KR20110081228A - 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도를 제공한다.

Description

변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도{MODIFIED ANIMAL ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND THEIR USES}
본 발명은 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 변형된 고양이, 개, 및 말 에리트로포이에틴 폴리펩티드에 관한 것이다.
성장 호르몬(GH: growth hormone) 초유전자 계열(문헌 ([Bazan, F. Immunology Today 11:350-354 (1991)]; [Mott, H. R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; [Silvennomen, O. and Ihle, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]))은 유사한 구조적 특징을 갖는 하나의 단백질 세트를 나타낸다. 상기 계열의 구성원 중에는 아직 밝혀져야 할 구성원들이 훨씬 더 많이 남아있지만, 상기 계열의 일부 구성원은 하기: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리트로포이에틴(EPO: erythropoietin), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: macrophage colony stimulating factor) 및 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin)("GH 초유전자 계열")을 포함한다. GH 초유전자 계열의 구성원은 일반적으로 아미노산 또는 DNA 서열 동일성이 제한되어 있다는 사실에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 이러한 공통된 구조적 특징으로 인해 상기 유전자 계열의 신규한 구성원을 용이하게 동정할 수 있다.
GH 초유전자 계열 중 한 구성원으로는 고양이 에리트로포이에틴(fEPO: feline erythropoietin)이 있다. 천연적으로 발생된 에리트로포이에틴(EPO)은 포유동물의 신장 및 간에서 생산이 되며, 분자량이 34 킬로달톤 (kDa)인 당단백질 호르몬이다. EPO는 적혈구 전구체의 증식과 분화를 비롯한 적혈구 생성에서 중요한 성분이다. EPO 활성은 또한 글로빈 및 카보닉 안하이드라제를 비롯한, 다수의 에리트로이드 특이 유전자의 활성화와 관련이 있다(예로서, 문헌 ([Bondurant et al, Mol. Cell Biol. 5:675-683 (1985)]; [Koury et al., J. Cell . Physiol. 126: 259-265 (1986)]) 참조할 수 있다).
에리트로포이에틴 수용체(EpoR: erythropoietin receptor)는, 예로서, 인터루킨(IL)-3, -4 및 -6 수용체, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 수용체 뿐만 아니라, 프로락틴 및 성장 호르몬 수용체와 같은 수개의 기타 다른 성장 인자 수용체를 포함하는 조혈/사이토카인/성장 인자 수용체 계열의 한 구성원이다(문헌 [Bazan, Proc. Natl. Acad, Sci USA 87: 6934-6938 (1990)]). 사이토카인 수용체 계열의 구성원들은 트랜스막 영역의 바깥쪽에 바로 위치하고 있는 하나의 트립토판-세린-X-트립토판-세린 모티프와 보존되는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 보존되는 서열이 단백질과 단백질 사이의 상호작용에 관여한다고 사료된다(문헌 [Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)] 참조).
미국 특허 번호 제5,441,868호; 제5,547,933호; 제5,618,698호; 및 제5,621,080호에는 인간 EPO를 코딩하는 DNA 서열 및 천연적으로 발생된 EPO의 1차 구조 형태의 일부 또는 그 모두와 생물학적 특성도 갖고 있는 정제되고 단리된 폴리펩티드가 기재되어 있다.
EPO의 생물학적 효과는 그와 특이적인 세포 수용체와의 상호작용으로부터 유래된 것이다. EPO와 그의 수용체(EPObp)의 세포외 도메인 사이의 상호작용에 대해서는 잘 이해되고 있다. 고해상도 x선 결정학적 데이터를 통해 EPO는 2개의 수용체 결합 부위를 갖고 있으며, 순차적으로 상기 분자 상에 존재하는 별도의 다른 부위를 사용하여 2개의 수용체 분자에 결합하는 것으로 나타났다. 2개의 수용체 결합 부위는 부위 I 및 부위 II로 지칭된다. 부위 I은 그의 조합 D의 카르복시 말단 종단부 및 나선 A 일부 및 A-B 루프를 포함하는 반면, 부위 II는 나선 A의 아미노 말단 영역과 나선 C의 일부를 포함한다. EPO가 그의 수용체 결합하는 것은 순차적으로 일어나는데, 부위 I이 먼저 결합을 한다. 이어서, 부위 II가 두번째 EPO 수용체를 차지함으로써 수용체는 이량체화되고, 세포내 신호전달 경로가 활성화됨으로써 호르몬에 대한 세포 반응이 일어나게 된다.
재조합 인간 EPO는 치료제로 사용되며, 인간 피험체의 치료용으로서도 승인을 받은 바 있다. EPO가 결핍되면 빈혈에 걸리게 되는데, 이는 예를 들면, 호르몬을 외부에서 투여함으로써 성공적으로 치료할 수 있었다.
빈혈은 광범위하게는 재생성 및 재생불량성 빈혈이라는 2개의 카테고리로 분류될 수 있다. 재생성 빈혈은 혈액 손실에 의해 유발되거나, 면역계에 의한 적혈구 파괴의 결과로서 유발되는 경향이 있다. 한편, 재생불량성 빈혈은 골수가 빈혈에 대해 반응을 하지 않거나, 할 수 없는 것이다. 빈혈의 일반적인 원인은 만성 신부전(CRF: chronic renal failure)이며, 그밖에 사례에서 대부분은 고양이 백혈병 바이러스(FeLV: feline leukemia virus)로의 감염에 기인하는 것이다. 이들 2가지 질병이 애완용 고양이 사망 원인의 1위(FeLV) 및 2위(CRF)를 차지하는 것이다. hEPO가 고양이 빈혈 치료에 사용되어 왔다. 불행하게도, 고양이 빈혈을 치료하기 위해 hEPO를 사용할 때 면역원성과 관련된 문제들이 발생되는데, 약 hEPO로 치료받은 고양이 중 약 25% 내지 33%에서는 적혈구 무형성(RCA)이 발생하였다. CRP를 앓는 11마리의 고양이와 6마리의 개를 재조합 hEPO로 치료함으로써 진행된 연구를 수행하였고, 비록 적혈구(RBC) 및 망상적혈구 계수를 증가시킬 수 있는 능력에 관해 몇몇은 입증된 바 있으나, 11마리의 고양이 중 5마리에서 항r-hEPO 항체가 발생하였다(문헌 [LD Cowgill, et al., J Am Vet Med Assoc, 1998 Feb 15;212(4):521-8]). 26마리의 테스트 피험체 고양이를 사용하여 재조합 고양이 에리트로포이에틴(rfEPO)의 안전성 및 효능에 관한 연구를 수행하였는데, 이 역시 비록 RBC 및 망상적혈구 계수는 상승하기는 하였지만, 26마리의 고양지 중 8마리(즉, 30% 초과)에서 항r-hEPO 항체가 발생하였다(문헌 [JE Randolph, et al., Am J Vet Res. 2004 Oct;65(10): 1355-66]). 또다른 연구에서, 고양이 에리트로포이에틴 cDNA를 함유하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 2(rAAV2: recombinant adeno-associated virus serotype 2) 벡터를 10마리의 고양이로 이루어진 연구군에 투여하였고, 벡터로 처리된 모든 고양이에서 rAAV2 항체가 검출되었으며, 한마리의 고양이는 순 RBC 무형성으로 앓았고, 더 소량으로 처리된 고양이에서는 어떤 효과도 나타나지 않은 것으로 밝혀졌다(문헌 [MC Walker, et al., Am J Vet Res. 2005 Mar;66(3):450-6]).
친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)(약칭, PEG)의 공유적인 부착이 수용성, 생체이용성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료학적 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조정하거나, 생물학적 활성을 조정하거나, 단백질, 펩티드, 및 특히 소수성 분자를 비롯한 다수의 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 약제에서, 인공 임플란트 상에서, 및 생체적합성, 독성 결여, 및 면역원성 결여가 중요한 다른 적용에 있어서 광범위하게 사용되어 왔다. PEG의 원하는 특성을 최대화시키기 위해 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체 또는 중합체들의 전체 분자량 및 수화 상태는 모체 분자의 생체활성에는 역효과를 주지 않으면서, 예를 들면, 수용성 및 순환 반감기 증가와 같이 전형적으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유익한 특징들을 부여하기에 충분히 높아야 한다.
PEG 유도체는 종종 예를 들면, 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기와 같은 반응성 화학 관능기, N 말단 및 당질 부분을 통해 생물학적 활성 분자에 연결되어 있다. 단백질 및 다른 분자들은 종종 중합체 부착에 이용가능한 한정된 수의 반응성 부위를 가진다. 종종, 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 수용체 결합에 있어서 중요한 역할을 하고, 그 분자의 생물학적 활성의 보유를 위해 필수적이다. 그 결과, 생물학적 활성 분자 상의 상기와 같은 반응성 부위에 중합체 쇄가 무차별적으로 부착됨으로써 중합체 변형된 분자의 생물학적 활성이 현저하게 감소하거나 심지어는 완전히 상실된다(문헌 [R. Clark et al., (1996), J. Biol . Chem., 271:21969-21977]). 표적 분자에 원하는 장점을 부여하기에 충분한 중합체 분자량을 가진 접합체를 형성하기 위해, 선행 기술의 접근법은 전형적으로 다수의 중합체 암을 분자에 무작위적으로 부착시키는 단계를 포함함으로써, 모체 분자의 생체활성의 감소 또는 심지어 완전한 상실의 위험을 증가시킨다.
PEG 유도체가 단백질에 부착되기 위한 위치를 형성하는 반응성 부위는 단백질의 구조에 의해 결정된다. 효소를 비롯한 단백질은 일반 화학식 H2N--CHR--C00H를 가지는 알파 아미노산의 다양한 서열로 구성된다. 하나의 아미노산의 알파 아미노 부분(H2N--)은 인접 아미노산의 카르복실 부분(--C00H)에 결합되어 --(NH--CHR--CO)n--로서 표시될 수 있는 아미드 결합을 형성하는데, 여기서, 아래첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있다. R로 표시되는 단편은 단백질의 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.
예를 들어, 아미노산 리신의 경우, 알파 위치 뿐만 아니라, 엡실론 위치에도 -NH2 부분이 존재한다. 엡실론 -NH2는 염기성 pH의 조건하의 반응에 대해 자유롭다. PEG를 사용한 단백질 유도체화 분야에서 많은 기법은 단백질에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 -NH2 부분에 부착될 PEG 유도체의 개발에 관한 것이다(문헌 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]). 그러나, 이러한 PEG 유도체들은 모두 그들이 단백질의 표면 상에 존재하는 아주 많은 리신 잔기들 중에서 일부에만 선택적으로 안착될 수 없다는 공통된 한계를 가진다. 이는 예를 들어, 효소 활성 부위에 존재하는 리신 잔기가 단백질 활성에 중요한 경우, 또는 수용체 결합 부위의 경우와 같이 리신 잔기가 단백질과 다른 생물학적 분자의 상호작용을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 경우, 상당한 한계가 될 수 있다.
단백질 PEG화에 대한 기존 방법들 중 2번째로 똑같이 중요하게 여겨지는 문제점은 PEG 유도체가 원하는 잔기들 외의 잔기와 원치 않는 부반응을 할 수 있다는 점이다. 히스티딘은 구조적으로 -N(H)-로 표시되는 반응성 이미노 부분을 함유하지만, 엡실론 -NH2와 반응하는 많은 유도체 또한 -N(H)-와 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로 표시되는 유리 설프하이드릴 기를 보유한다. 몇몇 경우에 있어서, 리신의 엡실론 -NH2 기에서 유도된 PEG 유도체는 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기들과도 반응할 수 있다. 이는 PEG 유도체화된 생체활성 분자의 복잡한 비균질 혼합물을 생성시킬 수 있고, 표적이 되는 생체활성 분자의 활성을 파괴할 수 있는 위험을 초래할 수 있다. 명확하고 예측가능한 단백질 표면 상의 특이적인 부위에서 생체활성 분자에 하나 이상의 PEG 중합체를 선택적으로 커플링시킬 수 있는 단백질 내의 단일 부위에 화학적 작용기가 도입될 수 있게 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
리신 잔기 이외에, 당업계에서 시스테인, 히스티딘 및 N 말단을 비롯한 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약의 개발을 위해 상당히 노력하고 있다(미국 특허 번호 제6,610,281호, ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]). 시스테인 잔기는 부위 지정 돌연변이 유발법 및 당업계에 공지된 다른 기법들을 사용하여 단백질의 구조 내로 부위 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 유리 설프하이드릴 부분은 티올 반응성 작용기를 보유하는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 유리 설프하이드릴 기의 도입이 생성된 단백질의 발현, 폴딩 및 안정성을 복잡하게 할 수 있다는 점에서 문제가 된다. 따라서, 설프하이드릴, 및 전형적으로 단백질에서 발견되는 다른 화학적 작용기들과 상용가능하면서(즉, 원하지 않는 부반응에 참여하지 않으면서) 동시에 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 커플링시킬 수 있는 생체활성 분자 내로 화학적 작용기를 도입하는 수단을 가지는 것이 바람직하다.
당업계의 샘플링으로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH2 부분 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 부착시키기 위해 개발된 이들 유도체들의 대다수는 이들의 합성 및 사용에 있어서 문제점이 있는 것으로 입증되었다. 일부는 예를 들면, 혈류와 같은 수성 환경에서 가수분해되어 분해되거나, 질이 저하되거나, 아니면 불안정화된 단백질과의 불안정한 결합을 형성한다. 일부는 보다 안정한 결합을 형성하나, 결합이 형성되기 전에 가수분해되는데, 이는 PEG 유도체 상의 반응기가 단백질이 부착될 수 있기 전에 불활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 일부는 다소 독성을 나타내므로 생채내에서 사용하기에 덜 적합하다. 일부는 실용적으로 유용하기에는 너무 느리게 반응한다. 일부는 단백질의 활성을 책임지는 부위에 부착함으로써 단백질의 활성을 상실시킨다. 일부는 이들이 부착될 부위에 대해 특이적이지 않기 때문에 원하는 활성을 상실할 수도 있고 결과의 재현가능성도 없다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용한 단백질의 변형과 관련된 문제점을 극복하기 위해, 보다 안정하거나(예를 들어, 미국 특허 제6,602,498호), 분자 및 표면 상의 티올 잔기와 선택적으로 반응하는 PEG 유도체가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제6,610,281호). 안정한 화학 결합을 형성하도록 선택적으로 반응될 것이 요구될 때까지 생리적 환경에서 화학적으로 불활성을 나타내는 PEG 유도체가 당업계에서 명백히 필요하다.
최근, 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 다수의 한계를 극복할 것이라고 기대되는 완전히 새로운 기술이 단백질 과학에서 보고된 바 있다. 구체적으로, 생체내에서 비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는, 원핵생물 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(E. 콜라이(E. coli))(예를 들면, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500]) 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae)(S. 세레비지애(S. cerevisiae))(예를 들면, 문헌 [J. Chin et al.; Science 301:964-7 (2003)])의 단백질 생합성 기구에 새로운 성분들을 추가시켰다. 광친화성 표지 및 광이성질체화가능한 아미노산, 케토 아미노산, 및 글리코실화된 아미노산을 비롯한, 신규의 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 가진 다수의 새로운 아미노산이 이러한 방법에 의해 앰버 코돈인 TAG에 대한 반응으로 E. 콜라이 및 효모에서 단백질 내로 효율적이고 신뢰도 높은 방식으로 도입되었다. 예를 들면, 문헌 ([J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027]; [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11 :1135-1137]; [J. W. Chin, et al, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024]; 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem . Comm .. 1-10])을 참조한다. 이 연구들은 단백질에서 발견되지 않으며, 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견된 모든 작용기에 대해 화학적으로 불활성이고, 효율적으로 그리고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학적 작용기, 예를 들면, 알킨 기 및 아지드 부분을 선택적으로 그리고 통상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.
비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력을 통해 천연적으로 발생된 작용기, 예를 들면, 리신의 엡실론-NH2, 시스테인의 설프하이드릴-SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 대한 귀중한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있다. 일부 화학적 작용기는 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견된 작용기에 대해 불활성을 나타내지만, 명백히 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 아지드 및 아세틸렌 기는 촉매량의 구리의 존재하의 수성 조건에서 휘스겐(Huisgen) [3+2] 사이클로첨가 반응을 하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) Org . Chem. 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem. Int . Ed. 41:2596-2599])를 참조한다. 예를 들어, 당업자는 아지드 부분을 단백질 구조 내로 도입함으로써 단백질에서 발견된 아민, 설프하이드릴, 카르복실산, 하이드록실 기에 대해 화학적으로 불활성이지만, 아세틸렌 부분과 원활히 효율적으로 반응하여 사이클로첨가 생성물을 형성하는 작용기를 도입할 수 있다. 중요하게는, 아세틸렌 부분의 부재하에서 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 및 생리학적 조건하에서 화학적으로 불활성이며 반응되지 않은 상태로 남아있다.
본 발명은 특히 EPO의 활성 및 제조와 관련된 문제점을 다루고, 생물학적 또는 약리학적 특성이 개선된, 예를 들면, 치료학적 반감기가 개선된 hEPO 폴리펩티드의 제조 또한 다룬다.
본 발명의 요약
본 발명은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 제2 fEPO 폴리펩티드에 연결되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 몇몇 실시태양에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 폴리펩티드는 fEPO 폴리펩티드이다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결되어 있는 적어도 2개의 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기와 같이 fEPO 중의 2차 구조에 상응하는 하기 영역들 중 하나 이상에 있는 임의의 위치에 도입된다: 1-7(N 말단), 8-26(A 나선), 27-54(A 나선와 B 나선 사이의 영역), 55-83(B 나선), 84-89(B 나선와 C 나선 사이의 영역), 90-112(C 나선), 113-137 (C 나선와 D 나선 사이의 영역), 138-161(D 나선), 162-166(C 말단), 39-41(베타 시트 1), 133-135 (베타 시트 2), 47-52(미니 B 루프), 114-121(미니 C 루프), 34-38(A 나선과 역평행 베타 1 시트 사이의 루프), 51-57(B' 나선의 C 말단 종단부, B' 나선과 B 나선 사이의 루프, 및 B 나선의 N 말단 종단부), 82-92(B 나선과 C 나선 사이의 영역), 및 120-133(C 나선과 역평행 베타 시트 2 사이의 영역). 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 중의 하기 위치 중 하나에 도입된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 및 166. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 중의 하기 위치 중 하나에 도입된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 및 166. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 중의 하기 위치 중 하나에 도입된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17,21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 113, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,136, 162, 163, 164, 165 및 166. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 중의 하기 위치 중 하나에 도입된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 113, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 162, 163, 164, 165 및 166. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 하기 위치들 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다: 21, 24, 27, 28, 30, 31, 34, 36, 37, 38, 40, 55, 68, 72, 76, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,136, 및 162. 몇몇 실시태양에서, 위치 21, 24, 38, 83, 85, 116, 및 119를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이들 또는 다른 위치에 있는 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 분자에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 하기 위치들 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다: 18, 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55, 및 60, 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 하기 위치들 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다: 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55, 및 60. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 하기 위치들 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다: 18, 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55, 및 60. 몇몇 실시태양에서, 위치 53, 58, 116, 121, 89, 94, 72, 77, 86, 91, 31, 36, 132, 137, 163, 168, 120, 125, 55, 및 60을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이들 또는 다른 위치에 있는 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 분자에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 하기 위치들 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다: 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 및 130. 몇몇 실시태양에서, 위치 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 및 130을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이들 또는 다른 위치에 있는 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 분자에 연결되어 있다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 에리트로포이에틴 수용체에 대한 fEPO 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 fEPO 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 fEPO 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 숙주 세포에서 생산된 fEPO 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 서열번호 2 중 N24, N36, N38, Q58, Q65, N83, Q86, G113, Q115, 및 S126 및 그의 조합으로 구성되나, 그에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 아미노산의 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 서열번호 4 중 N24, N36, N38, Q58, Q65, N83, Q86, G113, Q115, 및 S126 및 그의 조합으로 구성되나, 그에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 아미노산의 치환을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드에서의 아미노산 치환은 천연적으로 발생된 아미노산 또는 비천연적으로 발생된 아미노산으로 이루어질 수 있는데, 단, 적어도 하나의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 이루어진다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아세틸 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00001
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 기를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00003
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이며, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드는 에리트로포이에틴 효현제, 부분적인 효현제, 길항제, 부분적인 길항제, 또는 역 효현제이다. 몇몇 실시태양에서, 에리트로포이에틴 효현제, 부분적인 효현제, 길항제, 부분적인 길항제, 또는 역 효현제는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 수용성 중합체에 연결되어 있는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 fEPO의 부위 2 영역(AC 나선형 다발면을 포함하는 단백질 영역) 내에 존재한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결되어 있는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 fEPO 길항제가 제2 fEPO 수용체 분자에 결합하는 것을 방해함으로써 fEPO 수용체의 이량체화를 방해한다. 몇몇 실시태양에서, 루신 이외의 아미노산이 서열번호 2 중 L108를 대신하는 것으로서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 아르기닌 또는 리신이 서열번호 2 중 L108를 대신하는 것으로서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2 중 L108를 대신하는 것으로서 치환된다.
본 발명은 또한 엄격한 조건하에서 서열번호 24, 25, 26, 또는 27에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인, 단리된 핵산을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈, 및 4 염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 수용성 중합체에 연결된 fEPO 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 fEPO 폴리펩티드를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해서는 별다른 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다.
몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 fEPO 폴리펩티드는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를, 아미노옥시 기, 하이드록실아민 기, 히드라진 기, 히드라지드 기 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아미노옥시 기, 하이드록실아민 기, 히드라진 기, 히드라지드 기 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 fEPO 폴리펩티드는 카르보닐 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조한다.
몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 fEPO 폴리펩티드는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를, 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 fEPO 폴리펩티드는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를, 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 약 1 내지 약 100 kDa 사이이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 1 kDa 내지 50 kDa 사이이다.
몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각 분지의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa 사이, 또는 1 kDa 내지 50 kDa 사이이다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 기, 아세틸 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 하이드록실아민, 히드라지드, 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.
본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다.
본 발명은 또한 fEPO 폴리펩티드를 코딩하며, 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 fEPO 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 오르토고날 RNA 신테타제 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함한다.
본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 fEPO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 오르토고날 RNA 신테타제 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를 상기 fEPO 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 fEPO 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 fEPO의 치료학적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법들은 천연적으로 발생된 fEPO 중의 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시키는 단계, 및/또는 fEPO 폴리펩티드를 수용성 중합체에 연결시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 fEPO 분자를 사용하여 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 점을 제외하고, 서열번호 1, 2, 3, 또는 4에 나타낸 서열을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 서열번호 2, 또는 서열번호 4로부터의 1-6, 21-40, 68-89, 116-136, 162-166, 또는 서열번호 1, 또는 서열번호 3의 상응하는 아미노산 위치를 포함하나, 이에 한정도지 않는 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 서열번호 1, 2, 3, 또는 4에 나타낸 서열을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기서, 적어도 하나의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 것이다. 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 서열번호 2 또는 4에 나타낸 서열을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기서, 적어도 하나의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 당류 부분을 통해 폴리펩티드에 연결되어 있다.
도 1 - 인간 및 고양이 에리트로포이에틴의 서열 정렬을 나타낸 다이어그램이다.
도 2 - 진뱅크에 기탁된 2개의 서열(진뱅크 수탁 번호 U00685 및 진뱅크 수탁 번호 L10606), 공통 서열 사이의 차이를 강조하여 표시한 다이어그램이다.
도 3 - 고친화성 및 저친화성 수용체와 함께, 4개의 나선형 다발 단백질 에리트로포이에틴(EPO)에 대한 일반 구조의 대체 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 4 - 고친화성 및 저친화성 수용체와 함께, 4개의 나선형 다발 단백질 에리트로포이에틴(EPO)에 대한 일반 구조의 대체도에 관한 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 5 - 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입되는 몇몇의 선택 부위를 나타낸 다이어그램이다.
도 6 - 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입되는 몇몇의 선택 부위의 상면도를 나타낸 다이어그램이다.
도 7 - 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입되는 몇몇의 선택 부위의 상면도를 나타내고, 상기 부위 중 글리코실화 부위에 근접해 있는 부위를 강조하여 표시한 다이어그램이다.
도 8 - 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입되는 몇몇의 선택 부위, 천연적으로 발생된 아미노산 및 서열번호 2 및 서열번호 4로부터의 아미노산 위치, 및 상기 부위에 대한 평균 Cx를 나타낸 차트이다.
도 9 - 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입되는 몇몇의 선택 부위, 천연적으로 발생된 아미노산 및 서열번호 2 및 서열번호 4로부터의 아미노산 위치, 및 상기 부위에 대한 평균 Cx를 나타낸 차트이다.
도 10a - 제조 완충액의 농도에 대하여 그래프로 작성된 450 nm에서의 광학 밀도를 나타낸 것이다.
도 10b - 내독소의 농도에 대하여 그래프로 작성된 450 nm에서의 광학 밀도를 나타낸 것이다.
도 11 - TF-1 증식 분석법을 나타낸 다이어그램이다.
도 12 - 리간드 결합시의 fEPO 수용체 동종이량체화를 나타낸 다이어그램이다.
도 13 - 종 모양의 투여량 반응 곡선으로 보여지는, fEPO의 농도를 증가시키면서 플롯팅된 450 nm에서의 OD를 나타낸다.
도 14 - TF-1 세포의 상이한 시딩 밀도를 나타내는 것이다. 본 그래프에서는, 예를 들면, JAK-STAT 신호 전달 경로라고 가정했을 때, fEPO에 대한 반응으로 최적의 활성을 나타내기 위해서는 fEPO 및 fEPO 수용체 사이의 비가 1:2라는 것을 나타낸다.
도 15 - 세포 기아가 세포 분열과 동시에 일어나는지 여부 및 그 결과로서 동역학적 범위가 더 증가하게 되었는지 여부를 측정한 실험상의 결과를 나타낸 그래프이다-상기 결과에서는 어떤 특별한 유익성이 없는 것으로 나타났다.
도 16 - 시딩 밀도가 20,000, 인큐베이션 시간이 72시간, fEPO 출발 농도가 500 ng/ml, 및 희석율이 2.5x인, TF-1 분석법에 사용된 조건을 나타낸 그래프이다.
도 17 - 세포 계대접종 횟수, EC50, OD' 및 동역학적 범위에 대한 데이터를 제공하는, 분석법의 강건성을 측정한 차트이다.
도 18 - 야생형 fEPO 및 제조 완충액을 사용하여 이루어진 TF-1 분석법의 수행능 분석을 나타낸 차트 및 그래프이다.
도 19 - 야생형 인간 EPO와 야생형 고양이 EPO의 수행능을 비교 분석한 그래프이다.
도 20 - 대조군으로서 야생형 fEPO를 사용하여 수행된, 다양한 농도의 CHO 조정 배지 및 비조정 배지에 대한 OD 측정치를 나타낸 그래프이다.
도 21 - 야생형 fEPO, CHO/PEI + 1.25 ng/mL fEPO 및 CHO/PEI 만인 것의 농도를 감소시켜 가면서, 그들의 OD 측정치를 비교한 그래프이다.
도 22 - 야생형 fEPO와 비교되는, 비천연 아미노산 pAF가 도입된 fEPO 변이체의 상대적인 활성도를 나타낸 차트 및 그래프이다.
도 23 - 특정 부위에 pAF가 도입되어 있는 수개의 fEPO 변이체, 및 그들 각각의 EC 50 ng/mL 측정치를 나타낸 막대 그래프이다.
도 24 - 야생형 fEPO와 비교되는, 4℃ 및 -80℃에서 5주간에 걸쳐 저장된 E72 fEPO 변이체, 및 그의 OD를 나타낸 그래프이다.
도 25 - 루시 F 벡터 및 tRNA의 위치, 관심의 대상이 되는 유전자의 전사 요소, 및 tRNA 신테타제를 도시한 개략도이다.
도 26 - 어윈(Irwin) 벡터 및 tRNA의 위치, 관심의 대상이 되는 유전자의 전사 요소, 및 tRNA 신테타제를 도시한 개략도이다.
도 27 - 고양이 에리트로포이에틴을 위한 루시 F 중 억제 발현 구성체 Nat L BB-Opti FEPO를 도시한 개략도이다.
도 28 - 고양이 에리트로포이에틴을 위한 어윈 중 억제 발현 구성체 Nat L BB-Opti FEPO를 도시한 개략도이다.
도 29 - 경쇄 및 중쇄 유전자를 갖는 일반 항체를 코딩하는, 본 발명에 따른 억제 발현 구성체를 도시한 개략도이다.
도 30 - ELISA(OD-50)에 의해 측정된, pAF 존재하의 fEPO 변이체의 억제 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 31 - SDS-PAGE에 의한 PEG화된 fEPO 이동을 비교하여 나타낸 것이다. 래인 1-3: fEPO R53 pAF 변이체와 20 kDa PEG의 반응. 래인 1 : R53, 8 ㎍ fEPO 로드, PEG 포함하지 않음. 래인 2: R53 PEG화, 2 ㎍ fEPO 로드. 래인 3: R53 PEG화, 8 ㎍ fEPO 로드. 래인 4-6: fEPO P129 pAF 변이체와 30 kDa PEG의 반응. 래인 4: P129, 8 ㎍ fEPO 로드, PEG 포함하지 않음. 래인 5: P129 PEG화, 2 ㎍ fEPO 로드. 래인 6: P129 PEG화, 8 ㎍ fEPO 로드. 래인 7-9: fEPO Y49 pAF 변이체와 40 kDa PEG의 반응. 래인 7: Y49, 8 ㎍ fEPO 로드, PEG 포함하지 않음. 래인 9: Y49 PEG화, 8 ㎍ fEPO 로드. 래인 9: Y49 PEG화, 2 ㎍ fEPO 로드. 38 kDa의 화살표 표시(→)는 PEG화되지 않은 fEPO의 이동 위치를 나타낸다. 박스형의 직사각형 표시는 PEG화된 fEPO의 이동 영역을 나타낸다.
도 32 - 2개의 PEG화된 변이체를 나타내는 fEPO D55 및 P129 pAF 변이체에 대한 PEG화 반응(30 kDa)을 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 래인 1: D55, PEG 포함하지 않음. 래인 2: D55 PEG화, 래인 3: 야생형 fEPO, 인큐베이션시키지 않은 것. 래인 4: P129, 8 ㎍ fEPO 로드, PEG 포함하지 않음. 래인 5: P129 PEG화, 2 ㎍ fEPO 로드. 래인 6: P129 PEG화, 8 ㎍ fEPO 로드. 38 kDa의 화살표 표시(→)는 PEG화되지 않은 fEPO의 이동 위치를 나타낸다. 박스형의 직사각형 표시는 PEG화된 fEPO의 이동 영역을 나타낸다.
도 33 - fEPO A1 pAF 변이체에 대한 성공적인 PEG화 반응(30 kDa)을 보여주는 SDS-PAGE 겔이다. 래인 1은 야생형 fEPO, 8 ㎍ 로드, 인큐베이션시키지 않은 것을 나타내고, 래인 2는 PEG화된 A1을 나타낸다.
도 34 - 둘 간의 상동성이 94%인, cEPO(서열번호 31)와 fEPO(서열번호 4) 아미노산 서열 사이의 비교를 나타낸 것이다.
도 35 - 둘 간의 상동성이 94%인, eEPO(서열번호 33)와 fEPO(서열번호 4) 아미노산 서열 사이의 비교를 나타낸 것이다.
도 36 - 실시예 32에서 수행된 실험을 통해 얻은 결과로서, 각종 처리가 헤마토크리트 및 적혈구(RBC)에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
정의
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구성체 및 시약에 한정되지 않으며, 변할 수 있다는 점을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이며, 오직 첨부되는 특허청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본원 및 특허청구범위에서 사용된 바, 단수 형태의 표현인 "하나"("a," "an") 및 "그"는 달리 명시하지 않는다면 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "fEPO"에 대한 언급은 이러한 단백질 하나 이상을 지칭하며, 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련인에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나, 등가인 임의의 방법, 장치 및 물질들을 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용할 수 있지만, 지금부터 바람직한 방법, 장치 및 물질을 기술한다.
본원에서 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보에 기술되는 구성체 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 본원에서 참고로 인용된다. 본원에서 논의되는 공보는 오직 본 출원의 출원일 전 그들의 개시내용만이 제공된다. 본원 중 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 선행하지 않을 권리를 갖는다는 것을 용인하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다.
"실질적으로 정제된"이라는 용어는 그의 천연적으로 발생된 환경, 즉, 본래의 세포, 또는 재조합으로 생산된 fEPO의 경우, 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 보통 수반하거나, 그와 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않을 수 있는 fEPO를 지칭한다. 실질적으로 세포 물질을 함유하지 않을 수 있는 fEPO는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만(건조 중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질로 된 제제를 포함한다. fEPO 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. fEPO 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L, 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 "실질적으로 정제된" fEPO는 적절한 방법, 예를 들면, SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 특히 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 더욱 특히 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99% 이상의 순도 수준을 가질 수 있다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용되는 방법, 예를 들면, 직접 흡수, 형질도입, f-교배, 또는 당업계에 알려져 있는 다른 재조합 숙주 세포 생성 방법에 상관없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터, 예를 들면, 플라스미드로서 보유될 수 있거나, 별법으로, 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "배지" 또는 "배지들"은 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 숙주 세포, E. 콜라이, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 및 세포 함유물을 비롯한 임의의 숙주 세포를 지지하거나 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들면, 증식 단계 전후의 배지를 비롯한 fEPO가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 상기 용어는 예를 들면, fEPO가 세포내에서 생산되고, 숙주 세포가 용해되거나, 붕괴되어 fEPO를 방출하는 경우, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "IRES" 또는 내부 리보좀 진입 부위(internal ribosome entry site)는 당업자에게 알려져 있다. IRES는 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,715,821호에 기재된 비시스트론 리포터 분석법과 같은, 캡 독립형 번역에 관한 분석법에서 번역을 개시시키기에 충분할 정도로 내부 리보좀 진입/결합을 허용하는 핵산 분자, 예로서, mRNA 분자 중의 영역이다. mRNA 분자 내에 IRES가 존재하게 되면, 다르게는 번역되지 않을 연결된 단백질 코딩 서열의 캡 독립형 번역이 이루어질 수 있다. IRES는 최초로는 피코나바이러스에서 확인되었고, 이는 캡 독립형 번역을 위한 전형적인 예인 것으로 간주되고 있다. 모든 피코나바이러스의 5' UTR는 장쇄이며, 직접 리보좀을 동원하고 그에 결합하여 초기의 캡 결합 단계를 우회함으로써 번역 개시를 매개한다.
IRES 요소는 빈번하게는 바이러스성 mRNA에서 발견이 되며, 비바이러스성 mRNA에서는 드물게 발견된다. 현재까지, 그의 각 5' UTR 중에 작용성 IRES 요소를 함유하는 것으로 밝혀진 비바이러스성 mRNA로는 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BIP)을 코딩하는 것(문헌 [Macejak, D. J. et al., Nature 353:90-94 (1991)]); 초파리의 안테나페디아(Antennapedia)(문헌 [Oh, S. K. et al., Genes Dev. 6:1643-53 (1992)]); 및 울트라바이소란(Ultrabithoran)(문헌 [Ye, X. et al., Mol. Cell. Biol. 17:1714-21 (1997)]); 섬유아세포 성장 인자 2(문헌 [Vagner et al., Mol. Cell. Biol. 15:35-47 (1915)]); 개시 인자(문헌 [Gan et al., J. Biol. Chem. 273:5006-12 (1992)]); 단백질 온코진 c-myc(문헌 [Nambru et al., J. Biol. Chem. 272:32061-6 (1995)]; [Stonely M. Oncogene 16:423-8 (1998)]); 혈관 내피 성장 인자(VEGF: Vascular endothelial growth factor)(문헌 [Stein J. et al., Mol. Cell. Biol. 18:3112-9 (1998)])를 포함한다. 세포성 IRES 요소는 명백한 서열을 갖고 있지 않거나, IRES 서열과 또는 서로서로 구조상의 유사성은 없으며, 이에 번역 분석법을 사용함으로써 확인할 수 있다. 또다른 공지의 IRES로는 미국 특허 번호 제6,171,821호(본원에서 그의 전문이 참고로 인용된다)에 개시된 XIAP IRES가 있다.
본원에서 단백질 리폴딩과 관련하여 사용된 "환원제"란 환원된 상태에서 설프하이드릴기를 보유시키고, 세포내 또는 세포간의 디설피드 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 환원제로는 디티오트레이톨(DTT: dithiothreitol), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다는 점이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.
본원에서 단백질 리폴딩과 관련하여 사용된 "산화제"란 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 산화제로는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다는 점이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.
본원에서 사용된 "변성 제제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 언폴딩을 일으키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성 제제 또는 변성제의 강도는 특정 변성 제제 또는 변성제의 특성 및 농도, 둘 모두에 의해 결정된다. 적합한 변성 제제 또는 변성제로는 카오트로프, 계면활성제, 유기물질, 수용성 용매, 인지질, 또는 2개 이상의 상기 제제의 조합물일 수 있다. 적합한 카오트로프는 우레아, 구아니딘 및 나트륨 티오시아네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유용한 계면활성제로는 강한 계면활성제, 예를 들면, 황산나트륨 도데실, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들면, 트윈(Tween) 또는 트리톤 계면활성제), 사르코실(Sarkosyl), 온화한 비이온성 계면활성제(예를 들면, 디지토닌), 온화한 양이온성 계면활성제, 예를 들면, N→2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 온화한 이온성 계면활성제(예를 들면, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트), 또는 설포베타인(쯔비터젠트(Zwittergent)), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS), 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 유기 수용성 용매, 예를 들면, 아세토니트릴, 저급 알카놀(특히, C2-C4 알카놀, 예를 들면, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C2-C4 알칸디올, 예를 들면, 에틸렌-글리콜)은 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 천연적으로 발생된 인지질, 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체, 예를 들면, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "리폴딩"은 디설피드 결합 함유 폴리펩티드가 디설피드 결합에 대해 부적합하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 본래의 또는 적합하게 폴딩된 형태로 형질전환되는 임의의 공정, 반응 또는 방법을 기술한다.
본 명세서에 사용된 "코폴딩"은 구체적으로 서로 상호작용하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 사용하여 언폴딩된 또는 부적합하게 폴딩된 폴리펩티드를 본래의 적합하게 폴딩된 폴리펩티드로 형질전환시키는 리폴딩 공정, 반응 또는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "에리트로포이에틴" 또는 "EPO"는 그의 생물학적 활성과는 상관없이, 그리고, 추가로는 재조합(cDNA, 게놈 DNA로부터 생산되든), 합성, 트랜스제닉, 및 유전자 활성화 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 그의 합성 또는 제조 방법과는 상관없이, 에리트로포이에틴 유사체, 에리트로포이에틴 이소형(예를 들면, 미국 특허 번호 제5, 856,298호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것), 에리트로포이에틴 모사체(미국 특허 번호 제6,310,078호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것), 에리트로포이에틴 단편, 하이브리드 에리트로포이에틴 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 동족체, 글리코실화 패턴 변이체, 및 뮤테인 뿐만 아니라, 고양이 에리트로포이에틴(fEPO)의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질도 포함하여야 한다. 에리트로포이에틴의 구체적인 예로는 에포에틴 알파(미국 특허 번호 제4,667,016호; 제4,703,008호; 제5,441,868호; 제5,547,933호; 제5,618,698호; 제5,621,080호; 제5,756,349호; 및 제5,955,422호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것), 다베포이에틴 알파(예를 들면, 유럽 특허 출원 EP640619에 기재되어 있는 것), 다이네포(DYNEPO)™(에포에틴 델타), 인간 에리트로포이에틴 유사체(예를 들면, 국제 특허 출원 WO9966054 및 미국 특허 번호 제6,548,653호; 및 제5,888,772호(이들은 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 인간 혈청 알부민 융합 단백질), 에리트로포이에틴 돌연변이체(예를 들면, 국제 특허 출원 WO9938890, 및 미국 특허 번호 제6,489,293호; 제5,888,772호; 제5,614,184호; 및 제5,457,089호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것), 에리트로포이에틴 오메가(이는 미국 특허 번호 제5,688,679호; 제6,099,830호; 제6,316,254호; 및 제6,682,910호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것과 같은, 인간 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한 단편으로부터 생산될 수 있다), 변경된 글리코실화된 인간 에리트로포이에틴(예를 들면, 국제 특허 출원 WO9911781 및 EP 1064951에 기재되어 있는 것), 및 PEG 접합된 에리트로포이에틴 유사체(예를 들면, WO9805363 및 미국 특허 번호 제5,643,575호; 제6,583,272호; 제6,340,742호; 및 제6,586,398호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 내인성 인간 에리트로포이에틴의 발현을 위해 변형된 세포주의 구체적인 예는 국제 특허 출원 WO9905268 및 WO9412650, 및 미국 특허 번호 제6,376,218호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
"고양이 에리트로포이에틴(fEPO)" 또는 "fEPO 폴리펩티드"라는 용어는 상기 기술된 바와 같은 에리트로포이에틴 또는 EPO 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 fEPO의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. fEPO 폴리펩티드는 천연적으로 발생된 고양이 에리트로포이에틴의 약제학적으로 허용되는 염 및 프로드럭, 및 상기 염의 프로드럭, 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성체 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 인간 에리트로포이에틴의 효현제, 모사체, 및 길항제 변이체 및 그의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. fEPO 폴리펩티드 및 모사체의 예로는 미국 특허 번호 제6,310,078호; 제5,106,954호; 제6,703,480호; 제6,642,353호; 제5,986,047호; 및 제5,712,370호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것을 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 그 둘 모두에 추가의 아미노산을 포함하는 융합체도 "fEPO 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다. 예시적인 융합체로는 예로서, 메티오닌이 fEPO의 N 말단에 연결되어 있는 것인 메티오닐 에리트로포이에틴, 정제용 융합체(폴리히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 혈청 알부민 결합 펩티드를 포함하는 융합체, 및 혈청 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민을 포함하는 융합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연적으로 발생된 fEPO 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있다. 완전한 천연적으로 발생된 fEPO 아미노산 서열 뿐만 아니라, 성숙한 천연적으로 발생된 hEPO 아미노산 서열에 대해서는 각각 본원에서 서열번호 1 및 서열번호 2를 참조한다. 완전한 공통 fEPO 아미노산 서열 뿐만 아니라, 성숙한 공통 fEPO 아미노산 서열에 대해서는 각각 본원에서 서열번호 3 및 서열번호 4를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 실질적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4와 동일하다. fEPO 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자 및 돌연변이체 fEPO 폴리펩티드 또한 공지되어 있다. fEPO 돌연변이체의 예로는 미국 특허 번호 제6,489,293호; 제6,153,407호; 제6,048,971호; 제5,614,184호; 및 제5,457,089호(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것을 포함한다.
에리트로포이에틴 또는 fEPO는 그의 수용체에의 결합, 그의 수용체의 이량체화 유발, 적혈구 생산 자극, 및 세포 증식 자극을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적 활성을 갖는다. 에리트로포이에틴 및 hEPO의 생물학적 활성 중 몇몇에 대한 예는 미국 특허 번호 제6,676,947호; 제6,579,525호; 제6,531,121호; 제6,521,245호; 제6,489,293호; 제6,368,854호; 제6,316,254호; 제6,268,336호; 제6,239,109호; 제6,165,283호; 제5,986,047호; 제5,830,851호; 및 제5,773,569호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
fEPO의 생물학적 활성 단편/변이체는, 192개의 아미노산 중 처음 26개는 분비되는 동안에 절단이 될 뿐만 아니라, 마지막 4개의 아미노산들 중 하나 이상은 성숙한 형태의 에리트로포이에틴(서열번호 1 및 서열번호 2)가 형성되는 동안에 제거가 되는 것인, 192개의 아미노산을 포함하는 유전자 생성물을 포함한다. "fEPO 폴리펩티드"라는 용어는 또한 24, 38, 및 83에 N 연결된 글리코실화 부위 및 126에 O 연결된 글리코실화 부위를 갖는 것인 글리코실화된 형태를 포함한다(문헌 ([Takeuchi et al. (1988) JBC 263: 3657-3663]; [Saski et al. (1988) Biochemistry 27; 8618-8626])). 단일 뉴클레오티드 변이를 포함하는 변이체(즉, S104N 및 L105F, P122Q, E13Q, Q58→QQ, G113R) 또한 hEPO의 생물학적 활성 변이체로서 간주된다(문헌 ([Jacobs et al., (1985) Nature 313: 806-810]; [Funakoshi et al., (1993) Biochem.Biophys.Res.Cornm. 195: 717-722])). "fEPO 폴리펩티드"라는 용어는 또한 화학적 수단에 의해 연결되거나, 융합 단백질로서 발현된, fEPO 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 당질, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 임의 유형의 다른 활성 분자의 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체, 또는 동종다량체(문헌 ([Sytkowski et al., (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(3):1184-8]; 및 [Sytkowski et al. (1999) J.Biol.Chem. 274(35):24773-8], 및 미국 특허 번호 제6,187,564호; 제6,703,480호; 제5,767,078호)(본원에서 참고로 인용된다)) 뿐만 아니라, 특이적인 결실을 포함하여도, 생물학적 활성은 유지하는 폴리펩티드 유사체도 포함한다(문헌 ([Boissel et al., (1993) JBC 268: 15983-15993]; [Wen et al., (1994) JBC 269: 22839-22846]; [Bittorf et al., (1993) FEBS 336: 133-136]; 및 미국 특허 번호 제6,153,407호(본원에서 참고로 인용된다))).
달리 언급하지 않는 한(즉, 서열번호 3에 기초하여 비교한다고 언급할 경우), 본원에 기술된 fEPO 내의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 서열번호 2에서의 위치에 기초한다. 서열번호 2 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 fEPO 융합체, 변이체, 단편 등에서 쉽게 확인할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들면, 서열 정렬 프로그램, 예를 들면, BLAST를 사용하여 서열번호 2 중의 위치에 상응하는 단백질을 정렬하고, 상기 단백질 중의 특정 위치를 확인할 수 있다. 서열번호 2에 관한, 본원에 기술된 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가는 본원에 기술되어 있거나, 당업계에 공지되어 있는 fEPO 융합체, 변이체, 단편 등의 상응하는 위치에서의 치환, 결실 또는 첨가도 언급하고자 하는 것이며, 이는 명백히 본 발명에 포함된다.
"fEPO 폴리펩티드"라는 용어는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 포함한다. 천연적으로 발생된 fEPO 폴리펩티드 중의 매우 다양한 아미노산 위치에서 이루어진 예시적인 치환이 기술되어 있으며, 이는 효현제 활성을 증가, 폴리펩티드의 가용성을 증가, 폴리펩티드의 길항제로의 전환 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 같은 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 용어 "fEPO 폴리펩티드"에 포함된다.
고양이 EPO 길항제로는 저친화성 수용체 결합 부위(부위 2)에서 발견되는 V11, R14, Y15, D96, K97, S100, R103, S104, T107, L108, 및 R110에서의 치환(V11S, R14Q, Y151, S100E, R103A, S104I, 및 L108K를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 [Elliot et al. 1993] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 길항제는 fEPO가 길항제로서 작용할 수 있도록 하는 영역 10-15 또는 100-108 중의 적어도 하나의 치환을 포함한다. 예로서, 문헌 ([Elliot et al. 1993] 및 [Cheetham et al. 1998])을 참조한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 길항제는 hEPO 분자의 부위 2 결합 영역에 존재하는, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 하기 치환: V11S, R14Q, Y15I, S100E, R103A, S104I, 및 L108K를 포함함으로써 추가로 더 변형된다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 fEPO의 생물학적 활성을 조정하는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 예를 들면, 첨가, 치환 또는 결실은 fEPO 수용체에 대한 친화성을 조정할 수 있거나, 수용체 이량체화를 조정할 수 있거나(증가 또는 감소시킬 수 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 수용체 이량체를 안정화시킬 수 있거나, 순환 반감기를 조정할 수 있거나, 치료학적 반감기를 조정할 수 있거나, 폴리펩티드의 안정성을 조정할 수 있거나, 투여량을 조정할 수 있거나, 방출 또는 생체이용성을 조정할 수 있거나, 정제를 촉진시킬 수 있거나, 특정 투여 경로를 개선 또는 변경시킬 수 있다. 유사하게, fEPO 폴리펩티드는 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 다른 친화성에 기초한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자(비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다.
"fEPO 폴리펩티드"라는 용어는 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 연결되거나, 링커를 통해 간접적으로 연결된 fEPO 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 및 이종다량체를 포함한다. 예시적인 링커로는 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 폴리펩티드와 같은 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20종의 일반 아미노산 중 하나 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. "비천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어는 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 일반 아미노산 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 변형에 의해 천연적으로 발생하지만, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연적으로 발생된 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형기로는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 또는 다른 부분들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"작용기," "활성 부분," "활성화 기," "이탈기," "반응성 부위," "화학적 반응기" 및 "화학적 반응성 부분"이라는 용어는 당업계 및 본원에서 분자의 독특한 정의가능한 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서는 다소 동일한 의미를 가지며, 본원에서는 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다른 분자와 반응성을 갖는 분자의 부분을 나타내는데 사용된다.
"결합" 또는 "링커"라는 용어는 보통 화학 반응의 결과로서 형성되고, 전형적으로는 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 가수분해에 안정한 결합은 결합이 수중에서 실질적으로 안정하고, 생리학적 조건하에 장기간 동안, 아마도 심지어는 무기한의 기간 동안을 포함하나, 이에 한정되지 않는 조건에서 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해에 불안정한 또는 가수분해로 분해가능한 결합은 결합이 물 또는 예를 들면, 혈액을 비롯한 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 중, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기 중에 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상의 알코올 기와 반응시킴으로써 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건하에서 가수분해됨으로써 상기 제제를 유리시킨다. 다른 가수분해로 분해가능한 결합은 카르보네이트 결합; 아민 및 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올을 포스페이트 기와 반응시킴으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드 및 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합; 알데히드 및 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포름에이트 및 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 중합체, 예를 들면, PEG의 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아민 기 및 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 중합체의 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 포스포라미다이트 기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "생물학적 활성 분자," "생물학적으로 활성인 부분" 또는 "생물학적 활성제"라는 용어는 바이러스, 세균, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적 유기체의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히 본원에서 사용되는 바, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질환을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하거나, 다르게는, 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 증강시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 미셀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류로는 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 약제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"이작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정의 생물학적으로 활성인 성분 상의 기와 반응성을 띠는 하나의 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응성을 띠는 또다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 제1 생물학적으로 활성인 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적으로 활성인 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 펩티드에 다양한 화합물을 부착시키기 위한 많은 절차 및 링커 분자들이 공지되어 있다. 예로서, 유럽 특허 출원 번호 제188,256호; 미국 특허 번호 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제4,680,338호; 제4,569,789호; 및 제4,589,071호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. "다작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다.
치환기 기가 왼쪽으로부터 오른쪽으로 쓰여진 그들의 통상적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 화학식을 오른쪽에서 왼쪽으로 씀으로써 형성되는 화학적으로 동일한 치환기 기도 동일하게 포함하며, 예를 들면, -CH2O-는 -OCH2-와 일치한다.
"치환기"라는 용어는 "비간섭 치환기"를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적합한 비간섭 치환기 또는 라디칼은 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C1-C12 아르알킬, C1-C12 알크아릴, C3-C12 사이클로알킬, C3-C12 사이클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C2-C12 알콕시아릴, C7-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬설피닐, C1-C10 알킬설포닐, --(CH2)m--0-(C1-C10 알킬)(여기서, m은 1 내지 8이다), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 치환된 헤테로사이클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO2, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 알킬), --C(O)--(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C1-C10 알킬), --OH, --SO2, =S, --C00H, --NR2, 카르보닐, --C(O)--(C1-C10 알킬)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(C1-C10 아릴)-S--(C6-C10 아릴), --C(O)--(C1-C10 아릴), --(CH2)m--0--(--(CH2)m--O--(C1-C10 알킬)(여기서, 각각의 m은 1 내지 8이다), --C(O)NR2, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O)NR2, --NRC(S)NR2, 그의 염 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아르알킬, 또는 알크아릴이다.
"할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.
"알킬"이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 완전히 포화, 단일- 또는 다중불포화될 수 있고, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 2가 및 다가 라디칼(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미한다)을 포함할 수 있는 직쇄 또는 분지형 쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그의 조합물을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 기, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 그의 동족체 및 이성체, 예를 들면, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 불포화된 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 언급하지 않는 한, 이하 더 상세히 정의되는 알킬의 유도체, 예를 들면, "헤테로알킬"을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소 기로 제한된 알킬 기를 "동종알킬"이라 칭한다.
"알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 제한하는 것은 아니지만, 화학식 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-에 의해 예시되는, 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하며, 하기에서 "헤테로알킬렌"으로 설명되는 기를 추가로 포함한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖고, 본 발명에서는 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 상기와 같은 기가 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 더 짧은 쇄 알킬 또는 알킬렌 기이다.
"알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)라는 용어는 그들의 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자를 통해 분자 나머지 부분에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
"헤테로알킬"이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 또다른 용어와 함께, 언급된 갯수의 탄소 원자 및 0, N, Si 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자로 구성된 안정한 직쇄 또는 분지형 쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그의 조합물을 의미하며, 여기서, 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예로는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2개 이하의 헤테로원자는 연속적일 수 있으며, 예를 들면, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 제한하는 것은 아니지만, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 예시되는, 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자는 또한 쇄 말단의 한쪽 또는 양쪽 모두를 차지할 수 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 멀티아암형(multiarmed)의 경우, 연결기의 화학식이 쓰여지는 방향은 연결기의 배향을 암시하지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 모두를 나타낸다.
"사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬" 사이클릭 버전을 나타낸다. 따라서, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬은 포화 및 불포화된 환 결합을 포함한다. 추가로, 헤테로사이클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "수용성 중합체"라는 용어는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. 수용성 중합체의 fEPO에의 결합을 통해 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 또는 조정된 혈청 반감기, 또는 증가된 또는 조정된 치료학적 반감기, 조정된 면역원성, 조정된 물리적 회합 특징, 예를 들면, 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나, 가질 수 없다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체(미국 특허 번호 제5,252,714호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당, 글리칸, 셀룰로스 및 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바, "폴리알킬렌 글리콜"이라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 그의 유도체를 지칭한다. "폴리알킬렌 글리콜"이라는 용어는 선형 및 분지형 중합체, 둘 모두 및 평균 분자량이 0.1 kDa 내지 100 kDa인 것을 포함한다. 다른 예시적인 실시태양들은 예를 들면, 상업적 공급업체 카탈로그, 예를 들면, 쉐어워터 코퍼레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]에 열거되어 있다.
"아릴"이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, 함께 융합되거나 공유적으로 연결된 단일 환 또는 다중 환(바람직하게, 1 내지 3개의 환)일 수 있는 다중불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서, 상기 질소 및 황 원자가 임의로 산화되고, 질소 원자(들)가 임의로 4급화되는 아릴 기(또는 환)를 지칭한다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 각각의 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템계에 대한 치환기는 하기 기술하는 허용가능한 치환기의 군으로부터 선택된다.
간략히, "아릴"이라는 용어는 다른 용어들(아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 함께 사용되는 경우, 상기 정의한 아릴 및 헤테로아릴 환, 둘 모두를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴 기가, 탄소 원자 (메틸렌 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)가 예를 들면, 산소 원자(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 대체된 알킬 기를 비롯한 알킬 기(벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 부착된 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어들("알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 각각은 지시된 라디칼의 치환된 형태 및 비치환된 형태, 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다. 각 유형의 라디칼에 대한 예시적인 치환기를 하기에 제공한다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 지칭되는 기를 포함한다)에 대한 치환기는 0 내지 (2m' + 1)(여기서, m'는 상기 라디칼 중 탄소 원자의 총 갯수이다) 범위의 수의 -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, - SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치환되거나, 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하고, 0 내지 방향족 환 시스템 상의 총개방 원자가 갯수 범위의 수로 다음으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다: 할로겐, -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬(여기서, R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다). 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바, "혈청 반감기가 조정되었다"라는 용어는 그의 변형되지 않은 형태에 비하여 변형된 생물학적 활성 분자의 순환 반감기가 양성 또는 음성적으로 변하였다는 것을 의미한다. 혈청 반감기는 생물학적 활성 분자의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 각 샘플 중에서 상기 분자의 농도를 측정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상관관계를 통해 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 혈청 반감기의 증가는 바람직하게 적어도 약 2배이지만, 예를 들면, 투여 요법을 만족스럽게 하거나, 독성 효과를 피하는 경우에는 상기보다 더 적게 증가한 것도 유용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 증가는 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 또는 약 10배이다.
본원에서 사용되는 바, "치료학적 반감기가 조정되었다"라는 용어는 그의 변형되지 않은 형태에 비하여 치료학적 유효량의 변형된 생물학적 활성 분자의 반감기가 양성 또는 음성적으로 변하였다는 것을 의미한다. 치료학적 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 바람직하게는, 치료학적 반감기 증가는 유익한 특정 투여 요법, 유익한 특정 총 투여량을 가능하게 하거나, 원치 않는 효과를 피할 수 있게 한다. 몇몇 실시태양에서, 치료학적 반감기의 증가로 효능 증가, 변형된 분자의 그의 표적에의 결합 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 또다른 파라미터 또는 작용 기전의 증가 또는 감소가 일어난다.
"단리된"이라는 용어가 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 이는 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 그와 회합하고 있는 다른 세포 성분들을 실질적으로 함유하고 있지 않은 것을 나타낸다. 이는 균질한 상태에서 이루어질 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 수용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 전형적으로, 순도 및 균질성은 분석 화학 기법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피의 사용으로 측정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된 것이다. 특히 단리된 유전자는 그 유전자 측면에 위치하고, 관심의 대상이 되는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 나타낸다. 특히 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이상인 것을 의미한다.
"핵산"이라는 용어는 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 한정하지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연적으로 발생된 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 상보적 서열 뿐만 아니라, 명확하게 지시된 서열을 내재적으로 포함한다. 특히 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 수행될 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acids Res . 19: 5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260: 2605-2608 (1985)]; 및 [Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8: 91-98 (1994)]) 참조).
"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어들은 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용되는 바, 용어들은 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯한 임의의 길이로 된 아미노산 쇄을 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다.
항체는 특이 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 천연 항체는 일반적으로 분자량이 약 150,000 달톤인 이종 사량체 당단백질로서, 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 하나의 디설피드 공유 결합에 의하여 중쇄에 결합되어 있는 반면에, 디설피드 결합의 수는 상이한 면역 글로불린 이소타입의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격화된 쇄내 디설피드 결합을 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH)이 존재하며 그에 이어서 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL)이 존재하며 다른 쪽 끝에는 불변 도메인이 존재하는데; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 함께 정렬되어 있고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이라는 용어는, 가변 도메인의 임의 부분의 서열이 항체들 간에 매우 상이하여 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 특이성을 좌우하는 경우를 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통하여 부여되는 것은 아니다. 여기서, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 있어서 상보성 결정 영역(CDR: Complementarity Determining Region)이라고 불리는 3개의 절편으로 초점을 옮겨야 할 것이다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존되는 부분을 프레임워크 영역(FR: framework Region)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이 영역은 대부분 β-시트 형태를 띠고 있으며, 3 또는 4개의 CDR로 연결되어 루프 연결 구조를 형성하고, 몇몇 경우에 있어서는 이 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDR는 FR 영역에 의해 함께 근접하여 모아져 있으며, 다른 쇄의 CDR는 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조).
불변 도메인은 항체의 항원에의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체 또는 면역 글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 여기에는 5개의 면역 글로불린 주 부류가 있으며(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM), 이들 중 몇몇은 추가로 서브부류(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 나누어질 수도 있다. 상이한 부류의 면역 글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 다양한 인간 면역 글로불린 부류 중에서, 오로지 인간의 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.
생체내에서, 항체의 친화성 성숙은 보다 높은 친화성을 갖는 항체 변이체(1차적으로 체성 과돌연변이 유발법에 의해 생성된다)의 항원 선택에 의해 촉진된다. "레파토리 이동"은 또한 2차 또는 3차 반응의 우세한 생식 계열 유전자가 1차 또는 2차 반응의 우세한 생식 계열 유전자와 상이한 것으로 나타나는 경우에 발생한다.
면역계의 친화성 성숙 과정은 돌연변이를 시험관내에서 항체 유전자에 도입하고, 친화성이 개선된 돌연변이체를 분리하는 친화성 선택법을 사용함으로써 반복될 수 있다. 이러한 돌연변이 항체는 사상 박테리오파지 또는 미생물, 예를 들어, 효모의 표면상에 디스플레이될 수 있으며, 항체는 이의 항원에 대한 친화성과 항원으로부터의 해리 동력학(오프 속도)에 의하여 선택될 수 있다(문헌 [Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]). CDR 워킹 돌연변이 유발법(CDR walking mutagenesis)은 인간 면역결핍증 바이러스 제1형(HIV-1: human immunodeficiency virus type 1)의 인간 외피 당단백 gp120에 결합하는 인간 항체(문헌 ([Barbas III et al. PNAS (USA) 91 : 3809-3813 (1994)]; 및 [Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)]); 및 항-c-erbB-2 단일 쇄 Fv 단편(문헌 [Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)])의 친화성 성숙화에 사용된다. 항체 쇄 셔플링 및 CDR 돌연변이 유발법은 HIV의 제3의 고가변성 루프에 대하여 유도된 고친화성 인간 항체의 친화성 성숙화를 위해 사용되었다(문헌 [Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)]). 문헌 [Balint and Larrick Gene 137:109-118 (1993)]에는 컴퓨터 보조 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유도 주사 돌연변이 유발법에 관하여 기술되어 있는데, 이 방법에 의하여 가변 영역 유전자의 모든 CDR은 개선된 변이체에 대하여 동시에 그리고 철저하게 검색된다. ανβ3 특이 인간화 항체는 초기 제한적 돌연변이 유발 기술을 사용하여 친화성 성숙화가 이루어졌으며, 이때 상기 기술에서 6개 모두의 CDR 중 모든 위치에서의 성숙화 후에는 친화성이 가장 높은 돌연변이체를 포함하는 조합 라이브러리의 발현과 스크리닝이 이루어진다(문헌 [Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)]). 파지 디스플레이된 항체에 관하여는 문헌 ([Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)]; 및 [Rader and Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508 (1997)])에 리뷰되어 있다. 모체 항체에 비하여 개선된 친화성을 갖는 돌연변이 항체가 상기 참고 문헌에 보고되어 있는 각각의 경우에 있어서, 돌연변이 항체는 CDR 중 아미노산 치환을 갖고 있다.
본원에 있어서, "친화성 성숙"이란, 항체의 항원에 대한 친화성이 강화되는 과정을 의미한다. 친화성 성숙화 방법으로는 컴퓨터에 의한 스크리닝 방법 및 실험적 방법이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 있어서, "항체"란, 실질적으로 항체 유전자 모두 또는 일부에 의해서 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 이러한 면역 글로불린 유전자로서는 카파, 람다, 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자와, 다수의 면역 글로불린 가변 영역 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원의 항체는 전장 항체 및 항체 단편을 포함하며, 임의의 유기체에 천연으로 존재하는 항체 또는 조작된 항체(예를 들어, 변이체)를 포함한다는 의미를 갖는다.
"항체 단편"이란, 전장 형태 이외에 임의 형태의 항체를 의미한다. 본원의 항체 단편은 전장 항체와, 조작된 항체 내에 존재하는 더욱 작은 성분을 포함한다. 항체 단편으로서는 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일 쇄 Fv(scFv: single chain Fv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합체, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(문헌 ([Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76]; [Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]).
"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 비천연적으로 발생된 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 예를 들면, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상의 공지된 3문자 기호 또는 1문자 기호로 지칭될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드도 통상 허용되는 1문자 코드로 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여 "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나, 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 하나의 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기술된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변그의 한 종인 "침묵 변이"이다. 또한, 본 원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업계의 숙련인은 핵산 중의 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각각의 기술되는 서열에 내재한다.
아미노산 서열에 관해, 당업계의 숙련인은 단일 아미노산 또는 코딩된 서열 중 비율이 적은 아미노산을 변경시키거나, 첨가하거나, 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가가, 이러한 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우, "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 외에도 상기와 같은 보존적으로 변형된 변이체가 존재하며, 그러한 변이체는 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계의 숙련인에게 알려져 있다. 다음의 8개의 군 각각은 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들면, 문헌 [Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성(%)"이라는 용어는 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정한 바, 비교창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일한(즉, 특정 영역에 대해 즉, 약 60% 동일성, 임의로 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 백분율(%)을 갖는다면, 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 또한, 이러한 정의는 테스트 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 길이가 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 특정되지 않은 경우, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해 전형적으로는 하나의 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이에 대해 테스트 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 테스트 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 서브서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다.
본원에서 사용되는 바, "비교창"은 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택되는 인접 위치 수 중 어느 하나로 이루어진 절편에 대한 기준을 포함하며, 여기서, 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv . Appl . Math . 2: 482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J Mol . Biol . 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc . Nat'l . Acad. Sci . USA 85; 2444]의 유사성 방법 탐색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌 [Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한가지 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이들 각각 문헌 ([Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402], 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410])에 기재되어 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff and Hemkoff (1989) Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 작동하지 않는 "저 복잡성" 필터를 사용하여 수행된다.
또한, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다 (예를 들면, 문헌 [Karlin and Altschul(1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생하는 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 테스트 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게, 약 0.01 미만, 가장 바람직하게, 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
"~에 선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화한다"라는 어구는 서열이 복합 혼합물 (전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중에 존재하는 경우, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자를 결합시키거나, 이중체를 형성하거나, 하이브리드화하는 것을 의미한다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이란 어구는 당업계에 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도 및 고온 조건을 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건하에서, 프로브는 핵산의 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중의 그의 표적 서브서열에 하이브리드화하지만, 복합 혼합물 중의 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존성이고, 상이한 환경 중에서는 상이할 수 있다. 서열이 길수록 특이적으로 더 높은 온도에서 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization 및 strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5-10℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (표적 서열이 과량으로 존재하는 바, Tm에서, 평형 상태에서 프로브의 50%가 존재함) (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도하의) 온도이다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 경우, 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브 (50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 경우, 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들면, 포름아미드의 첨가를 사용하여 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 배경 하이브리드화의 적어도 2배, 임의로 배경 하이브리드화의 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션과 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS로 세척. 이러한 세척은 5, 15, 30, 60, 120분 이상 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "진핵생물"이라는 용어는 계통발생적 도메인 진핵생물류, 예를 들면, 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 진균, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등에 속하는 유기체를 지칭한다.
"진핵 세포" 및 "진핵 세포들"은 일례로 예를 들면, CHO, 골수종, BHK, 면역 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 예로서, 개구리 난모세포와 같은 포유동물 세포, 진균 및 효모 세포를 포함한다. 효모는 일례로 사카로마이세스(Saccharomyces), 시조사카로마이세스(SchizoSaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 토루롭시스(Torulopsis), 야로위아(Yarrowia), 피치아(Pichia) 등을 포함한다. 발현용으로서 특히 바람직한 효모는 메탄올자화성 효모 균주, 예로서, 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라, 다형체, 피치아 길리에르몬디(Pichia guillermordii), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피치아 이노시토베타(Pichia inositovera) 등을 포함한다(예로서, 미국 특허 번호 제4,812,405호, 제4,818,700호, 제4,929,555호, 제5,736,383호, 제5,955,349호, 제5,888,768호, 및 제6,258,559호(이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다)). 이들 및 다른 특허에는 추가로 효모에서의 이종성 유전자 발현을 촉진시키는 데 유용한 프로모터, 종결인자, 인핸서, 신호 서열, 및 다른 조절 서열, 예로서, 본 발명에서와 같은 단백질 유전자가 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "형질전환"이라는 용어는 유전형을 변화시켜 결과적으로는 수용체 세포에서 변화를 일으키는, DNA의 수용체 숙주 세포 내로의 임의의 도입을 언급하는 것으로서 광범위한 의미로 사용되어야 한다.
본원에서 사용되는 바, "비진핵생물"이란 용어는 비진핵생물 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비진핵생물 유기체는 진정세균(에스케리치아 콜라이, 써머스 써모필러스(Thermos thermophilus), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 계통발생적 도메인, 또는 고세균(메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들면, 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로부스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코쿠스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii), 오로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "피험체"라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 바람직하게는, 포유동물, 및 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
상세한 설명
당업자는 고양이 에리트로포이에틴 조성물 및 그와 관련된 방법, 개 에리트로포이에틴(cEPO)(서열번호 31 성숙 아미노산 서열, 서열번호 30 전장의 아미노산 서열) 및 말 에리트로포이에틴(eEPO)(서열번호 33 성숙 아미노산 서열, 서열번호 32 전장의 아미노산 서열)와 관련된 조성물 및 방법, 비천연, 비천연적인, 및/또는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 cEPO 및 eEPO 폴리펩티드 내로 도입되어 있는 cEPO 및 eEPO를 위해 하기 기술하는 것과 동일한 방법을 개발하고 사용할 수 있을 것이다. 이들 폴리펩티드는 또한 고양이 또는 그를 필요로 하는 다른 동물을 위해서 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있거나, 또는 개 또는 말의 치료에서 사용될 수 있다. 도 34 및 35는 cEPO 및 eEPO, 각각의 166개의 아미노산 서열과 fEPO(166개의 아미노산) 사이의 비교를 제공한 것으로서, 이에 대해서는 본원에서 더욱 상세하게 논의하고 있지만, 본 개시내용은 또한 각각 cEPO 및 eEPO에 대한 서열번호 31 및 서열번호 33에의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환, 첨가, 또는 결실에 대해 증거를 제공한다.
I. 도입
적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 고양이 EPO 분자를 본 발명에서 제공한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 EPO는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 번역 후 변형은 제2 반응기를 포함하는 분자(염료, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 비오틴 유도체, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질, 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않음) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 특정 반응기에 적합한 것으로 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 화학 방법론을 사용하여 제1 반응기를 포함하는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 부착시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 제1 반응기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 중 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 프로파르길 기는 때때로 아세틸렌 부분으로도 지칭된다)이고, 제2 반응기는 아지도 부분이고, [3+2] 사이클로첨가 화학 방법론이 사용된다. 또다른 예에서, 제1 반응기는 아지도 부분(비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 fEPO의 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하는 적어도 하나의 비천연 아미노산(케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 적어도 하나의 번역 후 변형이 당류 부분을 포함하는 경우에 사용된다. 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포 중 생체내에서 이루어진다.
특정 실시태양에서, 단백질은 하나의 숙주 세포에 의해 생체내에서 이루어지는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 번역 후 변형은 보통 또다른 숙주 세포 유형에 의해서는 이루어지지 않는다. 특정 실시태양에서, 단백질은 진핵 세포에 의해 생체내에서 이루어지는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 번역 후 변형은 보통 비진핵 세포에 의해서는 이루어지지 않는다. 번역 후 변형의 예는 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고당을 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다(올리고당이 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 또다른 실시태양에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고당(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다.
관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이할 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 천연적으로 발생된 버전의 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 적어도 하나의, 단, 전체 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.
본 발명은 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 초유전자 계열의 구성원, 특히 fEPO를 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 GH 초유전자 계열 구성원에 도입시키는 것은 통상 발생된 20종의 아미노산과는 반응하지 않으면서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 특이적으로 화학 반응하는 것을 포함하는 접합 화학 작용을 적용할 수 있게 한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 초유전자 계열 구성원, 예로서, fEPO는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결되어 있다. 본 발명은 아지드 또는 아세틸렌 부분을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 20종의 천연적으로 도입된 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입하고, 이러한 아미노산을 적합한 반응성을 띠는 PEG 유도체를 사용하여 추후 변형시키는 것을 포함하는 것인, PEG 유도체를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시키는데 매우 효과적인 방법을 제공한다. 일단 도입되면, 이어서, 아미노산 측쇄는 천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로 당업계의 숙련인에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 변형될 수 있다. 수용성 중합체를 단백질 내로 도입하는 매우 다양한 공지된 화학 방법론들이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 이러한 방법론은 각각 아세틸렌 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis , Vol . 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109]; 및 [Huisgen, R. in 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176]) 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 방법은 친핵성 치환 반응 이외의 사이클로첨가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 반응은 실온에서 수성 조건하에 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599]; 및 WO 03/101972)를 참조한다. [3+2] 사이클로첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자는 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적합한 작용기 또는 치환기를 갖는 사실상 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아지도 기, 또는 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아세틸렌 기를 갖는 비천연 아미노산에 첨가될 수 있다.
휘스겐 [3+2] 사이클로첨가로부터 생성된 5원 환은 일반적으로 환원 환경에서는 가역적이지 않고, 장기간 동안 수성 환경에서 가수분해에 대해 안정하다. 결과적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특징은 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용하여 요구되는 수성 조건하에서 변형될 수 있다. 더욱더 중요하게는, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적(그리고, 예를 들면, 20종의 유전적으로 코딩된 일반 아미노산 중 어느 것과도 반응하지 않는다)이기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특이 부위에서 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체 및 관련된 친수성 중합체의, 수용성이며 가수분해에 안정한 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분의 커플링에 매우 선택적이다.
더욱 특히 아지드 부분은 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이들 아지드의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌 특이 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬 및 아릴 아세틸렌 및 그들 각각의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드 특이 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다.
본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질과, PEG, 단백질, 소형 분자, 생체 물질 또는 임의의 바람직한 화합물 또는 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질의 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과 상응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체의 접합체를 포함한다. 예를 들면, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 관능기를 함유하는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 단백질 중의 위치에서 생물학적 활성 분자에 커플링될 수 있다. PEG 및 생물학적 활성 분자를 커플링시키는 결합으로는 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
PEG가 생체물질의 표면을 변형시키는데 사용될 수 있다는 점은 당업계에 잘 정립되어 있다(예를 들면, 예로서, 미국 특허 번호 제6,610,281호; 문헌 [Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3(1); 125-136 (2000)](본원에서 참고로 인용된다) 참조). 또한, 본 발명은 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 결합을 통해 표면에 커플링된 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체 중 하나 이상, 및 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면을 포함하는 생체물질을 포함한다. 생체물질 및 다른 물질들은 또한 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들면, 카르복실산, 아민, 알코올 또는 티올 부분을 포함하는 결합을 통해 아지드 활성화된 중합체 유도체 또는 아세틸렌 활성화된 중합체 유도체에 커플링되어 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남길 수 있다.
본 발명은 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 별법으로, 아지드 함유 PEG 유도체는 생성된 중합체가 그의 말단에서 아지드 부분을 갖도록 하나의 말단에서 아지드 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접 결합할 수 있다. 별법으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 생성된 중합체가 그의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖도록 하나의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다.
더욱 특히 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 적어도 하나의 활성 하이드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 그 위에 더욱 반응성을 띠는 부분, 예를 들면, 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기를 갖는 치환된 중합체를 생성하는 반응을 수행한다. 설포닐 산 할라이드, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 당업자에게 주지되어 있다. 이어서, 생성된 치환된 중합체는 중합체의 말단에서 더욱 반응성을 띠는 부분을 대신하여 아지드 부분으로 치환하는 반응을 수행한다. 별법으로, 적어도 하나의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 하나의 말단에서 아지드를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알코올, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 당업자에게 주지되어 있다.
더욱 특히 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 적어도 하나의 활성 하이드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 함유하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기를 옮겨 놓는 반응을 수행한다. 별법으로, 적어도 하나의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 하나의 말단에서 아세틸렌를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 유기 합성과 관련한 할로겐 부분, 활성화된 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분의 용도 및 PEG 유도체의 제조 및 용도 역시 당업계에 숙련인에게 잘 정립되어 있다.
본 발명은 또한 수용성 중합체, 예를 들면, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형된 단백질에 다른 물질을 첨가하는 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 생체적합성, 안정성, 가용성, 및 면역원성 결여가 중요하고, PEG 유도체를 단백질에 부착시키는 수단에 있어 동시에 종래 당업계에 공지된 것보다 더욱 선택적인 수단을 제공하는 경우, 아지드 함유 PEG 유도체 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 표면 및 분자의 특성을 변형시키는데 사용될 수 있다.
II. 성장 호르몬 초유전자 계열
하기 단백질은 성장 호르몬(GH) 초유전자 계열(문헌 ([Bazan, F., Immunology Today 11:350-354 (1991)]; [Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992)]; [Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; [Silvennoinen, O. and IhIe, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)])): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반성 락토겐, 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀-1(CT-1)("GH 초유전자 계열")의 유전자에 의해 코딩되는 것을 포함한다. 이들 유전자 계열을 구성하는 추가의 구성원들은 유전자 클로닝 및 서열 분석을 통해 추후에도 확인될 것으로 기대된다. GH 초유전자 계열의 구성원들은, 일반적으로는 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 갖는다는 사실에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖고 있다. 공통된 구조적 특징을 통해 본 유전자 계열을 구성하는 신규의 구성원들을 용이하게 확인할 수 있다. GH 초유전자 계열의 구성원들 간의 구조적 상동성 정도를 고려해 볼 때, 본 발명을 사용하여 비천연적으로 코딩된 아미노산이 GH 초유전자 계열의 임의의 구성원 내로 도입될 수 있다.
G-CSF(문헌 [Hill, C. P., Proc . Natl . Acad Sci USA 90:5167-5171 (1993)]), GM-CSF(문헌 ([Diederichs, K., et al Science 154: 1779-1782 (1991)]; [Walter et al, J. Mol . Biol. 224:1075-1085 (1992)])), IL-2(문헌 ([Bazan, J. F. Science 257:410-411 (1992)]; [McKay, D. B. Science 257: 412 (1992)])); IL-4(문헌 ([Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991)]; [Powers et al, Science 256:1673-1677 (1992)])), 및 IL-5(문헌 [Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)])를 비롯한 다수의 사이토카인에 대한 구조는 x선 회절 및 NMR 연구에 의해 측정될 수 있고, 이는 유의적인 1차 서열 상동성이 부족함에도 불구하고, GH 구조와의 현저한 보존성을 나타낸다. EPO는 모델링 및 돌연변이 유발법 연구에 기초하여 상기 계열의 구성원인 것으로 간주된다(문헌 ([Boissel et al., J. Biol . Chem . 268: 15983-15993 (1993)]; [Wen et al, J. Biol . Chem . 269: 22839-22846 (1994)])). 섬모 신경영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 트롬보포이에틴(TPO), 온코스타틴 M, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, 및 알파, 베타, 오메가, 타우 및 감마 인터페론을 비롯한 다수의 추가 사이토카인 및 성장 인자가 상기 계열에 속한다(문헌 ([Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; [Silvennoinen and IhIe (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]))에 리뷰됨). 현재, 상기 사이토카인 및 성장 인자 모두 하나의 거대 유전자 계열을 포함하는 것으로 간주된다.
유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 이외에도, 상기 계열의 구성원은, 세포 표면 수용체를 올리고머화시켜 세포내 신호전달 경로를 활성화시켜야 한다는 특성을 공유하다. GH 및 EPO를 비롯한 몇몇 GH 계열 구성원은 단일 유형의 수용체에 결합하여 동종이량체를 형성한다. IL-2, IL4. 및 IL-6을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 구성원은 1 초과의 수용체 유형에 결합하여 이종이량체 또는 고차 응집체를 형성한다(문헌 ([Davis et al., (1993) Science 260: 1805-1808]; [Paonessa et al, 1995) EMBO J. 14: 1942-1951]; [Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)])). 돌연변이 유발법 연구를 통해 이들 다른 사이토카인 및 성장 인자도 GH와 같이 다중의 수용체 결합 부위, 전형적으로는 2개의 수용체 결합 부위를 포함하고, 연속하여 그의 동종 수용체에 결합한다는 것이 밝혀졌다(문헌 ([Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5:114-121 (1995)]; [Matthews et al., (1996) Proc . Natl Acad , Sci . USA 93: 9471-9476])). GH와 같이, 이들 다른 계열 구성원에 대한 1차 수용체 결합 부위는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에 존재한다. 수용체 결합에 참여하는 나선형 다발 중의 특정 아미노산은 계열 구성원들과는 차이는 보인다. GH 초유전자 계열의 구성원과 상호작용아는 세포 표면 수용체 대부분은 구조적으로 관련성을 갖고, 제2 거대 다중유전자 계열을 포함한다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,608,183호를 참조한다.
GH 초유전자 계열을 구성하는 각종 구성원들에 대한 돌연변이 연구로부터 일반적으로는 알파 나선을 연결하는 루프가 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 일반적인 결론에 도달하게 되었다. 특히, 단쇄의 B-C 루프는 전부는 아닐지라도 대부분의 계열 구성원에서 수용체 결합에 대해 비필수적인 것으로 보인다. 이러한 이유에서 GH 초유전자 계열의 구성원 중에서 B-C 루프는 본원에 기술된 바와 같은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있다. A-B 루프, C-D 루프(및 인터페론/GH 초유전자 계열의 IL-10 유사 구성원의 D-E 루프)는 또한 비천연적으로 발생된 아미노산으로 치환될 수 있다. 나선 A에 인접해 있고, 마지막 나선으로부터는 원거리에 있는 아미노산 또한 수용체 결합에는 관여하지 않는 경향이 있으며, 이는 또한 비천연적으로 발생된 아미노산 도입을 위한 부위가 될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것인 로프 부위 내의 임의의 위치에서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산 내에서 치환된다.
EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF5 GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12, p35, IL-13, IL-15 및 베타-인터페론을 포함하나, 이에 한정되지 않는, GH 계열을 구성하는 특정의 구성원들은 N 연결된 당 및 O 연결된 당을 포함한다. 단백질 중의 글리코실화 부위는 거의 오직 루프 영역에만 존재하고, 알파 나선형 다발에는 존재하지 않는다. 일반적으로 루프 영역은 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유 부착을 위한 부위이기 때문에, 상기 영역은 비천연적으로 발생된 아미노산 치환을 단백질 내로 도입하는 데 유용한 부위가 될 수 있다. 단백질 중 N 및 O 연결된 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산은 이들 아미노산이 표면에 노출되어 있기 때문에 비천연적으로 발생된 아미노산 치환을 위한 부위가 될 수 있다. 따라서, 천연 단백질은 이들 부위에서 단백질에 부착된 벌키한 당 기를 용인할 수 있으며, 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위로부터 떨어진 위치에 존재하는 경향이 있다.
GH 유전자 계열의 추가 구성원이 추후에도 발견될 가능성이 있다. GH 초유전자 계열의 신규 구성원은 예측되는 단백질 서열의 2차 및 3차 구조의 컴퓨터 보조 분석을 통해 확인할 수 있다. GH 초유전자 계열의 구성원은 전형적으로 비나선형 아미노산(루프 영역)에 의해 연결된 양쪽선 나선을 4개 또는 5개 갖고 있다. 단백질은 세포로부터의 분비를 촉진시키기 위해 그의 N 말단에 소수성 신호 서열을 포함할 수 있다. 이와 같이 GH 초유전자 계열 중 추후에 발견될 구성원 또한 본 발명 내에 포함된다.
본 출원에서 fEPO 폴리펩티드를 언급하는 것은 GH 초유전자 계열의 구성원의 일례로서 fEPO를 사용하고자 하는 것이다. 따라서, fEPO와 관련하여 본원에서 기술된 변형 방법 및 화학법이 본원에서 구체적으로 열거된 구성원들을 비롯한, GH 초유전자 계열의 임의 다른 구성원들에도 동등하게 적용될 수 있음을 이해하여야 한다.
III . 본 발명과 함께 사용되고, 단일 발현 구성체로부터 관심의 대상이 되는 단일 또는 다중 유전자 생성물을 생산하는 발현 시스템
본원에서는 단일 발현 구성체로부터 또는 다중 발현 구성체로부터 관심의 대상이 되는 단일 또는 다중 유전자 생성물을 생산하는 신규한 발현 시스템을 기술한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은, 인공 아미노산을 포함하기 위해 억제에 필요한 모든 요소를 코딩하는 단일 벡터로부터 관심의 대상이 되는 억제된 단백질 유전자가 전사가 되는 진핵성 억제 발현 시스템을 포함한다. 특히, 발현 시스템은 상기의 단백질(들)이 인공 아미노산을 포함할 수 있도록 하기 위해 진핵 숙주 세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 발현 시스템은 상기의 단백질(들)이 천연 아미노산이 아닌 아미노산 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있도록 하기 위해 진핵 숙주 세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 발현 시스템은 상기의 단백질(들)이 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, p-아세틸페닐알라닌(pAF)을 포함할 수 있도록 하기 위해 진핵 숙주 세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 진핵 세포에서 작동가능한 프로모터 및 전사 종결인자; 발현시키고자(억제시키고자) 하는 관심의 대상이 되는 임의 유전자를 코딩하는 DNA 서열에 연결된 프로모터; 및 포유동물 작용성 tRNA 신테타제 코딩 부위에 연결된 프로모터를 비롯한, 억제 tRNA 서열의 단일 또는 다중 카피와 같이, 작동가능하게 연결된 요소들을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시태양은 억제 발현 벡터를 포함하는 포유동물 세포, 및 억제 발현 벡터으로 형질감염된 포유동물 세포에서 작용성의 억제된 단백질을 생산하는 방법이다.
본 발명은 또한 진핵 숙주 세포에서 발현 시스템을 통해 작용성 단백질을 적절한 발현 수준으로 발현시키는 작용성 단백질의 억제 발현에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 억제 발현 시스템을 사용하여 진핵 세포, 바람직하게, 포유동물 세포, 진균 또는 효모 세포 및 더욱더 바람직하게, (차이니즈 햄스터 난소) CHO 세포에서 작용성 단백질을 발현시키는 작용성 단백질의 억제 발현에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명의 하나의 실시태양은 모든 억제 요소가 하나의 벡터 상에 포함되어 있는 억제 발현 시스템을 사용하여 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 진균 또는 효모 세포에서 작용성 단백질을 발현시키는 작용성 단백질의 억제 발현에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양은 모든 억제 요소가 하나의 벡터 상에 포함되어 있는 억제 발현 시스템을 사용하여 (차이니즈 햄스터 난소) CHO 세포(ATCC 저장된 세포 뿐만 아니라, CHO 세포 대신하여 사용될 수 있는 것으로서 당업자에게 알려져 있는 공지의 변종 및 세포 및/또는 세포주)에서 작용성 단백질을 발현시키는 작용성 단백질의 억제 발현에 관한 것이다. 본 발명의 상기 실시태양의 한 측면에서, 포유동물 세포에서 작용성 단백질을 발현시키는 작용성 단백질의 억제 발현은 tRNA, tRNA 신테타제, 및 관심의 대상이 되는 단백질의 전사/번역 요소를 포함하는 억제 발현 시스템을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 세포내 발현 수준을 효과적으로 조정하기 위한 독립적인 전사 방향으로 단일 또는 다중 tRNA 요소를 포함한다는 옵션을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 그 내부로 인공 아미노산이 도입되는 것인 관심의 대상이 되는 단일의 단백질을 코딩하는 단일 전사 유닛을 포함한다는 옵션을 제공한다. 본 발명의 또다른 실시태양은 인공 아미노산이 둘 중 하나의 단백질 내부로 또는 그 둘 모두의 내부로 도입되는 것인 관심의 대상이 되는 다중의 단백질 또는 그안의 서브유닛(예로서, 항체 경쇄 및 중쇄)을 코딩하는 다중 전사 유닛을 포함한다는 옵션을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 억제된 단백질을 분비하는 진핵 세포주, 예로서, CHO 세포주로서, 여기서, 상기 단백질의 발현은 본원에 기술되어 있는 억제 발현 시스템을 통해 이루어진 것이다. 몇몇 실시태양에서, 진핵 세포는 CHO 세포 또는 효모 세포, 예로서, 피치아이다. 본 발명의 또다른 실시태양은 작용성의 억제된 단백질을 생산할 수 있는 억제 발현 시스템을 포함하는 포유동물 또는 효모 세포 배양물이다. 본 발명에 따른 억제 발현 서열을 포함하는 벡터는 포유동물 또는 효모 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 배양하는 동안, 원하는 외인성 DNA 서열을 표적 포유동물 또는 효모 세포 내로 도입하여, 외인성 DNA가 무작위적으로 또는 동종 상동성 재조합을 통해 포유동물 또는 효모 세포의 게놈 내로 삽입되도록 할 수 있다. 사용되는 서열에 따라 작용성의 억제된 단백질은 세포 배양물의 바이오매스로부터 또는 세포 배양물 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 추가의 또다른 실시태양은 항체 경쇄 및 중쇄 서열을 발현하는 억제 발현 시스템을 포함하는 진핵 세포, 바람직하게, 포유동물 또는 효모 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 작용성 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 작용성의 억제된 단백질을 생산하는 방법이다. 작용성 항체는 회분식 공급 세포 배양물 중에서 상업상의 최대 생산량을 위해 최적화된 조건하에서 치료학적으로 사용하기에 적합한 수준으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 글루코스 수준이 연속적으로 제어되는 회분식 공급 세포 배양물 중에서 성장시킨 CHO 세포는 적어도 12일 이상 동안 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 회분식 공급 배양물 중에서 성장시킨 세포에 의한 재조합 단백질의 생산과 관련된 논의에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,180,401호를 참조한다.
본 발명에 따라 각종의 상이한 유형의 단백질이 발현될 수 있다. 단백질 유형으로는 단일 폴리펩티드 또는 다중으 조립된 폴리펩티드, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 다수의 억제 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 억제 발현 벡터는 세균, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, E, 콜라이, 바실러스, 살모넬라; 동물 바이러스 예로서, 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 포함할 수 있다. 추가로, 억제 발현 구성체 DNA가 그의 염색체 내로 통합되어져 있는 세포는 형질감염된 세포이 선별될 수 있도록 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 선별 수단을 제공할 수 있으며, 그 예로는, 영양요구성 숙주에 대한 원영양성, 살생제 내성(예로서, 항생제에 대한 내성) 또는 예로서, 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 선별가능한 마커 유전자는 발현될 수 있도록 DNA 서열에 직접 연결되어 있을 수 있거나, 공형질전환에 의해 동일의 세포 내로 도입될 수 있다. mRNA의 합성을 최적화시키는 데 사용될 수 있는 추가의 요소는 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호 뿐만 아니라, 스플라이스 신호를 포함할 수 있다.
더욱 일반적으로, 일단 단백질 서브유닛을 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열을 제조하고 나면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 즉, 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 당업자에게 주지된 각종 기법에 의해 달성될 수 있다. 그러한 기법으로는 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체의 융합, 인산칼슘 침전법, 외피가 있는 DNA와의 세포 융합, PEI, 및 본래의 바이러스를 사용한 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 문헌 [Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)]을 참조한다. 안정적으로 통합된 벡터를 위해서는 숙주 내로의 플라스미드 도입이 전기천공을 통해 이루어지는 것이 가장 바람직하다. 형질전환된 세포를 단백질 생산에 적합한 조건하에서 성장시키고, 단백질 합성에 대하여 분석한다. 관심의 대상이 되는 유전자 생성물을 확인하고 정량하는 분석 기법의 예로는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 방사성면역측정법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류기 분석법(FACS: fluorescence-activated cell sorter analysis), 면역조직화학법 등을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 포유동물 기원의 것이다. 당업자는 원하는 유전자 생성물의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주를 쉽게 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주로는 DG44 및 DUXB1(차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), CHO-K1 유도체, CHO-S, HELA(인간 자궁경부암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(V40 T 항원을 포함하는 CVI의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포 또는 세포주는 전형적으로 상업적 서비스 업체, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection)으로부터, 또는 공개 문헌으로부터 이용가능하다.
시험관내 생산을 통해 규모를 확장함으로써 억제 발현 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드를 다량으로 생산할 수 있다. 조직 배양 조건하에서 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 및 효모 세포을 배양하는 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 공수 반응기 중에서 또는 연속식 교반 반응기 중에서 균질 현탁액을 배양하는 것, 또는 예로서, 중공 섬유, 마이크로캡슐 중, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에 고정화된 또는 포획된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 항체를 단리시키고 회수하기 위해서는 먼저 배양 상등액 중의 면역글로불린을 예로서, 황산암모늄을 사용한 침전법, 예로서, PEG와 같은 흡수성 물질에 대한 투석, 선택적 막을 통한 여과 등에 의해 농축시킬 수 있다. 필요한 경우 및/또는 원하는 경우, 다가 항체의 농축액을 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE 셀룰로스 상에서의 크로마토그래피, 또는 (면역)친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 발현을 위해 사용되는 진핵 세포는 포유동물 또는 효모 세포이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 발현을 위해 사용되는 진핵 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 발현을 위해 사용되는 진핵 세포는 고수준의 단백질 생산을 위해 효과적으로 배양될 수 있는 다른 세포이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 억제 발현 시스템 내로 도입시키기 위해 단백질 유전자를 수득하거나 클로닝하는 것은 당업계의 숙련인의 범주 내에 포함된다. 언급한 바와 같이, 상기와 같은 단백질 유전자는 성숙 유전자, 전장의 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 유전자는 예로서, 침팬지화, 인간화, 도메인 결실 또는 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 시스템에 의해 생산되는 단백질로는 전장의 단백질, 성숙 단백질, 절단형 단백질, 비절단형 단백질, 본원에 개시된 단백질, 항체, Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 단편, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합체, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역 등을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 발현 시스템은 진핵 세포(비제한적인 예로서, 포유동물 세포, 예로서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, 섬유아세포 세포주 및 골수종 세포)에서 단백질을 생산한다. 하나의 실시태양에서, CHO 세포는 하기 서열: tRNA 서열 유전자, 발현을 위해 사용되는 특정 진핵 세포에서 작용성인 진핵 프로모터 서열, 예로서, CMV, SV40 조기 또는 액틴 프로모터 서열, 바람직하게, CMV; 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 바람직하게, 그의 5' 말단에 있는 진핵 분비성 리더 서열; 및 측면에 위치하는 5' 출발 및 3' 종결 코돈, 및 그의 3' 말단에 있는 폴리 A 서열을 포함하는 시스트론을 포함하는 억제 발현 시스템에 대한 숙주로서 사용된다.
일반적으로, 본 발명에 따라 억제되고 발현된 단백질은 다수의 접합된 형태(즉, 면역접합체) 또는 비접합된 형태들 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 단백질은 세포독소, 예로서, 방사성 동위 원소, 치료제, 세포 증식 억제제, 생물학적 독소 또는 프로드럭에 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 발현 시스템에 따라 생산되는 단백질은 예로서, 방사성 동위 원소 또는 생체활성 펩티드에의해 접합에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 방사성 동위 원소의 예로는 다수의 주지된 킬레이터 또는 직접적인 표지화 중 어느 하나를 사용하는, 9OY, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 접합된 단백질 및 비접합된 단백질은 예로서, 특정의 비호지킨 림프종 치료를 위해 제발린(Zevalin)을 사용하여 이루어지는 승인받은 현 치료 요법에서 사용되는 것과 같이, 동일의 치료 요법에서 함께 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 단백질은 약물, 프로드럭 또는 생물학적 반응 개질제, 예로서, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 림포카인, 예로서, 인터페론에 커플링되는 변형된 단백질을 포함하는 조성물 중에 포함될 수 있다. 본 발명의 추가의 다른 실시태양은 특정의 생체독소, 예로서, 리신 또는 디프테리아 독소에 접합된 변형된 단백질을 사용하는 것을 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 변형된 단백질은 다른 면역적 활성 리간드(예로서, 항체 또는 그의 단편)과 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서, 생성된 분자는 신생물 세포에 결합하며, 임의로는 효과기 세포, 예로서, T 세포에 결합한다. 추가의 다른 실시태양에서, 변형된 단백질은 다른 면역적 활성 리간드(예로서, 항체 또는 그의 단편)과 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서, 생성된 분자는 신생물 세포에 결합하며, 임의로는 효과기 세포, 예로서, T 세포에 결합한다. 사용하기 위해서 접합된 및/또는 비접합된 단백질 중 어떤 것을 선택할지는 암의 유형 및 단계, 보조 치료법(예로서, 화학요법 또는 외부 방사선 조사)의 사용, 및 환자의 증상에 따라 달라질 것이다. 당업자는 본원의 교시와 관련하여 상기와 같은 선택을 용이하게 할 수 있을 것으로 이해된다.
본 발명은 추가로 비제한적인 실시예 2, 3, 및 4에 의해 추가로 설명된다.
IV . 본 발명에 사용하기 위한 일반적 핵산 재조합 방법
본 발명의 다수의 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 fEPO를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 클로닝하고, 종종, 재조합 방법을 사용하여 변경시킬 것이다. 이러한 실시태양은 단백질 발현시 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트, 또는 fEPO 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열 생성시를 포함하나, 이에 한정되지 않는 경우에 사용된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다. hEPO를 단리시키는 것은 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,441,868호; 제5,547,933호; 제5,618,698호; 제5,621,080호; 및 제6,544,748호에 기재되어 있고, 인간 세포에서 EPO를 생산하는 것은 WO 93/09222에 기재되어 있으며(각 명세서는 본원에서 참고로 인용된다), 이들 기법이 당업자에 의해 fEPO를 단리시키고 생산하는 데 적용될 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2(또는 서열번호 4, 또는 원하는 경우, 대체 공지 서열 또는 SNP)에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 이어서, 관련 아미노산 잔기(들)를 도입(즉, 도입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)하기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 모체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위 지정 돌연변이 유발법에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 디자인되며, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성된 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드 부분에 대한 몇몇의 소형 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되고, 조립될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Barany, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. 88: 189-193(1991)]; 미국 6,521,427(본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.
본 발명은 재조합 유전학 분야의 통상의 기법을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반 방법을 개시하는 기본서로는 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning , Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds., 1994)])을 포함한다.
분자 생물학적 기법을 설명하는 일반 교재로는 문헌 ([Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2 nd Ed .), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989("Sambrook")] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999)("Ausubel")])을 포함한다. 이러한 교재들은 비천연 아미노산, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 신테타제, 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이 유발법, 벡터의 용도, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기재하고 있다.
다양한 유형의 돌연변이 유발법은 tRNA의 라이브러리 생성, 신테타제의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈 생성, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드 중의 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 본 발명에서 사용된다. 이들은 부위 지정, 무작위 점 돌연변이 유발법, 상동성 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구성, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이 유발법, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 갭을 갖는 이중체 DNA를 사용한 돌연변이 유발법 등, 또는 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 적절한 방법은 점 미스매치 수복법, 수복 결함 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발법, 제한 선택 및 제한 정제법, 결실 돌연변이 유발법, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 더블 스트랜드 파괴 수복법 등을 포함한다. 키메라 구성체를 사용하는 돌연변이 유발법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발법도 본 발명에 포함된다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이 유발법은 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 결정 구조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연적으로 발생된 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이화된 천연적으로 발생된 분자의 공지된 정보를 지침으로 할 수 있다.
본원에서 살펴볼 수 있는 기재된 문헌 및 예에는 이러한 방법들이 기재되어 있다. 추가 정보는 하기 공보 및 이러한 공보에 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다: 문헌 ([Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis : an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)]; [Dale et al., Oligonucleotide - directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol . Biol . 57:369-374 (1996)]; [Smith, In vitro mutagenesis , Ann . Rev . Genet. 19:423-462 (1985)]; [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)]; [Carter, Site - directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)]; [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)]; [Kunkel, Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc . Natl . Acad . Sci . 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본 발명은 또한 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵 숙주 세포, 비진핵 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체에 의해 유전공학적으로 처리된다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 세균, 바이러스, 나형 폴리뉴클레오티드 또는 접합화된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(문헌 [From et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 82, 5824(1985)]), 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자로 된 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 갖는 소립자에 의한 고속 탄도 침투(문헌 [Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)) 등을 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.
공학처리된 숙주 세포는 예를 들면, 단계를 스크리닝하거나, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하는 것과 같이 상기 활성에 적합하게 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이들 세포는 임의로 트랜스제닉 유기체로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리를 위한 배양)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참조 문헌은 문헌 [Freshney(1994) Culture of Animal Cells , Manual of Basic Technique , third edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기에 인용된 참조 문헌; ([Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; [Gamborg and Phillips(eds.)(1995) Plant Cell , Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag(Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks(eds.) The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press, Boca Raton, FL])을 포함한다.
표적 핵산을 세포 내로 도입시키는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 이들은 수용 세포와 DNA를 함유하는 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격, 및 바이러스 벡터를 사용한 감염(또한, 하기에서 추가로 논의된다) 등을 포함한다. 세균 세포를 본 발명의 DNA 구성체를 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는데 사용할 수 있다. 세균은 대수증식기까지 성장하고, 세균 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법 (예를 들면, 문헌 [Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 세균으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 수많은 키트가 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, 둘 모두 Pharmacia Biotech로부터 입수되는 EasyPrep™, FlexiPrep™; Stratagene으로부터 입수되는 StrataClean™; 및 Qiagen으로부터 입수되는 QIAprep™). 이어서, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 조작하여 다른 플라스미드를 제조하거나, 세포를 형질감염시키는데 사용하거나, 유기체를 감염시키기 위해 관련 벡터 내로 도입한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 벡터는 임의로 적어도 하나의 독립된 종결자 서열, 진핵생물, 또는 원핵생물 또는 그 둘 모두에서 카세트의 복제를 가능하게 하는 서열(셔틀 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선별 마커를 포함하는 범용 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 바람직하게, 그 둘 모두에 있어서 복제 및 통합에 적합하다. 문헌 ([Gillam & Smith, Gene 8:81(1979)]; [Roberts, et al, Nature , 328:731(1987)]; [Schneider, B., et al, Protein Expr . Purif. 6435:10(1995)]; [Ausubel, Sambrook, Berger(모두 상기 문헌 동일)])를 참조한다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 카탈로그는, 예를 들어, ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC가 발행한 카탈로그 [The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds)]가 있다. 또한, 서열 분석, 클로닝 및 분자생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 방법 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌 [Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 살펴볼 수 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산(및 표준 또는 비표준이든 간에 사실상 어떠한 표지된 핵산도) 다양한 임의의 상업적 공급업체로부터, 예를 들어, 미드랜드 써티파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(텍사스주 미드랜드 소재, mcrc.com에서 이용가능), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 상의 genco.com에서 이용가능), 익스프레스젠 인크.(ExpressGen Inc.)(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 상의 expressgen.com에서 이용가능), 오페론 테크놀로지스 인크.(Operon Technologies Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급업체로부터 맞춤 주문 또는 일반 주문할 수 있다.
셀렉터 코돈
본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격구조를 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 특이한 3 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예를 들면, 앰버 코돈(UAG), 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈, 비천연 코돈, 4 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. fEPO의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 초과, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 갯수 범위가 매우 광범위한 셀렉터 코돈이 원하는 유전자 내로 도입될 수 있다는 것이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 비천연 아미노산을 생체내에서 진핵 세포로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, UAG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하는 O-tRNA가 생산되고, O-RS에 의해 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된다. 이러한 O-tRNA는 천연적으로 발생된 숙주의 아미노아실-tRNA 신테타제에 의해서는 인식되지 않는다. 통상의 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 내의 관심의 대상이 되는 부위에, TAG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3 ' Exonucleases in phosphorothioate - based oligonucleotide - directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]를 참조한다. O-RS, O-tRNA, 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대한 반응으로 도입되어 특정 위치에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.
비천연 아미노산을 생체내에서 도입하는 것은 진핵 숙주 세포에 유의적인 혼란없이 수행될 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 앰버 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵 방출 인자(eRF를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)(이는 정지 코돈에 결합하고, 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시한다) 사이의 경쟁에 따라 달라지기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 서프레서 tRNA의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 조정될 수 있다.
셀렉터 코돈은 또한 4 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4, 5, 6 이상의 염기 코돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4 염기 코돈의 예로는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 5 염기 코돈의 예로는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한가지 특징은 프레임쉬프트 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4 이상의 염기 코돈은 하나 또는 다수의 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 동일한 단백질 내로 삽입시킬 수 있다. 예를 들면, 안티코돈 루프, 예를 들면, 적어도 8-10 nt의 안티코돈 루프를 갖는 특이 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이화된 O-tRNA의 존재하에서, 4 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로서 판독된다. 다른 실시태양에서, 안티코돈 루프는 적어도 4 염기 코돈, 적어도 5 염기 코돈, 또는 적어도 6 염기 코돈 또는 그 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 데코딩할 수 있다. 256개의 가능한 4개 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌 ([Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244]; [Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four - base Codons and Identification of " Shifty " Four - base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol . Biol. 307: 755-769])를 참조한다.
예를 들면, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 ([Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939]; 및 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc. 121:34])를 참조한다. CGGG 및 AGGU는, 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘으로 도입하는데 사용되었다. 예를 들면, 문헌 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc ., 121: 12194-12195]를 참조한다. 생체내 연구에서, (Moore) 등은 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있다)을 억제할 수 있는 능력에 관해 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임에서 거의 데코딩하지 않은 채 13∼26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 데코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌 [Moore et al., (2000) J. Mol . Biol., 298:195]를 참조한다. 하나의 실시태양에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 하여 연장된 코돈이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이는 원치 않는 다른 부위에서의 미스센스 리드쓰루 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.
또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 천연 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서, 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않는다). 예를 들어, 이는 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.
셀렉터 코돈은 임의로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이들 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 추가로 확장시킨다. 추가의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세번째 염기쌍의 특성은 안정하고 선택적인 염기쌍 형성, 높은 충실도로 폴리머라제에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 방법 및 조성물에서 채용될 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 설명은, 예를 들면, 문헌 [[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182]를 포함한다. 다른 관련 공보들도 열거되어 있다.
생체내 사용에 있어서는, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 지니고 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정성이 있고 세포내 효소에 의해 파괴되지 않는다. (Benner) 등에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 사용하였는데, 이 중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌 ([Switzer et al., (1989) J. Am . Chem . Soc . 111:8322]; 및 [Piccirilli et al., (1990) Nature. 343:33]; [Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol., 4:602])를 참조한다. 이 염기들은 일반적으로 어느 정도까지 천연 염기와 잘못 쌍을 이루어 효소적으로 복제될 수 없다. (Kool)과 그의 동료들은 염기 사이의 소수성 패킹 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 것을 입증하였다. 문헌 ([Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:602]; 및 [Guckian and Kool, (1998) Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 36, 2825])를 참조한다. 상기 요건들 모두를 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하기 위한 노력으로, (Schultz), (Romesberg) 및 그 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍은 천연 염기쌍보다 더 안정한 것으로 밝혀졌고, 에스케리치아 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([McMinn et al., (1999) J. Am . Chem . Soc. 121:11585-6]; 및 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc, 122:3274])를 참조한다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율성 및 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc , 122:88034]를 참조한다. 그러나, 2개의 염기 모두 추가 복제를 위한 쇄 종결자로서 작용한다. 최근, PICS 자가 쌍을 복제하는데 사용될 수 있는 돌연변이체 DNA 폴리머라제가 개발되었다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들어, 예로서, [Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439]를 참조한다. 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 문헌 [Meggers et al., (2000) J. Am . Chem . Soc. 122:10714]를 참조한다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르토고날하기 때문에, 본 방법은 이러한 특성을 사용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.
번역 우회 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열이 유전자 내로 도입되기는 하나, 단백질로 번역되지는 않는다. 이 서열은 리보솜이 서열을 건너 뛰어, 삽입 부위 하류의 번역을 재개하도록 유도하는 신호로서 작용하는 구조를 포함한다.
특정 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 적어도 하나의 셀렉터 코돈, 적어도 2개의 셀렉터 코돈, 적어도 3개 셀렉터 코돈, 적어도 4개 셀렉터 코돈, 적어도 5개 셀렉터 코돈, 적어도 6개 셀렉터 코돈, 적어도 7개 셀렉터 코돈, 적어도 8개 셀렉터 코돈, 적어도 9개 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
당업자에게 주지되어 있고, 예를 들면, 비천연 아미노산의 도입을 위해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것으로 본원 "돌연변이 유발법 및 다른 분자생물학적 기법"에 기재되어 있는 방법의 사용으로 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 핵산에 돌연변이를 생성하여 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하며, 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입을 제공한다. 본 발명은 예를 들면, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 비롯한 임의의 단백질의 버전인 돌연변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 상기와 같은 변이체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한 상응하는 핵산, 즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.
관심의 대상이 되는 단백질, 예를 들면, fEPO를 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이화될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 관심의 대상이 되는 단백질 내로 도입하는데 광범위하게 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,608,183호(본원에서 참고로 인용된다)에 기술되어 있는 것, 및 표준 돌연변이 유발 기법이 있다.
V. 비천연적으로 코딩된 아미노산
매우 광범위한 비천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에 사용하기에 적합하다. 임의의 많은 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 내로 도입돌 수 있다. 일반적으로, 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 유전적으로 코딩된 일반 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 실질적으로는 화학적으로 불활성이다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에서 발견되지 않는 작용기와 유효하게 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들면, 아지도 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 중합체(폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 별법으로, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응하여 안정한 접합체를 형성함으로써 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응이 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성할 수 있게 할 수 있다.
알파 아미노산의 일반 화학식은 하기에 도시한 바와 같다:
Figure pct00004
비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 하기 열거한 화학식을 갖는 임의의 화학식을 갖는데, 여기서, R 기는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 치환기 이외의 임의의 치환기이며, 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 오직 측쇄 구조에서만 천연 아미노산과 차이를 나타내기 때문에 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 발생된 폴리펩티드에서 그들이 형성하는 방식과 동일한 방식으로 천연 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 식별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들면, R은 임의로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노 기 등 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는, 관심의 대상이 되는 다른 비천연적으로 발생된 아미노산으로는 광활성화 가능한 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀 표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이지드 및/또는 광이성화 가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면, 당 치환된 세린, 다른 당질에 의해 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단 가능한 및/또는 광절단 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비해 신장된 측쇄(약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 갖는 아미노산, 탄소 연결 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있고, 수용성 중합체와의 반응에 유용한 비천연적으로 코딩된 아미노산의 일례로는 카르보닐, 아미노옥시, 하이드록실아민, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응기를 갖는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 상기 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 아미노산과 당류 사이의 천연적으로 발생된 N-결합 또는 0-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연 상태에서는 통상 발견되지 않는 공유 결합에 의해 대체된 예를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 천연적으로 발생된 단백질에서는 통상 발견되지 않는 당류, 예를 들면, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.
본원에 제공된 많은 비천연적으로 코딩된 아미노산은 예로서, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐(Novabiochem)(독일 다름스타드트 소재의 EMD Biosciences의 지사), 또는 펩테크(Peptech)(미국 매사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용될 수 없는 것들은 임의로 본원에 제공된 바와 같이, 또는 당업계에게 주지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성 기법의 경우, 예를 들면, 문헌 ([Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg(Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)])을 참조한다. 또한, 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 외에도, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 하기 화학식(II) 및 화학식(III)의 화학식으로 도시한 구조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형된 골격 구조를 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 식에서, Z는 전형적으로 S 또는 O를 포함하며, 임의로 동일하거나 상이할 수 있는 R 및 R'은 전형적으로 화학식(I)을 갖는 비천연 아미노산에 대해 상기 기술된 R 기에 대한 구성성분으로 된 동일한 목록 뿐만 아니라, 수소로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명의 비천연 아미노산은 임의로 화학식(II) 및 화학식(III)에 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실 기에서의 치환을 포함한다. 이러한 유형의 비천연 아미노산은 20종의 일반 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 갖는 α-하이드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 임의로 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예를 들면, D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 사이클릭 아미노산, 예를 들면, 프롤린 유사체 뿐만 아니라 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 환 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예를 들면, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.
많은 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들면, 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기초로 하고, 본 발명에 사용하기에 적합하다. 티로신 유사체는 파라 치환된 티로신, 오르토 치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 치환된 티로신은 케토 기(아세틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 하이드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C6-C20 직쇄 또는 분지형 탄화수소, 포화된 또는 불포화된 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기, 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 환도 고려된다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 글루타민 유사체로는 α-하이드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 사이클릭 유도체, 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체는 파라 치환된 페닐알라닌, 오르토 치환된 페닐알라닌, 및 메타 치환된 페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서, 치환기는 하이드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토 기(아세틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 벤조일, 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 각종 비천연 아미노산 구조물의 예는, 예를 들어 발명의 명칭이 "비천연 아미노산의 생체내 도입"인 WO 2002/085923호에 제공되어 있다. 또한, 추가의 메티오닌 유사체에 대해서는 문헌[Kiick et al., (2002), Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger litgation, PNAS 99:19-24] 참조.
하나의 실시태양에서, 비천연 아미노산(예를 들면, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 fEPO의 조성물을 제공한다. p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 단백질 및/또는 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 조성물 또한 제공한다. 하나의 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르토고날 tRNA를 추가로 포함한다. 비천연 아미노산은 오르토고날 tRNA에 결합할 수 있으며(공유 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 이는 아미노 아실 결합을 통해 오르토고날 tRNA에 공유 결합하는 것, 오르토고날 tRNA의 말단 리보스 당의 3' OH 또는 2' OH에 공유 결합하는 것 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비천연 아미노산을 통해 단백질로 도입될 수 있는 화학적 부분은 다양한 장점 및 이러한 단백질의 조작을 제공한다. 예를 들면, 케토 작용기의 독특한 반응성으로 인해 임의의 다수의 히드라진 함유 시약 또는 하이드록실아민 함유 시약을 사용하여 단백질을 시험관내 및 생체내에서 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 중원자 비천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는데 유용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자의 위치를 선택하는데 있어 선택성 및 유연성을 제공한다. 예를 들면, 광반응성 비천연 아미노산(벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 단백질의 효과적인 생체내 및 시험관내 광가교결합을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이어서, 광반응기를 제공하는 시간 제어를 자극시켜 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질을 마음대로 가교결합시킬 수 있다. 일례로, 비천연 아미노의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광학을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 사용하여 국소 구조의 프로브 및 원동력으로서 동위 원소로 표지화된 메틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 치환될 수 있다. 예를 들면, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3+2] 사이클로첨가 반응을 통해 분자를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시킬 수 있다.
비천연 아미노산의 화학적 합성
본 발명에 사용하기 적합한 많은 비천연 아미노산들이 예를 들면, 시그마 (미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용될 수 없는 것들은 임의로 본원에 제공된 바와 같이, 또는 다양한 공보에서 제공된 바와 같이, 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해, 예를 들면, 문헌 ([Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)])을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 기재하는 추가적인 공보로는 예를 들면, 문헌 (WO 2002/085923(발명의 명칭 "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"); [Matsoukas et al., (1995) J. Med . Chem., 38, 4660-4669]; [King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem . Soc, 3315-3319]; [Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti - Tumor Agents. J. Am . Chem . Soc . 81, 3750-3752]; [Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7- Chloro -4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline ( Chloroquine ). J. Org . Chem . 53, 1167-1170]; [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur . J. Med . Chem. 26, 201-5]; [Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4- Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues . J. Org . Chem. 54, 1859-1866]; [Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine . Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org . Chem. 1989:1859-1866]; [Barton et al., (1987) Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry : Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids , L-α- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308]; 및 [Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues : synthesis of beta - heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate - sensitized site. J. Med . Chem. 35:4602-7])을 포함한다. 2002년 12월 22일 출원된 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 특허 출원(변리사 문서 번호 P1001US00) 또한 참조한다.
A. 카르보닐 반응기
카르보닐 반응기를 갖는 아미노산은 다양한 반응으로 특히 친핵성 첨가 또는 알돌 축합 반응을 통해 분자(PEG 또는 다른 수용성 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 연결시킨다.
예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00007
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, R2는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, R2는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한다.
p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42:6735-6746(2003)](참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 다른 카르보닐 함유 아미노산은 당업자에 의해 유사하게 제조될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카르보닐 작용기를 생성한다. 예를 들면, 접합화 반응에 유용한 알데히드 관능기는 인접 아미노 및 하이드록실 기를 갖는 관능기로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, N 말단 세린 또는 트레오닌(이는 보통 존재할 수 있거나, 화학적 또는 효소적 분해를 통해 노출될 수 있다)을 사용하여, 페리오데이트를 사용하는 온화한 산화 절단 조건하에서 알데히드 관능기를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Gaertner, et al, Bioconjug. Chem. 3:262-268(1992)]; [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug . Chem. 3:138- 146(1992)]; [Gaertner et al, J. Biol Chem. 269:7224-7230(1994)])를 참조한다. 그러나, 당업계에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N 말단에서 있는 아미노산으로 한정된다.
본 발명에서, 인접 하이드록실 기 및 아미노 기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된" 알데히드 관능기로서 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 5-하이드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 하이드록실 기를 보유한다. 전형적으로, 알데히드 생성 반응 조건은 온화한 조건하에서 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 첨가하여 폴리펩티드내 다른 부위의 산화를 막는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적인 반응은 약 1.5 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 폴리펩티드 완충액에 첨가한 후, 약 10분 동안 암실에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,423,685호를 참조한다.
카르보닐 관능기는 온화한 조건하에 수용액 중에서 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 하이드록실아민 함유 시약, 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건하에서 안정한 상응하는 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Jencks, W. P., J Am. Chem . Soc. 81, 475-481(1959)]; [Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am . Chem . Soc. 117:3893-3899(1995)])를 참조한다. 또한, 카르보닐 기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄의 존재하에서 선택적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Cornish, V. W., et al, J. Am . Chem . Soc. 118:8150-8151(1996)]; [Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug . Chem . 3:138- 146(1992)]; [Mahal, L. K., et al, Science 276:1125-1128(1997)])을 참조한다.
B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응기
친핵성 기, 예를 들면, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의) 접합체를 형성하게 한다.
예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00008
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, 또는 S이거나, 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
몇몇 실시태양에서, n은 4이고, R1은 존재하지 않고, X는 N이다. 몇몇 실시태양에서, n은 2, R1은 존재하지 않고, X는 존재하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 환 상의 지방족 기에 대해 파라 위치에 위치한다.
히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산, 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 상업적 공급업체로부터 이용가능하다. 예를 들면, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 상업적으로 이용가능하지 않는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,281,211호를 참조한다.
히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 관능기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., S; Am . Chem . Soc. 117: 3893-3899 (1995)]를 참조한다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 독특한 반응성으로 인해 20종의 일반 아미노산 상에 존재하는 친핵성 기(세린 또는 트레오닌의 하이드실 기 또는 리신 및 N 말단의 아미노 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 비교하여 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대한 현저히 더 큰 반응성을 갖게 된다.
C. 아미노옥시 함유 아미노산
아미노옥시(또한, 하이드록실아민으로도 불린다) 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여(PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의) 접합체를 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시 기의 증강된 친핵성은 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있게 한다. 예를 들면, 문헌 ([Shao, J. and Tarn, J., J. Am . Chem . Soc. 117:3893-3899(1995)]; [H. Hang and C. Bertozzi, cc. Chem. Res. 34: 727-736(2001)])을 참조한다. 히드라진 기와의 반응의 결과, 상응하는 히드라존이 생성되지만, 일반적으로 옥심은 아미노옥시 기와 카르보닐 함유 기, 예를 들면, 케톤의 반응으로부터 발생한다.
아미노옥시 기를 함유하는 예시적인 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00009
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; Y = C(O)이거나 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, Y가 존재한다. 몇몇 실시태양에서, n은 2이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.
아미노옥시 함유 아미노산은 용이하게 이용가능한 아미노산 전구체(동종세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [M. Carrasco and R. Brown, J. Org . Chem . 68: 8853-8858(2003)]을 참조한다. 특정 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들면, L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원으로부터 단리되었다(문헌 [Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)]을 참조). 다른 아미노옥시 함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.
D. 아지드 및 알킨 반응기
아지드 및 알킨 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하게 된다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 및 알킨은 공통의 반응 화학 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히 아지드 및 알킨 작용기, 그 둘 모두는 천연적으로 발생된 폴리펩티드에서 발견되는 20종의 일반 아미노산의 측쇄(즉, R 기)에 대해 불활성이다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩된(spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응을 통해 선택적으로 유효하게 반응하여 상응하는 트리아졸을 생성한다. 예를 들면, 문헌 ([Chin J., et al, Science 301:964-7(2003)]; [Wang, Q., et al, J. Am . Chem . Soc. 125, 3192-3193(2003)]; [Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027(2002)])를 참조한다.
휘스겐 사이클로첨가 반응은 친핵성 치환 이외의 선택적 사이클로첨가 반응을 포함하기 때문에(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A., in COMPREHENSIVE Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109]; [Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176)]) 참조), 아지드 및 알킨 함유 측쇄를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입함으로써 생성된 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형될 수 있다. 아지드 또는 알킨 함유 fEPO를 포함하는 사이클로첨가 반응은 실온에서 수성 조건하에서 Cu(II)를 Cu(I)로 환원시키는 환원제의 존재하에서, 계내에서, 촉매량으로 Cu(II)(촉매량의 CuSO4의 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Wang, Q., et al, J. Am . Chem. Soc. 125, 3192-3193(2003)]; [Tornoe, C. W., et al, J. Org . Chem . 67:3057-3064(2002)]; [Rostovtsev, et al., Angew . Chem . Int . Ed . 41:2596-2599(2002)])를 참조한다. 예시적인 환원제는 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 하이드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe2 +, Co2 + 및 인가된 전기 전위를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 포함한다.
몇몇 경우에서, 아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응이 바람직한 경우, fEPO는 알킨 부분을 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 별법으로, 반대 반응(즉, 아미노산 상의 아지드 부분 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 부분과의 반응) 또한 수행될 수 있다.
아지드 작용기는 또한 아릴 에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적절히 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원시킨 다음, 이어서, 생성된 아민은 근접한 에스테르 결합과 유효하게 반응하여 상응하는 아미드를 생성시킨다. 예를 들면, 문헌 [E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010(2000)]을 참조한다. 아지드 함유 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥사노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 아릴 아지드(p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.
아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00010
상기 식에서, X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로는 -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. R', R", R'" 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않은 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 이들 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기에 관한 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이, 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는)을 포함하는 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다.
아지드 작용기는 또한 티오에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적절히 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원시킨 다음, 이어서, 생성된 아민은 티오에스테르 결합과 유효하게 반응하여 상응하는 아미드를 형성한다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.
예시적인 알킨 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00012
상기 식에서,
n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, 프로파르길옥시 기는 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다(즉, O-프로파르길-티로신). 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다(즉, 프로프아릴글리신).
알킨 함유 아미노산은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 프로파르길글리신은 펩테크(미국 매사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 별법으로, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들면, 문헌 [Deiters, A., et al., J. Am . Chem . Soc. 125: 11782-11783(2003)]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌 [Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484(1997)]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 다른 알킨 함유 아미노산은 당업계의 숙련인에 의해 제조될 수 있다.
예시적인 아지드 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00013
상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 0-4이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m=0이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, m은 2이며, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다.
아지드 함유 아미노산은 상업적 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들면, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔널, 인크.(Chem-Impex International, Inc.)(일리노이주 우드 다일 소재)로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 이용될 수 없는 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드 기는 적합한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 치환 또는 적합하게 보호된 락톤의 개방을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 비교적 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조한다.
E. 아미노티올 반응기
베타 치환된 아미노티올 작용기의 독특한 반응성은 이들을 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하게 한다. 예를 들면, 문헌 [J. Shao and J. Tam , J. Am . Chem . Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899]를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 베타 치환된 아미노티올 아미노산은 fEPO 폴리펩티드 내로 도입된 후, 알데히드 관능기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 페이로드(payload)를 티아졸리딘의 형성을 통해 베타 치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드에 커플링시킬 수 있다.
비천연 아미노산의 세포 흡수
진핵 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입시키기 위한 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 디자인하고 선택하는 경우에 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포 투과성을 가질 수 있는 가능성은 없다는 것을 시사한다. 천연 아미노산은 단백질 기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵 세포 내로 흡수된다. 존재한다면, 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들면, 문헌 (2002년 12월 22일 출원된 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 특허 출원(변리사 문서 번호 P1001US00); 및 [Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785])에 기재되어 있는 독성 분석법을 참조한다. 비록 흡수는 다양한 분석법을 사용하여 용이하게 분석되지만, 세포 흡수 경로를 따르는 비천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생합성 경로를 제공하여 생체내에서 아미노산을 생성하는 것이다.
비천연 아미노산의 생합성
세포에는 아미노산 및 다른 화합물을 생산하는 많은 생합성 경로들이 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법은 진핵 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 자연계에는 존재할 수 없지만, 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 신규한 효소를 첨가하거나, 존재하는 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포에서 임의로 생성된다. 추가적인 신규의 효소로는 임의로 천연적으로 발생된 효소 또는 인공적으로 진화된 효소가 있다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성(WO 2002/085923(발명의 명칭 "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에서 실시예로서 제공)은 다른 유기체로부터 유래된 공지 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 효소 경로를 제공하여 원하는 화합물을 합성한다. 임의로 첨가되는 효소 유형의 예가 하기 실시예에서 제공된다. 추가적인 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크(Genbank)에서 살펴볼 수 있다. 또한, 인공적으로 진화된 효소는 임의로 동일한 방식으로 세포에 첨가된다. 이러한 방식으로, 세포 기구 및 세포 공급원을 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.
다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용을 위해 신규한 효소를 생산하거나, 현존하는 경로를 진화시키는데 이용될 수 있다. 임의로, 예를 들면, 멕시겐, 인크.(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 상의 www.maxygen.com에서 이용가능)에 의해 개발된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 신규한 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌 ([Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391]; 및 [Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly : In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 91:10747-10751])을 참조한다. 유사하게, 제넨코어(Genencor)(월드 와이드 웹 상의 genencor.com에서 이용가능)에 의해 개발된 디자인 패쓰(DesignPath)™는 임의로 세포에서 경로를 조작하여 0-메틸-L-티로신을 생성하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기술은 기능적 게놈을 통해 동정된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신규한 유전자의 조합물, 및 분자 진화 및 디자인을 사용하여 숙주 유기체 중에 현존하는 경로를 재구성한다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 상의 diversa.com에서 이용가능) 또한 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리를 신속하게 스크리닝하여 신규한 경로를 제공하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기술을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 공학처리된 생합성 경로를 사용하여 생산된 비천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나, 세포 공급원을 고갈시키는 정도는 아닌 천연 세포의 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양으로 효과적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생산된다. 이러한 방식으로 생체내에서 생산되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 세포를, 특이 경로에 바람직한 효소를 생산하는데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시키고, 비천연 아미노산을 생성시킨 후, 임의로, 생체내 선택을 사용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장, 그 둘 모두를 위한 비천연 아미노산의 생산을 추가로 최적화시킨다.
비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드
비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하거나, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성을 변화시키거나, 부분에 대한 표적화(단백질 어레이에 대한 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증강되거나, 심지어 완전히 신규한 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 특성: 독성, 생체분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 공유적으로 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등을 임의로 변형시킨다. 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 공업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들에 유용하다. 예를 들면, 문헌 [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652]를 참조한다.
본 발명의 하나의 측면에서, 본 조성물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개 이상의 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 적어도 하나의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이할 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 단백질을 포함하며, 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중의 전첨가 비천연 아미노산으로 치환되지는 않는다. 1 초과의 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이할 수 있다(상기 단백질이 2개 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 동일한 비천연 아미노산 2개를 포함할 수 있는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 2 초과의 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나, 적어도 하나의 상이한 비천연 아미노산을 갖는 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드가 본 발명의 한가지 특징이 된다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 부형제(약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.
적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵 세포에서 생산함으로써, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 번역 후 진핵 세포 변형물을 포함하게 된다. 특정 실시태양에서, 단백질은 적어도 하나의 비천연 아미노산, 및 진핵 세포에 의해 생체내에서 이루어진 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 이러한 번역 후 변형은 원핵 세포에 의해서는 이루어지지 않는다. 예를 들면, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 하나의 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고당((GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다. 진핵 단백질의 N-연결된 올리고당의 일부 예를 나열한 하기 표 1을 참조한다(또한, 추가적인 잔기가 존재할 수 있으며, 이는 나타내지 않는다). 또다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고당(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다.
Figure pct00014
추가의 또다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구 인슐린(preproinsulin), 전구 인슐린, 전전구 오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구 오피오멜라노코르틴 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 단백질 분해 프로세싱, 다중서브유닛 단백질 또는 거대분자 조립체로의 조립, 세포내 다른 부위로의 이동(소기관, 예를 들어, 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로의 이동 또는 분비 경로를 통한 이동을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.
비천연 아미노산의 한가지 장점은 이것이 추가 분자를 첨가하는데 사용될 수 있는 추가의 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포의 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 상기 번역 후 변형은 친핵성 친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우, 선택성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 시험관내 및 생체내에서의 비천연 케토 아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응과 같은, 선택성이 더욱 큰 다른 반응들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc 118:8150-8151]; [Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128]; [Wang, et al., (2001) Science 292:498-500]; [Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027]; [Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024]; [Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61]; [Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746]; 및 [Chin, et al., (2003) Science, (발행중)])(이들 모두 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 이를 통해 형광단, 가교결합제, 당류 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 다수의 시약으로 사실상 어떠한 단백질도 선택적으로 표지할 수 있다. 또한, 2003년 1월 16일 출원된 특허 출원 시리얼 번호 제10/686,944호(발명의 명칭 "Glycoprotein synthesis")(본원에 참고로 인용된다)를 참조한다. 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 번역 후 변형 또한 스타우딩어 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용한 결찰을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24]를 참조한다.
본 발명은 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 아지드 또는 알키닐 부분을 함유하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 단백질 내로 유전적으로 도입시키는 단계를 포함하는, 단백질을 선택적으로 변형시키는데 매우 효과적인 방법을 제공한다. 이어서, 이러한 아미노산 측쇄는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis , Vol . 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109]; 및 [Huisgen, R. in 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176]) 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반응에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방법은 친핵성 치환 반응 이외의 사이클로첨가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이러한 반응은 실온에서 수성 조건하에 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) Org . Chem. 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem . Int . Ed . 41:2596-2599])를 참조한다. 사용될 수 있는 또다른 방법은 비스비소 화합물 상에서 테트라시스테인 모티프와 리간드 교환을 하는 것이다(예를 들면, 문헌 [Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272] 참조).
[3+2] 사이클로첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자로는 사실상 아지도 또는 알키닐 유도체를 갖는 어떤 분자도 모두 포함한다. 상기 분자는 염료, 형광단, 가교결합제, 당류 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴의 유도체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들) (DNA, RNA 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 분자들은 각각 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 알키닐 기 또는 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아지도 기를 갖는 비천연 아미노산에 첨가될 수 있다.
VI. 비유전적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO의 생체내 제조
본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 천연적으로 발생된 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산에 첨가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 신테타제를 사용함으로써 생체내에서 제조될 수 있다.
천연적으로 발생된 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 신테타제를 제조하는 방법은 예로서, 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 신테타제 및 tRNA에 독립적으로 기능하는(따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭된다) 번역 기구를 제조하는 것을 포함한다. 전형적으로, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 신테타제(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 우선적으로 번역 시스템에서 적어도 하나의 비천연적으로 발생된 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화시키고, O-tRNA는 상기 시스템에서 다른 tRNA에 의해서는 인식되지 않는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 상기 시스템 내에서 생산된 단백질 내로 삽입시킴으로써 코딩된 폴리펩티드 내의 위치로 아미노산을 "치환"시킨다.
특정 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 매우 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 신테타제가 당업계에 기술되어 있고, 일반적으로 본 발명에 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 케토 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 신테타제가 문헌 ([Wang, L., et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100:56-61(2003)] 및 [Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746(2003)])에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 그의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, ORS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자 또한 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
아지드 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 신테타제 시스템의 일례는 문헌 [Chin, J. W., et al, J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027(2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열로는 미국 특허 출원 공보 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 뉴클레오티드 서열 서열번호 14-16 및 29-32, 및 아미노산 서열 서열번호 46-48 및 61-64를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열로는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호)(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것과 같은 뉴클레오티드 서열 서열번호 1-3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 신테타제 쌍의 다른 예는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. S. 세레비지애에서 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산, 둘 모두를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌 [Chin, J. W., et al, Science 301:964-967(2003)]에 기재되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 신테타제를 사용하는 것은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특이적인 코돈을 선택하는 것을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 신테타제가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나, 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예를 들면, 정지 코돈(앰버, 오커, 및 오팔), 4 이상의 염기 코돈, 및 거의 사용되지 않거나, 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.
특이적인 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이 유발 방법(부위 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)을 사용하여 fEPO 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면, O-RS, O-tRNA, 및 오르토고날 0-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌 [Wang, L. et al., Science 292:498-500 (2001)]; 문헌 [Chin, J. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)]; 문헌[Zhang, Z. et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 신테타제 쌍을 선별하는 방법은 문헌 ([Wang, L., et al., Science 292:498-500(2001)]; [Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027(2002)]; [Zhang, Z. et al, Biochemistry 42:6735-6746(2003)])에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 생체내에서 도입히는 방법 및 조성물은 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 신테타제 쌍을 선별하는 방법 또한 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
적어도 하나의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 신테타제(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 원핵 유기체, 예를 들면, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, E. 콜라이, A. 풀기더스(A. fulgidus), P. 푸리오서스(P. furiosus), P. 호리코쉬이(P. horikoshii), A. 페르닉스(A. pernix), T. 써모필러스(T. thermophilus) 등, 또는 진핵 유기체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 제1 유기체로부터 유래된 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 신테타제(RS)로부터 유도된 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 구성원에 대해 RS(임의로 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)함으로써, 활성(임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및/또는 (c) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대해 상기 풀을 (임의로 음성 선별을 통해) 선별함으로써, 적어도 하나의 재조합 O-RS를 제공하는데; 여기서, 적어도 하나의 재조합 O-RS는 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 것인 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이화시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 비활성 RS는 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 6개, 또는 적어도 약 10개 이상의을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)으로 돌연변이화시킴으로써 생성할 수 있다.
돌연변이체 RS의 라이브러리는, 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적 디자인을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 기법, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 사용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이 유발법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구성체, 합리적 디자인, 및 본원에 기재되어 있는 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 활성을 갖는 구성원에 대해 RS(임의로 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하는 것은, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양성 선별 또는 스크리닝 마커, 및 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 복수개의 세포 내로 도입하는 단계(여기서, 상기 양성 선별 및/또는 스크리닝 마커는 앰버, 오커, 또는 오팔 코돈을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다); 선별제의 존재하에 상기 복수개의 세포를 배양하는 단계; 양성 선별 또는 스크리닝 마커 중의 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 억제시켜 선별제 및/또는 스크리닝제의 존재하에 생존하는(또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포의 서브세트를 제공하는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 선별제 및/또는 스크리닝제 농도는 변화시킬 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT: chloramphenicol acetyltransferase) 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 앰버 정지 코돈이다. 임의로, 상기 양성 선별 마커는 β-락타마제 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 앰버 정지 코돈이다. 또다른 측면에서, 상기 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝하는 것은, 양성 선별 또는 스크리닝으로부터의 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀과 함께 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계(여기서, 상기 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 적어도 하나의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다); 및 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝제 또는 선별제로 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 선별제 또는 스크리닝제로 보충되지 않은 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, CAT 확인 프로토콜은 임의로 적절한 O-RS 재조합체를 확인함에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들어, 클론의 풀은 임의로 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하거나 함유하지 않고 CAT(이는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다)를 함유하는 배양 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 하나의 측면에서, 선별제(및/또는 스크리닝제)의 농도는 변화시킬 수 있다. 몇몇 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 임의로 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 스크리닝 또는 선별(음성 선별을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하는 것은, 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리시키는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 도입하는 단계(여기서, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 적어도 하나의 셀렉터 코돈(적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다), 및 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서는 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 임의로 이러한 실시태양은 적어도 하나의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 경우(각각의 유기체는 임의로 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 임의로 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본원의 실시태양에서, 스크리닝 및/또는 선별은 임의로 스크리닝 및/또는 선별 엄격도의 변동을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 신테타제(O-RS)를 제조하는 방법은 (d) 적어도 하나의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(임의로, 돌연변이화됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화할 수 있는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS를 수득할 때까지 단계(b) 및 단계(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 단계(d)-(f)를 적어도 약 2회 반복하는 것을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이화된 O-RS의 제2 세트는 무작위 돌연변이 유발법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 재조합 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발법에 의해 생성될 수 있다.
상기 기술한 방법에서 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계(b) 및 단계(c), 둘 모두를 포함하나, 이에 한정되지 않는 선별/스크리닝 단계의 엄격도는 임의로 선별/스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계(b) 및 단계(c), 둘 모두는 리포터를 사용하는 것을 포함하는데, 여기서, 리포터는 형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence-activated cell sorting)에 의해 검출되거나, 리포터는 발광에 의해 검출된다. 임의로, 리포터는 세포 표면상, 파지 디스플레이상 등에 디스플레이되고, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체를 포함하는 친화성 또는 촉매 활성을 기초로 선택된다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이된 신테타제는 세포 표면상, 파지 디스플레이상 등에 디스플레이된다.
재조합 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 제조하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에서 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 신테타제(RS)에 의해 아미노아실화된(임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선별하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하거나, 스크리닝하여 tRNA(임의로 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(임의로 돌연변이체)의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써, 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해서는 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화되는 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 하나의 tRNA는 서프레서 tRNA이고/거나, 천연 및/또는 비천연 염기로 된 특이한 3 염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 적어도 4개의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈, 또는 오팔 정지 코돈이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르토고날성을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, O-tRNA는 임의로 변형될 필요없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 임의로 유입된다는 점이 이해될 것이다. 다양한 실시태양에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 상이하고, 임의로 원핵생물(메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 에스케리치아 콜라이, 할로박테리움 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 진핵생물, 포유동물, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 추가로, 재조합 tRNA는 임의로 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화되는데, 여기서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내 생합성된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 임의로 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 성장 배지에 첨가한다.
하나의 측면에서, 아미노아실-tRNA 신테타제에 의해 (임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하거나, 스크리닝하는 단계(단계(b))는 독성 마커 유전자(여기서, 독성 마커 유전자는 셀렉터 코돈(또는 이러한 마커 유전자가 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 유기체에 필수적인 유전자 또는 독성 약제 또는 항균제를 생산하게 하는 유전자) 및 (임의로 돌연변이체) tRNA의 라이브러리 중 적어도 하나를 포함함)을 제2 유기체로부터의 다수의 세포 내로 도입시키고; 적어도 하나의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는(임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 포함하는 생존하는 세포를 선별하는 것을 포함한다. 예를 들면, 생존하는 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 사용함으로써 선별될 수 있다.
또다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또다른 실시태양에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 여기서, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 적어도 하나의 앰버 코돈을 포함한다. 임의로, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (임의로 돌연변이체)의 풀을 선별하거나, 스크리닝하는 것은 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자(여기서, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(적어도 하나의 셀렉터 코돈, 예를 들면, 적어도 하나의 앰버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 약제를 해독하는 유전자를 포함함), 및 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 도입시키는 단계; 및 항생제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에서 성장하는 생존하거나, 스크리닝된 세포를 동정함으로써 적어도 재조합 tRNA(여기서, 적어도 하나의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 적어도 하나의 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물 내로 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 선별제 및/또는 스크리닝제의 농도는 변화한다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에서 제2 유기체로부터 아미노아실-tRNA 신테타제(RS)에 의해 아미노아실화된 (임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 음성적으로 선별하거나, 스크리닝함으로써 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 선택하거나, 스크리닝함으로써 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 본 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 신테타제(RS)로부터 유도된 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에서 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별하거나, 스크리닝하여 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에서 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (임의로 돌연변이체) RS에 대한 풀을 음성적으로 선별하거나, 스크리닝함으로써, 적어도 하나의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(여기서, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 적어도 하나의 재조합 O-tRNA에 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법에 의해 제조된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍을 포함한다. 예를 들면, 특이적인 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면, mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한(메타노코커스 잔나스키이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 경우를 포함한다.
또한, 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 신테타제 쌍을 선별하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 방법은 마커 유전자, tRNA 및 제1 유기체로부터 단리되거나, 또는 유도된 아미노아실-tRNA 신테타제(RS)를 제2 유기체로부터의 세포의 제1 세트 내로 도입시키고; 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복 세포 세트에 도입시키고; 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하는 제1 세트에서 생존하는 세포를 선별하거나, 중복 세포 세트에서는 이러한 반응을 제공하지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 것을 포함하는데, 여기서, 상기 제1 세트 및 중복 세포 세트는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에서 성장하고, 상기 생존하거나 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용되는 오르토고날 tRNA-tRNA 신테타제 쌍을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 한 실시양태에서, 비교 및 선별 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선별제 또는 스크리닝제의 농도는 변화할 수 있다.
본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나, 상이할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 유기체는 임의로 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 상기 유기체는 임의로 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 등과 같은 고등 식물), 조류, 원생 생물, 진균(예를 들어, 효모 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충 및 절지 동물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체이다. 또다른 실시태양에서, 제2 유기체는 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, 할로박테리움, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균, 포유동물 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체이다. 다양한 실시태양에서, 제1 및 제2 유기체는 상이한다.
VII. fEPO 내의 비천연적으로 발생된 아미노산의 위치
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 fEPO 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 특정 위치에 도입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산과 소수성 아미노산의 치환, 벌키한 아미노산과 벌키한 아미노산의 치환, 친수성 아미노산과 친수성 아미노산의 치환 및/또는 활성에 필요치 않은 위치에 비천연적으로 발생된 아미노산을 삽입하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행함으로써 이루어질 수 있다.
fEPO의 부위는 하기와 같이 도시될 수 있는데, 여기서, fEPO 중 아미노산 위치는 가운데 줄에 명시되어 있다:
Figure pct00015
비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되기에 바람직한 fEPO 폴리펩티드 내의 위치를 선택하기 위하여 다양한 생화학적 및 구조적 접근법을 사용할 수 있다. 상기 폴리펩티드 쇄 중 임의의 위치가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키는 선택 방법에 적합하고, 이러한 선택은 합리적인 디자인에 기초하여 이루어질 수 있거나, 임의의 원하는 목적을 위해 또는 별다른 특정의 원하는 목적없이 무작위적인 선택에 의해 이루어질 수 있다는 사실이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다. 원하는 부위를 선택함으로써 효현제, 초 효현제, 역 효현제, 길항제, 수용체 결합 조정제, 수용체 활성 조정제, 이량체 또는 다량체를 형성하는 활성 또는 특성, 본래의 분자와 차이가 없는 활성 또는 특성, 또는 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 가용성, 응집성 또는 안정성을 조정하는 활성 또는 특성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 원하는 특성 또는 활성을 갖는 fEPO 분자를 생산해낼 수 있다. 예를 들어, fEPO의 생물학적 활성에 필요한 폴리펩티드내 위치는 당업계에 공지되어 있는 알라닌 스캐닝법, 또는 상동체 스캐닝법을 사용하여 확인할 수 있다. 예로서, 문헌 ([Bittorf, T. et al. FEBS, 336:133-136 (1993)](EPO 활성에 중요한 잔기 확인), [Wen, D., et al. JBC, 269:22839-22846 (1994)](hEPO의 작용에 있어 중요한 도메인을 확인하는 데 사용되는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법), 및 [Elliot, S. et al. Blood, 89:493-502 (1997)](hEPO 및 인간 EPO 수용체 사이의 중요한 정전기적 상호작용 확인))을 참조한다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해서 생물학적 활성에 중요한 것으로서 확인된 것 이외의 잔기는 폴리펩티드에 필요한 원하는 활성에 따라, 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 우수한 후보자가 될 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로서 확인된 부위 또한 이 역시 폴리펩티드에 필요한 원하는 활성에 따라, 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 우수한 후보자가 될 수 있다. 또다른 대안은 폴리펩티드 상의 각 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 간단하게 일련의 치환을 일으키고, 상기 폴리펩티드의 활성에 미치는 효과를 관찰하는 것일 수 있다. 임의의 폴리펩티드에서 비-천연 아미노산에 의한 치환 위치를 선별하는 임의의 수단, 기법, 또는 방법이 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.
결실을 포함하는 fEPO의 천연적으로 발생된 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 예로서, 문헌 ([Bittorf et al, FEBS, 336:133 (1993)]; [Wen et al, JBC, 269:22839 (1994)])를 참조한다. 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 내성을 갖지 않을 것으로 보이는 잔기를 제거한 후, fEPO 및 그의 결합 단백질의 3차 결정 구조로부터 남아있는 각 위치에서 제안되는 치환의 영향을 조사할 수 있다. 문헌 ([Syed et al, Nature, 395: 511 (1998)] 및 [Cheetham et al, Nature Structural Biology, 5:861 (1998)])을 참조할 수 있으며; hEPO의 x선 결정학적 구조 및 NMR 구조는, 단백질 및 핵산의 거대 분자에 관한 3차 구조 데이터를 포함하는 중앙 데이터베이스인 단백질 데이터 뱅크(PDB: Protein Data Bank, PDB ID: 1CN4, 1EER, 및 1BUY를 포함하는 www.rcsb.org)에서 이용가능하다. 따라서, hEPO와 관련된 공지의 정보를 이용함으로써 당업자는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는, fEPO 중의 아미노산 위치를 쉽게 확인할 수 있다(도 1 참조).
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 EPO 폴리펩티드는 EPO의 나선 또는 베타 시트 2차 구조를 파괴시키지 않는, 단백질의 영역 중에 위치하는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기와 같이 EPO 중의 2차 구조에 상응하는 하기 영역들 중 하나 이상에 도입되거나, 그러한 영역들 중 하나 이상에서 치환된다: 1-7(N 말단), 8-26(A 나선), 27-38(A 나선과 B 나선 사이의 영역), 39-41(베타 시트 1), 42-46(베타 시트 1과 미니 나선 B' 사이의 영역), 47-52(미니 B' 나선), 53-54(미니 B' 나선과 B 나선 사이의 영역), 55-83(B 나선), 84-89(B 나선과 C 나선 사이의 영역), 90-113(C 나선), 114-121(미니 C 나선), 122-132(미니 C 나선과 베타 시트 2 사이의 영역), 133-135(베타 시트 2), 136-137(베타 시트 2와 D 나선 사이의 영역), 138-161(D 나선), 162-166(C 말단). 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 EPO 중 하기 위치들: : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 17, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 107, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,136, 154, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165 및 166 중 하나에 도입된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 EPO 폴리펩티드는 하기 위치들: 21, 24, 27, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 및 162 중 하나 이상에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 위치 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127, 및 128을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이들 위치 또는 다른 위치에서 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 분자에 연결되어 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위는 부위 I 및 부위 II로부터 배제된 부위, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있는 부위, 인접 잔기와의 최소한의 수소 결합 상호작용을 하는 부위, 수소 결합 상호작용을 전혀 하지 않을 수 있는 부위, 인접 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있는 부위, 및 hEPO의 수용체와 함께 hEPO의 3차원 결정 구조에 의해 예측할 때, 고도의 가용성을 갖거나(C-D 루프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 구조상 강직성을 갖는(B 나선을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 영역 중에 존재할 수 있는 부위를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
매우 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 중 주어진 위치에서 치환될 수 있거나, 그 위치 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입을 위한 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산은 fEPO와 그의 수용체의 3차원 결정 구조, 보존적 치환에 대한 선호성(즉, Phe, Tyr 또는 Trp를 아릴계 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면, p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 및 fEPO 폴리펩티드 내로 도입시키고자 하는 특이적 접합화 화학(예를 들면, 알킨 부분을 갖는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 또는 아릴 에스테르를 가짐으로써 포스핀 부분을 혼입하는 수용성 중합체를 사용한 아미드 결합 형성에 영향을 미치고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)의 조사를 기초로 선택된다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 제1 반응기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키고; 상기 단백질을 제2 반응기를 포함하는 분자(염료, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴 유도체, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질, 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않음) 등)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 반응기는 제2 반응기와 반응하여 [3+2] 사이클로첨가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 부착시킨다. 하나의 실시태양에서, 제1 반응기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들면, 제1 반응기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 중의 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 아지도 부분이다. 또다른 예에서, 제1 반응기는 아지도 부분(비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 알키닐 부분이다.
비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위의 서브세트로는 1, 2, 4, 17, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 50, 53, 55, 58, 65, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 136, 및 162를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. hEPO의 결정 구조, 및 그와 hEPO 수용체 사이의 상호작용에 관한 조사 뿐만 아니라, fEPO에 관한 본 출원과 함께 제공되는 분자 모델링을 통해 이들 아미노산 잔기의 측쇄가 전체적으로 또는 부분적으로 용매에 접근가능하며, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄가 단백질 표면으로부터 용매쪽을 향해 가리키고 있는 것으로 나타났다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 fEPO 내로 도입하기 위한 예시적인 위치로는 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 및 162를 포함한다. hEPO의 결정 구조, 및 그와 hEPO 수용체 사이의 상호작용에 관한 조사를 통해 아미노산 잔기의 측쇄가 전체적으로 용매에 노출되어 있으며, 본래의 잔기의 측쇄가 용매쪽을 향해 가리키고 있는 것으로 나타났다.
몇몇 경우에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들) 또는 도입(들)은 fEPO 폴리펩티드 내의 다른 첨가, 치환 또는 결실과 조합되어 fEPO의 다른 생물학적 형질에 영향을 미치게 된다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 fEPO 폴리펩티드의 안정성(단백질 분해적 분해에 대한 내성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 증가시키거나, fEPO 폴리펩티드의 에리트로포이에틴 수용체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 fEPO 폴리펩티드의 가용성(E. 콜라이 또는 다른 숙주 세포 중에서 발현되는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, E. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 fEPO 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 비천연 아미노산의 도입을 위한 또다른 부위 외에도 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 이루어지는 치환을 위한 부위도 선택된다. 가용성을 증가시키는 아미노산 치환을 위한 fEPO 중의 상기와 같은 부위의 예로는 N36, Q86, G113 및/또는 Q115이며, 이는 Lys, Arg, Glu, 또는 임의의 다른 하전된 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 fEPO 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조정하거나, 수용체 이량체화를 조정하거나(증가 또는 감소시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 방출 또는 생체이용률을 조정하거나, 정제를 용이하게 하거나, 특정 투여 경로를 개선시키거나 변경시키는 또다른 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, fEPO 폴리펩티드는 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 다른 친화성에 기초한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 정제, 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자(비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 것 이외에도, fEPO 변이체의 그의 수용체에 대한 친화성을 증가시키기 위해 하기 치환들: S9A, F48S, Y49S, A50S, Q59A, A73G, G101A, T106A, L108A, T132A, R139A, K140A, R143A, S146A, N147A, R150A, 및 K154A 중 하나 이상을 도입할 수 있다(문헌 [Wen et al, (1994) JBC 269:22839-22846]).
몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 fEPO 길항제를 생성한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위의 서브세트로는 10, 11, 14, 15, 96, 97, 100, 103, 104, 107, 110을 포함한다(문헌 ([Elliot et al. (1997) Blood 89: 493-502]; 및 [Cheetham et al. (1998) Nature Structural Biology 5: 861-866])). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위로는 나선 A의 아미노 말단 영역 및 나선 C의 부위 내에 있는 잔기를 포함한다. 또다른 실시태양에서, L108을 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예로서, p-아지도-L-페닐알라닌 또는 O-프로파르길-L-티로신으로 치환할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 열거한 치환은 fEPO 폴리펩티드를 fEPO 길항제로 만들 수 있는 추가의 치환과 조합될 수 있다. 예를 들면, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 본원에서 확인된 위치들 중 하나에서 치환되며, L108에 동시에 치환이 도입될 수 있다(L108K, L108R, L108H, L108D, 또는 L108E를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 경우에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 몇몇 경우에서, fEPO 폴리펩티드는 추가로 천연적으로 발생된 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시키는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 치환을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, fEPO의 하기 영역 중 적어도 2개의 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다: 1-7(N 말단), 8-26(A 나선), 27-38(A 나선과 B 나선 사이의 영역), 39-41(베타 시트 1), 42-46(베타 시트 1과 미니 나선 B' 사이의 영역), 47-52(미니 B' 나선), 53-54(미니 B' 나선과 B 나선 사이의 영역), 55-83(B 나선), 84-89(B 나선과 C 나선 사이의 영역), 90-113(C 나선), 114-121(미니 C 나선), 122-132(미니 C 나선과 베타 시트 2 사이의 영역), 133-135(베타 시트 2), 136-137(베타 시트 2와 D 나선 사이의 영역), 138-161(D 나선), 162-166(C 말단). 몇몇 경우에서, 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 하나 이상의 저분자량의 선형 또는 분지형 PEG(질량 대략 ~5-20 kDa)에 연결됨으로써 단일의 고분자량의 PEG에 부착된 종과 비교할 때 결합 친화성과 동등한 혈청 반감기를 증강시킨다.
몇몇 실시태양에서, 하기 잔기들 중 2개 이하의 잔기가 위치: 1, 2, 4, 17, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 50, 53, 55, 58, 65, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 136, 및 162에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 하기와 같은 치환 쌍 중 임의의 것이 이루어질 수 있다: N24X* 및 G113X*; N38X* 및 Q115X*; N36X* 및 S85X*; N36X* 및 A125X*; N36X* 및 A128X*; Q86X* 및 S126X*(여기서, X*는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타낸다). 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 바람직한 부위는 하기 잔기들: 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 및 162의 조합을 포함한다. 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 특히 바람직한 부위는 하기 잔기들: 21, 24, 38, 83, 86, 89, 116, 119, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 및 162의 조합을 포함한다.
VIII . 비진핵생물 및 진핵생물에서의 발현
클로닝된 fEPO를 높은 수준으로 발현시키기 위해 본 발명자들은 전형적으로 본 발명의 fEPO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결인자, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우에는 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 함유하는 발현 벡터에 서브클로닝한다. 적합한 세균 프로모터는 당업계의 주지되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.
본 발명의 fEPO 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세균 발현 시스템은 E. 콜라이, 바실러스 종(Bacillus sp .), 및 살모넬라를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에서 이용가능하다(문헌 ([Palva et al., Gene 22:229-235(1983)]; [Mosbach et al., Nature 302:543-545(1983)])). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵 발현 시스템은 당업계의 주지되어 있고, 또한 상업적으로 이용가능하다. 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 신테타제(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 fEPO 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포로는 그람 양성 세균(B. 브레비스(B. brevis), B. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 그람 음성 세균(E. 콜라이 뿐만 아니라, 효모 및 다른 진핵 세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 많은 유용한 양으로 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 하나의 측면에서, 조성물은 임의로 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 적어도 10 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 200 ㎍, 적어도 250 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 1 mg, 적어도 10 mg, 적어도 100 mg, 적어도 1 g 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양, 또는 생체내 단백질 생산 방법(재조합 단백질 생산 및 정제에 관한 상세한 설명은 본원에 제공되어 있음)을 사용함으로써 달성될 수 있는 양을 포함한다. 또다른 측면에서, 단백질은 세포 용해물, 완충액, 약제학적 완충액, 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것(약 1 nl 내지 약 100 ℓ 중 임의의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 부피를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중의 1 ℓ당 적어도 10 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 50 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 75 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 100 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 200 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 250 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 500 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 1 mg의 단백질, 또는 1 ℓ당 적어도 10 mg 이상의 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 농도로 조성물 중에서 존재한다. 진핵 세포에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량(전형적으로, 시험관내 번역을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 방법을 사용하여 생산할 수 있는 양보다 더 많은 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 생산하는 것이 본 발명의 한 특징이다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 많은 유용한 양으로 생합성할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충액 등 중 적어도 10 ㎍/ℓ, 적어도 50 ㎍/ℓ, 적어도 75 ㎍/ℓ, 적어도 100 ㎍/ℓ, 적어도 200 ㎍/ℓ, 적어도 250 ㎍/ℓ, 또는 적어도 500 ㎍/ℓ, 적어도 lmg/ℓ, 적어도 2mg/ℓ, 적어도 3 mg/ℓ, 적어도 4 mg/ℓ, 적어도 5 mg/ℓ, 적어도 6 mg/ℓ, 적어도 7 mg/ℓ, 적어도 8 mg/ℓ, 적어도 9 mg/ℓ, 적어도 10 mg/ℓ, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ℓ, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 이상의 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 농도로 생산될 수 있다.
발현 시스템, 배양 및 단리
fEPO는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 세균을 비롯한 임의의 많은 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 하기에서 예시적인 발현 시스템에 대해 설명한다.
효모 본원에 사용된 용어 "효모"는 fEPO를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 과, 스퍼모프토라세에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세에(Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4 개의 아과, 시조사카로마이코이데에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들면, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데에(Nadsonioideae), 리포마이코이데에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에(Saccharomycoideae)(예를 들면, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세에(Sporobolomycetaceae)(예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세에(Cryptococcaceae)(예를 들면, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.
본 발명에 사용하기에 특히 관심의 대상이 되는 것으로는 P. 파스토리스(P. pastoris), P. 귈러리몬디이(P. guillerimondii), S. 세레비지애(S. cerevisiae), S. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), S. 더글라시이(S. douglasii), S. 클루이베리(S. kluyveri), S, 노르벤시스(S, norbensis), S. 오비포르미스(S. oviformis), K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis), C. 알비칸스(C. albicans), C. 말토사(C. maltosa) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 시조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 있다.
fEPO를 발현시키는데 적합한 효모의 선택 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 발현용 효모 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 예를 들면, 분비능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 및 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션("ATCC": American Type Culture Collection)(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다.
용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 효모를 지칭한다. 상기 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 받은 원래의 효모 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, fEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
염색체외 레플리콘 또는 통합 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, S. 세레비지애(문헌 [Sikorski et al., GENETICS (1998) 112:19]; [Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163]; [Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929])); C. 알비칸스(문헌 [Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142]); C. 말토사(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141]); H. 폴리모르파(문헌 ([Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459]; [Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202:302])); K. 프라길리스(문헌 [Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165]); K. 락티스(문헌 ([De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737]; [Van den Berg et al., BIO/TECHNOLOGY (1990) 8: 135])); P. 귈러리몬디(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25; 141]); P. 파스토리스(미국 특허 번호 제5,324,639호; 제4,929,555호; 및 제4,837,148호; [Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376])); 시조사카로마이세스 폼베(문헌 [Beach and Nurse, NATURE (1981) 300:706]); 및 Y. 리폴리티카(Y. lipolytica)(문헌 ([Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985)]; [Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10:49)]); A. 니둘란스(A. nidulans)(문헌 ([Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89]; [Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221]; 및 [Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74])); A. 니거(A. niger)(문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479]); T. 리시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 섬유상 진균, 예를 들면, 예로서, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.
효모 벡터에 대한 제어 서열은 당업계의 숙련인에게 주지되어 있고, 알코올 데하이드로게나아제(ADH: alcohol dehydrogenase)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데하이드로게나아제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프룩토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타아제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP0 329 203)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌 [Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1983) 80:1]). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제(문헌 [Hitzeman et al., J. BiOL. CHEM. (1980) 255:2073]) 및 다른 해당 효소, 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코스 이소머라제(문헌 ([Holland et al., BIOCHEMISTRY(1978) 17:4900]; [Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7:149]))를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 장점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제; 질소 기전과 관련된 분해성 효소 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.
또한, 효모 인핸서를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 작용할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS: upstream activating sequence)이 또다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다. 미국 특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호를 참조한다. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 해당 효소 유전자, 예를 들면 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 영역과 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자로 된 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조한다. 추가로, 효모 프로모터는 효모 RNA 폴리머라제에 결합하고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비효모 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 제어 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터의 종결자를 포함한다(문헌 [Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385]). 또한, 2 μ 플라스미드 기원으로부터의 복제 기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기 적합한 선별 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌 ([Tschumper et al., GENE(1980) 10:157]; [Kingsman et al., GENE(1979) 7:141])을 참조한다. trp1 유전자가 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2 결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업계의 숙련인에게 주지되어 있고, 전형적으로 스페로플라스트의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌 ([Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1979) 76:3829] 및 [Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946])에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 또한 일반적으로 문헌 [SAMBR00K ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL(2001)]에 기재된 바와 같이 예를 들면, 핵 주사, 전기천공 또는 원형질체 융합에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 이어서, 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 기술을 사용하여 효모 숙주 세포를 배양할 수 있다.
효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법이 당업계의 숙련인에게 주지되어 있다. 일반적으로 미국 특허 출원보 번호 20020055169, 미국 특허 번호 제6,361,969호; 제6,312,923호; 제6,183,985호; 제6,083,723호; 제6,017,731호; 제5,674,706호; 제5,629,203호; 제5,602,034호; 및 제5,089,398호; 재심사된 미국 특허 번호 RE37,343 및 RE35749; PCT 공개 특허 출원 WO 99/07861; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556을 참조한다. 또한, 문헌 ([Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992) 62(1-2):79-93]; [Romanos et al., YEAST(1992) 8(6):423-488]; [Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY(1990) 185:3-7])을 참조한다.
효모 숙주 균주는 당업계의 숙련인에게 주지되어 있는 공급 회분식 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 제어 방식에서의 차이를 유발하도록 적합화될 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합 질소원(예를 들면, 카제인 가수분해물) 및 복합 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메탄올자화(methylotrophic) 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 문헌 (미국 특허 번호 제5,324,639호; [Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95]; 및 [Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113])을 참조한다.
그러나, 그러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적인 특정한 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 성장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증폭기 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기초 염, 인, 및 다른 소량의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는데 적합한 발효 배지의 예는 미국 특허 번호 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기재되어 있다.
바큘로바이러스 감염 곤충 세포 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"란 용어는, 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 곤충을 지칭한다. 상기 용어는 형질감염된 원래의 곤충 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, fEPO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
fEPO를 발현시키는데 적합한 곤충 세포의 선택 방법은 당업계의 숙련인에게 주지되어 있다. 아에데스 아에집티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 수개의 곤충 종이 당업계에 잘 기술되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 발현용 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히 분비능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 및 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 곤충은 일반적으로 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션("ATCC")(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다.
일반적으로, 바큘로바이러스 감염 곤충 발현 시스템의 성분으로는 전이 벡터, 통상적으로 세균 플라스미드(바큘로바이러스 게놈 단편과, 발현될 이종 유전자를 삽입하기 위한 편리한 제한 부위 둘 모두를 함유); 전이 벡터 내에 바큘로바이러스 특이 단편에 상동성인 서열을 보유하는 야생형 바큘로바이러스(이종 유전자의 상동성 재조합에 의해 바큘로바이러스 게놈 내에 도입 가능); 및 적절한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질감염시키며, 플라크를 선택하고, 배양액 중에서 세포를 성장시키는 등에 사용되는 물질, 방법 및 기법에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 이에 관한 매뉴얼에는 이러한 기법에 관하여 설명되어 있다.
이종 유전자를 전이 벡터에 삽입한 이후, 상기 벡터 및 야생형 바이러스 게놈은 벡터와 바이러스 게놈이 재조합되는 곤충 숙주 세포 내로 형질감염된다. 팩킹된 재조합 바이러스는 발현되며, 재조합 플라크는 동정 및 정제된다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 사용되는 물질 및 방법은 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.; 캘리포니아주 칼즈배드 소재)으로부터 입수한 키트 형태로 상업적으로 이용가능하다. 이러한 기법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987)](참고로 인용된다)에 상세히 설명되어 있다. 또한, 문헌 ([RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)]; [AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)]; [KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)]; 및 [O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)])를 참조한다.
실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 다양한 이종 단백질을 생산하는 방법에 관하여는 당업계에 주지되어 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,368,825호; 제6,342,216호; 제6,338,846호; 제6,261 ,805호; 제6,245,528, 6,225,060호; 제6,183,987호; 제6,168,932호; 제6,126,944호; 제6,096,304호; 제6,013,433호; 제5,965,393호; 제5,939,285호; 제5,891,676호; 제5,871,986호; 제5,861,279호; 제5,858,368호; 제5,843,733호; 제5,762,939호; 제5,753,220호; 제5,605,827호; 제5,583,023호; 제5;5713709호; 제5,516,657호; 제5,290,686호; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032 WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082를 참조한다.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 헬퍼 독립성 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파캘리포니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV: Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus)로부터 유래하는 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 이러한 시스템으로부터 유래하는바이러스 발현 벡터는 통상적으로 강한 바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌 [Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]를 참조한다.
외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입하기 이전에, 프로모터, 리더 (원하는 경우), 관심의 대상이 되는 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기 기술된 성분들은 전형적으로 중간 대체 구성체(전이 벡터) 내로 조립된다. 중간 대체 구성체는 종종 레플리콘 예를 들어, 숙주, 예를 들면, 세균 내에서 안정하게 유지될 수 있는 염색체 외부 요소(예를 들어, 플라스미드) 내에 유지된다. 상기 레플리콘은 복제 시스템를 가지므로, 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주 내에 유지될 수 있다. 더욱 특히 상기 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(문헌 [Miller, et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177])와 원핵 앰피실린 내성(amp) 유전자, 및 E. 콜라이 내에서의 선별 및 증식을 위한 복제 기점을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 AcNPV 내로 도입하는데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT로부터 32개 염기쌍만큼 떨어진 하류 위치 내로 BamHI 클로닝 부위를 도입하는 pVL985와 같은 벡터를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌 [Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]를 참조한다. 다른 상업적으로 이용가능한 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 포함한다.
이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주 내로 동시에 형질감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 ([SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987)]; [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]; [Luckow and Summers, VIROLOGY(1989) 17:31])을 참조한다. 예를 들면, 상동성 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 삽입될 수 있고; 또한, 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 공학처리된 제한 효소 부위 내로 삽입될 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS(1989) 4:91]을 참조한다.
형질감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌 ([TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)]; [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501])을 참조한다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키기 위해 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Liebman et al., BIOTECHNIQUES(1999) 26(1):36]; [Graves et al., BIOCHEMISTRY(1998) 37:6050]; [Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570]; [Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998) 12:323]; [Siffert et al., NATURE GENETICS(1998) 18:45]; [TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDB00K 145-154(1998)]; [Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997) 10:263]; [Dolphin et al., NATURE GENETICS(1997) 17:491]; [Kost et al., GENE(1997) 190:139]; [Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203]; [Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376]; [Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10]; [Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121]; [Sisk et al., J. ViROL. (1994) 68(2):766]; 및 [Peng et al., BIOTECHNIQUES(1993) 14.2:274])를 참조한다. 상업적으로 이용가능한 리포좀으로는 예를 들면, 셀펙틴(Cellfectin)® 및 리포펙틴(Lipofectin)®(Invitrogen, Corp., 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 사용될 수 있다. 문헌 ([TROTTER AND W00D, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)]; [Kitts, NAR(1990) 18(19):5667]; 및 [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501])을 참조한다.
통상적으로 바큘로바이러스 발현 벡터는 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고, 코딩 서열(예로서, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상적으로 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이러한 전사 개시 영역은 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는, 통상적으로 구조 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서(존재하는 경우)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 또한, 발현은 조절되거나, 구성적일 수 있다.
감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 바이러스 폴리헤드론 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 ([FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839 및 0 155 476)) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765])로부터 유래된 서열을 포함한다.
새로이 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스 내로 팩킹된 후, 성장한 플라크는 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 정제될 수 있다. 문헌 ([Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4:91]; [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조한다.
재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 수개의 곤충 세포에 감염시키기 위한 목적으로 개발되었다. 예를 들면, 재조합 바큘로바이러스는 특히 아에데스 아에집티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노개스터(ATCC 번호 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리코플러시아 니에 사용하기 위한 것으로서 개발되었다. 문헌 (WO 89/046,699, [Wright, NATURE(1986) 321:718]; [Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153]; [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156])을 참조한다. 일반적으로, 문헌 [Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]를 참조한다. 더욱 특히 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템용으로 사용되는 세포주로는 통상 Sf9(스포도프테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포도프테라 프루기페르다)(Invitrogen Corp., 카탈로그 번호 11497-013(캘리포니아주 칼즈배드 소재)), 트리-368(트리코플러시아 니), 및 하이-파이브(High-Five)™ BTI-TN-5B1-4(트리코플러시아 니)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바큘로바이러스/발현에서의 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 둘 모두를 위한 세포 및 배양 배지가 상업적으로 이용가능하고, 일반적으로 세포 배양 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
E. 콜라이 세균 발현 기법은 당업계에 주지되어 있다. 세균 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들이 이용가능하다. 벡터는 단일 카피 벡터이거나 낮은 또는 높은 다중카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터, 많은 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 그들의 제한 지도 및 특징을 기재하는 매뉴얼에 관한 충분한 문헌이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 보통 벡터는 선별을 가능케 하는 마커를 포함하며, 여기서, 마커는 세포독성제 내성, 원영양성(prototrophy) 또는 면역성을 제공할 수 있다. 흔히, 상이한 특징을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.
세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고, 코딩 서열(예로서, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상적으로 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이러한 전사 개시 영역은 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 세균 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 RNA 폴리머라제 결합 부위와 중첩될 수 있는, 오퍼레이터로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특이 유전자의 전사를 억제할 수 있음에 따라 오퍼레이터는 음성 조절된(유도성) 전사를 일으킨다. 구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면, 오퍼레이터의 부재하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성 조절은 존재하는 경우, 통상적으로 RNA 폴리머라제 결합 서열에 근접한(5') 유전자 활성자 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성자 단백질의 예는 에스케리치아 콜라이(E. 콜라이)에서 lac 오페론의 초기 전사를 돕는 이화 생성물 활성자 단백질(CAP: catabolite activator protein)이다(문헌 [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성이므로 전사를 증강시키거나, 감소시킬 수 있다.
대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 당 대사 효소, 예를 들면, 갈락토스, 락토스(lac)(문헌 [Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예는 생합성 효소, 예를 들면, 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다(문헌 ([Goeddel et al., Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057]; [Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731]; 미국 특허 번호 제4,738,921호; EPO 공보 번호 036 776 및 121 775). 또한, β-갈락토시다제(bla) 프로모터 시스템(문헌 [Weissmann(1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon(Ed. I. Gresser)]), 박테리오파지 람다 PL(문헌 [Shimatake et al., NATURE(1981) 292:128]) 및 T5(미국 특허 번호 제4,689,406호) 프로모터 시스템은 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면, T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 fEPO를 유도하는 것이다. 이러한 벡터의 예는 당업계에 주지되어 있고, 노바겐(Novagen)으로부터의 pET29 시리즈, 및 WO 99/05297에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포 생존능 또는 성장 파라미터를 약화시키지 않으면서 숙주에서 fEPO 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다.
또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 세균 프로모터로서 작용한다. 예를 들면, 하나의 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다(미국 특허 번호 제4,551,433호). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터, 및 lac 리프레서에 의해 조절되는 lac 오페론 서열, 둘 모두를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌 [Amann et al., GENE(1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]). 추가로, 세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비세균 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비세균 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 상용가능한 RNA 폴리머라제와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌 ([Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113]; [Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074])). 또한, 하이브리드 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 E. 콜라이 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다(EPO 공보 번호 267 851).
기능성 프로모터 서열 외에도, 효과적인 리보좀 결합 부위는 또한 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. E. 콜라이에서, 리보좀 결합 부위는 샤인 달가노(SD: Shine-Dalgarno) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈으로부터 3-11개 뉴클레오티드만큼 상류에 위치하는, 길이가 3-9개의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다(문헌 [Shine et al., NATURE(1975) 254:34]). 이러한 SD 서열은 E. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이에 염기쌍을 형성함으로써 mRNA의 리보좀에의 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다(문헌 [Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌 [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]를 참조한다.
용어 "세균 숙주" 또는 "세균 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 세균을 지칭한다. 상기 용어는 형질감염된 원래의 세균 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, fEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
fEPO의 발현에 적합한 숙주 세균을 선택하는 것은 당업계의 숙련인에게 주지되어 있다. 발현용 세균 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히 봉입체 형성능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 및 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 세균 숙주는 일반적으로 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션("ATCC")(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다. 산업적/약제학적 발효는 일반적으로 K 균주(예로서, W3110)로부터 유래된 세균 또는 B 균주(예로서, BL21)로부터 유래된 세균을 사용한다. 이러한 균주는 성장 파라미터가 매우 잘 알려져 있고, 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 비병원성이며, 안전성 및 환경적 이유에서 상업적으로 중요하다. 본 발명의 방법의 하나의 실시태양에서, E. 콜라이 숙주는 BL21의 숙주이다. 본 발명의 방법의 또다른 실시태양에서, E. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-을 포함하나, 이에 한정되지 않는 프로테아제 마이너스 균주를 포함한다.
일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구성체가 숙주 세포 내로 도입되었고, 적절한 발현 구성체를 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 fEPO 제조에 적합한 조건하에서 배양한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구성체의 성질 및 숙주 세포의 본질에 따라 달라진다. 보통 재조합 숙주 균주는 당업계에 주지된 방법을 이용하여 배양한다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한 공급원, 및 임의로, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 주지된 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 임의로, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제; 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.
재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(fEPO가 세포내 축적되는 경우) 또는 배양 상등액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다.
본 발명의 fEPO는 보통 재조합 시스템에서 발현된 이후에 정제된다. fEPO는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 보통, 세균 숙주 세포에서 생산된 fEPO는 난용성이거나 불용성일 수 있다(봉입체 형태로). 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산된 단백질의 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선택된 아미노산 치환이 fEPO 폴리펩티드 내에서 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 단백질일 경우, 단백질은 숙주 세포 용해물로부터 원심 분리에 의해 수집될 수 있으며, 세포를 추가로 균질화시킬 수도 있다. 난용성 단백질의 경우, 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성인 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 이어서, 침전된 단백질은 원심 분리에 의해 편리하게 수집할 수 있다. 재조합 숙주 세포는 분쇄 또는 균질화되어 당업계의 숙련인에게 주지된 다수의 방법을 이용하여 세포 내에서 봉입체를 방출하도록 만들 수 있다. 숙주 세포 분쇄 또는 균질화는 효소 세포 분쇄, 초음파 처리, 다운스 균질화 또는 고압 방출 분쇄 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 잘 알려져 있는 기법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 하나의 실시태양에서, 고압 방출 분쇄 기법을 사용하여 E. 콜라이 숙주 세포를 분쇄함으로써 fEPO의 봉입체를 방출시킬 수 있다. 봉입체 형태의 불용성 fEPO의 수율은 균질화기를 통해 E. 콜라이 숙주 세포를 단 1회 계대접종하는 것을 사용함으로써 증가시킬 수 있다는 것으로 밝혀졌다. fEPO의 봉입체를 취급할 때에는 예를 들어, 가용화, 기계적 전단성 또는 단백질분해와 같은 인자로 인하여 손상되지 않은 채로 봉입체의 수율을 최대화하도록, 균질화 반복 시간을 최소화하는 것이 유리할 수 있다.
이어서, 불용성 또는 침전된 fEPO는 당업계에 공지된 다수의 적합한 가용화제 중 임의의 것을 이용하여 가용화될 수 있다. 바람직하게, fEPO는 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여 가용화될 수 있다. 용해된 fEPO-BP의 부피는 최소화되어, 관리가 용이한 회분 크기를 갖는 다량의 회분을 생산할 수 있어야 한다. 이러한 인자는 재조합 숙주가 수천 리터 부피의 회분식으로 성장할 수 있는 상업용의 대규모 환경하에서 중요할 수 있다. 또한, 상업용의 대규모 환경하에서 fEPO를 생산하는 경우, 특히 인간 의약용으로 생산하는 경우, 기계와 용기, 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학물질은 가능한한 피해야 한다. 본 발명의 방법에 있어서, fEPO 봉입체를 가용화시키기 위해서는 강력한 변성 제제인 구아니딘 하이드로클로라이드 대신에 보다 약한 변성 제제인 우레아를 사용할 수도 있는 것으로 파악된다. 우레아를 사용하면 fEPO의 제조 및 정제 공정에 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 손상을 줄 위험성이 상당히 줄어 듦과 동시에, fEPO 봉입체도 효율적으로 가용화시킬 수 있다.
fEPO가 융합 단백질로서 생산될 때, 상기 융합 서열은 제거되는 것이 바람직하다. 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의해, 바람직하게는, 효소적 절단에 의해 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열을 효소적으로 제거하는 것은 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 융합 서열을 제거하기 위한 효소의 선택은 융합체의 본질에 의해 결정될 것이며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이, 효소를 선택함으로써 특정될 것이다. 절단된 fEPO는 당업계의 주지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제되는 것이 바람직하다. 그러한 방법은 당업계의 숙련인에게 자명한 바와 같이, 융합 서열 및 fEPO 폴리펩티드의 본질과 특성에 따라서 결정될 것이다. 정제 방법으로서는 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, fEPO를 정제하여 단백질 용액으로부터 DNA를 제거하는 것이 바람직하다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있지만, 예를 들면, 프로타민 설페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 핵산 침전제를 사용하여 침전시킴으로써 제거하는 것이 바람직하다. 원심분리 또는 여과를 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 fEPO를 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 fEPO가 인간을 치료하는데 사용되는 환경에서 중요한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약제학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.
발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법은 또한 단백질 발현에 사용될 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 공급 회분식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 고양이 EPO 폴리펩티드는 일반적으로 당업계의 표준적인 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심 분리 또는 여과하여 세포 파편을 제거할 수 있다. 상등액은 원하는 부피로 농축 또는 희석시키거나, 추가 정제용 제제를 조절하는데 적합한 완충액으로 투석여과할 수 있다. 본 발명의 fEPO를 추가로 정제하는 것은 온전한 형태로부터 fEPO 변이체의 탈아미드화 형태 및 단축 형태를 분리하는 것을 포함한다.
하기 예시적인 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 fEPO를 정제할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동법(분취용 등전 포커싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 차등 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), SDS-PAGE, 또는 추출.
비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 본 발명의 단백질은 당업계에 공지되고 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출법, 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 주지된 다수의 방법들 중 어느 것에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 폴딩된 성숙 단백질을 정확하게 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 고 순도가 바람직한 최종 정제 단계에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질)에 대하여 생성된 항체를 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질의 친화성에 기초한 정제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 위한 정제 시약으로서 사용한다. 폴리펩티드를 부분적으로 또는 균질하게 정제한 후, 필요에 따라, 임의로 분석시험 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 생산용 면역원을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로서 매우 다양한 용도에 사용한다.
본원에서 언급된 다른 참고 문헌 이외에도, 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계에 주지되어 있으며, 문헌 ([R. Scopes, Protein Purification , Springer-Verlag, N. Y. (1982)]; [Deutscher, Methods in Enzymology Vol . 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990)]; [Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.]; [Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd Edition Wiley-Liss, NY]; [Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ], [Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications : A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; [Harris and Angal, Protein Purification Methods : A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; [Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3 rd Edition Springer Verlag, NY]; [Janson and Ryden, (1998) Protein Purification : Principles , High Resolution Methods and Applications , Second Edition Wiley-VCH, NY]; 및 [Walker (1998), Protein Protocols on CD - ROM Humana Press, NJ]; 및 상기 문헌들에서 인용된 참고 문헌)에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 갖는, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 것이 갖는 한가지 장점은 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 본래의 형태로 폴딩된다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정 실시태양에서, 당업자는 합성, 발현 및/또는 정제 이후에 단백질은 관련 폴리펩티드의 원하는 형태와는 다른 형태를 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 발현된 단백질은 임의로 변성되고 재생될 수 있다. 이는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드에 샤페로닌을 첨가하거나, 카오트로픽 제제, 예를 들어, 구아니딘 HCl 중에 단백질을 가용화시키거나, 또는 단백질 디설피드 이소머라제를 사용하거나 하는 등의 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되는 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 형태로 리폴딩시키는 것이 때로는 바람직할 수도 있다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE, 및/또는 샤페로닌을 관심의 대상이 되는 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질을 환원, 변성 및 재생하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다(상기 참고 문헌들 및 문헌 ([Debinski, et al. (1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070]; [Kreitman and Pastan(1993) Bioconiug . Chem .. 4: 581-585]; 및 [Buchner, et al., (1992) Anal . Biochem .. 205: 263-270])을 참조). (Debinski) 등은 예를 들면, 구아니딘-DTE 중에서 봉입체 단백질을 변성시키고 환원시키는 것에 관해 기술하였다. 제한하는 것은 아니지만, 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 산화 환원 완충액 중에서 단백질을 리폴딩할 수 있다. 리폴딩 시약을 유동시키거나, 다르게는 이동시켜 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있도록 할 수 있거나, 그 반대로 할 수 있다.
fEPO를 원핵생물 내에서 생산하는 경우, 그렇게 생산된 fEPO는 미스폴딩되어 생물학적 활성을 갖지 않거나, 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 상기 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, 하나 이상의 카오트로픽 제제(예로서, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 디설피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예로서, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화(fEPO가 또한 불용성인 경우), 언폴딩, 및 환원시킴으로써 미스폴딩된 fEPO는 리폴딩된다. 이어서, 카오트로프의 농도가 적당할 때, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하면, 디설피드 결합이 재형성될 수 있다. fEPO는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,511,502호, 제4,511,503호, 및 제4,512,922호에 기재된 방법을 이용하여 리폴딩될 수 있다. fEPO는 또한 다른 단백질과 코폴딩되어 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩된 후, fEPO는 추가로 정제되는 것이 바람직하다.
일반적인 정제 방법 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상 HPLC("RP-HPLC: reversed phase-HPLC"), 확장층 흡착법, 또는 그의 임의의 조합법 및/또는 이들 방법을 (임의의 적당한 순서로) 반복 수행하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 수득한 fEPO 또는 임의의 fEPO 혼합물을 포함하는 세포 용해물에 대해 다양한 단리 단계 중 임의의 하나를 수행할 수 있다.
본원에 기술된 기법을 수행하는데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 이용가능하다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록기 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-래드 라보라토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(캘리포니아주 허큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인크.(Amersham Biosciences, Inc.)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터 이용가능하다. 또한, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 상기 회사들로부터 이용가능하다.
평형화, 및 본원에 기술된 칼럼 크로마토그래피 방법에서의 다른 단계, 예를 들면, 세척 및 용리는 특수 장치, 예를 들면, 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 펌프로는 하이로드(HILOAD)® 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
분획 수집기의 예로는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기인 FRAC-100 및 FRAC-200 분획 수집기, 및 슈퍼프랙(SUPERFRAC)® 분획 수집기(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다. pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기 또한 이용가능하다. 상업적으로 이용가능한 혼합기는 그라디안트 혼합기 (Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기(In-Line Mixer)(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.
임의의 상업적으로 이용가능한 모니터를 사용하여 크로마토그래피 과정을 모니터할 수 있다. 그러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로는 모니터(Monitor) UV-1, 유니코드(UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈, 인크.(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전체 시스템이 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 예를 들면, fEPO는, 먼저 생성된 정제된 fEPO를 우레아 중에서 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제(예를 들면, DTT)를 함유하는 트리스 완충액으로 희석시킴으로써 환원되고 변성될 수 있다. 또다른 실시태양에서, fEPO는 약 2 M 내지 약 9 M 농도 범위의 우레아 중에서 변성된 후, pH가 약 5.0 내지 약 8.0 범위인 트리스 완충액 중에서 희석된다. 이어서, 본 실시태양의 리폴딩 혼합물을 인큐베이션시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 환원되고 변성된 fEPO 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리시키거나, 정제할 수 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 fEPO 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 fEPO 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지된 기법을 사용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 당업계의 숙련인에게 주지되어 있는 기법을 사용하여 제1 fEPO 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충액을 다음 단리 단계에 적합한 완충액으로 교환할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 하나의 실시태양에서, 선택적 추가 단계로서 이온 교환 크로마토그래피를 제1 fEPO 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](카탈로그 번호 18-1114-21, Amersham Biosciences(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))을 참조한다. 상업적으로 이용가능한 이온 교환 칼럼은 하이트랩(HITRAP)®, 하이프랩(HIPREP)®, 및 하이로드® 칼럼(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함한다. 이러한 칼럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면, Q 세파로스® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면, SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스® 패스트 플로우 및 SP 세파로스® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면, DEAE 세파로스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면, CM 세파로스® 패스트 플로우(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 사용한다. 정제 과정 중 임의의 단계에서 fEPO에 대해 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 fEPO 를 단리시킬 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유상, 다공성, 비다공성, 미세구형, 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질로는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 그의 임의의 복합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 양이온 교환기 매트릭스에 fEPO를 흡착시킨 이후에, 상기 매트릭스와, 매트릭스로부터 fEPO를 치환시키는데 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액을 접촉시켜 실질적으로 정제된 fEPO를 용리시킬 수 있다. 실질적으로 정제된 fEPO의 고 pH 용리에 사용하기에 적합한 완충액으로서는 농도 범위가 적어도 약 5 mM 내지 적어도 약 100 mM인 시트레이트, 포스페이트, 포름에이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
역상 크로마토그래피 RP-HPLC를 수행하여 당업계의 숙련인에게 공지된 적합한 프로토콜에 따라서 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230(1982)]; [Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119]; [Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402])를 참조한다. RP-HPLC를 fEPO에 대하여 수행하여 실질적으로 정제된 fEPO를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C30, 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C20, 또는 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C18 수지를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다양한 길이를 갖는 알킬 관능기를 포함하는 실리카 유도체화된 수지가 사용될 수 있다. 별법으로, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 앰버크롬 CG1000sd 수지(TosoHaas Amberchrome CG1000sd resin)가 사용될 수 있다. 알킬 쇄 길이가 매우 다양한 시아노 또는 중합체 수지도 사용될 수 있다. 추가로, 상기 RP-HPLC 칼럼을 용매, 예를 들어, 에탄올로 세척할 수 있다. 이온 쌍 형성제 및 유기 개질제, 예를 들어, 메탄올, 이소프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용리 완충액을 RP-HPLC 칼럼으로부터 fEPO를 용리시키는데 사용할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 이온 쌍 형성제로서는 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 아세트산트리에틸암모늄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 용리는 하나 이상의 구배 조건 또는 등용매 조건을 사용하여 수행될 수 있으며, 분리 시간을 단축시키고 피크 폭을 줄이는 것이 바람직한 구배 조건이다. 또다른 방법은 상이한 용매로 2가지 농도 구배를 걸어주어 수행하는 것을 포함한다. 본원에 사용하기에 적합한 용리 완충액의 예로서는 아세트산암모늄 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC: Hydrophobic interaction chromatography)를 fEPO에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(카탈로그 번호 18-1020-90, Amersham Biosciences (뉴 저지주 피스카타웨이 소재))](본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 적합한 HIC 매트릭스는 아가로스, 가교 결합된 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬- 또는 아릴-치환 매트릭스, 예를 들면, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스, 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 혼합된 형태의 수지를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피에 대한 상업적으로 이용가능한 공급원으로는 하이트랩®, 하이프랩®, 및 하이로드® 칼럼(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 간략하면, 로딩 전, HIC 칼럼을 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 완충액, 예를 들면, 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 이어서, fEPO를 로딩시킨 후, 칼럼을 표준 완충액과 조건을 사용하여 세척함으로써 fEPO는 HIC 칼럼 상에서 체류시키면서 원치 않는 물질은 제거할 수 있다. 약 3 내지 약 10 칼럼 부피의 표준 완충액, 예를 들면, 특히 EDTA, 및 평형 완충액보다 낮은 농도의 황산암모늄을 함유하는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액 등을 사용하여 fEPO를 용리시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 사용하여 선형 염 구배를 줄여가면서 fEPO 분자를 용리시킬 수 있다. 이어서, 예를 들면, 여과, 예를 들면, 투석여과 또는 한외여과에 의해 용리액을 농축시킬 수 있다. 투석여과를 사용하여 fEPO를 용리시키는데 사용되는 염을 제거할 수 있다.
기타 정제 기법 예를 들어, 겔 여과(GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS(카탈로그 번호 18-1022-18, Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재))(본원에서 참고로 인용된다), HPLC, 확장층 흡착법, 한외여과법, 투석여과 및 동결 건조법 등을 사용하는 추가의 또다른 단리 단계를 제1 fEPO 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물에 대해 수행하여 임의의 과량의 염을 제거하고, 상기 완충액을 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약품의 제형화를 위한 적합한 완충액으로 대체할 수 있다. 본원에 기술된 각 단계에서 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기법을 사용하여, 실질적으로 정제된 fEPO를 비롯한 fEPO의 수율을 모니터할 수 있다. 또한, 그러한 기법은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 fEPO의 수율을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면, 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC; 뿐만 아니라, 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 기법을 사용하여 fEPO의 수율을 모니터할 수 있다.
순도는 표준 기법, 예를 들면, SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블롯(Western blot) 및 ELISA 분석을 사용하여 fEPO를 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.
추가의 정제 방법으로는 미국 특허 번호 제4,612,367호에 기재되어 있는 것을 포함하고, (1) 약 7 내지 약 9의 pH에서 fEPO 폴리펩티드를 포함하는 혼합물을 역상 거대 다공성 아크릴레이트 에스테르 공중합체 수지 지지체에 적용시키는 것; 및 (2) 약 20부피% 내지 약 80부피%의, 아세톤, 아세토니트릴, 및 아세톤 및 아세토니트릴의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 유기 희석제를 함유하며 약 7 내지 약 9의 pH를 갖는 수성 용리제를 사용하여 상기 지지체로부터 fEPO 폴리펩티드를 용리시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
EPO 단백질을 정제하는 전형적인 방법은 1996년 11월 14일 공개된 WO 96/35718(Burg)에 개시되어 있고, 이는 하기에 기술되어 있다. 블루 세파로스(Blue Sepharose)(Pharmacia)는 그의 표면에 시버크론(Cibacron) 블루 염료가 공유결합되어 있는 세파로스 비드로 구성되어 있다. EPO는 대부분의 비단백질성 오염원보다는 블루 세파로스에 더욱 강하게 결합하기 때문에, 몇몇 단백질성 불순물 및 PVA, EPO가 본 단계에서 강화될 수 있다. 블루 세파로스 칼럼 용리는 염 농도 뿐만 아니라, pH를 증가시킴으로써 수행할 수 있다. 칼럼을 80-100 ℓ의 블루 세파로스로 충진시키고, NaOH로 재생시키고, 평형화 완충액(염화나트륨/염화칼슘 및 아세트산나트륨)으로 평형화시킨다. 산성화되고 여과시킨 발효조 상등액을 로딩한다. 로딩을 마친 후, 먼저 고농도의 염화나트륨을 함유하는 평형화 완충액과 유사한 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 이어서 TRIS 염기 완충액으로 세척한다. 생성물을 TRIS 염기 완충액으로 용리시킨 후, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다.
부틸 토요펄(Butyl Toyopearl) 650 C (Toso Haas)는 지방족 부틸 잔기가 공유결합되어 있는 폴리스티렌계 매트릭스이다. EPO는 대부분의 불순물 및 PVA보다는 상기 겔에 더욱 강하게 결합하기 때문에, 이소프로판올을 함유하는 완충액을 사용하여 용리시켜야 한다. 칼럼을 NaOH로 재생된 30-40 ℓ의 부틸 토요펄 650 C5로 팩킹하고, TRIS 염기 완충액으로 세척하고, 이소프로판올을 함유하는 TRIS 염기 완충액으로 평형화시킨다. 블루 세파로스 용리액을 칼럼 평형화 완충액 중의 이소프로판올 농도로 조정하고, 칼럼 상에 로딩한다. 이어서, 이소프로판올 농도를 증가시키면서 평형화 완충액을 사용하여 칼럼을 세척한다. 생성물을 용리 완충액(고함량의 이소프로판올을 포함하는 TRIS 염기 완충액)으로 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다.
하이드록시아파타이트 울트로겔(Ultrogel)(Biosepra)은 기계적인 특성을 개선시키기 위한 목적으로 아가로스 매트릭스에 혼입되어 있는 하이드록시아파타이트로 구성되어 있다. EPO는 하이드록시아파타이트에 대하여 낮은 친화성을 갖기 때문에, 저농도의 포스페이트에서는 단백질 불순물보다 먼저 용리될 수 있다. 칼럼을 30-40 ℓ의 하이드록시아파타이트 울트로겔로 충진시키고, 인산칼륨/염화칼륨 완충액 및 NaOH에 이어 TRIS 염기 완충액을 사용함으로써 재생시킨다. 이어서, 소량의 이소프로판올과 염화나트륨을 함유하는 TRIS 염기 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 부틸 토요펄 크로마토그래피의 EPO 함유 용리액을 칼럼 상에 로딩한다. 이어서, 칼럼을 평형화 완충액과, 이소프로판올 및 염화나트륨을 함유하지 않는 TRIS 염기 완충액으로 세척한다. 생성물을 저농도의 인산칼륨을 함유하는 TRIS 염기 완충액으로 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다.
RP-HPLC 물질 비다크(Vydac) C4(Vydac)는 그 표면이 C4-알킬 쇄를 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 fEPO의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리시킬 수 있다. 스테인레스 스틸 칼럼(2.8 내지 3.2 ℓ의 비다크 C4 실리카 겔로 충진됨)을 사용하여 분취형 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 하이드록시아파티트 울트로겔 용리액을 산성화시키고, 비다크 C4 칼럼에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충액으로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 fEPO 분획을 풀링한다.
DEAE 세파로즈(Pharmacia) 물질은 세파로즈 비드의 표면에 공유 결합되어 있는 디에틸아미노에틸(DEAE) 기로 이루어져 있다. fEPO를 DEAE 기에 결합시키는 과정은 이온 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 체류하지 않고 칼럼을 통과한다. 이 물질들이 씻겨져 나간 후, 낮은 pH의 아세테이트 완충액으로 칼럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 이어서, 상기 칼럼을 중성의 포스페이트 완충액으로 세척하고, fEPO는 이온 강도를 점점 증가시키면서가면서 완충액으로 용리시킨다. 칼럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 팩킹한다. 칼럼 부피는 fEPO 로딩량이 3-10 mg fEPO/ml 겔 범위가 되도록 조정한다. 칼럼을 물과 평형 완충액(인산나트륨/인산 칼륨)으로 세척한다. 풀링된 HPLC 용리액 분획을 로딩하고, 이 칼럼을 평형 완충액으로 세척한다. 이어서, 상기 칼럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)으로 세척한 후, 다시 평형 완충액으로 세척한다. 이어서, 용리 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)을 사용하여 상기 칼럼으로부터 fEPO를 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획물에서 수집한다. DEAE 세파로오스 칼럼의 용리액을 특수 전도성을 갖도록 조정한다. 생성된 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70℃에서 보관한다.
브래드포드(Bradford) 분석, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분광분석법(MALDI-TOF를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 당업계에 공지되어 있는, 단백질을 특징화하는 다른 방법들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 방법 및 절차들이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 단백질의 수율 및 순도를 평가하는데 사용될 수 있다.
IX . 대체 시스템에서의 발현
비-재조합 숙주 세포, 돌연변이를 생성 숙주 세포, 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 수개의 전략법들이 사용되었다. 또한, 이러한 시스템들은 본 발명의 fEPO를 제조하는데 사용하기에 적합하다. 반응성 측쇄, 예를 들면, Lys, Cys 및 Tyr로 아미노산을 유도체화시킴으로써 리신을 N2-아세틸-리신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 본래의 화학적 결찰이 최근 개발됨으로써 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu . Rev . Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조한다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 서프레서 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반 시험관내 생합성 방법을 사용하여 100개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들면, 문헌 ([V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 1995, 34:621 (1995)]; [CJ. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site -specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989)]; 및 [J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc . 111:8013-8014 (1989)])를 참조한다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 전달의 연구를 위해 광범위한 작용기가 단백질 내로 도입되었다.
선택적 압력 도입으로 불리는 생체내 방법을 개발하여 야생형 신테타제의 무차별 혼합(promiscuity)을 실시하였다. 예를 들면, 문헌 [N. Budisa, C Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41(1999)]를 참조한다. 세포에 특정한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 성장 정체기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 소실되고, 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 전략법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질 내로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더 (shoulder)를 나타내며(예를 들면, 문헌 [C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem ., 284:29(2000)] 참조); 트리플루오로메티오닌을 사용하여 박테리오파지 T4 리소자임에서 메티오닌을 대체함으로써 19F NMR을 사용하여 키토올리고당 리간드와 메티오닌의 상호작용을 연구하였고(예를 들면, 문헌 [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404(1997)] 참조); 트리플루오로류신을 류신 대신 도입한 결과, 루신 지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가하였다. 예를 들면, 문헌 [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 40:1494(2001)]을 참조한다. 또한, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌 ([W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665(1990)]; [J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol, 1:283(1994)]; [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur . J. Biochem, 230:788(1995)]; 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol ., 270:616(1997)])을 참조한다. 또한, 알켄 또는 알킨 관능기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들면, 문헌 ([J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett .. 428:68(1998)]; [J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am . Chem. Soc, 122:1282(2000)]; 및 [K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron , 56:9487(2000)]; 미국 특허 번호 제6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097)(본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.
이러한 방법의 성공 여부는 아미노아실-tRNA 신테타제에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선택성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한가지 방법은 아미노아실-tRNA 신테타제의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 수가 제한된 경우에 달성되었다. 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 신테타제(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala294의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 일으킨다. 문헌 [M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107(1994)]를 참조한다. 이 돌연변이체 PheRS를 보유하는 에스케리치아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입한다. 예를 들면, 문헌 ([M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett ., 364:272(1995)]; 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 467:37(2000)])을 참조한다. 유사하게, 에스케리치아 콜라이 티로실-tRNA 신테타제의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phe130Ser은 티로신보다 아자티로신을 더 효율적으로 도입하는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol . Chem .. 275:40324(2000)]을 참조한다.
생체내에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 또다른 전략법은 교정 기전을 갖는 신테타제를 개질시키는 것이다. 이러한 신테타제는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 분리 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된(mischarged) 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지시킨다. 상기 신테타제의 교정 활성이 작용하지 못하는 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이러한 접근법은 발릴-tRNA 신테타제(ValRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌 [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science. 292:501(2001)]을 참조한다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고; 이러한 비동족 아미노산들은 추후 교정 도메인에 의해 가수분해된다. 에스케리치아 콜라이 염색체의 무작위적 돌연변이유발 후, ValRS의 교정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주를 선별하였다. 이러한 교정 결핍 ValRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 치환됨), 돌연변이체 ValRS도 이 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주가 Abu의 존재하에 성장하는 경우 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질 내의 각각의 발린 위치에서 발린의 약 24%가 Abu로 치환된다는 것을 보여준다.
또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 새로운 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 하기 공보 및 그 안에서 인용되고 있는 참고 문헌을 참조한다: 문헌 ([Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins . Nature, 1227-1232 (1961)]; [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem . 5914-5919 (1966)]; [Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes , Ace Chem Res, 47-54(1989)]; [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987)]; [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone - engineered HIV protease , Science. 2221-225 (1992)]; [Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 255-301 (1981)]; [Offord, R.E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng ., 151-157 (1987)]; 및 [Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 243 (1994)]).
화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관내에서 단백질에 도입하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 ([Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence - specific single-stranded deoxyribonuclease , Science, 1401-1403 (1987)]; [Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Rev Biochem, 565-595 (1985)]; [Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science . 505-511 (1984)]; [Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol - subtilisin, J Biol . Chem. 6392-6401 (1968)]; [Polgar, L. B. M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site . Thiol - subtilisin. J. Am Chem Soc, 3153-3154 (1966)]; 및 [Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 1038-1040 (1988)])을 참조한다.
별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA을 사용하는 생합성 방법을 사용하여 시험관내에서 합성된 단백질 내로 수개의 생체물리적 프로브를 도입하였다. 하기 공보 및 그 안에서 인용되고 있는 참고 문헌을 참조한다: 문헌 ([Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem , 483-514 (1993)]; 및 [Krieg, U. C, Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 8604-8608 (1986)]).
종래, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그램화된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비천연 아미노산이 시험관내에서 부위 특이적으로 도입될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 접근법을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성을 갖는 균주를 사용하여 다수의 20종의 일반 아미노산을 근접한 구조적 동족체로 치환시킬 수 있고, 예를 들면, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P.G. A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science , 244: 182-188 (1989)]; [M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)]; [Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site - specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)]; [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)]; [Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site - specifically into proteins. Methods in Enz ., 301-336 (1992)]; 및 [Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)])를 참조한다.
예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 단백질 유전자 내의 관심의 대상이 되는 부위에 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들면, 문헌 [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate - based olignoucleotide - directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 791-802 (1988)]을 참조한다. 아실화된 서프레서 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정한 위치에 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 비천연 아미노산이 도입되었다. [3H]-Phe을 사용한 실험 및 α-하이드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에만 도입되고, 이 아미노산이 단백질 내의 임의의 다른 부위에는 도입되지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 문헌 ([Noren, et al, 상기 문헌 동일]; [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432]; 및 [Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site -specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science. 197-200(1992)])를 참조한다.
또한, 미세주입 기법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입하였다. 예를 들면, 문헌 ([M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Science, 268:439(1995)]; 및 [D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645(2000)])을 참조한다. 시험관내에서 제조된 2개의 RNA 종(관심의 대상이 되는 아미노산 위치에 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 서프레서 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 함께 주입하였다. 이어서, 난모 세포의 번역 기작은 UAG로 특정되는 위치에 인위적 아미노산을 삽입한다. 이러한 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템을 따르지 않는 통합 막 단백질의 생체내 구조 기능 연구를 가능케 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 타치키닌 뉴로키닌-2 수용체에 도입시켜 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들면, 문헌 [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J, Biol . Chem ., 271:19991(1996)] 참조); 이온 채널에서 표면 노출된 잔기를 확인하기 위해 비오티닐화된 아미노산을 도입하는 것(예를 들면, 문헌 [J. P. Gallivan, H. A. Lether and D. A. Dougherty, Chem . Biol., 4:739(1997)] 참조); 실시간으로 이온 채널의 구조적 변화를 모니터하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용하는 것(예를 들면, 문헌 [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Neuron, 20:619(1998)] 참조); 및 관문(gating) 기전을 프로빙하기 위해 알파 하이드록시 아미노산을 사용하여 이온 채널 골격을 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Cell, 96:89(1999)]; 및, [T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat . Neurosci .. 4:239(2001)])을 참조한다.
생체내에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포, 또는, 가능한 경우, 생명체에서 돌연변이체 단백질 연구 가능성, 및 치료학적 치료에 있어서 이러한 돌연변이체 단백질의 사용이라는 장점을 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 장점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 특성을 갖는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력은 단백질의 구조를 합리적 및 체계적으로 개조하는 능력 및 단백질 기능을 프로빙하고, 새로운 특성을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있는 능력을 크게 확장시킬 수 있다. 그러나, 단백질 번역에서 고도의 정확도를 달성하는 데 필요한 tRNA 신테타제 상호작용의 복잡한 성질로 인해 그러한 방법은 어렵다.
파라-F-Phe를 부위-특이적으로 도입하려는 한 시도에서, 효모 앰버 서프레서 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 신테타제 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 에스케리치아 콜라이 균주에서 사용하였다. 예를 들면, 문헌 [R. Furter, Protein Sci . 7:419 (1998)]을 참조한다.
무세포(시험관내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 fEPO 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻을 수도 있다. 분비 단백질을 번역하기에 유용한 막 추출물, 예컨대, 마이크로좀 막을 함유하는 개 췌장 추출물 또한 사용될 수 있다. 주형(시험관내 번역)으로서의 mRNA 또는 주형(시험관내 전사와 번역이 조합됨)으로서의 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 문헌 ([Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316(2001)]; [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)]; 및 [Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 번호 제6,337,191호; 미국 특허 공부 번호 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785)(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또다른 접근법은 mRNA 펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([R. Roberts and J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci . ( USA ) 94:12297-12302(1997)]; [A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)])을 참조한다. 이러한 접근법에서, 퓨로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비-천연 아미노산 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C 말단을 포획한다. 생성된 mRNA 펩티드 접합체가 시험관내 분석에서 관심의 대상이 되는 특성을 갖는 것으로 발견되는 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 보다 최근에는 정제된 성분을 사용한 시험관내 리보좀 번역이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌 [A. Forster et al., Proc . Natl Acad . Sci . ( USA ) 100:6353(2003)]을 참조한다.
X. fEPO 에 커플링된 거대분자 중합체
매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 발명의 fEPO 폴리펩티드에 연결시켜 fEPO의 생물학적 특성을 조정하고/거나, fEPO 분자에 새로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 이들 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용성 치환기, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 첨가되는 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 fEPO에 연결될 수 있다.
본 발명은 중합체:단백질 접합체로 된 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본원에서 사용된 "실질적으로 균질한"이라는 것은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질의 절반을 초과하는 정도의 수준으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본 명세서에 제공되는 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 fEPO 제제는 예를 들면, 롯 투 롯(lot to lot) 약동학의 예측가능성에 있어 임상적으로 쉽게 적용할 수 있는 것과 같은 균질한 제제의 장점을 나타내기에 충분한 정도로 균질한 제제이다.
또한, 당업자는 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택할 수 있으며, 이때 제공되는 장점은 혼합물 중에 포함되는 단일-중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 원한다면, 당업자는 다양한 갯수의 중합체 잔기(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)가 부착된 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 조합할 수 있고, 소정의 비율로 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 수득할 수 있다.
선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들면, 생리학적 환경 중에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료학적 사용을 위해, 중합체는 약제학적으로 허용될 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 분자:단백질 분자의 비는 반응 혼합물 중 그들의 농도와 같이 달라질 것이다. 일반적으로, (과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 최소로 존재한다는 점에서 반응 효율을 환산하면) 최적의 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응기의 갯수에 의해 결정될 수 있다. 분자량과 관련하여 전형적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 파라미터를 최적화하는 경우, 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.
본원에서 사용되는 바, PEG:fEPO 접합체를 고려하는 경우, 용어 "치료학적 유효량"은 환자에게 유리한 효과를 주는, 헤마토크리트를 증가시키는 양을 지칭한다. 이 양은 개인마다 다르고, 환자의 전반적인 신체 상태 및 빈혈의 근본적인 원인을 비롯한 다수의 인자에 달려 있다. 예를 들어, 만성 신부전을 앓는 환자에 대한 fEPO의 치료학적 유효량은 50 내지 150 유닛/kg씩 주당 3회인 양이 될 것이다. 요법에 사용되는 fEPO의 양은 허용가능한 속도로 헤마토크리트를 증가시키며, 유익한 수준(보통은 적어도 약 30% 및 전형적으로는 30% 내지 36% 범위)으로 헤마토크리트를 유지시킨다. 본 조성물의 치료학적 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
수용성 중합체는 선형, 갈래형(forked) 또는 분지형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용될 수 있다. 일례로, 본 발명의 특정한 실시태양을 기술하는데 있어서 PEG를 사용한다.
PEG는 상업적으로 이용가능하거나, 당업계에 주지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합화에 의해 제조될 수 있는 잘 알려져 있는 수용성 중합체이다(문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 fEPO에 연결된 것으로서 나타낼 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
(상기 식에서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나, C1-4 알킬을 포함하나 이로 한정되지 않는 말단 변형이다).
몇몇 경우에서, 본 발명에 사용되는 PEG는 하이드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH3이다)를 갖는 하나의 말단 상에서 종결된다("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응기로 종결되어 이작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응기는 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는데 통상적으로 사용되는 반응기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 활성화된 에스테르(N-하이드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 알데히드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 뿐만 아니라, 20종의 일반 아미노산에 대해 불활성을 나타내지만 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(아지드 기 및 알킨 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 한쪽의 말단이 천연적으로 발생된 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 fEPO에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들면, Y는 폴리펩티드의 아민 기(리신의 엡실론 아민 또는 N 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대한 아미드, 카바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 티올 기(시스테인의 티올 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 20종의 일반 아미노산을 통해 통상적으로는 접근할 수 없는 잔기에 대한 결합일 수 있다. 예를 들면, PEG 상의 아지드 기는 fEPO 폴리펩티드 상의 알킨 기와 반응하여 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성할 수 있다. 별법으로, PEG 상의 알킨 기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드 기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 하이드록실아민, 세미카르바지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 해당되는 경우, 몇몇 경우에서, 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존은 적절한 환원제의 처리에 의해 더 환원될 수 있다. 별법으로, 강한 친핵성 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 fEPO 폴리펩티드 내로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다.
필요에 따라 약 1,000 달톤(Da) 내지 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 (때때로 1-50 kDa 또는 10-40 kDa을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 임의의 분자량을 가진 PEG가 사실상 필요에 따라 사용될 수 있다. 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 MW가 10-40 kDa (5-20 kDa을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)인 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 분지형 쇄 PEG 또한 사용될 수 있다. 매우 다양한 PEG 분자들이 쉐어워터 폴리머, 인크.(Shearwater Polymer, Inc.) 카탈로그, 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics) 카탈로그(본원에서 참고로 인용된다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 문헌에 기재되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 적어도 하나의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응에 이용될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 PEG를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 알킨 부분을 함유하여 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성하거나, 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 결합을 형성한다. 별법으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 아지드 부분을 함유하여 [3+2] 휘스겐 사이클로첨가 생성물을 형성한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기를 포함하는 경우, PEG는 각각 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성하기 위해 전형적으로 강한 친핵성 물질(히드라지드, 하이드록실아민 또는 세미카르바지드 관능기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다. 다른 대안으로, 상기 기술한 반응기의 역 배향을 사용할 수 있다. 즉, 비천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, PEG 유도체를 갖는 fEPO 변이체는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 관능기와 반응하는 화학적 관능기를 함유한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 D인 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 또한, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련된 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체들도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점을 이해해야 한다. 용어 PEG는 이작용성 PEG, 멀티아암형 PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 현수 PEG(즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련된 중합체), 또는 그 안에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
전형적으로, PEG는 투명하고, 무색 무취이며, 수용성이고, 열에 대해 안정하며, 많은 화학 제제에 대해 불활성을 띠고, 가수분해되거나 악화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성 물질로서 간주되는데, 즉, PEG는 유해하지 않으며, 생명체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 특히 PEG는 실질적으로 비면역원성인데, 즉, PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 나타낸다. PEG가 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면, 생물학적 활성 제에 부착된 경우, PEG는 상기 물질을 차폐하는 경향을 나타내며, 유기체가 상기 물질의 존재에 대한 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체에는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 응고 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 일으키는 경향은 없다. 화학식 --CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(상기 식에서, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로 약 20 내지 약 2000이다)을 갖는 PEG가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG가 중합체 골격으로서 특히 유용하다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분, 및 중심 분지 코어에 연결된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예를 들면, 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예를 들면, 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)m(여기서, R은 코어 부분, 예를 들면, 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨로부터 유도되고, m은 아암의 갯수를 나타낸다)로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,932,462호; 제5,643,575호; 제5,229,490호; 제4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469호; 및 WO 93/21259(그들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 분지형 PEG는 PEG(--YCHZ2)n(상기 식에서, Y는 연결기이고, Z는 원자로 이루어진 일정 길이의 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단기이다)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 또다른 분지형 형태인 현수 PEG는 PEG 쇄의 말단이 아닌, PEG 골격을 따라 반응기, 예를 들면, 카르복실 기를 갖는다.
또한, 이러한 PEG 형태 이외에, PEG 중합체는 골격 상의 약한 또는 분해가능한 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, PEG는 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 내의 에스테르 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단시킨다:
-PEG-CO2-PEG-+H2O → PEG-CO2H+HO-PEG-
용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본원에 개시된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점을 당업자는 이해할 것이다.
또한, 다수의 다른 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 몇몇 실시태양에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격은 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예로는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면, 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 그의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다), 그의 3원중합체, 그의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 달라질 수 있지만, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da이다.
실질적으로, 당업자는 상기 수용성 골격에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며, 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 중합체 물질들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 중합체 유도체는 "다작용성"이며, 이는 중합체 골격이 적어도 2개의 말단을 갖고, 가능하게는 작용기로 작용화되거나, 활성화된 약 300개 정도의 말단을 갖는다는 것을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는 각각의 말단이 동일하거나, 상이할 수 있는 작용기에 결합되는 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시태양에서, 중합체 유도체 하기 화학식을 갖는다:
X-A-POLY-B-N=N=N
상기 식에서,
N=N=N은 아지드 부분이고;
B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 연결 부분이고;
POLY는 수용성 비항원성 중합체이고;
A는 존재하거나, 존재하지 않을 수 있고, B와 동일하거나, 상이할 수 있는 연결 부분이고;
X는 제2 작용기이다.
A 및 B에 대한 연결 부분의 예는 18개 이하의, 더욱 바람직하게는, 1-10개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 알킬 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 쇄에 헤테로원자, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지형일 수 있다. A 및 B에 대한 연결 부분의 다른 예로는 10개 이하, 더욱 바람직하게는, 5-6개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 아릴 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 연결기의 다른 예로는 미국 특허 제5,932,462호, 및 제5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0143596(각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 연결기를 포함한다. 당업계의 숙련인은 상기 연결 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며, 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 연결 부분들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤, 및 아지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 동종이작용성(여기서, 동종이작용성이란 제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미한다)이거나, 이종이작용성(여기서, 이종이작용성이란 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미한다)일 수 있다.
용어 "보호된"은 특정한 반응 조건하에서 화학적 반응 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 그러한 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응기의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 화학적 반응기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 t-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있다. 화학적 반응기가 카르복실산, 예를 들면, 부탄산 또는 프로피온산 또는 하이드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면, 메틸, 에틸 또는 t-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기도 본 발명에 사용될 수 있다.
문헌 중의 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-숙신이미딜 카르보네이트(예로서, 미국 특허 번호 제5,281,698호, 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들면, 문헌 ([Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379(1981)], [Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177(1983)]) 참조), 히드라지드(예를 들면, 문헌 [Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301(1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들면, 문헌 [Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997] 참조; 또한, 미국 특허 번호 제5,672,662호도 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들면, 문헌 ([Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175(1984)] 및 [Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381(1979)]) 참조), 숙신이미딜 에스테르(예로서, 미국 특허 번호 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예로서, 미국 특허 번호 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들면, 문헌 [Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11(1979)], [Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991)]) 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들면, 문헌 ([Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25(1983)], [Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251(1985)]) 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들면, 문헌 ([Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141(1985)]; 및 [Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45(1991)]) 참조), 알데히드(예로서, [Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341(1984)], 미국 특허 번호 제5,824,784호, 미국 특허 번호 제5,252,714호) 참조), 말레이미드(예를 들면, 문헌 ([Goodson et al. Bio/technology 8:343(1990)], [Romani et al. in Chemistry of Peptide and Protein 2:29(1984)], 및 [Kogan, Synthesis Comm. 22:2417(1992)]) 참조), 오르토피리딜디설피드(예를 들면, 문헌 [Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)] 참조), 아크릴로(예를 들면, 문헌 [Sawhney et al., Macromolecular, 26:581(1993)] 참조), 비닐설폰(예로서, 미국 특허 번호 제5,900,461호 참조)을 포함한다. 상기 참고 문헌 모두가 본원에서 참고로 인용된다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=N=N
상기 식에서,
X는 상기한 바와 같은 작용기이고,
n은 약 20 내지 약 4000이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
상기 식에서,
W는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고;
n은 약 20 내지 약 4000이고;
X는 상기한 바와 같은 작용기이고, m은 1 내지 10이다.
본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/거나 본원에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 방법에서, 이하 나타내는 바와 같이, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 갖고, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, t-부틸암모늄 등을 비롯한 다수의 적합한 반대이온들 중 어느 것과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 아지드 부분에 의해 대체되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공한다.
X-PEG-L + N3 - → X-PEG-N3
나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용하기 적합한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L는 적합한 이탈기이다)을 갖는다. 적합한 작용기의 예로는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 및 비닐피리딘, 및 케톤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 이탈기의 예로는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또다른 방법에서, 아지드 관능기를 갖는 결합제를 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격과 접촉시켜 아지드가 연결기에 의해 중합체 골격으로부터 분리되어 있는 아지드 함유 중합체 유도체 생성물을 형성하는데, 여기서, 결합제는 PEG 중합체 상에서 화학적 관능기와 선택적으로 반응하는 화학적 관능기를 갖는다.
예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:
X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N
상기 식에서,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;
X는 캡핑 기, 예를 들면, 알콕시 또는 상기한 바와 같은 작용기이고;
M은 아지드 관능기와는 반응하지 않지만, N 작용기와는 유효하게 선택적으로 반응하는 작용기이다.
적합한 작용기의 예로는 N이 아민인 경우, M은 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르이고; N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우, M은 케톤이고; N이 친핵성 물질인 경우, M은 이탈기인 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
더욱 구체적인 예는 아민 중 하나가 보호기 부분, 예를 들면, t-부틸-Boc에 의해 보호되는 PEG 디아민의 경우로 다음에 도시되고, 생성된 단일 보호된 PEG 디아민은 아지드 관능기를 갖는 연결 부분과 반응한다:
BocHN-PEG-NH2 + H02C-(CH2)3-N=N=N
이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예를 들면, 티오닐 클로라이드 또는 카보디이미드 시약 및 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어 모노아민 PEG 유도체와 아지드를 갖는 링커 부분 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아미드 결합이 성공적으로 형성된 후, 생성된 N-t-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체를 생체활성 분자를 변형시키는데 바로 사용하거나, 추가로 다른 유용한 작용기를 안착시키도록 할 수 있다. 예를 들면, N-t-Boc 기는 강한 산 처리에 의해 가수분해되어 오메가-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성된 아민을 중요한 이종이작용성 시약의 생성을 위한 합성 기회로 사용하여 다른 유용한 관능기, 예를 들면, 말레이미드 기, 활성화된 디설피드, 활성화된 에스테르 등을 안착시킬 수 있다.
상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착시키는 것이 바람직한 경우, 이종이작용성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들면, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예를 들면, 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자를 PEG의 한 말단에 부착시키고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착시킨다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
X-A-POLY-B-C≡C-R
상기 식에서,
R은 H 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고;
B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 연결 부분이고;
POLY는 수용성 비항원성 중합체이고;
A는 존재하거나, 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나, 상이할 수 있는 연결 부분이고;
X는 제2 작용기이다.
A 및 B에 대한 연결 부분의 예는 18개 이하의, 더욱 바람직하게는, 1-10개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 알킬 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 쇄에 헤테로원자, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지형일 수 있다. A 및 B에 대한 연결 부분의 다른 예로는 10개 이하, 더욱 바람직하게는, 5-6개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 아릴 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 연결기의 다른 예로는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국 특허 출원 2003/0143596(각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 연결기를 포함한다. 당업계의 숙련인은 상기 연결 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며, 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 연결 부분들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤, 및 아세틸렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이해되는 바와 같이, 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아세틸렌 기와 상용가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 동종이작용성(여기서, 동종이작용성이란 제2 작용기(즉, X)도 아세틸렌 부분인 것을 의미한다)이거나, 이종이작용성(여기서, 이종이작용성이란 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미한다)일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
상기 식에서,
X는 상기한 바와 같은 작용기이고;
n은 약 20 내지 약 4000이고;
m은 1 내지 10이다.
각 이종이작용성 PEG 중합체의 구체적인 예는 하기에 나타낸다.
본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업자에게 공지되고/거나 본원에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 갖고, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격은 아세틸렌 관능기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기 적합한 이탈기, 둘 모두를 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 갖는 PEG 중합체 및 이탈기를 갖는 분자가 조합된 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 친핵성 부분에 의해 대체되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공한다.
X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'
나타낸 바와 같이, 반응에 사용하기 바람직한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-Nu(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이고, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 관능기와 반응하지 않는 작용기이다)이다.
Nu의 예는 주로 SN2 유형의 기전에 의해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Nu 기의 추가적인 예는 주로 친핵성 첨가 반응을 통해 반응하는 작용기를 포함한다. L 기의 예는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트 및 친핵성 치환을 수행할 것으로 예상되는 다른 기 뿐만 아니라 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 첨가를 수행할 것으로 예상되는 다른 친전자성 기를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, A는 1-10개의 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14개의 탄소 원자의 치환된 아릴 환이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적합한 이탈기이다.
본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또다른 방법에서, 하나의 말단에서 보호된 작용기 또는 캡핑제를 갖고, 나머지 다른 하나의 말단에서 적합한 이탈기를 갖는 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체는 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.
예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:
X-PEG-L + -C≡CR'→ X-PEG-C≡CR'
상기 식에서,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;
X는 캡핑 기, 예를 들면, 알콕시 또는 상기한 바와 같은 작용기이고;
R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시 기 또는 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시 기이다.
상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우, SN2 유형의 치환이 이루어지도록 충분한 반응성을 띠어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는데 필요로 하는 반응 조건은 당업계에게 주지되어 있다.
통상, 조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라, 크로마토그래피하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
수용성 중합체는 본 발명의 fEPO 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 수용성 중합체는 fEPO 폴리펩티드에 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 첨가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 연결될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체는 천연적으로 발생된 아미노산(시스테인, 리신 또는 N 말단 잔기의 아민 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 fEPO 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개를 포함하는데, 여기서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 올리고당을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 연결되어 있다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 추가로 수용성 중합체에 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 천연적으로-코딩된 아미노산(들)을 포함한다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 비접합화된 형태에 비해 fEPO 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증강시킨다.
본 발명의 fEPO 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 갯수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변경된(증가되거나, 감소되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예를 들면, 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, fEPO의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2배, 5배, 10배, 50배, 또는 적어도 약 100배 증가된다.
강한 친핵성 기(즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 )를 함유하는 PEG 유도체
본 발명의 하나의 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 연결된 말단 히드라진, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
몇몇 실시태양에서, 하이드록실아민 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.
몇몇 실시태양에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나, 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)이다.
몇몇 실시태양에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 하이드록실아민, 히드라지드, 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
몇몇 실시태양에서, 하이드록실아민 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.
몇몇 실시태양에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나, 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)이다.
몇몇 실시태양에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 말단 히드라진, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 분자량은 10-40 kDa 범위이고, 더욱 바람직하게는, 5-20 kDa 범위일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서, 히드라진 말단 PEG 유도체 또는 히드라지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나, 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)이다.
몇몇 실시태양에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, 0, S, C(O)이거나, 존재하지 않고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.
몇몇 실시태양에서, 하이드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나, 존재하지 않고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.
수용성 중합체(들)가 fEPO에 연결되는 정도 및 부위가 fEPO의 부위 I에서의 fEPO 수용체 결합을 조정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합은 평형 결합 분석, 예를 들면, 문헌 [Spencer et al, J. Biol . Chem., 263:7862- 7867(1988)]에 기재된 것에 의해 측정한 바, 약 400 nM 이하의 Kd, 150 nM 이하의 Kd, 및 몇몇 경우에서, 100 nM 이하의 Kd로 fEPO 폴리펩티드가 부위 I에서 fEPO 폴리펩티드 수용체에 결합하도록 정렬된다.
중합체의 활성화 뿐만 아니라, 펩티드의 접합화 방법 및 화학 작용은 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 사용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 페리오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐설폰, 카르보디이미드, 설포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 ([R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.]; [S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton]; [G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.]; [Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991]) 참조).
PEG의 관능화 및 접합화에 대한 몇몇 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들면, 문헌 ([Harris, Macromol . Chem . Phys. C25: 325-373 (1985)]; [Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)]; [Wong et al, Enzyme Microb . Technol. 14: 866-874 (1992)]; [Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)]; [Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995)])를 참조한다.
또한, 중합체의 활성화 방법은 WO 94/17039, 미국 특허 번호 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 번호 제5,219,564호, 미국 특허 번호 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 번호 제5,281,698호, 및 추가로 WO 93/15189에서 살펴볼 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 사이의 접합화의 경우로는 응고 인자 VIII(WO 94/15625 참조), 헤모글로빈(WO 94/09027 참조), 산소 운반 분자(미국 특허 제 4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(문헌 [Veronese et al., App . Biochem . Biotech . 11: 141-45(1985)])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면, p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 fEPO 폴리펩티드의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들면, fEPO 폴리펩티드는 알킨 종결 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략하면, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 fEPO의 수용액에 첨가한다. 전형적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로, 약 pH 4-10) 근처에서 pKa를 갖는 완충액으로 완충 처리된다. 예를 들면, pH 7.5에서 PEG화하기 적합한 완충액의 예로는 HEPES, 포스페이트, 보레이트, 트리스-HCl, EPPS, 및 TES를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터하고, 필요에 따라 조정한다. 전형적으로, 반응을 약 1-48시간 동안 계속한다.
이어서, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하여 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 fEPO 변이체 분자를 가교 결합시키는 경우 형성될 수 있는 페길화된 fEPO의 임의의 고분자 복합체 및 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH로부터 PEG화된 fEPO 변이체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 동안의 조건은 임의의 가교 결합된 PEG화된 fEPO 변이체 복합체가 하나 이상의 PEG 기에 접합화된 하나의 fEPO 폴리펩티드 분자를 함유하는 원하는 형태를 따라 용리되는 반면, 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH는 컬럼을 통해 유동하도록 하는 것이다. 적합한 조건은 가교 결합된 복합체 대 원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 달라지며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용리액을 한외여과에 의해 농축시키고, 투석여과에 의해 탈염시킨다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 수득한 PEG화된 fEPO를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동법(분취용 등전 포커싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 차등 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 추출을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 방법으로 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 표준 물질과 비교함으로써 GPC에 의해 추정할 수 있다(문헌 [PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). fEPO-PEG 접합체의 순도는 단백질 분해적 분해(트립신 절단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 후 질량 분광분석법으로 평가할 수 있다(문헌 [Pepinsky B., et al., J. Pharmacol . & Exp . Ther . 297 (3): 1059-66 (2001)].
본 발명의 fEPO 폴리펩티드의 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 제한없이 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있다.
아지드 함유 PEG 유도체
본 발명의 또다른 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하는 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 몇몇 실시태양에서, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.
몇몇 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100- 1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.
또다른 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW은 10-40 kDa 범위이고, 더욱 바람직하게, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 임의로 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이고, 각각의 경우, 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
알킨 함유 PEG 유도체
본 발명의 또다른 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하는 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
몇몇 실시태양에서, 알킨 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 알킨 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 아지드 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
몇몇 실시태양에서, 알킨 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW은 10-40 kDa 범위이고, 더욱 바람직하게, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 알킨 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p-C≡CH
상기 식에서,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 임의로 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이거나, 존재하지 않을 수 있다.
포스핀 함유 PEG 유도체
본 발명의 또다른 실시태양에서, fEPO 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 몇몇 실시태양에서, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.
몇몇 실시태양에서, PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00016
상기 식에서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이다.
몇몇 실시태양에서, PEG 유도체는 화학식을 갖는다:
Figure pct00017
상기 식에서, X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로는 -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. R', R", R'" 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치환되거나, 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.
다른 PEG 유도체 및 일반 PEG화 기법
fEPO 폴리펩티드에 연결될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자 뿐만 아니라, PEG화 방법으로는 예로서, 미국 특허 공보 번호 제2004/0001838호; 제2002/0052009호; 제2003/0162949호; 제2004/0013637호; 제2003/0228274호; 제2003/0220447호; 제2003/0158333호; 제2003/0143596호; 제2003/0114647호; 제2003/0105275호; 제2003/0105224호; 제2003/0023023호; 제2002/0156047호; 제2002/0099133호; 제2002/0086939호; 제2002/0082345호; 제2002/0072573호; 제2002/0052430호; 제2002/0040076호; 제2002/0037949호; 제2002/0002250호; 제2001/0056171호; 제2001/0044526호; 제2001/0027217호; 제2001/0021763호; 미국 특허 번호 제6,646,110호; 제5,824,778호; 제5,476,653호; 제5,219,564호; 제5,629,384호; 제5,736,625호; 제4,902,502호; 제5,281,698호; 제5,122,614호; 제5,473,034호; 제5,516,673호; 제5,382,657호; 제6,552,167호; 제6,610,281호; 제6,515,100호; 제6,461,603호; 제6,436,386호; 제6,214,966호; 제5,990,237호; 제5,900,461호; 제5,739,208호; 제5,672,662호; 제5,446,090호; 제5,808,096호; 제5,612,460호; 제5,324,844호; 제5,252,714호; 제6,420,339호; 제6,201,072호; 제6,451,346호; 제6,306,821호; 제5,559,213호; 제5,612,460호; 제5,747,646호; 제5,834,594호; 제5,849,860호; 제5,980,948호; 제6,004,573호; 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것을 포함한다. 단일 쇄, 분지형 쇄, 멀티아암형 쇄, 단일 작용성, 이작용성, 다작용성, 또는 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의 형태의, 본원에 기술된 PEG 분자들 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
혈청 알부민에 대한 친화성 증강
또한, 다양한 분자를 본 발명의 fEPO 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중 fEPO의 반감기를 조정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 분자를 본 발명의 fEPO 폴리펩티드에 연결시키거나 융합시켜 동물 내의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 증강시킨다.
예를 들면, 몇몇 경우에서, fEPO 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예를 들면, 문헌 ([Makrides et al., J. Pharmacol. Exp . Ther. 277: 534-542 (1996)] 및 [Sjolander et al., J, Immunol . Methods 201: 115123 (1997)]) 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면, 문헌 [Dennis, et al., J. Biol . Chem . 277: 3503535043 (2002)]에 기재된 펩티드들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 몇몇 경우에서, 지방산은 혈청 알부민에의 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌 [Kurtzhals, et al., Biochem . J. 312; 725-731 (1995)]를 참조한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 직접 융합된다. 미국 특허 번호 제6,548,653호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.
당업자는 매우 다양한 다른 분자들도 또한 본 발명에서 fEPO에 연결되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조정할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
XI . fEPO 의 글리코실화
본 발명은 당류 잔기를 갖는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 fEPO 폴리펩티드를 포함한다. 당류 잔기는 천연 당류 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 비천연 당류 잔기(3-플루오로갈락토스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)일 수 있다. 당류는 N- 또는 0-연결된 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토스-L-세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 비-천연 결합(옥심 또는 상응하는 C- 또는 S-연결된 글리코시드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결될 수 있다.
당류(글리코실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 부분은 생체내 또는 시험관 내에서 fEPO 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 아미노옥시 기로 유도체화된 당류에 의해 변형시켜 옥심 결합을 통해 연결된 상응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 일단 당류가 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되면, 글리코실트랜스퍼라제, 및 fEPO 폴리펩티드에 결합된 올리고당류를 생성할 있는 다른 효소를 사용하여 추가로 처리함으로써 당류를 더 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다. 당류를 글리코실트랜스퍼라제 및 다른 효소로 추가 처리하여 fEPO 폴리펩티드에 결합된 올리고당을 생성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [H. Liu, et al. J. Am . Chem . Soc . 125: 1702-1703(2003)]을 참조한다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 아미노옥시 유도체로서 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸에 의해 직접 변형된다. 당업자는 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 비롯한 다른 관능기를 사용하여 당류를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결시킬 수 있다는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 이어서, 아지드 또는 알키닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 단백질이 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있게 한다.
XII . GH 초유전자 계열 구성원 이량체 및 다량체
본 발명은 또한, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 fEPO와 같은 GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드가 또다른 GH 초유전자 계열 구성원 또는 그의 변이체, 또는 GH 초유전자 계열 구성원 또는 그의 fEPO 변이체가 아닌 임의의 다른 폴리펩티드에 상기 폴리펩티드 골격에 직접 또는 링커를 통해 결합된, GH 초유전자 계열 구성원 조합물(fEPO를 포함하나, 이에 한정되지 않음) 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체(즉, 3량체, 4량체 등)를 제공한다. GH 초유전자 계열 구성원, 예로서, fEPO, 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 그의 분자량이 증가되어 있기 때문에, 단량체 GH 초유전자 계열 구성원과 비교하여 상이한 약리학적 성질, 약동학적 성질, 약력학적 성질, 조정된 치료학적 반감기, 또는 조정된 혈장 반감기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 신규하거나 바람직한 특성을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 GH 초유전자 계열 구성원, 예로서, fEPO, 이량체는 GH 초유전자 계열 구성원 수용체의 신호 전달을 조정할 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 GH 초유전자 계열 구성원 이량체 또는 다량체는 GH 초유전자 계열 구성원 수용체 길항제, 효현제 또는 조정제로 작용하게 된다.
몇몇 실시태양에서, fEPO 함유 이량체 또는 다량체 중에 존재하는 하나 이상의 fEPO 분자는 부위 II 결합 영역 내에 존재하는, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 그 자체로서, 이량체 또는 다량체 중의 각 fEPO 분자는 부위 I 경계면을 통한 fEPO 수용체에의 결합에 접근가능하지만, 부위 II 경계면을 통한 제2 fEPO 수용체에의 결합에는 이용불가능하다. 따라서, fEPO 이량체 또는 다량체는 2개의 다른 fEPO 수용체 각각의 부위 I 결합 부위를 차지할 수 있지만, fEPO 분자는 부위 II 영역 중에 존재하는 비유전적으로 코딩된 아미노산에 부착된 수용성 중합체를 갖고 있기 때문에, fEPO 수용체는 fEPO 리간드의 부위 II 영역을 차지할 수 없고, 이량체 또는 다량체는 fEPO 길항제로서의 역할을 한다. 몇몇 실시태양에서, fEPO 함유 이량체 또는 다량체 중에 존재하는 하나 이상의 fEPO 분자는 부위 I 결합 영역 내에 존재하는, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하며, 이를 통해 부위 II 영역에 결합할 수 있다. 별법으로, 몇몇 실시태양에서, fEPO 함유 이량체 또는 다량체 중에 존재하는 하나 이상의 fEPO 분자는 부위 I 또는 부위 II 결합 영역 내에 있는 부위에 존재하는, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하며, 그 둘 모두 결합에 이용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 결합에 이용될 수 있는 부위 I, 부위 II, 또는 그 둘 모두를 포함하는 fEPO 분자 조합이 사용된다. 적어도 하나는 결합에 이용가능한 부위 I를 포함하고, 적어도 하나는 결합에 이용가능한 부위 II를 포함하는 것인 fEPO 분자 조합이 바람직한 활성 또는 특성을 갖는 분자를 제공할 수 있다. 추가로, 결합에 이용가능한 부위 I 및 부위 II, 둘 모두를 포함하는 fEPO 분자 조합이 초효현제 fEPO 분자를 생산할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 디설피드 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 결합에 의해 직접 연결된다. 몇몇 실시태양에서, 연결된 GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드, 및/또는 연결된 비GH 초유전자 계열 구성원은 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함으로써 이량체화를 용이하게 하는데, 제1 fEPO 폴리펩티드의 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산 중 알킨과 제2 GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드의 제2 비천연적으로 코딩된 아미노산 중 아지드가 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가를 통해 접합화되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 별법으로, GH 초유전자 계열 구성원 및/또는 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 연결된 비GH 초유전자 계열 구성원은 하이드록실아민 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드에 접합화될 수 있고, 폴리펩티드는 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.
별법으로, 2개의 GH 초유전자 계열 구성원 폴리펩티드, 및/또는 연결된 비GH 초유전자 계열 구성원은 링커를 통해 연결되어 있다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커를 사용함으로써, 동일하거나, 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 GH 초유전자 계열 구성원, 및/또는 연결된 비GH 초유전자 계열 구성원을 연결시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, GH 초유전자 계열 구성원, 및/또는 연결된 비GH 초유전자 계열 구성원을 함께 연결시키는데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 하이드록실아민, 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기를 포함하며, 아령 구조를 갖는 수용성 이작용성 링커를 제공한다. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 적어도 하나의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들면, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 화학식을 갖는 활성화된 수용성 중합체와의 반응에 의해 형성된, 하나 이상의 GH 초유전자 계열 구성원, 예로서, fEPO를 포함하는 다량체를 제공한다:
R-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m-X
상기 식에서, n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2-10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 하이드록실아민, 아세틸, 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑 기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들면, 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N- 하이드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기일 수 있다.
XIII . fEPO 활성 및 IFN 수용체에 대한 fEPO 의 친화성의 측정
fEPO 수용체는 미국 특허 번호 제5,387,808호; 제5,292,654호; 제5,278,065호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. fEPO 폴리펩티드 활성은 표준 시험관내 또는 생체내 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, fEPO의 존재하에서 증식하는 세포주(UT-7 세포, TF-1 세포, FDCP-1/mEPOR, 또는 비장 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 fEPO 수용체 결합을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 문헌 ([Wrighton et al., (1997) Nature Biotechnology 15:1261-1265]; 미국 특허 번호 제5,773,569호; 및 제5,830,851호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 비천연 아미노산을 포함하는 비PEG화 또는 PEG화 fEPO 폴리펩티드의 경우, 호르몬의 그의 수용체에 대한 친화성은 비아코어™ 바이오센서(Pharmacia)를 사용하여 측정할 수 있다. fEPO 활성을 테스트하기 위한 생체내 동물 모델(예로서, 뮤린 등) 뿐만 아니라, 고양이 형질은 공지되어 있고, 예로서, 문헌 (미국 특허 번호 제6,696,056호; [Cotes et al., (1961) Nature 191:1065-1067]; 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0198691; 및 [Phaim Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)])(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것을 포함한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 이량체화 능력에 대한 분석은 미국 특허 번호 제6,221,608호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 수행할 수 있다.
XIV . 효능, 기능적 생체내 반감기 및 약동학적 파라미터의 측정
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 효능 및 기능적 생체내 반감기는 미국 특허 번호제6,586,398호; 제5,583,272호; 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0198691 A1(본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 프로토콜에 따라 측정할 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드에 대한 약동학적 파라미터는 정상적인 스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(처리군 당 N = 5마리 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 래트 1마리 당 25 ug의 단일 투여량을 정맥내로 투여받거나 또는 50 ug의 단일 투여량을 피하 투여받게 되고, 일반적으로, 수용성 중합체에 접합화되지 않은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 경우 약 6시간, 및 수용성 중합체에 접합화된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 경우 약 4일 동안의 미리 정해진 시간에 따라 대략 5-7개의 혈액 샘플을 채취하게 된다. fEPO에 대한 약동학적 데이터는 수개의 종에서 잘 연구되어 있고, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO에 대하여 수득한 데이터와 직접 비교할 수 있다. 문헌 [Mordenti J., et al, Pharm . Res. 8(11):1351-59 (1991)]을 참조한다.
본 발명에 따른 fEPO의 특이적인 활성은 당업계에 공지된 다양한 분석법으로 측정될 수 있다. 본 발명의 정제된 fEPO 단백질의 생물학적 활성은, fEPO 단백질을 인간 환자에게 주사하여 투여하면 주사을 맞지 않은 피험체 또는 대조군의 피험체와 비교하였을 때 골수 세포에서의 망상적혈구 및 적혈구의 생산이 증가된 것이다. 본 발명에 따라 수득하고 정제시킨, fEPO 뮤테인, 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 문헌 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]에 따른 방법에 의해 테스트할 수 있다. fEPO의 활성을 측정하는 또다른 생물학적 분석법은 노르모시타에믹(normocythaemic) 마우스 분석시험이 있다( 문헌 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]).
XV. 투여 및 약제학적 조성물
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 fEPO, 신테타제, 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 임의로 적합한 약제학적 담체와 함께 조합되어(이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 치료학적 용도로 사용된다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 치료학적 유효량의 본 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로는 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 제조된다. 일반적으로, 단백질 투여 방법은 당업계에 주공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.
효능 및 조직 대사를 확인하고, 투여량을 평가하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 치료학적 조성물을 하나 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 당업계에 주지된 방법에 따라 임의로 테스트한다. 특히 투여량은, 즉, 관련 분석에서 측정된, 천연 아미노산 상동체에 대한 본원의 비천연 아미노산 상동체의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 척도(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 EPO와 천연 아미노산 EPO의 비교를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 초기에 결정할 수 있다.
투여는 보통 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 임의의 적합한 방식으로 투여된다. 본 발명와 관련하여 상기 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용가능하고, 특정 조성물을 투여하는데 1 초과의 경로를 사용할 수 있지만, 대개 특정 경로가 또다른 경로보다 더 빠르고 더 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물로 이루어진 적합한 제제는 매우 다양하게 존재한다.
폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 수단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 경로를 통해 투여될 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드 조성물은 또한 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 그러한 투여 경로와 적절한 제형이 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드를, 단독으로 또는 다른 적합한 성분들과 함께 조합하여 흡입 투여를 위한 에어로졸 제제(즉, 이것은 "분무"될 수 있음)로 제조할 수 있다. 에어로졸 제제는 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같이 허용가능한 압축 추진제 중에 함유될 수 있다.
예를 들어, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제와, 제제가 해당 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 팩킹된 핵산 제제는 예를 들면, 앰플 및 바이알과 같이 단회 투여 또는 다회 투여용 밀봉 용기로 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히 현재 사용되고 있는 제제와 함께, 천연 아미노산 동족체 치료제에 대해 이미 사용되고 있는 투여 경로(EPO, GCSF, GMCSF, IFN, 인터루킨, 항체, 및/또는 임의의 다른 약제학적으로 전달되는 단백질에 대해 전형적으로 사용되는 투여 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)가 본 발명의 비천연 아미노산에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제를 제공한다.
본 발명과 관련하여, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 환자가 유익한 치료학적 반응을 갖도록 하거나, 병원체에 의한 감염을 저해시키는 데 충분하거나(이를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 또는 적용 분야에 따른 다른 적절한 활성을 나타내기에 충분하다. 투여량은 특정 벡터, 또는 제제의 효능과, 사용된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 상태 뿐만 아니라, 치료 받을 환자의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량의 크기는 특정 환자에 있어서의 특정 벡터, 제제 등의 투여에 수반되는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질 및 정도 등에 의해 결정된다.
질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 벡터 또는 제제의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 제제의 독성, 질환의 진행도, 및/또는 관련이 있는 경우, 항비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.
예를 들어, 체중 70 kg의 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 해당 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기에 맞추어 조정된, 현재 사용되는 치료학적 단백질의 투여량과 등가인 범위 내에 있다. 본 발명의 벡터는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드의 투여, 핵산의 투여, 뉴클레오티드 유사체의 투여, 생물학적 반응 개질제의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다.
투여시, 본 발명의 제제는 관련 제제의 LD-50 및/또는 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 적용되는 바와 같이 다양한 농도에서의 비천연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 수행될 수 있다.
제제를 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 앓는 경우, 적절한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜하이드라민을 포함하며, 이에 한정되지 않는 것들을 추가 주입하기 30분 전에 주입에 대한 반응, 예를 들면, 고열, 근육통 및 오한을 경험하는 환자에게 마취 전 투여한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 더욱 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심도에 따라 세포 주입을 늦추거나, 중단한다.
본 발명의 고양이 fEPO 폴리펩티드는 포유동물 피험체에게 직접 투여될 수 있다. 투여는 fEPO를 피험체에 도입하는데 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 임의의 주어진 사례에서 가장 적합한 경로는 치료하고자 하는 병증의 성질 및 중증도에 따라 달라지지만, 본 발명의 실시태양에 따른 fEPO 폴리펩티드 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 협측(설하를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 질내, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막강내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 모두), 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 화합물 제제는 예를 들면, 앰플 및 바이알과 같은 단회 투여 또는 다회 투여용의 밀봉 용기로 제공될 수 있다. 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 제형의 주사제 형태(액제, 현탁제 또는 에멀젼을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)로 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 연속 주입(예를 들면, 삼투압 펌프와 같은 미니펌프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 단일 볼루스 또는 서방형 데포 제제에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 상기의 등장성 멸균 용액과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 이미 기술된 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물과, 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물(임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함함)로 이루어진 적합한 제제는 매우 다양하게 존재한다(예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)).
적합한 담체로는 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 및 다른 유기산을 함유하는 완충액; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 갖는 폴리펩티드); 단백질, 예로서, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예로서, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예로서, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한, 단당류, 이당류, 및 다른 당질; 킬레이트제, 예로서, EDTA; 2가 금속 이온, 예로서, 아연, 코발트 또는 구리; 당 알코올, 예로서, 만닛톨 및 소르비톨; 형성 반대 이온, 예로서, 나트륨; 비이온성 계면활성제, 예로서, 트윈(Tween)™, 플루로닉스(Pluronics)™, 또는 PEG를 포함한다.
예를 들면, PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 비롯한, 본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 또한 서방형 시스템 또는 그의 일부에 의해 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌 ([Langer et al., J. Biomed . Mater . Res., 15:267-277(1981)]; [Langer, Chem . Tech ., 12: 98-105(1982)])), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌 [Langer et al, 상기 문헌 동일]) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 번호 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌 [U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)]), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 하이알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 이소루신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포좀에 포획된 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 문헌 (DE 3,218,121; [Eppstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82:3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77:4030- 4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
리포좀에 포획된 fEPO 폴리펩티드는 예를 들면, 문헌 (DE 3,218,121; [Eppstein et al, Proc . Natl Acad . Sci . U.S.A., 82:3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77:4030-4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 주지되어 있거나, 당업자에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 리포좀의 몇 가지 예가, 예를 들어 문헌 ([Park JW, et al, Proc. Natl Acad . Sci . USA 92:1327-1331 (1995)]; [Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)]; [Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)]; [Park JW, et al, Clin . Cancer Res . 8:1172-1181 (2002)]; [Nielsen UB, et al, Biochim . Biophys . Acta 1591(1-3): 109-118 (2002)]; [Mamot C, et al, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)])에 기재되어 있다.
본 발명과 관련하여 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에서 유익한 반응을 유발하기에 충분하여야 한다. 일반적으로, 1회 투여당 비경구적으로 투여되는, 본 발명의 fEPO의 총 약제학적 유효량 범위는 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg, 또는 환자 체중 기준으로 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이나, 이 양은 치료학적 자유 재량에 따른다. 또한, 투여 빈도 역시 치료학적 자유 재량에 따르지만, 인체 사용에 대해 승인받은 상업적으로 이용가능한 fEPO 제품보다 더 빈번하거나, 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, 본 발명의 PEG화된 fEPO 폴리펩티드는 상기한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
XVI . 본 발명의 fEPO 폴리펩티드의 치료학적 용도
본 발명의 fEPO 폴리펩티드는 광범위한 질병을 치료하는데 유용하다. 본 발명의 fEPO 생성물을 투여하면 인간에서 적혈구가 형성된다. 병태 또는 질환 단독으로 또는 그의 일부로서, 적혈구 생산이 낮거나 또는 결핍성인 것을 특징으로 하는 혈액 질병을 앓는 인간 환자에게 다양한 수단에 의해 투여하는 데 유요한 효능을 갖는 fEPO 당단백질 생성물을 함유하는 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. fEPO 당단백질 생성물의 평균량은 유자격 의사의 권고 및 처방에 기초하여 달라질 수 있고, 그에 기초하여야 한다. fEPO의 정확한 양은 치료할 병증의 정확한 유형, 치료 환자의 상태 뿐만 아니라, 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자에 대한 선호 대상의 문제이다. 따라서, 본 발명의 fEPO는 적혈구 생산을 자극하고, 하락한 적혈구 수치를 고치는 데 사용될 수 있다. 가장 보편적으로, 적혈구 수치는 빈혈에 기인하여 감소하게 된다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 병증들 중에는 신장 기능의 감소 또는 상실(만성 신부전)과 관련된 빈혈, 골수종 억제 요법, 예로서, 화학요법 또는 항바이러스 약물(예로서, AZT)과 관련된 빈혈, 비골수성 암의 진행과 관련된 빈혈, 및 바이러스 감염(예로서, HIV)과 관련된 빈혈이 포함된다. 다르게는, 건강한 개체에서 빈혈을 유발할 수 있는 병증, 예로서, 수술 중 예측되는 혈액 상실이 치료될 수 있다. 일반적으로, fEPO로 치료될 수 있는 임의의 병증은 또한 본 발명의 PEG: fEPO 접합체로 치료될 수 있다. 본 발명은 또한 요법 중 적혈구 생성 증가를 유지시키기 위해 치료학적 유효량의 철을 투여하는 것을 제공한다. 제공되는 양은 fEPO를 사용한 요법에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
XVII . 실시예
하기 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이며, 청구된 본 발명을 제한하기 위해 제공되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 내로 도입되는 부위를 선택하는 것에 관한 다수의 가능한 기준 세트 중 하나를 설명한다.
본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 바람직한 fEPO 폴리펩티드 내의 부위를 어떻게 선택하는지를 입증한다. fEPO의 2차 구조에 관한 분자 모델링 및 공지된 정보를 사용하여 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입될 수 있는 바람직한 위치를 결정하였다. fEPO에 관한 다른 fEPO 구조 및 공지된 결정 구조 정보를 사용하여 결정 구조 데이터 세트 간의 1차, 2차, 또는 3차 구조 요소의 잠재적인 변이에 관해 조사하였다. 이들 구조에 대한 좌표는 단백질 데이터 뱅크(PDB)(문헌 [Bernstein et al. J Mol . Biol. 1997, 112, pp 535])로부터, 또는 http://www,rcsb.org의 구조 생물정보학 PDB 연구 협력과(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB)를 통해 이용가능하다. 구조 모델 1CN4는 예외적으로 질병에 기인하여 잔기 124-130, N 말단 A1, 및 C 말단 T163, G164, D165, 및 R166 잔기가 결정 중에서 누락되어 있는 것을 제외하고는, fEPO의 완전한 성숙 18 kDa 서열을 포함한다. C7와 C161, 및 C29와 C33에 의해 형성된 2개의 디설피드 결합이 존재한다.
본 실시예에서 사용된 서열 번호화는 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타낸 성숙 fEPO (18 kDa 변이체)의 아미노산 서열에 따른 것이다.
본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 내로 도입되는 부위를 선택하는 것에 관한 다수의 가능한 기준 세트 중 하나를 설명한다. 하기 기술하는 기준을 사용하였을 때, 비천연적으로 코딩된 아미노산(예를 들어, p-아세틸-페닐알라닌(pAF))의 부위 특이적인 도입을 위해 사용되는 아미노산 위치는 위치 53, 55, 116, 89, 72, 86, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 31, 163, 120, 76, 24, 38, 37, 49, 83, 21, 36이다. 수개의 EPO 결정 구조를 사용하여 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 도입될 수 있는 바람직한 위치를 결정하였다: 이들 구조에 대한 좌표는 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터 http://www,rcsb.org의 구조 생물정보학 연구 협력과(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB)를 통해 이용가능하다(PDB ID 1CN4, IEER, 및 IBUY). x선 결정 구조 정보를 사용하여 Cx 프로그램(문헌 [Pintar et al. Bioinformatics, 2002, Vol. 18, p980])을 사용함으로써 fEPO 분자에 대한 용매 접근성 계산을 수행하였다. 모든 원자의 용매 접근성을 계산하고, 각 아미노산 잔기에 대한 Cx 평균값을 측정하고, 도 8 및 도 9에 제시하였다. 하기 기준을 사용하여 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 fEPO 중의 각 위치를 평가하였다: 잔기는 (a) fEPO의 구조 분석 및 fEPO 및 1CN4, IEER, 및 IBUY의 구조 분석(hEPOpb에 접합된 hEPO의 결정학적 구조)을 기초로 한 fEPObp의 결합을 방해하지 않아야 하고, (b) 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해 영향을 받지 않아야 하고(문헌 ([Bittorf, T. et al. FEBS, 336:133-136 (1993)], [Wen, D., et al. JBC, 269:22839-22846 (1994)], 및 [Elliot, S. et al. Blood , 89:493-502 (1997)])), (c) 표면에 노출되어야 하고, 최대 Cx를 보여야 하고, 주변 잔기와 최소의 반 데르 발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내야 하며, (d) fEPO 변이체에서 결실되거나, 변형되어야 하고(문헌 ([Bittorf, T. et al. FEBS, 336:133-136 (1993)], [Wen, D., et al. JBC, 269:22839-22846 (1994)])), (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환시 보존적 변화를 일으키고, (f) 고도로 가요성인 영역(CD 루프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 구조적으로 강성인 영역(나선 B를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에서 발견될 수 있다. 추가로, 각 단백질 원자에 대한 돌출 정도를 평가하기 위해 Cx 프로그램(문헌 [Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980])을 사용함으로써 fEPO 분자에 대한 추가 계산을 수행하였다. 그 결과, 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 제한하는 것은 아니지만, fEPO의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서 치환된다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 7 , 8, 9, 10, 13, 17, 20, 21, 24, 25, 27, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 43, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 65, 68, 69, 72, 75, 76, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 110, 111, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 139, 159, 161, 162 ,163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합.
fEPO 길항제의 생성을 위한 몇몇 부위로는 10, 11, 14, 15, 96, 97, 100, 103, 104, 107, 110을 포함한다. 이들 부위는 효현제 디자인에 관한 기준 c-e를 사용함으로써 선택된 것이었다. 길항제 디자인은 또한 fEPObp에 대한 결합 친화성을 증가시키기 위한 부위 1에서의 잔기의 부위 지정 변형을 포함할 수 있다.
도 3-9는 위치 모델링 및 선별을 나타낸다. 도 8은 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 제한하는 것은 아니지만, fEPO의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서 치환된다는 것을 나타낸다: 53, 55, 116, 89, 72, 86, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 31, 163, 120, 또는 그의 조합. 도 9는 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 제한하는 것은 아니지만, fEPO의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서 치환된다는 것을 나타낸다: 53, 55, 76, 24, 116, 38, 89, 37, 72, 86, 49, 83, 21, 36, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 그의 조합.
실시예 2
본 실시예는 변형된 fEPO 폴리펩티드를 클로닝하고 E. 콜라이에서 발현시키는 것에 대해 설명한다.
본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드가 어떻게 E. 콜라이에서 발현될 수 있는지를 입증한다. fEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 문헌 [Matthews et al., (1996) PNAS 93:9471-76]에 기재되어 있는 바와 같이 생산한다. 태아 간, 성체 간, 태아 신장 및 성체 신장 cDNA 라이브러리는 전장의 fEPO 및 성숙 fEPO를 코딩하는 cDNA의 클로닝을 위한 주형이었고, 태아 간이 최상의 결과를 제공하였다. 전장의 fEPO 및 성숙 fEPO를 클로닝하는 데 사용된 프라이머는 당업자에게 공지되어 있는 프라이머일 수 있고, 그 예로는 하기의 것을 포함한다:
Figure pct00018
본 클로닝에 사용될 수 있는 3' 프라이머 서열의 예로는
Figure pct00019
이 있다.
클로닝 반응 조건은 94℃에서 2분 동안일 수 있고, 94℃에서 30초 동안, 5O℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안, 및 2℃에서 7분 동안 30회 싸이클을 수행한 후, 4℃에서 반응을 종결시키는 것일 수 있다. 전장의 fEPO, N 말단 신호 서열을 포함하지 않는 성숙한 형태의 fEPO, 및 SNP를 비롯한, fEPO를 코딩하는 분자를 확인한다. 전장의 cDNA 및 성숙 fEPO 코딩 cDNA를 발현 벡터, 예를 들면, pBAD HISc, 및 pET20b 발현 벡터 내로 삽입시킨 후, 아미노산 서열을 변경시키지 않고 클로닝 및 발현을 위해 서열을 최적화시킬 수 있다.
오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 신테타제(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO를 발현시켰다. O-RS는 우선적으로 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화시킨다. 최종적으로 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 fEPO 내로 삽입시킨다. 하기 표(표 2)는 전장의 fEPO 서열 및 성숙 fEPO 서열, 둘 모두와 및 O-RS 및 O-tRNA 서열을 포함하며, 이중 몇몇은 본 실시예에서 사용되고, 그 나머지는 hEPO와 사용되었고, fEPO와 함께 사용될 수 있거나, 또는 fEPO와 함께 사용될 수 있도록 최적화될 수 있다.
Figure pct00020
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Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
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변형된 fEPO 유전자 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 신테타제/tRNA 쌍(원하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적)을 포함하는 플라스미드로 E. 콜라이를 형질전환시킴으로써 비천연적으로 코딩된 아미노산을 fEPO 폴리펩티드에 부위 특이적으로 도입시킬 수 있다. 0.01-100 mM 사이의 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지 중 37℃에서 형질전환된 E. 콜라이를 성장시키고, 고신뢰도 및 고효율로 변형된 fEPO를 발현시켰다. 봉입체 또는 응집체로서 E. 콜라이 숙주 세포에 의해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 His 태깅된 fEPO를 생산하였다. 응집체를 가용화시키고, 6 M 구아니딘 HCl 중 변성 조건하에서 친화성 정제를 시켰다. 50 mM TRIS-HCl(pH 8.0), 40 μM CuSO4, 및 2% (w/v) 사르코실 중 4℃에서 밤새도록 투석시켜 리폴딩을 수행하였다. 이어서 물질을 20 mM TRIS-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2에 대해 투석시킨 후, His-tag를 제거하였다(문헌 [Boissel et al., (1993) 268:15983-93] 참조). fEPO 정제 방법은 당업계에 주지되어 있으며(문헌 ([NaM et al, (1991) JBC3 Vol 266, pp 23022-23026]; [Narhi et al , (2001) Protein Engineering, Vol14, pp 135-140]; [Darling et al, (2002) Biochemistry Vol 41, pp 14524-14531]; [Boissel et al., (1993) 268:15983-93]; 및 WO0032772 A2)), SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석법, 또는 전자분무-이온화 이온 트랩 질량 분광분석법에 의해 확인하였다.
실시예 3
본 발명에 따라 고양이 에리트로포이에틴 단백질(fEPO)를 발현하는 억제 발현 DNA 발현 벡터를 구성하였다.
A. 발현 벡터 구성
도 25에 도시되어 있는 발현 구성체는 그의 동족 tRNA 신테타제에 의해 p-아세틸페닐알라닌으로 바꿀 수 있는 tRNA 전사체를 코딩하는 하이브리드 tRNA 유전자 카피를 8개 포함한다. 각각의 tRNA 유전자 카피는 H1 프로모터 부위, tRNA 서열 및 폴리머라제 III 전사 종결 신호를 포함한다.
tRNA 유전자 다음에는 시미안(Simian) 바이러스 SV40의 복제 기점(SVO)이 위치하는데, 이는 일시적인 형질감염 이후 COS 세포에서의 발현 구성체(벡터)의 복제를 촉진시킨다.
그 다음으로는, 본 경우에서는 고양이 EPO 코딩 영역인 관심의 대상이 되는 유전자 서열에 대한 발현 카세트가 위치한다. 상기 카세트에서 맨 처음의 것은 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV)로서, 이는 메세지 발현을 유도하는 것이다. 상기 구성체 중 메세지는 고양이 에리트로포이에틴(fEPO)을 코딩하는 것으로서, 이는 연속하여 천연 신호 펩티드(Nat L) 다음에 위치하는 것이다. 메세지 다음으로는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGH)가 위치한다.
그 다음으로는, 최적화된 E. 콜라이 아세틸페닐알라닌 tRNA 신테타제를 코딩하는 서열(OptEcAFRS)의 발현을 유도하기 위해 카세트 내에 위치하는 마우스 베타 글로불린 주요 프로모터(베타)로 시작하는 발현 카세트가 위치하고, 뮤린 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 살모넬라 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(Neo)가 위치하는데, 이들 각각의 사이에는 뇌척수 심근염 바이러스 게놈으로부터 유래된 내부 리보좀 진입 부위(IRES)가 존재함으로써 분리되어 있다. Neo 서열 다음에는 SV40 조기 SV40 폴리아데닐화 신호(SV)가 위치한다.
벡터는 또한 colE1 복제 기점(pUC Ori) 및 암피실린 내성을 부여하는 베타락타마제 유전자(Amp)를 비롯한, 세균에서의 복제에 필요한 서열을 포함한다.
EMCV는 상업적으로 이용가능하고, cDNA는 바이러스 게놈 내의 IRES 부위로 상업적으로 합성하였다. DNA를 증폭시키고, 코딩 도메인 사이에 삽입시키는 데 적합 5' 및 3' 말단을 첨가하기 위해 상기 cDNA의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭을 수행하였다. 위치 834-836의 ATG 트리뉴클레오티드(진뱅크 수탁 번호 NC-001479)를 DHFR 및 Neo 서열에 대한 출발 코돈으로서 사용하였다.
문헌상에는 IRES 하류의 오픈 리딩 프레임이 상류의 오픈 리딩 프레임(5' CAP로 개시되는 번역부)보다 효율성이 낮다고 명시되어 있기 때문에, 클론 선별이 용이하게 이루어질 수 있도록 하기 위한 노력으로 DHFR 및 Neo 유전자를 상기의 지배적인 선별가능 마커에 선택적으로 영향을 미치는 독립적인 IRES 요소 다음에 배치시키는 전략법을 취하였다.
2가지 버전의 억제 발현 벡터를 생성하고, 루시 F(도 25) 및 어윈(도 26)이라고 지정하였다. 루시 F는 tRNA 유전자 카피 8개, 제2 IRES, 및 Neo 유전자를 포함한다. 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 플라스미드를 G418 처리를 통해 선별할 수 있도록 하기 위해 Neo 유전자를 포함시켰고, 이와는 대조적으로, 어윈은 tRNA 유전자 카피를 단지 4개 포함하였고, 제2 IRES 및 Neo는 포함하지 않았다. 이에 어윈의 크기는 더 작고, 단백질을 실험실용 수준으로 생성하기 위해 억제된 단백질을 일시적으로 발현시키는 데 있어 더욱 적합하다.
B. CHO 세포 발현
그에 대한 지도가 도 28에 도시되어 있고, 그의 서열은 표 3에 도 4에 기재되어 있으며, 억제 요소를 포함하고 고양이 EPO 단백질을 코딩하는 것인 벡터 "어윈 중 Nat L BB-Opti FEPO"를 일시적인 형질감염 프로토콜을 사용하여 CHO-S 세포 내로 형질감염시켰다. 이들 형질감염은 야생형 fEPO와 22개의 fEPO 변이체에서 동시에 수행함으로써 fEPO 생체활성 및 글리칸 구조가 유지될 수 있도록 하는 방식으로 앰버 코돈이 억제에 대한 대상인 코딩 영역 내에 배치될 수 있도록 하였다. 22개의 fEPO 변이체는 도 30에 나타낸 것: K52, Q86, E89, E31, E21, E37, R131, K1 16, F133, L130, R53, Y49, T132, A1, S120, R76, P129, S36, D55, A128, E72, R163을 포함한다. 실험 결과, ELISA에 의해 검출된 바, 야생형 서열은 발현이 잘 이루어졌고, 22개의 상이한 변이체의 억제 발현은 매우 다양하게 이루어졌지만, 22개 중 적어도 19개에서 발현이 입증된 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 억제 발현 구성체의 실시태양은 다양한 위치에 위치하는 앰버 억제 코돈을 포함하는 관심의 대상이 되는 유전자 서열을 발현시키는 것으로 예측된다.
접합화 효율 및 몇몇 부위의 접근성에 영향을 줄 수 있는 약 pH 4의 등전점 및 fEPO의 고도한 글리코실화 (질량의 40% 초과)를 갖는 것과 같은 상기의 단백질을 생산하는 데 있어 몇몇 기술상의 도전 과제를 수용하기 위해 fEPO의 일시적인 발현을 사용할 수 있으며, 이로써, 대체 발현 시스템 뿐만 아니라, 대체 화학법 또한 사용될 수 있다.
실시예 4
G418 내성 세포주 생성
본 실시예에서 억제 발현 구성체는 잔기 1 위치에서 일반 알라닌 잔기가 앰버 코돈으로 치환된 변형된 고양이 EPO 단백질을 코딩한다. 본 발현 구성체를 "루시 F 중 Nat L BB-Opti FEPO"로 지칭하며, 그에 대한 지도는 도 3에 도시되어 있고, 그의 서열은 도 4에 기재되어 있다.
(위치 A1에 앰버 코돈을 포함하는) Nat L BB-Opti FEPO A1을 CHO-DG44 모체 세포주 내로 형질감염시켰다. 96 웰 플레이트당 4x106개의 CHO 세포마다 0.5, 1.0, 또는 2.0 ug 선형화된 DNA를 사용하여 형질감염을 수행하였다. 발현 구성체 코딩 네오마이신 내성 마커와 G418을 함유하는 배지(CHO-S-SFM II+HT)을 통해 안정적으로 형질감염된 세포의 지배적 선별을 수행하였다.
생존가능 웰을 확인하고, 소규모(50 ml) 진탕기 배양물로 확장시키고, ELISA 분석법에 의해 세포 생산성을 평가하였다. 쉽게 검출할 수 있는 분비된 fEPO를 생산하는 각종의 G418 내성 세포 단리물을 수드하였다. 특히, 5B5 및 15B3, 이 둘은 각각 3-4일 경과 후에 0.07 및 0.1 mg/L, 또는 0.03 피코그램/세포/일(pcd: picogram/cell/day)를 생산하는 것으로 측정되었다. 인간 에리트로포이에틴용의 스템셀 EPO ELISA 키트-면역분석법(StemCell EPO ELISA KIT-Immunoassy)(카탈로그 번호 01630)을 사용하여 ELISA 분석법에 의해 분비된 fEPO를 검출하였다.
실시예 5
A. 게놈 증폭을 통한 발현 증가
루시 F 억제 발현 시스템은 뮤린 DHFR 유전자를 코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 발현을 위해 사용된 모체 CHO-DG44 세포주에는 DHFR 효소적 활성(이중 결실)이 완전히 없기 때문에, 통합된 표적 유전자(뮤린 DHFR)는 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지 중에서의 성장 선별에 의해 증폭될 수 있다. 이와 같이 증폭되는 동안, 직접 연결된 단백질 유전자(본 실시예에서 fEPO)가 부수적으로 증폭된다. 따라서, 증가된 양으로 fEPO를 생산하는 세포주를 단리시킬 수 있다. 본 발명자들은 5 nM MTX 중에서 G418 내성 세포주에 대한 1회차 선별을 수행하였다. 이어서, (ELISA에 의해 측정된 바) 수준이 가장 생산자를 확인하고, 그의 특징을 규명하였다.
fEPO G418 내성 세포주 계열 5B5 및 15B3을 5 nM MTX에 가하였다. 각 경우에서, 증폭 후에 억제 발현 수준이 상승하였으며, 이를 하기에 열거하였다.
Figure pct00044
상기 표에로부터 알 수 있는 바와 같이, 5 nM MTX 증폭시 발현 수준은 대략 3-5배 상승하였다. MTX의 농도를 증가시켰을 때의 추후의 증폭는 생산성을 추가로 증가시킬 것으로 예측된다.
실시예 6
22개의 fEPO 변이체를 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)에서 일시적으로 발현시켰다. tRNA 및 RS를 포함하는 발현 벡터 내로 fEPO의 변이체를 구성하였다. 야생형의 fEPO는 tRNA 및 RS를 포함하지 않는 또다른 발현 벡터 내로 구성하였다. 본 회사에 의해 개발된 형질감염 방법을 사용하여 pAF를 포함하거나 포함하지 않는 CHO 세포 내로 플라스미드(변이체 및 w.t. fEPO)를 형지감염시켰다.
w.t. fEPO 및 fEPO 변이체의 일시적인 발현 방법
폴리사이언시즈(Polysciences)로부터 입수한 25 kDa 선형의, 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 증류수 중에서 1 mg/ml로 제조하고, pH를 7.2로 조정하고, 사용 전에 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 필터 멸균화시켰다.
글루타민이 보충된 CHO 프리스타일(CHO FreeStyle) 배지 중에서 CHO 세포(Invitrogen)를 유지시켰다. 코닝(Corning)으로부터 입수한 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 30 mL 배양물을 제조하였다. 형질감염 전날 세포를 0.5x6/ml로 시딩하였다. 형질감염 전 성장 배지를 사용하여 세포 밀도를 1x106/mL로 조정하였다. 형질감염 전 파라-아세틸-페닐알라닌을 1 mM로 첨가하였다. 37 ㎍의 DNA를 RPMI 배지 중에 용해시킨 후, DNA를 함유하는 RPMI 배지 중에 74 ㎕의 1 mg/mL PEI 용액을 첨가하였다. 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, DNA 및 PEI 혼합물을 125 ml 에를렌마이어 플라스크 중 30 mL 배양물 내로 첨가하였다. 이어서, 플라스크를 37℃ 인큐베이터로 옮긴 후, 형질감염 후 72시간이 경과하였을 때 인간 ELISA 분석법에 의해 상등액을 정량화하였다. 도 30은 pAF 존재하에서의 fEPO 변이체의 억제 수준을 나타낸다.
fEPO의 각 변이체는 pAF의 위치에 의해 조정된 바, 상이한 수준으로 억제되었다. K52, Q86, 및 E89는 pAF의 존재하에서 ELISA 분석법에 의해 검출되지 않았다. pAF의 부재하에서는 fEPO 변이체 어느 것도 ELISA 분석법에 의해 검출되지 않았다. 상등액을 또한 그 기능에 대하여 TF-1 분석법에 의해 분석하였다. 본 실험 결과를 도 30에 나타내었다.
실시예 7
TF-1 증식 분석법 및 TF-1 작용성 fEPO 분석법은 도 11-24에 제시되어 있다. TF-1 세포를 밤새도록 성장 배지 중 T-75 플라스크에 150,000개의 세포/ml로 시딩하고, 분석 당일날 세포를 50 ul의 분석 배지 중 20,000개의 세포/웰로 시딩하였다(도 11). TF-1 세포를 ATCC로부터 구입하고, 적백혈병을 앓는 환자의 골수 세포로부터 세포주를 확립하였다. 세포주의 성장은 IL-1, GMcsf, EPO 및 fEPO에 의존하는 것으로 나타났다. fEPO에 대한 반응으로 진행되는 TF-1 세포의 증식에 의해 활성을 측정하였다. WST-8에 의해 증식 정도를 측정하였다. 세포 미토콘드리아 데하이드로게나제에 의한 테트라졸륨 염 wst-8의 포르마잔으로의 절단은 살아있는 세포의 개수에 비례한다. 450 nm에서의 염료 용액의 흡광도를 측정함으로써 생존가능 세포에 의해 생성된 포르마잔 염료를 정량하였다(도 13, 도 16, 도 19, 도 20, 도 21). 도 13에서, 조건은 다음과 같았다: TF-1 세포를 웰당 40,000개; 30,000개; 20,000개; 및 10,000개의 세포인 밀도로 다양하게 하여 시딩하였다. 2개의 상이한 인큐베이션 시간, 48시간 및 72시간을 사용하였을 뿐만 아니라, 2개의 상이한 fEPO 농도 (2500 ng/mL 및 500 ng/mL), 2개의 상이한 희석 계획(3x 및 2.5x), 및 24시간 동안 기아 상태인 세포 뿐만 아니라, 비기아 상태인 세포도 사용하였다. 이들 실험 및 기능성 분석에서 얻은 결과는 도면 및 도면 설명에 설명되어 있고 제시되어 있다.
실시예 8
고양이 에리트로포이에틴( fEPO )의 야생형 및 파라- 아세틸페닐알라닌 ( pAF ) 변이체의 정제, 및 폴리(에틸렌글리콜)의 pAF 변이체로의 선택적 접합화
fEPO 및 pAF 변이체를 정제하는 것은 농축 및 투석여과 이후, 페닐보로네이트, 음이온 교환, 및 소수성 상호작용이라는 3가지 칼럼 크로마토그래피 단계를 포함한다. PEG화 이전에 정제된 물질을 농축시키고, PEG화 완충액으로 교환하였다.
UF/DF: 세포 배양물 상등액을 농축시키고, X 투석부피의 50 mM HEPES(pH 8.5) 중에서 교환한 후, 마스터플렉스(MasterFlex) 펌프에 연결된 슬라이스 200(Slice 200)(Sartorius Stedim) 시스템을 사용하여 크로마토그래피에 로딩하였다.
페닐보로네이트 ( PB : Phenylboronate ) 크로마토그래피
50 mM HEPES(pH 8.5) 중에서 평형화된 프로셉 PB(ProSep PB) 칼럼을 사용하여 음성 포획 모드로 페닐보로네이트 수지를 수행하였다. 물질이 유동 통과 세척액 중에 수집되었다(50 mM HEPES(pH 8.5)). 50 mM HEPES, 50 mM 소르비톨(pH 8.5); 50 mM Tris, 6 M 우레아(pH 8.5); 및 100 mM 아세트산 중 단계식 용리를 통해 불순물을 제거하였다.
상기 기술된 바와 같이, UF/DF에 의해 물질을 PB 유동 통과 세척액으로부터 20 mM Tris(pH 8.0)로 교환한 후, 음이온 교환 크로마토그래피 상에 로딩하였다.
음이온 교환 크로마토그래피( AEX : Anion exchange chromatography )
XK 16 칼럼(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE Healthcare) 중 Q 세파로스 고성능 칼럼(유속 120 cm/h)을 사용하여 물질을 정제하였다. 20 mM Tris(pH 8.0) 중에서 평형화된 칼럼 상에 물질을 로딩하였다. 선형 AB 구배를 사용하여 용리를 수행하였다(여기서, 완충액 A = 20 mM Tris(pH 8.0), 완충액 B = 20 mM Tris, 500 mM NaCl(pH 8.0)). 고정 부피의 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 항EPO ELISA에 의해 분석하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피( HIC : Hydrophobic Interaction Chromatography )
fEPO를 함유하는 AEX 풀을 3.5 M 황산암모늄 중에 희석시켜 최종 농도가 1.5 M인 황산암모늄 농충액을 수득하였다. 20 mM Tris, 1.5 M 황산암모늄(pH 8.0) 중에서 평형화된 페닐 세파로스 고성능 수지상에 물질을 로딩하였다(120 cm/h). 20 CV 선형 AB 구배상에서 용리를 수행하였다(여기서, A = 20 mM Tris, 1.5 M 황산암모늄(pH 8.0) 및 B = 20 mM Tris, 50% (v/v) 에틸렌글리콜(pH 8.0)). 고정 부피의 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 항EPO ELISA에 의해 분석하였다.
fEPO pAF 변이체의 PEG 화
관련 분획을 풀링하고, 1회전당 10분으로 하여 비바스핀(VivaSpin) 칼럼 10,000 MWCO @ 15000 x g를 사용하여 ~ 5 mg/ml로 농축시켰다. 샘플을 20 mM 아세트산나트륨, 1 mM EDTA(pH 4.0)로 교환하였다. 20 kD PEG-옥시아민(Sunbright ME200-CA) 및 아세트산을 이용함으로써 pH 4.0으로 조정된 1% (w/v) 아세트히드라지드를 사용하여 12:1 mol비의 PEG:단백질을 이용하여 PEG화를 개시하였다. >12시간 동안 28℃에서 PEG화를 수행하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 31, 도 32, 및 도 33). 변이체 A1은 30 kDa PEG로 PEG화하고, 변이체 Y49는 40 kDa PEG로 PEG화하고, 변이체 R53은 20 kDa PEG로 PEG화하고, 변이체 D55는 30 kDa PEG로 PEG화하고, 변이체 P129는 30 kDa PEG로 PEG화하였다.
실시예 9
본 실시예는 카르보닐 함유 아미노산의 도입, 및 아미노옥시 함유 PEG와의 후속 반응에 관해 설명한다.
본 실시예는 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하고, 이어서,대략 5,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 반응하는 fEPO 폴리펩티드를 생성하는 방법을 설명한다. 잔기 1, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127, 및 128, 각각은 개별적으로 하기 화학식을 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:
Figure pct00045
p-아세틸-페닐알라닌을 fEPO 내로 부위 특이적으로 도입하는데 사용되는 서열은 상기 기술된 표 2, 및 서열(예로서, muttRNA 및 TyrRS LW1, 5, 또는 6)에 개시되어 있다.
일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체를
화학식: R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
(상기 식에서, R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 5,000 MW이다)를 갖는 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시킨다. 25 mM MES(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 6.0), 25 mM Hepes(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 4.5) 중 10 mg/mL로 용해된, p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 fEPO를 10 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 후, 10-16시간 동안 실온에서 교반한다(문헌 [Jencks, W. J Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475]). 이어서, 즉시 정제하고 분석하기 위해 PEG-fEPO를 적절한 완충액 내로 희석시킨다.
실시예 10
아미드 결합을 통해 PEG에 연결되어 있는 하이드록실아민 기로 구성된 PEG와의 접합화
하기 화학식을 갖는 PEG 시약을 상기 실시예에 기술되어 있는 방법을 사용하여 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시킨다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
(상기 식에서, R = 메틸, n=4, 및 N은 대략 2,000 MW이다). 반응, 정제, 및 분석 조건은 상기 실시예에 기술되어 있는 바와 같다.
실시예 11
본 실시예는 2개의 독특한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 fEPO 내로 도입하는 것을 설명한다.
본 실시예는 하기 잔기 중 2개의 위치에 케톤 관능기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하고 있는 fEPO 폴리펩티드를 생성하는 방법을 설명한다: N24X* 및 G113X*; N38X* 및 Q115X*; N36X* 및 885X*; N36X* 및 A125X*; N36X* 및 A128X*; Q86X* 및 S126X*(여기서, X*는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타낸다). fEPO 폴리펩티드는 상기 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 제조되는데, 단, 예외적으로, 서프레서 코돈은 핵산내 2개의 독특한 부위에 도입된다.
실시예 12
본 실시예는 fEPO 폴리펩티드의 히드라지드 함유 PEG에의 접합화 및 후속하는 계내 환원을 설명한다.
카르보닐 함유 아미노산을 도입하고 있는 fEPO 폴리펩티드는 상기 실시예에 기술되어 있는 방법에 따라 제조한다. 일단 변형되면, 하기 화학식을 갖는 히드라지드 함유 PEG를 fEPO 폴리펩티드에 접합시킨다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
(상기 식에서, R = 메틸, n=2 및 N = 10,000 MW 및 X는 카르보닐(C=O) 기를 포함한다). p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 fEPO를 25 mM MES(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 6.0), 25 mM Hepes(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 4.5) 중에 0.1-10 mg/mL로 용해시키고, 10 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시키고, 최종 농도 10-50 mM로 H2O에 용해되어 있는 스톡 1 M NaCNBH3(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)을 첨가하여 상응하는 히드라존을 계내에서 환원시킨다. 반응은 암실에서 4℃ 내지 실온하에 18-24시간 동안 수행한다. 최종 트리스 농도 50 mM로 1 M 트리스(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(약 pH 7.6)를 첨가하여 반응을 종결시키거나, 즉시 정제하기 위해 적절한 완충액 내로 희석시킨다.
실시예 13
본 실시예는 알킨 함유 아미노산의 fEPO 내로의 도입 및 mPEG-아지드에 의한 유도체화를 설명한다.
하기 잔기, 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127, 및 128은 각각 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:
Figure pct00046
p-프로파르길-티로신을 fEPO 내로 부위 특이적으로 도입하는데 사용되는 서열은 상기 실시예 2에 기술되어 있는 muttRNA 등이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 fEPO 폴리펩티드를 E. 콜라이에서 발현시키고, 상기 기술된 조건을 사용하여 정제한다.
PB 완충액(100 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl(pH = 8))에 0.1-10 mg/mL로 용해된, 프로파르길-티로신을 함유하는 정제된 fEPO 및 10 내지 1000배 과량의 아지드 함유 PEG를 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 촉매량의 CuSO4 및 Cu 선을 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 인큐베이션시킨 후(실온 또는 37℃에서 약 4시간, 또는 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), H2O를 첨가하고, 혼합물은 투석 막을 통과시켜 여과시킨다. 상기 실시예에 기술되어 있는 것과 유사한 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 샘플을 첨가에 대하여 분석할 수 있다.
본 실시예에서, PEG는 하기 화학식을 갖는다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
(상기 식에서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 10,000 MW이다).
실시예 14
본 실시예는 fEPO 중의 큰 소수성 아미노산을 프로파르길 티로신으로 치환하는 것을 설명한다.
fEPO의 하기 영역들: 1-7 (N 말단), 27-38(A 나선과 B 나선 사이의 영역), 39-41(베타 시트 1), 42-46(베타 시트 1과 미니 나선 B' 사이의 영역), 47-52(미니 B' 나선), 53-54(미니 B' 나선과 B 나선 사이의 영역), 84-89(B 나선과 C 나선 사이의 영역), 114-121(미니 C 나선), 122-132(미니 C 나선과 베타 시트 2 사이의 영역), 133-135(베타 시트 2), 136-137(베타 시트 2와 D 나선 사이의 영역), 162-166(C 말단) 중 하나에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기는 상기 실시예에 기술되어 있는 바와 같은 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:
Figure pct00047
일단 변형되면, PEG를, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체에 부착시킨다. PEG는 하기 화학식을 가지며:
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
커플링 방법은 상기 실시예에 기술되어 있는 것을 따른다. 이는 천연 발생의 대형 소수성 아미노산 중 하나와 대략 등전자이고, 폴리펩티드내 별개의 부위에서 PEG 유도체를 사용하여 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체를 제조하게 된다.
실시예 15
본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 fEPO 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체의 제조를 설명한다.
상기 실시예에서 생산된 알킨 함유 fEPO 변이체를
화학식: N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
(상기 식에서, n은 4이고, PEG는 대략 5,000의 평균 MW를 갖는다)의 이작용성 PEG 유도체와 반응시켜 2개의 fEPO 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 상응하는 fEPO 동종이량체를 제조하였다. 유사한 방식으로, fEPO 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석을 상기 실시예에서와 같이 수행하였다.
실시예 16
본 실시예는 당류 부분을 fEPO에 커플링시키는 것을 설명한다.
다음 중 하나의 잔기를 상기 실시예에 기술한 바와 같이 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다: 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 및 162:
Figure pct00048
일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체를 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-연결된 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. fEPO 변이체(10 mg/mL) 및 아미노옥시 당류(21 mM)를 수성 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 중에서 혼합시키고, 37℃에서 7 내지 26시간 동안 인큐베이션시켰다. 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 중에서 당류 접합화된 fEPO(5 mg/mL)를 UDP 갈락토스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.4 단위/mL)와 48시간 동안 주변 온도에서 인큐베이션시킴으로써 제2 당류를 먼저 효소적으로 커플링시켰다(문헌 [Schanbacher et al. J Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061]).
실시예 17
본 실시예는 PEG화된 fEPO 길항제의 제조를 설명한다.
하기 잔기, 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 및 162 중 하나의 잔기를 상기 실시예에 기술한 바와 같이 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다:
Figure pct00049
일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체는
화학식: R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
(여기서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 20,000 MW이다)의 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응하여 폴리펩티드 내의 단일 부위에서 PEG 유도체로 변형된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 길항제를 생성한다. 커플링, 정제, 및 분석을 상기 실시예에서와 같이 수행한다.
실시예 18
fEPO 분자가 직접 연결된 fEPO 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체의 생성
알킨 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 변이체를, 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또다른 fEPO 변이체에 직접 커플링시킬 수 있는데, 이들 각각은 상기 실시예에 기술되어 있는 부위에 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함한다. 이를 통해서 두 fEPO 변이체가 부위 2 결합 경계면에서 물리적으로 결합되어 있는 것인 상응하는 fEPO 동종이량체가 생성될 것이다. 유사한 방식으로, fEPO 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종 이량체를 형성할 수 있다. 커플링, 정제, 및 분석을 상기 실시예에서와 같이 수행한다.
실시예 19
Figure pct00050
폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응하여 에테르(B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄 또는 분지형 쇄, 포화된 또는 불포화된 C1 내지 C20 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C3 내지 C7 포화된 또는 불포화된 사이클릭 알킬 또는 사이클릭 헤테로알킬, 치환되거나, 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기, 또는 치환되거나, 비치환된 알크아릴(알킬은 C1 내지 C20 포화된 또는 불포화된 알킬이다) 또는 헤테로알크아릴 기일 수 있다. 전형적으로, P-OH는 800-40,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.
실시예 20
mPEG-OH + Br-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C≡CH
20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 크실렌 중의 80중량% 용액(0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, Aldrich)으로서 용해된 프로파르길 브로마이드, 및 촉매량의 KI의 용액을 상기 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 환류하도록 가열하였다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 수득하였다.
실시예 21
mPEG-OH + Br-(CH2)3-C≡CH → mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 50 당량의 5-클로로-1-펜틴(0.53 mL, 5 mmol, Aldrich) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 상응하는 알킨을 수득하였다.
실시예 22
Figure pct00051
THF(50 mL) 및 물(2.5 mL) 중의 3-하이드록시벤질알코올(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨(1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 다음, 크실렌(3.36 mL, 30 mmol) 중의 80중량% 용액으로서 용해시킨 프로파르길 브로마이드의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 혼합물에 10% 시트르산(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-프로파르길옥시벤질 알코올을 수득하였다.
메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH2Cl2 중의 화합물 3(2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓았다. 통상적으로 후처리하여 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 제공하였다.
mPEG-OH 20 kDa(1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0.25 mmol)를 왕성하게 교반하면서 몇 분에 걸쳐 첨가한 후, 상기로부터 수득한 브로마이드(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성된 혼합물을 12시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 백색 침전물을 수득하고, 이를 수집하여 PEG 유도체를 수득하였다.
실시예 23
mPEG-NH2 + X-C(O)-(CH2)n-C≡CR'→ mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
또한, 상기 나타낸 바와 같이 말단 작용기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 관능기를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 수득할 수 있다.
실시예 24
Figure pct00052
4-펜티노산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH2Cl2(25 mL) 중에 용해시켰다. N-하이드록시숙신이미드(3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성된 조 NHS 에스테르 7을 추가 정제없이 하기 반응에 사용하였다.
5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH2(mPEG-NH2, 1 g, Sunbio)를 THF(50 mL) 중에 용해시키고, 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르 7(400 mg, 0.4 mmol)을 왕성하게 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 가온시키면서 교반하였다. 이어서, 물(2 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2(50 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 진공에서 건조시켰다.
실시예 25
본 실시예는, 또한 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로도 지칭될 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 설포닐 에스테르의 제조를 나타낸다. 상응하는 토실레이트 및 할라이드는 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
mPEG-OH + CH3SO2Cl + N(Et)3 → mPEG-O-SO2CH3 → mPEG-N3
150 mL의 톨루엔 중의 mPEG-OH(MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 2시간 동안 질소하에서 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 건조 CH2Cl2 및 2.1 mL의 건조 트리에틸아민(15 mmol)을 용액에 첨가하였다. 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시키고, 1.2 mL의 증류된 메탄설포닐 클로라이드(15 mmol를 적가하였다. 이 용액을 실온에서 질소하에서 밤새도록 교반하고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응을 퀀칭시켰다. 혼합물을 진공하에서 증발시켜 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공하에서 다시 농축시킨 다음, 100 mL의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여액을 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 수득하였다.
메실레이트(20 g, 8 mmol)를 75 mL의 THF 중에 용해시키고, 용액을 4℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 나트륨 아지드(1.56 g, 24 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소하에서 2시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔여물을 CH2Cl2(50 mL)로 희석시켰다. 유기 분획물을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ml로 감소시키고, 150 mL의 냉각 건조 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.
실시예 26
Figure pct00053
4-아지도벤질 알코올을 미국 특허 5,998,595에 기재되어 있는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃℃에서 CH2Cl2 중의 4-아지도벤질 알코올(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓았다. 통상적으로 후처리하여 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 상기 오일(9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 수득하였다.
mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF (35 mL) 중의 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브로마이드(3.32 g, 15 mmol)를 촉매량의 KI와 함께 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 12시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 침전물을 수득하고, 이를 수집하여 mPEG-O-CH2-C6H4-N3을 수득하였다.
실시예 27
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H + N3-CH2CH2CO2-NHS → N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC03(10 mL)의 포화 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-하이드록시숙신이미도 프로피오네이트(5 당량)를 왕성하게 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, 20 mL의 H2O를 첨가하고, 혼합물을 추가의 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5 N H2SO4를 pH를 사용하여 pH 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100 mLx3)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉 디에틸 에테르로 침전시킨 후, 여과하여 생성물을 수집하고, 이를 진공하에서 건조시켜 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 수득하였다.
실시예 28
mPEG-OMs + HC≡CLi → mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
당업계에 공지된 바와 같이 제조되고, THF 중에서 -78℃로 냉각된 리튬 아세틸리드(4 당량) 용액에 THF 중에 용해된 mPEG-OM의 용액을 왕성하게 교반하면서 적가한다. 3시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가하여 퀀칭시켰다. 이어서, 20 mL의 H2O를 첨가하고, 혼합물을 추가의 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5 N H2SO4를 사용하여 pH를 pH 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100 mLx3)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉 디에틸 에테르로 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에서 건조시켜 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 수득하였다.
실시예 29
문헌 ([L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500], [J. W. Chin et al., Science 301:964-7(2003)], [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027]; [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11:1135-1137]; [J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024]: 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10])에 기재된 방법을 사용하여 아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산을 단백질 내로 부위 선택적으로 도입할 수 있다. 일단 아미노산이 도입되고 나면, 37℃에서 4시간 동안 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO4, 및 ~1 mg Cu 선의 존재하에 포스페이트 완충처리된 용액(PB)(pH 8) 중 0.01 mM 단백질을 사용하여 사이클로첨가 반응을 수행한다.
실시예 30
노르모시타에믹 마우스 분석시험에 의해 측정된 PEG화된 fEPO 의 시험관내 및 생체내 활성
PEG-fEPO, 비변형된 fEPO 및 완충 용액을 마우스에 투여하였다. 본 결과는, 마우스당 동일한 투여량을 사용하였을 때 비변형된 fEPO와 비교해 보면, 망상적혈구의 양이 유의적으로 증가하였고, 망상적혈구 계수 최대치가 변화한 것으로 나타난 바, 본 발명의 PEG화된 fEPO가 우수한 활성을 갖고 연장된 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
노르모시타에믹 마우스 분석법은 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]). 샘플을 BSA-PBS로 희석시켰다. 7-15주령된 정상적인 건강한 마우스에 0.2 ml의, 본 발명의 PEG화된 fEPO를 s.c.로 투여하였다. 투여 후 72시간이 경과하였을 때를 시작으로 하여 4일간의 기간에 걸쳐 꼬리 정맥 천자를 통해 채혈하고, 1 ml의 0.15 μmol 아크리딘 오렌지 염색 용액 중에 1 ㎕의 혈액이 존재하도록 희석시켰다. 출발 시점은 3 내지 10분이었다. (분석 혈액 세포 30,000개당) 적색 형광 히스토그램의 분석에 의해 유세포 분석기에서 미세형광측정법을 이용함으로써 망상적혈구 계수를 수행하였다. 각 조사군은 1일당 5마리씩인 것으로 구성되었고, 오직 1회씩만 마우스를 출혈시켰다.
생물학적 분석법 추가로, 생체활성을 Ba/F3-fEPOR 세포 증식에 의해 측정하는 세포 증식 분석법 및 fEPO 수용체 결합 분석법을 사용하여 시험관내 생물학적 활성에 관해 본 발명의 fEPO 폴리펩티드를 평가하였다. 각 분석법에 대한 프로토콜은 문헌 ([Wrighton et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1261-1265], 및 미국 특허 번호 제5,773,569호 및 제5,830,851호)에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 제조된 fEPO 폴리펩티드에 대한 EC50 값은 재조합 에리트로포이에틴으로 수득된 최대 활성의 50%을 얻는 데 필요한 화합물의 농도이다.
실시예 31
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO의 안전성 및/또는 효능에 관한 임상 시험
목적 피하 투여된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 재조합 고양이 EPO의 안정성 및 약동학적 성질과 상업적으로 이용가능한 hEPO 제품 프로크릿트(PROCRIT) 또는 아라네스프(ARANESP)의 것을 비교하기 위함 것이다.
환자 유사한 프로파일(연령 및 체중)을 갖는 18마리의 건강한 고양이를 이 연구에 등록시켰다. 이 피험체들은 혈액 검사 또는 혈청 화학 검사, 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험값을 나타내지 않을 것이다. 이들은 다음 중 어느 하나에도 해당되지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 원발성 혈액 질환의 병력; 중증 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식기, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 세균 또는 포유동물 유래 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 알려진 감수성; 카페인 함유 음료의 상습적인 다량 소비자; 연구 시작 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 혈액을 수혈받았거나 수혈한 적이 있는 자; 연구 시작 전 3개월 이내에 hEPO 또는 fEPO에 노출된 자; 연구 시작 전 7일 이내에 질환을 앓은 적이 있는 자; 및 연구 시작 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가에서 유의한 이상을 나타낸 자. 모든 피험체에 대해 안전성 평가를 수행하고, 계획대로 약동학적 분석을 위한 모든 채혈을 실시한다. 모든 연구는 윤리 위원회의 승인과 환자의 동의하에 수행된다.
연구 디자인 이 연구는 건강한 수컷 지원자들을 대상으로 한 I 기, 단일 센터, 공개의, 무작위화된 두 기간의 교차연구로 이루어진다. 18마리의 피험체를 2개의 치료 순서 군 중 하나(군당 9마리의 피험체)에 무작위로 배정하였다. 독립된 두 투여 기간에 걸쳐, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO 및 선택한 상업적으로 이용가능한 제품을 동량 사용하여 상대퇴부에 볼루스 피하 주사로서 EPO를 투여하였다. 상업적으로 이용가능한 제품의 투여량 및 투여 빈도는 포장 라벨에 지시된 것과 같았다. 추가 군의 피험체를 포함시킴으로써, 상업적으로 이용가능한 제품을 사용하여, 추가 투여, 투여 빈도, 또는 원하는 경우, 다른 파라미터를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간 사이에 인간 시험 버전에 기초한 기간(예로서, 14일간의 세척 기간)을 두었다. 피험체들은 두 투여 기간 각각에 대해 적어도 투여 12시간 전 및 투여 72시간 후에만 연구 센터에 있었고 투여 기간 사이에는 그렇지 않았다. 또한 PEG화된 fEPO에 대해 테스트할 추가 투여, 투여 빈도 또는 다른 파라미터가 존재할 경우, 추가 군의 피험체를 연구에 포함시킬 수 있다. 본 연구에서는 사용 허가를 받은 다중의 EPO 제제를 사용할 수 있다. 프로크릿트®로 시판되고 있는 에포에틴 알파 및/또는 아라네스프®로 시판되고 있는 다르베포이에틴은 또한 동물에서도 치료학적으로 사용되어 온 상업적으로 이용가능한 EPO 제품이다. fEPO의 실험 제제는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO이다.
혈액 샘플링 EPO의 투여 전과 투여 후에 직접 정맥 천자를 통해 연속적으로 채혈하였다. 혈청 에리트로포이에틴 농도 측정을 위해 정맥혈 샘플(5 mL)을 투여 약 30분전, 20분전 및 10분전에 입수하고(3개의 기준선 샘플), 투여 후 대략 30분, 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간째에 입수하였다. 각각의 혈청 샘플을 2개의 분액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20℃에 저장하였다. 혈청 샘플은 드라이아이스에 넣어 이송하였다. 금식 임상 실험실 테스트(혈액 검사, 혈청 화학 검사 및 뇨 검사)는 첫째날에 최초 투여 직전, 4일째 아침, 16일째 투여 직전, 및 19일째 아침에 수행하였다.
생체분석 방법 혈청 에리트로포이에틴 농도를 측정하는 데 방사성면역측정법(RIA) 키트 방법(텍사스주 웹스터 소재의 Diagnostic Systems Laboratory [DSL])을 사용하였다. 상업적으로 이용가능한 RIA는 1차 항체로서는 뇨 에리트로포이에틴에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청을 사용하고, 표지자로서 125I-표지된 뇨 에리트로포이에틴을 사용하는 이중 항체에 의한 경쟁적 방법이다. 표준 및 정질 대조군 샘플 중에서 DLS 키트에서 제공되는 뇨 에리트로포이에틴을 대신하여 에포에틴 알파 또는 다르베포이에틴으로 치환하였다. 본 분석법에서 사용된 표준 농도는 7.8, 15.6, 31.3, 50, 62.5,1 00, 및 125 mlU/mL였다. 최하의 표준값을 제공하는 허용 정밀도에 대한 백피트(back-fit) 평균값으로서 정의되는 감도는 8.6 mIU/mL였고, 정질 대조군 희석을 통해 분석 범위는 2,000 mIU/mL였다.
안전성 측정 매회 투여 직전(첫째날 및 16일째)과, 매회 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간째 바이탈 사인을 기록하였다. 안전성 측정은 유해 사건의 발생률 및 유형과 임상 실험실 테스트에 있어서 기준선으로부터의 변화에 기초한다. 또한, 혈압을 비롯한 바이탈 사인 측정 및 신체 검사 결과에 있어서 연구 전으로부터의 변화를 평가하였다.
데이터 분석 투여 후 혈청 농도값은, 투여 후의 각각의 값으로부터, 투여 30분전, 20분전, 및 10분전에 수집된 3개 샘플의 에리트로포이에틴 수준의 평균값을 구하여 결정된 평균 기준선 에리트로포이에틴 농도를 감산함으로써, 투여 전 기준선 에리트로포이에틴 농도에 대해 보정하였다. 투여 전 혈청 에리트로포이에틴 농도가 분석의 정량 수준 미만인 경우, 이 농도는 평균값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 파라미터는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 디지탈 이큅먼트 코퍼레이션(Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템에서 모델 독립적 방법에 의해 계산하였다. 하기 약동학적 파라미터를 결정하였다: 피크 혈청 농도(Cmax); 피크 혈청 농도까지 걸리는 시간(tmax); 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산한 0시간 내지 마지막 혈액 샘플링 시간(AUC0 -72)의 농도-시간 곡선하 면적(AUC); 및 제거율 상수로부터 계산된 최종 제거 반감기(t½). 제거율 상수는 로그 선형 농도 시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속적인 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 파라미터의 평균, 표준 편차(SD: 표준 deviation) 및 변동 계수(CV: coefficient of variation)를 계산하였다. 파라미터 평균의 비(보존된 제제/비보존된 제제)를 계산하였다.
안전성 결과 유해 사건 발생률은 처리군 전반에 동일하게 분포하였다. 기준선 또는 연구 전 임상 실험실 테스트 또는 혈압으로부터 임상적으로 유의한 변화는 없었고, 연구 전 신체 검사 결과 및 바이탈 사인 측정에 있어서도 연구 전으로부터 뚜렷한 변화가 없었다. 두 처리군에 대한 안전성 프로필은 유사한 것으로 보인다.
약동학적 결과 1회분의 상업적으로 이용가능한 hEPO(프로크릿트® 또는 아라네스프®)을 투여받은 후 18마리의 피험체 모두에서 평균 혈청 에리트로포이에틴 농도 시간 프로필(기준선 에리트로포이에틴 수준에 대해 보정되지 않은 프로파일)을 이용가능한 PEG화된 fEPO 및/또는 연구용 또는 시판용 fEPO와 비교하였다. 비교를 위해 사용된 PEG화된 fEPO가 각각의 시점에서 측정된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는, 본 발명의 것이다. 모든 피험체들은 정상적인 생리학적 범위 내의 투여 전 기준선 에리트로포이에틴 농도를 나타내야 한다. 약동학적 파라미터는 투여 전 평균 기준선 에리트로포이에틴 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정되고, Cmax 및 tmax가 결정된다. hEPO(프로크릿트®)에 대한 평균 tmax는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hEPO에 대한 tmax보다 유의적으로 더 짧았다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO에 대한 최종 반감기와 비교할 때, hEPO(프로크릿트®)에 대한 최종 반감기가 유의적으로 더 짧았다.
본 연구는 건강한 피험체를 대상으로 수행되었지만, 다른 환자 집단, 예를 들면, 암 또는 만성 신부전증을 앓고 있는 환자, 손상 유도성 빈혈을 앓는 손상 후의 환자, 소아 신부전증 환자, 자가조직 예치(autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 선택 수술이 예정된 환자에 있어서도 유사한 흡수 특징 및 안전성 프로필이 예상된다.
결론적으로, 피하 투여되는 1회분의, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO는 건강한 피험체에게 안전하고, 상기 피험자들에 의해 잘 용인된다. 유해 사건의 상대 발생률, 임상 실험실 값, 바이탈 사인 및 신체 검사 결과에 기초할 때, 연구용/시판용 EPO, hEPO(프로크릿트®) 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO의 안전성 프로필은 동등할 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 fEPO는 환자와 건강 관리 제공자에게 잠재적으로 큰 임상적 유용성을 제공한다.
실시예 32
PEG화된 fEPO 변이체의 생체내 활성
PEG가 단백질 활성의 지속 시간에 미치는 효과는 적어도 부분적으로는 PEG의 크기 및 구조(선형 대 분지형)에 의존한다. PEG 크기가 상이한 fEPO 변이체가 헤마토크리트(Hct)를 증가시킬 수 있는 비교에 의한 상대적인 능력을 건강한 고양이에서 평가하였다.
위치 A1에서의 p-아미노페닐알라닌(pAF:p-aminophenylalanine) 치환을 포함하는 재조합 fEPO 변이체를 차이니즈 햄스터 난소 세포 발현 시스템에서 발현시켰다. 단백질을 비천연 아미노산 치환 부위에서 20 kD, 30 kD or 40 kD 옥시아미노 PEG로 PEG화시켰다. 20 mM NaPO4, 140 mM NaCl, 0.005% 폴리소르베이트 80(pH 6.2)으로 구성된 제조 완충액 중에서 PEG화된 fEPO 변이체를 제조하였다.
체중이 대략 3-6 kg인 24마리의 건강한 고양이(수커 12마리/암컷 12마리)를 클래스 A(Class A) 공급업체로부터 구입하고, 연구 시설, 그의 섭식 및 남편으로 알맞은 방법에 순응시켰다. 연구에 등록하기 전 -14일째 및 -7일째 기준 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플 수집 당시 받은 스트레스를 감소시키기 위해 아세프로마진 및 이소플루린을 사용하여 고양이를 진정시켰다. 질환에 대한 임상적 징후가 없고, 건강한 고양이에 대한 정상적인 기준 범위내에 포함된 Hct 값을 갖는 동물을 연구에 등록시키기 위해 선별하였다.
처리군들 간에는 기준 헤마토크리트를 동등하게 하는 무작위화 차단 디자인을 사용함으로써 고양이를 3개의 처리군 중 하나로 배정하였다.
Figure pct00054
처리 전 0일째 동물을 출혈시키고, 체중을 측정하였다. 동물을 그의 배정받은 처리군에 따라 1회 피하 주사하여 처리하였다.
처리 후 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31, 35, 38 및 42일째에 추가의 혈액 샘플을 수집하였다. 각 샘플에 대하여 헤마토크리트를 측정하였다. 1일 음식it물 섭취량 또한 측정하고, 임의의 건강상의 문제들에 대해서 동물을 매일 관찰하였다.
각종 처리가 헤마토크리트 및 RBC에 미치는 효과에 대해서 도 36에 제시하였다.
20 kD 또는 30 kD PEG화된 fEPO 변이체를 사용하였을 때 투여후 3일 이내에 Hct 값이 완충액 대조군에 비하여 유의적으로 증가한 것이 관찰되었다. 40 kD PEG 변이체로 처리된 동물에서는 처리 후 대략 10일까지 완충액 대조군에 비하여 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 20 kD PEG 변이체로 처리된 동물의 경우에는 10일째, 30 kD PEG 변이체의 경우에는 14일째, 및 40 kD PEG 변이체의 경우에는 17일째에 최대 Hct 값이 관찰되었다. 20 또는 30 kD PEG 변이체로 처리된 동물에서의 헤마토크리트는 투여후 적어도 28일간에 걸쳐 완충액 대조군보다 유의적으로 더 큰 값을 나타내었다. 이러한 결과는 증가된 Hct 수준이 지속적으로 유지될 수 있도록 하는 데는 1개월당 1회로 PEG fEPO를 투여하는 것이 적당하다는 것을 제안한다. 연구 기간 동안 어떤 부작용도 관찰되지 않았다.
실시예 33
빈혈을 앓는 고양이에서 PEG화된 fEPO 변이체의 효능
III 단계 또는 IV 단계의 만성 신장 질환(CKD: chronic kidney disease)을 고양이에서 빈혈을 앓는 고양이에서의 정상적인 적혈구(RBC) 개수로 회복시킬 수 있는 PEG화된 fEPO 변이체의 능력에 대해 평가할 수 있다. 이러한 병증을 앓는 고양이는 내인성 fEPO의 1차 공급원인 실질 신장 세포의 손실을 인해 중간 정도 내지 중증의 재생불량성 빈혈을 나타낸다.
CKD 및 빈혈을 앓는 고양이에서 적혈구 개수를 증가시킬 수 있는 PEG화된 fEPO의 능력에 대해 평가하기 위해, 체중이 대략 3-6 kg이고, CKD의 병력을 가지고 있으며, 헤마토크리트가 <30%인 12마리의 고양이(수컷 6마리 및 암컷 6마리)를 연구 시설, 그의 섭식 및 남편으로 알맞은 방법에 순응시켰다. 연구에 등록하기 전 -14일째 및 -7일째 수집한 혈액 샘플로부터 얻은 헤마토크리트 및 RBC 계수를 각 동물에 대한 기준 대조군으로서 사용하였다.
처리군들 간에는 기준 헤마토크리트 및 RBC를 동등하게 하는 무작위화 차단 디자인을 사용함으로써 고양이를 3개의 처리군 중 하나로 배정하였다. 각 처리군은 4마리의 동물(수컷 2마리/암컷 2마리)을 포함하였다. 2-8 □g/kg 범위의 투여량으로 PEG화된 fEPO를 피하 주사를 통해 1회 투여하였다.
처리 후 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28 및 31일째에 추가의 혈액 샘플을 수집하였다. 각 샘플에 대하여 헤마토크리트 및 RBC 계수를 측정하였다. 1일 음식물 섭취량 또한 측정하고, 삶의 질도 평가하기 위해 우울증 및/또는 무기력 상태의 임상적 징후에 대해서 매일 관찰하고 점수화하였다.
단백질 투여 이전에 수득한 기준선 값과 처리 후의 헤마토크리트 및 RBC 계수를 비교하여 효능을 측정하였다. 1일 헤마토크리트 및 RBC 계수의 평균값이 기준선 값과 비교하여 통계학상 유의적으로 증가한 것으로 나타났거나, 또는 처리 후 기간 동안 임의의 어느 시점에서 1일 평균값이 정상적인 기준 범위값 내의 값으로 증가한 것으로 나타났다면, 본 단백질은 효능이 있는 것으로 간주하였다.
본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그러한 관점에서 각종의 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 수 있으며, 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되어야 한다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 인용하는 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Tian, Feng Hays Putnam, Anna-Maria A. Song, Frank Chu, Stephanie Sheffer, Joseph Barnett, Richard S. Siladi, Marc Atkinson, Kyle Lee, Darin <120> Modified Animal Erythropoietin Polypeptides and Their Uses <130> AMBX-0156.00PCT <150> 61/100,679 <151> 2008-09-26 <150> 61/100,692 <151> 2008-09-26 <160> 34 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 192 <212> PRT <213> Felis catus <400> 1 Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Felis catus <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg 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synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for cloning full length hEPO cDNA <400> 21 cagttacata tgggagttca cgaatgtcct gcctgg 36 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for cloning mature hEPO cDNA <400> 22 cagttacata tgctccacca agattaatct gtg 33 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3'Primer for cloning full length and mature hEPO cDNA <400> 23 ctgcaactcg agtcatctgt cccctgtcct gcag 34 <210> 24 <211> 582 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of full length hEPO cDNA <400> 24 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582 <210> 25 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of mature hEPO cDNA <400> 25 gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60 gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120 gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180 gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240 ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300 ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgcgag cccagaagga agccatctcc 360 cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420 ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480 tgcaggacag gggacagatg a 501 <210> 26 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of G113R hEPO cDNA <400> 26 gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60 gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120 gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180 gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240 ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300 ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga agccatctcc 360 cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420 ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480 tgcaggacag gggacagatg a 501 <210> 27 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Optimized for expression of mature hEPO cDNA in E. coli <400> 27 atgctccacc aagattaatc tgtgacagcc gagtcctgga gaggtacctc ttggaggcca 60 aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg cagcttgaat gagaatatca 120 ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag gatggaggtc gggcagcagg 180 ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc tgtcctgcgg ggccaggccc 240 tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct gcatgtggat aaagccgtca 300 gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg agcccagaag gaagccatct 360 cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat cactgctgac actttccgca 420 aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct gaagctgtac acaggggagg 480 cctgcaggac aggggacaga tga 503 <210> 28 <211> 12006 <212> DNA <213> Felis catus <400> 28 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcc cgtccgcgta ccggcgcgcc ggatgccaat cgatgaattc cggtgtgaaa 240 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 300 gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 360 ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 420 gtaaaacgac ggccagtgaa ttgatgcatc catcaattca tatttgcatg tcgctatgtg 480 ttctgggaaa tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt 540 atgagaccac tcggatccgg tggggtagcg aagtggctaa acgcggcgga ctctaaatcc 600 gctccctttg ggttcggcgg ttcgaatccg tcccccacca ttttttggaa cctagggaat 660 tccggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 720 cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 780 agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 840 agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgatgca tccatcaatt catatttgca 900 tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct 960 tataagttct gtatgagacc actcggatcc ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg 1020 gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc ggttcgaatc cgtcccccac cattttttgg 1080 aagacgtcga attccggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 1140 ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 1200 cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 1260 cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgatg catccatcaa 1320 ttcatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 1380 atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactcggat ccggtggggt agcgaagtgg 1440 ctaaacgcgg cggactctaa atccgctccc tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc 1500 accatttttt ggaacatatg gaattccggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 1560 aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 1620 tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 1680 gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattga 1740 tgcatccatc aattcatatt tgcatgtcgc tatgtgttct gggaaatcac cataaacgtg 1800 aaatgtcttt ggatttggga atcttataag ttctgtatga gaccactcgg atccggtggg 1860 gtagcgaagt ggctaaacgc ggcggactct aaatccgctc cctttgggtt cggcggttcg 1920 aatccgtccc ccaccatttt ttggaactta attaaggcgc gccggatgcc aatcggccat 1980 caccatccaa cgggaaggcg atgaattccg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 2040 aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 2100 ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 2160 aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 2220 gatgcatcca tcaattcata tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg 2280 tgaaatgtct ttggatttgg gaatcttata agttctgtat gagaccactc ggatccggtg 2340 gggtagcgaa gtggctaaac gcggcggact ctaaatccgc tccctttggg ttcggcggtt 2400 cgaatccgtc ccccaccatt ttttggaacc tagggaattc cggtgtgaaa taccgcacag 2460 atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 2520 ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 2580 tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 2640 ggccagtgaa ttgatgcatc catcaattca tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa 2700 tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac 2760 tcggatccgg tggggtagcg aagtggctaa acgcggcgga ctctaaatcc gctccctttg 2820 ggttcggcgg ttcgaatccg tcccccacca ttttttggaa gacgtcgaat tccggtgtga 2880 aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 2940 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 3000 agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 3060 ttgtaaaacg acggccagtg aattgatgca tccatcaatt catatttgca tgtcgctatg 3120 tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 3180 gtatgagacc actcggatcc ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactctaaat 3240 ccgctccctt tgggttcggc ggttcgaatc cgtcccccac cattttttgg aacatatgga 3300 attccggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc 3360 gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg 3420 ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 3480 ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgatg catccatcaa ttcatatttg 3540 catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg atttgggaat 3600 cttataagtt ctgtatgaga ccactcggat ccggtggggt agcgaagtgg ctaaacgcgg 3660 cggactctaa atccgctccc tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc accatttttt 3720 ggaacttaat taagtacggg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag 3780 aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag 3840 aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg 3900 ttgctgacta attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact 3960 ttccacacct ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg cccgcggagt 4020 tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 4080 acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 4140 tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 4200 gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 4260 acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 4320 accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 4380 gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 4440 ccaagcctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 4500 tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 4560 tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag aacccactgc ttactggctt 4620 atcgaaatta ctagtccacc atggggtcgt gcgaatgtcc tgccctgctg cttctgctat 4680 ctttgctgct gcttcccctg ggcctcccag tcctgggcgc cccccctcgc ctcatctgtg 4740 acagccgagt cctggagagg tacattctgg aggccaggga ggccgaaaat gtgaccatgg 4800 gctgcgctga aggctgcagc ttcagtgaga atatcaccgt tccggacacc aaggtcaact 4860 tctatacctg gaagaggatg gacgtcgggc agcaggctgt ggaagtctgg cagggcctcg 4920 ccctcctcag cgaagccatc ctgcggggcc aggccctgct ggccaactcc tcccagccct 4980 ctgagaccct gcagctgcat gtcgacaagg ccgtcagcag cctgcgcagc ctcacctccc 5040 tgctgcgcgc actgggagcc cagaaggaag ccacctccct tcccgaggca acctctgccg 5100 cccccttaag aaccttcact gtggacactt tgtgcaagct tttccgaatc tactccaact 5160 tcctgcgggg caagctgacg ctgtacacag gggaggcctg ccgaagagga gacaggtgag 5220 cggccgcatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 5280 ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 5340 aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 5400 acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 5460 tggcttctga ggcggaaaga accagtgtac agctttgctt ctcaatttct tatttgcata 5520 atgagaaaaa aaggaaaatt aattttaaca ccaattcagt agttgattga gcaaatgcgt 5580 tgccaaaaag gatgctttag agacagtgtt ctctgcacag ataaggacaa acattattca 5640 gagggagtac ccagagctga gactcctaag ccagtgagtg gcacagcatc cagggagaaa 5700 tatgcttgtc atcaccgaag cctgattccg tagagccaca ccctggtaag ggccaatctg 5760 ctcacacagg atagagaggg caggagccag ggcagagcat ataaggtgag gtaggatcag 5820 ttgctcctca catttgcttc tgacatagtt gtgttgggag cttggatagc ttgggggggg 5880 gacagctcag ggctgcgatt tcgcgccaac ttgacggcaa tcctagcgtg aaggctggta 5940 ggattttatc cctcgagcca ccatggcctc cagcaacctg atcaagcagc tccaggagag 6000 gggcctcgtg gctcaggtca ccgacgaaga agcactcgct gaaagactgg cccagggacc 6060 cattgcactg atctgcgggt tcgatcctac agccgactct ctccacctgg gtcatctcgt 6120 gccactgctg tgtctcaaac ggtttcagca ggctggccac aagcccgtcg cactggtggg 6180 aggtgctact gggctgattg gcgatcctag tttcaaagcc gcagagcgca agctcaatac 6240 cgaggagaca gtgcaggaat gggtcgacaa aatccgaaag caggtcgccc catttctgga 6300 tttcgactgc ggagagaact cagctattgc cgcaaataac tacgattggt ttgggaatat 6360 gaacgtcctc actttcctgc gtgacatcgg taaacatttt tccgtgaatc agatgattaa 6420 caaggaagct gtgaagcaga ggctgaatag agagggccag ggaatcagct tcaccgaatt 6480 ttcttataat ctcctgcagg ggtacggtat ggcctgtgca aacaaacagt atggcgtcgt 6540 gctgcagatt ggaggcagtg atcagtgggg gaacatcaca tcaggtattg acctcactcg 6600 gcgcctgcac cagaatcagg tctttggact caccgtgccc ctgatcacaa aggctgatgg 6660 cacaaaattt ggtaagaccg agggtggagc cgtgtggctg gaccctaaaa agacatcccc 6720 atacaaattc tatcagtttt ggatcaacac tgcagatgct gacgtctacc gattcctcaa 6780 gtttttcacc tttatgagca ttgaggaaat caatgccctg gaggaagagg ataagaactc 6840 tggcaaagct ccccgtgcac agtatgtgct cgccgaacag gtcacaaggc tggtgcatgg 6900 ggaggaaggt ctgcaggctg ccaagagaat tactgagtgc ctcttcagtg gctcactgtc 6960 cgcactgagc gaagctgact ttgagcagct cgcccaggat ggagtgccta tggtcgagat 7020 ggaaaaaggc gcagacctga tgcaggctct cgtggattct gagctgcagc caagtcgggg 7080 gcaggcccgc aagaccatcg catcaaatgc tattacaatc aacggtgaaa aacagtccga 7140 ccccgagtac ttctttaagg aagaggatcg actgttcgga cgttttaccc tcctgaggag 7200 aggcaaaaag aattattgtc tgatttgctg gaagtgatct agaggccgcg cagttaacgc 7260 cgcccctctc cctccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 7320 gtgcgtttgt ctatatgtta tattccacca tattgccgtc tattggcaat gtgagggccc 7380 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 7440 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 7500 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 7560 tctgcggcca aaagccacgt gtataaaata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcg 7620 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 7680 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 7740 acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 7800 gggacgtggt attcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacacccgt ccgagatcac 7860 cctcgagcca ccatggttcg accattgaac tgcatcgtcg ccgtgtccca aaatatgggg 7920 attggcaaga acggagacct accctggcct ccgctcagga acgagttcaa gtacttccaa 7980 agaatgacca caacctcttc agtggaaggt aaacagaatc tggtgattat gggtaggaaa 8040 acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg acagaattaa tatagttctc 8100 agtagagaac tcaaagaacc accacgagga gctcattttc ttgccaaaag tttggatgat 8160 gccttaagac ttattgaaca accggaattg gcaagtaaag tagacatggt ttggatagtc 8220 ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg aatcaaccag gccacctcag actctttgtg 8280 acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac acgtttttcc cagaaattga tttggggaaa 8340 tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc ctctctgagg tccaggagga aaaaggcatc 8400 aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa gactaatcta gaggccgcgc acttaacgcc 8460 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 8520 gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 8580 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 8640 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 8700 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 8760 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 8820 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 8880 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 8940 acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 9000 gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaagatc tatgcttgaa 9060 caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 9120 tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 9180 cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag 9240 gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 9300 gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 9360 tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 9420 catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 9480 gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 9540 gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat 9600 ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 9660 tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 9720 gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 9780 tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 9840 ttctgacaat tgcacgggct acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 9900 ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg 9960 ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 10020 aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 10080 tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc ggttaccccc gtccgacatg tgagcaaaag 10140 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 10200 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 10260 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 10320 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 10380 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 10440 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 10500 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 10560 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 10620 ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 10680 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 10740 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 10800 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 10860 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 10920 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 10980 cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 11040 tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 11100 cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 11160 ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 11220 gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 11280 gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 11340 gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 11400 gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 11460 tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 11520 aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 11580 cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 11640 caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 11700 cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 11760 ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 11820 aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 11880 tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 11940 tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 12000 ttcgtc 12006 <210> 29 <211> 8834 <212> DNA <213> Felis catus <400> 29 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcc cgtccgcgta ccggcgcgcc ggatgccaat cgatgaattc cggtgtgaaa 240 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 300 gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 360 ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 420 gtaaaacgac ggccagtgaa ttgatgcatc catcaattca tatttgcatg tcgctatgtg 480 ttctgggaaa tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt 540 atgagaccac tcggatccgg tggggtagcg aagtggctaa acgcggcgga ctctaaatcc 600 gctccctttg ggttcggcgg ttcgaatccg tcccccacca ttttttggaa cctagggaat 660 tccggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 720 cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 780 agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 840 agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgatgca tccatcaatt catatttgca 900 tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct 960 tataagttct gtatgagacc actcggatcc ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg 1020 gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc ggttcgaatc cgtcccccac cattttttgg 1080 aagacgtcga attccggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 1140 ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 1200 cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 1260 cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgatg catccatcaa 1320 ttcatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 1380 atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactcggat ccggtggggt agcgaagtgg 1440 ctaaacgcgg cggactctaa atccgctccc tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc 1500 accatttttt ggaacatatg gaattccggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 1560 aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 1620 tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 1680 gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattga 1740 tgcatccatc aattcatatt tgcatgtcgc tatgtgttct gggaaatcac cataaacgtg 1800 aaatgtcttt ggatttggga atcttataag ttctgtatga gaccactcgg atccggtggg 1860 gtagcgaagt ggctaaacgc ggcggactct aaatccgctc cctttgggtt cggcggttcg 1920 aatccgtccc ccaccatttt ttggaactta attaagtacg ggcctccaaa aaagcctcct 1980 cactacttct ggaatagctc agaggcagag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa 2040 attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc 2100 ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg 2160 cctgctgggg agcctgggga ctttccacac ctggttgctg actaattgag atgcatgctt 2220 tgcatacttc tgcccgcgga gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2280 cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2340 caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2400 gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2460 tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2520 ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 2580 attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 2640 gcggtttgac tcacggggat ttccaagcct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 2700 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 2760 aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag 2820 agaacccact gcttactggc ttatcgaaat tactagtcca ccatggggtc gtgcgaatgt 2880 cctgccctgc tgcttctgct atctttgctg ctgcttcccc tgggcctccc agtcctgggc 2940 gccccccctc gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacattct ggaggccagg 3000 gaggccgaaa atgtgaccat gggctgcgct gaaggctgca gcttcagtga gaatatcacc 3060 gttccggaca ccaaggtcaa cttctatacc tggaagagga tggacgtcgg gcagcaggct 3120 gtggaagtct ggcagggcct cgccctcctc agcgaagcca tcctgcgggg ccaggccctg 3180 ctggccaact cctcccagcc ctctgagacc ctgcagctgc atgtcgacaa ggccgtcagc 3240 agcctgcgca gcctcacctc cctgctgcgc gcactgggag cccagaagga agccacctcc 3300 cttcccgagg caacctctgc cgccccctta agaaccttca ctgtggacac tttgtgcaag 3360 cttttccgaa tctactccaa cttcctgcgg ggcaagctga cgctgtacac aggggaggcc 3420 tgccgaagag gagacaggtg agcggccgca tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 3480 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 3540 gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 3600 ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 3660 gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagtgt acagctttgc 3720 ttctcaattt cttatttgca taatgagaaa aaaaggaaaa ttaattttaa caccaattca 3780 gtagttgatt gagcaaatgc gttgccaaaa aggatgcttt agagacagtg ttctctgcac 3840 agataaggac aaacattatt cagagggagt acccagagct gagactccta agccagtgag 3900 tggcacagca tccagggaga aatatgcttg tcatcaccga agcctgattc cgtagagcca 3960 caccctggta agggccaatc tgctcacaca ggatagagag ggcaggagcc agggcagagc 4020 atataaggtg aggtaggatc agttgctcct cacatttgct tctgacatag ttgtgttggg 4080 agcttggata gcttgggggg gggacagctc agggctgcga tttcgcgcca acttgacggc 4140 aatcctagcg tgaaggctgg taggatttta tccctcgagc caccatggcc tccagcaacc 4200 tgatcaagca gctccaggag aggggcctcg tggctcaggt caccgacgaa gaagcactcg 4260 ctgaaagact ggcccaggga cccattgcac tgatctgcgg gttcgatcct acagccgact 4320 ctctccacct gggtcatctc gtgccactgc tgtgtctcaa acggtttcag caggctggcc 4380 acaagcccgt cgcactggtg ggaggtgcta ctgggctgat tggcgatcct agtttcaaag 4440 ccgcagagcg caagctcaat accgaggaga cagtgcagga atgggtcgac aaaatccgaa 4500 agcaggtcgc cccatttctg gatttcgact gcggagagaa ctcagctatt gccgcaaata 4560 actacgattg gtttgggaat atgaacgtcc tcactttcct gcgtgacatc ggtaaacatt 4620 tttccgtgaa tcagatgatt aacaaggaag ctgtgaagca gaggctgaat agagagggcc 4680 agggaatcag cttcaccgaa ttttcttata atctcctgca ggggtacggt atggcctgtg 4740 caaacaaaca gtatggcgtc gtgctgcaga ttggaggcag tgatcagtgg gggaacatca 4800 catcaggtat tgacctcact cggcgcctgc accagaatca ggtctttgga ctcaccgtgc 4860 ccctgatcac aaaggctgat ggcacaaaat ttggtaagac cgagggtgga gccgtgtggc 4920 tggaccctaa aaagacatcc ccatacaaat tctatcagtt ttggatcaac actgcagatg 4980 ctgacgtcta ccgattcctc aagtttttca cctttatgag cattgaggaa atcaatgccc 5040 tggaggaaga ggataagaac tctggcaaag ctccccgtgc acagtatgtg ctcgccgaac 5100 aggtcacaag gctggtgcat ggggaggaag gtctgcaggc tgccaagaga attactgagt 5160 gcctcttcag tggctcactg tccgcactga gcgaagctga ctttgagcag ctcgcccagg 5220 atggagtgcc tatggtcgag atggaaaaag gcgcagacct gatgcaggct ctcgtggatt 5280 ctgagctgca gccaagtcgg gggcaggccc gcaagaccat cgcatcaaat gctattacaa 5340 tcaacggtga aaaacagtcc gaccccgagt acttctttaa ggaagaggat cgactgttcg 5400 gacgttttac cctcctgagg agaggcaaaa agaattattg tctgatttgc tggaagtgat 5460 ctagaggccg cgcagttaac gccgcccctc tccctccccc cccctaacgt tactggccga 5520 agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tatattccac catattgccg 5580 tctattggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg 5640 ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt 5700 cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac 5760 cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaaa tacacctgca 5820 aaggcggcac aaccccagtg cgacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg 5880 ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg 5940 ggatctgatc tggggcctcg gtacacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa 6000 cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gtattccttt gaaaaacacg atgataatat 6060 ggccacaccc gtccgagatc accctcgagc caccatggtt cgaccattga actgcatcgt 6120 cgccgtgtcc caaaatatgg ggattggcaa gaacggagac ctaccctggc ctccgctcag 6180 gaacgagttc aagtacttcc aaagaatgac cacaacctct tcagtggaag gtaaacagaa 6240 tctggtgatt atgggtagga aaacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa 6300 ggacagaatt aatatagttc tcagtagaga actcaaagaa ccaccacgag gagctcattt 6360 tcttgccaaa agtttggatg atgccttaag acttattgaa caaccggaat tggcaagtaa 6420 agtagacatg gtttggatag tcggaggcag ttctgtttac caggaagcca tgaatcaacc 6480 aggccacctc agactctttg tgacaaggat catgcaggaa tttgaaagtg acacgttttt 6540 cccagaaatt gatttgggga aatataaact tctcccagaa tacccaggcg tcctctctga 6600 ggtccaggag gaaaaaggca tcaagtataa gtttgaagtc tacgagaaga aagactaatc 6660 tagagccaga tctccaattg cacgggctac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 6720 aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 6780 atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 6840 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 6900 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtcgg ttacccccgt ccgacatgtg 6960 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 7020 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 7080 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 7140 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 7200 gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 7260 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 7320 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 7380 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 7440 cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 7500 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 7560 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 7620 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 7680 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 7740 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 7800 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 7860 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 7920 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 7980 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 8040 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 8100 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 8160 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 8220 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 8280 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 8340 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 8400 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 8460 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 8520 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 8580 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 8640 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 8700 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 8760 acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 8820 gaggcccttt cgtc 8834 <210> 30 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Full-length amino acid sequence of cEPO <400> 30 Met Cys Glu Pro Ala Pro Pro Lys Pro Thr Gln Ser Ala Trp His Ser 1 5 10 15 Phe Pro Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp 35 40 45 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn 50 55 60 Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr 65 70 75 80 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val 85 90 95 Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 100 105 110 Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser 115 120 125 Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser 145 150 155 160 Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp 165 170 175 Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys 180 185 190 Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 195 200 205 <210> 31 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The mature amino acid sequence of cEPO <400> 31 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly 20 25 30 Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Arg Gly Asp Arg 165 <210> 32 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Full-length amino acid sequence of eEPO <400> 32 Met Gly Val Arg Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Gly Glu Asn 50 55 60 Val Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ser Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Glu Val Glu Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Leu Arg Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Ala 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 33 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The mature amino acid sequence of eEPO <400> 33 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Cys Ser Phe Gly Glu Asn Val Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ser Trp Lys Arg Met Glu Val Glu Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Arg Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Phe Ala Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Arg Gly Asp Arg 165 <210> 34 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 34 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77

Claims (77)

  1. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 고양이 에리트로포이에틴(fEPO) 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, fEPO 폴리펩티드가 하나 이상의 추가의 fEPO 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자가 이작용성 중합체인 fEPO 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 이작용성 중합체가 제2 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 비fEPO 폴리펩티드인 fEPO 폴리펩티드.
  8. 제4항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결되어 있는 2 이상의 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수용성 중합체에 연결되어 있는 하나 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산인 fEPO 폴리펩티드.
  10. 제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 1-7, 27-54, 84-89, 114-137, 162-166으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  11. 제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 17, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65, 68, 72, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 107, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 154, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165 및 166으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 2, 4, 17, 21, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 50, 53, 55, 58, 65, 68, 72, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 136 및 162, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  13. 제11항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 21, 24, 28, 30, 31, 36, 37, 38, 55, 72, 83, 85, 86, 87, 89, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 및 162, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  14. 제11항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 21, 24, 38, 83, 85, 86, 89, 116, 119, 121, 124, 125, 126, 127 및 128, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  15. 제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 24, 36, 38, 58, 65, 83, 86, 113, 115, 126, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, fEPO 폴리펩티드가 에리트로포이에틴 수용체에 대한 fEPO 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  17. 제1항에 있어서, fEPO 폴리펩티드가 fEPO 폴리펩티드의 안정성 또는 가용성을 증가시키는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, 서열번호 2에서 S9A, F48S, Y49S, A50S, Q59A, A73G, G101A, T106A, L108A, T132A, R139A, K140A, R143A, S146A, N147A, R150A 및 K154A, 및 그의 조합으로 구성되나, 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  19. 제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해서는 별다른 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타내는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  20. 제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기, 아세틸기, 아미노옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기, 또는 알킨기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 fEPO 폴리펩티드:
    Figure pct00055

    상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
  23. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아미노옥시기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  24. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라지드기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  25. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라진기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  26. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 세미카르바지드기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  27. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 아지드기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 fEPO 폴리펩티드:
    Figure pct00056

    상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
  29. 제20항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 fEPO 폴리펩티드:
    Figure pct00057

    상기 식에서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이며, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
  31. 제4항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa인 fEPO 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분자량이 1 kDa 내지 50 kDa 인 fEPO 폴리펩티드.
  33. 제4항에 있어서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 아미노옥시기, 하이드록실아민기, 히드라진기, 히드라지드기 또는 세미카르바지드기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시켜 제조되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 아미노옥시기, 하이드록실아민기, 히드라진기, 히드라지드기 또는 세미카르바지드기가 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  35. 제4항에 있어서, 카르보닐기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 아미노옥시기, 하이드록실아민기, 히드라지드기 또는 세미카르바지드기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시켜 제조되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  36. 제4항에 있어서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시켜 제조되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  37. 제4항에 있어서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시켜 제조되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 아지드기 또는 알킨기가 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  39. 제4항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자가 분지형 또는 멀티아암형 중합체인 fEPO 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각 분지는 분자량이 5 kDa 내지 30 kDa인 fEPO 폴리펩티드.
  41. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴 길항제인 fEPO 폴리펩티드.
  42. 제41항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2로부터의 잔기 V11, R14, Y15, D96, K97, S100, R103, S104, T107, L108 및 R110, 및 그의 조합을 포함하나, 그에 한정되지 않는 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  43. 제41항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  44. 제41항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  45. 제41항에 있어서, 수용성 중합체에 연결되어 있는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 폴리펩티드의 부위 II 영역 내에 존재하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  46. 제41항에 있어서, 수용성 중합체에 연결되어 있는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 fEPO 길항제의 제2 fEPO 수용체에의 결합을 방지함으로써 fEPO 수용체의 이량체화를 방지하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  47. 제41항에 있어서, 루신 이외의 아미노산이 서열번호 2의 L108 대신 치환되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, 아르기닌이 서열번호 2의 L108 대신 치환되는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  49. 제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 당류 부분을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드
  50. 제3항에 있어서, 수용성 중합체가 당류 부분을 통해 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  51. 엄격한 조건하에서 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 또는 서열번호 27에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  52. 제51항에 있어서, 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이(unique) 코돈, 희귀 코돈, 및 4 염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
  53. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 fEPO 폴리펩티드를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제4항의 fEPO 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함하는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기, 또는 알킨기를 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체가 아미노옥시, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 포함하는 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체가 아지드 부분을 포함하는 것인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 아지드 부분을 포함하고, 수용성 중합체가 알킨 부분을 포함하는 것인 방법.
  59. 제54항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 부분은 평균 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 부분이 분지형 또는 멀티아암형 중합체인 방법.
  61. 제1항의 fEPO 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 조성물.
  63. fEPO에 의해 조절되는 질병을 앓는 환자에게 제61항의 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, fEPO에 의해 조절되는 질병을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  64. 제51항의 핵산을 포함하는 세포.
  65. 제64항에 있어서, 세포가 오르토고날 tRNA 신테타제 및 오르토고날 tRNA를 포함하는 것인 세포.
  66. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, fEPO 폴리펩티드를 코딩하고 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 오르토고날 RNA 신테타제 및 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 fEPO 폴리펩티드의 발현이 허용되는 조건하에서 배양하는 단계; 및 fEPO 폴리펩티드를 세포로부터 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  67. 천연적으로 발생된 fEPO 중의 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는, fEPO의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법.
  68. 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26 또는 서열번호 27에 나타낸 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 fEPO 폴리펩티드로서, 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  69. 제68항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  70. 제68항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  71. 제68항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 3으로부터의 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 17, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 68, 72, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 107, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 154, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165 및 166으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 치환된 것인 fEPO 폴리펩티드.
  72. 제68항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 히드라진기, 세미카르바지드기, 아지드기, 또는 알킨기를 포함하는 것인 fEPO 폴리펩티드.
  73. 제70항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분은 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa인 fEPO 폴리펩티드.
  74. 제70항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분은 분자량이 5 kDa 내지 40 kDa인 fEPO 폴리펩티드.
  75. 제70항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 부분이 분지형 또는 멀티아암형 중합체인 fEPO 폴리펩티드.
  76. 제68항의 fEPO 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  77. 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 비인간 에리트로포이에틴 폴리펩티드로서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환 또는 첨가를 포함하는 것인 비인간 에리트로포이에틴 폴리펩티드.
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