CCGTGGTTTT AGTTGCCCTG

CMV

172/238

4501TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG

AAAGGTTTTA CAGCATTGTT GAGGCGGGGT AACTGCGTTT ACCCGCCATC CGCACATGCC

CMV

4561TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCTCTGG CTAACTAGAG AACCCACTGC TTACTGGCTT

ACCCTCCAGA TATATTCGTC TCGAGAGACC GATTGATCTC TTGGGTGACG AATGACCGAA

CMV Nat L

4621ATCGAAATTA CTAGTCCACC ATGGGGTCGT GCGAATGTCC TGCCCTGCTG CTTCTGCTAT

TAGCTTTAAT GATCAGGTGG TACCCCAGCA CGCTTACAGG ACGGGACGAC GAAGACGATA

Nat L

BB-Opti FEPO

4681CTTTGCTGCT GCTTCCCCTG GGCCTCCCAG TCCTGGGCGC CCCCCCTCGC CTCATCTGTG

GAAACGACGA CGAAGGGGAC CCGGAGGGTC AGGACCCGCG GGGGGGAGCG GAGTAGACAC

BB-Opti FEPO---4741ACAGCCGAGT CCTGGAGAGG TACATTCTGG AGGCCAGGGA GGCCGAAAAT GTGACCATGG

TGTCGGCTCA GGACCTCTCC ATGTAAGACC TCCGGTCCCT CCGGCTTTTA CACTGGTACC

BB-Opti FEPO

173/238

4801GCTGCGCTGA AGGCTGCAGC TTCAGTGAGA ATATCACCGT TCCGGACACC AAGGTCAACT CGACGCGACT TCCGACGTCG AAGTCACTCT TATAGTGGCA AGGCCTGTGG TTCCAGTTGA

BB-Opti FEPO

4861TCTATACCTG GAAGAGGATG GACGTCGGGC AGCAGGCTGT GGAAGTCTGG CAGGGCCTCG

AGATATGGAC CTTCTCCTAC CTGCAGCCCG TCGTCCGACA CCTTCAGACC GTCCCGGAGC

BB-Opti FEPO

4921CCCTCCTCAG CGAAGCCATC CTGCGGGGCC AGGCCCTGCT GGCCAACTCC TCCCAGCCCT

GGGAGGAGTC GCTTCGGTAG GACGCCCCGG TCCGGGACGA CCGGTTGAGG AGGGTCGGGA

BB-Opti FEPO

4981CTGAGACCCT GCAGCTGCAT GTCGACAAGG CCGTCAGCAG CCTGCGCAGC CTCACCTCCC

GACTCTGGGA CGTCGACGTA CAGCTGTTCC GGCAGTCGTC GGACGCGTCG GAGTGGAGGG

BB-Opti FEPO

5041TGCTGCGCGC ACTGGGAGCC CAGAAGGAAG CCACCTCCCT TCCCGAGGCA ACCTCTGCCG

ACGACGCGCG TGACCCTCGG GTCTTCCTTC GGTGGAGGGA AGGGCTCCGT TGGAGACGGC

BB-Opti FEPO

5101CCCCCTTAAG AACCTTCACT GTGGACACTT TGTGCAAGCT TTTCCGAATC

TACTCCAACT

174/238

GGGGGAATTC TTGGAAGTGA CACCTGTGAA ACACGTTCGA AAAGGCTTAG

ATGAGGTTGA

BB-Opti FEPO

5161TCCTGCGGGG CAAGCTGACG CTGTACACAG GGGAGGCCTG CCGAAGAGGA GACAGGTGAG

AGGACGCCCC GTTCGACTGC GACATGTGTC CCCTCCGGAC GGCTTCTCCT CTGTCCACTC

BGH

5221CGGCCGCATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC

GCCGGCGTAG TCGGAGCTGA CACGGAAGAT CAACGGTCGG TAGACAACAA ACGGGGAGGG

BGH

5281CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAATGAGG

GGCACGGAAG GAACTGGGAC CTTCCACGGT GAGGGTGACA GGAAAGGATT ATTTTACTCC

BGH

5341AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGG

GTGGGGCAGG

TTTAACGTAG CGTAACAGAC TCATCCACAG TAAGATAAGA CCCCCCACCC

CACCCCGTCC

BGH

5401ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCG

GTGGGCTCTA

TGTCGTTCCC CCTCCTAACC CTTCTGTTAT CGTCCGTACG ACCCCTACGC

CACCCGAGAT

175/238

Beta

5461TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA ACCAGTGTAC AGCTTTGCTT CTCAATTTCT TATTTGCATA

ACCGAAGACT CCGCCTTTCT TGGTCACATG TCGAAACGAA GAGTTAAAGA ATAAACGTAT

Beta

5521ATGAGAAAAA AAGGAAAATT AATTTTAACA CCAATTCAGT AGTTGATTGA GCAAATGCGT

TACTCTTTTT TTCCTTTTAA TTAAAATTGT GGTTAAGTCA TCAACTAACT CGTTTACGCA Beta

5581TGCCAAAAAG GATGCTTTAG AGACAGTGTT CTCTGCACAG ATAAGGACAA ACATTATTCA

ACGGTTTTTC CTACGAAATC TCTGTCACAA GAGACGTGTC TATTCCTGTT TGTAATAAGT

Beta

5641GAGGGAGTAC CCAGAGCTGA GACTCCTAAG CCAGTGAGTG GCACAGCATC CAGGGAGAAA

CTCCCTCATG GGTCTCGACT CTGAGGATTC GGTCACTCAC CGTGTCGTAG GTCCCTCTTT

Beta

5701TATGCTTGTC ATCACCGAAG CCTGATTCCG TAGAGCCACA CCCTGGTAAG GGCCAATCTG

ATACGAACAG TAGTGGCTTC GGACTAAGGC ATCTCGGTGT GGGACCATTC CCGGTTAGAC

Beta

176/238

5761CTCACACAGG ATAGAGAGGG CAGGAGCCAG GGCAGAGCAT ATAAGGTGAG GTAGGATCAG

GAGTGTGTCC TATCTCTCCC GTCCTCGGTC CCGTCTCGTA TATTCCACTC CATCCTAGTC

Beta

5821TTGCTCCTCA CATTTGCTTC TGACATAGTT GTGTTGGGAG CTTGGATAGC TTGGGGGGGG

AACGAGGAGT GTAAACGAAG ACTGTATCAA CACAACCCTC GAACCTATCG AACCCCCCCC

5881GACAGCTCAG GGCTGCGATT TCGCGCCAAC TTGACGGCAA TCCTAGCGTG AAGGCTGGTA

CTGTCGAGTC CCGACGCTAA AGCGCGGTTG AACTGCCGTT AGGATCGCAC TTCCGACCAT

OptEcAFRS

5941GGATTTTATC CCTCGAGCCA CCATGGCCTC CAGCAACCTG ATCAAGCAGC TCCAGGAGAG

CCTAAAATAG GGAGCTCGGT GGTACCGGAG GTCGTTGGAC TAGTTCGTCG AGGTCCTCTC

OptEcAFRS

6001GGGCCTCGTG GCTCAGGTCA CCGACGAAGA AGCACTCGCT GAAAGACTGG CCCAGGGACC

CCCGGAGCAC CGAGTCCAGT GGCTGCTTCT TCGTGAGCGA CTTTCTGACC

GGGTCCCTGG

OptEcAFRS

6061CATTGCACTG ATCTGCGGGT TCGATCCTAC AGCCGACTCT CTCCACCTGG GTCATCTCGT

GTAACGTGAC TAGACGCCCA AGCTAGGATG TCGGCTGAGA GAGGTGGACC CAGTAGAGCA

OptEcAFRS

177/238

6121GCCACTGCTG TGTCTCAAAC GGTTTCAGCA GGCTGGCCAC AAGCCCGTCG CACTGGTGGG

CGGTGACGAC ACAGAGTTTG CCAAAGTCGT CCGACCGGTG TTCGGGCAGC

GTGACCACCC

OptEcAFRS

6181AGGTGCTACT GGGCTGATTG GCGATCCTAG TTTCAAAGCC GCAGAGCGCA AGCTCAATAC

TCCACGATGA CCCGACTAAC CGCTAGGATC AAAGTTTCGG CGTCTCGCGT TCGAGTTATG

OptEcAFRS

6241CGAGGAGACA GTGCAGGAAT GGGTCGACAA AATCCGAAAG CAGGTCGCCC CATTTCTGGA

GCTCCTCTGT CACGTCCTTA CCCAGCTGTT TTAGGCTTTC GTCCAGCGGG

GTAAAGACCT

OptEcAFRS

6301TTTCGACTGC GGAGAGAACT CAGCTATTGC CGCAAATAAC TACGATTGGT TTGGGAATAT

AAAGCTGACG CCTCTCTTGA GTCGATAACG GCGTTTATTG ATGCTAACCA

AACCCTTATA

OptEcAFRS

6361GAACGTCCTC ACTTTCCTGC GTGACATCGG TAAACATTTT TCCGTGAATC AGATGATTAA

CTTGCAGGAG TGAAAGGACG CACTGTAGCC ATTTGTAAAA AGGCACTTAG TCTACTAATT

OptEcAFRS

6421CAAGGAAGCT GTGAAGCAGA GGCTGAATAG AGAGGGCCAG GGAATCAGCT

TCACCGAATT

GTTCCTTCGA CACTTCGTCT CCGACTTATC TCTCCCGGTC CCTTAGTCGA

AGTGGCTTAA

178/238

OptEcAFRS

6481TTCTTATAAT CTCCTGCAGG GGTACGGTAT GGCCTGTGCA AACAAACAGT ATGGCGTCGT

AAGAATATTA GAGGACGTCC CCATGCCATA CCGGACACGT TTGTTTGTCA TACCGCAGCA

OptEcAFRS

6541GCTGCAGATT GGAGGCAGTG ATCAGTGGGG GAACATCACA TCAGGTATTG ACCTCACTCG

CGACGTCTAA CCTCCGTCAC TAGTCACCCC CTTGTAGTGT AGTCCATAAC TGGAGTGAGC

OptEcAFRS

6601GCGCCTGCAC CAGAATCAGG TCTTTGGACT CACCGTGCCC CTGATCACAA AGGCTGATGG

CGCGGACGTG GTCTTAGTCC AGAAACCTGA GTGGCACGGG GACTAGTGTT TCCGACTACC

OptEcAFRS

6661CACAAAATTT GGTAAGACCG AGGGTGGAGC CGTGTGGCTG GACCCTAAAA

AGACATCCCC GTGTTTTAAA TCTGTAGGGG	CCATTCTGGC	TCCCACCTCG GCACACCGAC OptEcAFRS	CTGGGATTTT
6721ATACAAATTC TATCAGTTTT GGATCAACAC TGCAGATGCT	GACGTCTACC
GATTCCTCAA
TATGTTTAAG	ATAGTCAAAA	CCTAGTTGTG ACGTCTACGA	CTGCAGATGG
CTAAGGAGTT		OptEcAFRS
			GAGGAAGAGG
6781GTTTTT	CACO TTTATGAGCA TTGAGGAAAT CAATGCCCTG
ATAAGAACTC
CAAAAAGTGG	AAATACTCGT	AACTCCTTTA GTTACGGGAC	CTCCTTCTCC
TATTCTTGAG		OptEcAFRS

179/238

6841TGGCAAAGCT CCCCGTGCAC AGTATGTGCT CGCCGAACAG GTCACAAGGC TGGTGCATGG

ACCGTTTCGA GGGGCACGTG TCATACACGA GCGGCTTGTC CAGTGTTCCG ACCACGTACC

OptEcAFRS

6901GGAGGAAGGT CTGCAGGCTG CCAAGAGAAT TACTGAGTGC CTCTTCAGTG GCTCACTGTC

CCTCCTTCCA GACGTCCGAC GGTTCTCTTA ATGACTCACG GAGAAGTCAC CGAGTGACAG

OptEcAFRS

6961CGCACTGAGC GAAGCTGACT TTGAGCAGCT CGCCCAGGAT GGAGTGCCTA TGGTCGAGAT

GCGTGACTCG CTTCGACTGA AACTCGTCGA GCGGGTCCTA CCTCACGGAT ACCAGCTCTA

OptEcAFRS

7021GGAAAAAGGC GCAGACCTGA TGCAGGCTCT CGTGGATTCT GAGCTGCAGC CAAGTCGGGG

CCTTTTTCCG CGTCTGGACT ACGTCCGAGA GCACCTAAGA CTCGACGTCG GTTCAGCCCC

OptEcAFRS

7081GCAGGCCCGC AAGACCATCG CATCAAATGC TATTACAATC AACGGTGAAA AACAGTCCGA

CGTCCGGGCG TTCTGGTAGC GTAGTTTACG ATAATGTTAG TTGCCACTTT TTGTCAGGCT

OptEcAFRS

7141CCCCGAGTAC TTCTTTAAGG AAGAGGATCG ACTGTTCGGA CGTTTTACCC TCCTGAGGAG

GGGGCTCATG AAGAAATTCC TTCTCCTAGC TGACAAGCCT GCAAAATGGG AGGACTCCTC

OptEcAFRS IRES

180/238

7201AGGCAAAAAG AATTATTGTC TGATTTGCTG GAAGTGATCT AGAGGCCGCG CAGTTAACGC

TCCGTTTTTC TTAATAACAG ACTAAACGAC CTTCACTAGA TCTCCGGCGC GTCAATTGCG

IRES

7261CGCCCCTCTC CCTCCCCCCC CCTAACGTTA CTGGCCGAAG CCGCTTGGAA TAAGGCCGGT

GCGGGGAGAG GGAGGGGGGG GGATTGCAAT GACCGGCTTC GGCGAACCTT ATTCCGGCCA

IRES

7321GTGCGTTTGT CTATATGTTA TATTCCACCA TATTGCCGTC TATTGGCAAT GTGAGGGCCC

CACGCAAACA GATATACAAT ATAAGGTGGT ATAACGGCAG ATAACCGTTA CACTCCCGGG

IRES

7381GGAAACCTGG CCCTGTCTTC TTGACGAGCA TTCCTAGGGG TCTTTCCCCT CTCGCCAAAG

CCTTTGGACC GGGACAGAAG AACTGCTCGT AAGGATCCCC AGAAAGGGGA GAGCGGTTTC

IRES

7441GAATGCAAGG TCTGTTGAAT GTCGTGAAGG AAGCAGTTCC TCTGGAAGCT TCTTGAAGAC

CTTACGTTCC AGACAACTTA CAGCACTTCC TTCGTCAAGG AGACCTTCGA AGAACTTCTG

IRES

7501AAACAACGTC TGTAGCGACC CTTTGCAGGC AGCGGAACCC CCCACCTGGC GACAGGTGCC

TTTGTTGCAG ACATCGCTGG GAAACGTCCG TCGCCTTGGG GGGTGGACCG CTGTCCACGG

IRES

181/238

7561TCTGCGGCCA AAAGCCACGT GTATAAAATA CACCTGCAAA GGCGGCACAA CCCCAGTGCG

AGACGCCGGT TTTCGGTGCA CATATTTTAT GTGGACGTTT CCGCCGTGTT GGGGTCACGC

IRES

7621ACGTTGTGAG TTGGATAGTT GTGGAAAGAG TCAAATGGCT CTCCTCAAGC GTATTCAACA

TGCAACACTC AACCTATCAA CACCTTTCTC AGTTTACCGA GAGGAGTTCG CATAAGTTGT

IRES

7681AGGGGCTGAA GGATGCCCAG AAGGTACCCC ATTGTATGGG ATCTGATCTG GGGCCTCGGT

TCCCCGACTT CCTACGGGTC TTCCATGGGG TAACATACCC TAGACTAGAC CCCGGAGCCA

IRES

7741ACACATGCTT TACATGTGTT TAGTCGAGGT TAAAAAAACG TCTAGGCCCC CCGAACCACG

TGTGTACGAA ATGTACACAA ATCAGCTCCA ΑΤΙ ITTTTGC AGATCCGGGG GGCTTGGTGC

IRES

7801GGGACGTGGT ATTCCTTTGA AAAACACGAT GATAATATGG CCACACCCGT CCGAGATCAC

CCCTGCACCA TAAGGAAACT TTTTGTGCTA CTATTATACC GGTGTGGGCA GGCTCTAGTG

DHFR

7861CCTCGAGCCA CCATGGTTCG ACCATTGAAC TGCATCGTCG CCGTGTCCCA AAATATGGGG

GGAGCTCGGT GGTACCAAGC TGGTAACTTG ACGTAGCAGC GGCACAGGGT TTTATACCCC

DHFR

182/238

7921ATTGGCAAGA ACGGAGACCT ACCCTGGCCT CCGCTCAGGA ACGAGTTCAA GTACTTCCAA

TAACCGTTCT TGCCTCTGGA TGGGACCGGA GGCGAGTCCT TGCTCAAGTT CATGAAGGTT

DHFR

7981AGAATGACCA CAACCTCTTC AGTGGAAGGT AAACAGAATC TGGTGATTAT GGGTAGGAAA

TCTTACTGGT GTTGGAGAAG TCACCTTCCA TTTGTCTTAG ACCACTAATA CCCATCCTTT

DHFR

8041ACCTGGTTCT CCATTCCTGA GAAGAATCGA CCTTTAAAGG ACAGAATTAA TATAGTTCTC

TGGACCAAGA GGTAAGGACT CTTCTTAGCT GGAAATTTCC TGTCTTAATT ATATCAAGAG

DHFR

8101AGTAGAGAAC TCAAAGAACC ACCACGAGGA GCTCATTTTC TTGCCAAAAG TTTGGATGAT

TCATCTCTTG AGTTTCTTGG TGGTGCTCCT CGAGTAAAAG AACGGTTTTC AAACCTACTA

DHFR

8161GCCTTAAGAC TTATTGAACA ACCGGAATTG GCAAGTAAAG TAGACATGGT TTGGATAGTC

CGGAATTCTG AATAACTTGT TGGCCTTAAC CGTTCATTTC ATCTGTACCA AACCTATCAG

DHFR

8221GGAGGCAGTT CTGTTTACCA GGAAGCCATG AATCAACCAG GCCACCTCAG ACTCTTTGTG

CCTCCGTCAA GACAAATGGT CCTTCGGTAC TTAGTTGGTC CGGTGGAGTC TGAGAAACAC

DHFR

8281ACAAGGATCA TGCAGGAATT TGAAAGTGAC ACGTTTTTCC CAGAAATTGA

183/238

TTTGGGGAAA

TGTTCCTAGT ACGTCCTTAA ACTTTCACTG TGCAAAAAGG GTCTTTAACT

AAACCCCTTT

DHFR

8341TATAAACTTC TCCCAGAATA CCCAGGCGTC CTCTCTGAGG TCCAGGAGGA AAAAGGCATC

ATATTTGAAG AGGGTCTTAT GGGTCCGCAG GAGAGACTCC AGGTCCTCCT TTTTCCGTAG

DHFR IRES

8401AAGTATAAGT TTGAAGTCTA CGAGAAGAAA GACTAATCTA GAGGCCGCGC ACTTAACGCC

TTCATATTCA AACTTCAGAT GCTCTTCTTT CTGATTAGAT CTCCGGCGCG TGAATTGCGG

IRES

8461GCCCCTCTCC CTCCCCCCCC CCTAACGTTA CTGGCCGAAG CCGCTTGGAA TAAGGCCGGT

CGGGGAGAGG GAGGGGGGGG GGATTGCAAT GACCGGCTTC GGCGAACCTT ATTCCGGCCA

IRES

8521GTGCGTTTGT CTATATGTTA TTTTCCACCA TATTGCCGTC TTTTGGCAAT GTGAGGGCCC

CACGCAAACA GATATACAAT AAAAGGTGGT ATAACGGCAG AAAACCGTTA CACTCCCGGG

IRES

8581GGAAACCTGG CCCTGTCTTC TTGACGAGCA TTCCTAGGGG TCTTTCCCCT CTCGCCAAAG

CCTTTGGACC GGGACAGAAG AACTGCTCGT AAGGATCCCC AGAAAGGGGA GAGCGGTTTC

IRES

8641GAATGCAAGG TCTGTTGAAT GTCGTGAAGG AAGCAGTTCC TCTGGAAGCT

TCTTGAAGAC

184/238

CTTACGTTCC AGAACTTCTG	AGACAACTTA	CAGCACTTCC IRES	TTCGTCAAGG	AGACCTTCGA
8701AAACAACGTC TGTAGCGACC CTTTGCAGGC AGCGGAACCC	CCCACCTGGC
GACAGGTGCC
TTTGTTGCAG	ACATCGCTGG	GAAACGTCCG	TCGCCTTGGG	GGGTGGACCG
CTGTCCACGG		IRES
8761TCTGCGGCCA AAAGCCACGT GTATAAGATA CACCTGCAAA	GGCGGCACAA
CCCCAGTGCC
AGACGCCGGT	TTTCGGTGCA	CATATTCTAT	GTGGACGTTT	CCGCCGTGTT
GGGGTCACGG		IRES
8821ACGTTGTGAG TTGGATAGTT GTGGAAAGAG TCAAATGGCT	CTCCTCAAGC
GTATTCAACA
TGCAACACTC	AACCTATCAA	CACCTTTCTC	AGTTTACCGA	GAGGAGTTCG

CATAAGTTGT

IRES

8881AGGGGCTGAA GGATGCCCAG AAGGTACCCC ATTGTATGGG ATCTGATCTG GGGCCTCGGT

TCCCCGACTT CCTACGGGTC TTCCATGGGG TAACATACCC TAGACTAGAC CCCGGAGCCA

IRES

8941ACACATGCTT TACATGTGTT TAGTCGAGGT TAAAAAAACG TCTAGGCCCC CCGAACCACG

TGTGTACGAA ATGTACACAA ATCAGCTCCA ATTTTTTTGC AGATCCGGGG

GGCTTGGTGC

IRES

Neo

9001GGGACGTGGT TTTCCTTTGA AAAACACGAT GATAATATGG CCACAAGATC

185/238

TATGCTTGAA

CCCTGCACCA AAAGGAAACT TTTTGTGCTA CTATTATACC GGTGTTCTAG

ATACGAACTT

Neo

9061CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC

GTTCTACCTA ACGTGCGTCC AAGAGGCCGG CGAACCCACC TCTCCGATAA GCCGATACTG

Neo

9121TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG

AUUUü I ϋ I I ü I U I I I AUUU üAUbAdAU I A UIjOUIjIjUACA AGGCCGACAG TCGCGTCCCC

Neo

9181CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAGGACGAG

GCGGGCCAAG AAAAACAGTT CTGGCTGGAC AGGCCACGGG ACTTACTTGA CGTCCTGCTC

Neo

9241GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT

CGTCGCGCCG ATAGCACCGA CCGGTGCTGC CCGCAAGGAA CGCGTCGACA CGAGCTGCAA

Neo

9301GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG

CAGTGACTTC GCCCTTCCCT GACCGACGAT AACCCGCTTC ACGGCCCCGT CCTAGAGGAC

Neo

9361TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT

GCGGCGGCTG

186/238

AGTAGAGTGG AACGAGGACG GCTCTTTCAT AGGTAGTACC GACTACGTTA

CGCCGCCGAC

Neo

9421CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA

GTATGCGAAC TAGGCCGATG GACGGGTAAG CTGGTGGTTC GCTTTGTAGC GTAGCTCGCT

Neo

9481GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG

CGTGCATGAG CCTACCTTCG GCCAGAACAG CTAGTCCTAC TAGACCTGCT TCTCGTAGTC

Neo

9541GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA

CGGCGAGGAT

CCCGAGCGCG GCCGCTCCTA	GTCGGCTTGA	CAAGCGGTCC Neo	GAGTTCCGCG	CGTACGGGCT
9601CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA	TGGTGGAAAA
TGGCCGCTTT	GGGTACCGCT	ACGGACGAAC	GGCTTATAGT
GAGCAGCACT	ACCACCTTTT
ACCGGCGAAA		Neo
9661TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC	GCTATCAGGA
CATAGCGTTG
AGACCTAAGT	AGCTGACACC	GGCCGACCCA	CACCGCCTGG	CGATAGTCCT
GTATCGCAAC		Neo

9721GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACGGGTT

CCTCGTGCTT

CGATGGGCAC TATAACGACT TCTCGAACCG CCGCTTACCC GACTGGCGAA

187/238

GGAGCACGAA

Neo

9781TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT TGACGAGTTC

ATGCCATAGC GGCGAGGGCT AAGCGTCGCG TAGCGGAAGA TAGCGGAAGA

ACTGCTCAAG

Neo

9841TTCTGACAAT TGCACGGGCT ACGAGATTTC GATTCCACCG CCGCCTTCTA TGAAAGGTTG

AAGACTGTTA ACGTGCCCGA TGCTCTAAAG CTAAGGTGGC GGCGGAAGAT ACTTTCCAAC

9901GGCTTCGGAA TCGTTTTCCG GGACGCCGGC TGGATGATCC TCCAGCGCGG GGATCTCATG

CCGAAGCCTT AGCAAAAGGC CCTGCGGCCG ACCTACTAGG AGGTCGCGCC CCTAGAGTAC

SV40 PolyA

9961CTGGAGTTCT TCGCCCACCC CAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC

GACCTCAAGA AGCGGGTGGG GTTGAACAAA TAACGTCGAA TATTACCAAT GTTTATTTCG

SV40 PolyA

10021AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG

TTATCGTAGT GTTTAAAGTG TTTATTTCGT AAAAAAAGTG ACGTAAGATC AACACCAAAC

SV40 PolyA

10081TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC GGTTACCCCC GTCCGACATG TGAGCAAAAG

AGGTTTGAGT AGTTACATAG AATAGTACAG CCAATGGGGG CAGGCTGTAC ACTCGTTTTC pUC Ori

188/238

10141GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCG ΓΤΤΊ IC CATAGGCTCC

CGGTCGTTTT CCGGTCCTTG GCAITTI ICC GGCGCAACGA CCGCAAAAAG GTATCCGAGG pUC Ori

10201GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG

CGGGGGGACT GCTCGTAGTG TTTTTAGCTG CGAGTTCAGT CTCCACCGCT TTGGGCTGTC pUC Ori

10261GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA

CTGATATTTC TATGGTCCGC AAAGGGGGAC CTTCGAGGGA GCACGCGAGA GGACAAGGCT pUC Ori

10321CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC

GGGACGGCGA ATGGCCTATG GACAGGCGGA AAGAGGGAAG CCCTTCGCAC CGCGAAAGAG pUC Ori

10381ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG

TATCGAGTGC GACATCCATA GAGTCAAGCC ACATCCAGCA AGCGAGGTTC

GACCCGACAC pUC Ori

10441TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT

ACGTGCTTGG GGGGCAAGTC GGGCTGGCGA CGCGGAATAG GCCATTGATA GCAGAACTCA pUC Ori

10501CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC

189/238

AGGATTAGCA

GGTTGGGCCA TTCTGTGCTG AATAGCGGTG ACCGTCGTCG GTGACCATTG TCCTAATCGT pUC Ori

10561GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA

CTCGCTCCAT ACATCCGCCA CGATGTCTCA AGAACTTCAC CACCGGATTG

ATGCCGATGT pUC Ori

10621CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG

GATCTTCTTG TCATAAACCA TAGACGCGAG ACGACTTCGG TCAATGGAAG CCTTTTTCTC pUC Ori

10681TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA

AACCATCGAG AACTAGGCCG TTTGTTTGGT GGCGACCATC GCCACCAAAA AAACAAACGT pUC Ori

10741AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG

TCGTCGTCTA ATGCGCGTCT TTTTTTCCTA GAGTTCTTCT AGGAAACTAG AAAAGATGCC pUC Ori

10801GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA

CCAGACTGCG AGTCACCTTG CTTTTGAGTG CAATTCCCTA AAACCAGTAC TCTAATAGTT

10861AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA

190/238

TTTCCTAGAA GTGGATCTAG GAAAATTTAA TTTTTACTTC AAAATTTAGT TAGATTTCAT 10921TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG

ATATACTCAT TTGAACCAGA CTGTCAATGG TTACGAATTA GTCACTCCGT GGATAGAGTC

Amp

10981CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA

GCTAGACAGA TAAAGCAAGT AGGTATCAAC GGACTGAGGG GCAGCACATC TATTGATGCT

Amp

11041TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC

ATGCCCTCCC GAATGGTAGA CCGGGGTCAC GACGTTACTA TGGCGCTCTG GGTGCGAGTG

Amp

11101CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC

GCCGAGGTCT AAATAGTCGT TATTTGGTCG GTCGGCCTTC CCGGCTCGCG TCTTCACCAG

Amp

11161CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA

GACGTTGAAA TAGGCGGAGG TAGGTCAGAT AATTAACAAC GGCCCTTCGA TCTCATTCAT

Amp

11221GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC

CAAGCGGTCA ATTATCAAAC GCGTTGCAAC AACGGTAACG ATGTCCGTAG CACCACAGTG

191/238

Amp

11281GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG

CGAGTTACAT

CGAGCAGCAA ACCATACCGA AGTAAGTCGA GGCCAAGGGT TGCTAGTTCC

GCTCAATGTA

Amp 11341GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA
CTAGGGGGTA CAACAGTCTT	CAACACGTTT	TTTCGCCAAT	CGAGGAAGCC	AGGAGGCTAG
Amp 11401GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC	ACTGCATAAT
TCTCTTACTG CATTCAACCG	GCGTCACAAT	AGTGAGTACC	AATACCGTCG	TGACGTATTA
AGAGAATGAC

Amp

11461TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG

AGTACGGTAG GCATTCTACG AAAAGACACT GACCACTCAT GAGTTGGTTC AGTAAGACTC

Amp

11521AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC

TTATCACATA CGCCGCTGGC TCAACGAGAA CGGGCCGCAG TTATGCCCTA TTATGGCGCG

Amp

11581CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT

GTGTATCGTC TTGAAATTTT CACGAGTAGT AACCTTTTGC AAGAAGCCCC

GCTTTTGAGA ----------------Amp

192/238

11641CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT

GTTCCTAGAA TGGCGACAAC TCTAGGTCAA GCTACATTGG GTGAGCACGT GGGTTGACTA

Amp

11701CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG

GAAGTCGTAG AAAATGAAAG TGGTCGCAAA GACCCACTCG TTTTTGTCCT TCCGTTTTAC

Amp

11761CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCC I ΓΤΊ Γ0

GGCGITTTTT CCCTTATTCC CGCTGTGCCT TTACAACTTA TGAGTATGAG AAGGAAAAAG

Amp

Amp P

11821AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA

TTATAATAAC TTCGTAAATA GTCCCAATAA CAGAGTACTC GCCTATGTAT AAACTTACAT

Amp P

11881TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG

AAATCTTTTT ATTTGTTTAT CCCCAAGGCG CGTGTAAAGG GGCTTTTCAC GGTGGACTGC

Amp P

11941TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC

ACGAGGCCCT

AGATTCTTTG GTAATAATAG TACTGTAATT GGATATTTTT ATCCGCATAG

TGCTCCGGGA

12001TTCGTC

193/238

AAGCAG

SEQ ID NO: 29 sequência de nucleotídeos da construção de supressão de expressão Nat L BB-Opti FEPO em Irwin para eritropoetina felina

1TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA

AGCGCGCAAA GCCACTACTG CCACTTTTGG AGACTGTGTA CGTCGAGGGC CTCTGCCAGT

61CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG

GTCGAACAGA CATTCGCCTA CGGCCCTCGT CTGTTCGGGC AGTCCCGCGC AGTCGCCCAC

121TTGGCGGGTG τπαηηηητηη ΟΤΤΛΛΟΤΛΤΟ OOCOATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC

AACCGCCCAC AGCCCCGACC GAATTGATAC GCCGTAGTCT CGTCTAACAT GACTCTCACG

181ACCATATGCC CGTCCGCGTA CCGGCGCGCC GGATGCCAAT CGATGAATTC CGGTGTGAAA

TGGTATACGG GCAGGCGCAT GGCCGCGCGG CCTACGGTTA GCTACTTAAG GCCACACTTT

241TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC

ATGGCGTGTC TACGCATTCC TCTTTTATGG CGTAGTCCGC GGTAAGCGGT AAGTCCGACG

301GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG

CGTTGACAAC CCTTCCCGCT AGCCACGCCC GGAGAAGCGA TAATGCGGTC GACCGCTTTC

361GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG TCACGACGTT

CCCCTACACG ACGTTCCGCT AATTCAACCC ATTGCGGTCC CAAAAGGGTC AGTGCTGCAA tRNA

H1

194/238

421GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGATGCATC CATCAATTCA TATTTGCATG TCGCTATGTG

CATTTTGCTG CCGGTCACTT AACTACGTAG GTAGTTAAGT ATAAACGTAC AGCGATACAC tRNA

H1
481TTCTGGGAAA TCACCATAAA CGTGAAATGT CTTTGGATTT	GGGAATCTTA CCCTTAGAAT
TAAGTTCTGT AAGACCCTTT ATTCAAGACA	AGTGGTATTT GCACTTTACA GAAACCTAAA tRNA
H1	Hyb1 tRNA

541ATGAGACCAC TCGGATCCGG TGGGGTAGCG AAGTGGCTAA ACGCGGCGGA CTCTAAATCC

TACTCTGGTG AGCCTAGGCC ACCCCATCGC TTCACCGATT TGCGCCGCCT GAGATTTAGG

Hyb1 tRNA tRNA

Term

601GCTCCCTTTG GGTTCGGCGG TTCGAATCCG TCCCCCACCA TTTTTTGGAA CCTAGGGAAT

CGAGGGAAAC CCAAGCCGCC AAGCTTAGGC AGGGGGTGGT AAAAAACCTT GGATCCCTTA

661TCCGGTGTGA AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCCATTCGC

AGGCCACACT TTATGGCGTG TCTACGCATT CCTCTTTTAT GGCGTAGTCC GCGGTAAGCG

721CATTCAGGGT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCG CTATTACGCC

GTAAGTCCGA CGCGTTGACA ACCCTTCCCG CTAGCCACGC CCGGAGAAGC

195/238

GATAATGCGG

781AGCTGGCGAA AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA

GGGTTTTCCC

TCGACCGCTT TCCCCCTACA CGACGTTCCG CTAATTCAAC CCATTGCGGT

CCCAAAAGGG tRNA

H1

841AGTCACGACG TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AATTGATGCA TCCATCAATT

CATATTTGCA

TCAGTGCTGC GTATAAACGT	AACATTTTGC TGCCGGTCAC tRNA	TTAACTACGT	AGGTAGTTAA
H1
901TGTCGCTATG TGTTCTGGGA AATCACCATA AACGTGAAAT	GTCTTTGGAT
TTGGGAATCT
ACAGCGATAC	ACAAGACCCT TTAGTGGTAT	TTGCACTTTA	CAGAAACCTA
AACCCTTAGA	tRNA
H1	Hyb1 tRNA
961TATAAGTTCT GTATGAGACC ACTCGGATCC	GGTGGGGTAG	CGAAGTGGCT
AAACGCGGCG
ATATTCAAGA	CATACTCTGG TGAGCCTAGG	CCACCCCATC	GCTTCACCGA
TTTGCGCCGC	Term
	tRNA

Hyb1 tRNA

1021GACTCTAAAT CCGCTCCCTT TGGGTTCGGC GGTTCGAATC CGTCCCCCAC

CATTTTTTGG

196/238

CTGAGATTTA GGCGAGGGAA ACCCAAGCCG CCAAGCTTAG GCAGGGGGTG GTAAAAAACC

1081AAGACGTCGA ATTCCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA

TTCTGCAGCT TAAGGCCACA CTTTATGGCG TGTCTACGCA TTCCTCTTTT ATGGCGTAGT

1141GGCGCCATTC GCCATTCAGG CTGCGCAACT GTTGGGAAGG GCGATCGGTG CGGGCCTCTT

CCGCGGTAAG CGGTAAGTCC GACGCGTTGA CAACCCTTCC CGCTAGCCAC GCCCGGAGAA

1201CGCTATTACG CCAGCTGGCG AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCGATTAAGT TGGGTAACGC

GCGATAATGC GGTCGACCGC TTTCCCCCTA CACGACGTTC CGCTAATTCA

ACCCATTGCG

1261CAGGGTTTTC CCAGTCACGA CGTTGTAAAA CGACGGCCAG TGAATTGATG CATCCATCAA

GTCCCAAAAG GGTCAGTGCT GCAACATTTT GCTGCCGGTC ACTTAACTAC GTAGGTAGTT tRNA

H1

1321TTCATATTTG CATGTCGCTA TGTGTTCTGG GAAATCACCA TAAACGTGAA ATGTCTTTGG

AAGTATAAAC GTACAGCGAT ACACAAGACC CTTTAGTGGT ATTTGCACTT TACAGAAACC tRNA

H1 Hyb1 tRNA

1381ATTTGGGAAT CTTATAAGTT CTGTATGAGA CCACTCGGAT CCGGTGGGGT AGCGAAGTGG

TAAACCCTTA GAATATTCAA GACATACTCT GGTGAGCCTA GGCCACCCCA TCGCTTCACC tRNA

Hyb1 tRNA

197/238

1441CTAAACGCGG CGGACTCTAA ATCCGCTCCC TTTGGGTTCG GCGGTTCGAA TCCGTCCCCC

GATTTGCGCC GCCTGAGATT TAGGCGAGGG AAACCCAAGC CGCCAAGCTT AGGCAGGGGG

Term tRNA

Hyb1 tRNA

1501ACCATTTTTT GGAACATATG GAATTCCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA

TGGTAAAAAA CCTTGTATAC CTTAAGGCCA CACTTTATGG CGTGTCTACG CATTCCTCTT

1561AATACCGCAT CAGGCGCCAT TCGCCATTCA GGCTGCGCAA CTGTTGGGAA GGGCGATCGG

TTATGGCGTA GTCCGCGGTA AGCGGTAAGT CCGACGCGIT GACAACCCTT CCCGCTAGCC

1621TGCGGGCCTC TTCGCTATTA CGCCAGCTGG CGAAAGGGGG ATGTGCTGCA AGGCGATTAA

ACGCCCGGAG AAGCGATAAT GCGGTCGACC GCTTTCCCCC TACACGACGT TCCGCTAATT

1681GTTGGGTAAC GCCAGGGTTT TCCCAGTCAC GACGTTGTAA AACGACGGCC AGTGAATTGA

CAACCCATTG CGGTCCCAAA AGGGTCAGTG CTGCAACATT TTGCTGCCGG TCACTTAACT tRNA

H1

1741TGCATCCATC AATTCATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG

ACGTAGGTAG TTAAGTATAA ACGTACAGCG ATACACAAGA CCCTTTAGTG GTATTTGCAC tRNA

198/238

H1 Hyb1 tRNA

1801AAATGTCTTT GGATTTGGGA ATCTTATAAG TTCTGTATGA GACCACTCGG ATCCGGTGGG

TTTACAGAAA CCTAAACCCT TAGAATATTC AAGACATACT CTGGTGAGCC TAGGCCACCC tRNA

Hyb1 tRNA

1861GTAGCGAAGT GGCTAAACGC GGCGGACTCT AAATCCGCTC CCTTTGGGTT CGGCGGTTCG

CATCGCTTCA CCGATTTGCG CCGCCTGAGA TTTAGGCGAG GGAAACCCAA GCCGCCAAGC

Term tRNA

Hyb1 tRNA SVO

1921AATCCGTCCC CCACCATTTT TTGGAACTTA ATTAAGTACG GGCCTCCAAA AAAGCCTCCT

TTAGGCAGGG GGTGGTAAAA AACCTTGAAT TAATTCATGC CCGGAGGTTT TTTCGGAGGA

SVO

1981CACTACTTCT GGAATAGCTC AGAGGCAGAG GCGGCCTCGG CCTCTGCATA

AATAAAAAAA

GTGATGAAGA CCTTATCGAG TCTCCGTCTC CGCCGGAGCC GGAGACGTAT

SVO

2041ATTAGTCAGC CATGGGGCGG AGAATGGGCG GAACTGGGCG GAGTTAGGGG

CGGGATGGGC

TAATCAGTCG GTACCCCGCC TCTTACCCGC CTTGACCCGC CTCAATGGGG

GCCCTACCCG

SVO

199/238

2101GGAGTTAGGG GCGGGACTAT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG CATACTTCTG

CCTCAATCCC CGCCCTGATA CCAACGACTG ATTAACTCTA CGTACGAAAC GTATGAAGAC

SVO

2161CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CTGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT

GGACGACCCC TCGGACCCCT GAAAGGTGTG GACCAACGAC TGATTAACTC TACGTACGAA

SVO CMV

9991τηΓ.ΔΤΔΓ.ΤΤΠ ΤΠΓ.ΩΩΓϊΩΠΠΔ GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT TAGTTCATAG

ACGTATGAAG ACGGGCGCCT CAATAATTAT CATTAGTTAA TGCCCCAGTA ATCAAGTATC

CMV

2281CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG

GCTGACCGCC

GGGTATATAC CGACTGGCGG	CTCAAGGCGC CMV	AATGTATTGA	ATGCCATTTA	CCGGGCGGAC
2341CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT	CCCATAGTAA
CGCCAATAGG
GTTGCTGGGG	GCGGGTAACT	GCAGTTATTA	CTGCATACAA	GGGTATCATT
GCGGTTATCC	CMV
2401GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGAGTA TTTACGGTAA	ACTGCCCACT
TGGCAGTACA
CTGAAAGGTA	ACTGCAGTTA	CCCACCTCAT	AAATGCCATT	TGACGGGTGA
ACCGTCATGT	CMV

200/238

2461TCAAGTGTAT CATATGCCAA GTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC

AGTTCACATA GTATACGGTT CATGCGGGGG ATAACTGCAG TTACTGCCAT TTACCGGGCG

CMV

2521CTGGCATTAT GCCCAGTACA TGACCTTATG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT ACATCTACGT

GACCGTAATA CGGGTCATGT ACTGGAATAC CCTGAAAGGA TGAACCGTCA TGTAGATGCA

CMV

2581ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACATCAATG GGCGTGGATA

TAATCAGTAG CGATAATGGT ACCACTACGC CAAAACCGTC ATGTAGTTAC CCGCACCTAT

CMV

2641GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGCCT CCACCCCATT GACGTCAATG GGAGTTTGTT

CGCCAAACTG AGTGCCCCTA AAGGTTCGGA GGTGGGGTAA CTGCAGTTAC CCTCAAACAA

CMV

2701TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCC CATTGACGCA

AACCGTGGTT TTAGTTGCCC TGAAAGGTTT TACAGCATTG TTGAGGCGGG GTAACTGCGT

CMV

2761AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCTCT GGCTAACTAG

TTACCCGCCA TCCGCACATG CCACCCTCCA GATATATTCG TCTCGAGAGA CCGATTGATC

CMV NatL

2821AGAACCCACT GCTTACTGGC TTATCGAAAT TACTAGTCCA CCATGGGGTC

201/238

GTGCGAATGT

TCTTGGGTGA CGAATGACCG AATAGCTTTA ATGATCAGGT GGTACCCCAG

CACGCTTACA

Nat L

2881CCTGCCCTGC TGCTTCTGCT ATCTTTGCTG CTGCTTCCCC TGGGCCTCCC AGTCCTGGGC

GGACGGGACG ACGAAGACGA TAGAAACGAC GACGAAGGGG ACCCGGAGGG TCAGGACCCG

BB-Opti FEPO

AlaProProArg LeulleCys AspSerArg ValLeuGluArg TyrlIeLeu GluAlaArg

2941GCCCCCCCTC GCCTCATCTG TGACAGCCGA GTCCTGGAGA GGTACATTCT GGAGGCCAGG

CGGGGGGGAG CGGAGTAGAC ACTGTCGGCT CAGGACCTCT CCATGTAAGA CCTCCGGTCC

BB-Opti FEPO

GluAlaGluAsn ValThrMet GlyCysAla GluGlyCysSer PheSerGIu AsnIleThr

3001GAGGCCGAAA ATGTGACCAT GGGCTGCGCT GAAGGCTGCA GCTTCAGTGA GAATATCACC

CTCCGGCTTT TACACTGGTA CCCGACGCGA CTTCCGACGT CGAAGTCACT CTTATAGTGG

BB-Opti FEPO

VaIProAspThr LysValAsn PheTyrThr TrpLysArgMet AspValGIy GlnGInAla

3061GTTCCGGACA CCAAGGTCAA CTTCTATACC TGGAAGAGGA TGGACGTCGG GCAGCAGGCT

CAAGGCCTGT GGTTCCAGTT GAAGATATGG ACCTTCTCCT ACCTGCAGCC CGTCGTCCGA

BB-Opti FEPO

ValGIuValTrp GlnGlyLeu AlaLeuLeu SerGIuAlalle LeuArgGly GlnAlaLeu

3121GTGGAAGTCT GGCAGGGCCT CGCCCTCCTC AGCGAAGCCA TCCTGCGGGG

CCAGGCCCTG

CACCTTCAGA CCGTCCCGGA GCGGGAGGAG TCGCTTCGGT AGGACGCCCC

GGTCCGGGAC

202/238

BB-Opti FEPO

LeuAlaAsnSer SerGInPro SerGIuThr LeuGInLeuHis ValAspLys AlaValSer

3181CTGGCCAACT CCTCCCAGCC CTCTGAGACC CTGCAGCTGC ATGTCGACAA GGCCGTCAGC

GACCGGTTGA GGAGGGTCGG GAGACTCTGG GACGTCGACG TACAGCTGTT CCGGCAGTCG

BB-Opti FEPO

SerLeuArgSer LeuThrSer LeuLeuArg AlaLeuGlyAla GlnLysGlu AlaThrSer

3241AGCCTGCGCA GCCTCACCTC CCTGCTGCGC GCACTGGGAG CCCAGAAGGA AGCCACCTCC

TCGGACGCGT CGGAGTGGAG GGACGACGCG CGTGACCCTC GGGTCTTCCT TCGGTGGAGG

BB-Opti FEPO

LeuProGluAla ThrSerAla AlaProLeu ArgThrPheThr ValAspThr LeuCysLys

3301CTTCCCGAGG CAACCTCTGC CGCCCCCTTA AGAACCTTCA CTGTGGACAC TTTGTGCAAG

GAAGGGCTCC GTTGGAGACG GCGGGGGAAT TCTTGGAAGT GACACCTGTG AAACACGTTC

BB-Opti FEPO

LeuPheArgIle TyrSerAsn PheLeuArg GlyLysLeuThr LeuTyrThr GlyGluAla

3361CTTTTCCGAA TCTACTCCAA CTTCCTGCGG GGCAAGCTGA CGCTGTACAC AGGGGAGGCC

GAAAAGGCTT AGATGAGGTT GAAGGACGCC CCGTTCGACT GCGACATGTG TCCCCTCCGG

BB-Opti FEPO BGH

CysArgArgGly AspArg***

3421TGCCGAAGAG GAGACAGGTG AGCGGCCGCA TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC

TAGTTGCCAG

ACGGCTTCTC CTCTGTCCAC TCGCCGGCGT AGTCGGAGCT GACACGGAAG

ATCAACGGTC

BGH

203/238

3481CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT

GGTAGACAAC AAACGGGGAG GGGGCACGGA AGGAACTGGG ACCTTCCACG GTGAGGGTGA

BGH

3541GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT

CAGGAAAGGA TTATTTTACT CCTTTAACGT AGCGTAACAG ACTCATCCAC AGTAAGATAA

BGH

3601CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT

GACCCCCCAC CCCACCCCGT CCTGTCGTTC CCCCTCCTAA CCCTTCTGTT ATCGTCCGTA

BGH Beta

3661GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGTGT ACAGCTTTGC

CGACCCCTAC GCCACCCGAG ATACCGAAGA CTCCGCCTTT CTTGGTCACA TGTCGAAACG

Beta

3721TTCTCAATTT CTTATTTGCA TAATGAGAAA AAAAGGAAAA TTAATTTTAA CACCAATTCA

AAGAGTTAAA GAATAAACGT ATTACTCTTT TTTTCCTTTT AATTAAAATT GTGGTTAAGT

Beta

3781GTAGTTGATT GAGCAAATGC GTTGCCAAAA AGGATGCTTT AGAGACAGTG TTCTCTGCAC

CATCAACTAA CTCGTTTACG CAACGGTTTT TCCTACGAAA TCTCTGTCAC AAGAGACGTG

Beta

3841AGATAAGGAC AAACATTATT CAGAGGGAGT ACCCAGAGCT GAGACTCCTA

AGCCAGTGAG

204/238

TCTATTCCTG TTTGTAATAA GTCTCCCTCA TGGGTCTCGA CTCTGAGGAT

TCGGTCACTC

Beta

3901TGGCACAGCA TCCAGGGAGA AATATGCTTG TCATCACCGA AGCCTGATTC CGTAGAGCCA

ACCGTGTCGT AGGTCCCTCT TTATACGAAC AGTAGTGGCT TCGGACTAAG GCATCTCGGT

Beta

3961CACCCTGGTA AGGGCCAATC TGCTCACACA GGATAGAGAG GGCAGGAGCC AGGGCAGAGC

GTGGGACCAT TCCCGGTTAG ACGAGTGTGT CCTATCTCTC CCGTCCTCGG TCCCGTCTCG

Beta

4021ATATAAGGTG AGGTAGGATC AGTTGCTCCT CACATTTGCT TCTGACATAG TTGTGTTGGG

TATATTCCAC TCCATCCTAG TCAACGAGGA GTGTAAACGA AGACTGTATC

AACACAACCC

4081AGCTTGGATA GCTTGGGGGG GGGACAGCTC AGGGCTGCGA TTTCGCGCCA ACTTGACGGC

TCGAACCTAT TGAACTGCCG	CGAACCCCCC CCCTGTCGAG OptEcAFRS	TCCCGACGCT	AAAGCGCGGT
4141AATCCTAGCG TGAAGGCTGG TAGGATTTTA TCCCTCGAGC	CACCATGGCC
TCCAGCAACC
TTAGGATCGC	ACTTCCGACC ATCCTAAAAT	AGGGAGCTCG	GTGGTACCGG

AGGTCGTTGG

OptEcAFRS

4201TGATCAAGCA GCTCCAGGAG AGGGGCCTCG TGGCTCAGGT CACCGACGAA

GAAGCACTCG

ACTAGTTCGT CGAGGTCCTC TCCCCGGAGC ACCGAGTCCA GTGGCTGCTT

CTTCGTGAGC

OptEcAFRS

205/238

4261CTGAAAGACT GGCCCAGGGA CCCATTGCAC TGATCTGCGG GTTCGATCCT ACAGCCGACT

GACTTTCTGA CCGGGTCCCT GGGTAACGTG ACTAGACGCC CAAGCTAGGA TGTCGGCTGA

OptEcAFRS

4321CTCTCCACCT GGGTCATCTC GTGCCACTGC TGTGTCTCAA ACGGTTTCAG CAGGCTGGCC

GAGAGGTGGA CCCAGTAGAG CACGGTGACG ACACAGAGTT TGCCAAAGTC

GTCCGACCGG

OptEcAFRS

4381ACAAGCCCGT CGCACTGGTG GGAGGTGCTA CTGGGCTGAT TGGCGATCCT AGTTTCAAAG

TGTTCGGGCA GCGTGACCAC CCTCCACGAT GACCCGACTA ACCGCTAGGA TCAAAGTTTC

OptEcAFRS

4441CCGCAGAGCG CAAGCTCAAT ACCGAGGAGA CAGTGCAGGA ATGGGTCGAC AAAATCCGAA

GGCGTCTCGC GTTCGAGTTA TGGCTCCTCT GTCACGTCCT TACCCAGCTG TTTTAGGCTT

OptEcAFRS

4501AGCAGGTCGC CCCATTTCTG GATTTCGACT GCGGAGAGAA CTCAGCTATT GCCGCAAATA

TCGTCCAGCG GGGTAAAGAC CTAAAGCTGA CGCCTCTCTT GAGTCGATAA CGGCGTTTAT

OptEcAFRS

4561ACTACGATTG GTTTGGGAAT ATGAACGTCC TCACTTTCCT GCGTGACATC GGTAAACATT

TGATGCTAAC CAAACCCTTA TACTTGCAGG AGTGAAAGGA CGCACTGTAG

CCATTTGTAA

OptEcAFRS

206/238

4621TTTCCGTGAA TCAGATGATT AACAAGGAAG CTGTGAAGCA GAGGCTGAAT AGAGAGGGCC

AAAGGCACTT AGTCTACTAA TTGTTCCTTC GACACTTCGT CTCCGACTTA TCTCTCCCGG

OptEcAFRS

4681AGGGAATCAG CTTCACCGAA TTTTCTTATA ATCTCCTGCA GGGGTACGGT ATGGCCTGTG

TCCCTTAGTC GAAGTGGCTT AAAAGAATAT TAGAGGACGT CCCCATGCCA TACCGGACAC

OptEcAFRS

4741CAAACAAACA GTATGGCGTC GTGCTGCAGA TTGGAGGCAG TGATCAGTGG GGGAACATCA

GTTTGTTTGT CATACCGCAG CACGACGTCT AACCTCCGTC ACTAGTCACC CCCTTGTAGT

OptEcAFRS

4801CATCAGGTAT TGACCTCACT CGGCGCCTGC ACCAGAATCA GGTCTTTGGA CTCACCGTGC

GTAGTCCATA ACTGGAGTGA GCCGCGGACG TGGTCTTAGT CCAGAAACCT GAGTGGCACG

OptEcAFRS

4861CCCTGATCAC AAAGGCTGAT GGCACAAAAT TTGGTAAGAC CGAGGGTGGA GCCGTGTGGC

GGGACTAGTG TTTCCGACTA CCGTGTTTTA AACCATTCTG GCTCCCACCT CGGCACACCG

OptEcAFRS

4921TGGACCCTAA AAAGACATCC CCATACAAAT TCTATCAGTT TTGGATCAAC ACTGCAGATG

ACCTGGGATT TTTCTGTAGG GGTATGTTTA AGATAGTCAA AACCTAGTTG TGACGTCTAC

OptEcAFRS

4981CTGACGTCTA CCGATTCCTC AAGTTTTTCA CCTTTATGAG CATTGAGGAA

207/238

ATCAATGCCC

GACTGCAGAT GGCTAAGGAG TTCAAAAAGT GGAAATACTC GTAACTCCTT

TAGTTACGGG

OptEcAFRS

5041TGGAGGAAGA GGATAAGAAC TCTGGCAAAG CTCCCCGTGC ACAGTATGTG CTCGCCGAAC

ACCTCCTTCT CCTATTCTTG AGACCGTTTC GAGGGGCACG TGTCATACAC GAGCGGCTTG

OptEcAFRS

5101AGGTCACAAG GCTGGTGCAT GGGGAGGAAG GTCTGCAGGC TGCCAAGAGA ATTACTGAGT

TCCAGTGTTC CGACCACGTA CCCCTCCTTC CAGACGTCCG ACGGTTCTCT TAATGACTCA

OptEcAFRS

5161GCCTCTTCAG TGGCTCACTG TCCGCACTGA GCGAAGCTGA CTTTGAGCAG CTCGCCCAGG

CGGAGAAGTC ACCGAGTGAC AGGCGTGACT CGCTTCGACT GAAACTCGTC GAGCGGGTCC

OptEcAFRS

5221ATGGAGTGCC TATGGTCGAG ATGGAAAAAG GCGCAGACCT GATGCAGGCT CTCGTGGATT

TACCTCACGG ATACCAGCTC TACCTTTTTC CGCGTCTGGA CTACGTCCGA

GAGCACCTAA

OptEcAFRS

5281CTGAGCTGCA GCCAAGTCGG GGGCAGGCCC GCAAGACCAT CGCATCAAAT GCTATTACAA

GACTCGACGT CGGTTCAGCC CCCGTCCGGG CGTTCTGGTA GCGTAGTTTA CGATAATGTT

OptEcAFRS

5341TCAACGGTGA AAAACAGTCC GACCCCGAGT ACTTCTTTAA GGAAGAGGAT CGACTGTTCG

208/238

AGTTGCCACT TTTTGTCAGG CTGGGGCTCA TGAAGAAATT CCTTCTCCTA

GCTGACAAGC

OptEcAFRS

5401GACGTTTTAC CCTCCTGAGG AGAGGCAAAA AGAATTATTG TCTGATTTGC TGGAAGTGAT

CTGCAAAATG GGAGGACTCC TCTCCGTTTT TCTTAATAAC AGACTAAACG ACCTTCACTA

IRES

5461CTAGAGGCCG CGCAGTTAAC GCCGCCCCTC TCCCTCCCCC CCCCTAACGT TACTGGCCGA

GATCTCCGGC GCGTCAATTG CGGCGGGGAG AGGGAGGGGG GGGGATTGCA ATGACCGGCT

IRES

5521AGCCGCTTGG AATAAGGCCG GTGTGCGTTT GTCTATATGT TATATTCCAC

CATATTGCCG

TCGGCGAACC GTATAACGGC	TTATTCCGGC IRES	CACACGCAAA CAGATATACA	ATATAAGGTG
5581TCTATTGGCA ATGTGAGGGC CCGGAAACCT GGCCCTGTCT	TCTTGACGAG
CATTCCTAGG
AGATAACCGT	TACACTCCCG	GGCCTTTGGA CCGGGACAGA	AGAACTGCTC
GTAAGGATCC	IRES
5641GGTCTTTCCC CTCTCGCCAA AGGAATGCAA GGTCTGTTGA	ATGTCGTGAA
GGAAGCAGTT
CCAGAAAGGG	GAGAGCGGTT	TCCTTACGTT CCAGACAACT	TACAGCACTT
CCTTCGTCAA	IRES

5701CCTCTGGAAG CTTCTTGAAG ACAAACAACG TCTGTAGCGA CCCTTTGCAG

GCAGCGGAAC

GGAGACCTTC GAAGAACTTC TGTTTGTTGC AGACATCGCT GGGAAACGTC

209/238

CGTCGCCTTG

IRES

5761CCCCCACCTG GCGACAGGTG CCTCTGCGGC CAAAAGCCAC GTGTATAAAA TACACCTGCA

GGGGGTGGAC CGCTGTCCAC GGAGACGCCG GTTTTCGGTG CACATATTTT ATGTGGACGT

IRES

5821AAGGCGGCAC AACCCCAGTG CGACGTTGTG AGTTGGATAG TTGTGGAAAG AGTCAAATGG

TTCCGCCGTG TTGGGGTCAC GCTGCAACAC TCAACCTATC AACACCTTTC TCAGTTTACC

IRES
5881CTCTCCTCAA GCGTATTCAA CAAGGGGCTG	AAGGATGCCC	AGAAGGTACC
CCATTGTATG
GAGAGGAGTT	CGCATAAGTT GTTCCCCGAC	TTCCTACGGG	TCTTCCATGG
GGTAACATAC	IRES
5941GGATCTGATC TGGGGCCTCG GTACACATGC TTTACATGTG	TTTAGTCGAG
GTTAAAAAAA
CCTAGACTAG	ACCCCGGAGC CATGTGTACG	AAATGTACAC	AAATCAGCTC
CAATTTTTTT	IRES
6001CGTCTAGGCC CCCCGAACCA CGGGGACGTG GTATTCCTTT	GAAAAACACG
ATGATAATAT	GGGGCTTGGT GCCCCTGCAC	CATAAGGAAA
GCAGATCCGG	CTTTTTGTGC
TACTATTATA
IRES	DHFR
6061GGCCACACCC GTCCGAGATC ACCCTCGAGC CACCATGGTT	CGACCATTGA
ACTGCATCGT
CCGGTGTGGG	CAGGCTCTAG TGGGAGCTCG	GTGGTACCAA	GCTGGTAACT
TGACGTAGCA

210/238

DHFR

6121CGCCGTGTCC CAAAATATGG GGATTGGCAA GAACGGAGAC CTACCCTGGC
CTCCGCTCAG GCGGCACAGG GAGGCGAGTC	GTTTTATACC DHFR	CCTAACCGTT CTTGCCTCTG	GATGGGACCG
6181GAACGAGTTC AAGTACTTCC AAAGAATGAC	CACAACCTCT	TCAGTGGAAG
GTAAACAGAA
CTTGCTCAAG	TTCATGAAGG	TTTCTTACTG GTGTTGGAGA	AGTCACCTTC
CATTTGTCTT	DHFR
6241TCTGGTGATT ATGGGTAGGA AAACCTGGTT	CTCCATTCCT	GAGAAGAATC
GACCTTTAAA
AGACCACTAA	TACCCATCCT	TTTGGACCAA GAGGTAAGGA	CTCTTCTTAG
CTGGAAATTT	DHFR
63O1GGACAGAATT AATATAGTTC TCAGTAGAGA	ACTCAAAGAA	CCACCACGAG
GAGCTCATTT
CCTGTCTTAA	TTATATCAAG	AGTCATCTCT TGAGTTTCTT	GGTGGTGCTC
CTCGAGTAAA	DHFR
6361TCTTGCCAAA AGTTTGGATG ATGCCTTAAG	ACTTATTGAA	CAACCGGAAT
TGGCAAGTAA
AGAACGGTTT	TCAAACCTAC	TACGGAATTC	TGAATAACTT	GTTGGCCTTA
ACCGTTCATT	DHFR

6421AGTAGACATG GTTTGGATAG TCGGAGGCAG TTCTGTTTAC CAGGAAGCCA

TGAATCAACC

TCATCTGTAC CAAACCTATC AGCCTCCGTC AAGACAAATG GTCCTTCGGT

ACTTAGTTGG

DHFR

211/238

6481AGGCCACCTC AGACTCTTTG TGACAAGGAT CATGCAGGAA TTTGAAAGTG ACACGTTTTT

TCCGGTGGAG TCTGAGAAAC ACTGTTCCTA GTACGTCCTT AAACTTTCAC TGTGCAAAAA

DHFR

6541CCCAGAAATT GATTTGGGGA AATATAAACT TCTCCCAGAA TACCCAGGCG TCCTCTCTGA

GGGTCTTTAA CTAAACCCCT TTATATTTGA AGAGGGTCTT ATGGGTCCGC AGGAGAGACT

DHFR

6601GGTCCAGGAG GAAAAAGGCA TCAAGTATAA GTTTGAAGTC TACGAGAAGA AAGACTAATC CCAGGTCCTC Cl I FTICCGT AGTTCATATT CAAACTTCAG ATGCTCTTCT TTCTGATTAG

6661TAGAGCCAGA TCTCCAATTG CACGGGCTAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG

ATCTCGGTCT AGAGGTTAAC GTGCCCGATG CTCTAAAGCT AAGGTGGCGG CGGAAGATAC

6721AAAGGTTGGG CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC CAGCGCGGGG

TTTCCAACCC GAAGCCTTAG CAAAAGGCCC TGCGGCCGAC CTACTAGGAG GTCGCGCCCC

SV40 PolyA

6781ATCTCATGCT GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA

TAGAGTACGA CCTCAAGAAG CGGGTGGGGT TGAACAAATA ACGTCGAATA TTACCAATGT

SV40 PolyA

6841AATAAAGCAA TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG

CATTCTAGTT

TTATTTCGTT ATCGTAGTGT TTAAAGTGTT TATTTCGTAA AAAAAGTGAC

GTAAGATCAA

212/238

SV40 PolyA

6901GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCGG TTACCCCCGT CCGACATGTG

CACCAAACAG GTTTGAGTAG TTACATAGAA TAGTACAGCC AATGGGGGCA

GGCTGTACAC pUC Ori

6961AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA

TCGTTTTCCG GTCGTTTTCC GGTCCTTGGC ATTTTTCCGG CGCAACGACC GCAAAAAGGT pUC Ori

7021TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA

GGTGGCGAAA

ATCCGAGGCG GGGGGACTGC TCGTAGTGTT TTTAGCTGCG AGTTCAGTCT

CCACCGCTTT pUC Ori

7081CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG

TGCGCTCTCC

GGGCTGTCCT GATATTTCTA TGGTCCGCAA AGGGGGACCT TCGAGGGAGC

ACGCGAGAGG pUC Ori

7141TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG

GAAGCGTGGC

ACAAGGCTGG GACGGCGAAT GGCCTATGGA CAGGCGGAAA GAGGGAAGCC

CTTCGCACCG pUC Ori

7201GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC

GCTCCAAGCT

CGAAAGAGTA TCGAGTGCGA CATCCATAGA GTCAAGCCAC ATCCAGCAAG

CGAGGTTCGA pUC Ori

213/238

7261GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG

CCCGACACAC GTGCTTGGGG GGCAAGTCGG GCTGGCGACG CGGAATAGGC CATTGATAGC pUC Ori

7321TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA

CTGGTAACAG

AGAACTCAGG TTGGGCCATT CTGTGCTGAA TAGCGGTGAC CGTCGTCGGT

GACCATTGTC pUC Ori

7381GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT

GGCCTAACTA

CTAATCGTCT CGCTCCATAC ATCCGCCACG ATGTCTCAAG AACTTCACCA

CCGGATTGAT pUC Ori

7441CGGCTACACT AGAAGAACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG

TTACCTTCGG

GCCGATGTGA TCTTCTTGTC ATAAACCATA GACGCGAGAC GACTTCGGTC

AATGGAAGCC pUC Ori

7501AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG

GTGGTTTTTT

TTTTTCTCAA CCATCGAGAA CTAGGCCGTT TGTTTGGTGG CGACCATCGC

CACCAAAAAA pUC Ori

7561TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC

CTTTGATCTT

ACAAACGTTC GTCGTCTAAT GCGCGTCTTT TTTTCCTAGA GTTCTTCTAG

GAAACTAGAA pUC Ori

7621TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT

214/238

TGGTCATGAG

AAGATGCCCC AGACTGCGAG TCACCTTGCT TTTGAGTGCA ATTCCCTAAA

ACCAGTACTC pUC Ori

7681 ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT

TAATAGTTTT TCCTAGAAGT GGATCTAGGA AAATTTAATT TTTACTTCAA AATTTAGTTA 7741CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC

GATTTCATAT ATACTCATTT GAACCAGACT GTCAATGGTT ACGAATTAGT CACTCCGTGG

Amp

7801TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG

TCGTGTAGAT

ATAGAGTCGC TAGACAGATA AAGCAAGTAG GTATCAACGG ACTGAGGGGC

AGCACATCTA

Amp 7861AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC
TTGATGCTAT GCCCTCCCGA GCGCTCTGGG	ATGGTAGACC	GGGGTCACGA	CGTTACTATG
Amp
7921ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT	AAACCAGCCA	GCCGGAAGGG
CCGAGCGCAG
TGCGAGTGGC CGAGGTCTAA	ATAGTCGTTA	TTTGGTCGGT	CGGCCTTCCC
GGCTCGCGTC
Amp
7981AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT	AATTGTTGCC
GGGAAGCTAG
TTCACCAGGA CGTTGAAATA	GGCGGAGGTA	GGTCAGATAA	TTAACAACGG
CCCTTCGATC

215/238

Amp

8041AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA

CAGGCATCGT

TCATTCATCA AGCGGTCAAT TATCAAACGC GTTGCAACAA CGGTAACGAT

GTCCGTAGCA

Amp

8101GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC

GATCAAGGCG

CCACAGTGCG AGCAGCAAAC CATACCGAAG TAAGTCGAGG CCAAGGGTTG

CTAGTTCCGC

Amp

8161AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC

CTCCGATCGT

TCAATGTACT AGGGGGTACA ACACGTTTTT TCGCCAATCG AGGAAGCCAG

GAGGCTAGCA

Amp

8221TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC

TGCATAATTC

ACAGTCTTCA TTCAACCGGC GTCACAATAG TGAGTACCAA TACCGTCGTG

ACGTATTAAG

Amp

8281TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC

AGAATGACAG TACGGTAGGC ATTCTACGAA AAGACACTGA CCACTCATGA

GTTGGTTCAG

Amp

8341ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA

TACGGGATAA

TAAGACTCTT ATCACATACG CCGCTGGCTC AACGAGAACG GGCCGCAGTT

ATGCCCTATT

Amp

216/238

8401TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG

ATGGCGCGGT GTATCGTCTT GAAATTTTCA CGAGTAGTAA CCTTTTGCAA

GAAGCCCCGC

Amp

8461AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA

CTCGTGCACC

TTTTGAGAGT TCCTAGAATG GCGACAACTC TAGGTCAAGC TACATTGGGT

GAGCACGTGG

Amp

8521CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA

AAACAGGAAG

GTTGACTAGA AGTCGTAGAA AATGAAAGTG GTCGCAAAGA CCCACTCGTT

TTTGTCCTTC

Amp

8581GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC

TCATACTCTT

CGTTTTACGG CGTTTTTTCC CTTATTCCCG CTGTGCCTTT ACAACTTATG

AGTATGAGAA

Amp

Amp P

8641CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG

GATACATATT

GGAAAAAGTT ATAATAACTT CGTAAATAGT CCCAATAACA GAGTACTCGC

CTATGTATAA

Amp P

8701TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC

GAAAAGTGCC

ACTTACATAA ATCTTTTTAT TTGTTTATCC CCAAGGCGCG TGTAAAGGGG

CTTTTCACGG

217/238

Amp P

8761ACCTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC

TGGACTGCAG ATTCTTTGGT AATAATAGTA CTGTAATTGG ATATTTTTAT

CCGCATAGTG

8821GAGGCCCTTT CGTC

CTCCGGGAAA GCAG

A transformação de E. coli com plasmídeos contendo o gene modificado de fEPO e o par de aminoacil tTRNA sintetase/tRNA ortogonal (específico para o aminoácido não codificado naturalmente desejado) possibilita a incorporação sítio-específica de aminoácido não codificado naturalmente no polipeptídeo de fEPO. A E. coli transformada, cultivada a 37 °C em meio contendo entre 0,01 - 100 mM do aminoácido não codificado naturalmente em particular, expressa fEPO modificada com alta fidelidade e eficiência. A fEPO His-íagged contendo um aminoácido não codificado naturalmente é produzida pelas células hospedeiras de E. coli na forma de corpos de inclusão ou agregados. Os agregados são solubilizados e purificados por afinidade sob condições de desnaturação em guanidina HCI 6 Μ. O renovelamento é realizado por diálise a 4 °C durante a noite em TRIS-CI 50 mM, pH 8,0, CuSO₄ 40 Mm e Sarkosyl 2% (w/v). O material é então dialisado contra TRIS-HCI 20 mM, pH 8,0, NaCI 100 mM CaCI₂ 2 mM, seguido pela remoção do His-tag. Consultar Boissel et al., (1993) 268:15983-93. Métodos para purificar fEPO são bem conhecidos no estado da técnica (Nahri et al., (1991) JBC, Vol 266, pp 23022-23026; Narhi et al., (2001) Protein Engineering, Vol14, pp 135-140; Darling et al., (2002) Biochemistry Vol 41, pp 14524-14531; Boissel et al., (1993) 268:15983-93; e WO0032772A2) e são confirmados por SDS-PAGE, análises pela técnica de Western Blotting ou espectrometria de massa com ionização por electrospray e analisador de íons tipo ion trap.

Exemplo 3

Um vetor de expressão de DNA para supressão de expressão foi construído de acordo com a invenção, expressando proteína eritropoetina felina (fEPO).

A. Construção do vetor de expressão

A construção de expressão, retratada na Figura 25, compreende oito cópias de um gene híbrido tRNA que codifica um transcrito de tRNA capaz de ser incluído com pacetilfenilalanina por sua tRNA sintetase cognata. Cada cópia do gene tRNA inclui uma região promotora H1, a sequência de tRNA e um sinal de terminação de transcrição de polimerase III.

Em seguida, os genes tRNA são posicionados em uma origem de replicação do ví218/238 rus símio SV40 (SVO), o que facilita a replicação da construção de expressão (vetor) em células COS após transfecção transitória.

Depois, é posicionado um cassete de expressão para as sequências gênicas de interesse, as quais, neste caso, representam a região de codificação de EPO felina. Primeiramente no cassete, está o promoter do citomegalovírus humano (CMV), que direciona a expressão da mensagem. A mensagem nesta construção codifica a eritropoetina felina (fEPO), a qual é sequencialmente precedida pelo peptídeo natural de sinalização (Nat L). A mensagem é seguida pelo sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH).

Posteriormente, está situado um cassete de expressão iniciando com o principal promoter de beta-globulina de camundongo (beta), situado dentro do cassete de modo a direcionar a expressão de sequências codificadoras da acetilfenilalanina tRNA sintetase otimizada de E. coli (OptEcAFRS), a dihidrofolato redutase (DHFR) murina e o gene de neomicina fosfotransferase de Salmonella (Neo), cada um separado por um sítio interna de entrada de ribossomo (IRES) derivado do genoma do vírus da encefalomiocardite. A sequência Neo é seguida pelo sinal de poliadelinação precoce do SV40 (SV).

O vetor contém também sequências necessárias para replicação em bactérias, incluindo a origem colE1 (pUC Ori) de replicação e o gene de beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina (Amp).

O EMCV é disponível comercialmente, cDNA foi comercialmente sintetizado para a região do IRES dentro do genoma viral. Amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase) daquele cDNA foi realizada para amplificar o DNA, bem como para adicionar extremidades 5' e 3' adequadas para inserção entre os domínios de codificação. O trinucleotídeo ATG na posição 834-836 (Número de acesso do Genbank: NC-001479) foi utilizado como o códon de partida para as sequências DHFR e Neo.

A literatura indica que a tradução do quadro aberto de leitura da IRES em sentido descendente seria menos eficiente do que o quadro aberto de leitura em sentido ascendente (tradução iniciada por 5' CAP), portanto, a estratégia escolhida foi posicionar os genes DHFR e Neo, após elementos independentes de IRES para prejudicar seletivamente os referidos marcadores selecionáveis dominantes, tentando-se facilitar a seleção do clone.

Duas versões do vetor de supressão de expressão foram geradas e denominadas Lucy F (Figura 25) e Irwin (Figura 26). Lucy F contém 8 cópias dos genes tRNA, um segundo IRES e o gene Neo. O gene Neo é incluído para possibilitar a seleção de plasmídeos estáveis integrados no genoma da célula por tratamento com G418. Irwin, por outro lado, contém somente 4 cópias dos genes tRNA e é desprovido do segundo IRES e Neo. Por esse motivo, Irwin é menor em tamanho e melhor adequado para expressão transitória de proteínas suprimidas para geração de níveis experimentais de produção de proteínas.

219/238

B. Expressão em células CHO

O vetor “Nat L BB-Opti FEPO em Irwin”, cujo mapa está retratado na Figura 28, e cuja sequência é apresentada na Tabela 3 contendo os elementos de supressão e codificando a proteína EPO felina, foi transfectado em células CHO-S, utilizando um protocolo de transfecção transitória. Estas transfecções foram realizadas paralelamente com fEPO do tipo selvagem e 22 variantes de fEPO, de modo que códons âmbar foram posicionados dentro da região de codificação sujeita à supressão em maneira a reter a bioatividade de fEPO e a estrutura de glicano. Os 22 variantes de fEPO incluem aqueles mostrados na Figura 30: K52, Q86, E89, E31, E21, E37, R131, K116, F133, L130, R53, Y49, T132, A1, S120, R76, P129, S36, D55, A128, E72, R163. Resultados experimentais indicam que a sequência do tipo selvagem expressa bem e que a expressão de supressão dos 22 diferentes variantes variou amplamente, porém 19 dos 22 demonstraram expressão detectável por ELISA. Dessa forma, prevê-se que expresse sequências de genes de interesse com códons âmbar de supressão, situados em uma variedade de posições.

A expressão transitória de fEPO pode ser utilizada para conciliar alguns desafios técnicos ao se produzir esta proteína, por exemplo, com ponto isoelétrico em pH torno de 4 e alta glicosilação de fEPO (mais de 40% da massa), os quais podem afetar a eficiência da conjugação e a acessibilidade em alguns sítios, portanto alternativas químicas podem ser utilizadas, bem como sistemas alternativos de expressão.

Exemplo 4

Geração de linhagens celulares resistentes a G418

A construção de supressão de expressão neste exemplo codifica a proteína EPO felina modificada com o códon âmbar, posicionado no resíduo 1 substituindo o resíduo normal, alanina. Esta construção de expressão é referida como Nat L BB-Opti FEPO em Lucy F, cujo mapa está retratado na Figura 3 e cuja sequência é apresenta na Figura 4.

Nat L BB-Opti FEPO A1 em Lucy F (contendo o códon âmbar na posição A1) foi transfectado na linhagem celular precursor CHO-DG44. As transfecções foram realizadas usando 0,5; 1 ;0 ou 2,0 ug de DNA linearizado por 4 x 10⁶ células CHO por placa de 96 cavidades. A seleção dominante de células transfectadas estavelmente foi conseguida com o marcador de resistência à neomicina, codificado pela construção de expressão, e meio (CHO-S-SFM ll+HT) contendo G418.

Células viáveis foram identificadas, expandidas para cultura sob agitação em pequena escala (50 ml), e a produtividade celular avaliada por ensaio pela técnica ELISA. Foram obtidos vários isolados de células resistentes a G418, produzindo fEPO secretada facilmente detectável. Duas em particular, 5B5 e 15B3 foram determinadas com produção de 0,07 e 0,1 mg/L em 3-4 dias, respectivamente, ou 0,3 picograma/célula/dia (pcd). A fEPO secretada foi detectada por ensaio ELISA, usando o kit StemCell EPO ELISA KIT- Imunoen220/238 saio para Eritropoetina Humana, cat ref. 01630.

Exemplo 5

A. Aumentos em expressão por amplificação genômica

O sistema de supressão de expressão Lucy F contém um cassete de expressão codificando o gene DHFR murino. Como a linhagem celular precursora CHO-DG44, utilizada para expressão, é completamente deficiente em atividade enzimática de DHFR (deleção dupla), a amplificação do gene-alvo integrado (DHFR murino) é possível por seleção de crescimento em meio contendo metotrexato (MTX). Durante esta amplificação, o gene diretamente ligado à proteína (neste exemplo, fEPO) é amplificado concomitantemente. Dessa forma, é possível isolar linhagens celulares produzindo quantidades elevadas de fEPO. O primeiro ciclo de seleção de linhagens celulares resistentes a G418 é realizado em MTX 5 nM. Produtoras com níveis mais altos (determinados por ELISA) são então identificadas e caracterizadas.

As linhagens de células resistentes a fEPO G418, 5B5 e 15B3, foram submetidas à amplificação em MTX a 5 nM. Em cada caso, os níveis de supressão de expressão são elevados após amplificação e estão listados abaixo.

TABELA 4

Linhagem celular	G418 pg/célula/dia	G418 mg/L/3-4 dias	MTX 5 nM pg/célula/dia	MTX 5 nM mg/L/3-4 dias	Vezes de aumento em pg/célula/dia
5B5	0,03	0,07	—	—
5B5-8C9	0,03	0,07	0,14	0,41	4,7
15B3	0,03	0,10	—	—
15B3-7E3	0,03	0,10	0,10	0,22	3,3

Como pode ser visto a partir da tabela acima, os níveis de expressão em amplificação em MTX a 5 nM elevaram-se aproximadamente em 3-5 vezes. Prevê-se que amplificações subsequentes em concentrações crescentes de MTX aumentem mais ainda o rendimento em produtividade.

Exemplo 6

Vinte e dois fEPO variantes foram expressas transitoriamente em células de ovário de hamster chinês. Os variantes de fEPO foram construídos em vetor de expressão, o qual contém tRNA e RS. O tipo selvagem de fEPO foi construído em outro vetor de expressão, o qual não contém tRNA e RS. Plasmídeos (fEPO variantes e do tipo selvagem) foram transfectados em células CHO com ou sem pAF, usando o método de transfecção desenvolvido pela empresa.

Método de expressão de fEPO do tipo selvagem e de variantes de fEPO

221/238

Uma solução de polietileimina (PEI), um linear de 25 kDa da Polysciences, foi preparada em 1mg/ml em água destilada, seu pH ajustado para 7,2 e submetida à filtração estéril usando filtro de 0,22 pm antes do uso.

Células CHO (Invitrogen) foram mantidas em meio CHO FreeStyle, suplementado com glutamina. Uma cultura de 30 mL foi preparada em frasco Erlenmeyer de 125 ml da Corning. As células foram semeadas em 0,5 x 6/ml dia antes da transfecção. A densidade celular foi ajustada para 1x10⁶/mL com meio de crescimento antes da transfecção. Paraacetil-fenilalanina foi adicionada em concentração de 1mM antes da transfecção. DNA, 37 pg de DNA, foi dissolvido em meio RPMI e, então, 74 pL de 1 mg/mL de solução de PEI foram adicionados no meio RPMI contendo DNA. Este foi incubado por 15 minutos. Em seguida, a mistura de DNA com PEI foi adicionada em 30 ml de cultura em frasco Erlenmeyer de 125 ml. O frasco foi então transferido para incubadora a 37 °C, depois do que o sobrenadante foi quantificado por ensaio ELISA humano, 72 horas após a transfecção. A Figura 30 mostra os níveis de supressão de fEPO variantes na presença de pAF.

Cada variante de fEPO foi suprimido em diferentes níveis, modulados pela posição de pAF. K52, Q86 e E89 não foram detectados pelo ensaio ELISA na presença de pAF. Sem pAF, os variantes de fEPO não foram detectados por ensaio ELISA. Os sobrenadantes foram também analisados por ensaio de TF-1 para função. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 30.

Exemplo 7

O ensaio de proliferação de TF-1 e ensaios de fEPO funcionais de TF-1 são mostrados nas Figuras 11-24. Células TF-1 foram semeadas em 150.000 células/ml em frasco T-75 em meio de crescimento durante a noite e, no dia do ensaio, as células foram semeadas em 20.000 células/cavidade em 50 ul de meio de ensaio (Figura 11). As células TF-1 foram adquiridas da ATCC, e a linhagem celular foi estabelecida a partir de células da medula óssea de um paciente com eritroleucemia. A linhagem celular mostra dependência de crescimento com IL-1, GMcsf, EPO e fEPO. A atividade é mensurada por proliferação de células TF-1 em resposta à fEPO. A extensão da proliferação é medida por WST-8. A divagem de sal de tetrazólio wst-8 para formazan, pela desidrogenase mitocondriana celular, é diretamente proporcional ao número de células vivas. O corante formazan, produzido por células viáveis, é quantificado medindo-se a absorvência da solução do corante a 450 nm (Figura 13, Figura 16, Figura 19, Figura 20, Figura 21). Na Figura 13, as condições foram: células TF-1 semeadas em densidades variadas de 40.000, 30.000, 20.000 e 10.000 células por cavidade. Dois tempos diferentes de incubação, 48 horas e 72 horas, foram utilizados, bem como duas diferentes concentrações de fEPO (2500 ng/mL e 500 ng/mL), dois esquemas diferentes de diluição (3x e 2,5x) e células sem nutrientes por 24 horas, bem como células sem privação de nutrientes, foram utilizados. Os resultados destes experimentos e de

222/238 ensaios funcionais são descritos e mostrados nas figuras e em suas descrições.

Exemplo 8

Purificação de variantes do tipo selvagem e do tipo para-acetilfenilalanina (pAF) de eritropoetina felina (fEPO), e conjugação seletiva de poli(etilenoglicol) com variantes pAF

A purificação de fEPO e de variantes pAF envolve concentração e diafiltração, seguido ou três etapas de cromatografia em coluna: fenilboronato, troca aniônica e interação hidrofóbica. Antes da PEGuilação, o material purificado é concentrado e trocado em tampão de PEGuilação.

UF/DF: O sobrenadante da cultura celular foi concentrado e trocado em X diavolumes de HEPES 50 mM, pH 8,5, antes que carregado para cromatografia, com sistema Slice 200 (Sartorius Stedim) conectado a uma bomba MasterFlex.

Cromatografia em fenilboronato (PB)

A cromatografia em resina de fenilboronato foi realizada em modo negativo de captura usando coluna PB ProSep, equilibrada em HEPES 50 mM, pH 8,5. O material foi coletado na lavagem em fluxo continuo (flow-through) (HEPES 50 mM, pH 8,5). As impurezas foram removidas com eluições em etapas em HEPES 50 mM, sorbitol 50 mM, pH 8,5; Tris 50 mM, ureia 6 M, pH 8,5; e ácido acético 100 mM.

O material do fluxo continuo na coluna PB foi trocado para Tris 20 mM, pH 8,0 por UF/DF em Tris 20 mM, pH 8,0, como descrito acima antes que fosse carregado para cromatografia de troca aniônica.

Cromatografia de troca aniônica (ΑΕΧ)

O material foi purificado com coluna de Alto Desempenho Q Sepharose em coluna XK 16 (GE Healthcare, Piscataway, NJ), vazão: 120 cm/h. O material foi carregado em coluna equilibrada em Tris 20 mM, pH 8.0. A eluição foi conduzida com gradiente linear AB, em que o Tampão A = Tris 20 mM, pH 8,0; Tampão B = Tris 20 mM, NaCI 500 mM, pH 8,0. Frações de volumes fixos foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE e ELISA anti-EPO.

Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)

O pool contendo fEPO, obtido em ΑΕΧ, foi diluído em sulfato de amônio 3,5 M para obter concentração final de sulfato de amônio de 1,5 Μ. O material foi carregado em resina de Fenil Sefarose de Alto Desempenho, 120 cm/h, equilibrada em Tris 20 mM, sulfato de amônio 1,5, pH 8,0. A eluição foi realizada sobre gradiente linear AB 20 CV, em que A = Tris 20 mM, sulfato de amônio 1,5, pH 8,0 e B = Tris 20 mM, etilenoglicol 50% (v/v), pH 8,0. Frações de volumes fixos foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE e ELISA anti-EPO.

PEGuilação de variantes pAF de fEPO

Frações pertinentes foram agrupadas e concentradas para ~ 5 mg/ml com coluna

VivaSpin 10 000 MWCO a 15000 x g, 10 min por rotação. A amostra foi trocada para acetato de sódio 20 mM, EDTA 1 mM, pH 4,0. A PEGuilação foi iniciada usando razão molar 12:1 de

223/238

PEG:proteína com PEG-oxima de 20 kD (Sunbright ME200-CA), e acetil-hidrazida 1% (w/v) ajustado para pH 4,0 com ácido acético. A PEGuilação foi conduzida a 28 °C por >12 horas e analisada por SDS-PAGE (Figura 31, Figura 32 e Figura 33). O Variante A1 foi PEGuilado com PEG de 30 kDa, o variante Y49 foi PEGuilado com PEG de 40 kDa, o variante R53 foi PEGuilado com PEG de 20 kDa, o variante D55 foi PEGuilado com PEG de 30 kDa e o variante P129 foi PEGuilado com PEG de 30 kDa.

Exemplo 9

Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido contendo carbonila e reação subsequente com PEG contendo aminóxi.

Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de fEPO que incorpora um aminoácido não codificado naturalmente contendo cetona, o qual é subsequentemente reagido com PEG contendo aminóxi com peso molecular (MW) de aproximadamente 5.000. Cada um dos resíduos 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127 e 128 é separadamente substituído com um aminoácido não codificado naturalmente com a seguinte estrutura:

As sequências utilizadas para incorporação sítio-específica de p-acetil-fenilalanina em fEPO estão expostas na Tabela 2, e sequências (por exemplo, muttRNA e TyrRS LW1,5 ou 6) descritas acima.

Uma vez modificada, a fEPO variante compreendendo o aminoácido contendo carbonila é reagida com um derivado de PEG contendo aminóxi da forma:

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂ onde R é metila, n é 3 e N é aproximadamente 5.000 MW. A fEPO purificada contendo p-acetilfenilalanina dissolvida em 10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, HEPES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0 ou em Acetato de Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, é reagida com excesso de 10 a 100 vezes de PEG contendo aminóxi e, então, agitada por 10-16 horas em temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475). O PEG-fEPO é então diluído em tampão apropriado para purificação imediata e análise.

Exemplo 10

Conjugação com PEG consistindo em grupo hidroxilamina ligado ao PEG através de ligação amida.

Um reagente PEG com a estrutura a seguir é acoplado a aminoácido não codificado naturalmente contendo cetona, usando o procedimento descrito nos exemplos acima:

224/238

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-O-NH₂ onde R = metila, n=4 e N é aproximadamente 20.000 MW. As condições de reação, purificação e análise são conforme descritas nos exemplos acima.

Exemplo 11

Este exemplo detalha a introdução de dois diferentes aminoácidos não codificados naturalmente em fEPO.

Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de fEPO que incorpora aminoácido não codificado naturalmente, compreendendo uma funcionalidade cetona, em duas posições entre os seguintes resíduos: N24X* e G113X*; N38X* e Q115X*; N36X* e S85X*; N36X* e A125X*; N36X* e A128X*; Q86X* e S126X*, em que X* representa um aminoácido não codificado naturalmente. O polipeptídeo de fEPO é preparado como descrito nos exemplos acima, exceto que o códon supressor é introduzido em dois diferentes sítios dentro do ácido nucléico.

Exemplo 12

Este exemplo detalha a conjugação de um polipeptídeo de fEPO com PEG contendo hidrazida e subsequente redução in situ.

Um polipeptídeo de fEPO incorporando um aminoácido contendo carbonila é preparado de acordo com o procedimento descrito nos exemplos acima. Uma vez modificado, um PEG contendo hidrazida com a estrutura seguinte é conjugado com o polipeptídeo de fEPO:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂ onde R = metila, n=2 e N = 10.000 MW e X é um grupo carbonila (C=O). A fEPO purificada contendo p-acetilfenilalanina é dissolvida entre 0,1-10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0 ou Acetato de Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, é reagida com excesso de 10 a 100 vezes de PEG contendo aminóxi, e a hidrazona correspondente é reduzida in situ por adição de NaCNBH₃1 M de estoque (Sigma Chemical, St. Louis, MO), dissolvida em H₂O para concentração final de 10-50 mM. As reações são conduzidas no escuro em temperatura de 4 °C a temperatura ambiente (RT) por 18-24 horas. As reações são interrompidas por adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) em pH em torno de 7,6 para concentração final de Tris de 50 mM, ou diluída em tampão apropriado para purificação imediata.

Exemplo 13

Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido contendo alcino em fEPO e derivatização com mPEG-azida.

Os seguintes resíduos, 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127 e 128, são, cada um, substituídos com o seguinte aminoácido não codificado naturalmente:

225/238

As sequências utilizadas para incorporação sítio-específica de p-propargil-tirosina em fEPO são muttRNA, et. al. que estão descritas nos exemplos acima. O polipeptídeo de fEPO contendo a propargil tirosina é expresso em E. coli e purificado usando as condições descritas acima.

A fEPO purificada contendo propargil-tirosina, dissolvida entre 0,1-10 mg/mL em tampão PB (fosfato de sódio 100 mM, NaCI 0,15 M, pH = 8), e excesso de 10 a 1000 vezes de PEG contendo azida é adicionado à mistura da reação. Uma quantidade catalítica de CuSO₄ e fio de Cu são, então, adicionados à mistura da reação. Depois que a mistura é incubada (incluindo, entre outros, cerca de 4 horas em temperatura ambiente ou 37 °C, ou durante a noite a 4 °C), H₂O é adicionado e a mistura é filtrada através de membrana de diálise. A amostra pode ser analisada quanto à adição, incluindo, entre outros, por procedimentos semelhantes aos descritos nos exemplos acima.

Neste Exemplo, o PEG terá seguinte estrutura:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃ onde R é metila, n é 4 e N é 10.000 MW.

Exemplo 14

Este exemplo detalha a substituição de um grande aminoácido hidrofóbico em fEPO com propargil tirosina.

Um resíduo Phe, Trp ou Tyr, presente dentro de uma das seguintes regiões de fEPO: 1-7 (N-terminal), 27-38 (região entre hélice A e hélice B), 39-41 (folha beta 1), 42-46 (região entre folha beta 1 e mini hélice B’), 47-52 (mini hélice B’), 53-54 (região entre mini hélice B’ e hélice B), 84-89 (região entre hélice B e hélice C), 114-121 (mini hélice C’), 122132 (região entre mini hélice C’ e folha beta 2), 133 - 135 (folha beta 2), 136- 137 (região entre folha beta 2 e hélice D), 162-166 (C-terminal) é substituído com o seguinte aminoácido não codificado naturalmente como descrito nos exemplos acima:

Uma vez modificado, um PEG é unido à fEPO variante, compreendendo o aminoácido contendo alcino. O PEG terá a seguinte estrutura:

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

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E procedimentos de acoplamento seguiríam aqueles descritos nos exemplos acima. O resultado é a geração de uma fEPO variante compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente que é aproximadamente isostérico com um dos grandes aminoácidos hidrofóbicos naturais e que é modificado com um derivado de PEG em um sítio diferente dentro do polipeptídeo.

Exemplo 15

Este exemplo detalha a geração de um homodímero, heterodímero, homomultímero ou heteromultímero de fEPO separado por um ou mais ligantes PEG.

A fEPO variante contendo alcino descrita nos exemplos acima é reagida com um derivado de PEG bifuncional da forma:

N₃-(CH₂)n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)n-N₃ onde n é 4 e o PEG possui MW médio de aproximadamente 5.000, para gerar o homodímero da fEPO correspondente, em que as duas moléculas de fEPO são fisicamente separadas por PEG. Em maneira análoga, um polipeptídeo de fEPO pode ser acoplado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros. O acoplamento, a purificação e as análises serão realizadas como descritos nos exemplos acima.

Exemplo 16

Este exemplo detalha o acoplamento de um grupo sacarídico à fEPO.

Um dos resíduos seguintes é substituído com o aminoácido não codificado naturalmente abaixo: 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128,129, 130 e 162, como descrito nos exemplos acima.

Uma vez modificada, a fEPO variante compreendendo o aminoácido contendo carbonila é reagida com um análogo aminóxi β-ligado de N-acetilglicosamina (GlcNAc). A fEPO variante (10 mg/mL) e o sacarídeo aminóxi (21 mM) são misturados em tampão aquoso de acetato de sódio 100 mM (pH 5,5) e incubados a 37 °C por 7 a 26 horas. Um segundo sacarídeo é enzimaticamente acoplado ao primeiro, incubando-se o conjugado sacarídeo-fEPO (5mg/mL) com UDP-galactose (16mM) e β-1,4-galacitosiltransferase (0,4 unidades/mL) em tampão HEPES 150 mM (pH 7,4) por 48 horas em temperatura ambiente (Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061).

Exemplo 17

Este exemplo detalha a geração de um antagonista PEGuilado de fEPO.

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Um dos resíduos seguintes, 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 e 162, é substituído com o seguinte aminoácido não codificado naturalmente, como descrito nos exemplos acima.

Uma vez modificada, a fEPO variante compreendendo o aminoácido contendo carbonila será reagida com um derivado de PEG contendo aminóxido da forma:

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂ onde R é metila, n é 4 e N é 20.000 MW para gerar um antagonista de fEPO compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente que é modificado com um derivado de PEG em um único sítio dentro do polipeptídeo. O acoplamento, a purificação e análises são realizadas conforme descritos nos exemplos acima.

Exemplo 18

Geração de homodímero, heterodímero, homomultímero ou heteromultímero de fEPO na qual as moléculas de fEPO são ligadas diretamente

Uma fEPO variante compreendendo o aminoácido contendo alcino pode ser diretamente acoplada a outra fEPO variante compreendendo o aminoácido contendo azido, cada uma das quais compreende substituições com aminoácido não codificado naturalmente nos sítios descritos nos exemplos acima. O resultado será a geração do homodímero da fEPO correspondente, em que as duas fEPO variantes são unidas fisicamente na interface do sítio 2 de ligação. Em maneira análoga, um polipeptídeo de fEPO pode ser acoplado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros. O acoplamento, a purificação e análises são realizadas conforme descritos nos exemplos acima.

Exemplo 19

PEG-OH + Br-(CH₂)_n-C:CR’ PEG-O-(CH₂)_n-C=CR’

AB

O polialquileno glicol (P-OH) é reagido com o haleto de alquila (A) para formar o éter (B). Nesses compostos, n é um número inteiro de um a nove e R’ pode ser grupo C1 a C20 alquila ou heteroalquila de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado. R’ pode ser também grupo C3 a C7 alquila cíclico ou heteroalquila cíclico saturado ou insaturado, grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído, ou grupo alcarila (o alquila é C1 a C20 saturado ou insaturado) ou heteroalcarila substituído ou não substituído. Tipicamente, P-OH é polietilenoglicol (PEG) ou monometoxipolietilenoglicol (mPEG) com peso molecular de 800 a 40.000 Daltons (Da).

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Exemplo 20 mPEG-OH + Br-CH₂ -C=CH -à mPEG-O-CH₂-C=CH mPEG-OH com peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH: 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). Uma solução de brometo de propargila, dissolvido em forma de solução a 80% em peso de xileno (0,56 mL, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich), uma quantidade catalítica de Kl foi adicionada à solução e a mistura resultante foi aquecida para refluxo por 2 h. Água (1 mL) foi então adicionada, e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo, foi adicionado CH₂Cl₂ (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na₂SO₄ anidro e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH₂CI₂ foi adicionada a dietil éter (150 mL) em gotas. O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de dietil éter frio e seco para fornecer propargil-O-PEG.

Exemplo 21 mPEG-OH + Br-(CH₂)₃-C=CH -» mPEG-O-(CH₂)₃-C=CH

O mPEG-OH com peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH: 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). À mistura, foram então adicionados cinquenta equivalentes de 5-cloro-1-pentino (0,53 mL, 5 mmol, Aldrich) e uma quantidade catalítica de Kl. A mistura resultante foi aquecida para refluxo por 16 horas. Água (1 mL) foi então adicionada, e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo, foi adicionado CH₂CI₂ (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na₂SO₄ anidro e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH₂CI₂ foi adicionada a dietil éter (150 mL) em gotas. O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de dietil éter frio e seco para fornecer o alcino correspondente.

Exemplo 22 (1) m-HOCH₂C₆H₄OH + NaOH + Br- CH₂-C=CH m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH (2) m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH + MsCI + N(Et)₃ m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH (3) m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH + LiBr m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH (4) mPEG-OH + m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C=CH mPEG-O-CH₂-C₆H₄O-CH₂-C=CH

A uma solução de álcool 3-hidroxibenzílico (2,4 g, 20 mmol) em THF (50 mL) e água (2,5 mL), foi primeiramente adicionado hidróxido de sódio em pó (1,5 g, 37,5 mmol) e, depois, uma solução de brometo de propargila, dissolvida em forma de solução de 80% em peso de xileno (3,36 mL, 30 mmol). A mistura da reação foi aquecida para refluxo por 6 horas. À mistura da reação, foi adicionado ácido cítrico 10% (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3x15 mL), e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas com MgSO₄ e concentradas para fornecer álcool 3-propargiloxibenzílico.

Cloreto de metanossulfonila (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) fo229/238 ram adicionados a uma solução do composto 3 (2,0 g, 11,0 mmol) em CH2CI2 a 0 °C, e a ração foi colocada na geladeira por 16 horas. Uma reação comum deu origem ao mesilato em forma de óleo amarelo claro. Este óleo (2,4 g, 9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL), e LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) foi adicionado. A mistura da reação foi aquecida para refluxo por 1 hora e, depois, resfriada para temperatura ambiente. À mistura, foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3x15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCI (10 mL), secas com Na₂SO₄ anidro e concentradas para fornecer o brometo desejado.

mPEG-OH de 20 kDa (1,0 g, 0,05 mmol, Sunbio) foi dissolvido em THF (20 mL) e a solução foi resfriada em banho gelado. NaH (6 mg, 0,25 mmol) foi adicionado sob agitação vigorosa sobre um período de vários minutos, seguido por adição do brometo obtido acima (2,55 g, 11,4 mmol) e de uma quantidade catalítica de Kl. O banho de resfriamento foi removido, e a mistura resultante foi aquecida para refluxo por 12 horas. Água (1,0) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH₂CI₂ (25 mL), e a camada orgânica foi separada, seca com Na₂SO₄ anidro, e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. A adição em gotas a uma solução de éter (150 mL) resultou em precipitado branco, o qual foi coletado e rendeu o derivado de PEG.

Exemplo 23 mPEG-NH₂ + X-C(O)-(CH₂)_n-C^CR’ -» mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C=CR’

Os polímeros de poli(etilenoglicol) com terminações em alcino podem também ser obtidos acoplando um polímero de poli(etilenoglicol) contendo grupo funcional terminal para uma molécula reativa contendo a funcionalidade alcino como mostrada acima.

Exemplo 24 (1) HO₂C-(CH₂)₂-C^CH + NHS +DCC^ NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C=CH (2) mPEG-NH₂ + NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C=CH mPEG-NH-C(0)-(CH₂)₂-OCH

Ácido 4-pentinoico (2,943 g, 3,0 mmol) foi dissolvido em CH₂CI₂ (25 mL). Nhidroxisuccinimida (3,80 g, 3,3 mmol) e DCC (4,66 g, 3,0 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O NHS éster 7 bruto resultante foi utilizado na reação seguinte sem purificação adicional.

mPEG-NH2 com peso molecular de 5.000 Da (mPEG-NH₂, 1 g, Sunbio) foi dissolvido em THF (50 mL) e a mistura foi resfriada para 4 °C. NHS éster 7 (400 mg, 0,4 mmol) foi adicionado em porções sob agitação vigorosa. A mistura foi deixada sob agitação por 3 horas, enquanto aquecida até a temperatura ambiente. Água (2 mL) foi então adicionada e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo, foi adicionado CH₂CI₂ (50 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na₂SO₄ anidro, e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH₂CI₂ foi adicionada a éter (150 mL) em gotas. O precipitado resultante foi coletado e seco em vácuo.

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Exemplo 25

Este exemplo representa o preparo do metanossulfonil éter de poli(etilenoglicol), o qual pode ser referido como metanossulfonato ou mesilato de poli(etilenoglicol). O tosilato e os haletos correspondentes podem ser preparados por procedimentos semelhantes.

mPEG-OH + CH₃SO₂CI + N(Et)₃ -> mPEG-O-SO₂CH₃ mPEG-N₃

O mPEG-OH (MW = 3.400, 25 g, 10 mmol) em 150 mL de tolueno foi destilado azeotropicamente por 2 horas sob nitrogênio, e a solução foi resfriada para temperatura ambiente. À solução, foram adicionados 40 mL de CH₂CI₂ seco e 2,1 mL de trietilamina seca (15 mmol). A solução foi resfriada em banho de gelo, e 1,2 mL de cloreto de metanossulfonila destilado (15 mmol) foram adicionados em gotas. A solução foi agitada em temperatura ambiente sob nitrogênio durante a noite, e a reação foi finalizada pela adição de 2 mL de etanol absoluto. A mistura foi evaporada sob vácuo para remover solventes, primariamente aqueles além de tolueno, filtrada, novamente concentrada sob vácuo e, então, precipitada em 100 mL de dietil éter. O filtrado foi lavado com várias porções de dietil éter frio e seco para fornecer mesilato.

O mesilato (20 g, 8 mmol) foi dissolvido em 75 ml de THF, e a solução foi resfriada para 4 °C. À solução resfriada, foi adicionada azida sódica (1,56 g, 24 mmol). A reação foi aquecida para refluxo sob nitrogênio por 2 horas. Os solventes foram então evaporados, e o resíduo diluído com CH₂CI₂ (50 mL). A fração orgânica foi lavada com solução de NaCl e seco com MgSO₄ anidro. O volume foi reduzido para 20 ml e o produto foi precipitado por adição a 150 ml de éter seco gelado.

Exemplo 26 (1) N₃-C₆H₄-CO₂H N₃-C₆H₄CH₂OH (2) N₃-C₆H₄CH₂OH Br-CH₂-C₆H₄-N₃ (3) mPEG-OH + Br-CH₂-C₆H₄-N₃ mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃

Álcool 4-azidobenzílico pode ser produzido usando o método descrito na Patente U.S. N° 5 998 595. Cloreto de metanossulfonila (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) foram adicionados a uma solução de álcool 4-azidobenzílico (1,75 g, 11,0 mmol) em CH₂CI₂ a 0 °C, e a reação foi colocada na geladeira por 16 horas. Uma reação comum deu origem ao mesilato sob a forma de óleo amarelo claro. Este óleo (9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL), e LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) foi adicionado. A mistura da reação foi aquecida para refluxo por 1 hora e, depois, resfriada para temperatura ambiente. À mistura da reação, foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3x15 mL), e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas com Na₂SO₄ anidro e concentradas para fornecer o brometo desejado.

mPEG-OH de 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5

231/238 mmol) em THF (35 mL), e o brometo (3,32 g, 15 mmol) foi adicionado à mistura junto com uma quantidade catalítica de Kl. A mistura resultante foi aquecida para refluxo por 12 horas. Água (1,0) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo, foi adicionado CH2CI2 (25 mL), e a camada orgânica foi separada, seca com Na₂SO₄ anidro, e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. Adição em gotas a uma solução de éter (150 mL) resultou em precipitado, o qual foi coletado para render mPEG-O-CH₂-C₆H4-N3.

Exemplo 27

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H + N₃-CH₂CH₂CO₂-NHS N₃-CH₂CH₂-C(O)NH-PEG-OCH₂CH₂CO₂H

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H (MW: 3.400 Da, 2,0 g) foi dissolvido em solução aquosa saturada de NaHCO₃ (10 mL), e a solução foi resfriada para 0 °C. Propionato de 3-azido-1N-hidroxisuccinimido (5 equiv.) foi adicionado sob agitação vigorosa. Após 3 horas, 20 mL de H₂O foram adicionados, e a mistura foi agitada por mais 45 minutos em temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 3 com H2SO4 0,5 N, e NaCI foi adicionado em concentração de aproximadamente 15% pt. A mistura da reação foi extraída com CH₂CI₂ (100 mL x 3), seca com Na₂SO₄ e concentrada. Após precipitação com dietil éter frio, o produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para render o derivado de ômega-carbóxi-azida de PEG.

Exemplo 28 mPEG-OMs + HC=CLi mPEG-O-CH₂-CH₂-C=C-H

A uma solução de acetileto de lítio (4 equiv.), preparada como conhecido no estado da técnica e resfriada para -78 °C em THF, uma solução de mPEG-OMs dissolvido em THF é adicionada em gotas sob agitação vigorosa. Após 3 horas, a reação é permitida aquecer para temperatura ambiente e é finalizada com a adição de 1 mL de butanol. 20 mL de H₂O são, então, adicionados e a mistura foi agitada por mais 45 minutos em temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 3 com H₂SO₄ 0,5 N, e NaCI foi adicionado para uma concentração de aproximadamente 15% pt. A mistura da reação foi extraída com CH₂CI₂ (100 mL x 3), seca com Na₂SO₄ e concentrada. Após precipitação com dietil éter frio, 0 produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para render o derivado ômega-carbóxi-azida de PEG.

Exemplo 29

Os aminoácidos contendo azida e acetileno foram incorporados sítio-seletivamente em proteínas, utilizando os métodos descritos em L. Wang, et al., (2001), Science 292:498500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of América 99:1102011024: e L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10. Assim que os aminoácidos foram incorporados, a reação de cicloadição foi conduzida com proteína 0,01 M em tampão fosfato (PB), pH 8, na presença de derivado de PEG 2 mM, CuSO₄ 1 mM e ~1 mg de fio de

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Cu por 4 horas a 37 °C.

Exemplo 30

Atividade in vitro e in vivo de fEPO PEGuilada, determinada pelo ensaio em camundongo normocitêmico

PEG-fEPO, fEPO não modificada e solução tampão foram administrados a camundongos. Os resultados revelarão atividade superior e meia-vida prolongada da fEPO PEGuilada da presente invenção, em comparação à fEPO não modificada, o que é indicado por quantidades significativamente aumentadas de reticulócitos e desvio para contagem máxima de reticulócitos, usando a mesma dose por camundongo.

O bioensaio com camundongo normocitêmico é conhecido no estado da técnica (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2)). As amostras são diluídas com BSA-PBS. Camundongos normais saudáveis com 7-15 semanas de idade são administrados s.c. com 0,2 ml de fEPO PEGuilada da presente invenção. Sobre um período de 4 dias iniciando 72 horas após a administração, sangue é coletado por punção da veia do rabo e diluído de modo que houvesse 1 pl de sangue em 1 ml de uma solução de coloração laranja de acridina 0,15 pmol. O tempo para coloração é de 3 a 10 minutos. As contagens de reticulócitos são conduzidas por microfluorometria de citometria de fluxo por análise do histograma de fluorescência vermelha (por 30.000 células sanguíneas analisadas). Cada grupo investigado consistia em 5 camundongos por dia, e os camundongos eram sangrados somente uma única vez.

Bioensaio: Adicionalmente, polipeptídeos de fEPO da presente invenção eram avaliados com respeito à atividade in vitro com um ensaio de ligação ao receptor de fEPO e em um ensaio de proliferação celular no qual a bioatividade é determinada por proliferação de células Ba/F3-fEPOR. O protocolo de cada ensaio está descrito em Wrighton et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1261-1265 e nas Patentes U.S. N^os 5 773 569 e 5 830 851. Valores de EC₅₀, para os polipeptídeos de fEPO preparados de acordo com esta invenção, representam a concentração de composto necessária para produzir 50% da atividade máxima obtida com eritropoetina recombinante.

Exemplo 31

Estudo clínico da segurança e/ou da eficácia de fEPO PEGuilada compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente

Objetivo: Comparar a segurança e a farmacocinética de EPO felina PEGuilada, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente, administrada por via subcutânea, com o produto PROCRIT ou ARANESP comercialmente disponível de hEPO.

Pacientes: Dezoito gatos saudáveis de perfil semelhante (idade e peso) são incluídos neste estudo. Os participantes não apresentam valores laboratoriais anormais clinicamente significantes para hematologia e bioquímica sérica, e são negativos para teste de

233/238 toxicologia em urina, teste de HIV e de antígeno de superfície da hepatite B. Não devem apresentar qualquer evidência dos seguintes: hipertensão, histórico de qualquer doença hematológica primária, histórico significativo de doença hepática, renal, cardiovascular, gastrintestinal, geniturinária, metabólica, neurológica; histórico de anemia ou transtorno convulsivo; sensibilidade conhecida a produtos derivados de bactérias ou mamíferos, PEG ou albumina sérica humana; consumo habitual e pesado de bebidas contendo cafeína; participação em qualquer outro estudo clínico ou terem recebido transfusão ou doado sangue no período de 30 dias da admissão no estudo; terem sido expostos a hEPO ou fEPO no período de três meses da admissão no estudo; apresentado doença nos sete dias da admissão no estudo e apresentado anormalidades significativas no exame físico pré-estudo ou nas avaliações laboratoriais clínicas no período de 14 dias da admissão no estudo. Todos os participantes são avaliáveis quanto à segurança e todas as amostras de sangue para análise farmacocinética são coletadas de acordo com a programação. Todos os estudos são realizados com a aprovação do comitê de ética da instituição e com o consentimento do paciente.

Desenho do estudo: Este é um estudo de Fase I em um único centro, aberto, randomizado de cruzamento em dois períodos realizado em voluntários masculinos saudáveis. Dezoito voluntários são designados aleatoriamente para um dos dois grupos de sequência de tratamento (nove voluntários/grupo). EPO é administrada sobre dois períodos separados de administração, em forma de bolus injetado por via s.c. na região superior da coxa, usando doses equivalentes da fEPO PEGuilada compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente e o produto comercialmente disponível escolhido. A dose e a frequência de administração são de acordo com as instruções contidas na bula do medicamento. É possível acrescentar doses adicionais, frequência de administração ou outros parâmetros, conforme desejado, usando os produtos comercialmente disponíveis ao estudo, incluindo-se grupos adicionais de voluntários. Cada período de administração é separado por um período de tempo a ser calculado com base na versão do estudo em seres humanos (por exemplo, período de 14 dias de washout). Os voluntários são mantidos no centro de estudo por pelo menos pelo menos 12 horas antes e 72 horas depois de cada dose em cada um dos dois períodos de administração, porém não entre os períodos de administração. Grupos adicionais de voluntários podem ser adicionados se houver doses adicionais, frequência ou outro parâmetro a ser também testado para a fEPO PEGuilada. Múltiplas formulações de EPO, cujo uso é aprovado, podem ser utilizadas neste estudo. Epoetina alfa comercializada como PROCRIT® e/ou darbepoiteina comercializada como ARANESP® são produtos à base de EPO comercialmente disponíveis que podem ser terapeuticamente usados em animais. A formulação experimental de fEPO é a fEPO PEGuilada compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente.

234/238

Coleta de amostras de sangue: Sangue em série é coletado por punção venosa direta e após administração de EPO. Amostras de sangue venoso (5 mL) para determinação de concentrações séricas de eritropoetina são obtidas em torno de 30, 20 e 10 minutos antes da administração (3 amostras basais) e em aproximadamente os mesmos tempos após a dose: 30 minutos e em 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e 72 horas. Cada amostra de soro é dividida em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20 °C. As amostras de soro são enviadas em gelo seco. Testes de laboratório clínico em jejum (hematologia, bioquímica sérica e urinálise) são realizados imediatamente antes da dose inicial no Dia 1, na manhã do Dia 4, imediatamente antes da administração no Dia 16 e na manhã do Dia 19.

Métodos bioanalíticos: Um procedimento com kit de radioimunoensaio (RIA) (Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX) é utilizado para a determinação de concentrações séricas de eritropoetina. O RIA comercialmente disponível é um método competitivo com anticorpo duplo que usa um anticorpo policlonal anti-soro de coelho contra eritropoetina urinária, como o anticorpo primário, e uma eritropoetina ¹²⁵l-marcada urinária como o traçador. Epoetina alfa ou darbepoietina é substituída para eritropoetina urinária fornecida no kit da DSL, em padrões e amostras de controle de qualidade. As concentrações padrão utilizadas no ensaio são 7,8; 15,6; 31,3; 50; 62,5; 100 e 125 mIU/mL. A sensibilidade, definida como o valor médio de ajuste reverso para o padrão mais baixo com precisão aceitável, é de 8,6 mIU/mL, e o intervalo do ensaio é ampliado para 2.000 mIU/mL por diluições de controle de qualidade.

Determinações de segurança: Sinais vitais são registrados imediatamente antes (Dias 1 e 16) e após 6, 24, 48 e 72 horas de cada dose. As determinações de segurança têm como base a incidência e o tipo de eventos adversos, e as alterações em testes laboratoriais clínicos desde o período basal. Adicionalmente, alterações em sinais vitais medidos antes do estudo, incluindo resultados de pressão arterial e de exame físico, são avaliadas.

Análise de dados: Valores pós-dose de concentrações séricas são corrigidos para concentrações basais pré-dose de eritropoetina, subtraindo de cada valor pós-dose, a concentração média basal de eritropoetina determinada pela média calculada sobre os níveis de eritropoetina das três amostras coletadas em 30, 20 e 10 minutos antes da dose. As concentrações séricas pré-dose de eritropoetina não são incluídas no cálculo de valor médio se estiverem abaixo do nível de quantificação do ensaio. Parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir dos dados de concentração sérica corrigidos para concentrações basais de eritropoetina. Parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos de modelos independentes em sistema informatizado VAX8600 da Digital Equipment Corporation, utilizando a versão mais recente do software BIOAVL. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos são determinados: concentração sérica máxima (C_max); tempo para concentração sérica má235/238 xima (t_max); área sob a curva de concentração-tempo (AUC) a partir do momento zero ao último momento de coleta de sangue (AUC₀.₇₂), calculado com o uso de regra linear trapezoidal; e meia-vida terminal de eliminação (t_1/2), computada a partir da constante de taxa de eliminação. A constante de taxa de eliminação é estimada por regressão linear de pontos consecutivos de dados na região terminal do traçado linear de concentração-tempo em logaritmo. O desvio padrão (SD) médio e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos são calculados para cada tratamento. A razão das médias de parâmetros (formulação preservada/ formulação não preservada) é calculada.

Resultados de segurança: A incidência de eventos adversos é igualmente distribuída nos grupos de tratamento. Não há alterações clinicamente significativas em testes laboratoriais clínicos ou pressão arterial desde o período basal ou pré-estudo, e nenhuma alteração acentuada em resultados de exame físico e em sinais vitais medidos antes do estudo. Os perfis de segurança para os dois grupos de tratamento devem parecer semelhante.

Resultados farmacocinéticos: Perfis médios de concentração de eritropoetina sérica-tempo (não corrigidos para níveis basais de eritropoetina) em todos os 18 voluntários após receberem uma dose de hEPO disponível comercialmente (PROCRIT® ou ARANESP®) são comparados à fEPO PEGuilada e/ou fEPOs de pesquisa ou comerciais que existam disponíveis. A fEPO PEGuilada usada na comparação é uma da presente invenção, compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente em cada momento medido. Todos os voluntários devem apresentar concentrações basais pré-dose de eritropoetina dentro dos limites normais fisiológicos. Parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir de dados séricos corrigidos para concentrações basais médias pré-dose de eritropoetina, e a Cmax e o t_max são determinados. O t_max médio para hEPO (PROCRIT®) é significativamente mais curto do que o t_max para a hEPO PEGuilada compreendendo o aminoácido não codificado naturalmente. Os valores de meia-vida terminal são significativamente mais curtos para hEPO (PROCRIT®) comparados com a meia-vida terminal para a fEPO PEGuilada compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente.

Embora o presente estudo seja conduzido em voluntários saudáveis, características e perfis de segurança semelhantes seriam previstos em outras populações de pacientes, tais como aqueles portadores de câncer ou insuficiência renal crônica, anemia secundária induzida por lesão, pacientes pediátricos com insuficiência renal, pacientes em programas de pré-depósito autólogo ou pacientes programados para cirurgia eletiva.

Em conclusão, doses únicas administradas por via subcutânea de fEPO PEGuilada compreendendo aminoácido não codificado naturalmente são seguras e bem toleradas por voluntários saudáveis. Com base em comparação de incidência de eventos adversos, valores laboratoriais clínicos, sinais vitais e resultados de exame físico, os perfis de segurança de EPOs de pesquisa/comerciais, hEPO (PROCRIT®) e fEPO PEGuilada compreendendo

236/238 aminoácido não codificado naturalmente são equivalentes. A fEPO PEGuilada compreendendo aminoácido não codificado naturalmente oferece potencialmente grande utilidade clínica a pacientes e a profissionais de saúde.

Exemplo 32

Atividade in vivo de variantes de fEPO PEGuilada

O impacto de PEG sobre a duração de atividade de uma proteína é pelo menos parcialmente dependente do tamanho e da estrutura (linear versus ramificada) do PEG. A capacidade comparativa de diferentes variantes de tamanho de PEG de fEPO para aumentar hematócritos (Hct) foi avaliada em gatos saudáveis.

Variantes recombinantes de fEPO, contendo uma substituição com paminofenilalanina (pAF) na posição A1, foram expressos em um sistema de expressão em células de ovário de hamster chinês. A proteínas foi PEGuilada com PEG oxiamino de 20 kD, 30 kD ou 40 kD, no sítio da substituição do aminoácido não nativo. Os variantes de fEPO PEGuilada foram formulados em tampão de formulação consistindo em NaPO₄ 20 mM, NaC1140 mM, polissorbato 80 0,005% em pH 6,2.

Vinte e quatro gatos saudáveis (12 machos/12 fêmeas), pesando aproximadamente 3-6 kg, foram adquiridos de um fornecedor Classe A e deixados para que se aclimatassem às instalações do estudo e procedimentos relativos à dieta e a criação. Amostras basais de sangue foram coletadas nos Dia -14 e Dia -7 antes que fossem incluídos no estudo. Os gatos foram sedados com acepromazina e isoflurina para reduzir o estresse causado pela coleta de amostras de sangue. Animais que não apresentassem sinais clínicos de doença e com valores de Hct dentro dos limites normais de referência para gatos saudáveis foram selecionados para inclusão no estudo.

Os gatos foram designados para um de quatro grupos de tratamento usando um desenho em bloco randomizado, o qual equalizava hematócritos basais entre tratamentos.

TABELA 5

Tratamento	Regime de dose	N° de animais
1) Tampão de formulação	SIDX1	6 (3M/3F)
2) fEPO A1 pAF-20K PEG	8 Dg/kg, SIDX1	6 (3M/3F)
3) fEPO A1 pAF-30K PEG	8 Dg/kg, SIDX1	6 (3M/3F)
4) fEPO A1 pAF-40K PEG	8 Dg/kg, SIDX1	6 (3M/3F)

Os animais foram sangrados e pesados no Dia 0 anterior ao tratamento. Foram tratados uma vez com seu tratamento designado por injeção subcutânea.

Amostras adicionais de sangue foram coletadas nos Dias 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24,

28, 31, 35, 38 e 42 pós-tratamento. Hematócritos foram determinados para cada amostra. O consumo diário de alimento foi também medido, e os animais foram observados diariamente

237/238 para detectar quaisquer questões relativas à saúde.

Os efeitos dos vários tratamentos sobre hematócritos e RBC são apresentados na Figura 36.

Aumentos significativos em valores de Hct em relação a controles com tampão foram observados com as variantes de fEPO PEGuilada de 20 kD ou 30 kD em até 3 dias de administração. Animais tratados com o variante de PEG de 40 kD exibiram aumentos significativos em relação aos controles com tampão em aproximadamente 10 dias pós-tratamento. Valores máximos de Hct foram observados no Dia 10 para animais tratados com o variante de PEG de 20 kD, no Dia 14 para o variante de PEG de 30 kD e no Dia 17 para o variante de PEG de 40 kD. Hematócritos de animais tratados com os variantes de PEG de 20 ou de kD foram significativamente maiores do que os dos controles com tampão até pelo menos 28 dias após a administração. Esses resultados sugerem que a administração de fEPO PEG uma vez por mês deve ser adequada para sustentar a manutenção de níveis aumentados de Hct. Não foram observados eventos adversos durante o transcorrer do estudo.

Exemplo 33

Eficácia de variantes de fEPO PEGuilada em gatos anêmicos

A capacidade de variantes de fEPO PEGuilada de restaurar números normais de células sanguíneas da série vermelha (RBC) em gatos com anemia pode ser avaliada em gatos com doença renal crônica (CDK) estágio III ou estágio IV. Gatos portadores dessa condição exibem anemia não regenerativa de moderada a grave em decorrência de a perda de células do parênquima renal, as quais são a fonte primária de fEPO endógena.

A fim de avaliar a capacidade de fEPO PEGuilada para aumentar os números de células sanguíneas da séria vermelha em gatos com CKD e anemia, 12 gatos (6 machos e 6 fêmeas), pesando aproximadamente 3-6 kg e com histórico clínico de CKD e hematócrito <30%, foram aclimatados às instalações do estudo e a procedimentos relativos à dieta e criação. Hematócritos e contagens de RBC de amostras de sangue coletadas nos Dias -14 e -7 anteriores à inclusão no estudo são utilizados como controles basais para cada animal.

Os gatos foram designados para um de três grupos de tratamento, usando um desenho de bloco randomizado que equaliza hematócritos e RBCs basais entre tratamentos. Cada grupo de tratamento contém quatro animais (2 machos/2 fêmeas). fEPO PEGuilada é administrada uma vez por injeção subcutânea em doses variando de 2-8 pg/kg.

Amostras adicionais de sangue são coletadas nos Dias 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28 e após o tratamento. Os valores de hematócritos e contagens de RBC são determinados para cada amostra. O consumo diário de alimentos é também medido, e os animais são observados e pontuados diariamente quanto a sinais clínicos de depressão e/ou letargia para avaliar qualidade de vida.

A eficácia é determinada comparando os hematócritos e contagens de RBC pós238/238 tratamento com os valores basais obtidos previamente à administração da proteína. A proteína é considerada eficaz se os valores médios diários de hematócrito e de contagem RBC exibirem aumento estatisticamente significativo em relação aos valores basais, ou se os valores médios diários aumentarem dentro dos limites normais de valores de referência para 5 estes parâmetros em qualquer ponto durante o período pós-tratamento.

Deve ser entendido que os exemplos e as modalidades descritos neste pedido de patente têm somente fins ilustrativos e que, portanto, várias modificações ou alterações em vista do mesmo serão sugeridas àqueles versados no estado da técnica, as quais deverão ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido de patente e na abrangência das 10 reivindicações anexadas. Todas as publicações, patentes e os pedidos de patentes citados neste relatório descritivo são aqui incorporados, em sua totalidade e para todos os fins, por referência neste pedido de patente.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33 ou polipeptídeos substancialmente idênticos dos mesmos CARACTERIZADO por compreender um ou mais aminoácidos não codificado naturalmente onde pelo menos um aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água e quando o polipeptídeo de eritropoetina não-humana é da SEQ ID NO: 2 então:

   a) o aminoácido não codificado naturalmente é diferente de para-acetilfenilalanina;

   ou

   b) polímero solúvel em água é diferente de uma fração polietilenoglicol.
2. 2. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por estar ligado a pelo menos um polipeptídeo de eritropoetina nãohumana adicional.
3. 3. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do polímero solúvel em água compreender uma fração poli(etilenoglicol), a referida fração poli(etilenoglicol) sendo opcionalmente um polímero bifuncional ligado a um segundo polipeptídeo.
4. 4. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do aminoácido não codificado naturalmente compreender um grupo carbonila, um grupo acetila, um grupo aminóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alquileno.
5. 5. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato do aminoácido não codificado naturalmente possuir a estrutura:

   (ÇH^CORz

   R₃Hrr ^cor₄ onde o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonila; ou tem a estrutura:

   (ÇH^nRíXÍCH^Na

   R₂HhT ^COR₃ onde o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo azida; ou tem a estrutura:

   2/3 (ÇH^R^CH^CCH

   F^Hrr ^cor₃ onde o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo alquileno; né0-10;

   m é 0-10;

   X é O, N, S ou não está presente;

   R! é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída;

   R₂ é H, um aminoácido, um polipeptídeo, um grupo com modificação no terminal amino; uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituídao

   R₃ é H, um aminoácido, um polipeptídeo, um grupo com modificação no terminal amino, ou um grupo com modificação no terminal carbóxi; e

   R₄é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo com modificação no terminal carbóxi.
6. 6. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato da molécula de poli(etilenoglicol) possuir um peso molecular entre 1 e 100 kDa.
7. 7. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação Erro! Fonte de referência não encontrada., CARACTERIZADO pelo fato da molécula de poli(etilenoglicol) ser um polímero ramificado ou com múltiplos braços.
8. 8. Polipeptídeo de eritropoetina não-humana, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do aminoácido não codificado naturalmente compreender um grupo sacarídico.
9. 9. Composição CARACTERIZADA por compreender o polipeptídeo de eritropoetina não-humana conforme definido na reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. 10. Uso da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 9 CARACTERIZADO por ser para a manufatura de um medicamento para tratar um paciente com um transtorno modulado por um polipeptídeo de eritropoetina não-humana.
11. 11. Método para produzir o polipeptídeo de eritropoetina não-humana conforme definido na reivindicação 1 CARACTERIZADO por pôr em contato um polipeptídeo isolado de eritropoetina não-humana com um polímero solúvel em água compreendendo um grupo que reage com o aminoácido não codificado naturalmente.
12. 12. Método para produzir o polipeptídeo de eritropoetina não-humana conforme definido na reivindicação 1 CARACTERIZADO por:

    cultivar células, contendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam o referido polipeptídeo de eritropoetina não-humana e compreendem um códon seletor, um

    3/3

    RNA sintetase ortogonal e um tRNA ortogonal, sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo de eritropoetina não-humana; e purificar o polipeptídeo de eritropoetina não-humana das células.
13. 13. Ácido nucléico isolado CARACTERIZADO por compreender um polinucleotídeo

    5 que se hibridiza sob condições rigorosas com a SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27, onde o polinucleotídeo compreende pelo menos um códon seletor.
14. 14. Célula CARACTERIZADA por compreender o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 13. ok