CN1914223B

CN1914223B - 经修饰的人类四螺旋束多肽及其用途

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Publication number: CN1914223B
Application number: CN2005800037880A
Authority: CN
Inventors: 丘霍松; 托马斯·丹尼尔; 理查德·迪马什; 安娜-玛丽亚·A·海斯·普特南; 特洛伊·威尔逊; 比·查·西姆; 戴维·利青格
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2004-02-02
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: CN1942589A; ZA200606224B; ZA200606216B; CN1914223A; CN101001866A; ZA200606225B

Abstract

本发明提供经修饰的人类四螺旋束(4HB)多肽及其用途。

Description

经修饰的人类四螺旋束多肽及其用途

本发明主张2004年2月2日申请的美国临时专利申请案第60/541,528号、2004年6月18日申请的美国临时专利申请案第60/581,314号、2004年6月18日申请的美国临时专利申请案第60/581,175号、2004年6月18日申请的美国临时专利申请案第60/580,885号和2004年12月22日申请的题为60/638,616的美国临时专利申请案的优先权，所述申请案的说明书以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及经至少一种非天然编码氨基酸修饰的四螺旋束多肽。

背景技术

生长激素(GH)超基因家族(Bazan，F.Immunology Today 11：350-354(1991)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.(1996)SIGNALING BY THE HEMATOPOIETICCYTOKINE RECEPTORS)代表一组具有类似结构特征的蛋白。这个蛋白家族的各成员包含四螺旋束，其为图1中所示者的通用结构。家族成员在本文中意指“四螺旋束多肽”或“4HB”多肽。虽然所述家族的更多成员尚未鉴别，但所述家族的一些成员包括以下各物：生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞间介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)和心脏营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，虽然其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征允许容易地鉴别基因家族的新成员。家族成员hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的通用结构分别展示于图2、3、4和5中。

GH超基因家族的一个成员为人类生长激素(hGH)。人类生长激素参与正常人类生长及发育的许多调控。这种天然产生的单链垂体激素是由191个氨基酸残基组成且具有大约22kDa的分子量。hGH展现多种生物效应，尤其包括线性生长(体质发生)、生乳、活化巨噬细胞和类胰岛素及致糖尿病的效应(Chawla，R.等人，Ann.Rev.Med.34：519-547(1983)；Isaksson，O.等人，Ann.Rev.Physiol.，47：483-499(1985)；Hughes，J.和Friesen，H.，Ann.Rev.Physiol，47：469-482(1985))。

hGH的结构是众所周知的(Goeddel，D.等人，Nature 281：544-548(1979))，并且hGH的三维结构已由X射线结晶学解析(de Vos，A.等人，Science255：306-312(1992))。蛋白具有紧凑的球状结构，其包含四个两性α螺旋束，从N-末端起始被称为A-D，它们由环接合。hGH还含有四个半胱氨酸残基，其参与两个分子内二硫键：C53与C165配对且C182与C189配对。激素并未经糖基化且已在大肠杆菌中以分泌形式表达(Chang，C等人，Gene 55：189-196(1987))。

已鉴别hGH的多种天然产生的突变体。这些突变体包括hGH-V(Seeberg，DNA1：239(1982)；美国专利第4,446,235、4,670,393和4,665,180号，其以引用的方式并入本文中)和含有hGH的残基32-46缺失的20-kDa hGH(Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta 925：314(1987)；Lewis，U.等人，J.Biol Chem.，253：2679-2687(1978))。此外，已报导多种hGH变异体，其是由转录后、翻译后、分泌性、代谢加工型及其他生理过程产生(Baumann，G.，Endocrine Reviews12：424(1991))。

hGH的生物效应是源自其与特异性细胞受体的相互作用。激素为包括胎盘催乳素和催乳激素的同源蛋白家族的成员。然而，hGH在家族成员中是不寻常的，因为其展现广泛的物种特异性并与经克隆的躯体原(Leung，D.等人，Nature330：537-543(1987))受体或催乳激素(Boutin，J.等人，Cell 53：69-77(1988))受体相结合。基于结构和生化研究，已提出催乳性和躯体原性结合域的功能图谱(Cunningham，B.和Wells，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.88：3407(1991))。hGH受体为造血/细胞激素/生长因子受体家族的一员，所述家族包括数种其他生长因子受体，诸如白细胞间介素(IL)-3、-4和-6受体、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)受体、促红细胞生成素(EPO)受体以及G-CSF受体。参看Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：6934-6938(1990)。细胞激素受体家族的成员含有四个保守性半胱氨酸残基和正好位于跨膜区外侧的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基元。认为保守性序列涉及于蛋白-蛋白相互作用中。例如参看Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184：485-490(1992)。hGH与其受体(hGHbp)的胞外域之间的相互作用是最为人所了解的激素-受体相互作用之一。高解析度X射线结晶学数据(Cunningham，B.等人，Science，254：821-825(1991))已展示hGH具有两个受体结合位点并使用分子上独特的位点依次结合两个受体分子。所述两个受体结合位点被称为位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基末端和部分螺旋A以及A-B环，而位点II涵盖螺旋A的氨基末端区和部分螺旋C。GH与其受体的结合依次发生，位点I首先结合。位点II然后啮合第二GH受体，导致受体二聚作用和引起对激素的细胞反应的细胞内信号通路的活化。其中已将G120R取代引入位点II中的hGH突变蛋白能够结合单一hGH受体，但不能二聚两种受体。突变蛋白充当体外hGH拮抗剂，推测其是通过占据受体位点同时不会活化细胞内信号通路(Fuh，G.等人，Science 256：1677-1680(1992))。

重组hGH是用作治疗剂且已被批准用于治疗多种适应症。hGH缺乏引起侏儒症，例如其已通过外源投与激素而被成功治疗十年以上。除hGH缺乏外，hGH还被批准用于治疗肾衰竭(儿童中)、特纳氏综合症(Turner’s Syndrome)和AIDS患者中的恶病质。最近，食品及药物管理局(FDA)已批准hGH用于治疗非GH依赖性身材矮小。hGH当前还被研究以用于治疗衰老、老年人虚弱、短肠综合症和充血性心脏衰竭。

重组hGH当前是作为每日可注射产品销售，当前市场上的五种主要产品为：Humatrope^TM(Eli Lilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono)。然而，对于使用生长激素作为治疗剂的显著难题为蛋白具有短的体内半衰期，且因此其必须通过每日皮下注射来投与以达到最大效率(MacGillivray等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.81：1806-1809(1996)。显著努力是集中于通过降低生产成本、使投与对患者而言更容易、改良功效及安全概况和产生将提供竞争优势的其他特性来改良hGH促效剂和拮抗剂的投与。举例而言，Genentech和Alkermes先前销售Nutropin Depot^TM，其为用于儿科生长激素缺乏症的hGH储存调配物。虽然所述储存物允许更低频率的投与(每2-3周一次而不是每日一次)，但其也与不当的副作用有关，诸如降低的生物利用性和注射部位处疼痛，并且在2004年从市场撤柜。另一产品Pegvisomant^TM(Pfizer)最近也已通过FDA批准。Pegvisomant^TM为hGH的基因工程类似物，其用作指定用于治疗肢端肥大症的高度选择性生长激素受体拮抗剂(van der Lely等人，The Lancet 358：1754-1759(2001)。虽然Pegvisomant^TM中的数个氨基酸侧链残基经聚乙二醇(PEG)聚合物衍生，但所述产品仍然每日一次投与，表明医药特性并非最佳。除聚乙二醇化和储存调配物之外，包括hGH的吸入和口服剂型的其他投与途径处于临床前初期及临床开发阶段，且尚未有投与途径通过FDA批准。因此，需要展现生长激素活性并且还提供较长的血清半衰期且因此提供更佳的hGH治疗水平和增加的治疗剂半衰期的多肽。

干扰素为由被病毒入侵或暴露于某些其他物质的细胞释放的相对较小的单链糖蛋白。干扰素目前被分组为三个主要类别，命名为：1)白细胞干扰素(干扰素-α、α-干扰素、IFN-α)、2)成纤维细胞干扰素(干扰素-β、β-干扰素、IFN-β)和3)免疫干扰素(干扰素-γ、γ-干扰素、IFN-γ)。回应于病毒感染，淋巴细胞主要合成α-干扰素(和ω干扰素、IFN-ω)，而成纤维细胞的感染通常诱导产生β-干扰素。IFNα和IFNβ共有约20-30百分比的氨基酸序列同源性。人类IFN-β的基因缺少内含子，并编码与人类IFN-α具有29％氨基酸序列一致性的蛋白，表明IFN-α和IFN-β基因是从共同祖先演化而来(Taniguchi等人，Nature 285547-549(1980))。相反，IFN-γ是由淋巴细胞回应于有丝分裂素合成而来。已知IFNα、IFNβ和IFNω诱导MHC I类抗原表达并被称为I类干扰素，而IFN-γ诱导MHC II类抗原表达并被称为II类干扰素。

已鉴别多种编码不同种类IFNα的独特基因。α干扰素属于两个主要类别，即I和II，其各自含有多种离散蛋白(βaron等人，Critical Reviews inBiotechnology 10，179-190(1990)；Nagata等人，Nature 287，401-408(1980)；Nagata等人，Nature 284，316-320(1980)；Streuli等人，Science 209，1343-1347(1980)；Goeddel等人，Nature 290，20-26(1981)；Lawn等人，Science 212，1159-1162(1981)；Ullrich等人，J.Mol.Biol.156，467-486(1982)；Weissmann等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B299，7-28(1982)；Lund等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81，2435-2439(1984)；Capon等人，Mol.Cell.Biol.5，768(1985))。各种IFN-α物质包括IFN-αA(IFN-α2)、IFN-αB、IFN-αC、IFN-αC1、IFN-αD(IFN-α1)、IFN-αE、IFN-αF、IFN-αG、IFN-αH、IFN-αI、IFN-αJ1、IFN-αJ2、IFN-αK、IFN-αL、IFN-α4B、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α74、IFN-α76(IFN-α4a)、IFN-α88及其等位基因。

干扰素起初是源自天然产生的来源，诸如血沉棕黄层白细胞和成纤维细胞，视情况使用诱导剂以增加干扰素产生。也已经由重组DNA技术产生干扰素。

重组IFNαA的克隆和表达(IFNαA，也称为IFNα2)由Goeddel等人，Nature287，411(1980)描述。IFNαA、B、C、D、F、G、H、K和L的氨基酸序列连同编码核苷酸序列由Pestka在Archiv.Biochem.Biophys.221，1(1983)中描述。成熟IFNβ的克隆和表达由Goeddel等人，Nucleic Acids Res 8，4057(1980)描述。成熟IFNγ的克隆和表达由Gray等人，Nature 295，503(1982)描述。IFNω已经由Capon等人，Mol.Cell.Biol.5，768(1985)描述。IFNτ已经由Whaley等人，J.Biol.Chem.269，10864-8(1994)鉴别和公开。

干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒、免疫调控和抗增殖特性，并且已被用作治疗剂以用于治疗诸如癌症和各种病毒疾病的疾病。已展示干扰素-α类别抑制各种类型的细胞增殖，且尤其适用于治疗与癌症紧密相关的各种细胞增殖病状，尤其是诸如白血病的血液恶性肿瘤。这些蛋白已经展示对抗多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、低恶度性淋巴瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、膀胱肿瘤和卵巢癌的抗增殖活性(Bonnem，E.M.等人，(1984)J.Biol.Response Modifiers 3：580；Oldham，R.K.(1985)Hospital Practice 20：71)。

市售IFN产品的特定实例包括IFNγ-1b(Actimmune

)、IFNβ-1a(Avonex

和Rebif)、IFNβ-1b(Betaseron)、IFN alfacon-1(Infergen)、IFNα-2(IntronA

)、IFNα-2a(Roferon-A)、聚乙二醇化干扰素α-2a(Pegasys)和聚乙二醇化干扰素α-2b(PEG-Intron

)。与IFN蛋白的聚乙二醇化变体的产生相关的一些问题描述于Wang等人，(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54：547-570；和Pedder，S.C.Semin Liver Dis.2003；23增刊1：19-22中。Wang等人表征PEG-Intron

的位置异构体，且Pedder等人将Pegasys

与PEG-Intron进行比较，描述所用聚乙二醇化化学的不稳定性和对调配物的效应。虽然当前在市场上可购得的IFN产品数目众多，但仍不能满足干扰素治疗剂的需要。

GH超基因家族的另一成员为人类粒细胞群落刺激因子(G-CSF)。天然产生的G-CSF为具有约177个氨基酸的糖蛋白激素，其具有约20千道尔顿(kDa)的分子量。G-CSF的晶体结构是已知的(Hill等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167-71)，并且与其受体相结合的G-CSF的晶体结构也是已知的(Aritomi等人，(1999)Nature，401：713-717)。G-CSF的三维结构在原子水平上是已知的。根据G-CSF的三维结构，可预测G-CSF分子的氨基酸组成的改变如何导致结构改变。可使这些结构特征或改变与生物活性联系起来以设计和产生G-CSF类似物。

G-CSF为调控中性粒细胞的增殖、分化和功能活化的医药学活性蛋白(Metcalf，Blood 67：257(1986)；Yan等人，Blood 84(3)：795-799(1994)；Bensinger等人，Blood 81(11)：3158-3163(1993)；Roberts等人，Expt’l Hematology 22：1156-1163(1994)；Neben等人，Blood 81(7)：1960-1967(1993)；Welte等人，PNAS-USA 82：1526-1530(1985)；Souza等人，Science 232：61-65(1986)和Gabrilove，J.Seminars in Hematology 26：21-14(1989))。从人类膀胱癌细胞系5637的细胞培养物上清液纯化G-CSF以达到同源性(Welte等人，Proc.Natl.Acad.Sci(1985)82：1526-30)。根据Souza等人，Science(1986)232：61-65，已知编码天然G-CSF的cDNA的序列。作为第二内含子中的替代剪接的结果，存在具有204或207个氨基酸的G-CSF的两种天然产生的形式，所述氨基酸中最先30个代表信号肽(Lymphokines，IRL Press，Oxford，Washington D.C.，编者D.Male和C.Rickwood)。展示成熟蛋白具有约19kDa的分子量并具有5个半胱氨酸残基，其可形成分子间或分子内二硫桥。结合研究已经展示G-CSF与中性粒细胞相结合。对于红系淋巴嗜酸细胞系以及巨噬细胞并未观察到结合。

在人类中，在血浆中可检测到内源性G-CSF(Jones等人，Bailliere’s ClinicalHematology 2：183-111(1989))。G-CSF是由成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞、滋养层细胞、内皮细胞和上皮细胞产生且为位于第17染色体上的包含四个外显子和五个内含子的单一拷贝基因的表达产物。这个基因座的转录产生mRNA物质，其经差别加工，导致两种形式的G-CSF mRNA，一种变体编码具有177个氨基酸的蛋白而另一种编码具有174个氨基酸的蛋白(Nagata等人，EMBO J 5：575-581(1986))，且已经发现包含174个氨基酸的形式具有最特异的体内生物活性。G-CSF为交叉反应性物质，以致当投与诸如小鼠、犬或猴子的另一哺乳动物人类G-CSF时，引发持续的中性白细胞增多(Moore等人，PNAS-USA 84：7134-7138(1987))。

人类G-CSF可从多种来源获得和纯化。天然人类G-CSF(nhG-CSF)可从经培养的人类肿瘤细胞系的上清液中分离。重组DNA技术的开发(例如参看美国专利第4,810,643号(Souza)，其以引用的方式并入本文中)已经使得能够产生商业规模数量的作为真核宿主细胞表达产物的糖基化形式的G-CSF，以及作为原核宿主细胞表达产物的非糖基化形式的G-CSF。

已经发现G-CSF适用于治疗其中中性白细胞增加将提供益处的适应症。G-CSF可从骨髓中移动干细胞和前驱细胞并用于治疗其粒细胞已被化学疗法耗尽的患者，或用作骨髓移植的先驱。举例而言，对于癌症患者而言，G-CSF作为选择性刺激中性白细胞产生以补偿由化学疗法或放射疗法引起的造血缺陷的方式是有益的。其他适应症包括治疗各种感染性疾病和相关病症，诸如通常由细菌代谢物引起的败血症。G-CSF也适用于单独或与其他化合物(诸如其他细胞激素)组合用于培养物中的细胞生长或扩张，例如用于骨髓移植。

G-CSF受体(G-CSFR)为造血/细胞激素/生长因子受体家族的一员，所述家族包括数种其他生长因子受体，诸如白细胞间介素(IL)-3、-4和-6受体、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)受体、促红细胞生成素(EPO)受体以及催乳激素和生长激素受体。参看Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：6934-6938(1990)。细胞激素受体家族的成员含有四个保守性半胱氨酸残基和正好位于跨膜区外侧的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基元。认为保守性序列涉及于蛋白-蛋白相互作用中。例如参看Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184：485-490(1992)。G-CSF受体是由具有约150kD分子量的单一肽链组成(Nicola，Immunol.Today 8(1987)，134)。

已经将糖基化hG-CSF与通过用神经氨酸酶和内-α-N-乙酰半乳糖胺酶体外酶促消化所制备的去糖基化hG-CSF在其作为pH和温度的函数的稳定性方面进行比较(Oh-eda等人，1990，J.Biol.Chem.265(20)：11432-35)。在含有0.2M NaCl和0.01％Tween 20的20mM磷酸盐缓冲液中以1μg/mL浓度溶解的去糖基化hG-CSF在37℃下培育两天后于约pH7到约pH8的pH范围内迅速失活。相反，糖基化hG-CSF在相同条件下保留其活性的80％以上。此外，两种形式hG-CSF的热稳定性的评估(由生物检定和量热分析加以测量)表明去糖基化hG-CSF比天然形式的hG-CSF对热更不稳定。

已经采取多种方法以便提供稳定的医药学上可接受的G-CSF组合物。一种改良G-CSF的组合物稳定性的方法包括合成所述蛋白的衍生物。美国专利第5,665,863号公开形成包含与白蛋白偶合的G-CSF的重组嵌合蛋白，其具有新型的药物动力学特性。美国专利第5,824,784号和美国专利第5,320,840号公开水溶性聚合物与蛋白的化学连接以改良稳定性并提供对抗蛋白水解型降解的保护，且更特定而言为携带经化学连接的聚合物(包括聚乙二醇)的经N末端修饰的G-CSF分子。

一种增加组合物中G-CSF稳定性的替代方法包括改变蛋白的氨基酸序列。美国专利第5,416,195号公开具有改良组合物稳定性的G-CSF的基因工程类似物，其中通常在成熟多肽链的第17位发现的半胱氨酸残基、在第27位发现的天冬氨酸残基和在第65和66位发现的串联脯氨酸残基中的至少一个全部由丝氨酸残基置换。美国专利第5,773,581号公开已经共价接合到水溶性聚合物的G-CSF的基因工程G-CSF类似物。

GH超基因家族的另一成员为人类促红细胞生成素(hEPO)。天然产生的促红细胞生成素(EPO)为在哺乳动物肾脏和肝脏中产生的具有34千道尔顿(kDa)分子量的糖蛋白激素。EPO为包括红细胞祖先的增殖和分化的红细胞生成中的关键组分。EPO活性也与多种红系特异性基因的活化相关，所述基因包括球蛋白和碳酸酐酶。例如参看Bondurant等人，Mol.Cell Biol.5：675-683(1985)；Koury等人，J.Cell Physiol.126：259-265(1986)。

促红细胞生成素受体(EpoR)为造血/细胞激素/生长因子受体家族的一员，所述家族包括数种其他生长因子受体，诸如白细胞间介素(IL)-3、-4和-6受体、G-CSF受体(G-CSFR)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)受体以及催乳激素和生长激素受体。参看Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：6934-6938(1990)。细胞激素受体家族的成员含有四个保守性半胱氨酸残基和正好位于跨膜区外侧的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基元。认为保守性序列涉及于蛋白-蛋白相互作用中。例如参看Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184：485-490(1992)。

美国专利第5,441,868、5,547,933、5,618,698和5,621,080号描述DNA序列，其编码人类EPO和具有天然产生的EPO的部分或所有一级结构构象和生物特性的经纯化及经分离多肽。

hEPO的生物效应是源自其与特异性细胞受体的相互作用。hEPO与其受体(hEPObp)的胞外域之间的相互作用为人所非常了解。高解析度X射线结晶学数据已经展示hEPO具有两个受体结合位点并使用分子上独特的位点依次结合两个受体分子。所述两个受体结合位点被称为位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基末端和部分螺旋A以及A-B环，而位点II涵盖螺旋A的氨基末端区和部分螺旋C。EPO与其受体的结合依次发生，位点I首先结合。位点II然后啮合第二EPO受体，导致受体二聚作用和引起对激素的细胞反应的细胞内信号通路的活化。

重组hEPO用作治疗剂并已被批准用于治疗人类受检者。hEPO缺乏引起贫血症，例如其已通过外源投与激素而被成功治疗十年以上。

共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)为一种增加水溶性和生物利用性、增加血清半衰期、增加治疗剂半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白、肽且尤其是疏水性分子)的循环时间的方法。PEG已经广泛用于药品中、用于人工移植上并用于其中生物相容性、毒性缺少和免疫原性缺少具重要性的其他应用中。为最大化PEG的所要特性，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接有关的有利特征，诸如增加的水溶性和循环半衰期，而不会不利地影响母体分子的生物活性。

PEG衍生物经常经由反应性化学官能基与生物活性分子连接，所述官能基诸如为赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分。蛋白及其他分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适合于经由聚合物连接进行修饰的位点在受体结合中扮演重要角色，并且为分子生物活性的保留所必需。因此，聚合物链与生物活性分子上所述反应性位点的无差别连接通常引起经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低甚或全部损失。R.Clark等人，(1996)，J.Biol.Chem.，271：21969-21977。为形成具有足以赋予靶分子所要优势的聚合物分子量的接合物，先前技术方法通常已经包括将众多聚合物臂随机连接于所述分子，由此增加母体分子的生物活性降低甚或完全损失的风险。

形成用于将PEG衍生物连接于蛋白的基因座的反应性位点受蛋白结构支配。包括酶的蛋白是由具有通用结构H₂N--CHR--COOH的各种α氨基酸序列组成。一种氨基酸的α氨基部分(H₂N--)接合到邻近氨基酸的羧基部分(--COOH)以形成酰胺键合，其可表示为--(NH--CHR--CO)_n--，其中下标“n”可等于几百或几千。由R代表的片段可含有用于蛋白生物活性并用于连接PEG衍生物的反应性位点。

举例而言，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位置以及α位置中存在--NH₂部分。在碱性pH条件下ε--NH₂不发生反应。蛋白的PEG衍生领域中大多数技术已针对开发PEG衍生物以用于连接于蛋白中所存在的赖氨酸残基的ε--NH₂部分。″Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation″，NektarMolecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同局限，即其不能选择性安装在蛋白表面上所存在的通常众多的赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对例如存在于酶活性位点中的蛋白活性具重要性的情况下，或者在赖氨酸残基在调节蛋白与其他生物分子的相互作用方面起作用的情况下(如同在受体结合位点的情况下)，其可为显著限制。

用于蛋白聚乙二醇化的现存方法的第二及同等重要的复杂情况为所述PEG衍生物可经历与除所要者之外的残基的不当副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(在结构上表示为--N(H)--)，但许多与ε--NH₂反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离巯基，其在结构上表示为-SH。在某些情况下，在赖氨酸的ε-NH₂基团上对准的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其他残基反应。如此可产生经PEG衍生的生物活性分子的复杂异质混合物，并且有可能破坏所针对的生物活性分子的活性。需要开发允许在蛋白内的单一位点处引入化学官能基的PEG衍生物，其然后使得一种或一种以上PEG聚合物能够在蛋白表面上经明确定义且可预测的特异性位点处选择性偶合到生物活性分子。

除赖氨酸残基之外，在所属领域中已经对开发针对其他氨基酸链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的经活化PEG试剂投入显著努力。例如参看美国专利第6,610,281号(其以引用的方式并入本文中)和″Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGylation″，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。使用定点突变形成法和所属领域中已知的其他技术，可将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白结构中，且所得游离巯基部分可与具有硫醇反应性官能基的PEG衍生物反应。然而，这种方法很复杂，因为引入游离巯基会使所得蛋白的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有将化学官能基引入生物活性分子中的方式，所述生物活性分子能够使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白选择性偶合，同时与蛋白中通常所发现的巯基及其他化学官能基相容(即不参加与其的不当副反应)。

从所属领域的取样可以看到，经开发用于连接于蛋白侧链、尤其是赖氨酸氨基酸侧链上的--NH₂部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多所述衍生物已经证实在其合成和使用上存在问题。一些衍生物与蛋白形成不稳定的键合，其在含水环境中(诸如在血流中)经受水解且因此分解、降解或在其他方面不稳定。关于PEG-Intron

中键合稳定性的讨论请参看Pedder，S.C.Semin Liver Dis.2003；23增刊1：19-22。一些衍生物形成较稳定的键合，但在形成键合之前仍经受水解，其意谓PEG衍生物上的反应基可在蛋白连接之前经失活。一些衍生物具有些许毒性且因此较不适合于体内使用。一些衍生物反应太慢而在实际上不适用。一些衍生物通过连接于负责蛋白活性的位点而导致蛋白活性损失。一些衍生物在其将连接的位点中并不具有特异性，其也可导致所要活性损失和缺少结果的再现性。为克服与以聚(乙二醇)部分修饰蛋白相关的难题，已经开发较稳定(例如美国专利第6,602,498号，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如美国专利第6,610,281号，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。在所属领域中显然需要直到被唤醒以选择性反应以形成稳定化学键之前在生理环境中一直为化学惰性的PEG衍生物。

最近，已经报导蛋白科学中完全新型的技术，其很有希望克服许多与蛋白的位点特异性修饰相关的局限。特定而言，已经向原核生物大肠杆菌(E.coli)(例如L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)和真核生物酿酒酵母(S.cerevisiae)(例如J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白生物合成机构中加入新型组分，其使得能够将非遗传编码的氨基酸体内并入蛋白中。使用这一方法，已将具有新颖化学、物理或生物特性的多种新型氨基酸(包括光亲和标记和可光致异构化的氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效地及高保真度地在大肠杆菌中和酵母中并入回应于琥珀密码子TAG的蛋白中。例如参看J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024；和L.Wang，&P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-10。这些研究已经证明有可能选择性且常规批引入化学官能基，诸如酮基、炔基和叠氮部分，其在蛋白中未发现、对于在20种常见的遗传编码的氨基酸中所发现的所有官能基呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定的共价键合。

将非遗传编码的氨基酸并入蛋白中的能力允许引入可提供天然产生的官能基的有价值替代物的化学官能基，诸如赖氨酸的ε-NH₂、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等。已知某些化学官能基对于在20种常见的遗传编码的氨基酸中所发现的官能基呈惰性，但显著且有效地反应以形成稳定键合。举例而言，在所属领域中已知叠氮基和乙炔在催化量的铜存在下于含水条件下经历Huisgen[3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。举例而言，通过将叠氮部分引入蛋白结构中，能够并入对于在蛋白中所发现的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分顺利且有效地反应以形成环加成产物的官能基。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基在其他蛋白侧链存在下和生理条件下仍为化学惰性和无反应性。

本发明尤其解决与四螺旋束(4HB)多肽的活性和产生相关的问题，也解决具有改良生物或药理学特性(诸如改良的治疗剂半衰期)的4HB多肽的产生。

发明内容

本发明提供GH超基因家族成员，其包括包含一种或一种以上非天然编码氨基酸的hGH多肽、hIFN多肽、hG-CSF多肽和hEPO多肽。

在一些实施例中，4HB多肽包含一种或一种以上翻译后修饰。在一些实施例中，4HB多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，4HB多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一种额外4HB多肽连接。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽为4HB多肽。

在一些实施例中，4HB多肽包含至少两种与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一种氨基酸为非天然编码氨基酸。

hGH的区域可说明如下，其中在中间行中指定hGH中的氨基酸位置：

螺旋A 螺旋B 螺旋C 螺旋D

[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]

N-末端 A-B环 B-C环 C-D环 C-末端

在一些实施例中，在如下对应于hGH中的二级结构的以下区域的一个或一个以上中的任何位置并入一种或一种以上非天然编码氨基酸：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的1-5(N-末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C-末端)。在其他实施例中，在选自由hGH SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的残基1-5、32-46、97-105、132-149和184-191组成的群组的位置取代非天然编码氨基酸。在一些实施例中，在hGH中以下位置的一个或一个以上中并入一种或一种以上的非天然编码氨基酸：位置1之前(即N-末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

在一些实施例中，在以下位置的一个或一个以上中取代一种或一种以上的非天然编码氨基酸：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

在一些实施例中，在以下位置的一个或一个以上中取代一种或一种以上的非天然编码氨基酸：29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186或187(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

在一些实施例中，在以下位置的一个或一个以上中取代一种或一种以上的非天然编码氨基酸：35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

在一些实施例中，在以下位置的一个或一个以上中取代一种或一种以上的非天然编码氨基酸：30、74或103(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。在一些实施例中，在以下位置的一个或一个以上中取代一种或一种以上的非天然编码氨基酸：35、92、143、145(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N-末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：35、92、143、145(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

人类GH拮抗剂包括但不限于在1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127具有取代或在位置1(即N-末端)具有添加或其任何组合(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸或任何其他GH序列)的拮抗剂。

在一些实施例中，在如下对应于IFN中的二级结构的以下区域的一个或一个以上中的任何位置并入一种或一种以上非天然编码氨基酸：1-9(N-末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C-末端)(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在IFN中以下位置的一个或一个以上中并入一种或一种以上的非天然编码氨基酸：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：100、106、107、108、111、113、114(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：41、45、46、48、49(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生的氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、91、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即羧基末端)(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)。在一些实施例中，非天然产生的氨基酸在以下位置的一个或一个以上中连接于水溶性聚合物：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸以提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)；视所选位点和所要特性而定，包含这些取代中的一者的hIFN多肽可有效地充当弱拮抗剂或弱促效剂。人类IFN拮抗剂包括但不限于在22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合(hIFN；SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂。

在一些实施例中，在如下对应于G-CSF中的二级结构的以下区域的一个或一个以上中的任何位置并入一种或一种以上非天然编码氨基酸：1-10(N-末端)、11-39(A螺旋)、40-70(螺旋A与螺旋B之间的区域)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区域)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区域)、143-172(D螺旋)、173-175(C-末端)，包括在A螺旋与B螺旋之间44-53处的短螺旋节段微小E螺旋，其是由3₁₀螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在G-CSF中以下位置的一个或一个以上中并入一种或一种以上的非天然编码氨基酸：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在以下位置的一个或一个以上中包含一种或一种以上非天然产生氨基酸：30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170、171(SEQ IDNO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。用于并入非天然编码氨基酸的例示性位置包括59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171或其组合(如在SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生的氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)(SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些或其他位置上的一种或一种以上非天然产生的氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167、171或其任何组合(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36的对应氨基酸)。人类G-CSF拮抗剂包括但不限于在以下位置具有取代的拮抗剂：6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145或其任何组合(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36的对应氨基酸)。

在一些实施例中，在如下对应于EPO中的二级结构的以下区域的一个或一个以上中的任何位置并入一种或一种以上非天然编码氨基酸：1-7(N-末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环，其含有β折叠1(39-41)和微小B’螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环，其含有微小C’螺旋(114-121)和β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C-末端)(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39的对应氨基酸)。在一些实施例中，在EPO中以下位置的一个或一个以上中并入一种或一种以上的非天然编码氨基酸：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。用于并入一种或一种以上非天然编码氨基酸的例示性位点的亚组包括但不限于EPO中的1、2、4、9、17、20、21、24、25、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、79、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136、159、162、163、164、165和166(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。用于并入一种或一种以上非天然编码氨基酸的例示性位置包括：EPO中的21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165和166(SEQ ID NO：38或SEQID NO：37或39中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，这些位置的一个或一个以上中的非天然产生的氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)(SEQ ID NO：38或SEQ IDNO：37或39中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些或其他位置上的一种或一种以上非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于位置21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128或其组合(SEQID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。

人类EPO拮抗剂包括但不限于在以下位置具有取代的拮抗剂：2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159或其任何组合(hEPO；SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39的对应氨基酸)。

在一些实施例中，4HB多肽包含调节4HB多肽对4HB多肽受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，4HB多肽包含增加4HB多肽稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hGH多肽在hGH SEQ ID NO：2中包含选自由F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D、H21N、G120A；R167N、D171S、E174S；F176Y、I179T或其任何组合组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，4HB多肽包含调节4HB多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，4HB多肽包含调节4HB多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，4HB多肽包含增加4HB多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，4HB多肽包含增加在宿主细胞中产生的4HB多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，4HB多肽包含增加宿主细胞中或体外合成的4HB多肽表达的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hGH多肽包含氨基酸取代G120A。包含这种取代的hGH多肽保留促效剂活性并保留或改良宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，hG-CSF多肽包含选自由但不限于T38A、H52A、L71A、T102A、L108A、W118A、S159A(Biochemistry 35：9034(1996)，或SEQ ID NO：29的对应氨基酸位置)及其组合组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，hEPO多肽包含选自由但不限于SEQ ID NO：38中的N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126或其组合组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，4HB多肽包含增加4HB多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，4HB多肽中的氨基酸取代可以天然产生或非天然产生氨基酸进行，只要至少一个取代是以非天然编码氨基酸进行即可。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，多肽为4HB多肽促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或逆向促效剂。在一些实施例中，4HB多肽促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或逆向促效剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，4HB促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或逆向促效剂包含非天然编码氨基酸和一种或一种以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸存在于4HB多肽的位点II区域(涵盖AC螺旋束面、螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C的蛋白区域)中。在一些实施例中，包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸的4HB多肽通过阻止4HB多肽拮抗剂结合到第二4HB多肽受体分子来阻止4HB多肽受体的二聚作用。在一些实施例中，在SEQ ID NO：2(hGH)中用除甘氨酸之外的氨基酸取代G120。在一些实施例中，在SEQ ID NO：2中用精氨酸取代G120。在一些实施例中，在SEQ ID NO：2中用非天然编码氨基酸取代G120。在一些实施例中，在SEQ ID NO：29(hG-CSF)中用除亮氨酸之外的氨基酸取代L70。在一些实施例中，在SEQ ID NO：29中用精氨酸或赖氨酸取代L70。在一些实施例中，在SEQ ID NO：29中用非天然编码氨基酸取代L70。在一些实施例中，在SEQ ID NO：38(hEPO)中用除亮氨酸之外的氨基酸取代L108。在一些实施例中，在SEQ IDNO：38中用精氨酸或赖氨酸取代L108。在一些实施例中，在SEQ ID NO：38中用非天然编码氨基酸取代L108。

本发明也提供包含在严谨条件下杂交到SEQ ID NO：21、22、26、27、31、32、33、34、40、41、42或43的多核苷酸的经分离核酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、唯一密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。

本发明也提供制造连接于水溶性聚合物的4HB多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含以水溶性聚合物接触包含非天然编码氨基酸的经分离4HB多肽，所述水溶性聚合物包含与非天然编码氨基酸反应的部分。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸对不能另外与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物具有反应性。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸对不能另外与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子具有反应性。

在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的4HB多肽是通过将包含含羰基氨基酸的4HB多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应而得以制造。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键合连接于聚(乙二醇)分子。

在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的4HB多肽是通过将包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应而得以制造。

在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的4HB多肽是通过将包含含炔氨基酸的4HB多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应而得以制造。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键合连接于聚(乙二醇)分子。

在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的4HB多肽是通过将包含含叠氮基氨基酸的4HB多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应而得以制造。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键合连接于聚(乙二醇)分子。

在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于0.1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分枝聚合物的各分枝具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，连接于4HB多肽的水溶性聚合物包含聚亚烷基二醇部分。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分且水溶性聚合物包含炔部分。

本发明也提供组合物，其包含包含非天然编码氨基酸的4HB多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。

本发明也提供细胞，其包含包含选择密码子的编码4HB多肽的多核苷酸。在一些实施例中，所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代入4HB多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。

本发明也提供制造包含非天然编码氨基酸的4HB多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许4HB多肽表达的条件下培养包含编码4HB多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞，和从细胞和/或培养基中纯化4HB多肽。

本发明也提供增加4HB多肽的治疗剂半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明也提供调节4HB多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然产生的4HB多肽中的任何一种或一种以上氨基酸和/或将4HB多肽连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。

本发明也提供以有效量的本发明的4HB分子治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含投与患者治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包含包含非天然编码氨基酸的4HB多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。

本发明也提供包含SEQ ID NO：1、2、3或任何其他GH多肽序列SEQ ID NO：23、4、25或任何其他hIFN多肽序列SEQ ID NO：28、29、30、35、36或任何其他hG-CSF多肽序列SEQ ID NO：37、38、39或任何其他hEPO多肽序列中所示序列的4HB多肽，其例外为至少一种氨基酸由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，在选自由SEQ ID NO：3(hGH)的残基1-5、82-90、117-134、和169-176组成的群组的位置上取代非天然编码氨基酸。在一些实施例中，在选自由包括但不限于以下各残基的残基组成的群组的位置上取代非天然编码氨基酸：SEQ ID NO：29(G-CSF)中的1-16、30-109、125-175或SEQ ID NO：28、30、35或36的对应氨基酸位置。在一些实施例中，在选自由包括但不限于以下各残基的残基组成的群组的位置上取代非天然编码氨基酸：SEQ ID NO：38(EPO)或SEQ ID NO：39的1-6、21-40、68-89、116-136、162-166或SEQ ID NO：37的对应氨基酸位置。

本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ IDNO：1、2、3或任何其他GH多肽序列SEQ ID NO：23、24、25或任何其他IFN多肽序列SEQ ID NO：28、29、30、35、36或任何其他G-CSF多肽序列SEQ IDNO：37、38、39或任何其他EPO多肽序列中所示序列的4HB多肽，其中至少一种氨基酸由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物经由糖部分连接于多肽。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分连接于4HB多肽。

本发明也提供包含水溶性聚合物的4HB多肽，所述水溶性聚合物经由共价键连接于所述多肽上的单一氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，共价连接于水溶性聚合物的氨基酸为在多肽中存在的非天然编码氨基酸。

本发明提供包含至少一种连接子、聚合物或生物活性分子的多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经由核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能基连接于多肽。在一些实施例中，多肽是经单聚乙二醇化。本发明也提供包含连接于一种或一种以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经由核糖体并入多肽中。

定义

应了解本发明不限于本文中所述的特定方法、实验方案、细胞系、构筑体和试剂且因此可加以变化。也应了解本文中所用的方法是仅用于描述特定实施例的目的，且并不意欲限制本发明的范畴，本发明的范畴将仅由随附权利要求书所限制。

除非上下文另外明确指定，否则如本文和随附权利要求书中所用的单数形式“一”和“所述”包括复数形式的引用。因此，举例而言，对于“hGH”、“hIFN”、“G-CSF”或“hEPO”的引用为对于一种或一种以上所述蛋白的引用，且包括所属领域的技术人员已知的其等效物等等。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

本文中所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中以用于描述和公开目的，例如在申请案中所述的可与本文所述发明结合使用的构筑体和方法。仅提供本文所讨论的公开案在本发明申请日期之前的公开内容。本文中没有内容将被解释为承认发明者可因先前发明或任何其他原因而提前公开所述公开内容。

术语“经大体上纯化”意指4HB多肽可大体上或基本上不含在蛋白天然产生的环境(即天然细胞，或在重组产生的4HB多肽的情况下为宿主细胞)中所发现的通常伴随蛋白或与其相互作用的组分。可大体上不含细胞材料的4HB多肽包括具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(以干重计)的污染性蛋白的蛋白制剂。当由宿主细胞重组产生4HB多肽或其变异体时，蛋白可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当由宿主细胞重组产生4HB多肽或其变异体时，蛋白可以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少存在于培养基中。因此，由本发明的方法产生的“经大体上纯化”4HB多肽可具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，尤其是至少约75％、80％、85％的纯度水平且更尤其是至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％的纯度水平或更高，其是由诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法测定而来。

“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

如本文所使用，术语“介质”包括可支撑或含有任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内容物。因此，所述术语可涵盖其中已生长宿主细胞的介质，例如4HB多肽已分泌入其中的介质，包括在增殖步骤之前或之后的介质。所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，诸如在4HB多肽于细胞内产生且宿主细胞经溶解或破裂以释放4HB多肽的情况下。

本文中关于蛋白再折叠所使用的“还原剂”被定义为在还原态下保持巯基并还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原谷胱甘肽。所属领域的普通技术人员易于了解多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。

本文中关于蛋白再折叠所使用的“氧化剂”被定义为能够从经氧化的化合物去除电子的任何化合物或材料。合适的氧化剂包括但不限于氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫苏糖醇、氧化赤藓糖醇和氧。所属领域的普通技术人员易于了解多种氧化剂适用于本发明的方法中。

本文所用的“变性剂”被定义为将引起可逆的蛋白解折叠的任何化合物或材料。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度加以确定。合适的变性剂可为离液剂、清洁剂、有机溶剂、水混溶性溶剂、磷脂或两种或两种以上所述药剂的组合。合适的离液剂包括但不限于脲、胍和硫氰酸钠。适用的清洁剂可包括但不限于：强清洁剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl；中度非离子性清洁剂(例如毛地黄皂苷)；中度阳离子性清洁剂，诸如N-＞2，3-(二油烯氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；中度离子性清洁剂(诸如胆酸盐或去氧胆酸钠)；或两性离子性清洁剂，包括但不限于磺酸基甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基铵基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可使用诸如乙腈、低碳数烷醇(尤其是C₂-C₄烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低碳数烷二醇(尤其是C₂-C₄烷二醇，诸如乙二醇)的有机水混溶性溶剂作为变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然产生的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变异体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。

本文所用的“再折叠”描述与二硫键相关的任何过程、反应或方法，其将含二硫键的多肽从不当折叠或未折叠的状态转化为天然或适当折叠的构象。

本文所用的“共折叠”尤其意指使用至少两种多肽的再折叠过程、反应或方法，所述多肽彼此相互作用并导致未折叠或不当折叠的多肽转化为天然的适当折叠多肽。

本文所用的术语“四螺旋束多肽”、“4HB多肽”和“4HB”意指任何已知的和变得已知的GH超基因家族的多肽或蛋白。这些术语包括但不限于hGH多肽、hIFN多肽、hG-CSF多肽、hEPO多肽，且进一步涵盖任何其他GH超基因家族成员，包括那些包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的成员以及变异体、融合体、突变体、片段、促效剂、拮抗剂、二聚体、多聚体、与聚合物共价结合的多肽、与GH超基因家族成员共有90％或更高氨基酸序列一致性的多肽和具有四螺旋束结构的多肽。除非上下文另外明确指定，否则所述术语包括复数形式的引用。

如本文所用，“生长激素”或“GH”应包括那些具有至少一种人类生长激素生物活性的多肽和蛋白以及其GH类似物、GH同功异型物、GH模拟剂、GH片段、杂交GH蛋白、融合蛋白寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变异体和突变蛋白，而不管生物活性是否相同，且进一步不管其合成或制造方法为何种方法，包括但不限于重组(无论是产生自cDNA、基因组DNA、合成DNA还是其他形式的核酸)、合成、转殖基因和基因活化方法。

术语“hGH多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。举例而言，例示性取代包括在天然hGH第41位的赖氨酸取代或第176位的苯丙氨酸取代。在一些情况下，如果取代位于第41位，那么取代可为异亮氨酸或精氨酸残基，或者如果位置为176，那么取代可为酪氨酸残基。位置F10可经例如A、H或I取代。位置M14可经例如W、Q或G取代。其他例示性取代包括任何取代或其组合，包括但不限于：

R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；

R167E、D171S、E174S、F176Y；

F10A、M14W、H18D、H21N；

F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；

F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、E174S、F176Y、I179T；

F10H、M14G、H18N、H21N；

F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、T175T、I179T；

或F10I、M14Q、H18E、R167N、D171S、I179T。例如参看美国专利第6,143,523号，其以引用的方式并入本文中。

已描述在天然产生的hGH中多种氨基酸位置中的例示性取代，包括增加促效剂活性、增加蛋白酶抗性、将多肽转变成拮抗剂等的取代，并且由术语“hGH多肽”所涵盖。

举例而言，促效剂hGH序列包括包含修饰H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、I179T的天然产生的hGH序列。例如参看美国专利第5,849,535号，其以引用的方式并入本文中。额外促效剂hGH序列包括

H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；

H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；或

H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A。例如参看美国专利第6,022,711号，其以引用的方式并入本文中。在H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A包含取代的hGH多肽增强在位点I处对hGH受体的亲和力。例如参看美国专利第5,854,026号，其以引用的方式并入本文中。具有增加的蛋白酶抗性的hGH序列包括但不限于在C-D环内包含一个或一个以上氨基酸取代的hGH多肽。在一些实施例中，取代包括但不限于R134D、T135P、K140A及其任何组合。例如参看Alam等人，(1998)J.Biotechnol.65：183-190。

举例而言，人类生长激素拮抗剂包括那些在G120(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)具有取代且有时进一步包括以下取代的拮抗剂：H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A。例如参看美国专利第6,004,931号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂在区域106-108或127-129中包含至少一个取代使得GH充当拮抗剂。例如参看美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含非天然编码氨基酸，所述氨基酸连接于在hGH分子的位点II结合区中所存在的水溶性聚合物。在一些实施例中，hGH多肽进一步包含以下取代：H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T，同时在G120具有取代。(例如参看美国专利第5,849,535号)。

关于完整全长天然产生的GH氨基酸序列以及成熟天然产生的GH氨基酸序列和天然产生的突变体，请分别参看本文中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。在一些实施例中，本发明的hGH多肽大体上与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或生长激素多肽的任何其他序列相一致。已经鉴别多种hGH的天然产生的突变体。这些突变体包括hGH-V(Seeberg，DNA 1：239(1982)；美国专利第4,446,235、4,670,393和4,665,180号，其以引用的方式并入本文中)和含有hGH(SEQ ID NO：3)的残基32-46缺失的20-kDa hGH(Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta 925：314(1987)；Lewis，U.等人，J.Biol.Chem.，253：2679-2687(1978))。胎盘生长激素描述于Igout，A.等人，Nucleic Acids Res.17(10)：3998(1989)中。此外，已经报导由转录后、翻译后、分泌性、代谢加工型及其他生理过程产生的众多hGH变异体，包括蛋白水解型裂解的变异体或2链变异体(Baumann，G.，Endocrine Reviews 12：424(1991))。经由Cys-Cys二硫键直接连接的hGH二聚体描述于Lewis，U.J.等人，J.Biol.Chem.252：3697-3702(1977)；Brostedt，P.和Roos，P.，Prep.Biochem.19：217-229(1989)中。编码hGH突变体和突变型hGH多肽的核酸分子是众所周知的，且包括但不限于那些在美国专利第5,534,617、5,580,723、5,688,666、5,750,373、5,834,250、5,834,598、5,849,535、5,854,026、5,962,411、5,955,346、6,013,478、6,022,711、6,136,563、6,143,523、6,428,954、6,451,561、6,780,613号和美国专利申请公开案2003/01 53003中公开的核酸分子，所述文献以引用的方式并入本文中。

hGH的商业制剂是以下列名称销售：Humatrope^TM(EliLilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono)。

术语“hGH多肽”也包括其医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和天然产生的hGH的立体异构体，以及天然产生的hGH的促效剂、模拟剂和拮抗剂变异体及其多肽融合体。在氨基末端、羧基末端或两端包含额外氨基酸的融合体由术语“hGH多肽”所涵盖。举例而言，例示性融合体包括但不限于甲硫氨酰基生长激素(其中甲硫氨酸连接于由重组表达产生的hGH的N末端)、用于纯化目的的融合体(包括但不限于与多聚组氨酸或亲和力抗原决定部位融合)、与血清白蛋白结合肽的融合体和与血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合体。

如本文中所用，“干扰素”或“IFN”应包括那些具有至少一种人类干扰素生物活性的多肽和蛋白，包括但不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNε或IFNτ(诸如在美国专利第4,414,150、4,456,748、4,727,138、4,762,791，4,929,554、5,096,705、4,695,623、4,614,651、4,678,751、4,925,793、5,460,811、5,120,832、4,780,530、4,908,432、4,970,161、4,973,479、4,975,276、5,098,703、5,278,286、5,661,009、6,372,206、6,433,144、6,472,512、6,572,853、6,703,225、6,200,780、6,299,869、6,300,475、6,323,006、6,350,589、5,705,363、5,738,845、5,789,551、6,117,423、6,174,996、5,540,923、5,541,293、5,541,312、5,554,513、5,593,667号中所描述者，其以引用的方式并入本文中)，以及其IFN类似物、IFN同功异型物、IFN模拟剂、IFN片段、杂交IFN蛋白、融合蛋白寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变异体和突变蛋白，而不管生物活性是否相同，且进一步不管其合成或制造方法为何种方法，包括但不限于重组(无论是产生自cDNA、基因组DNA、合成DNA还是其他形式的核酸)、合成、转殖基因和基因活化方法。IFN的特定实例包括但不限于IFNγ-1b(Actimmune)、IFNβ-1a(Avonex和Rebif)、IFNβ-1b(Betaseron)、复合IFN、IFN alfacon-1(Infergen)、IFNα-2(Intron A

)、IFNα-2a(Roferon-A)、Peginterferon α-2a(Pegasys)、Peginterferonα-2b(PEG-Intron

)、IFN类似物、IFN突变体、经改变的糖基化人类IFN和PEG接合的IFN类似物。用于表达内源性人类IFN的经修饰细胞的特定实例描述于Devlin等人，J.Leukoc.Biol.41：306(1987)；美国专利第6,716,606、6,610,830、6,482,613、6,489,144、6,159,712、5,814,485、5,710,027、5,595,888、4,966,843、6,379,661、6,004,548、5,830,705、5,582,823、4,810,643和6,242,218号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

术语“人类IFN(hIFN)”或“hIFN多肽”意指如上所述的干扰素或IFN，以及保留至少一种天然产生的hIFN的生物活性的多肽。hIFN多肽包括其医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和天然产生的人类IFN的立体异构体，以及天然产生的人类IFN的促效剂、模拟剂和拮抗剂变异体及其多肽融合体。hIFN多肽的实例包括但不限于那些在美国专利第4,604,284、5,582,824、6,531,122、6,204,022、6,120,762、6,046,034、6,036,956、5,939,286、5,908,626、5,780,027、5,770,191、5,723,125、5,594,107、5,378,823、4,898,931、4,892,743号中所述的hIFN多肽，所述专利以引用的方式并入本文中。在氨基末端、羧基末端或两端包含额外氨基酸的融合体由术语“hIFN多肽”所涵盖。举例而言，例示性融合体包括但不限于甲硫氨酰基IFN(其中甲硫氨酸连接于由缺乏分泌信号肽或其部分的hIFN成熟形式的重组表达产生的hIFN的N末端)、用于纯化目的的融合体(包括但不限于与多聚组氨酸或亲和力抗原决定部位融合)、与血清白蛋白结合肽的融合体和与血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合体。全长和成熟形式的天然产生的hIFN核酸和氨基酸序列是已知的，诸如单一氨基酸变异体或剪接变异体的变异体同样已知。

复合干扰素为含有166个氨基酸的重组1型干扰素。复合IFN是通过扫描数种天然α干扰素的序列并将最通常观察到的氨基酸指派给各对应位置而得到。复合IFN当基于相等质量与IFNα-2a和α-2b在体外检定中进行比较时，其通常展示高出5-10倍的生物活性(Blatt等人，J.Interferon Cytokine Res.1996；16：489-99)。

关于完整全长天然产生的IFNα-2a氨基酸序列以及成熟天然产生的IFNα-2a氨基酸序列，请分别参看本文中的SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。在一些实施例中，本发明的hIFN多肽大体上与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25或干扰素多肽的任何其他序列相一致。编码hIFN突变体和突变型hIFN多肽的核酸分子是众所周知的，且包括但不限于那些公开于美国专利第6,331,525、6,069,133、5,955,307、5,869,293、5,831,062、5,081,022、5,004,689、4,738,931、4,686,191号中的核酸分子，所述专利以引用的方式并入本文中。hIFN突变体的实例包括那些公开于美国专利第6,514,729和5,582,824号中的突变体，所述专利以引用的方式并入本文中。

干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒、免疫调控和抗增殖特性，并且已被用作治疗剂以用于治疗诸如癌症和各种病毒疾病的疾病。已展示干扰素-α抑制各种类型的细胞增殖，且尤其适用于治疗与癌症紧密相关的各种细胞增殖病状，尤其是诸如白血病的血液恶性肿瘤。这些蛋白已经展示对抗多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、低恶度性淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、膀胱肿瘤和卵巢癌的抗增殖活性(Bonnem，E.M.等人，(1984)J.Biol.Response Modifiers 3：580；Oldham，R.K.(1985)Hospital Practice 20：71)。

IFNα适用于对抗各种类型的病毒感染(Finter，N.B.等人，(1991)Drugs42(5)：749)。干扰素α已展示对抗人类乳头状瘤病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎感染的活性(Finter，N.B.等人，1991，如上；Kashima，H.等人，(1988)Laryngoscope 98：334；Dusheiko，G.M.等人，(1986)J.Hematology 3(增刊2)：S199；Davis，G L等人，(1989)N.England J.Med.321：1501)。也已经研究干扰素和干扰素受体在某些自体免疫和发炎性疾病的发病机制中的作用(Benoit，P.等人，(1993)J.Immunol.150(3)：707)。此外，干扰素α已被批准用于治疗诸如毛细胞白血病、肾细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、AIDS相关卡波西氏肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿、尖锐湿疣、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎和慢性非甲型、非乙型/丙型肝炎的疾病。

干扰素已涉及于各种自体免疫疾病的发病机制中，诸如系统性红斑狼疮、自塞氏病(Behcet’s disease)和胰岛素依赖性糖尿病(IDDM，也称作I型糖尿病)。已经在转殖基因小鼠模型中证明IFN-α的β细胞表达可引起胰岛炎和IDDM，并且已提出IFN-α拮抗剂(包括抗体)可用于治疗IDDM(WO93/04699，1993年3月18日公开)。已经在多发性硬化(MS)患者中观察到受损的IFN-γ和IFN-α产生。已经在许多AIDS患者的血清中检测到IFN-α，并且已报导IFN-γ产生在源自AIDS患者的有丝分裂素刺激型单核细胞的悬浮液中受到显著抑制。关于评论例如请参看Interferons and other Regulatory Cytokines，Edward deMaeyer(1988，John Wiley and Sons publishers)中的第16章″The Presence andPossible Pathogenic Role of Interferons in Disease″。α和β干扰素已用于治疗急性病毒疾病带状疱疹(T.C.Merigan等人，N.Engl.J.Med.298，981-987(1978)；E.Heidemann等人，Onkologie 7，210-212(1984))、例如丙型肝炎和乙型肝炎感染的慢性病毒感染(R.L.Knobler等人，Neurology 34，1273078(1984)；M.A.Faerkkilae等人，Act.Neurol.Sci.69，184-185(1985))。rIFNα-2a(Roferon，Roche)为指定用于治疗毛细胞白血病和AIDS相关卡波西氏肉瘤的注射调配物。重组IFNα-2b(Intron A^TM，Schering)已被批准用于在某些患者中治疗毛细胞白血病、尖锐湿疣的所选病例、AIDS相关卡波西氏肉瘤、慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎感染。多种IFNα亚型的组合物也用于治疗各种疾病(Multiferon

，Viragen，Inc.)。IFNγlb(Actimmune，Intermune Pharmaceuticals，Inc.)为用于治疗慢性肉芽肿性疾病和恶性骨石化症的市售品。

在所属领域中已公开且已知I型IFN的生物活性，并且例如可发现于Pfeffer，Semin.Oncol.24(增刊9)，S9-63-S9-69(1997)和美国专利第6,436,391、6,372,218、6,270,756、6,207,145、6,086,869、6,036,949、6,013,253、6,007,805、5,980,884、5,958,402、5,863,530、5,849,282、5,846,526、5,830,456、5,824,300、5,817,307、5,780,021、5,624,895、5,480,640、5,268,169、5,208,019、5,196,191、5,190,751、5,104,653、5,019,382、5,959,210号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

IFNα为细胞激素基因的不同螺旋束总科的成员(Sprang，S.R.等人，(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3：815-827)。人类干扰素α是由在氨基酸水平上共有85-98％序列一致性的超过20种衔接复制的非等位基因的家族编码(Henco，K.等人，(1985)J.Mol.Biol.185：227-260)。人类IFNβ为具有约22kDa分子量的调控多肽，其是由166个氨基酸残基组成。其可由体内大部分细胞(尤其是成纤维细胞)应答病毒感染或暴露于其他药剂而产生。其结合到多聚性细胞表面受体，且产生型受体结合导致细胞内事件级联，从而引起IFNβ可诱导基因的表达，其接着产生可分类为抗病毒、抗增殖和免疫调控型的效应。

人类IFNβ的氨基酸序列是已知的并由Taniguchi，Gene 10：11-15，1980和在EP83069、EP41313和美国专利第4,686,191号中所报导，所述文献以引用的方式并入本文中。已分别报导人类和鼠类IFNβ的晶体结构(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11813-11818，1997；J.Mol.Biol.253：187-207，1995；美国专利第5,602,232、5,460,956、5,441,734、4,672,108号，所述文献以引用的方式并入本文中)。其已评论于Cell Mol.Life Sci.54：1203-1206，1998中。已报导IFNβ的变异体(WO95/25170、WO98/48018、美国专利第5,545,723号、美国专利第4,914,033号、EP260350、美国专利第4,588,585号、美国专利第4,769,233号；Stewart等人，DNA第6卷，第2期，1987，第119-128页；Runkel等人，1998，J.Biol.Chem.273，第14期，第8003-8008页，所述文献以引用的方式并入本文中)。已报导IFNβ在CHO细胞中的表达(美国专利第4,966,843号、美国专利第5,376,567号和美国专利第5,795,779号，其以引用的方式并入本文中)。已报导具有特定糖基化模式的IFNβ分子及其制备方法(EP 287075和EP 529300)。

IFNβ的商业制剂是以名称Betaseron(也称为干扰素β1b，其未经糖基化、是使用重组细菌细胞产生、具有N末端甲硫氨酸残基缺失和C17S突变)和Avonex^TM及Rebif(也称为干扰素β1a，其经糖基化、是使用重组哺乳动物细胞产生)销售，已经展示可有效降低恶化率，并且与经安慰剂治疗的患者相比，更多的患者在长时期内保持无恶化。此外，伤残的累积速率得以降低(Neurol.51：682-689，1998)。

已经在Pharmaceut.Res.15：641-649，1998中呈现IFNβ1a与β1b在结构和功能方面的比较。已展示IFNβ可延缓多发性硬化的进展，即中枢神经系统的前进性发炎性变性疾病的复发。IFNβ可对白细胞增殖和抗原呈现具有抑制效应。IFNβ可朝着消炎表型调节细胞激素产生概况。IFNβ可通过抑制T细胞基质金属蛋白酶的活性来减少T细胞迁移。这些活性很可能协调作用以引起MS中IFNβ的机制(Neurol.51：682-689，1998)。

IFNβ可用于治疗骨肉瘤、基底细胞癌、子宫颈非典型增生、神经胶质瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、乳癌、黑色素瘤和病毒感染，诸如乳头状瘤病毒、病毒性肝炎、生殖器疱疹、带状疱疹、疱疹性角膜炎、单纯疮疹、病毒性脑炎、巨细胞病毒肺炎和鼻病毒。各种副作用与当前IFNβ制剂的使用相关，包括注射部位反应、发烧、发冷、肌痛、关节疼痛及其他类流感症状(Clin.Therapeutics，19：883-893，1997)。

考虑到与当前IFNβ产品相关的众多副作用、其与频繁注射的联系、发展阻碍IFNβ的所要治疗效应的中和抗体的风险和获得更多最佳治疗IFNβ含量以及伴随的增强治疗效应的可能性，显然需要改良的类IFNβ分子。

如本文中所使用，“粒细胞群落刺激因子”或“G-CSF”应包括那些具有至少一种人类hG-CSF生物活性的多肽和蛋白(诸如在美国专利第6,716,606、6,689,351、6,565,841、6,162,426、5,811,301、5,776,895、5,718,893、5,580,755、5,536,495、5,202,117、5,043,156、4,999,291、4,810,643和4,968,618号中所描述者，其以引用的方式并入本文中)，以及其G-CSF类似物、G-CSF同功异型物、G-CSF模拟剂、G-CSF片段、杂交G-CSF蛋白、融合蛋白寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变异体和突变蛋白，而不管生物活性是否相同，且进一步不管其合成或制造方法为何种方法，包括但不限于重组(无论是产生自cDNA、基因组DNA、合成DNA还是其他形式的核酸)、合成、转殖基因和基因活化方法。G-CSF的特定实例包括但不限于聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)(NEULASTA

)、非格司亭(filgrastim)(NEUPOGEN

)、G-CSF类似物、G-CSF突变体、经改变的糖基化人类G-CSF和PEG接合的G-CSF类似物。用于表达内源性人类G-CSF的经修饰细胞系的特定实例描述于Devlin等人，J.Leukoc.Biol.41：306(1987)；美国专利第6,716,606、6,379,661、6,004,548、5,830,705、5,582,823、4,810,643和6,242,218号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

术语“人类G-CSF(hG-CSF)”或“hG-CSF多肽”意指如上所述的粒细胞群落刺激因子或G-CSF，以及保留至少一种天然产生的hG-CSF的生物活性的多肽。hG-CSF多肽包括其医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和天然产生的人类G-CSF的立体异构体，以及天然产生的人类G-CSF的促效剂、模拟剂和拮抗剂变异体及其多肽融合体。hG-CSF多肽和模拟剂的实例包括在美国专利第6,716,606、6,689,351、6,565,841、6,162,426、5,824,784、5,811,301、5,776,895、5,718,893、5,202,117、5,043,156、4,968,618、6,630,470、6,346,531号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中。在氨基末端、羧基末端或两端包含额外氨基酸的融合体由术语“hG-CSF多肽”所涵盖。举例而言，例示性融合体包括但不限于甲硫氨酰基G-CSF(其中甲硫氨酸连接于由缺乏分泌信号肽的hG-CSF成熟形式的重组表达产生的hG-CSF(诸如SEQ ID NO：29的多肽)的N末端)、用于纯化目的的融合体(包括但不限于与多聚组氨酸或亲和力抗原决定部位融合)、与血清白蛋白结合肽的融合体和与血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合体。在SEQ IDNO：29的第1位的甲硫氨酸置换在天然产生的hG-CSF成熟形式中发现的丙氨酸。全长和成熟形式的天然产生的hG-CSF核酸和氨基酸序列是已知的，诸如单一氨基酸变异体和剪接变异体的变异体同样已知。关于完整全长天然产生的hG-CSF氨基酸序列以及成熟甲硫氨酰基hG-CSF氨基酸序列以及剪接变异体，请分别参看本文中的SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30。关于天然产生的hG-CSF单一氨基酸序列变异体，请参看本文中的SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36。在一些实施例中，本发明的hG-CSF多肽大体上与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36相一致。编码hG-CSF突变体和突变型hG-CSF多肽的核酸分子同样是已知的。hG-CSF突变体的实例包括那些公开于美国专利第6,489,293、6,153,407、6,048,971、5,614,184、5,416,195、5,399,345和5,457,089号中的突变体，所述专利以引用的方式并入本文中。

粒细胞群落刺激因子或hG-CSF具有多种生物活性，包括但不限于与其受体结合、引起其受体的二聚作用、刺激中性白细胞产生和刺激细胞增殖及分化。粒细胞群落刺激因子和hG-CSF的一些生物活性的实例是如上所述并描述于美国专利第6,676,947、6,579,525、6,531,121、6,521,245、6,489,293、6,368,854、6,316,254、6,268,336、6,239,109、6,165,283、5,986,047、5,830,851、5,043,156和5,773,569号中，所述专利以引用的方式并入本文中。

hG-CSF的生物活性片段/变异体包括但不限于含有207或204个(丢失V66、S67和E68的剪接变异体)氨基酸的基因产物，所述氨基酸中最先30个在分泌期间裂解(Nagata等人，Nature 319：415(1986)；Souza等人，Science 232：61(1986))。

如本文中所使用，“促红细胞生成素”或“EPO”应包括那些具有至少一种EPO生物活性的多肽和蛋白，以及人类EPO(hEPO)、促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素同功异型物(诸如在美国专利第5,856,298号中所述者，其以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素模拟剂(诸如在美国专利第6,310,078号中所述者，其以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素片段、杂交促红细胞生成素蛋白、融合蛋白寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变异体和突变蛋白，而不管生物活性是否相同，且进一步不管其合成或制造方法为何种方法，包括但不限于重组(无论是产生自cDNA还是基因组DNA)、合成(美国专利第6,552,167、6,001,364、6,174,530、6,217,873、6,663,869、6,673,347号；WO00/12587，其以引用的方式并入本文中)、转殖基因和基因活化方法。非人类EPO的特定实例包括但不限于牛、犬(美国专利第6,696,411号)、猫、灵长类(美国专利第6,555,343和6,831,060号)、猪和马EPO。也参看Wen等人，″Erythropoietin structure-function relationships：high degree of sequence homologyamong mammals,″Blood，(1993)82：1507-1516 for an analysis of EPO sequencesfrom a variety of mammals including horse，pig，cat，and sheep和Lin等人.″Monkey erythropoietin gene：cloning，expression and comparison with the humanerythropoietin gene,″Gene，(1986)44(2-3)：201-9。所有引用都以引用的方式并入本文中。促红细胞生成素的特定实例包括但不限于阿法依泊汀(epoetin alfa)(诸如在美国专利第4,667,016、4,703,008、5,441,868、5,547,933、5,618,698、5,621,080、5,756,349和5,955,422号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)(诸如在欧洲专利申请案EP640619中所述者)、DYNEPO^TM(德尔塔依泊汀(epoetin delta))、人类促红细胞生成素类似物(诸如在国际专利申请案WO99/66054和美国专利第6,548,653和5,888,772号中所述的人类血清白蛋白融合蛋白，所述文献以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素突变体(诸如在国际专利申请案WO99/38890和美国专利第6,489,293、5,888,772、5,614,184和5,457,089号中所述者，所述文献以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素ω(其可由美国专利第5,688,679、6,099,830、6,316,254和6,682,910号中所述的人类促红细胞生成素基因的Apa I限制片段产生，所述专利以引用的方式并入本文中)、经改变的糖基化人类促红细胞生成素(诸如在国际专利申请案WO99/11781和EP1064951中所述者)和PEG接合的促红细胞生成素类似物(诸如在WO98/05363和美国专利第5,643,575、6,583,272、6,340,742和6,586,398号中所述者，所述文献以引用的方式并入本文中)。用于表达内源性人类促红细胞生成素的经修饰细胞系的特定实例描述于国际专利申请案WO99/05268和WO94/12650和美国专利第6,376,218号中，其以引用的方式并入本文中。

术语“人类促红细胞生成素(hEPO)”或“hEPO多肽”意指如上所述的促红细胞生成素或EPO，以及保留至少一种天然产生的hEPO的生物活性的多肽。hEPO多肽包括其医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和天然产生的人类促红细胞生成素的立体异构体，以及天然产生的人类促红细胞生成素的促效剂、模拟剂和拮抗剂变异体及其多肽融合体。hEPO多肽和模拟剂的实例包括在美国专利第6,310,078、5,106,954、6,703,480、6,642,353、5,986,047和5,712,370号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中。在氨基末端、羧基末端或两端包含额外氨基酸的融合体由术语“hEPO多肽”所涵盖。举例而言，例示性融合体包括但不限于甲硫氨酰基促红细胞生成素(其中甲硫氨酸连接于hEPO的N末端)、用于纯化目的的融合体(包括但不限于与多聚组氨酸或亲和力抗原决定部位融合)、与血清白蛋白结合肽的融合体和与血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合体。天然产生的hEPO核酸和氨基酸序列是已知的。关于完整全长天然产生的hEPO氨基酸序列以及成熟天然产生的hEPO氨基酸序列和成熟EPO的突变体，请分别参看本文中的SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39。在一些实施例中，本发明的hEPO多肽大体上与SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39相一致。编码hEPO突变体和突变型hEPO多肽的核酸分子同样是已知的。hEPO突变体的实例包括那些公开于美国专利第6,489,293、6,153,407、6,048,971、5,614,184和5,457,089号中的突变体，所述专利以引用的方式并入本文中。

促红细胞生成素或hEPO具有多种生物活性，包括但不限于与其受体结合、引起其受体的二聚作用、刺激红血球产生和刺激细胞增殖。促红细胞生成素和hEPO的一些生物活性的实例描述于美国专利第6,676,947、6,579,525、6,531,121、6,521,245、6,489,293、6,368,854、6,316,254、6,268,336、6,239,109、6,165,283、5,986,047、5,830,851和5,773,569号中，所述专利以引用的方式并入本文中。

各种参考案公开通过聚合物接合或糖基化对多肽进行修饰。术语“4HB多肽”包括接合到诸如PEG的聚合物的多肽，并且可包含一种或一种以上半胱氨酸、赖氨酸或其他残基的额外衍生。此外，4HB多肽可包含连接子或聚合物，其中连接子或聚合物所接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或者可使用所属领域中已知的技术接合到天然编码氨基酸，诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合。

已报导hGH多肽的聚合物接合。例如参看美国专利第5,849,535、6,136,563和6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。已报导天然IFNβ或其C17S变异体的聚合物修饰(EP229108、美国专利第5,382,657号、EP593868、美国专利第4,917,888号和WO99/55377，其以引用的方式并入本文中)。美国专利第4,904,584号公开耗尽聚乙二醇化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已经缺失或由任何其他氨基酸残基所置换。WO99/67291公开用于接合蛋白与PEG的方法，其中缺失蛋白上的至少一个氨基酸残基并在足以实现与蛋白接合的条件下以PEG接触蛋白。WO99/03887公开属于生长激素总科的多肽的聚乙二醇化变异体，其中半胱氨酸残基已由位于多肽指定区域内的非必需氨基酸残基所取代。聚乙二醇化IFN分子的实例包括那些公开于美国专利第6,524,570、6,250,469、6,180,096、6,177,074、6,042,822、5,981,709、5,951,974、5,908,621、5,738,846、5,711,944、5,382,657号中的分子，所述专利以引用的方式并入本文中。IFNβ被提及作为属于生长激素总科的多肽的一个实例。WO00/23114公开糖基化及聚乙二醇化IFNβ。WO00/23472公开IFNβ融合蛋白。WO00/26354公开产生糖基化多肽变异体的方法，所述多肽变异体与包含至少一个额外糖基化位点的母体多肽相比具有降低的致过敏性。美国专利第5,218,092号公开对粒细胞群落刺激因子(G-CSF)及其他多肽进行修饰以便与天然多肽相比引入至少一个额外的碳水化合物链。IFNβ被公开作为可根据美国专利第5,218,092号中所述技术加以修饰的许多多肽中的一个实例。

术语“4HB多肽”也包括与N连接或与O连接的糖基化形式的多肽。这些形式包括但不限于在SEQ ID NO：23的第129位或SEQ ID NO：24或25的等效位置具有与O连接的糖基化位点的多肽，或任何其他IFN多肽(Adolf等人，BiochemJ.276：511(1991))。术语“hG-CSF多肽”也包括糖基化形式的多肽，其包括但不限于在SEQ ID NO：29的第134位具有与O连接的糖基化位点的多肽(J.Chromatogr.A 637：55-62(1993))。术语“hEPO多肽”也包括在第24、38和83位具有与N连接的糖基化位点和在第126位具有与O连接的糖基化位点的糖基化形式(Takeuchi等人，(1988)JBC 263：3657-3663；Saski等人，(1988)Biochemistry27：8618-8626)。

含有单一核苷酸改变的变异体也被视为4HB多肽的生物活性变异体。此外，也包括剪接变异体。术语“4HB多肽”也包括任何一种或一种以上4HB多肽的4HB多肽异质二聚体、同型二聚体、异质多聚体或同型多聚体，或任何其他多肽、蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、配位体或任何类型的其他活性分子(其由化学方式连接或表达为融合蛋白)以及含有例如保持生物活性的特异性缺失或其他修饰的多肽类似物。含有单一核苷酸改变(即L127M和A144T)的变异体也被视为hG-CSF的生物活性变异体(参看SEQ ID NO：35和36)。此外，也包括剪接变异体，诸如但不限于SEQ ID NO：30中所示的变异体，其丢失SEQID NO：28的V66、S67和E68。术语“hG-CSF多肽”也包括任何一种或一种以上hG-CSF的hG-CSF异质二聚体、同型二聚体、异质多聚体或同型多聚体，或任何其他多肽、蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、配位体或任何类型的其他活性分子(其由化学方式连接或表达为融合蛋白)(美国专利第6,261,550、6,166,183、6,204,247、6,261,550、6,017,876号，其以引用的方式并入本文中)以及含有例如保持生物活性的特异性缺失或其他修饰的多肽类似物(美国专利第6,261,550、6,004,548、6,632,426号，其以引用的方式并入本文中)。hEPO的生物活性片段/变异体包括含有193个氨基酸的基因产物，所述氨基酸中最先27个在分泌期间裂解(Jacobs等人，(1985)Nature 313：806-810；Lin等人(1985)PNAS，USA 82：7580-7584)(SEQ ID NO：38)，以及在形成成熟形式的促红细胞生成素期间最后四个氨基酸中的一个或一个以上去除。含有单一核苷酸改变(即S104N和L105F、P122Q、E13Q、Q58-＞QQ、G113R)的变异体也被视为hEPO的生物活性变异体(Jacobs等人，(1985)Nature 313：806-810；Funakoshi等人，(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.195：717-722)。术语“hEPO多肽”也包括任何一种或一种以上hEPO的hEPO异质二聚体、同型二聚体、异质多聚体或同型多聚体，或任何其他多肽、蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、配位体或任何类型的其他活性分子，其由化学方式连接或表达为融合蛋白(Sytkowski等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(3)：1184-8；和Sytkowski等人，(1999)J.Biol.Chem.274(35)：24773-8，和美国专利第6,187,564、6,703,480、5,767,078号，其以引用的方式并入本文中)以及含有例如保持生物活性的特异性缺失的多肽类似物(Boissel等人，(1993)JBC 268：15983-15993；Wen等人，(1994)JBC 269：22839-22846；Bittorf等人，(1993)FEBS 336：133-136；和美国专利第6,153,407号，其以引用的方式并入本文中)。

除非另外说明(即，当声称比较是基于SEQ ID NO：1、3或其他hGH序列时)，否则对于本文所述的hGH中氨基酸位置的所有引用都是基于SEQ ID NO：2中的位置。除非另外说明(即，当声称比较是基于SEQ ID NO：23、25或其他hIFN序列时)，否则对于本文所述的hIFN中氨基酸位置的所有引用都是基于SEQ ID NO：24中的位置。除非另外说明(即，当声称比较是基于SEQ ID NO：28、30、35、36或其他hG-CSF序列时)，否则对于本文所述的hG-CSF中氨基酸位置的所有引用都是基于SEQ ID NO：29中的位置。除非另外说明(即，当声称比较是基于SEQ ID NO：37、39或其他hEPO序列时)，否则对于本文所述的hEPO中氨基酸位置的所有引用都是基于SEQ ID NO：38中的位置。所属领域的技术人员将了解，对应于SEQ ID NO：1、2、3或任何其他GH序列中的位置的氨基酸位置可在任何其他hGH分子(诸如hGH融合体、变异体、片段等)中容易地鉴别。举例而言，诸如BLAST的序列比对程序可用于比对和鉴别蛋白中对应于SEQ ID NO：1、2、3或其他GH序列中的位置的特定位置。本文中关于SEQ IDNO：1、2、3或其他GH序列所描述的氨基酸取代、缺失或添加也意欲意指在本文所述或所属领域中已知的hGH融合体、变异体、片段等的对应位置中的取代、缺失或添加，且其为本发明所明确涵盖。类似的鉴别和分析适用于SEQ ID NO：23、24、25或任何其他IFN序列SEQ ID NO：28、29、30、35、36或任何其他hG-CSF序列SEQ ED NO：37、38、39或任何其他EPO序列。

术语“4HB多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的四螺旋束多肽。本发明的4HB多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸的修饰连同一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已描述在天然产生的4HB多肽中的多种氨基酸位置上的例示性取代，其包括但不限于调节4HB多肽的生物活性中的一种或一种以上的取代，诸如但不限于增加促效剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转变为拮抗剂等，且其由术语“4HB多肽”所涵盖。

人类GH拮抗剂包括但不限于在1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127具有取代或在第1位(即N-末端)具有添加或其任何组合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1、3或任何其他GH序列中的对应氨基酸)的拮抗剂。在一些实施例中，hGH拮抗剂在以下区域中包含至少一个取代使得GH充当拮抗剂：1-5(N-末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C-末端)。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，以非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代G120。在其他实施例中，将上述取代与使得hGH多肽成为hGH拮抗剂的额外取代相组合。举例而言，在本文所鉴别的位置之一处取代非天然编码氨基酸并在G120引入同时取代(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与存在于hGH分子的受体结合区内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

人类IFN拮抗剂包括但不限于那些在2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合(SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：23、25或任何其他IFN序列中的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂；视所选位点和所要活性而定，包含这些取代中的一者的hIFN多肽可能充当弱拮抗剂或弱促效剂。人类IFN拮抗剂包括但不限于那些在22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合(hIFN；SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂。在一些实施例中，hIFN拮抗剂在以下区域中包含至少一个取代使得IFN充当拮抗剂：1-9(N-末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C-末端)。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在其他实施例中，将上述取代与使得hIFN多肽成为hIFN拮抗剂的额外取代相组合。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包含与存在于hIFN分子的受体结合区内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

人类G-CSF拮抗剂包括但不限于那些在6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145或其任何组合(SEQ ID NO：29，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂。在一些实施例中，hG-CSF拮抗剂在区域6-30、40-70或105-130中包含至少一个取代使得G-CSF充当拮抗剂。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，以非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代L70。在其他实施例中，将上述取代与使得hG-CSF多肽成为hG-CSF拮抗剂的额外取代相组合。举例而言，在本文所鉴别的位置之一上取代非天然编码氨基酸并在L70引入同时取代。在一些实施例中，hG-CSF拮抗剂包含与存在于hG-CSF分子的受体结合区内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

人类EPO拮抗剂包括但不限于那些在2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159或其任何组合(hEPO；SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：37或39的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂。在一些实施例中，hEPO拮抗剂在区域10-15或100-108中包含至少一个取代使得EPO充当拮抗剂。参看Elliott等人，(1997)Blood 89：493-502和Cheetham等人，(1998)Nature StructuralBiology 5：861-866。在一些实施例中，通过含有以下取代中的一个或一个以上来修饰hEPO多肽：在低亲和力受体结合位点(位点2)中所发现的V11S、R14Q、Y15I、S100E、R103A、SI041和L108K。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，以非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代L108。在其他实施例中，将上述取代与使得hEPO多肽成为hEPO拮抗剂的额外取代相组合。举例而言，在本文所鉴别的位置之一上取代非天然编码氨基酸并在L108引入同时取代(包括但不限于L108K、L10SR、L108H、L108D或L108E)。在一些实施例中，hEPO拮抗剂包含与存在于hEPO分子的位点2结合区内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，4HB多肽进一步包含调节4HB多肽生物活性的添加、取代或缺失。举例而言，所述添加、取代或缺失可调节对4HB多肽受体的亲和力、调节(包括但不限于增加或降低)受体二聚作用、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节治疗剂半衰期、调节多肽稳定性、调节剂量、调节释放或生物利用性、有利于纯化或者改良或改变特定投与途径。类似地，4HB多肽可包含改良多肽检测(包括但不限于GFP)、纯化或其他特征的蛋白酶裂解序列、反应基、抗体结合域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或经连接的分子(包括但不限于生物素)。

术语“4HB多肽”也涵盖连接于(包括但不限于经由非天然编码氨基酸侧链直接连接)相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、连接于天然编码氨基酸侧链或经由连接子间接连接的异质二聚体、同型二聚体、异质多聚体或同型多聚体。例示性连接子包括但不限于诸如聚(乙二醇)或多葡聚糖或多肽的水溶性聚合物。

“非天然编码氨基酸”意指并非20种常见氨基酸其中一种或脯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义地使用的其他术语为“非天然氨基酸”、“非天然产生氨基酸”及其各种带连字符和不带连字符的变体。术语“非天然编码氨基酸”也包括但不限于以下氨基酸：其是通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或脯赖氨酸和硒代半胱氨酸)来产生，但其自身并不由翻译复合体天然并入生长中的多肽链中。所述非天然产生氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸基酪氨酸。

“氨基末端修饰基”意指可连接于多肽氨基末端的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基”意指可连接于多肽羧基末端的任何分子。末端修饰基包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白(诸如血清白蛋白)或其他增加肽的血清半衰期的部分。

术语“官能基”、“活性部分”、“活化基”、“离去基”、“反应位点”、“化学反应基”和“化学反应性部分”在所属领域和本文中是用于意指独特的可定义的分子部分或单元。所述术语在化学领域中有点同义，并在本文中用于指示执行某些功能或活性且对其他分子具反应性的分子部分。

术语“键合”或“连接子”在本文中用于意指作为化学反应的结果而通常形成的基团或键且通常为共价键合。对水解稳定的键合意谓键合在水中大体上稳定且在延长时期内(也许甚至是无限长)不与水在适用pH值下(包括但不限于在生理条件下)反应。对水解不稳定的或可降解的键合意谓键合在水中或水溶液(例如包括血液)中是可降解的。对酶解不稳定的或可降解的键合意谓键合可由一种或一种以上的酶降解。如所属领域中所了解，PEG和相关聚合物可在聚合物骨架中或聚合物骨架与聚合物分子的末端官能基中一个或一个以上之间的连接子基团中包括可降解的键合。举例而言，通过将PEG羧酸或经活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键在生理条件下通常水解以释放药剂。其他可水解降解的键合包括但不限于：碳酸酯键合；由胺与醛反应而产生的亚胺键合；由醇与磷酸根基团反应而形成的磷酸酯键合；为酰肼与醛的反应产物的腙键合；为醛与醇的反应产物的缩醛键合；为甲酸根与醇的反应产物的原酸酯键合；由包括但不限于在诸如PEG的聚合物末端的胺基团与肽的羧基形成的肽键合；和由包括但不限于在聚合物末端的亚磷酰胺基团与寡核苷酸的5’羟基形成的寡核苷酸键合。

术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”当在本文中使用时意谓可影响生物有机体的任何物理或生化特性的任何物质，所述有机体包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人类。特定而言，如本文所用的生物活性分子包括但不限于意欲用于在人类或其他动物中诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或另外用于增强人类或动物的身体或精神状况的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白、酶、小分子药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶粒。适用于本发明的生物活性剂类别包括但不限于抗生素、杀真菌剂、抗菌剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管药剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇药剂等等。

“双官能聚合物”意指包含两个能够与其他部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异反应以形成共价或非共价键合的分离官能基的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能基和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的接合物。用于将各种化合物连接于肽的许多程序和连接子分子是已知的。例如参看欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784、4,680,338、4,569,789和4,589,071号，其以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”意指包含两个或两个以上能够与其他部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异反应以形成共价或非共价键合的分离官能基的聚合物。

当取代基由其从左往右书写的常规化学式加以说明时，其同等地涵盖通过从右往左书写结构而得到的化学上一致的取代基，例如结构-CH₂O-等效于结构-OCH₂-。

术语“取代基”包括但不限于“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”为那些生成稳定化合物的取代基。合适的非干扰性取代基或基团包括但不限于卤基、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₂芳烷基、C₁-C₁₂烷芳基、C₃-C₁₂环烷基、C₃-C₁₂环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、C₂-C₁₂烷氧基烷基、C₂-C₁₂烷氧基芳基、C₇-C₁₂芳氧基烷基、C₇-C₁₂氧芳基、C₁-C₆烷基亚磺酰基、C₁-C₁₀烷基磺酰基、-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO₂、-CN、-NRC(O)-(C₁-C₁₀烷基)、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)、C₂-C₁₀烷基硫烷基、-C(O)O-(C₁-C₁₀烷基)、-OH、-SO₂、＝S、-COOH、-NR₂、羰基、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)-CF₃、-C(O)-CF₃、-C(O)NR₂、-(C₁-C₁₀芳基)-S-(C₆-C₁₀芳基)、-C(O)-(C₁-C₁₀芳基)、-(CH₂)_m-O-(-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)(其中各m都为1到8)、-C(O)NR₂、-C(S)NR₂、-SO₂NR₂、-NRC(O)NR₂、-NRC(S)NR₂、其盐等等。本文中所用的各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。

术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。

除非另外说明，否则术语“烷基”自身或作为另一取代基的部分时意谓直链或支链或环状烃基或其组合，其可完全饱和、单或多不饱和，且可包括具有指定碳原子数目(即C₁-C₁₀意谓1到10个碳)的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等等的基团。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-及3-丙炔基、3-丁炔基和更高碳数同系物和异构体。除非另外指定，否则术语“烷基”也意谓包括那些在下文详细定义的烷基衍生物，诸如“杂烷基”。仅限为烃基的烷基被称为“同型烷基”。

术语“亚烷基”自身或作为另一取代基的部分时意谓源自烷烃的二价基团(例如但不限于结构-CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂-)，且进一步包括那些在下文被描述为“杂亚烷基”的基团。烷基(或亚烷基)通常具有1到24个碳原子，其中那些具有10个或更少碳原子的基团在本发明中是优选的。“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”为较短链烷基或亚烷基，其通常具有8个或更少的碳原子。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)以其常规含义使用，且意指那些经由氧原子、氨基或硫原子分别连接于分子剩余部分上的烷基。

除非另外说明，否则术语“杂烷基”自身或与另一术语组合时意谓稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其是由指定数目的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N、S和Si可置于杂烷基的任何内部位置或置于烷基连接于分子剩余部分的位置。实例包括但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH2-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“杂亚烷基”自身或作为另一取代基的部分时意谓源自杂烷基的二价基团(例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-)。对于杂亚烷基而言，相同或不同的杂原子也可占据一个或两个链末端(包括但不限于亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基而言，连接基的式所书写的方向并不表明连接基的方位。举例而言，式-C(O)₂R’-代表-C(O)₂R’-和-R’C(O)₂-。

除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或与其他术语组合时分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状变体。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和和不饱和环键合。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可占据杂环连接于分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、匹氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语“杂环亚烷基”自身或作为另一取代基的部分时意谓衍生自杂环烷基的二价基团，且术语“环亚烷基”自身或作为另一取代基的部分时意谓衍生自环烷基的二价基团。

如本文中所使用，术语“水溶性聚合物”意指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与4HB多肽的键合可导致改变，包括但不限于增加或调节的血清半衰期、或相对于未经修饰形式增加或调节的治疗剂半衰期、调节的免疫原性、调节的物理缔合特征(诸如聚集和多聚体形成)、改变的受体结合和改变的受体二聚或多聚作用。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其自身生物活性。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C₁-C₁₀烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚顺丁烯二酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。

如本文中所使用，术语“聚亚烷基二醇”或“聚(亚烷基二醇)”意指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”涵盖线性及分枝聚合物和介于0.1kDa与100kDa之间的平均分子量。举例而言，其他例示性实施例列举于商业供应商目录中，诸如Shearwater Corporation目录″Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications″(2001)。

除非另外说明，否则术语“芳基”意谓多不饱和的芳族烃取代基，其可为单环或稠合到一起或共价连接的多环(优选为1到3个环)。术语“杂芳基”意指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子视情况经氧化，且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可经由杂原子连接于分子剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。用于上述各芳基和杂芳基环系统的取代基是选自由下文所述的可接受取代基组成的群组。。

为简便起见，术语“芳基”当与其他术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)组合使用时包括如上所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意谓包括那些其中芳基连接于烷基的基团(包括但不限于苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其包括那些其中碳原子(包括但不限于亚甲基)已被例如氧原子置换的烷基(包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等)。

各上述术语(包括但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都意谓包括经取代及未经取代形式的指定基团。下文提供用于每种类型基团的例示性取代基。

用于烷基和杂烷基(包括那些通常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基可为选自但不限于以下基团的多种基团中的一个或一个以上：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R

、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R

)＝NR

′、-NR-C(NR’R”)＝NR

、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，数目在0到(2m’+1)的范围内，其中m’为所述基团中碳原子的总数目。R’、R”、R和R′各自独立地意指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，举例而言，各R基团都是独立选择，当存在R’、R”、R

和R

′基团的一个以上时，各R’、R”、R

和R

′基团情况同上。当R’和R”连接于相同氮原子时，其可与氮原子组合以形成5、6或7元环。举例而言，-NR’R”意谓包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的以上讨论，所属领域的技术人员将了解术语“烷基”意谓包括如下基团：其包括结合到除氢基之外的基团的碳原子，诸如卤代烷基(包括但不限于-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括但不限于-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等)。

类似于对于烷基所述的取代基，用于芳基和杂芳基的取代基可有所不同且是选自但不限于：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R

、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R

、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R

)＝NR

′、-NR-C(NR’R”)＝NR

、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂、-R’、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，数目在0到芳族环系统上开放化合价的总数目的范围内，且其中R’、R”、R

和R′是独立选自卤素、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，举例而言，各R基团都是独立选择，当存在R’、R”、R

和R

′基团的一个以上时，各R’、R”、R

和R

′基团情况同上。

如本文中所使用，术语“调节的血清半衰期”意谓经修饰的生物活性分子相对于其非修饰形式在循环半衰期上的正性或负性改变。血清半衰期是通过在投与生物活性分子之后的各个时间点采血样并测定各样品中所述分子的浓度来测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。增加的血清半衰期理想地具有至少约2倍的血清半衰期，但更小的增加可能适用，例如其中其促成令人满意的给药方案或避免毒性效应。在一些实施例中，所述增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。

如本文中所使用的术语“调节的治疗剂半衰期”意谓治疗有效量的经修饰的生物活性分子相对于其非修饰形式在半衰期上的正性或负性改变。治疗剂半衰期是通过在投与之后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效学特性来测量。增加的治疗剂半衰期理想地促成特定的有益给药方案、特定的有益总剂量或避免不当效应。在一些实施例中，增加的治疗剂半衰期是由增加的效力、增加或降低的经修饰分子与其靶的结合或非修饰分子的作用的另一参数或机制增加或降低而引起。

术语“经分离”当用于核酸或蛋白时，其表示核酸和蛋白大体上不含与其天然状态相关的其他细胞组分。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态或为溶液形式，其包括但不限于水溶液。纯度和均质度通常是使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法的分析化学技术来测定。为制剂中所存在的主要物质的蛋白大体上经纯化。特定而言，经分离基因是从包围基因两侧并编码除相关基因之外的蛋白的开放阅读框分离而来。术语“经纯化”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中大体上达到一条带。特定地，其意谓核酸或蛋白具有至少85％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度、至少99％纯度或更高纯度。

术语“核酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“氨基酸”意指天然产生及非天然产生氨基酸，以及以类似于天然产生氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟剂。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及脯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物意指具有与天然产生氨基酸相同的基础化学结构的化合物，即α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基团(诸如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然产生氨基酸相同的基础化学结构。

可以氨基酸的通常已知的三字母符号或以由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来引用氨基酸。同样可以核苷酸的通常可接受的单字母代码来引用核苷酸。

“经保守修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列而言，“经保守修饰的变异体”意指以下核酸：其编码一致或基本上一致的氨基酸序列或其中核酸并不将氨基酸序列编码成基本上一致的序列。因为遗传密码的简并，所以许多功能一致的核酸编码任何给定蛋白。举例而言，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在以密码子说明丙氨酸的每个位置，密码子都可经改变为所述的任何对应密码子而不会改变所编码的多肽。所述核酸变体为“沉默变体”，其为一种种类的经保守修饰的变体。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述每个可能的核酸沉默变体。所属领域的技术人员将认识到核酸中的各密码子(除AUG外，其为通常用于甲硫氨酸的唯一密码子，以及除TGG外，其为通常用于色氨酸的唯一密码子)都可经修饰以生成功能一致的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变体在各所述序列中是隐含的。

关于氨基酸序列，所属领域的技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸)为“经保守修饰的变异体”，其中所述改变导致氨基酸经化学上类似的氨基酸所取代。提供功能类似的氨基酸的保守取代表在所属领域中是众所周知的。所述经保守修饰的变异体是在本发明的多形态变异体、种间同系物和等位基因的范围之外但并不将其排除在外。

以下8组各自含有对另一氨基酸而言为保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(Y)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)

(例如参看Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月))。

在两种或两种以上核酸或多肽序列的上下文中的术语“一致”或“一致性”百分比意指两种或两种以上序列或子序列相同。当使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测在比较窗口或所测量的指定区域上比较及比对最大对应性时，如果序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(即在指定区域上有约60％一致性，视情况为约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)，那么序列是“大体上一致的”。这一定义也意指测试序列的互补。在至少约50个氨基酸或核苷酸长度的区域上或在75-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上可存在一致性，或者在未指定时，在整个序列或多核苷酸或多肽中可存在一致性。

对于序列比较而言，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要则指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

如本文所用的“比较窗口”包括对具有选自由以下数目组成的群组的邻近位置数目之一的节段的引用：20到600个、通常为约50到约200个、更通常为约100到约150个，其中可在序列与具有相同数目的邻近位置的参考序列最佳比对之后将它们进行比较。用于比较的序列的比对方法在所属领域中是众所周知的。可包括但不限于以Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、以Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、以Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’I.Acad.Sci.USA 85：2444的类似度方法的研究、以所述算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者以手动比对及目测(例如参看Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995增刊))进行用于比较的序列的最佳比对。

适用于测定序列一致性百分比和序列类似度的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公共地获得。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3且期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 89：10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及比较两条链。在执行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”筛选程序。

BLAST算法也执行两个序列之间类似度的统计分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法所提供的一种类似度测量法为最小总和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。举例而言，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，那么认为核酸与参考序列类似。

短语“选择性(或特异性)杂交到”意指当在复合混合物中存在特定核苷酸序列时，分子在严谨杂交条件下仅与所述序列结合、形成双螺旋或杂交(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)。

短语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针将杂交到核酸的复合混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的其目标子序列上，但并不杂交到复合混合物中的其他序列上。严谨条件是序列依赖性的并且在不同环境中将有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。对于核酸杂交的详尽指导发现于Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短探针(包括但不限于10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括但不限于大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培育，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

如本文中所使用，术语“真核生物”意指属于种系发生真核领域的有机体，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。

如本文所使用，术语“非真核生物”意指非真核有机体。举例而言，非真核有机体可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌、嗜热细菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等)种系发生领域，或古细菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌属NRC-1)、嗜超高温硫酸根还原古细菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、霍氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热古菌(Aeuropyrum pernix)等)种系发生领域。

本文中所用的术语“受检者”意指为治疗、观察或实验对象的动物，优选为哺乳动物，最优选为人类。

本文中所使用的术语“有效量”意指所投与的(经修饰)非天然氨基酸多肽的量，其在一定程度上减轻所治疗疾病、病症或病状的症状中的一种或一种以上。可投与含有本文所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以用于预防型、增强型和/或治疗型治疗。

术语“增强”意谓在效力或持续时间上增加或延长所要效应。因此，关于增强治疗剂的效应，术语“增强”意指在效力或持续时间上增加或延长其他治疗剂对系统的效应的能力。本文所用的“增强有效量”意指足以增强另一治疗剂在所要系统中的效应的量。当在患者中使用时，可有效用于这一用途的量将取决于疾病、病状或病症的严重性和病程、先前疗法、患者健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断。

本文中所用的术语“经修饰”意指在多肽上存在翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语意谓所讨论的多肽视情况经修饰，即所讨论的多肽可经修饰或未经修饰。

术语“经翻译后修饰”和“经修饰”意指在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后对所述氨基酸的任何修饰。仅以实例说明之，所述术语涵盖共翻译体内修饰、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。

在预防型应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易患特定疾病、病状或病症或者有患特定疾病、病状或病症的风险的患者。所述量被定义为“预防有效量”。在这一用途中，精确量也取决于患者健康状况、重量等等。所属领域的技术人员充分了解以常规实验(例如剂量不断提升临床试验)确定所述预防有效量。

术语“经保护”意指存在阻止化学反应性官能基在特定反应条件下反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护化学反应基的类型而变化。举例而言，如果化学反应基为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。如果化学反应基为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基为诸如丁酸或丙酸的羧酸或羟基，那么保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属领域中已知的其他保护基也可用于本文所述的方法和组合物。

仅以实例说明之，封端基/保护基可选自：

其他保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，New York，NY，1999中，其以全文引用的方式并入本文中。

在治疗型应用中，以足以治愈或至少部分阻滞疾病、病状或病症的症状的量，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与已患有所述疾病、病症或病状的患者。所述量被定义为“治疗有效量”，并且将取决于疾病、病状或病症的严重性和病程、先前疗法、患者健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断。所属领域的技术人员充分了解以常规实验(例如剂量不断提升临床试验)确定所述治疗有效量。

术语“治疗”用以意指预防型和/或治疗型治疗。

除非另外指定，否则使用所属领域的技术人员所了解的常规方法，诸如质谱分析、NMR、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学。

附图说明

图1展示四螺旋束(4HB)蛋白的通用结构。

图2展示四螺旋束蛋白生长激素(GH)的通用结构。

图3展示四螺旋束蛋白促红细胞生成素(EPO)的通用结构。

图4展示四螺旋束蛋白干扰素α-2(IFNα-2)的通用结构。

图5展示四螺旋束蛋白粒细胞群落刺激因子(G-CSF)的通用结构。

图6展示库马斯蓝(Coomassie blue)染色SDS-PAGE，其证明在以下各个位置上包含非天然编码氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的hGH的表达：Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143或K145。

图7画面A和B展示包含非天然编码氨基酸的hGH(画面B)和野生型hGH(画面A)对IM9细胞的生物活性。

图8展示库马斯蓝染色SDS-PAGE，其证明通过PEG(5、20和30kDa)与非天然编码氨基酸共价键合而经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH的产生。

图9展示包含非天然编码氨基酸的各种聚乙二醇化形式的hGH对IM9细胞的生物活性。

图10画面A描绘具有指定胰蛋白酶裂解位点和以箭头说明的非天然氨基酸取代F92pAF的hGH的一级结构(从Becker等人，Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)：326-337改编的图)。图10画面B展示以下物质的重叠胰蛋白酶图谱：由经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(经标记的A)、由包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(经标记的B)和由WHO rhGH产生的肽(经标记的C)。图10画面C是画面B的峰值9的放大图。

图11画面A和画面B展示经纯化PEG-hGH多肽的库马斯蓝染色SDS-PAGE分析。

图12展示hGH二聚体分子对IM9细胞的生物活性。

图13画面A展示测量具有G120R取代的hGH拮抗剂对pSTAT5的磷酸化作用的IM-9检定数据。图13画面B展示测量在相同位置(G120)并入非天然氨基酸的hGH多肽对pSTAT5的磷酸化作用的IM-9检定数据。

图14表明图13画面B中所示的hGH拮抗剂的二聚体在IM-9检定中也缺乏生物活性。

图15展示经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽与未经聚乙二醇化的hGH多肽的大鼠中血清半衰期的比较图。

图16展示经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽的大鼠中血清半衰期的比较图。

图17展示经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽的大鼠中血清半衰期的比较图。大鼠以2.1mg/kg给药一次。

图18画面A展示在投与单剂量的经聚乙二醇化(位置35、92)的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对大鼠体重增加的效应。图18画面B展示在投与单剂量的经聚乙二醇化(位置35、92)的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对循环血浆IGF-1含量的效应。图18画面C展示在投与单剂量的经聚乙二醇化(位置92、134、145、131、143)的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对大鼠体重增加的效应。图18画面D展示在投与单剂量的经聚乙二醇化(位置92、134、145、131、143)的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对循环血浆IGF-1含量的效应。图18画面E展示经聚乙二醇化(位置92、134、145、131、143)的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽的大鼠内血清半衰期的比较图。

具体实施方式

I.介绍

本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的四螺旋束分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一种非天然氨基酸的4HB多肽包括至少一个翻译后修饰。在一实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含使用所属领域的普通技术人员已知适用于特定反应基的化学方法，将包含第二反应基的分子连接于至少一个包含第一反应基的非天然氨基酸，所述包含第二反应基的分子包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能基、与其他分子共价或非共价相互作用的基团、光封闭部分、可光致异构化的部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、延长侧链、与碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述或任何其他所要化合物或物质的任何组合。举例而言，第一反应基为炔基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称为乙炔部分)，且第二反应基为叠氮部分，并且使用[3+2]环加成化学方法。在另一实施例中，第一反应基为叠氮部分(包括但不限于在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应基为炔基部分。在本发明的经修饰4HB多肽的某些实施例中，使用包含至少一个翻译后修饰的至少一个非天然氨基酸(包括但不限于含有酮基官能基的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，在真核细胞或非真核细胞中体内进行翻译后修饰。

在某些实施例中，蛋白包括至少一个由一种宿主细胞体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白包括至少一个由真核细胞体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸加成、磷酸化、糖脂键合修饰等等。在一实施例中，翻译后修饰包含经由GlcNAc-天冬酰胺键合将寡糖连接于天冬酰胺(包括但不限于其中寡糖包含(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc等等)。在另一实施例中，翻译后修饰包含经由GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键合将寡糖(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)连接于丝氨酸或苏氨酸。在某些实施例中，本发明的蛋白或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定部位标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体等等。

相关蛋白或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或更多非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如在蛋白中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，在天然产生的蛋白变体中存在的特定氨基酸中的至少一种(但少于全部)经非天然氨基酸取代。

本发明提供基于GH超基因家族成员、特定而言为hGH、hIFN、hG-CSF和hEPO的方法和组合物，其包含至少一种非天然编码氨基酸。将至少一种非天然编码氨基酸引入GH超基因家族成员中可允许应用接合化学，其包括与(包括但不限于)一种或一种以上非天然编码氨基酸特异性化学反应，同时不与通常产生的20种氨基酸反应。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员经由非天然编码氨基酸的侧链连接于水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)。本发明提供用于以PEG衍生物选择性修饰蛋白的高效方法，其包括将非遗传编码的氨基酸选择性并入应答选择密码子的蛋白中，并随后以合适反应性的PEG衍生物修饰所述氨基酸，所述氨基酸包括但不限于那些含有在20种天然并入的氨基酸中未发现的官能基或取代基(包括但不限于酮、叠氮或乙炔部分)的氨基酸。并入后，氨基酸侧链然后可通过利用所属领域的普通技术人员已知适用于天然编码氨基酸中存在的特定官能基或取代基的化学方法加以修饰。多种已知的化学方法适用于本发明以将水溶性聚合物并入蛋白中。所述方法包括但不限于分别与(包括但不限于)乙炔或叠氮衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应(例如参看Padwa，A.Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.1.3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry.(1984)Padwa，A.编，Wiley，New York，第1-176页)。

因为Huisgen[3+2]环加成方法包括环加成反应而不是亲核取代反应，所以可以极高的选择性修饰蛋白。可通过将催化量的Cu(I)盐加入反应混合物中而在含水条件下于室温下以极好的区位选择性(1，4＞1，5)进行反应。例如参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem. Int.Ed.41：2596-2599；和WO03/101972。可经由[3+2]环加成反应加成到本发明蛋白上的分子几乎包括任何具有合适官能基或取代基(包括但不限于叠氮基或乙炔衍生物)的分子。这些分子可分别加成到具有乙炔基团的非天然氨基酸(包括但不限于对炔丙氧基苯丙氨酸)上或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括但不限于对叠氮基苯丙氨酸)上。

由Huisgen[3+2]环加成产生的五元环在还原性环境中通常不是可逆的且在含水环境中于长时期内对水解是稳定的。因此，多种物质的物理及化学特征可在所需含水条件下以本发明的活性PEG衍生物加以修饰。更重要的是，因为叠氮和乙炔部分对于彼此是特异性的(且例如不与20种遗传编码的氨基酸中的任一种反应)，所以可在一个或一个以上特异性位点以极高的选择性修饰蛋白。

本发明也提供PEG衍生物的水溶性及水解稳定性衍生物和具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对于与已选择性引入应答选择密码子的蛋白中的叠氮部分偶合而言是高度选择性的。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对于与已选择性引入应答选择密码子的蛋白中的乙炔部分偶合而言是高度选择性的。

更特定而言，叠氮部分包含但不限于烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其他取代基，只要乙炔特异性反应性得以保持即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其他取代基，只要叠氮特异性反应性得以保持即可。

本发明提供具有多种官能基、取代基或部分的物质与其他物质的接合物，所述其他物质包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能基、与其他分子共价或非共价相互作用的基团、光封闭部分、可光致异构化的部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、延长侧链、与碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合或任何其他所要化合物或物质。本发明也包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有对应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例而言，含有叠氮部分的PEG聚合物可与生物活性分子在蛋白中含有具有乙炔官能基的非遗传编码的氨基酸的位置上偶合。PEG与生物活性分子偶合所经由的键合包括但不限于Huisgen[3+2]环加成产物。

在所属领域中已确认PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利第6,610,281号和Mehvar，R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136(2000)，其以引用的方式并入本文中)。本发明也包括生物材料，其包含具有一个或一个以上反应性叠氮或乙炔位点的表面和经由Huisgen[3+2]环加成键合与表面偶合的本发明的含叠氮或乙炔聚合物中的一种或一种以上。生物材料及其他物质也可经由除叠氮或乙炔键合之外的键合与经叠氮或乙炔活化的聚合物衍生物偶合，诸如经由包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键合，以留下可用于随后反应的叠氮或乙炔部分。

本发明包括合成本发明的含叠氮和乙炔聚合物的方法。在含叠氮PEG衍生物的情况下，叠氮可直接键结到聚合物的碳原子上。或者，通过将在一端具有叠氮部分的连接剂连接于常规经活化聚合物以便所得聚合物在其末端具有叠氮部分，如此可制备含叠氮PEG衍生物。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可直接键结到聚合物的碳原子上。或者，通过将在一端具有乙炔部分的连接剂连接于常规经活化聚合物以便所得聚合物在其末端具有乙炔部分，如此可制备含乙炔PEG衍生物。

更特定而言，在含叠氮PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生其上具有反应性更高的部分(诸如甲磺酸根、三氟乙磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基)的经取代聚合物。含有磺酰基酸性卤化物、卤素原子及其他离去基的PEG衍生物的制备和用途对于所属领域的技术人员是众所周知的。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物末端用叠氮部分取代反应性更高的部分。或者，具有至少一个活性亲核性或亲电子性部分的水溶性聚合物与在一端具有叠氮的连接剂进行反应，以便在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，且叠氮部分位于聚合物末端。包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸根、醛、酮、硫酯等等的亲核性和亲电子性部分对于所属领域的技术人员是众所周知的。

更特定而言，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以从含有乙炔部分的前驱体置换卤素或其他经活化离去基。或者，具有至少一个活性亲核性或亲电子性部分的水溶性聚合物与在一端具有乙炔的连接剂进行反应，以便在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，且乙炔部分位于聚合物末端。PEG衍生物的有机合成和制备和使用的上下文中的卤素部分、经活化离去基、亲核性和亲电子性部分的使用对于所属领域的实施者是众所周知的。

本发明也提供用于选择性修饰蛋白以将其他物质加成到经修饰蛋白上的方法，包括但不限于诸如含有叠氮或乙炔部分的PEG和PEG衍生物的水溶性聚合物。含有叠氮和乙炔的PEG衍生物可用于修饰其中生物相容性、稳定性、溶解性和免疫原性缺乏具重要性的表面和分子的特性，同时提供比所属领域中先前已知方式选择性更高的连接PEG衍生物与蛋白的方式。

II.生长激素超基因家族

以下蛋白包括那些由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的蛋白(Bazan，F.，Immunology Today 11：350-354(1991)；Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Hile，J.N.，SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETICCYTOKINE RECEPTORS(1996))：生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞间介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)和心脏营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。预期在未来将经由基因克隆和测序来鉴别这个基因家族的额外成员。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，虽然其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征允许容易地鉴别基因家族的新成员并类似地应用本文所述的非天然氨基酸方法和组合物。考虑到GH超基因家族成员中的结构同源性的程度，可使用本发明将非天然编码氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。这个蛋白家族的各成员都包含四螺旋束，其为图1所示者的通用结构。家族成员hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的通用结构分别展示于图2、3、4和5中。

已经由X射线衍射和NMR研究测定多种细胞激素的结构，且其展示对GH结构的惊人观察，虽然缺乏显著一级序列同源性，所述细胞激素包括G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314：435(1992)；Zink等人，Biochemistry 33：8453(1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人，Science 154：1779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.224：1075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；McKay,D.B.Science 257：412(1992))、IL-4(Redfield等人，Biochemistry 30：11029-11035(1991)；Powers等人，Science 256：1673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，Nature 363：172-176(1993))。基于建模及其他研究，IFN被视为这个家族的成员(Lee等人，J.Growthhormone Cytokine Res.15：341(1995)；Murgolo等人，Proteins 17：62(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 4：1453(1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274：661(1997))。基于建模和突变诱发研究，EPO被视为这个家族的成员(Boissel等人，J.Biol.Chem.268：15983-15993(1993)；Wen等人，J.Biol.Chem.269：22839-22846(1994))。现在认为所有上述细胞激素和生长因子组成一个很大的基因家族。

除共有类似的二级和三级结构外，这个家族的成员共有以下特性：它们必须寡聚合细胞表面受体以激活细胞内信号通路。包括但不限于GH和EPO的一些GH家族成员结合单一类型的受体并使其形成同型二聚体。包括但不限于IL-2、IL-4和IL-6的其他家族成员结合一种以上类型的受体并使受体形成异质二聚体或更高阶聚集体(Davis等人，(1993)，Science 260：1805-1808；Paonessa等人，(1995)，EMBO J.14：1942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion inStructural Biology 5：114-121(1995))。突变诱发研究已展示，如同GH一样，所述其他细胞激素和生长因子含有多个受体结合位点(通常为两个)并依次结合其同源受体(Mot和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Set USA 93：9471-9476)。如同GH一样，用于所述其他家族成员的主要受体结合位点主要存在于四α螺旋和A-B环中。螺旋束中参与受体结合的特异性氨基酸在家族成员中有所不同。大多数与GH超基因家族成员相互作用的细胞表面受体是结构相关的且组成第二大的多基因家族。例如参看美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。

从GH超基因家族的各个成员的突变研究得到的一般结论为接合α螺旋的环通常倾向于并不涉及于受体结合中。特定而言，在大多数(如果不是全部)家族成员中短的B-C环似乎对受体结合是非必需的。为此，在GH超基因家族成员中B-C环可经本文所述的非天然编码氨基酸取代。A-B环、C-D环(和GH超基因家族的类干扰素/IL-10成员的D-E环)也可经非天然产生氨基酸取代。邻近螺旋A和远离最终螺旋的氨基酸也倾向于并不涉及于受体结合中，并且也可为用于引入非天然产生氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然编码氨基酸在环结构内的任何位置经取代，包括但不限于A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7个或更多氨基酸处。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在A-B、B-C、C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7个或更多氨基酸内经取代。

包括但不限于EPO、EL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12 p35、IL-13、IL-15和β干扰素的某些GH家族成员含有与N连接和/或与O连接的糖。蛋白中的糖基化位点几乎独有地存在于环区域中且不存在于α螺旋束中。因为环区域通常并不涉及于受体结合中且因为其为用于共价连接糖基的位点，所以其可为用于将非天然产生氨基酸取代引入蛋白中的适用位点。蛋白中包含与N和O连接的糖基化位点的氨基酸可为用于非天然产生氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸为表面暴露的。因此，天然蛋白可容许在这些位点处连接于蛋白的庞大糖基，且糖基化位点倾向于远离受体结合位点。

很可能在未来发现GH超基因家族的额外成员。可经由所预测蛋白序列的计算机辅助式二级和三级结构分析来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有经由非螺旋氨基酸(环区域)接合的四个或五个两性螺旋。蛋白可在其N-末端含有疏水性信号序列以促进从细胞的分泌。所述后来发现的GH超基因家族成员也包括于本发明中。

因此，提供对于生长激素超基因家族的描述以用于说明目的，并且其仅为实例且并不作为本文所述的方法、组合物、策略和技术的范畴的限制。此外，在本申请案中对GH、IFN、G-CSF和EPO多肽的引用意欲使用通用术语作为GH超基因家族的任何成员的实例。因此，应了解关于hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO多肽或蛋白的本文所述的修饰和化学可同等地应用于GH超基因家族的任何成员，包括本文所详细列举者。

III.用于本发明的一般重组核酸方法

在本发明的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆和通常改变编码相关4HB多肽的核酸。所述实施例用于(包括但不限于)蛋白表达或用于源自4HB多肽的变异体、衍生物、表达盒或其他序列的产生期间。在一些实施例中，编码本发明多肽的序列操作性连接于异源启动子。hGH的分离和宿主细胞中GH的产生例如描述于美国专利第4,601,980、4,604,359、4,634,677、4,658,021、4,898,830、5,424,199、5,795,745、5,854,026、5,849,535、6,004,931、6,022,711、6,143,523和6,608,183号中，其以引用的方式并入本文中。hIFN的分离和宿主细胞中IFN的产生例如描述于美国专利第6,489,144、6,410,697、6,159,712、5,955,307、5,814,485、5,710,027、5,595,888、5,391,713、5,244,655、5,196,323、5,066,786、4,966,843、4,894,330、4,364,863号中，其以引用的方式并入本文中。hG-CSF的分离和宿主细胞中G-CSF的产生例如描述于美国专利第4,810,643、4,999,291、5,580,755和6,716,606号中，其以引用的方式并入本文中。hEPO的分离例如描述于美国专利第5,441,868、5,547,933、5,618,698、5,621,80和6,544,748号中，且人类细胞中EPO的产生描述于WO93/09222中。

可基于母体多肽的氨基酸序列来合成编码包含非天然编码氨基酸的4HB多肽的核苷酸序列，其包括但不限于具有SEQ ID NO：2(hGH)、24(hIFN)、29(hG-CSF)或38(EPO)中所示的氨基酸序列，并且然后改变核苷酸序列以便实现相关氨基酸残基的引入(即并入或取代)或去除(即缺失或取代)。可根据常规方法通过定点突变诱发来常规地修饰核苷酸序列。或者，核苷酸序列可通过化学合成制备而来，包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是基于所要多肽的氨基酸序列来设计)，并优选地选择那些在其中产生重组多肽的宿主细胞中有利的密码子。举例而言，可合成编码所要多肽的部分的数种小寡核苷酸并通过PCR、接合或接合链式反应来组装。例如参看Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美国专利第6,521,427号，其以引用的方式并入本文中。

本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。公开在本发明中有用的一般方法的基础文本包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

描述分子生物技术的一般文本包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning；Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第 2版)，第1-3卷.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.andJohn Wiley&Sons，Lie，(1999年增补)(″Ausubel″)。这些文本描述突变诱发、载体使用、启动子和许多其他相关论题，所述论题是关于(包括但不限于)产生包括用于产生包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶及其配对的蛋白的选择密码子的基因。

在本发明中使用各种类型的突变诱发以用于各种目的，包括但不限于产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、将编码非天然氨基酸的选择密码子插入相关蛋白或多肽中。其包括但不限于定点随机点突变诱发、同源重组、DNA重排或其他递归突变诱发方法、嵌合构筑、使用含尿嘧啶模板的突变诱发、针对寡核苷酸的突变诱发、经硫代磷酸酯修饰的DNA突变诱发、使用间隔双螺旋DNA的突变诱发等等或其任何组合。其他合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的突变诱发、限制选择和限制纯化、缺失突变诱发、以总基因合成进行的突变诱发、双股断裂修复等等。包括但不限于涉及嵌合构筑体的突变诱发也包括于本发明中。在一实施例中，可以天然产生的分子或经改变或经突变的天然产生的分子的已知信息指导突变诱发，所述信息包括但不限于序列、序列比较、物理特征、晶体结构等等。

本文中所发现的文本和实例描述这些程序。额外信息发现于以下文献中所引用的公开案和参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：anoverview，Anal Biochem.254(2)：157-178 (1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev. Genet.19：423-462(1985)；Botstein&Shortle，Strategies and applications of in vitromutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编，Springer Verlag，Berlin)(1987)；Kunkel，Rapid and effiicient site-specificmutagenesis without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，MutantTrp repressors with new DNA-binding specificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller&Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3-derivedvectors：an effiicient and general procedure for the production of point mutations inany DNA fragment，Nucleic Acids Res.10；6487-6500(1982)；Zoller&Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller&Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions toprepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，Therapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye&Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage byphosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，Y-T Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in thepresence of ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer&Fritz Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed constructionof mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesisusing M13 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter，Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors，Methods in Enzymol.154：382-403(1987)；Eglitedarzadeh&Henikoff，Use of oligonucleotides to generatelarge deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance ofhydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil.Trans. R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning ofa gene coding for the ribonuclease S protein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl. Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficientmethod for generation of multiple mutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale‘shot-gun’gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；和I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。对于许多上述方法的额外详述可发现于Methods in Enzymology第154卷中，其也描述用于各种突变诱发方法的寻找故障问题的适用控制。

本发明也涉及用于经由正交tRNA/RS对体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和有机体。以本发明的多核苷酸或包括本发明的多核苷酸的构筑体对宿主细胞进行基因工程(包括但不限于转化、转导或转染)，所述构筑体包括但不限于本发明的载体，其例如可为克隆载体或表达载体。载体例如可为质粒、细菌、病毒、裸多核苷酸或接合多核苷酸的形式。以标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔法(From等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82,5824(1985))、以病毒载体感染、以在小珠粒或颗粒的基质内或表面上具有核酸的小颗粒高速弹道穿透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))。

经工程设计的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基在适当时经调节以用于诸如筛选步骤、活化启动子或选择转化体的活性。这些细胞可视情况培养入转殖基因有机体中。用于(包括但不限于)细胞分离和培养(例如用于随后核酸分离)的其他适用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，New York及其中引用的参考文献；Payne等人，(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems JohnWiley&Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell. Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。

可获得数种将目标核酸引入细胞中的众所周知的方法，其中任何方法都可用于本发明。这些方法包括：将接受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔法、抛射物轰击和以病毒载体(下文进一步讨论)注射等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数期，并可以所属领域中已知的多种方法分离细菌内的质粒(例如参看Sambrook)。此外，可购得许多试剂盒以用于从细菌纯化质粒(例如参看购自PharmaciaBiotechEasyPrep^TM和FlexiPrep^TM；购自Stratagene的StrataClean^TM；和购自Qiagen的QIAprep^TM)。经分离及纯化的质粒随后经进一步操纵以产生其他质粒，用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录及翻译终止子、转录及翻译起始序列和适用于调控特定目标核酸的表达的启动子。载体视情况包含含有至少一个独立的终止子序列的一般表达盒、允许在真核生物或原核生物或两者中复制表达盒的序列(包括但不限于穿梭载体)和用于原核生物及真核生物系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选为两者中复制和整合。参看Giliman&Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等人，Nature，328：731(1987)；Schneider，B.等人，Protein Expr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(全部如上)。举例而言，由ATCC提供适用于克隆的细菌和噬菌体的目录，例如由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其他方面及潜在理论考虑的额外基础程序也发现于Watson等人，(1992)Recombinant DNA Second EditionScientific American Books，NY中。此外，基本上任何核酸(且几乎为任何经标记的核酸，无论标准还是非标准)都可从多种商业来源中的任一种常规或标准定购，诸如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX，可在万维网mcrc.com上得到)、The Great American Gene Company(Ramona，CA，可在万维网genco.com上得到)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，可在万维网expressgen.com上得到)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和许多其他来源。

选择密码子

本发明的选择密码子扩展蛋白生物合成机构的遗传密码框。举例而言，选择密码子包括但不限于唯一性三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，包括但不限于琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA))、非天然密码子、四或更多碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域的普通技术人员易于了解可引入所要基因中的选择密码子的数目范围很广，包括但不限于在编码至少一部分4HB多肽的单一多核苷酸中为一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4、5、6、7、8、9、10个或更多。

在一实施例中，所述方法包括使用为终止密码子的选择密码子以将非天然氨基酸体内并入真核细胞中。举例而言，产生识别终止密码子(包括但不限于UAG)的O-tRNA，并以具有所要非天然氨基酸的O-RS氨基酰化。这个O-tRNA并不由天然产生的宿主氨酰基-tRNA合成酶所识别。常规定点突变诱发可用于在相关多肽中的相关位点引入终止密码子(包括但不限于TAG)。例如参看Sayers，J.R.等人，(1988)，5’，3’Exonuclease in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，791-802。当将O-RS、O-tRNA和编码相关多肽的核酸体内组合时，回应于UAG密码子，并入非天然氨基酸以得到在指定位置含有非天然氨基酸的多肽。

可在不显著扰乱真核宿主细胞的情况下进行体内并入非天然氨基酸。举例而言，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括但不限于琥珀抑制子tRNA)与真核生物释放因子(包括但不限于eRF)(其结合到终止密码子并引发生长中的肽从核糖体释放)之间的竞争，所以可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制子tRNA的表达水平来调节抑制效率。

选择密码子也包含延长的密码子，其包括但不限于四或更多碱基密码子，诸如四、五、六或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包括但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包括基于移码抑制来使用延长的密码子。四或更多碱基密码子可将(包括但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入相同蛋白中。举例而言，在具有反密码子环(例如具有至少8-10nt反密码子环)的突变O-tRNA(包括但不限于特定的移码抑制子tRNA)存在下，四或更多碱基密码子被读作单一氨基酸。在其他实施例中，反密码子环可解码(包括但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。因为存在256个可能的四碱基密码子，所以可使用四或更多碱基密码子在相同细胞中编码多种非天然氨基酸。参看Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and AnticodonSize，Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the GeneticCode：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol. Biol.307：755-769。

举例而言，使用体外生物合成方法，四碱基密码子已用于将非天然氨基酸并入蛋白中。例如参看Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：34。CGGG和AGGU用于同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物并入体外具有两个化学酰化的移码抑制子tRNA的抗生蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：12194。在一体内研究中，Moore等人检验具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN(N可为U、A、G或C)密码子的能力，并发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13到26％的效率解码，在0或-1框中有很少解码。参看Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298：195。在一实施例中，基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子可用于本发明中，其可减少其他不需要的位点处的错义通读和移码抑制。

对于给定系统而言，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源性系统并不使用(或很少使用)天然三碱基密码子。举例而言，其包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。

选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有的遗传字母表。一个额外碱基对将三联密码子的数目从64增加到125。三碱基对的特性包括稳定及选择性的碱基配对、以聚合酶高保真度地有效酶促并入DNA中以及在合成新生非天然碱基对之后有效的连续引物延伸。对于可经调适以用于方法和组合物的非天然碱基对的描述例如包括Hirao等人，(2002)Anunnatural base pair-for incorporating amino acid analogues into protein，Nature BiotechnoloRy，20：177-182。其他相关公开案在下文列举。

对于体内使用而言，非天然核苷为膜渗透性的且经磷酸化以形成对应三磷酸酯。此外，增加的遗传信息是稳定的且不被细胞酶所摧毁。Benner及其他人的先前努力利用不同于典型Watson-Crick对的氢键合模式，其最值得注意的实例为iso-C：iso-G对。例如参看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，111：8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.BioL，4：602。一般而言，这些碱基在一定程度上与天然碱基错配且不能被酶促复制。Kool及其合作者证实碱基之间的疏水性填装相互作用可置换氢键合以驱动碱基对的形成。参看Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol，4：602；和Guckian及Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。在开发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg及其合作者已系统地合成并研究一系列非天然疏水性碱基。发现PICS：PICS自身配对比天然碱基对更为稳定，并且可由大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11586；和Ogawa等人，(2000)J.Am. Chem.Soc，122：3274。可以KF在对于生物功能而言足够的效率和选择性下合成3MN:3MN自身配对。例如参看Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：8803。然而，两种碱基都充当链终止子以用于进一步复制。最近已演化出可用于复制PICS自身配对的突变型DNA聚合酶。此外，可复制7AI自身配对。例如参看Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439。也已经开发出新颖金属碱基对Dipic：Py，其在结合Cu(II)时形成稳定的配对。参看Meggers等人，(2000)J.Am. Chem.Soc，122：10714。因为延长密码子和非天然密码子对于天然密码子是固有正交的，所以本发明的方法可利用这一特性以从其产生正交tRNA。

翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸并入所要多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中而不是翻译成蛋白。所述序列含有充当指令以诱导核糖体跳过所述序列并继续插入点下游的翻译的结构。

在某些实施例中，由核酸编码本发明的方法和/或组合物中的相关蛋白或多肽(或其部分)。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。

可使用所属领域的技术人员众所周知且在本文中所述的方法诱发编码相关蛋白或多肽的基因突变，以包括例如一个或一个以上选择密码子以用于并入非天然氨基酸。举例而言，诱发用于相关蛋白的核酸突变以包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括任何蛋白的任何所述变异型(包括但不限于突变型)变体，例如包括至少一种非天然氨基酸。类似地，本发明也包括对应核酸，即具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。

编码诸如4HB多肽的相关蛋白的核酸分子可容易地突变以在多肽的任何所要位置引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白或多种其他分子引入到相关蛋白上。适用于将半胱氨酸引入4HB多肽的所要位置的方法在所属领域中是众所周知的，诸如美国专利第6,608,183号(其以引用的方式并入本文中)中所述的方法和标准突变诱发技术。

IV.非天然编码氨基酸

多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可将任何数目的非天然编码氨基酸引入4HB多肽中。一般而言，所引入的非天然编码氨基酸对20种常见的遗传编码的氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸酪氨酸和缬氨酸)大体上是化学惰性的。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与20种常见氨基酸中未发现的官能基(包括但不限于叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效及选择性地反应以形成稳定接合物的侧链官能基。举例而言，包括含有叠氮基官能基的非天然编码氨基酸的4HB多肽可与聚合物(包括但不限于聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定接合物，其是通过叠氮与炔官能基选择性反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物而产生。

α氨基酸的通用结构说明如下(式I)：

非天然编码氨基酸通常为具有上述式的任何结构(其中R基为除20种天然氨基酸中所用取代基之外的任何取代基)，并且可适用于本发明。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅在侧链结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸以与天然产生的多肽中形成酰胺键相同的方式与其他氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有将其与天然氨基酸区别开来的侧链基团。举例而言，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸根、酸根、磷酸基、膦酸基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等等或其任何组合。其他可适用于本发明的相关非天然产生氨基酸包括但不限于包含可光致活化的交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合性氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能基的氨基酸、共价或非共价地与其他分子相互作用的氨基酸、光封闭和/或可光致异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如经糖取代的丝氨酸)、经其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光致裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括但不限于聚醚或长链烃，包括但不限于大于约5个或大于约10个碳)的氨基酸、与碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。

可适用于本发明且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括但不限于那些具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮基和炔反应基的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例也包括其中氨基酸与糖之间天然产生的N-或O-键合由在自然界中通常未发现的共价键(包括但不限于烯、肟、硫醚、酰胺等等)置换的实例。所述氨基酸的实例也包括在天然产生的蛋白中通常未发现的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等等。

本文中所提供的许多非天然编码氨基酸可购自例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences，Darmstadt，Germany的分公司)或Peptech(Burlington，MA，USA)。不能购得的氨基酸视情况按本文所提供进行合成或使用所属领域的技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术例如参看Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982，第2版，Willard GrantPress，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wileyand Sons，New York)；和Carey及Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，部分A和B，1990，Plenum Press，New York)。也参看美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明的非天然氨基酸也视情况包含经修饰的骨架结构，其包括但不限于由式II和III的结构所说明的结构：

其中Z通常包含OH、NH₂、SH、NH-R’或S-R’；X和Y可相同或不同，其通常包含S或O；且R和R’视情况同上或不同，其通常是选自用于具有式I的非天然氨基酸的上述R基团的相同组分列表以及氢。举例而言，本发明的非天然氨基酸视情况在氨基或羧基中包含取代，如式II和III所说明。这种类型的非天然氨基酸包括但不限于α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括但不限于具有对应于常见20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链。此外，在α-碳上的取代视情况包括但不限于L、D或α-α-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸酯、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其他结构类似物包括环状氨基酸(诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物)和β及γ氨基酸(诸如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸)。

许多非天然氨基酸是基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等等的天然氨基酸，并且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括但不限于经对位取代的酪氨酸、经邻位取代的酪氨酸和经间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括但不限于)酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C₆-C₂₀直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等等。此外，也涵盖经多取代的芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物、γ取代衍生物、环状衍生物和经酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明的苯丙氨酸类似物的实例包括但不限于经对位取代的苯丙氨酸、经邻位取代的苯丙氨酸和经间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等等。可适用于本发明的非天然氨基酸的特定实例包括但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸基丝氨酸、膦酸基丝氨酸、膦酸基酪氨酸、对碘代苯丙氨酸、对溴代苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等等。可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构的实例例如提供于题为“In vivoincorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中。关于额外甲硫氨酸类似物，也参看Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinantproteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS99：19-24。

在一实施例中，提供包括非天然氨基酸(诸如对炔丙氧基-苯丙氨酸)的4HB多肽的组合物。也提供包含对炔丙氧基-苯丙氨酸和(包括但不限于)蛋白和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对炔丙氧基-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可键结(包括但不限于共价地)到正交tRNA，包括但不限于经由氨基-酰基键共价地键结到正交tRNA、共价地键结到正交tRNA的末端核糖的3’OH或2’OH等。

经由非天然氨基酸可并入蛋白中的化学部分提供各种优势和对蛋白的操纵。举例而言，酮基官能基的独特反应性允许以多种含有肼或羟胺的试剂中的任一种在体外和体内选择性修饰蛋白。举例而言，重原子非天然氨基酸可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性地引入重原子也可在选择用于重原子的位置方面提供选择性和灵活性。举例而言，光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)允许体内和体外有效地光致交联蛋白。光反应性非天然氨基酸的实例包括但不限于对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。然后可通过激发提供光反应基的短暂控制来任意地交联具有光反应性非天然氨基酸的蛋白。在一实例中，非天然氨基酸的甲基可由经同位素标记的(包括但不限于)甲基取代，以在(包括但不限于)使用核磁共振和振动光谱学时作为局部结构和动力学的探针。举例而言，炔基或叠氮基官能基允许经由[3+2]环加成反应以分子选择性修饰蛋白。

在氨基末端并入多肽中的非天然氨基酸可由R基团和不同于在α-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH₂基团的第二反应基组成，所述R基团为除20种天然氨基酸中所用取代基之外的任何取代基。可在具有不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第二反应基的羧基末端并入类似的非天然氨基酸。

非天然氨基酸的化学合成

适用于本发明的许多非天然氨基酸例如可购自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)。不能购得的氨基酸视情况按照本文所提供或按照各种公开案中所提供进行合成或使用所属领域的技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术例如参看Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；和Carey及Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，部分A和B，1990，Plenum Press，NewYork)。描述非天然氨基酸合成的额外公开案例如包括题为“In vivo incorporationof Unnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas等人，(1995) J.Med. Chem.，38，4660-4669；King，F.E.&Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesisof Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J. Chem.Soc，3315-3319；Friedman，O.M.&Chatterrji，R.(1959)Synthesis ofDerivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem. Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人，(1988)Absolute Configuration of theEnantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroauine).J.Ore.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.&Frappier，F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials，.Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.&Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolinesas Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.&Rapoport，H.(1985)Synthesis of Optically PurePipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.1989：1859-1866；Barton等人，(1987)Synthesis of Novela-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L-andD-a-Amino-Adipic Acids，L-a-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron Lett.43：4297-4308；和Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acid analogues：synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acidderivatives and their activity at a novel ouisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35：4602-7。也参看2003年12月22日申请的题为“Protein Arrays”的专利申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号。

A.羰基反应基

具有羰基反应基的氨基酸允许尤其经由亲核加成或醇醛缩合反应来连接分子(包括但不限于PEG或其他水溶性分子)的各种反应。

例示性含羰基氨基酸可如下所示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基且R₂为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮部分位于相对于烷基侧链的对位中。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基且R₂为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮部分位于相对于烷基侧链的间位中。

对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其他含羰基氨基酸可由所属领域的技术人员类似地制备。

在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能基。举例而言，适用于接合反应的醛官能基可由具有邻近氨基和羟基的官能基产生而来。当生物活性分子为多肽时，例如N-末端丝氨酸或苏氨酸(其可通常存在或可经由化学或酶促消化而暴露)可用于在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下产生醛官能基。例如参看Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.&Stroh，L，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白的N-末端的氨基酸。

在本发明中，具有邻近羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经伪装的”醛官能基并入多肽中。举例而言，5-羟基赖氨酸具有邻近于ε胺的羟基。用于产生醛的反应条件通常包括在温和条件下加入摩尔过量的过碘酸钠以避免在多肽内的其他位点处氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应包括将约1.5摩尔过量的过碘酸钠加入经缓冲的多肽溶液中，随后在黑暗中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文中。

羰基官能基可与含有肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂在温和条件下于水溶液中选择性反应，以分别形成对应的腙、肟或缩氨基脲键合，其在生理条件下是稳定的。例如参看Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tarn，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其他氨基酸侧链的存在下进行选择性修饰。例如参看Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.&Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。

B.肼、酰肼或氨基脲反应基

含有诸如肼、酰肼或氨基脲的亲核基团的非天然编码氨基酸允许与各种亲电子基团进行反应以形成接合物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物形成接合物)。

例示性含有肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下所示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，n为4，R₁不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在且X不存在。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上脂族基团的对位。

含有酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可从商业来源购得。举例而言，L-谷氨酸-γ-酰肼可从Sigma Chemical(St.Louis，MO)购得。不能购得的其他氨基酸可由所属领域的技术人员制备而来。例如参看美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文中。

含有具有酰肼、肼或氨基脲官能基的非天然编码氨基酸的多肽可与各种含有醛或具有类似化学反应性的其他官能基的分子有效地及选择性地反应。例如参看Shao，J.和Tam，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。酰肼、肼和氨基脲官能基的独特反应性使得它们与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸上的羟基或赖氨酸的氨基和N-末端)相比，对于醛、酮及其他亲电子基团显著地更具反应性。

C.含氨氧基的氨基酸

含有氨氧基(也称作羟胺)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电子基团进行反应以形成接合物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物形成接合物)。类似于肼、酰肼和氨基脲，氨氧基增强的亲核性允许其与各种含有醛或具有类似化学反应性的其他官能基的分子有效地及选择性地反应。例如参看Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem.Res.34：727-736(2001)。虽然与肼基的反应结果为对应的腙，然而，由氨氧基与诸如酮的含羰基基团的反应通常得到肟。

例示性含有氨氧基的氨基酸可如下所示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1且存在Y。在一些实施例中，n为2，R₁和X都不存在，m为0且Y不存在。

含有氨氧基的氨基酸可由容易获得的氨基酸前驱体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备而来。例如参看M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。已经从天然来源分离诸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸的某些含有氨氧基的氨基酸(Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。其他含有氨氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员制备而来。

D.叠氮和炔反应基

叠氮和炔官能基的独特反应性使得它们极为适用于选择性修饰多肽及其他生物分子。有机叠氮化物(尤其是脂族叠氮化物)和炔对于常用反应性化学条件通常是稳定的。特定而言，叠氮和炔官能基对于在天然产生的多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链(即R基团)是惰性的。然而，当叠氮基和炔基紧密靠近时，其“弹簧承载”性质得以公开并且其经由Huisgen[3+2]环加成反应有效地及选择性地反应以产生对应三唑。例如参看Chin J.等人，Science 301：964-7(2003)；Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。

因为Huisgen环加成反应包括选择性环加成反应(例如参看Padwa，A.，COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost，B.M.编，1991)，第1069-1109页；Huisgen，R.1，3-DiPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，(Padwa，A.编，1984)，第1-176页)而不是亲核取代，所以并入具有含叠氮和炔的侧链的非天然编码氨基酸会允许所得多肽在非天然编码氨基酸的位置上经选择性修饰。通过在用于将Cu(II)当场还原成Cu(I)的还原剂的存在下加入催化量的Cu(II)(包括但不限于催化量的CuSO₄形式)，可在室温下于含水条件下进行涉及含有叠氮或炔的4HB多肽的环加成反应。例如参看Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Iht.Ed.41：2596-2599(2002)。例示性还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe²⁺、Co²⁺和施加的电势。

在需要叠氮与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应的一些情况下，4HB多肽包含包含炔部分的非天然编码氨基酸且有待连接于氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行逆反应(即与氨基酸上的叠氮部分和水溶性聚合物上存在的炔部分逆反应)。

叠氮官能基也可与含有芳基酯且适当地经芳基膦部分官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键合。芳基膦基团当场还原叠氮化物，且所得胺然后与邻近酯键合有效地反应以产生对应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含有叠氮的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。

含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括但不限于-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂。R’、R”、R

和R

′各自独立地意指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，举例而言，各R基团都是独立选择，当存在R’、R”、R和R

′基团的一个以上时，各R’、R”、R

和R

叠氮官能基也可与含有硫酯且适当地经芳基膦部分官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键合。芳基膦基团当场还原叠氮化物，且所得胺然后与硫酯键合有效地反应以产生对应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示：

其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。

例示性含炔氨基酸可如下所示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位中。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1且炔丙氧基位于相对于烷基侧链的对位中(即O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R₁和X都不存在且m为0(即炔丙基甘氨酸)。

含炔氨基酸可由市面购得。举例而言，炔丙基甘氨酸可由Peptech(Burlington，MA)购得。或者，含炔氨基酸可根据标准方法制备而来。举例而言，可如(例如)Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙氧基苯丙氨酸，并如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。其他含炔氨基酸可由所属领域的技术人员制备而来。

例示性含叠氮氨基酸可如下所示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0且叠氮部分位于相对于烷基侧链的对位中。在一些实施例中，n为0-4且R₁和X都不存在，且m＝0。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为2且β叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位中。

含叠氮氨基酸可从市面购得。举例而言，4-叠氮基苯丙氨酸可从Chem-ImpexInternational，Inc.(Wood Dale，IL)获得。对于那些不能购得的含叠氮氨基酸而言，可使用所属领域的技术人员已知的标准技术相对容易地制备叠氮基，包括但不限于经由置换合适的离去基(包括但不限于卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或经由开环经合适保护的内酯。例如参看March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)。

E.氨基硫醇反应基

经β取代的氨基硫醇官能基的独特反应性使得其极为适用于经由形成噻唑烷来选择性地修饰含有醛基的多肽及其他生物分子。例如参看J.Shao和J.Tam，J.Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些实施例中，经β取代的氨基硫醇氨基酸可并入4HB多肽中并且然后与包含醛官能基的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其他有效负载可经由形成噻唑烷而与包含经β取代的氨基硫醇氨基酸的4HB多肽偶合。

非天然氨基酸的细胞摄取

当设计及选择用于(包括但不限于)并入蛋白中的非天然氨基酸时，真核细胞对非天然氨基酸的摄取为通常所考虑的一个问题。举例而言，α-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物不太可能具有细胞渗透性。天然氨基酸经由一系列基于蛋白的输送系统而被摄取入真核细胞中。可进行评定何种非天然氨基酸(若有的话)被细胞摄取的快速筛选。例如参看2003年12月22日申请的题为“ProteinArrays”的申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号和Liu，D.R.&Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism withan expanded genetic code.PNAS United States 96：4780-4785中的毒性检定。虽然易于以各种检定分析摄取，但设计受细胞摄取路径作用的非天然氨基酸的替代方法为提供生物合成路径以体内产生氨基酸。

非天然氨基酸的生物合成

细胞中已经存在许多生物合成路径以用于产生氨基酸及其他化合物。虽然在自然界中(包括但不限于在真核生物中)可能不存在用于特定非天然氨基酸的生物合成方法，但是本发明提供所述方法。举例而言，通过加入新型酶或修饰现有的宿主细胞路径，视情况在宿主细胞中产生用于非天然氨基酸的生物合成路径。额外的新型酶视情况为天然产生的酶或人工演化的酶。举例而言，对氨基苯丙氨酸的生物合成(例如于题为“In vivo incorporation of unnatural aminoacids”的WO2002/085923中所呈现)依赖于来自其他有机体的已知酶的组合的加入。可通过用包含用于这些酶的基因的质粒转化细胞而将所述基因引入真核细胞中。所述基因当在细胞中表达时提供酶促路径以合成所要化合物。在以下实例中提供视情况加入的酶类型的实例。额外的酶序列例如发现于Genbank中。视情况也以相同方式将人工演化的酶加入细胞中。以这种方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。

各种方法可用于产生新颖酶以用于生物合成路径中或用于演化现有路径。举例而言，视情况使用递归重组(包括但不限于由Maxygen，Inc.(可在万维网maxygen.com上得到)开发的递归重组)来开发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)：389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation andreassembly：In vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，91：10747-10751。类似地，由Genencor(可在万维网genencor.com上得到)开发的DesignPath^TM视情况用于代谢路径工程设计，(包括但不限于)以工程设计路径用于在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。这种技术使用(包括但不限于)经由功能基因组学鉴别的新型基因的组合和分子进化及设计而在宿主有机体中重建现有路径。Diversa公司(可在万维网diversa.com上得到)也提供用于快速筛选基因和基因路径的文库的技术(包括但不限于)以产生新型路径。

以本发明的经工程设计的生物合成路径产生的非天然氨基酸的浓度通常应足以用于有效的蛋白生物合成(包括但不限于天然细胞量)，但不会达到影响其他氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。以这种方式在体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在以包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞并产生非天然氨基酸之后，视情况使用体内选择以进一步优化用于核糖体蛋白合成和细胞生长的非天然氨基酸的产生。

具有非天然氨基酸的多肽

可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入，所述目的包括但不限于定制蛋白结构和/或功能上的改变；改变大小、酸度、亲核性、氢键结、疏水性、蛋白酶靶位点的可接近性；对准部分(包括但不限于用于蛋白阵列)等。包括非天然氨基酸的蛋白可具有增强甚或完全新的催化或生物物理特性。举例而言，通过将非天然氨基酸包括入蛋白中来视情况修饰以下特性：毒性、生物分布、结构特性、分光特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括但不限于血清半衰期)、与其他分子反应的能力(包括但不限于共价或非共价地)等等。包括包含至少一种非天然氨基酸的蛋白的组合物适用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化性酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)和(包括但不限于)蛋白结构和功能的研究。例如参看Dougherty，(2000)UnnaturalAmino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。

在本发明的一方面中，组合物包括至少一种具有至少一个(包括但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多)非天然氨基酸的蛋白。非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于可存在在蛋白中的包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同的非天然氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同位点。另一方面，组合物包括蛋白，其中蛋白中所存在的特定氨基酸的至少一种(但少于全部)经非天然氨基酸取代。对于具有一种以上非天然氨基酸的给定蛋白而言，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于蛋白可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或者可包括两种相同的非天然氨基酸)。对于具有两种以上非天然氨基酸的给定蛋白而言，非天然氨基酸可相同、不同或为多种相同种类的非天然氨基酸与至少一种不同的非天然氨基酸的组合。

具有至少一种非天然氨基酸的相关蛋白或多肽为本发明的特征。本发明也包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一种非天然氨基酸的多肽或蛋白。蛋白中也可存在赋形剂(包括但不限于医药学上可接受的赋形剂)。

通过在真核细胞中产生具有至少一种非天然氨基酸的相关蛋白或多肽，蛋白或多肽将通常包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不由原核细胞进行。举例而言，翻译后修饰包括但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸加成、磷酸化、糖脂键合修饰、糖基化等等。一方面，翻译后修饰包括经由GlcNAc-天冬酰胺键合将寡糖(包括但不限于(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc))连接于天冬酰胺。参看表1，其列举真核生物蛋白的与N连接的寡糖的一些实例(也可存在额外残基，其未加以展示)。另一方面，翻译后修饰包括经由GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键合或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键合将寡糖(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)连接于丝氨酸或苏氨酸。

表1：经由GlcNAc-键合的寡糖的实例

另一方面，翻译后修饰包括前驱体(包括但不限于降钙素前驱体、降钙素基因相关肽前驱体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、前胰岛素、前阿黑皮素原、阿黑皮素原等等)的蛋白水解加工、组装入多亚单元蛋白或大分子组件、翻译到细胞中的另一位点(包括但不限于到细胞器，诸如内质网、高尔基体、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或者经由分泌路径)。在某些实施例中，所述蛋白包含分泌或定位序列、抗原决定部位标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合等等。美国专利第4,963,495和6,436,674号(其以引用的方式并入本文中)详述经设计以改良hGH多肽分泌的构筑体。

非天然氨基酸的一个优点在于其呈现可用于添加额外分子的额外化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞中体内形成或体外形成。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸。举例而言，所述翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应。当前用于选择性修饰蛋白的多数反应包括在亲核和亲电子反应搭配物之间的共价键形成，包括但不限于α卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情形中的选择性是由蛋白中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白中，可使用其他更具选择性的反应，诸如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物在体外或体内的反应。例如参看Cornish，等人，(1996)Am. Chem.Soc，118：8150-8151；Mahal，等人，(1997)Science.276：1125-1128；Wang，等人，(2001)Science 292：498-500；Chin，等人，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin，等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，99：11020-11024；Wang，等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci，100：56-61；Zhang，等人，(2003)Biochemistry，42：6735-6746和Chin，等人，(2003)Science，在编。其允许以包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的试剂的主体选择性标记几乎任何蛋白。也参看美国专利申请案第10/686,944号，标题为“Glycoprotein synthesis”，2003年1月16日申请，其以引用的方式并入本文中。(包括但不限于)经由叠氮基氨基酸的翻译后修饰也可通过Staudinger连接进行(包括但不限于以三芳基膦试剂)。例如参看Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS 99：19-24。

本发明提供另一种用于选择性修饰蛋白的高效方法，其包括将(包括但不限于)含有叠氮基或炔基部分的非天然氨基酸遗传性并入应答选择密码子的蛋白中。这些氨基酸侧链然后可分别以(包括但不限于)炔基或叠氮衍生物由(包括但不限于)Huisgen[3+2]环加成反应进行修饰(例如参看Padwa，A.Comprehensive OrRanic Synthesis，第4卷，(1991)编，Trost，B.M.，Pergamon，Oxford，第1069-1109页和Huisgen，R.1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(1984)编，Padwa，A.，Wiley，New York，第1-176页)。因为这种方法包括环加成反应而不是亲核取代，所以蛋白可以极高选择性得以修饰。通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，可在室温下于含水条件下以极佳的区位选择性(1，4＞1，5)进行这一反应。例如参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。可使用的另一种方法是具有四半胱氨酸基元的双砷酸化合物上的配位体交换，例如参看Griffin等人，(1998)Science 281：269-272。

可通过[3+2]环加成反应加成到本发明的蛋白上的分子几乎包括任何具有叠氮或炔基衍生物的分子。分子包括但不限于染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括但不限于聚乙二醇的衍生物)、光致交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白或多肽(或更多)、多核苷酸(包括但不限于DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物等等。这些分子可分别加成到具有炔基(包括但不限于对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括但不限于对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸上。

V.体内产生包含非遗传编码的氨基酸的四螺旋束多肽

可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶在体内产生本发明的4HB多肽以添加或取代并非在天然产生的系统中编码的氨基酸。

使用并非在天然产生的系统中编码的氨基酸来产生tRNA和tRNA合成酶的方法例如描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)中，其以引用的方式并入本文中。这些方法包括产生不依赖于翻译系统内源的合成酶和tRNA(且因而有时称为“正交的”)而行使功能的翻译机构。翻译系统通常包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，在翻译系统中O-RS优选地用至少一种非天然产生氨基酸氨酰化O-tRNA并且O-tRNA识别至少一种不由系统中其他tRNA所识别的选择密码子。因此翻译系统反应所编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白中，由此将氨基酸“取代”入所编码的多肽中的位置中。

多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶已描述于用于将特定合成氨基酸插入多肽中的技术领域中，并且通常适用于本发明。举例而言，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码且包括公开于美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885(各自以引用的方式并入本文中)中的氨基酸序列。与O-RS一起使用的对应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)中，其以引用的方式并入本文中。

叠氮特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin，J.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。用于对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括但不限于公开于美国专利申请公开案2003/0108885(序号10/126,931)中的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64，所述公开案以引用的方式并入本文中。适用于本发明的例示性O-tRNA序列包括但不限于公开于美国专利申请公开案2003/0108885(序号10/126,931号)中的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3，所述公开案以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码氨基酸呈特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其他实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其以引用的方式并入本文中。酿酒酵母(S.cerevisiae)中的并入含酮基和叠氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.等人，Science 301：964-967(2003)中。

O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用包括选择编码非天然编码氨基酸的特异性密码子。虽然可使用任何密码子，但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中少用或不用的密码子。举例而言，例示性密码子包括诸如终止密码子(琥珀、赭石和乳白)的无义密码子、四或更多碱基密码子及其他少用或不用的天然三碱基密码子。

可使用在所属领域中已知的突变诱发方法(包括但不限于位点特异性突变诱发、盒式突变诱发、限制选择突变诱发等)将特异性选择密码子引入4HB多肽编码序列中的适当位置。

用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白生物合成机构的组份(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。用于体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其以引用的方式并入本文中。用于选择用于有机体的体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)中，其以引用的方式并入本文中。

用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)产生源自来自第一有机体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况为突变型)RS文库，所述有机体包括但不限于诸如詹氏甲烷球菌、嗜热甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜超高温硫酸根还原古细菌、激烈火球菌(P.furiosus)、霍氏火球菌(P.horikoshii)、嗜热古菌、嗜热细菌(T.thermophilus)等等的原核有机体或者真核有机体；(b)选择(和/或筛选)RS(视情况为突变型RS)文库中在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA(O-tRNA)的成员，由此提供活性(视情况为突变型)RS的集合；和/或(c)选择(视情况通过阴性选择)所述集合中在没有非天然编码氨基酸存在下优选地氨酰化O-tRNA的活性RS(包括但不限于突变型RS)，由此提供至少一种重组O-RS，其中所述至少一种重组O-RS优选地以非天然编码氨基酸氨酰化O-tRNA。

在一个实施例中，RS是非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而得以产生。举例而言，非活性RS可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或更多氨基酸突变为不同氨基酸(包括但不限于丙氨酸)而得以产生。

突变型RS文库可使用所属领域中已知的各种技术产生，包括但不限于基于蛋白三维RS结构的合理设计或者以随机或合理设计技术诱发RS核苷酸突变。举例而言，突变型RS可通过位点特异性突变、随机突变、产生重组突变的多样性、嵌合构筑体、合理设计及其他本文描述或所属领域中已知的方法得以产生。

在一个实施例中，选择(和/或筛选)RS(视情况为突变型RS)文库中(包括但不限于)在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下可氨酰化正交tRNA(O-RNA)的成员，其包括：将包括但不限于抗生素抗性基因等等的阳性选择或筛选标记和(视情况为突变型)RS文库引入多个细胞中，其中所述阳性选择和/或筛选标记包含至少一个包括但不限于琥珀、赭石或乳白密码子的选择密码子；在选择药剂存在下生长所述多个细胞；通过抑制阳性选择或筛选标记中的至少一个选择密码子来鉴别在所述选择和/或筛选药剂存在下存活(或展示特异性反应)的细胞，由此提供含有活性(视情况为突变型)RS集合的经阳性选择细胞的子集。选择和/或筛选药剂浓度可视情况改变。

一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。阳性选择标记视情况为β-内酰胺酶基因且选择密码子为所述β内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记(包括但不限于细胞表面标记)。

在一个实施例中，阴性选择或筛选所述集合中在没有非天然编码氨基酸存在下优选地氨酰化O-tRNA的活性RS(视情况为突变型)，其包括：将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况为突变型)RS的集合一起引入多个第二有机体细胞中，其中所述阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于抗生素抗性基因，包括但不限于氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因)；并鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选或选择药剂的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但不能在未补充有非天然编码氨基酸和选择或筛选药剂的第二培养基中存活或展示特异性反应的细胞，由此提供具有至少一个重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例而言，CAT鉴别方案在适当O-RS重组体的测定中视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例而言，将克隆集合视情况在含有具有或不具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长平板上复制。因此认为在含有非天然编码氨基酸的平板上独自生长的群落含有重组O-RS。一方面，选择(和/或筛选)药剂的浓度加以改变。在一些方面，所述第一和第二有机体不同。因此，所述第一和/或第二有机体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其他实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。

在另一实施例中，筛选或选择(包括但不限于阴性选择)所述集合中的活性(视情况为突变型)RS包括：将活性突变型RS的集合从阳性选择步骤(b)分离；将阴性选择或筛选标记和活性(视情况为突变型)RS的集合引入多个第二有机体细胞中，其中所述阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于毒性标记基因，包括但不限于核糖核酸酶barnase基因，其包含至少一个选择密码子)；并鉴别在未补充有非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或展示特异性筛选反应的细胞，由此提供具有至少一个重组O-RS的存活或筛选细胞，其中所述至少一个重组O-RS对所述非天然编码氨基酸具有特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。所述实施例视情况可包括其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且其中所述第一和第二有机体不同(包括但不限于各有机体视情况包括但不限于原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)。同样，一些方面包括其中所述阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)。其他方面包括其中所述筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。在本文的实施例中，所述筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严谨性的变化。

在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生第二组源自所述至少一种重组O-RS的O-RS(视情况经突变)；和(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优选地氨酰化所述O-tRNA的能力的突变O-RS。视情况重复步骤(d)-(f)，包括但不限于至少约两次。一方面，可通过突变诱发(包括但不限于随机突变诱发、位点特异性突变诱发)、重组或其组合来产生所述第二组源自至少一种重组O-RS的突变O-RS。

包括但不限于阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性和阴性选择/筛选步骤(b)和(c)两者的选择/筛选步骤的严谨性在上述方法中视情况包括改变选择/筛选严谨性。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性和阴性选择/筛选步骤(b)和(c)两者包含使用报导子，其中所述报导子是由荧光激活细胞拣选(FACS)来检测或者其中所述报导子是由发光来检测。视情况在细胞表面、噬菌体展示等等上展示报导子且基于涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和力或催化活性加以选择。在一个实施例中，在细胞表面、噬菌体展示等等上展示突变的合成酶。

用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)产生源自来自第一有机体的至少一种tRNA(包括但不限于抑制tRNA)的突变型tRNA文库；(b)选择(包括但不限于阴性选择)或筛选所述文库中由来自第二有机体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)在没有来自第一有机体的RS存在下氨酰化的(视情况为突变型)tRNA，由此提供tRNA(视情况为突变型)的集合；并(c)选择或筛选tRNA(视情况为突变型)集合中由引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，由此提供至少一种重组O-tRNA，其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且不由来自第二有机体的RS有效识别并且优选地由所述O-RS氨酰化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包含天然和/或非天然碱基的唯一性三碱基密码子，或者为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或乳白终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解，在一些实施例中，视情况将O-tRNA从第二有机体输入第一有机体而无需修饰。在各种实施例中，第一和第二有机体相同或不同且视情况选自(包括但不限于)原核生物(包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA视情况由非天然编码氨基酸氨酰化，其中所述非天然编码氨基酸是在体内天然地生物合成或通过遗传操纵而生物合成。视情况将非天然编码氨基酸加入生长培养基中以至少用于第一或第二有机体。

一方面，选择(包括但不限于阴性选择)或筛选文库中由氨酰基-tRNA合成酶氨酰化的(视情况为突变型)tRNA(步骤(b))包括：引入毒性标记基因，其中所述毒性标记基因包含所述选择密码子的至少一种(或导致产生毒性剂或静电剂的基因或对所述有机体为必需的基因，其中所述标记基因包含至少一种选择密码子)，并将(视情况为突变型)tRNA文库引入多个来自第二有机体的细胞中；以及选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包含至少一种正交tRNA或无功能tRNA的(视情况为突变型)tRNA的集合。举例而言，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。

另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在本方法的另一实施例中，毒性标记基因是核糖核酸酶barnase基因，其中所述核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。

在一个实施例中，选择或筛选(视情况为突变型)tRNA集合中由引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员可包括：与O-RS一起将阳性选择或筛选标记基因和(视情况为突变型)tRNA集合引入多个来自第二有机体的细胞中，其中所述阳性标记基因包含药物抗性基因(包括但不限于β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或对所述有机体为必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；并鉴别在包括但不限于抗生素的选择或筛选药剂存在下生长的存活或筛选细胞，由此提供具有至少一种重组tRNA的细胞集合，其中所述至少一种重组tRNA是由所述O-RS氨酰化并且应答所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一实施例中，选择和/或筛选药剂的浓度加以改变。

提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包括：(a)产生源自来自第一有机体的至少一种tRNA的突变型tRNA的文库；(b)阴性选择或筛选文库中在没有来自第一有机体的RS存在下由来自第二有机体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的(视情况为突变型)tRNA，由此提供(视情况为突变型)tRNA的集合；(c)选择或筛选所述(视情况为突变型)tRNA集合中由引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，由此提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且不由来自第二有机体的RS有效识别并且优选地由O-RS氨酰化。所述方法也包括(d)产生源自来自第三有机体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况为突变型)RS文库；(e)选择或筛选所述突变型RS文库中在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下优选地氨酰化所述至少一种重组O-tRNA的成员，由此提供活性(视情况为突变型)RS的集合；和(f)阴性选择或筛选所述集合中在没有非天然编码氨基酸存在下优选地氨酰化所述至少一种重组O-tRNA的活性(视情况为突变型)RS，由此提供所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸呈特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例而言，所述特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等等。另外，这些方法包括其中所述第一和第三有机体相同(包括但不限于詹氏甲烷球菌)。

选择正交tRNA-tRNA合成酶对以用于第二有机体的体内翻译系统的方法也包括于本发明中。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一有机体分离或源自其的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入第一组来自第二有机体的细胞中；将所述标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；以及选择在复制细胞组中不能存活的在第一组中的存活细胞或者筛选在复制细胞组中不能产生特异性筛选反应的展示特异性筛选反应的细胞，其中所述第一组和复制细胞组在选择或筛选药剂存在下生长，其中所述存活或筛选细胞包含用于第二有机体的体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括体内互补检定。所述选择和/或筛选药剂浓度可加以改变。

本发明的有机体包含多种有机体和多种组合。举例而言，本发明的方法的第一和第二有机体可相同或不同。在一个实施例中，所述有机体视情况为原核有机体，包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、嗜超高温硫酸根还原古细菌、激烈火球菌、霍氏火球菌、嗜热古菌、嗜热细菌等等。或者，所述有机体视情况包含真核有机体，包括但不限于植物(包括但不限于诸如诸如单子叶植物或双子叶植物的复杂植物)、藻类、原生生物、真菌(包括但不限于酵母等)、动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等等。在另一实施例中，所述第二有机体为原核有机体，包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、嗜超高温硫酸根还原古细菌、嗜盐菌、激烈火球菌、霍氏火球菌、嗜热古菌、嗜热细菌等等。或者，所述第二有机体可为真核有机体，包括但不限于酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，所述第一和第二有机体不同。

VI.非天然产生氨基酸在四螺旋束多肽中的位置

本发明涵盖将一种或一种以上非天然产生氨基酸并入4HB多肽中。一种或一种以上非天然产生氨基酸可在不破坏多肽活性的特定位置并入。其可通过进行“保守性”取代(包括但不限于以疏水氨基酸取代疏水氨基酸、以庞大氨基酸取代庞大氨基酸、以亲水氨基酸取代亲水氨基酸)和/或在不为活性所需的位置中插入非天然产生氨基酸来实现。

可如下说明hGH的区域，其中hGH中的氨基酸位置说明于中间行(SEQ IDNO：2)中：

螺旋A 螺旋B 螺旋C 螺旋D

[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]

N-末端 A-B环 B-C环 C-D环 C-末端

可如下说明hIFN的区域，其中hIFN中的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：24：

1-9(N-末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D螺旋与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C-末端)。

可如下说明hG-CSF的区域，其中hG-CSF中的氨基酸位置说明于括号中(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中缺少N末端30个氨基酸信号序列的对应氨基酸位置)：

1-10(N-末端)、11-39(A螺旋)、40-70(A螺旋与B螺旋之间的区域)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区域)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区域)、143-172(D螺旋)、173-175(C-末端)，包括在A螺旋与B螺旋之间44-53处的短螺旋节段微小E螺旋，其是由3₁₀螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成。

可如下说明hEPO的区域(SEQ ID NO：38)：

1-7(N-末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环，含有β折叠1(39-41)和微小B’螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环，含有微小C’螺旋(114-121)和β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C-末端)。

可应用多种生物化学和结构方法以在4HB多肽中选择用于用非天然编码氨基酸取代的所要位点。所属领域的一般技术人员易于了解，多肽链的任何位置适于选择以并入非天然编码氨基酸，且对于任何或非特定所要目的而言，选择可基于合理设计或通过随机选择进行。所要位点的选择可用于产生具有任何所要特性或活性(包括但不限于促效剂、超促效剂、反向促效剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、二聚体或多聚体形成、与天然分子相比活性或特性无改变)的四螺旋束分子或者用于操纵诸如溶解性、聚集或稳定性的多肽的任何物理或化学特性。举例而言，四螺旋束多肽的生物活性所需的多肽中的位置可使用所属领域中已知的丙氨酸扫描或同系物扫描方法来进行鉴别。例如参看Cunningham，B.和Wells，J.，Science，244：1081-1085(1989)(鉴别对于hGH生物活性关键的14个残基)和Cunningham，B.等人，Science 243：1330-1336(1989)(使用同系物扫描突变诱发来鉴别抗体和受体抗原决定部位)。关于IFN例如参看Di Marco等人，Biochem Biophys Res Com 202：1445(1994)；Walter等人，Cancer Biotherapy&Radiopharm.13：143(1998)；Runkel等人，J.B.C.273：8003(1998)。G-CSF丙氨酸扫描突变诱发研究描述于Reidhaar-Olson JF等人，Biochemistry(1996)Jul 16，35(28)：9034-41；Young DC等人，Protein Sci.(1997)Jun；6(6)：1228-36和Layton等人，(1997)JBC 272(47)：29735-29741。例如参看Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)(鉴别对于hEPO活性关键的残基)；Wen，D.等人，JBC，269：22839-22846(1994)(用于鉴别hEPO的功能上重要的域的丙氨酸扫描突变诱发)和Elliot，S.等人，Blood，89：493-502(1997)(鉴别hEPO与人类EPO受体之间的关键静电相互作用)。除了通过丙氨酸或同系物扫描突变诱发被鉴别为对生物活性关键的残基外的残基对于取决于为多肽寻求的所要活性以非天然编码氨基酸进行取代为良好的候选者。或者，再次取决于为多肽寻求的所要活性，被鉴别为对生物活性关键的位点对于以非天然编码氨基酸进行取代也为良好的候选者。另一替代方法为在多肽链上的各位置中以非天然编码氨基酸简单进行连续取代并观察对多肽活性的效应。所属领域的普通技术人员易于了解，用于选择用于以非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法适用于本发明。

也可检测含有缺失的4HB多肽的天然产生的突变体的结构和活性以确定可能容许以非天然编码氨基酸进行取代的蛋白区域。关于hGH例如参看Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta，925：314(1987)；Lewis，U.，等人，J.Biol.Chem.，253：2679-2687(1978)。关于hEPO例如参看Bittorf等人，FEBS，336：133(1993)；Wen等人，JBC，269：22839(1994)。以类似方式，可使用蛋白酶消化和单克隆抗体鉴别负责结合4HB多肽受体的4HB多肽区域。例如参看Cunningham，B.等人，Science 243：1330-1336(1989)；Mills，J.等人，Endocrinology，107：391-399(1980)；Li，C，Mol Cell.Biochem.，46：31-41(1982)(表明对于hGH而言，残基134-149之间的氨基酸可缺失而无活性损失)。Layton等人，(2001)JBC 276(39)36779-36787描述用hG-CSF及其受体进行的抗体研究。一旦除去可能对于以非天然编码氨基酸进行的取代不耐受的残基，则可从4HB及其结合蛋白的三维晶体结构检测到所提议的取代在各剩余位置上的影响。关于hGH请参看de Vos，A.等人，Science，255：306-312(1992)；所有hGH晶体结构都可在含有蛋白和核酸的大分子三维结构数据的集中式数据库蛋白数据银行(Protein Data Bank)(包括3HHR、1AXI和1HWG)(PDB，可在万维网rcsb.org上获得)中获得。hIFN的X射线结晶学和NMR结构也可于蛋白数据银行(1RH2和1ITF)以及美国专利第5,602,232、5,460,956、5,441,734、4,672,108号(其以引用的方式并入本文中)中获得。hG-CSF的X射线结晶学和NMR结构可于蛋白数据银行中以PDB ID：1CD9、1PGR、1RHG、1GNC获得以及于美国专利第5,581,476和5,790,421号(其以引用的方式并入本文中)中获得。关于hEPO请参看Syed等人，Nature，395：511(1998)和Cheetham等人，Nature Structural Biology，5：861(1998)；hEPO的X射线结晶学和NMR结构可于蛋白数据银行中以PDB ID：1CN4、1EER和1BUY获得。因此，所属领域的技术人员可易于鉴别可以非天然编码氨基酸进行取代的氨基酸位置。

在一些实施例中，本发明的4HB多肽包含一个或一个以上位于不破坏多肽的螺旋或β折叠二级结构的蛋白区域中的非天然产生氨基酸。

并入非天然编码氨基酸的例示性残基可为被排除在潜在受体结合区域(包括但不限于位点I和位点II)外的残基，可为完全或部分暴露于溶剂的残基，具有最小或不具有与附近残基的氢键相互作用，可最小暴露于附近的反应性残基，且可在高度挠性(包括但不限于C-D环)或结构上刚性(包括但不限于B螺旋)的区域中，如通过四螺旋束多肽与其受体的三维晶体结构所预测。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入于对应于如下的hGH中的二级结构的以下区域中一个或一个以上的任何位置：SEQ ID NO：2的1-5(N-末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C-末端)。在其他实施例中，本发明的hGH多肽包含取代至少一个位于至少一个hGH区域中的氨基酸的至少一个非天然产生氨基酸，所述区域是选自由N-末端(1-5)、A-B环(32-46)的N-末端、B-C环(97-105)、C-D环(132-149)和C-末端(184-191)组成的群组。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是并入于hGH的以下位置的一个或一个以上中：位置1之前(即N-末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187或其任何组合。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括SEQID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187或其任何组合。对hGH的晶体结构及其与hGH受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全或部分可由溶剂接近并且非天然编码氨基酸的侧链可从蛋白表面伸出并进入溶剂中。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位置包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155或其任何组合。对hGH的晶体结构及其与hGH受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全暴露于溶剂且天然残基的侧链伸出以进入溶剂。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点子集包括SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的30、74、103或其任何组合。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的另一子集包括SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸的35、92、143、145或其任何组合。

在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N-末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：35、92、143、145(SEQID NO：2或SEQ ID NO：1或3的对应氨基酸)。

人类GH拮抗剂包括但不限于那些于1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127具有取代或于位置1(即N-末端)具有添加或其任何组合(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1、3或任何其他GH序列中的对应氨基酸)的拮抗剂。

在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入或取代入一个或一个以上对应于IFN中的二级结构的以下区域中，其中hIFN中的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：24：

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是并入一个或一个以上IFN中的以下位置中：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即蛋白的羧基末端)(如同在SEQ ID NO：24中或其他IFN中的对应氨基酸中)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：100、106、107、108、111、113、114(SEQID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：41、45、46、48、49(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些或其他位置上的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，其包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即羧基末端)(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)。在一些实施例中，水溶性聚合物在一个或一个以上氨基酸位置上偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162(SEQID NO：24或SEQ ID NO：23、25或任何其他IFN多肽中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上提供拮抗剂的以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合(SEQ ID NO：24或其他IFN中的对应氨基酸)；包含这些取代之一的hIFN多肽可能充当弱拮抗剂或弱促效剂，其取决于所选位点和所要活性。人类IFN拮抗剂包括但不限于在以下位置具有取代者：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合(hIFN；SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：23或25中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入或取代于对应于如下的G-CSF中的二级结构的以下区域的一个或一个以上：1-10(N-末端)、11-39(A螺旋)、40-70(A螺旋与B螺旋之间的区域)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区域)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区域)、143-172(D螺旋)、173-175(C-末端)，包括在A螺旋与B螺旋之间44-53处的短螺旋节段微小E螺旋，其是由310螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成(如在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35和36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是并入G-CSF中以下位置其中之一：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、111、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)(如同在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在一个或一个以上以下位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170和171(如同在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，其包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、111、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)(SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些或其他位置上的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171(如同于SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。

用于并入非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括但不限于30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170和171(如同在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。对hG-CSF的晶体结构及其与hG-CSF受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全或部分可由溶剂接近并且非天然编码氨基酸的侧链可从蛋白表面伸出并进入溶剂。

用于并入非天然编码氨基酸的例示性位置包括59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171(如同在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。对hG-CSF的晶体结构及其与hG-CSF受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全暴露于溶剂且天然残基的侧链伸出以进入溶剂。

人类G-CSF拮抗剂包括但不限于在以下位置具有取代者：6、7、8、9、10、11、12、1 3、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145或其任何组合(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸被并入或取代入对应于如下的EPO中的二级结构的以下区域的一个或一个以上：1-7(N-末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环，含有β折叠1(39-41)和微小B’螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环，其含有微小C’螺旋(114-121)和β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C-末端)(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是并入一个或一个以上EPO中的以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上中的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些或其他位置上的一个或一个以上非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，包括但不限于以下位置：21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128或其组合(SEQID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括但不限于1、2、4、9、17、20、21、24、25、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、79、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136、159、162、163、164、165和166(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。对hEPO的晶体结构及其与hEPO受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全或部分可由溶剂接近并且非天然编码氨基酸的侧链可从蛋白表面伸出并进入溶剂。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位置包括21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165和166(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。对hEPO的晶体结构及其与hEPO受体的相互作用的检测表明这些氨基酸残基的侧链完全暴露于溶剂且天然残基的侧链伸出以进入溶剂。

人类EPO拮抗剂包括但不限于在以下位置具有取代者：2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159(hEPO；SEQ ID NO：38或SEQID NO：37或39中的对应氨基酸)。

可将多种非天然编码氨基酸取代或并入4HB多肽中的给定位置。一般而言，基于4HB多肽与其受体的三维晶体结构的检测、对保守性取代的优选(即诸如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸的基于芳基的非天然编码氨基酸取代Phe、Tyr或Trp)和人们希望引入4HB多肽中的特定接合化学(例如如果人们希望与具有炔部分的水溶性聚合物实现Huisgen[3+2]环加成则引入4-叠氮基苯丙氨酸，或者如果人们希望与具有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺键则转而并入膦部分)来选择特定非天然编码氨基酸以用于并入。

在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应基；并以包含第二反应基的分子(包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光致交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、NDA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能基、与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光封闭部分、可光致异构化的部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、延长侧链、与碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或以上物质的任何组合，或者任何其他所要化合物或物质)接触所述蛋白。第一反应基与第二反应基反应以将分子通过[3+2]环加成反应连接于非天然氨基酸。在一个实施例中，第一反应基为炔基或叠氮基部分且第二反应基为叠氮基或炔基部分。举例而言，第一反应基为炔基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)且第二反应基为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应基为叠氮基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应基为炔基部分。

在一些情形下，非天然编码氨基酸取代将与4HB多肽中的其他添加、取代或缺失组合以影响4HB多肽的其他生物学特征。在一些情形下，所述其他添加、取代或缺失可增加4HB多肽的稳定性(包括但不限于对蛋白水解型降解的抗性)或者增加4HB多肽对其受体的亲和力。在一些实施例中，hGH多肽包含选自由SEQ ID NO：2中的F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D；H21N；G120A；R167N；D171S；E174S；F176Y、I179T或其任何组合组成的群组的氨基酸取代。在一些情形下，所述其他添加、取代或缺失可增加4HB多肽的溶解性(包括但不限于当于大肠杆菌或其他宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，在大肠杆菌重组宿主细胞中表达之后添加、取代或缺失可增加多肽溶解性。在一些实施例中，除用于并入非天然氨基酸的另一位点外，选择位点以用天然编码氨基酸或非天然氨基酸进行取代，其使得在大肠杆菌重组宿主细胞中表达之后增加多肽溶解性。这些在hEPO中用于氨基酸取代以增加溶解性的位点的实例为N36、Q86、G113和/或Q115，其可用Lys、Arg、Glu或任何其他带电的天然编码或非天然编码氨基酸进行取代(SEQ ID NO：38)。在一些实施例中，4HB多肽包含另一添加、取代或缺失，其调节对4HB多肽受体的亲和力、调节(包括但不限于增加或降低)受体二聚作用、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生物利用性、有利于纯化或者改良或改变特定投与途径。举例而言，除了如本文所述引入一个或一个以上非天然编码氨基酸外，引入一个或一个以上以下取代：F10A、F10H或F10I；M14W、M14Q或M14G；H18D；H21N；R167N；D171S；E174S；F176Y和I179T以增加hGH变异体对其受体的亲和力。举例而言，除了如本文所述引入一个或一个以上非天然编码氨基酸外，引入一个或一个以上以下取代：S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A和K154A以增加hEPO变异体对其受体的亲和力(Wen等人，(1994)JBC269：22839-22846)。类似地，4HB多肽可包含改良多肽检测(包括但不限于GFP)、纯化或其他特征的蛋白酶裂解序列、反应基、抗体结合域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或经连接的分子(包括但不限于生物素)。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生hGH拮抗剂。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括：1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或于位置1之前的添加(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1、3或任何其他GH序列中的对应氨基酸)。在一些实施例中，hGH拮抗剂在以下区域中包含至少一个取代使得GH充当拮抗剂：1-5(N-末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C-末端)。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括在螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然编码氨基酸取代G120。在其他实施例中，将以上列出的取代与使得hGH多肽成为hGH拮抗剂的额外取代组合。举例而言，在本文鉴别的位置之一上取代非天然编码氨基酸且在G120引入同时取代(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与存在于hGH分子的受体结合区中的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生hIFN拮抗剂。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165(如同于SEQ ID NO：24中或其他IFN中的对应氨基酸中)。用于并入非天然编码氨基酸的例示性位点的另一子集包括：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137(hIFN；SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)。在一些实施例中，hIFN拮抗剂在以下区域中包含至少一个取代使得IFN充当拮抗剂：1-9(N-末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D螺旋与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C-末端)。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括在螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在其他实施例中，将以上列出的取代与使得hIFN多肽成为hIFN拮抗剂的额外取代组合。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包含与存在于hIFN分子的受体结合区中的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生hG-CSF拮抗剂。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括：6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127和145(如同在SEQ ID NO：29中或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸中)。在一些实施例中，hG-CSF拮抗剂在区域6-30、40-70或105-130中包含至少一个取代使得G-CSF充当拮抗剂。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括在螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然编码氨基酸取代L70。在其他实施例中，将以上列出的取代与使得hG-CSF多肽成为hG-CSF拮抗剂的额外取代组合。举例而言，在本文鉴别的位置之一上取代非天然编码氨基酸且在L70引入同时取代。在一些实施例中，hG-CSF拮抗剂包含与存在于hG-CSF分子的受体结合区中的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生hEPO拮抗剂。人类EPO拮抗剂包括但不限于那些在2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159或其任何组合(hEPO；SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)具有取代的拮抗剂。在一些实施例中，hEPO拮抗剂在区域10-15或100-108中包含至少一个取代使得EPO充当拮抗剂。参看Elliott等人，(1997)Blood 89：493-502和Cheetham等人，(1998)Nature Structural Biology 5：861-866。在一些实施例中，hEPO多肽通过含有一个或一个以上以下取代而经修饰：发现于低亲和力受体结合位点(位点2)中的V11S、R14Q、Y15I、S100E、R103A、S104I和L108K。在其他实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括在螺旋A的氨基末端区域和部分螺旋C内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然编码氨基酸取代L108。在其他实施例中，将以上列出的取代与使得hEPO多肽成为hEPO拮抗剂的额外取代组合。举例而言，在本文鉴别的位置之一上取代非天然编码氨基酸且在L108引入同时取代(包括但不限于L108K、L108R、L108H、L108D或L108E)。在一些实施例中，hEPO拮抗剂包含与存在于hEPO分子的位点2结合区中的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。

在一些情形下，用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸。在一些情形下，4HB多肽进一步包括一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然产生氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多取代。举例而言，在一些实施例中，在以下hGH区域中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-5(N-末端)；32-46(A-B环的N-末端)；97-105(B-C环)；132-149(C-D环)；和184-191(C-末端)。在一些实施例中，在以下hGH区域中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-5(N-末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C-末端)。在一些实施例中，在以下hIFN区域中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-9(N-末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D螺旋与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C-末端)。在一些实施例中，在以下hG-CSF区域中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-10(N-末端)、11-39(A螺旋)、40-70(A螺旋与B螺旋之间的区域)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区域)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区域)、143-172(D螺旋)、173-175(C-末端)，包括在A螺旋与B螺旋之间44-53处的短螺旋节段微小E螺旋，其是由3₁₀螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成。举例而言，在一些实施例中，在以下hEPO区域中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-7(N-末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环，含有β折叠1(39-41)和微小B’螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环，含有微小C’螺旋(114-121)和β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C-末端)。在一些情形下，将两个或两个以上非天然编码的残基连接于一个或一个以上较低分子量的线性或分枝PEG(总体约～5-20kDa或更小)，由此相对于连接于单一较高分子量的PEG的物质而增强结合亲和力和相当的血清半衰期。

在一些实施例中，用一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下位置取代高达两个以下hGH残基：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187。在一些情形下，形成以下取代对的任一者：K38X^*和K140X^*、K41X^*和K145X^*、Y35X^*和E88X^*、Y35X^*和F92X^*、Y35X^*和Y143X^*、F92X^*和Y143X^*，其中X^*表示非天然编码氨基酸。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的尤其优选位点包括以下残基的组合：35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155。

在hGH中用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：SEQ ID NO：2的位置1之前(即N-末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)或其任何组合。

在hIFN中用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即蛋白的羧基末端)或其任何组合。

在一些实施例中，用一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下位置取代高达两个以下hG-CSF残基：30、31、33、58、59、61、63、64、66、61、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170和171。因此，在一些情形下，形成以下取代对的任一者：W59X^*和T134X^*、L131X^*和S67X^*、S67X^*和Q91X^*、T134X^*和Ser77X^*，其中X^*表示非天然编码氨基酸。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：30、31、33、58、59、61、63、64、66、61、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170和171。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的尤其优选位点包括以下残基的组合：59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171。

在hG-CSF中用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、61、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)。

在一些实施例中，用一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下位置取代在hEPO中高达两个以下残基：1、2、4、9、17、20、21、24、25、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、79、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136、159、162、163、164、165和166。因此，在一些情形下，形成以下取代对的任一者：N24X^*和G113X^*、N38X^*和Q115X^*、N36X^*和S85X^*、N36X^*和A125X^*、N36X^*和A128X^*、Q86X^*和S126X^*，其中X^*表示非天然编码氨基酸。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165和166。用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的尤其优选位点包括以下残基的组合：21、24、38、83、86、89、116、119、121、124、125、126、127、128、129、130和162。

在hEPO中用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位点包括以下残基的组合：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)。

VII.在非真核生物和真核生物中的表达

为获得所克隆的4HB多核苷酸的高水平表达，人们通常将编码本发明的4HB多肽的多核苷酸亚克隆入含有用于指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和(如果对于编码蛋白的核酸而言)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体。适合的细菌启动子在所属领域中是众所周知的并且例如描述于Sambrook等人和Ausubel等人中。

用于表达本发明的4HB多肽的细菌表达系统可在(包括但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)中获得(Palva等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒可由市面购得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在所属领域中是众所周知的且也可由市面购得。在其中使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(以上所述)表达本发明的4HB多肽的情形下，基于其使用正交组份的能力选择用于表达的宿主细胞。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括但不限于短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或链霉菌属(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)(大肠杆菌、荧光假单胞菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌)以及酵母及其他真核细胞。可如本文所述使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含巨大适用数量的非天然氨基酸的蛋白的能力。一方面，组合物视情况包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白，或者可以体内蛋白产生方法实现的量(重组蛋白产生和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，所述蛋白视情况以以下浓度存在于组合物中，所述浓度包括但不限于在包括但不限于细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其他液体悬浮液(包括但不限于以包括但不限于约1nl到约100L之间的体积)中的每升至少10微克蛋白、每升至少50微克蛋白、每升至少75微克蛋白、每升至少100微克蛋白、每升至少200微克蛋白、每升至少250微克蛋白、每升至少500微克蛋白、每升至少1毫克蛋白或每升至少10毫克蛋白或更多。在真核细胞中产生大量(包括但不限于大于通常可能使用其他包括但不限于体外翻译的方法可能获得的量)包括至少一种非天然氨基酸的蛋白是本发明的一个特征。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含巨大适用数量的非天然氨基酸的蛋白的能力。举例而言，可以以下浓度产生包含非天然氨基酸的蛋白，所述浓度包括但不限于在细胞萃取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等等中的至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更多蛋白。

I.表达系统、培养和分离

4HB多肽可于任何数量的合适表达系统中表达，所述系统包括例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌。例示性表达系统的描述提供于下文。

酵母如本文所用，术语“酵母”包括能够表达编码4HB多肽的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。所述产子囊酵母分为两科，即蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium属和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科，即掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(Candida))。

用于本发明的尤其相关物种是以下属内的物种：毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属，其包括但不限于甲醇酵母(P.pastoris)、P.guillerimondii、酿酒酵母(S.cerevisiae)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、S.douglasii、S.kluyveri、S.norbensis、S.oviformis、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和多态汉逊酵母(H.polymorpha)。选择用于表达4HB多肽的合适酵母是在所属领域的普通技术人员的能力范围内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好的可溶蛋白产生和总体稳固的酵母。酵母通常可从多种来源获得，其包括但不限于加里福利亚大学(伯克利分校)生物物理及医学物理学系酵母遗传储备中心(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and MedicalPhysics，University of California(Berkeley，CA))和美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。特征为诸如存在编码4HB多肽的核苷酸序列的相关特性的充分类似于亲本的亲本细胞后代包括于这一定义所意指的后代中。

已经开发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以用于转化入多种酵母宿主中。举例而言，已经开发用于以下酵母的表达载体：酿酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75：1929)、白色念珠菌(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)、麦芽糖假丝酵母(Kunze等人，J.BASICM1CROBiOL.(1985)25：141)、多态汉逊酵母(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET.(1986)202：302)、脆壁克鲁维酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)、乳酸克鲁维酵母(DeLouvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人，BIO/TECHNOLOGY(1990)8：135)、P.guillerimondii(Kunze等人，J.BASICMICROBIOL.(1985)25：141)、甲醇酵母(美国专利第5,324,639、4,929,555和4,837,148号；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse，NATURE(1981)300：706)和解脂亚罗酵母(Y.lipolytica)(Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET.(1985)10：49)、构巢曲霉(A.nidulans)(Balance等人，BIOCHEM.B1OPHYS.RES.COMMUN.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221和Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)、黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4：475479)、瑞氏木霉(T.reesia)(EP0244234)和丝状真菌，诸如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO91/00357)，其各自以引用的方式并入本文中。

用于酵母载体的控制序列对于所属领域中的普通技术人员是众所周知的，且包括但不限于来自诸如以下基因的基因的启动子区域：醇脱氢酶(ADH)(EP0284044)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的启动子序列(Myanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。其他用于酵母宿主的合适启动子序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)及其他诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶的糖解酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess等人，J.ADV.ENZYME REG.(1968)7：149)的启动子。具有由生长条件控制的转录的额外优点的可诱导酵母启动子可包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步描述于EP0073657中。

酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。此外，合成启动子也可起到酵母启动子的作用。举例而言，酵母启动子的上游激活序列(UAS)可接合于另一酵母启动子的转录激活区，从而产生合成杂合启动子。这些杂合启动子的实例包括连接于GAP转录激活区的ADH调控序列。参看美国专利第4,880,734和4,876,197号，其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其他实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列与诸如GAP或PyK的糖解酶基因的转录激活区组合组成的启动子。参看EP0164556。此外，酵母启动子可包括具有结合酵母RNA聚合酶和起始转录的能力的天然产生的非酵母来源的启动子。

可包含部分酵母表达载体的其他控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇化酶基因的终止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒起点的复制起点适用于酵母。用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒中的trp1基因。参看Tschemper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。所述trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株的选择标记。类似地，由具有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。

将外源DNA引入酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的，且通常包括但不限于转化原生质球体或转化用碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76：3829和Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946。然而，也可如通常在SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中所述，使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合的其他用于将DNA引入细胞的方法。然后可使用所属领域的普通技术人员已知的标准技术培养酵母宿主细胞。

用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其他方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。通常参看美国专利公开案第20020055169号、美国专利第6,361,969、6,312,923、6,183,985、6,083,723、6,017,731、5,674,706、5,629,203、5,602,034和5,089,398号、美国复查专利第RE37,343和RE35,749号、PCT公开专利申请案WO99/078621、WO98/37208和WO98/26080、欧洲专利申请案EP0946736、EP0732403、EP0480480、EP0460071、EP0340986、EP0329203、EP0324274和EP0164556。也参看Gellissen等人，ANTONIE VANLEEUWENHOEK(1992)62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，其各自以引用的方式并入本文中。

可在扩增阶段使用所属领域的普通技术人员众所周知的标准补料发酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在发酵罐内生长。所述发酵法可经调适以解决特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式中的差异。举例而言，酵母属酵母宿主的发酵可能需要单个葡萄糖馈料、复合氮源(例如酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相反，嗜甲醇酵母菌甲醇酵母可能需要甘油、甲醇和微量矿物质馈料，但仅需要简单的铵(氮)盐以用于最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号、Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95和Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)29：1113，其以引用的方式并入本文中。

然而，这些发酵方法可具有独立于所用酵母宿主菌株的某些常见特征。举例而言，通常为碳的生长限制营养素可在扩增阶段加入发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵法通常应用设计为含有足够量的碳、氮、基本盐、磷及其他次要营养素(例如维生素、微量矿物质和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639和5,231,178号中，其以引用的方式并入本文中。

杆状病毒感染的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”意指可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。特征为诸如存在编码4HB多肽的核苷酸序列的相关特性的充分类似于亲本的亲本细胞后代包括于这一定义意指的后代中。

选择用于表达4HB多肽的合适昆虫细胞对所属领域的普通技术人员是众所周知的。数种昆虫物种在所属领域中充分描述并可由市面购得，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主中，合适的宿主可包括展示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固的宿主。昆虫通常可从多种来源获得，其包括但不限于加里福利亚大学(伯克利分校)生物物理及医学物理学系昆虫遗传储备中心(InsectGenetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University ofCalifornia(Berkeley，CA))和美国典型培养物收藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。

杆状病毒感染的昆虫表达系统的组份通常包括：通常为细菌质粒的转移载体，其含有杆状病毒基因组片段和用于插入有待表达的异源基因的便利限制位点；野生型杆状病毒，其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(其允许将异源基因同源重组入杆状病毒基因组中)；和适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。用于构筑载体、转染细胞、挑选菌斑、生长培养物中的细胞等等的材料、方法和技术在所属领域中是已知的且可获得描述这些技术的手册。

在将异源基因插入转移载体后，将载体和野生型病毒基因组转染入昆虫宿主细胞中，其中所述载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒并鉴别和纯化重组菌斑。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式从例如Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)购得。这些技术通常为所属领域的技术人员所已知且完全描述于SUMMERS AND SMITH，TEXAS AGRICULTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN NO.1555(1987)，其以引用的方式并入本文中。也参看RICHARDSON，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE，THEBACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；和O’REILLY等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。

实际上，使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来产生各种异源蛋白在所属领域中是众所周知的。例如参看美国专利第6,368,825、6,342,216、6,338,846、6,261,805、6,245,528、6,225,060、6,183,987、6,168,932、6,126,944、6,096,304、6,013,433、5,965,393、5,939,285、5,891,676、5,871,986、5,861,279、5,858,368、5,843,733、5,762,939、5,753,220、5,605,827、5,583,023、5,571,709、5,516,657、5,290,686号；WO02/06305、WO01/90390、WO01/27301、WO01/05956、WO00/55345、WO00/20032、WO99/51721、WO99/45130、WO99/31257、WO99/10515、WO99/09193、WO97/26332、WO96/29400、WO96/25496、WO96/06161、WO95/20672、WO93/03173、WO92/16619、WO92/03628、WO92/01801、WO90/14428、WO90/10078、WO90/02566、WO90/02186、WO90/01556、WO89/01038、WO89/01037、WO88/07082，其以引用的方式并入本文中。

适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体在所属领域中是已知的，且包括例如源自杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(baculovirusAutographacalifornica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)的昆虫表达及转移载体，AcNPV为不依赖辅助物的病毒表达载体。源自这一系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参看Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRES SION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。

在将外来基因插入杆状病毒基因组之前，通常将包含启动子、前导序列(如果需要)、相关编码序列和转录终止序列的上述组份组装入中间互换构筑体(转移载体)中。中间互换构筑体通常保持于复制子中，诸如能够稳定保持于诸如细菌的宿主中的染色体外元件(例如质粒)。复制子将具有复制系统，因此使其保持于合适的宿主中以进行克隆和扩增。更特定而言，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人，ANN.REV.MiCROBiOL.(1988)42：177)和原核生物的氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点以用于在大肠杆菌中选择和繁殖。

用于将外来基因引入AcNPV的一种常用转移载体为pAc373。也已设计所属领域的技术人员已知的多种其他载体，其包括例如将多角体蛋白起始密码子从ATG改变为ATT并在ATT上游32个碱基对处引入BamHI克隆位点的pVL985。参看Luckow和Summers，17 VIROLOGY 31(1989)。其他市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)。

在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染入昆虫细胞宿主中。用于将异源DNA引入杆状病毒中的所要位点的方法在所属领域是已知的。参看SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETIN No.1555(1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：215 uckow和Summers，VIROLOGY(1989)17：31。举例而言，所述插入可通过同源双交换重组而进入诸如多角体蛋白基因的基因；插入也可进入经工程设计为所要杆状病毒基因的限制酶位点。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91。

可通过电穿孔完成转染。参看TROTTER和WOOD，39 METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。或者，可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATUREGENETICS(1998)18：45；TILKINS等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK145-154(1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37)：22376；Reversey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14.2：274。市售脂质体包括例如Cellfectin

和Lipofectin(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。此外，可使用磷酸钙转染。参看TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)：5667；和Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。

杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为能够结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游转录(3’)成mRNA的任何DNA序列。启动子具有转录起始区，其通常置于编码序列的5’末端附近。这个转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称为增强子的第二区域，其如果存在则通常远离结构基因。此外，表达可为受调控的或者组成性的。

在感染周期的后期经大量转录的结构基因提供尤其有用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多角体蛋白的基因的序列(FRIESEN等人，The Regulation ofBaculovirus Gene Expression，于THE MOLECULAR BIOLOGY OFBACULOVIRUSES(1986)中；EP0127839和0155476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69：765)。

将新形成的杆状病毒表达载体包装入感染性重组杆状病毒且随后可以所属领域的技术人员已知的技术纯化生长菌斑。参看Miller等人，BiOESSAYS(1989)4：91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETIN No.1555(1987)。

已开发用于感染入数种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例而言，已经开发尤其用于埃及伊蚊(ATCC编号CCL-125)、家蚕(ATCC编号CRL-8910)、黑腹果蝇(ATCC编号1963)、草地夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看WO89/046,699；Wright，NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56：153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。通常参看Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25：225。更特定而言，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括但不限于Sf9(草地夜蛾)(ATCC编号CRL-1711)、Sf21(草地夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-Five^TM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。

用于在杆状病毒/表达中指导和融合表达异源多肽的细胞和培养基可由市面购得，且细胞培养技术对所属领域的技术人员通常是已知的。

大肠杆菌及其他原核生物细菌表达技术在所属领域中是众所周知的。可获得用于细菌宿主的多种载体。载体可为单拷贝或低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于有关载体的充足文献、许多载体的市售性和描述载体及其限制图谱和特征的手册，本文无需广泛讨论。如所众所周知的，载体通常包括允许选择的标记，所述标记可提供细胞毒性剂抗性、原养型或免疫性。经常存在多个标记，其提供不同特征。

细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3’)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常置于编码序列的5’末端附近。这个转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称为操纵子的第二区域，其可重叠于RNA合成开始的毗邻RNA聚合酶结合位点。由于基因抑制蛋白可结合操纵子且因而抑制特定基因的转录，所以操纵子允许负调控(可诱导)的转录。组成性表达可在没有诸如操纵子的负调控元件存在的情形下发生。此外，正调控可由基因激活蛋白结合序列实现，所述序列如果存在则通常位于RNA聚合酶结合序列附近(5’)。基因激活蛋白的实例为代谢产物激活蛋白(CAP)，其帮助起始大肠杆菌(E.coli)中的lac操纵子的转录(Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18：173)。因而调控表达可为正向或负向的，由此增强或减少转录。

编码代谢路径酶的序列尤其提供有用的启动子序列。实例包括源自糖代谢酶的启动子序列，诸如半乳糖、乳糖(lac)(Chang等人，NATURE(1977)198：1056)和麦芽糖。额外实例包括源自生物合成酶的启动子序列，诸如色氨酸(trp)(Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲专利公开案036776和121775号，其以引用的方式并入本文中)。β半乳糖苷酶(bla)启动子系统(Weissmann(1981)″The cloning of interferon and other mistakes.″In Interferon 3(Ed.I.Gresser))、噬菌体λPL(Shimatake等人，NATURE(1981)292：128)和T5(美国专利第4,689,406号，其以引用的方式并入本文中)启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用诸如T7启动子的强启动子以高水平诱导4HB多肽。所述载体的实例在所属领域中是众所周知的且包括购自Novagen的pET29系列和描述于WO99/05297(其以引用的方式并入本文中)中的pPOP载体。所述表达系统在宿主中产生高含量的4HB多肽而不会损害宿主细胞成活力或生长参数。

另外，在自然界中不存在的合成启动子也起细菌启动子的作用。举例而言，一个细菌或噬菌体启动子的转录激活序列可接合于另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列，从而产生合成杂合启动子(美国专利第4,551,433号，其以引用的方式并入本文中)。举例而言，tac启动子为包含trp启动子和lac操纵子序列的杂合trp-lac启动子，其是由lac阻遏物加以调控[Amann等人，GENE(1983)25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包括具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力的天然产生的非细菌来源的启动子。天然产生的非细菌来源的启动子也可偶合于相容RNA聚合酶以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例(Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：107)。此外，杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域(欧洲专利公开案第267 851号)。

除功能启动子序列外，有效的核糖体结合位点也适用于外来基因在原核生物中的表达。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列(Shine等人，NATURE(1975)254：34)。认为SD序列是通过将SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3’末端之间的碱基配对来促进mRNA结合于核糖体(Steitz等人，″Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA″，InBiological Regulation and Development：Gene Expression(Ed.R.F.Goldberger，1979))。为了用弱核糖体结合位点表达真核生物基因和原核生物基因(Sambrook等人，″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，1989)。

术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”意指可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。特征为诸如存在编码4HB多肽的核苷酸序列的相关特性的充分类似于亲本的亲本细胞后代包括于这一定义所意指的后代中。

选择用于表达4HB多肽的合适宿主细菌对所属领域的普通技术人员是众所周知的。在选择用于表达的细菌宿主中，合适的宿主可包括展示尤其具有良好的包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固的宿主。细菌宿主通常可从多种来源获得，其包括但不限于加里福利亚大学(伯克利分校)生物物理及医学物理学系细菌遗传储备中心(Bacterial Genetic Stock Center，Department ofBiophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))和美国典型培养物收藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常使用源自K菌株的细菌(例如W3110)或源自B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株尤其适用，因为其生长参数极为众所周知且稳固。此外，这些菌株为非病原性的，出于安全和环境原因其在商业上是重要的。在本发明的方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主是BL21的菌株。在本发明的方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主是包括但不限于OMP-和LON-的去除蛋白酶的菌株。在本发明的方法的另一实施例中，宿主细胞菌株是假单胞菌的物种，其包括但不限于荧光假单胞菌、绿脓杆菌和恶臭假单胞菌。命名为菌株MB 101的荧光假单胞菌变种1可作为宿主菌株由The Dow Chemical Company购得以用于治疗蛋白产生方法(Midland，MI，可于万维网dow.com得到)。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,755,465和4,859,600号描述假单胞菌菌株作为宿主细胞用于hGH生产。

一旦建立重组宿主细胞菌株(即已经将表达构筑体引入宿主细胞中并分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)，则在适于产生4HB多肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。如对所属领域的技术人员所显而易见，培养重组宿主细胞菌株的方法依赖于所用表达构筑体的性质和宿主细胞的特性。通常使用所属领域众所周知的方法培养重组宿主菌株。通常于含有碳、氮和无机盐的可吸收源和视情况含有维生素、氨基酸、生长因子及其他所属领域众所周知的蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。

可以分批或连续型式培养重组宿主细胞，同时以分批或连续型式采集细胞(在其中4HB多肽于细胞中累积的情形下)或采集培养物上清液。为于原核宿主细胞中产生，分批培养和细胞采集是优选的。

本发明的4HB多肽通常在于重组系统中表达之后进行纯化。可以多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化4HB多肽。于细菌宿主细胞中产生的4HB多肽通常不良溶解或不可溶(以包涵体的形式)。在本发明的一个实施例中，可易于在4HB多肽中进行氨基酸取代，其是出于增加利用本文公开的方法以及所属领域中已知的方法重组产生的蛋白的溶解性的目的而加以选择。在不可溶蛋白的情形下，可通过离心而从宿主细胞溶解产物中收集蛋白并可进一步随后将细胞均质化。在不良溶解的蛋白的情形下，可加入包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以促使部分可溶的蛋白沉淀。所沉淀的蛋白随后可便利地通过离心进行收集。可使用多种所属领域的普通技术人员众所周知的方法破裂或均质化重组宿主细胞以从细胞内释放包涵体。宿主细胞破裂或均质化可使用包括但不限于酶促细胞破裂、超声波处理、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破裂的众所周知技术进行。在本发明的方法的一个实施例中，使用高压释放技术破裂大肠杆菌宿主细胞以释放4HB多肽的包涵体。已发现包涵体形式的不可溶4HB多肽的产率可通过利用仅将大肠杆菌宿主细胞通过均质器一次而得以增加。当处理4HB多肽的包涵体时，最小化重复的均质化时间是有利的以便最大化包涵体产率而不会具有归因于诸如溶解、机械剪切或蛋白水解作用的因素的损失。

随后可使用所属领域中已知的多种合适增溶剂中的任一种使不可溶或所沉淀的4HB多肽溶解。优选地以脲或盐酸胍使4HB多肽溶解。应使溶解的4HB多肽-BP的体积最小化，以便可使用方便的易于管理的批次大小产生大批次。这个因素在其中重组宿主可以数千升的体积的批次生长的大规模商业环境中可为重要的。此外，当在大规模商业环境(尤其是用于人类医药用途)中制造4HB多肽时，如果可能，则应避免可损坏机械和容器或蛋白产物本身的苛性化学品。已在本发明的方法中展示可使用较温和的变性剂脲代替苛性变性剂盐酸胍来溶解4HB多肽包涵体。使用脲会显著降低对在4HB多肽的制造和纯化过程中所用的不锈钢设备损坏的风险，同时有效溶解4HB多肽包涵体。

当4HB多肽作为融合蛋白产生时，优选地去除融合序列。可通过酶促或化学裂解、优选地通过酶促裂解来完成融合序列的去除。可使用所属领域的技术人员众所周知的方法完成融合序列的酶促去除。用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的特性确定，且反应条件由酶的选择指定，如对所属领域的技术人员显而易见。优选地以众所周知的方法从经裂解的融合序列纯化经裂解的4HB多肽。这些方法由融合序列和4HB多肽的特性和性质确定，如对所属领域的技术人员显而易见。用于纯化的方法可包括但不限于大小排除色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。

优选地也纯化4HB多肽以从蛋白溶液中去除DNA。可以任何所属领域中已知的合适方法(诸如沉淀或离子交换色谱)去除DNA，但优选地通过用诸如但不限于硫酸鱼精蛋白的核酸沉淀剂沉淀来去除。可使用包括但不限于离心或过滤的标准众所周知方法从沉淀DNA中分离4HB多肽。宿主核酸分子的去除在其中4HB多肽将用于治疗人类的环境中为重要因素且本发明的方法将宿主细胞DNA减少到医药学上可接受的水平。

也可在蛋白表达中使用用于小规模或大规模发酵的方法，其包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、空心纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法的每一种都可以分批、补料或连续模式方法进行。

通常可使用所属领域中的标准方法回收本发明的人类4HB多肽。举例而言，可离心或过滤培养基或细胞溶解产物以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所要体积或透滤入合适缓冲液中以调节制剂以用于进一步纯化。本发明的4HB多肽的进一步纯化包括从完整形式分离4HB多肽变异体的脱酰胺和截短形式。

任何以下例示性程序都可用于纯化本发明的4HB多肽：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAE SEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。

可根据所属领域的技术人员已知和使用的标准程序将本发明的蛋白部分地或大体上纯化到均质，所述蛋白包括但不限于包含非天然氨基酸的蛋白、抗包含非天然氨基酸的蛋白的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白的结合搭配物等。因此，可以所属领域中众所周知的多种方法中的任一种回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、管柱色谱、亲和管柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等等。必要时，可在产生正确折叠的成熟蛋白中使用蛋白再折叠步骤。高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其他合适方法可用于其中希望高纯度的最终纯化步骤。在一个实施例中，所产生的抗非天然氨基酸的抗体(或包含非天然氨基酸的蛋白)被用作纯化试剂，包括但不限于用于基于亲和纯化包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白。必要时，在部分或完全纯化到均质后，所述多肽视情况用于多种效用，包括但不限于用作检定组份、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体产生的免疫原。

除本文所提及的其他参考文献之外，多种纯化/蛋白折叠方法在所属领域中众所周知，其包括但不限于以下文献中所述的方法：R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in EnzymoloRy Vol. 182：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；Bollag等人，(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols HandbookHumana Press，NJ，Harris和Angal，(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein Purification：Principles and Practice 3rd Edition SpringerVerlag，NY；Janson和Ryden，(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，Second Edition Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)，Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；及其中所引用的参考文献。

在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的相关蛋白或多肽的一个优点在于所述蛋白或多肽通常将折叠为其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员应了解，在合成、表达和/或纯化后，蛋白可具有不同于相关多肽的所要构象的构象。在本发明的一方面，视情况将所表达的蛋白变性并随后复性。这一操作是利用所属领域中已知的方法来完成，所述方法包括但不限于通过向相关蛋白或多肽中加入伴侣蛋白、通过将蛋白溶于诸如盐酸胍的离液剂中、应用蛋白二硫键异构酶等。

一般而言，有时希望变性或还原所表达的多肽并然后使所述多肽再折叠为优选构象。举例而言，可向相关翻译产物中加入胍、脲、DTT、DTE和/或伴侣蛋白。还原、变性和复性蛋白的方法对所属领域的技术人员是众所周知的(参看以上参考文献和Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem..4：581-585；和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。举例而言，Debinski等人描述包涵体蛋白在胍-DTE中的变性和还原。蛋白可在含有(包括但不限于)氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流入或以其他方式进入以与一种或一种以上多肽或其他表达产物接触，或反之亦然。

在真核产生4HB多肽的情形下，如此产生的4HB多肽可能错误折叠并因而缺少生物活性或具有降低的生物活性。蛋白的生物活性可通过“再折叠”而得以恢复。一般而言，通过使用例如一种或一种以上离液剂(例如脲和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))来溶解(其中4HB多肽也为不可溶的)、解折叠和还原多肽链而使错误折叠的4HB多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后加入氧化剂(例如氧、半胱氨酸或胱胺)，使得再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法使4HB多肽再折叠，诸如描述于美国专利第4,511,502、4,511,503和4,512,922号(其以引用的方式并入本文中)中的方法。4HB多肽也可与其他蛋白共折叠以形成异质二聚体或异质多聚体。在再折叠或共折叠之后，优选地将4HB多肽进一步纯化。

一般纯化方法可以任何适当顺序对包含4HB多肽的细胞溶解产物或得自任何分离步骤的任何4HB多肽混合物进行多种分离步骤中的任一步骤，其包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。

用于执行本文所述技术的设备及其他必需材料可由市面购得。泵、馏分收集器、监视器、记录仪和整个系统可购自例如Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)和Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)。包括但不限于交换基质材料、介质和缓冲液的色谱材料也可购自所述公司。

诸如洗涤和洗脱的本文所述的管柱色谱方法中的平衡及其他步骤可使用诸如泵的专门设备更快速地完成。市售的泵包括但不限于HILOAD

泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器和SUPERFRAC

馏分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。混合器也可用于形成pH和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和直列式混合器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

色谱方法可使用任何市售监视器加以监控。所述监视器可用于搜集如UV、pH和导电性的信息。探测器的实例包括监视器UV-1、UVICORDS II、监视器UV-M II、监视器UV-900、监视器UPC-900、监视器pH/C-900和导电性监视器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。实际上，整个系统可由市面购得，其包括Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的各种AKTA

系统。

在本发明的一个实施例中，举例而言，通过首先于脲中将所得纯化4HB多肽变性，随后在含有还原剂(诸如DTT)的合适pH下的TRIS缓冲液中稀释，可使4HB多肽还原和变性。在另一实施例中，4HB多肽在脲中在约2M到约9M之间的浓度范围中变性，随后在TRIS缓冲液中在约5.0到约8.0的范围内的pH下稀释。然后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，再折叠混合物在室温下培育4小时到24小时。然后可将经还原和变性的4HB多肽混合物进一步分离或纯化。

如本文所述，可在进行任何随后的分离步骤之前调节第一4HB多肽混合物的pH。此外，可使用所属领域中已知的技术浓缩第一4HB多肽混合物或其任何随后的混合物。此外，可使用所属领域的普通技术人员众所周知的技术将包含第一4HB多肽混合物或其任何随后混合物的洗脱缓冲液交换为适于随后分离步骤的缓冲液。

离子交换色谱在一个实施例中且作为可选额外步骤，可对第一4HB多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换管柱包括HITRAP、HIPREP

和HILOAD管柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。所述管柱利用强阴离子交换剂，诸如Q SEPHAROSE

Fast Flow、Q SEPHAROSE

High Performance和QSEPHAROSE

XL；强阳离子交换剂，诸如SP SEPHAROSEHigh Performance、SP SEPHAROSEFast Flow和SP SEPHAROSE

XL；弱阴离子交换剂，诸如DEAE SEPHAROSE

Fast Flow；和弱阳离子交换剂，诸如CM SEPHAROSEFastFlow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可在纯化过程的任何阶段对4HB多肽进行阳离子交换管柱色谱以分离大体上纯化的4HB多肽。可使用任何合适的阳离子交换基质进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括但不限于纤维性、多孔性、无孔性、微粒状、珠粒化和交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括但不限于纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚和任何前述物质的复合物。在将4HB多肽吸附到阳离子交换基质上之后，通过使基质接触具有足够高的pH和离子强度的缓冲液以将4HB多肽从基质上置换，可将大体上纯化的4HB多肽洗脱。用于高pH洗脱大体上纯化的4HB多肽的合适缓冲液包括但不限于浓度范围为至少约5mM到至少约100mM的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。

反相色谱可根据所属领域的普通技术人员已知的合适实验方案进行RP-HPLC以纯化蛋白。例如参看Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可对4HB多肽进行RP-HPLC以分离大体上纯化的4HB多肽。在这点上，可使用具有多种长度的烷基官能基的经二氧化硅衍生的树脂，所述长度包括但不限于至少约C₃到至少约C₃₀、至少约C₃到至少约C₂₀和至少约C₃到至少约C₁₈。或者，可使用聚合树脂。举例而言，可使用TosoHaasAmberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基树脂和聚合树脂。此外，可以诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC管柱。可使用含有离子对偶剂和有机调节剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗脱缓冲液从RP-HPLC管柱洗脱4HB多肽。最常用的离子对偶剂包括但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、四氟乙酸、六氟丁酸、三乙胺、乙酸四甲铵、乙酸四丁铵、乙酸三乙铵。可使用一种或一种以上的梯度或等度条件进行洗脱，同时优选梯度条件以缩减分离时间并减少峰宽度。另一方法包括使用具有不同溶剂浓度范围的两个梯度。用于本文的合适洗脱缓冲液的实例可包括但不限于乙酸铵和乙腈溶液。

疏水相互作用色谱纯化技术可对4HB多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLESAND METHODS(目录号18-1020-90，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其以引用的方式并入本文。合适的HIC基质可包括但不限于经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂的基质，其包括但不限于聚乙烯胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质。疏水相互作用管柱色谱的市售来源包括但不限于HITRAP、HIPREP和HILOAD管柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。简言之，在装料之前，可使用所属领域的普通技术人员已知的标准缓冲液平衡HIC管柱，所述标准缓冲液诸如为乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES。在装载4HB多肽之后，然后可使用标准缓冲液和条件洗涤管柱以去除不需要的物质但将4HB多肽保留于HIC管柱上。可用约3到约10倍管柱体积的标准缓冲液洗脱4HB多肽，所述缓冲液诸如尤其为含有EDTA和比平衡缓冲液低的硫酸铵浓度的HEPES缓冲液或乙酸/氯化钠缓冲液。使用例如磷酸钾梯度降低线性盐梯度可用于洗脱4HB分子。举例而言，然后可通过诸如透滤或超滤的过滤法来浓缩洗脱液。可应用透滤去除用于洗脱4HB多肽的盐。

其他纯化技术可对第一4HB多肽混合物或其任何随后的混合物进行使用例如凝胶过滤(GELFILTRATION：PRINCIPLESAND METHODS(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其以引用的方式并入本文中)、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等等的另一分离步骤，以去除任何过量的盐并以合适缓冲液置换所述缓冲液以用于随后分离步骤甚或调配最终药物产品。可使用所属领域的普通技术人员已知的技术在本文所述的各步骤监控包括大体上纯化的4HB多肽的4HB多肽的产率。这些技术也可用于在最后的分离步骤后评估大体上纯化的4HB多肽的产率。举例而言，可使用诸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC的具有多种烷基链长度的数种反相高压液相色谱管柱以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC的任一种监控4HB多肽的产率。

可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或者通过使用Western印迹和ELISA检定测量4HB多肽来测定纯度。举例而言，可产生抗分离自阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收的蛋白的多克隆抗体。也可使用所述抗体探测污染性宿主细胞蛋白的存在。

额外纯化程序包括描述于美国专利第4,612,367号中的程序并包括但不限于：(1)在约7到约9的pH下将包含hEPO多肽的混合物加载到反相大孔性丙烯酸酯共聚物树脂支撑物上；和(2)以具有约7到约9的pH并含有约20体积％至约80体积％的选自由丙酮、乙腈和丙酮与乙腈的组合组成的群组的有机稀释剂的水性洗脱液从所述支撑物洗脱hEPO多肽。

用于纯化EPO蛋白的典型方法公开于WO96/35718(Burg，1996年11月14日公开)中并在下文描述。蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)(Pharmacia)是由Cibacron蓝色染料共价结合在其表面的琼脂糖凝胶珠粒组成。由于EPO结合蓝色琼脂糖凝胶比多数非蛋白污染物、一些蛋白杂质和PVA更强，所以EPO可在这一步骤中富集。通过增加盐浓度以及pH来进行蓝色琼脂糖凝胶管柱的洗脱。将管柱用80-1001蓝色琼脂糖凝胶装填，用NaOH再生并用平衡缓冲液(氯化钠/钙和乙酸钠)平衡。装载经酸化和过滤的发酵罐上清液。在完成装载后，首先用类似于平衡缓冲液的含有更高氯化钠浓度的缓冲液并连续用TRIS-碱缓冲液洗涤管柱。产物用TRIS-碱缓冲液洗脱并根据主要洗脱曲线以单溶离份收集。

丁基Toyopearl 650 C(Toso Haas)是脂族丁基残基共价偶合于其上的以聚苯乙烯为基础的基质。由于EPO与这种凝胶结合比多数杂质和PVA更强，所以其必须用含有异丙醇的缓冲液加以洗脱。将管柱用30-401丁基Toyopearl 650C装填，用NaOH再生，用TRIS-碱缓冲液洗涤并用含有异丙醇的TRIS-碱缓冲液平衡。使蓝色琼脂糖凝胶洗出液适于管柱平衡缓冲液中异丙醇的浓度并装载到管柱上。随后将管柱用具有增加的异丙醇浓度的平衡缓冲液洗涤。产物用洗脱缓冲液(具有高异丙醇含量的TRIS-碱缓冲液)洗脱并根据主要洗脱曲线以单溶离份收集。

羟磷灰石Ultrogel(Biosepra)是由并入琼脂糖基质中以改良机械性质的羟磷灰石组成。EPO对羟磷灰石具有低亲和力且因而可以比蛋白杂质更低的磷酸盐浓度洗脱。将管柱用30-401的羟磷灰石Ultrogel装填并用磷酸钾/氯化钙缓冲液和NaOH随后用TRIS-碱缓冲液再生。然后用含有少量异丙醇和氯化钠的TRIS-碱缓冲液使其平衡。将丁基Toyopearl色谱的含EPO洗出液装载于管柱上。随后将管柱用平衡缓冲液和不含异丙醇和氯化钠的TRIS-碱缓冲液洗涤。产物用含有低浓度的磷酸钾的TRIS-碱缓冲液洗脱并根据主要洗脱曲线以单溶离份收集。

RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)是由表面具有C4-烷基链的硅胶颗粒组成。将4HB多肽与蛋白杂质分离是基于疏水相互作用的强度不同。以稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢管柱(充填2.8到3.2升的Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟磷灰石Ultrogel洗出液并装载到Vydac C4管柱上。为洗涤和洗脱，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集溶离份并立即以磷酸盐缓冲液中和。汇集IPC限制内的4HB多肽溶离份。

DEAE琼脂糖凝胶(Pharmacia)材料是由共价结合于琼脂糖凝胶珠粒表面的二乙胺基乙基(DEAE)-基团组成。4HB多肽与DEAE基团的结合是由离子性相互作用介导。使乙腈和三氟乙酸通过管柱而不滞留。在这些物质洗出之后，通过在低pH下用乙酸盐缓冲液洗涤管柱来去除微量杂质。随后将管柱用中性磷酸盐缓冲液洗涤并用具有增加的离子强度的缓冲液洗脱4HB多肽。将管柱用DEAE Sepharose fast flow装填。调节管柱体积以确保4HB多肽以3-10毫克4HB多肽/毫升凝胶的范围装载。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤管柱。装载汇集的HPLC洗出液的溶离份并将管柱用平衡缓冲液洗涤。然后将管柱用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤随后用平衡缓冲液洗涤。随后用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)将4HB多肽从管柱洗脱并根据主要洗脱曲线以单溶离份收集。将DEAE琼脂糖凝胶管柱的洗出液调节到指定导电率。将所得药物物质无菌过滤到特氟龙(Teflon)瓶中并储存于-70℃。

可使用多种方法和程序评估含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的4HB蛋白的产率和纯度，所述方法包括但不限于Bradford检定、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、库马斯染色SDS-PAGE、质谱(包括但不限于MALDI-TOF)及其他所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白的方法。

VIII.在替代系统中的表达

已在非重组宿主细胞、突变诱发变宿主细胞或在无细胞系统中应用数种策略将非天然氨基酸引入蛋白中。所述系统也适用于制造本发明的4HB多肽。诸如Lys、Cys和Tyr的具有反应性侧链的氨基酸的衍生作用使得赖氨酸转变为N²-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。鉴于最近肽片段的酶促连接和天然化学连接的发展，可能制造更大的蛋白。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent Annu.Rev.Biochem.，69：923(2000)。其中将用所要非天然氨基酸化学酰化的抑制tRNA加入能够支持蛋白生物合成的体外萃取物中的一般体外生物合成方法已经用于将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入多种几乎任何大小的蛋白中。例如参看V.W.Cornish、D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：621(1995)；CJ.Noren，SJ.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specific incorporation ofunnatural amino acids into proteins，Science 244：182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specificincorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，L Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。已将广泛的官能基引入蛋白中用于研究蛋白稳定性、蛋白折叠、酶机制和信号转导。

开发被称为选择压力并入的体内方法以利用野生型合成酶的杂交性。例如参看N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13：41(1999)。将其中供应细胞特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基础培养基中，同时目标基因的转录受到抑制。在平稳生长期的开始，天然氨基酸被耗尽并用非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白的表达会导致含有非天然类似物的蛋白积累。举例而言，使用这一策略，已将邻、间和对氟苯丙氨酸并入蛋白中，并在可易于鉴别的UV光谱中展现两个特征性肩峰，例如参看C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，284：29(2000)；已在噬菌体T4溶菌酶中使用三氟甲硫氨酸置换甲硫氨酸以通过¹⁹F NMR研究其与壳寡糖配位体的相互作用，例如参看H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404(1997)；并且已并入三氟亮氨酸以取代亮氨酸，从而导致亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，40：1494(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白以利于解析X射线结晶学中的相。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBO J.，9：1665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.BioL 1：283(1994)；N.Budisa，B，Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem..230：788(1995)；和N.Budisa，W.Kambrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270：616(1997)。也已经有效地并入具有烯或炔官能基的甲硫氨酸类似物，从而允许以化学方法另外修饰蛋白。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBS Lett..428：68(1998)；J.C.M.vanHest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc，122：1282(2000)；和K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，其以引用的方式并入本文中。

这一方法的成功依赖于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，其一般要求高选择性以保证蛋白翻译的保真度。扩展这一方法的范畴的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，其已在有限数量的情形下实现。举例而言，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中以Gly置换Ala²⁹⁴会增加底物结合口袋的大小并导致tRNAPhe由对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化。参看M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33：7107(1994)。包含这一突变PheRS的大肠杆菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸以代替苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett..364：272(1995)；和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467：37(2000)。类似地，大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点附近的点突变Phel30Ser展示允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，J.Biol.Chem..275：40324(2000)。

体内将非天然氨基酸并入蛋白的另一策略是修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分结构上类似于同源天然氨基酸的氨基酸且因而活化其。这一错误在单独的位点得到校正，其将错装上的氨基酸从tRNA去酰化以维持蛋白翻译的保真度。如果合成酶的校对活性丧失，则错误活化的结构类似物可逃避编辑功能并被并入。最近已经用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证明这种方法。参看V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292：501(2001)。ValRS可用Cys、Thr或氨基丁酸酯(Abu)错氨酰化tRNAVal；这些非同源氨基酸随后由编辑域水解。在随机诱发大肠杆菌染色体突变后，选择在ValRS的编辑域中具有突变的突变大肠杆菌株。这个编辑缺陷型ValRS用Cys错误地装载tRNAVal。因为Abu空间上类似于Cys(在Abu中Cys的-SH基团以-CH₃置换)，所以在将这一突变大肠杆菌株在Abu存在下生长时突变ValRS也将Abu并入蛋白。质谱分析展示约24％的缬氨酸在天然蛋白中的各缬氨酸位置由Abu置换。

固相合成和半合成方法也允许合成多种含有新颖氨基酸的蛋白。举例而言，参看以下公开案及其中所引用的参考文献，其如下：Crick，F.J.C.，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature192：1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.Theeffect of Pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of anS-peptide fragment，J.Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Syntheticapproaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes，Ace Chem Res，47-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide seementcoupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，3808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailingunprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)：221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem，11(3)：255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering bychemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；和Jackson，D.y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligase for TotalSynthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)：243(1994)。

已使用化学修饰将包括多种辅助因子、自旋标记和寡核苷酸的非天然侧链体外引入蛋白。例如参看Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.Thechemical modification of enzymatic specificity.Annu Rev Biochem，54：565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Science，226(4674)：505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Propertiesof thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.，MX.Anew enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，3153-3154(1966)；和Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopicprobes into antibody combining sites，Science，242(4881)：1038～1040(1988)。

或者，已经使用应用化学修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法将数种生物物理探针体外并入所合成的蛋白。参看以下公开案及其中所引用的参考文献：Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62：483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslin Ung ofthe signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of thesignal recognition particle，Proc.Natl.Acad.Sci，83(22)：8604-8608(1986)。

之前已证明可通过将化学氨酰化的抑制tRNA加入用含有所要琥珀无义突变的基因编程的蛋白合成反应来将非天然氨基酸体外位点特异性地并入蛋白。使用这些方法，人们可使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株将多种常见二十种氨基酸用近似结构同系物取代，例如氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins Science 244：182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of anon-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc，111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducingunnatural amino acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W.&Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesiswith an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24，435-62(1995)。

举例而言，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA并用非天然氨基酸化学氨酰化。使用常规定点突变诱发在蛋白基因的相关位点引入终止密码子TAG。例如参看Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5’，3’Exonuclease inphosphoi’othioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)：791-802(1988)。当将酰化抑制tRNA和突变基因组合于体外转录/翻译系统中时，应答UAG密码子并入非天然氨基酸，其产生在指定位置含有所述氨基酸的蛋白。使用[³H]-Phe的实验和使用α-羟基酸的实验证明仅所要氨基酸被并入由UAG密码子指定的位置且这个氨基酸并不并入蛋白中的任何其他位点。例如参看Noren等人，同上；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology10(6)：425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specificincorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255(5041)：197-200(1992)。

已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白。例如参看M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268：439(1995)；和D.A.Doueherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4：645(2000)。向爪蟾卵母细胞同时注射两种体外制备的RNA物质：一种在相关氨基酸位置具有UAG终止密码子的编码目标蛋白的mRNA和一种经所要非天然氨基酸氨酰化的琥珀抑制tRNA。卵母细胞的翻译机构然后在由UAG指定的位置插入非天然氨基酸。这种方法已经允许通常不受体外表达系统作用的整合膜蛋白的体内结构功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体以通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参看G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol Chem 271：19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4：739(1997)；使用笼状酪氨酸类似物以实时监控离子通道中的构象改变，例如参看J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619(1998)；和使用α羟基氨基酸改变离子通道骨架以探测其门控机制。例如参看P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和HI A.Lester，Cell，96：89(1999)；和T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat. Neurosci..4：239(2001)。

体内直接将非天然氨基酸并入蛋白的能力提供高突变蛋白产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性和在治疗型治疗中使用这些突变蛋白的优点。将具有各种大小、酸性、亲核性、疏水性及其他特性的非天然氨基酸包括入蛋白中的能力可极大程度地扩展我们合理和系统地操纵蛋白结构的能力以探测蛋白功能和产生具有新颖特性的新的蛋白或有机体。然而，所述方法是困难的，因为在蛋白翻译中实现高程度的保真度所需要的tRNA-合成酶相互作用的复杂性质。

在位点特异性并入对-F-Phe的一个尝试中，在耐对-F-Phe的Phe营养缺陷型大肠杆菌株中使用酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对。例如参看R.Furter，Protein Sci..7：419(1998)。

也可能使用无细胞(体外)翻译系统获得本发明的4HB多核苷酸的表达。在其中可包括mRNA作为模板(体外翻译)或DNA作为模板(将体外转录与翻译组合)的这些系统中，由核糖体指导体外合成。已经有显著努力用于开发无细胞蛋白表达系统。例如参看Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology andBioengineering，74：309～316(2001)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，BiotechnologyLetters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66，180-188，(1999)；和Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号、美国专利公开案第2002/0081660号、WO00/55353、WO90/05785，其以引用的方式并入本文中。可用于表达包含非天然编码氨基酸的4HB多肽的另一方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry&Biology 10：1043-1050(2003)。在这一方法中，在核糖体上将连接于嘌呤霉素的mRNA模板翻译为肽。如果一个或一个以上tRNA分子已经修饰，则非天然氨基酸也可并入于肽中。在最后一个mRNA密码子被读取以后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果在体外检定中发现所得mRNA-肽接合物具有引人关注的特性，则其特性易于由mRNA序列公开。以这种方式，人们可筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的4HB多肽的文库以鉴别具有所要特性的多肽。最近，已经报导利用纯化组份的体外核糖体翻译允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100：6353(2003)。

IX.偶合于4HB多肽的大分子聚合物

可使用本文所述的组合物、方法、技术和策略实现本文所述的对非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将另一官能基并入于多肽的非天然氨基酸组份上，其包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光致交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能基、与其他分子共价或非共价相互作用的基团、光封闭部分、可光致异构化的部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、延长侧链、与碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或以上物质的任何组合或者任何其他所要化合物或物质。作为如本文所述的组合物、方法、技术和策略的说明性非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物添加于非天然氨基酸多肽，同时应了解，另外所述的组合物、方法、技术和策略也可用于(必要时经适当修饰且所属领域的技术人员可利用本文公开内容进行)添加包括但不限于以上所列出者的其他官能基。

多种大分子聚合物及其他分子可连接于本发明的4HB多肽以调节4HB多肽的生物特性和/或为4HB分子提供新的生物特性。这些大分子聚合物可经由天然编码氨基酸、经由非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加于天然或非天然氨基酸的任何取代基或官能基连接于4HB多肽。

本发明提供大体上均质的聚合物：蛋白接合物的制剂。如本文所用的“大体上均质”意谓观察到聚合物：蛋白接合物分子大于总蛋白的一半。所述聚合物：蛋白接合物具有生物活性且本文提供的本发明“大体上均质”的聚乙二醇化4HB多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点的制剂，所述优点例如为在批次之间药物动力学的预测性中的临床应用中的易用性。

人们也可选择制备聚合物：蛋白接合物分子的混合物，且本文提供的优点在于人们可选择单聚合物：蛋白接合物的比例以包括于所述混合物中。因此，必要时，人们可制备各种蛋白与各种数量的附接聚合物部分(即二-、三-、四-等)的混合物并将所述接合物与所述使用本发明的方法制备的单聚合物：蛋白接合物组合，并具有与预定比例的单聚合物：蛋白接合物的混合物。

所选聚合物可为水溶性的以便其所连接的蛋白不在诸如生理环境的含水环境中沉淀。聚合物可为分枝或不分枝的。对于治疗性使用终端产物制剂，聚合物优选地为医药学上可接受的。

聚乙二醇分子与蛋白分子的比例将有所变化，其在反应混合物中的浓度也将有所变化。一般而言，最佳比率(就反应效率而言，因为存在最小限度的过量未反应蛋白或聚合物)可由所选聚乙二醇的分子量和可用反应基的数量确定。当涉及分子量时，通常所述聚合物的分子量越高，则可能连接于蛋白的聚合物分子数量就越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑所述聚合物的分枝。通常，分子量越高(或分枝越多)，则聚合物：蛋白比率越高。

如本文所用，且当涵盖PEG：4HB多肽接合物时，术语“治疗有效量”意指产生对患者提供益处的血容比增加的量。所述量将在一个个体与另一个体之间变化且将取决于包括患者的总体身体条件和贫血的潜在病因的多种因素。举例而言，用于患慢性肾衰竭的患者的4HB多肽的治疗有效量为每周三次50到150单位/千克。用于治疗的4HB多肽的量产生可接受的血容比增加的速率并将所述血容比维持在有益的水平(通常至少约30％且通常在30％到36％的范围内)。本发明的组合物的治疗有效量易于由所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和程序确定。

水溶性聚合物可为包括但不限于线性、分叉或分枝的任何结构形式。水溶性聚合物通常为聚(亚烷基二醇)，诸如聚(乙二醇)(PEG)，但也可应用其他水溶性聚合物。举例而言，使用PEG描述本发明的某些实施例。

PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可由市面购得或可通过根据所属领域中众所周知的方法开环聚合乙二醇制备而来(Sandier和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。广泛使用术语“PEG”涵盖任何聚乙二醇分子而不管大小或PEG末端的修饰，且可由下式表示为连接于4HB多肽：

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

其中n为2到10,000且X为H或包括但不限于C_1-4烷基的末端修饰。

在一些情形下，用于本发明的PEG终止于一个具有羟基或甲氧基的末端，即X为H或CH₃(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应基终止，由此形成双官能聚合物。典型反应基可包括通常用于与发现于20种常见氨基酸中的官能基反应的那些反应基(包括但不限于顺丁烯二酰亚胺基团、活化碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活化酯(包括但不限于N-羟基丁二酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与存在于非天然编码氨基酸中的互补官能基特异性反应的官能基(包括但不限于叠氮基、炔基)。应注意，由Y展示于上式的PEG的另一末端将直接或经由天然产生或非天然编码氨基酸间接连接于4HB多肽。举例而言，Y可为与多肽的胺基团(包括但不限于赖氨酸的ε胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲键合。或者，Y可为与硫醇基团(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基团)的顺丁烯二酰亚胺键合。或者，Y可为与通常不可经由20种常见氨基酸接近的残基的键合。举例而言，PEG上的叠氮基可与4HB多肽上的炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与存在于非天然编码氨基酸中的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，适用时，强亲核试剂(包括但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与存在于非天然编码氨基酸中的醛或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲，其在一些情形下可进一步通过以适当还原剂处理而还原。或者，强亲核试剂可经由非天然编码氨基酸并入4HB多肽中并用于优选地与存在于水溶性聚合物中的酮或醛基反应。

实践上必要时，可使用PEG的任何分子质量，必要时其包括但不限于约100道尔顿(Da)到100,000道尔顿或更高(包括但不限于有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。也可使用包括但不限于各链具有范围为1-100kDa(包括但不限于1-50kDa或5-20kDa)的分子量的PEG分子的分枝PEG。广泛的PEG分子描述于(包括但不限于)the Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，其以引用的方式并入本文中。

PEG分子的至少一个末端通常可用于与非天然编码氨基酸反应。举例而言，用于与氨基酸侧链反应的具有炔和叠氮部分的PEG衍生物可用于将PEG连接于如本文所述的非天然编码氨基酸。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基，则PEG通常含有炔部分以实现形成含有膦基的[3+2]环加成产物或经活化PEG物质(即酯、碳酸酯)以实现形成酰胺键合。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，则PEG通常含有叠氮部分以实现形成[3+2]Huisgen环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，则PEG通常包含有效的亲核基团(包括但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能基)以便实现分别形成对应的腙、肟和缩氨基脲键合。在其他替代性情形中，可使用与上述反应基的方向相反的方向，即非天然编码氨基酸中的叠氮部分可与含有炔的PEG衍生物反应。

在一些实施例中，具有PEG衍生物的4HB多肽变异体含有可与存在于非天然编码氨基酸的侧链上的化学官能基反应的化学官能基。

在一些实施例中，本发明提供含有叠氮和乙炔的聚合物衍生物，其包含具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物骨架。水溶性聚合物的聚合物骨架可为聚(乙二醇)。然而，应了解，包括但不限于聚乙二醇及其他相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物也适用于实践本发明，且使用术语PEG或聚(乙二醇)意欲涵盖和包括所有这些分子。术语PEG包括但不限于呈其任何形式的聚(乙二醇)，其包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、分枝PEG、悬垂PEG(即具有一个或一个以上悬垂于聚合物骨架的官能基的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键合的PEG。

PEG通常透明、无色、无味、可溶于水、对热稳定、对多种化学剂惰性、不水解或劣化且通常无毒。认为聚(乙二醇)为生物相容性的，即是说PEG能够与活组织或有机体共存而不引起损害。更特定而言，PEG为大体上非免疫原性的，即是说PEG在体内无产生免疫反应的倾向。当连接于诸如生物活性剂的在体内具有一些所要功能的分子时，PEG倾向于遮蔽所述药剂并可减少或消除任何免疫反应从而有机体可耐受所述药剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质的免疫反应或引起凝结或其他不希望的效应。具有式-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-(其中n为约3到约4000，通常为约20到约2000)的PEG适用于本发明。在本发明的一些实施例中，具有约800Da到约100,000Da的分子量的PEG尤其适用作聚合物骨架。

聚合物骨架可为线性或分枝的。分枝聚合物骨架在所属领域通常是已知的。分枝聚合物通常具有中心分枝核心部分和多个连接于所述中心分枝核心的线性聚合物链。PEG通常以分枝形式使用，其可通过将环氧乙烷加成到诸如甘油、甘油寡聚体、季戊四醇和山梨糖醇的各种多元醇上制备而来。中心分枝部分也可衍生自诸如赖氨酸的数种氨基酸。分枝聚(乙二醇)可以如R(-PEG-OH)_m(其中R是源自核心部分，诸如甘油、甘油寡聚体或季戊四醇，且m表示臂的数量)的一般形式表示。诸如描述于以下文献中的多臂PEG分子也可用作聚合物骨架：美国专利第5,932,462、5,643,575、5,229,490、4,289,872号、美国专利申请案2003/0143596、WO96/21469和WO93/21259，其各自以全文引用的方式并入本文中。

分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ₂)_n(其中Y为连接基且Z为通过规定长度的原子链连接于CH的活化末端基团)表示的分叉PEG的形式。

另一分枝形式悬垂PEG沿着PEG骨架而不是在PEG链的末端具有诸如羧基的反应基。

除这些PEG形式之外，也可制备在骨架中具有弱的或可降解键合的聚合物。举例而言，可制备在聚合物骨架中具有经受水解的酯键的PEG。如下文所示，这一水解作用导致聚合物裂解为较低分子量的片段：

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O-＞PEG-CO₂H+HO-PEG-。

所属领域的技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，其包括但不限于本文所公开者。

多种其他聚合物也适用于本发明。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物骨架尤其适用于本发明。合适聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇)，诸如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括但不限于乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等等。尽管聚合物骨架的各链的分子量可变化，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常为约6,000Da到约80,000Da的范围内。

所属领域的普通技术人员将认识到，大体上水溶性的骨架的前述列表绝非详尽且仅为说明性的，且预期所有具有上述品质的聚合材料都适用于本发明。

在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，其意谓聚合物骨架具有经官能基官能化或活化的至少两个末端且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的线性聚合物，其中各末端键结于可相同或不同的官能基。

在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X-A-POLY-B-N＝N＝N

其中：

N＝N＝N为叠氮部分；

B为连接部分，其可存在或不存在；

POLY为水溶性非抗原性聚合物；

A为连接部分，其可存在或不存在且可与B相同或不同；且

X为第二官能基。

A和B的连接部分的实例包括但不限于含有高达18个且更优选地在1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包括于烷基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。A和B的连接部分的其他实例包括但不限于含有高达10个且更优选地5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其他实例包括描述于美国专利第5,932,462、5,643,575号和美国专利申请公开案2003/0143596(其各自以引用的方式并入本文中)中的那些连接基。所属领域的普通技术人员将认识到，连接部分的上述列表绝非详尽且仅为说明性的，且预期所有具有上述品质的连接部分都适用于本发明。

用作X的合适官能基的实例包括但不限于羟基、受保护的羟基、烷氧基、诸如N-羟基丁二酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯的活性酯、诸如碳酸N-羟基丁二酰亚胺基酯和碳酸1-苯并三唑基酯的活性碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护的胺、酰肼、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。所属领域的技术人员应了解，所选X部分应与叠氮基相容从而不发生与叠氮基的反应。含叠氮的聚合物衍生物可为同双官能性，其意谓第二官能基(即X)也为叠氮部分，或为杂双官能性，其意谓第二官能基为不同的官能基。

术语“受保护的”意指存在防止化学反应性官能基在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基将视受保护的化学反应基的类型而改变。举例而言，如果化学反应基是胺或酰肼，则保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应基是硫醇，则保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基是诸如丁酸或丙酸的羧酸或羟基，则保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属领域中已知的其他保护基也可用于本发明。

文献中末端官能基的特定实例包括但不限于碳酸N-丁二酰亚胺基酯(例如参看美国专利第5,281,698、5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人，Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zaplipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、丙酸丁二酰亚胺基酯和丁酸丁二酰亚胺基酯(例如参看Olson等人，Poly(ethyleneglycol)Chemistry&Biological Applications，第170-181页，Harris&ZaplipskyEds.，ACS，Washington，D.C.，1997；也参看美国专利第5,672,662号)、丁二酸丁二酰亚胺基酯(例如参看Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等人，Macrolol.Chem.180：1381(1979))、丁二酰亚胺基酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看美国专利第5,650,234号)、缩水甘油基醚(例如参看Pitha等人，Eur.J Biochem.94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(例如参看Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784号，美国专利第5,252,714号)、顺丁烯二酰亚胺(例如参看Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)，Romani等人，Chemistry of Peptides and Proteins2：29(1984))和Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有以上参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。

在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-N＝N＝N

其中：

X为上述官能基；且

n为约20到约4000。

在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N＝N＝N

其中：

W为包含1-10个之间的碳原子的脂族或芳族连接部分；

n为约20到约4000；且

X为上述官能基。m在1与10之间。

本发明的含叠氮的PEG衍生物可以所属领域中已知和/或本文公开的多种方法制备而来。在以下所示的一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物骨架(所述聚合物骨架具有键结于第一官能基的第一末端和键结于合适离去基的第二末端)与叠氮阴离子(其可与多种包括钠、钾、叔丁铵等等的合适平衡离子中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换并由叠氮部分置换，从而提供所要含叠氮的PEG聚合物。

X-PEG-L+N₃ ^--＞X-PEG-N₃

如所示，用于本发明的合适聚合物骨架具有式X-PEG-L，其中PEG是聚(乙二醇)且X是不与叠氮基反应的官能基且L是合适离去基。合适官能基的实例包括但不限于羟基、受保护的羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、受保护的胺、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、顺丁烯二酰亚胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合适离去基的实例包括但不限于氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根。

在用于制备本发明的含叠氮聚合物衍生物的另一方法中，使具有叠氮官能基的连接剂接触具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物骨架，以形成其中叠氮基与聚合物骨架通过连接基分开的含叠氮聚合物衍生物产物，其中所述连接剂具有将与PEG聚合物上的化学官能基选择性反应的化学官能基。

例示性反应流程展示如下：

X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N-＞PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N

其中：

PEG是聚(乙二醇)且X是诸如烷氧基或上述官能基的封端基团；且

M是不与叠氮官能基反应但与N官能基有效及选择性反应的官能基。

合适官能基的实例包括但不限于：如果N为胺则M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分则M为酮；如果N为亲核基团则M为离去基。

可以包括但不限于沉淀产物并必要时随后色谱的已知方法完成粗制产物的纯化。

更特定实例展示于以下PEG二胺的情形中，其中所述胺之一由诸如叔丁基-Boc的保护基部分保护且所得单保护PEG二胺与具有叠氮官能基的连接部分反应：

BocHN-PEG-NH₂+HO₂C-(CH₂)₃-N＝N＝N。

在这一情况下，可使用诸如亚硫酰氯或碳二酰亚胺试剂和N-羟基丁二酰亚胺或N-羟基苯并三唑的多种活化剂将胺基团与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮的连接子部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键之后，可直接使用所得经N-叔丁基-Boc保护的含叠氮衍生物修饰生物活性分子或可进一步将其精制以安装其他有用的官能基。举例而言，可通过用强酸处理来水解N-t-Boc基团以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作合成处理以安装其他诸如顺丁烯二酰亚胺基团、活化的二硫化物、活化酯等等的有用官能基以产生有价值的杂双官能试剂。

当希望在聚合物的各末端连接不同分子时，杂双官能衍生物尤其有用。举例而言，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG允许在PEG的一个末端连接具有活化亲电子基团(诸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等)的分子并在PEG的另一末端连接具有乙炔基团的分子。

在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X-A-POLY-B-C≡C-R

其中：

R可为H或烷基、烯、烷氧基或芳基或经取代的芳基；

B是连接部分，其可存在或不存在；

POLY是水溶性非抗原性聚合物；

A是连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且

X是第二官能基。

A和B的连接部分的实例包括但不限于含有高达18个且更优选地在1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包括于烷基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。A和B的连接部分的其他实例包括但不限于含有高达10个且更优选地5-6个碳原子的多官能化芳基。所述芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其他实例包括描述于美国专利第5,932,462、5,643,575号和美国专利申请公开案2003/0143596(其各自以引用的方式并入本文中)中的那些连接基。所属领域的普通技术人员将认识到，连接部分的上述列表绝非详尽且仅为说明性的，且预期多种具有上述品质的连接部分适用于本发明。

用作X的合适官能基的实例包括羟基、受保护的羟基、烷氧基、诸如N-羟基丁二酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯的活性酯、诸如碳酸N-羟基丁二酰亚胺基酯和碳酸1-苯并三唑基酯的活性碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护的胺、酰肼、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和乙炔。应了解，所选X部分应与乙炔基团相容从而不发生与所述乙炔基团的反应。含乙炔聚合物衍生物可为同双官能性，其意谓第二官能基(即X)也为乙炔部分，或为杂双官能性，其意谓第二官能基为不同的官能基。

在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-C≡CH

其中：

X是上述官能基；

n为约20到约4000；且

m在1与10之间。

各杂双官能基PEG聚合物的特定实例展示于下文。

本发明的含乙炔的PEG衍生物可使用所属领域的技术人员已知和/或本文公开的方法制备而来。在一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物骨架(所述聚合物骨架具有键结于第一官能基的第一末端和键结于合适亲核基团的第二末端)与具有乙炔官能基和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基的化合物反应。当具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基的分子组合时，所述离去基经历亲核置换且由所述亲核部分置换，从而提供所要含乙炔聚合物。

X-PEG-Nu+L-A-C-＞X-PEG-Nu-A-C≡CR’

如所展示，用于反应的优选聚合物骨架具有式X-PEG-Nu，其中PEG是聚(乙二醇)，Nu是亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能基反应的官能基。

Nu的实例包括但不限于主要经由SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚胺基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基团的额外实例包括主要经由亲核加成反应而反应的那些官能基。L基团的实例包括氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根及其他预期经历亲核置换的基团以及酮、醛、硫酯、烯、α-β不饱和羰基、碳酸酯及其他预期经历亲核试剂加成的亲电子基团。

在本发明的另一实施例中，A是具有1-10个之间碳原子的脂族连接子或6-14个之间碳原子的经取代芳基环。X是不与叠氮基反应的官能基且L是合适的离去基。

在制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量、在一个末端具有受保护的官能基或封端剂和在另一末端具有合适的离去基的PEG聚合物接触乙炔阴离子。

例示性反应流程展示如下：

X-PEG-L+-C≡CR’-＞X-PEG-C≡CR’

其中：

R’是H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。

在以上实例中，离去基L应具有足够的反应性以在接触足够浓度的乙炔阴离子时经历SN2型置换反应。完成由乙炔阴离子SN2置换离去基所需的反应条件在所属领域中是众所周知的。

通常可通过包括但不限于沉淀产物并必要时随后色谱的所属领域中已知的方法完成粗制产物的纯化。

水溶性聚合物可连接于本发明的4HB多肽。水溶性聚合物可经由并入4HB多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能基或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸上的任何官能基或取代基连接。或者，水溶性聚合物经由天然产生氨基酸(包括但不限于半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基团)连接于并入非天然编码氨基酸的4HB多肽。在一些情形下，本发明的4HB多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物(包括但不限于PEG和/或寡糖)。在一些情形下，本发明的4HB多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多连接于水溶性聚合物的天然编码氨基酸。在一些情形下，本发明的4HB多肽包含一个或一个以上连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸和一个或一个以上连接于水溶性聚合物的天然产生氨基酸。在一些实施例中，用于本发明的水溶性聚合物相对于未接合形式增强4HB多肽的血清半衰期。

可调节连接于本发明的4HB多肽的水溶性聚合物的数量(即聚乙二醇化或糖基化的程度)以提供改变的(包括但不限于增加的或降低的)诸如体内半衰期的药理学、药物动力学或药效学特征。在一些实施例中，4HB的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约百分之10、20、30、40、50、60、70、80、90、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。

含有强亲核基团(即酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物

在本发明的一个实施例中，包含含羰基的非天然编码氨基酸的4HB多肽经含有直接连接于PEG骨架的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之间)。

在一些实施例中，含肼或酰肼PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。

在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。

在本发明的另一实施例中，包含含羰基氨基酸的4HB多肽经含有借助于酰胺键合连接于PEG骨架的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

在一些实施例中，含肼或酰肼PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。

在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

在本发明的另一实施例中，包含含羰基氨基酸的4HB多肽经含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰，其中所述分枝PEG的各条链具有范围为10-40kDa且更优选地为5-20kDa的MW。

在本发明的另一实施例中，包含非天然编码氨基酸的4HB多肽经具有分枝结构的PEG衍生物修饰。举例而言，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

在一些实施例中，含氨基脲基团的PEG衍生物具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。

在一些实施例中，含羟胺基团的PEG衍生物具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

水溶性聚合物连接于4HB多肽的程度和位点可调节4HB多肽与4HB多肽受体在位点1的结合。在一些实施例中，安排键合以便4HB多肽以约400nM或更低的K_d、以150nM或更低的K_d且在一些情形下以100nM或更低的K_d(如由诸如对hGH描述于Spencer等人，J.Biol.Chem.，263：7862-7867(1988)中的平衡结合检定所测量)在位点1结合4HB多肽受体。

用于活化聚合物以及接合肽的方法和化学描述于文献中且在所属领域中已知。用于活化聚合物的常用方法包括但不限于用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二酰亚胺、磺酰卤化物、三氯三嗪等活化官能基(参看R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALAND APPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LlGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American ChemicalSociety，Washington.D.C.1991)。

可获得数种对PEG的官能化和接合的回顾和专论。例如参看Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。

用于活化聚合物的方法也可发现于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189中，且也可发现活化聚合物与酶之间的接合的方法，所述酶包括但不限于接合凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和过氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。所有引用的参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。

聚乙二醇化(即添加任何水溶性聚合物)含有诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸的非天然编码氨基酸的4HB多肽是以任何便利方法进行。举例而言，用炔终端的mPEG衍生物聚乙二醇化4HB多肽。简而言之，在室温下伴以搅拌将过量的固体mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH加入含对叠氮基-L-Phe的4HB多肽的水溶液中。通常用具有反应在其下进行的pH(通常约pH4-10)附近的pK_a的缓冲液缓冲水溶液。举例而言，用于在pH7.5下聚乙二醇化的合适缓冲液的实例包括但不限于HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HC1、EPPS和TES。必要时连续监控和调节pH。通常允许反应连续进行约1-48小时之间。

随后使反应产物经受疏水相互作用色谱以分离聚乙二醇化4HB多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH和聚乙二醇化4HB多肽的任何高分子量复合物，当未阻断的PEG在分子的两个末端经活化从而交联4HB多肽变异体分子时可形成所述高分子量复合物。疏水相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH流过管柱同时任何交联聚乙二醇化4HB多肽变异体复合物在所要形式后洗脱，其含有一个接合于一个或一个以上PEG基团的4HB多肽变异体分子。合适的条件视交联复合物对所要接合物的相对大小改变，且易于由所属领域的技术人员确定。含有所要接合物的洗出液通过超滤浓缩并通过透滤去盐。

必要时，获自疏水色谱的聚乙二醇化4HB多肽可进一步由所属领域的技术人员已知的一种或一种以上程序进行纯化，所述程序包括但不限于亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAE SEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)或萃取。表观分子量可通过与球蛋白标准比较而由GPC估算(PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press 1989，293-306)。4HB-PEG接合物的纯度可通过蛋白水解型降解(包括但不限于胰蛋白酶裂解)随后质谱分析来评估。Pepinsky B.等人，J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。

可进一步无限制地衍生或取代连接于本发明的4HB多肽的氨基酸的水溶性聚合物。

含叠氮PEG衍生物

在本发明的另一实施例中，用含有与存在于非天然编码氨基酸侧链上的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰4HB多肽。一般而言，PEG衍生物具有范围为1-100kDa且在一些实施例中范围为10-40kDa的平均分子量。

在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

在另一实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之间)。

在本发明的另一实施例中，包含含炔氨基酸的4HB多肽经含有末端叠氮部分的分枝PEG衍生物修饰，其中所述分枝PEG的各条链具有范围为10-40kDa且更优选地为5-20kDa的MW。举例而言，在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情形下X可存在或不存在。

含炔PEG衍生物

在本发明的另一实施例中，4HB多肽经含有与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

在本发明的另一实施例中，包含含炔非天然编码氨基酸的4HB多肽经含有借助于酰胺键合连接于PEG骨架的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。

在本发明的另一实施例中，包含含叠氮氨基酸的4HB多肽经含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰，其中所述分枝PEG的各条链具有范围为10-40kDa且更优选地为5-20kDa的MW。举例而言，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pC≡CH

其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)或不存在。

含膦PEG衍生物

在本发明的另一实施例中，4HB多肽经含有活化官能基(包括但不限于酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰，所述官能基进一步包含与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮部分反应的芳基膦部分。一般而言，PEG衍生物具有范围为1-100kDa且在一些实施例中范围为10-40kDa的平均分子量。

在一些实施例中，所述PEG衍生物具有以下结构：

其中n为1-10，X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基且W为水溶性聚合物。

在一些实施例中，所述PEG衍生物具有以下结构：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基。例示性R基团包括但不限于-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂。R’、R”、R和R′各自独立地意指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，举例而言，各R基团都是独立选择，当存在R’、R”、R和R′基团的一个以上时，各R’、R”、R

和R′基团情况同上。当R’和R”连接于相同的氮原子时，其可与氮原子组合以形成5、6或7元环。举例而言，-NR’R”意谓包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的以上讨论，所属领域的技术人员将了解术语“烷基”意谓包括如下基团：其包括结合到除氢基之外的基团的碳原子，诸如卤代烷基(包括但不限于-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括但不限于-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等)。

其他PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术

其他可连接于4HB多肽的例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括描述于以下文献者：例如美国专利公开案第2004/0001838、2002/0052009、2003/0162949、2004/0013637、2003/0228274、2003/0220447、2003/0158333、2003/0143596、2003/0114647、2003/0105275、2003/0105224、2003/0023023、2002/0156047、2002/0099133、2002/0086939、2002/0082345、2002/0072573、2002/0052430、2002/0040076、2002/0037949、2002/0002250、2001/0056171、2001/0044526、2001/0027217、2001/0021763号、美国专利第6,646,110、5,824,778、5,476,653、5,219,564、5,629,384、5,736,625、4,902,502、5,281,698、5,122,614、5,473,034、5,516,673、5,382,657、6,552,167、6,610,281、6,515,100、6,461,603、6,436,386、6,214,966、5,990,237、5,900,461、5,739,208、5,672,662、5,446,090、5,808,096、5,612,460、5,324,844、5,252,714、6,420,339、6,201,072、6,451,346、6,306,821、5,559,213、5,612,460、5,747,646、5,834,594、5,849,860、5,980,948、6,004,573、6,129,912号、WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/0605S、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316，其以引用的方式并入本文中。本文所述的任何PEG分子可以任何形式使用，所述形式包括但不限于单链、分枝、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。

增强对血清白蛋白的亲和力

也可将各种分子融合于本发明的4HB多肽以调节4HB多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，将分子连接或融合于本发明的4HB多肽以增强对动物中内源血清白蛋白的亲和力。

举例而言，在一些情形中，制备4HB多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括但不限于来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277：534-542(1996)和Sjolander等人，J，Immunol.Methods 201：115-123(1997))或者诸如描述于Dennis等人，J.Biol.Chem.277：35035-35043(2002)中的白蛋白结合肽。

在其他实施例中，本发明的4HB多肽经脂肪酸酰化。在一些情形下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。

在其他实施例中，本发明的4HB多肽直接与血清白蛋白(包括但不限于人类血清白蛋白)融合。对于EPO类似物的血清白蛋白融合，例如参看美国专利第6,548,653号，其以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员将认识到，多种其他分子也可连接于本发明中的4HB以调节与血清白蛋白或其他血清组份的结合。

X.4HB多肽的糖基化

本发明包括并入一个或一个以上具有糖残基的非天然编码氨基酸的4HB多肽。糖残基可为天然(包括但不限于N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包括但不限于3-氟半乳糖)。所述糖可通过N-或O-连接的糖苷键合(包括但不限于N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键合(包括但不限于肟或对应的C-或S-连接的糖苷)连接于非天然编码氨基酸。

可在体内或体外将糖(包括但不限于糖基)部分添加到4HB多肽上。在本发明的一些实施例中，包含含羰基非天然编码氨基酸的4HB多肽经以氨氧基衍生的糖修饰以产生经由肟键合连接的对应糖基化多肽。一旦与非天然编码氨基酸连接，所述糖可进一步通过用糖基转移酶及其他酶处理而精制以产生结合于4HB多肽的寡糖。例如参看H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.US：1702-1703(2003)。

在本发明的一些实施例中，包含含羰基非天然编码氨基酸的4HB多肽直接经制备为氨氧基衍生物的具有规定结构的聚糖修饰。所属领域的技术人员将认识到，包括叠氮、炔、酰肼、肼和氨基脲的其他官能基可用于将糖连接于非天然编码氨基酸。

在本发明的一些实施例中，包含含叠氮或炔基的非天然编码氨基酸的4HB多肽然后可通过包括但不限于分别与(包括但不限于)炔基或叠氮衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应来加以修饰。这一方法允许以极高选择性修饰蛋白。

XI.GH超基因家族成员二聚体和多聚体

本发明也提供GH超基因家族成员组合(包括但不限于hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO)同型二聚体、异质二聚体、同型多聚体或异质多聚体(即三聚体、四聚体等)，其中诸如含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO的GH超基因家族成员多肽结合于另一GH超基因家族成员或其变异体或任何其他为非GH超基因家族成员或其变异体的多肽，其可直接或经由连接子结合于多肽骨架。由于相比于单体其增加的分子量，诸如hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO的GH超基因家族成员二聚体或多聚体接合物可展现新的或所要的性质，包括但不限于相对于单体GH超基因家族成员的不同药理学、药物动力学、药效学、经调节的治疗剂半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的诸如hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO的GH超基因家族成员二聚体调节GH超基因家族成员受体的二聚作用。在其他实施例中，本发明的GH超基因家族成员二聚体或多聚体充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、促效剂或调节剂。

在一些实施例中，存在于含4HB的二聚体或多聚体中的4HB分子的一种或一种以上包含与存在于位点II结合区域内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸。因此，二聚体或多聚体的各4HB分子对于经由位点I界面结合4HB多肽受体而言是可接近的，但不可用于经由位点II界面结合第二4HB多肽受体。因此，4HB多肽二聚体或多聚体可啮合两个不同4HB多肽受体的各个的位点I结合位点，但是由于4HB分子具有与存在于位点II区域内的非遗传编码氨基酸相连接的水溶性聚合物，所以4HB多肽受体不能啮合4HB多肽配位体的位点II区域且二聚体或多聚体充当4HB多肽拮抗剂。在一些实施例中，存在于含4HB多肽的二聚体或多聚体中的4HB分子的一种或一种以上包含与存在于位点I结合区域内的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸，从而允许结合位点II区域。或者，在一些实施例中，存在于含4HB多肽的二聚体或多聚体中的4HB分子的一种或一种以上包含与存在于并不在位点I或位点II结合区域内的位点的水溶性聚合物相连接的非天然编码氨基酸，从而其均可用于结合。在一些实施例中，使用具有可用于结合的位点I、位点II或两者的4HB分子的组合。其中至少一个具有可用于结合的位点I且至少一个具有可用于结合的位点II的4HB分子的组合可提供具有所要活性或特性的分子。此外，具有可用于结合的位点I和位点II两者的4HB分子的组合可产生超促效剂4HB分子。

在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽(包括但不限于)经由Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接连接。在一些实施例中，所连接的GH超基因家族成员多肽和/或所连接的非GH超基因家族成员将包含不同的非天然编码氨基酸以利于二聚作用，其包括但不限于将经由Huisgen[3+2]环加成来接合在第一4HB多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔与第二GH超基因家族成员多肽的非天然编码氨基酸中的叠氮。或者，包含含酮非天然编码氨基酸的第一GH超基因家族成员多肽和/或所连接的包含含酮非天然编码氨基酸的非GH超基因家族成员多肽可接合到包含含羟胺非天然编码氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽，且多肽经由形成对应肟而反应。

或者，所述两个GH超基因家族成员多肽和/或所连接的非GH超基因家族成员经由连接子连接。可使用任何杂或同双官能连接子连接所述两个GH超基因家族成员多肽和/或所连接的非GH超基因家族成员多肽，其可具有相同或不同的一级序列。在一些情形下，用于将所述GH超基因家族成员多肽和/或所连接的非GH超基因家族成员多肽束缚在一起的连接子可为双官能聚乙二醇试剂。

在一些实施例中，本发明提供水溶性双官能连接子，其具有包括以下官能基的哑铃形结构：a)在聚合物骨架的至少第一末端上的含叠氮、炔、肼、酰肼、羟胺或羰基部分；和b)在聚合物骨架的第二末端上的至少一个第二官能基。第二官能基可与第一官能基相同或不同。在一些实施例中，第二官能基不与第一官能基反应。在一些实施例中，本发明提供包含至少一个分枝分子结构的臂的水溶性化合物。举例而言，所述分枝分子结构可为树枝状的。

在一些实施例中，本发明提供通过与具有以下结构的水溶性活化聚合物反应而形成的包含一个或一个以上诸如hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO的GH超基因家族成员的多聚体：

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为含叠氮、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基部分，且R为可与X相同或不同的封端基团、官能基或离去基。R可为例如选自由以下基团组成的群组的官能基：羟基、受保护的羟基、烷氧基、N-羟基丁二酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、碳酸N-羟基丁二酰亚胺基酯、碳酸1-苯并三唑基酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护的胺、酰肼、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。

XII.测量4HB多肽活性和4HB对4HB多肽受体的亲和力

可如McFarland等人，Science，245：494-499(1989)和Leung，D.等人，Nature，330：537-543(1987)所述来制备hGH受体。可使用标准体外或体内检定测定hGH多肽活性。举例而言，在hGH存在下增殖的细胞系(例如表达hGH受体或催乳激素受体的细胞系)可用以监控hGH受体结合。例如参看Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271(36)：21969(1996)；Wada等人，Mol.Endocrinol.12：146-156(1998)；Gout，P.W.等人，Cancer Res.40，2433-2436(1980)；WO99/03887。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化hGH多肽而言，所述激素对其受体的亲和力可通过使用BIAcore^TM生物传感器(Pharmacia)来测量。例如参看美国专利第5,849,535号、Spencer，S.A.等人，J.Biol.Chem.，263：7862-7867(1988)。用于测试hGH活性的体内动物模型包括那些例如描述于Clark等人，J.Biol.Chem.271(36)：21969-21977(1996)中的动物模型。对包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hGH多肽的二聚能力的检定可如Cunningham，B.等人，Science，254：821-825(1991)和Fuh，G.等人，Science，256：1677-1680(1992)所述来进行。所有引用的参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。

hIFN受体可如美国专利第6,566,132、5,889,151、5,861,258、5,731,169、5,578,707号所述进行制备，所述专利以引用的方式并入本文中。可使用标准或已知体外或体内检定来测定hIFN多肽活性。举例而言，应答hIFN而调节生长或I类或II类MHC抗原产生或结合hIFN的细胞或细胞系(包括但不限于诸如人类淋巴母细胞Daudi细胞的含有活性IFN受体的细胞或产生重组IFN受体的细胞)可用以监控hIFN受体结合。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化hIFN多肽而言，所述激素对其受体的亲和力可通过使用诸如BIAcore^TM生物传感器(Pharmacia)的所属领域中已知的技术测量。用于测试hIFN活性的体内动物模型以及人类临床试验包括那些例如在Kontsek等人，Acta Virol.43：63(1999)；Youngster等人，Current Pharma Design 8：2139(2002)；Kozlowski等人，BioDrugs 15：419(2001)；美国专利第6,180,096、6,177,074、6,042,822、5,981,709、5,951,974、5,908,621、5,711,944、5,738,846号中所描述者，所述文献以引用的方式并入本文中。

不管使用什么方法产生本发明的hIFN类似物，所述类似物都经受生物活性检定。可进行氚化胸腺嘧啶核苷检定以测定细胞分裂程度。然而，可使用其他生物检定以测定所要活性。诸如对抑制病毒复制的能力的检定的生物检定也提供IFN活性的指示。参看Bailon等人，Bioconj.Chem.12：195(2001)；Forti等人，Meth.Enzymol.119：533(1986)；Walter等人，Cancer Biother.&Radiopharm.13：143(1998)；DiMarco等人，BioChem.Biophys.Res.Com.202：1445(1994)；和美国专利第4,675,282、4,241,174、4,514,507、4,622,292、5,766,864号，其以引用的方式并入本文中。可使用其他体外检定以测定生物活性。一般而言，对生物活性的测试应提供对所要结果的分析，诸如生物活性的增加或降低(与未改变的IFN相比)、生物活性差异(与未改变的IFN相比)、受体亲和力分析或血清半衰期分析。

先前已报导Daudi细胞结合¹²⁵I标记的鼠类IFN且可通过加入未标记的IFN来竞争这一结合(例如参看美国专利第5,516,514、5,632,988号)。测试天然IFN和hIFN竞争¹²⁵I-IFN与人类和鼠类白血病细胞的结合的能力。将高度纯化的天然IFN(＞95％纯，1微克)碘化[Tejedor等，人Anal.Biochem.，127，143(1982)]，并通过凝胶过滤和离子交换色谱与反应物分离。天然¹²⁵I-IFN的比活性可为约100μCi/μg蛋白。

hG-CSF受体可如美国专利第5,574,136号所述进行制备，所述专利以引用的方式并入本文中。可使用标准或已知体外或体内检定来测定hG-CSF多肽活性。举例而言，在hG-CSF存在下增殖或结合hG-CSF的细胞或细胞系(包括但不限于含有活性G-CSF受体的细胞，诸如小鼠骨髓细胞WEHI-3B(D+)、AML-193(ATCC)或产生重组G-CSF受体的细胞)可用以监控hG-CSF受体结合。例如参看King等人，Exp.Hematol.20：223(1992)、美国专利第6,385,505号，其以引用的方式并入本文中。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化hG-CSF多肽而言，所述激素对其受体的亲和力可通过使用BIAcore^TM生物传感器(Pharmacia)来测量。用于测试hG-CSF活性的体内动物模型以及人类临床试验包括例如在美国专利第6,166,183、6,565,841、6,162,426、5,718,893号中所描述者，所述专利以引用的方式并入本文中。

不管使用什么方法产生本发明的hG-CSF类似物，所述类似物都经受生物活性检定。可进行氚化胸腺嘧啶核苷检定以测定细胞分裂程度。然而，可使用其他生物检定以测定所要活性。诸如对在小鼠WEHI-3B(D+)白血病细胞系中诱导终端分化的能力的检定的生物检定也提供G-CSF活性的指示。参看Nicola等人，Blood 54：614-27(1979)。可使用其他体外检定以测定生物活性。参看Nicola，Ann.Rev.Biochem.58：45-77(1989)。一般而言，对生物活性的测试应提供对所要结果的分析，诸如生物活性的增加或降低(与未改变的G-CSF相比)、生物活性差异(与未改变的G-CSF相比)、受体亲和力分析或血清半衰期分析。

先前已报导WEHI-3BD⁺细胞和来自新近诊断的白血病的人类白血病细胞结合¹²⁵I标记的鼠类G-CSF且可通过加入未标记的G-CSF或人类CSF-β来竞争这一结合。测试天然G-CSF和hG-CSF竞争¹²⁵I-G-CSF与人类和鼠类白血病细胞的结合的能力。将高度纯化的天然G-CSF(＞95％纯，1微克)碘化[Tejedor等人，Anal.Biochem.，127，143(1982)]，并通过凝胶过滤和离子交换色谱与反应物分离。天然¹²⁵I-G-CSF的比活性为约100μCi/μg蛋白。

hEPO受体可如美国专利第5,387,808、5,292,654、5,278,065号所述进行制备，所述专利以引用的方式并入本文中。可使用标准体外或体内检定来测定hEPO多肽活性。举例而言，在hEPO存在下增殖的细胞系(包括但不限于UT-7细胞、TF-1细胞、FDCP-1/mEPOR或脾细胞)可用以监控hEPO受体结合。例如参看Wrighton等人，(1997)Nature Biotechnology 15：1261-1265、美国专利第5,773,569和5,830,851号，其以引用的方式并入本文中。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化hEPO多肽而言，所述激素对其受体的亲和力可通过使用BIAcore^TM生物传感器(Pharmacia)来测量。用于测试hEPO活性的体内动物模型以及人类临床试验包括例如在美国专利第6,696,056号；Cotes等人，(1961)Nature 191：1065-1067；美国专利申请公开案第2003/0198691号和PharmEuropa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)中所描述者，所述文献以引用的方式并入本文中。对包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hEPO多肽的二聚能力的检定可如美国专利第6,221,608号中所述进行，其以引用的方式并入本文中。

以上对检定方法的参考文献的汇编并非详尽，且所属领域的技术人员将认识到其他适用于测试所要终端结果的检定。

XIII.测量效能、功能体内半衰期和药物动力学参数

本发明的一个重要方面是通过在将或不将4HB多肽接合于水溶性聚合物部分的情况下构筑所述多肽而获得的延长的生物半衰期。4HB多肽血清浓度的快速降低使得评估对接合和未接合的4HB多肽及其变异体处理的生物反应变得重要。优选地，本发明的接合和未接合的4HB多肽及其变异体在静脉内投与后也具有延长的血清半衰期，使得可能通过例如ELISA方法或通过初级筛选检定进行测量。可使用来自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic SystemsLaboratories(Webster，TX)的ELISA或RIA试剂盒。用于测量IFN或其变异体的体内半衰期的检定的另一实例描述于Kozlowski等人，BioDrugs 15：419(2001)；Bailon等人，Bioconj.Chem.12：195(2001)；Youngster等人，Current Pharm.Design8：2139(2002)；美国专利第6,524,570、6,250,469、6,180,096、6,177,074、6,042,822、5,981,709、5,591,974、5,908,621、5,738,846号中，所述文献以引用的方式并入本文中。用于测量G-CSF或其变异体的体内半衰期的检定的另一实例描述于美国专利第5,824,778号中，其以引用的方式并入本文中。如本文所述进行体内生物半衰期的测量。

可根据描述于Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271，36，21969-21977(1996)中的实验方案测定包含非天然编码氨基酸的hGH多肽的效能和功能体内半衰期。可根据描述于美国专利第5,711,944、5,382,657号中的实验方案测定包含非天然编码氨基酸的hIFN多肽的效能和功能体内半衰期，所述专利以引用的方式并入本文中。可根据描述于美国专利第6,646,110、6,555,660、6,166,183、5,985,265、5,824,778、5,773,581号中的实验方案测定包含非天然编码氨基酸的hG-CSF多肽的效能和功能体内半衰期，所述以引用的方式并入本文中。可根据描述于美国专利第6,586,398、5,583,272号和美国专利申请公开案第2003/0198691A1号中的实验方案测定包含非天然编码氨基酸的hEPO多肽的效能和功能体内半衰期，所述专利以引用的方式并入本文中。

可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每处理组中N＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的4HB多肽的药物动力学参数。动物接收静脉内25微克/大鼠或皮下50微克/大鼠的单剂量，且根据预定时程采集约5-7个血样，所述时程对于包含非天然编码氨基酸且未接合于水溶性聚合物的4HB多肽通常包括约6小时而对于包含非天然编码氨基酸且接合于水溶性聚合物的4HB多肽通常包括约4天。在数种物种中充分研究4HB多肽的药物动力学数据且可与对包含非天然编码氨基酸的4HB多肽获得的数据直接比较。对于hGH的相关研究请参看Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)：1351-59(1991)。

可以所属领域中已知的各种检定测定根据本发明的4HB多肽的比活性。本发明的纯化hG-CSF蛋白的生物活性应使得通过注射将所述hG-CSF蛋白投与人类患者会导致与受检者未注射组或对照组相比增加白血球产生的骨髓细胞。本发明的纯化hEPO蛋白的生物活性应使得通过注射将所述hEPO蛋白投与人类患者会导致与受检者未注射组或对照组相比增加网状细胞和红血球产生的骨髓细胞。根据本发明获得和纯化的hEPO突变蛋白或其片段的生物活性可由根据Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)的方法加以测试。用于测定hEPO活性的另一生物学检定是正常红细胞性小鼠检定(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))。根据本发明获得和纯化的4HB多肽突变蛋白或其片段的生物活性可由本文所述或所参考的或所属领域的技术人员已知的方法加以测试。

用于测量hG-CSF或其变异体的体内生物活性的检定的其他实例描述于美国专利第5,681,720、5,795,968、5,824,778、5,985,265号和Bowen等人，Experimental Hematology 27：425-432(1999)中，其各自以引用的方式并入本文中。

XIV.投与和医药组合物

本发明的多肽或蛋白(包括但不限于hGH、hIFN、hG-CSF、hEPO、合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白等)视情况用于治疗用途，包括但不限于与合适医药载剂组合使用。这些组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备调配物以适合投与模式。一般而言，投与蛋白的方法在所属领域是众所周知的且可用于投与本发明的多肽。

视情况根据所属领域中众所周知的方法在一种或一种以上适当的疾病的体外和/或体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物以证实功效、组织代谢并评估剂量。特定而言，可由本文的非天然氨基酸对比天然氨基酸同系物的活性、稳定性或其他合适测量标准(包括但不限于将经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的4HB多肽与天然氨基酸4HB多肽比较)、即在相关检定中来初始确定剂量。

投与是通过通常用于引入分子以最终接触血液或组织细胞的任何途径。本发明的非天然氨基酸多肽是以任何合适方式、视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投与。可使用将本发明的上下文中的所述多肽投与患者的合适方法，且尽管可使用一种以上途径投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径更即时和更有效的作用或反应。

医药学上可接受的载剂是部分由投与的特定组合物以及由用于投与所述组合物的特定方法来确定。因此，存在多种本发明的医药组合物的合适调配物。

可以包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式的数种途径投与多肽组合物。也可经由脂质体投与包含修饰或未修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所述投与途径和适当调配物通常对所属领域的技术人员为已知的。

单独或与其他合适组份组合的包含非天然氨基酸的4HB多肽也可制备为经由吸入投与的气溶胶调配物(即其可“雾化”)。气溶胶调配物可置于加压的诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等的可接受推进剂中。

适用于诸如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径的非经肠投与的调配物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述调配物与预定接受体的血液等张的溶质的水性和非水性等张无菌注射溶液，和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。经包装的核酸的调配物可存在于诸如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中。

非经肠投与和静脉内投与是优选的投与方法。特定而言，已经用于天然氨基酸同系物治疗剂的投与途径(包括但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞间介素、抗体和/或任何其他医药学上传递的蛋白的投与途径)与当前使用的调配物一起提供用于本发明的多肽的优选投与途径和调配物。

本发明的上下文中投与患者的剂量足以在患者中随着时间具有有益的治疗反应或包括但不限于足以抑制病原体感染或视应用提供其他适当活性。所述剂量是由特定载体或调配物的功效和应用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者状况以及欲治疗的患者的体重或表面积来确定。剂量的大小也由特定患者中伴随特定载体、调配物等等的投与的任何不利副作用的存在、性质和程度确定。

在确定治疗或预防疾病(包括但不限于癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS等等)中欲投与的载体或调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进程和/或抗非天然氨基酸多肽抗体的产生具有相关性之处。

投与例如70千克患者的剂量通常在相当于当前所用治疗蛋白的剂量的范围内，根据相关组合物的改变的活性或血清半衰期加以调节。本发明的载体可以任何已知的常规疗法补充治疗条件，所述常规疗法包括但不限于抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等等。

为进行投与，以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或包括但不限于应用于患者的质量和总体健康的各种浓度下非天然氨基酸的任何副作用的观察而确定的速率投与本发明的调配物。投与可经由单个或分开的剂量完成。

如果经历调配物输注的患者出现发热、发冷或肌肉痛，则他/她接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其他疼痛/发热控制药物。经历对输注的反应(诸如发热、肌肉痛和发冷)的患者在未来的输注前30分钟预先使用阿司匹林、醋氨酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)进行治疗。将哌替啶(meperidine)用于对退热剂和抗组胺剂并不迅速反应的更严重的发冷和肌肉痛。视所述反应的严重性减缓或中断细胞输注。

本发明的人类4HB多肽可直接投与哺乳动物受检者。投与是通过通常用于将4HB多肽引入受检者的任何途径。根据本发明的实施例的4HB多肽组合物包括适于口服、直肠、局部、吸入(包括但不限于经由气溶胶)、口腔(包括但不限于舌下)、阴道、非经肠(包括但不限于皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气管表面)和经皮投与者，尽管在任何给定情形中的最合适途径将依赖于欲治疗的病症的性质和严重性。投与可为局部或全身性的。化合物的调配物可存在于诸如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中。本发明的4HB多肽可制备为单位剂量可注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。本发明的4HB多肽也可通过连续输注(使用包括但不限于诸如渗透泵的微型泵)、单次注射或缓释药物储槽调配物投与。

适于投与的调配物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得所述调配物等张的溶质的水性和非水性溶液等张无菌溶液和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。溶液和悬浮液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和药片制备而来。

本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂部分是由投与的特定组合物以及由用于投与所述组合物的特定方法确定。因此，存在多种本发明的医药组合物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的合适调配物(例如参看Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版.1985)。

合适载剂包括含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐及其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖、二糖及其他碳水化合物；诸如EDTA的螯合剂；诸如锌、钴或铜的二价金属离子；诸如甘露糖醇或山梨糖醇的糖醇；诸如钠的成盐平衡离子；和/或诸如Tween^TM、Pluronics^TM或PEG的非离子表面活性剂。

包括连接于诸如PEG的水溶性聚合物的本发明的4HB多肽也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的部分来投与。持续释放组合物包括(包括但不限于)包括但不限于薄膜或微胶囊的定形物品形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物相容性材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP133,988)、聚交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号、EP58,481)、聚乙交酯(羟基乙酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸与羟基乙酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸的氨基酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。持续释放组合物也包括脂质体封装的化合物。含有所述化合物的脂质体通过本身已知的方法制备而来：DE3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045和4,544,545号和EP102,324。所有引用的参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。

通过脂质体捕集的4HB多肽可以下列文献所述的方法来制备：例如DE3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，11：4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045与4,544,545号；以及EP102,324。脂质体的组成和大小众所周知或可易于由所属领域的技术人员根据经验来确定。脂质体的一些实例描述于下列文献中：例如Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331(1995)；Lasic D与Papahadjopoulos D(编)：Medical Applications of Liposomes(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy，Teicher B(编)：CANCER Drug Discovery and Development(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochem.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。所有文献以及所引用的专利以引用的方式并入本文中。

在本发明的上下文中，投与患者的剂量应足以引起受检者随时间变化的有利反应。通常，每个剂量非经肠投与的本发明4HB多肽的总医药学有效量在约0.01μg/kg/天到约100μg/kg或约0.05mg/kg到约1mg/kg患者体重的范围内，尽管其易于由治疗判断支配。给药的频率也易于由治疗判断支配，且可比批准用于人类的市售4HB多肽产品更频繁或更稀少。通常，本发明的聚乙二醇化4HB多肽可通过上述投与途径中的任一种来投与。

XV.本发明4HB多肽的治疗用途

本发明的4HB多肽适用于治疗各种病症。

举例而言，本发明的hGH促效剂多肽可适用于治疗生长缺陷、免疫病症且适用于刺激心脏功能。患有生长缺陷的个体包括：例如患有特纳氏综合症的个体；GH缺陷个体(包括儿童)；在生长板闭合之前约2-3年经历正常生长曲线减缓或延迟的儿童(有时称作“矮小儿童”)；以及其中对GH的类胰岛素生长因子-I(IGF-I)反应已通过化学方式(举例而言，通过糖皮质激素治疗)或通过天然条件(诸如在成年患者中，其中IGF-I对GH的反应天然下降)阻断的个体。

促效剂hGH变异体可起作用以通过增加免疫功能来刺激哺乳动物免疫系统，无论是否因为抗体调节或细胞调节而引起所述增加且无论免疫系统对于经hGH多肽治疗的宿主而言是否为内源性的或是否由供体移植给已接受hGH多肽的宿主接受体(如在骨髓移植体中)。“免疫病症”包括其中个体免疫系统对抗原的抗体或细胞反应比正常个体(包括小脾因药物(例如化学治疗)治疗而具有减少的免疫性的那些个体)的反应有所减少的任何病症。患有免疫病症的实例个体包括：举例而言，老年患者；接受化学疗法或放射疗法的个体；自重病复原或将要接受手术的个体；患有AIDS的个体；患有例如低丙球蛋白血症、通常改变的无丙球蛋白血症(common varied agammaglobulinemia)以及选择性免疫球蛋白缺陷(例如IgG缺陷)的先天性以及后天性B细胞缺陷的患者；感染例如狂犬病的病毒的患者，其中所述病毒的培育时间比患者的免疫反应短；以及患有例如迪乔治综合症(diGeorge syndrome)的遗传病症的个体。

本发明的hGH拮抗剂多肽可适用于治疗巨人症与肢端肥大症、糖尿病与由糖尿病引起的并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病)、血管眼病(举例而言，涉及增生性新血管形成)、肾病以及GH反应性恶性肿瘤。

举例而言，血管眼病包括视网膜病(例如由早熟或镰状细胞性贫血引起)与黄斑变性。

举例而言，GH反应性恶性肿瘤包括：威尔姆氏肿瘤、肉瘤(例如骨源性肉瘤)、乳癌、结肠癌、前列腺癌与甲状腺癌、表达GH受体mRNA的组织(即胎盘、胸腺、脑、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、脊柱、脊髓、视网膜、淋巴结以及来自巴克氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、结肠直肠癌、肺癌、淋巴性白血病与黑素瘤的组织)的癌症。

hGH的平均数量可改变且尤其应以合格医师的推荐与处方为基础。hGH的精确量是个见仁见智的问题，由例如所治疗病状的精确类型、所治疗患者的健康状况以及组合物中的其他成份的因素来支配。

投与本发明的hIFN产品在人类中产生由市售IFN制剂所证实的任何活性。含有hIFN糖蛋白产品的医药组合物可以有效用于通过各种方式向罹患可受IFN促效剂或拮抗剂影响的病症(单独或作为病状或疾病的部分)的人类患者投与的浓度进行调配，例如(但不限于)使用抗增殖性、消炎或抗病毒药剂。hIFN糖蛋白产品的平均数量可改变且尤其应以合格医师的推荐与处方为基础。hIFN的精确量是个见仁见智的问题，由例如所治疗病状的精确类型、所治疗患者的健康状况以及组合物中的其他成份的因素来支配。因此，本发明的hIFN可用于中断或调节病毒复制周期，用于调节发炎或用作抗增殖性药剂。在可由本发明治疗的病状中，包括HCV、HBV及其他病毒感染、肿瘤细胞生长或成活力以及多发性硬化。本发明也提供投与治疗有效量的另一活性剂，例如抗癌化学治疗剂。将投与的量可易于由所属领域的技术人员以使用hIFN的疗法为基础来确定。

本发明hG-CSF产品的投与导致人类白细胞形成。含有hG-CSF糖蛋白产品的医药组合物可以有效用于通过各种方式向罹患特征为低或缺陷白细胞产生的病症(单独或作为病状或疾病的部分)的人类患者投与的浓度进行调配。hG-CSF糖蛋白产品的平均数量可改变尤其应以合格医师的推荐与处方为基础。hG-CSF的精确量是个见仁见智的问题，由例如所治疗病状的精确类型、所治疗患者的健康状况以及组合物中的其他成份的因素来支配。因此，本发明的hG-CSF可用于刺激白细胞产生及校正降低的红细胞含量。白细胞含量最常见会因癌、感染或化学疗法而降低。在本发明可治疗的病状中，包括与细菌感染相关的中性白细胞减少、与骨髓抑制性疗法(举例而言，化学治疗或抗病毒药物(例如AZT))相关的中性白细胞减少、与非骨髓癌的扩展相关的中性白细胞减少以及与病毒感染(例如HIV)相关的贫血。也可治疗可导致另一健康个体的中性白细胞减少的病状，例如用抗癌药剂进行的预计治疗。一般，可用hG-CSF治疗的任何病状也可用本发明的PEG：hG-CSF接合物治疗。本发明也提供治疗有效量的另一活性剂的投与，例如抗癌化学治疗剂。将投与的量可易于由所属领域的技术人员以用hG-CSF提供的疗法为基础来确定。

本发明的hEPO适用于治疗各种病症。本发明的hEPO产品的投与导致人类红细胞形成。含有hEPO糖蛋白产品的医药组合物可以有效用于通过各种方式向罹患特征为低或缺陷红细胞产生的病症(单独或作为病状或疾病的部分)的人类患者投与的浓度进行调配。hEPO糖蛋白产品的平均数量可改变尤其应以合格医师的推荐与处方为基础。hEPO的精确量是个见仁见智的问题，由例如所治疗病状的精确类型、所治疗患者的健康状况以及组合物中的其他成份的因素来支配。因此，本发明的hEPO可用于刺激红细胞产生及校正降低的红细胞含量。红细胞含量最常见会因贫血而降低。在本发明可治疗的病状中，包括与肾功能衰弱或损失(慢性肾衰竭)相关的贫血、与骨髓抑制性疗法(举例而言，化学治疗或抗病毒药物(例如AZT))相关的贫血、与非骨髓癌的扩展相关的贫血以及与病毒感染(例如HIV)相关的贫血。也可治疗可导致另一健康个体贫血的病状，例如手术期间的预计失血。一般，可用hEPO治疗的任何病状也可用本发明的PEG：hEPO接合物治疗。本发明也提供治疗有效量的铁的投与，以维持手术期间增加的红细胞生成。将投与的量可易于由所属领域的技术人员以用hEPO提供的疗法为基础来确定。

实例

提供下列实例以说明而不是限制本发明。

实例1

本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入hGH中的优选位点的多组潜在标准之一。

本实例证实如何选择hGH多肽中的优选位点以引入非天然编码氨基酸。使用由与受体(hGHbp)细胞外域的两个分子复合的hGH组成的晶体结构3HHR来确定其中可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。其他hGH结构(例如1AXI)是用来检测晶体结构数据集之间的一级与二级结构单元的潜在变化。这些结构的坐标可得自蛋白数据银行(PDB)(Berstein等人，J.Mol Biol1997，112，第535页)或可经由The Research Collaborator for StructuralBioinformatics PDB得自万维网rcsb.org。结构模型3HHR含有hGH的完整成熟22kDa序列，但晶体中因无序而省略的残基148-153以及C末端F191残基除外。存在由C53与C165以及C182与C185形成的两个二硫桥。用于这个实例中的序列编号是根据SEQ ID NO：2中所示的成熟hGH(22kDa变异体)的氨基酸序列。

下列标准是用于评估用于引入非天然编码氨基酸的hGH的各位置：残基(a)不应干扰基于3HHR、1AXI以及1HWG(与hGHbp单体或二聚体接合的hGH的结晶结构)的结构分析的任一hGHbp的结合；(b)不应受丙氨酸或同系物扫描突变诱发影响(Cunningham等人，Science(1989)244：1081-1085以及Cummingham等人，Science(1989)243：1330-1336)；(c)应表面暴露且展示与周围残基的最小范德华或氢键相互作用；(d)在hGH变异体中应缺失或可变化(例如Tyr35、Lys38、Phe92、Lys140)；(e)在经非天然编码氨基酸取代之后导致保守改变；以及(f)可见于高度挠性区域(包括但不限于CD环)或结构刚性区域(包括但不限于螺旋B)中。此外，在hGH分子上执行其他计算，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)来估算各蛋白原子的突出程度。结果，在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入hGH的下列位置中的一个或一个以上位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、32、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186，187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在下列位置中的一个或一个以上位置经取代：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186及187(SEQ ID NO：2，或SEQID NO：1或3中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在下列位置中的一个或一个以上位置经取代：29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186及187(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在下列位置中的一个或一个以上位置经取代：35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145及155(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在下列位置中的一个或一个以上位置经取代：30、74、103(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在下列位置中的一个或一个以上位置经取代：35、92、143、145(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，所述位置包括但不限于下列位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物：35、92、143、145(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)。

产生hGH拮抗剂的一些位点包括：1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或位置1之前的添加或任何其组合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1、3中的对应氨基酸，或任何其他GH序列)。利用促效剂设计的标准(c)-(e)来选择这些位点。拮抗剂设计也可包括位点I残基的定点修饰以增加与hGHbp的结合亲和力。

实例2

本实例详述在大肠杆菌中克隆与表达包括非天然编码氨基酸的hGH多肽。本实例也描述一种评估经修饰hGH多肽的生物活性的方法。

用于克隆hGH及其片段的方法详述于美国专利第4,601,980、4,604,359、4,634,677、4,658,021、4,898,830、5,424,199与5,795,745号中，所述专利以引用的方式并入本文中。编码全长hGH或缺乏hGH的N末端信号序列的成熟形式hGH的cDNA分别示于SEQ ID NO：21与SEQ ID NO：22中。

所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统是用于表达含有非天然编码氨基酸的hGH。O-RS优选地用非天然编码氨基酸氨酰化O-tRNA。所述翻译系统转而应答所编码的选择密码子将非天然编码的氨基酸插入hGH中。

表2：O-RS与O-tRNA序列

SEQ ID NO：4	詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)mtRNA^Tyr _CUA	tRNA
			SEQ ID NO：5	HLAD03；最佳琥珀抑制子tRNA	tRNA
SEQ ID NO：6	HL325A；最佳AGGA移码抑制子tRNA	tRNA
			SEQ ID NO：7	用于并入对叠氮基-L-苯丙氨酸p-Az-PheRS(6)的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ D NO：8	用于并入对苯甲酰基-L-苯丙氨酸p-BpaRS(1)的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：9	用于并入炔丙基-苯丙氨酸炔丙基-PheRS的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：10	用于并入炔丙基-苯丙氨酸炔丙基-PheRS的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：11	用于并入炔丙基-苯丙氨酸炔丙基-PheRS的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：12	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(1)的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：13	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(3)的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：14	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(4)的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：15	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(2)的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：16	用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW1)的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：17	用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW5)的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：18	用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW6)的氨酰基tRNA合成酶	RS
			SEQ ID NO：19	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸(AzPheRS-5)的氨酰基tRNA合成酶	RS
SEQ ID NO：20	用于并入对叠氮基-苯丙氨酸(AzPheRS-6)的氨酰基tRNA合成酶	RS

用含有经修饰hGH基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所要非天然编码氨基酸具有特异性)的质粒转化大肠杆菌会将非天然编码氨基酸的位点特异性地并入hGH多肽中。使经转化的大肠杆菌在含有0.01-100mM之间的特定非天然编码氨基酸的培养基中在37℃下生长，以高保真度和效率表达经修饰的hGH。大肠杆菌细胞将含有非天然编码的氨基酸的经His标记的hGH产生为包涵体或聚集体。在变性条件下，使所述聚集体在6M盐酸胍中溶解且进行亲和纯化。在50mM TRIS-HCl(pH8.0)、40μM CuSO₄及2％(w/v)Sarkosyl中，在4℃下通过透析整夜进行再折叠。然后，使所述材料以20mM TRIS-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl₂进行透析，然后去除His标记。参看Boissel等人，(1993)268：15983-93。用于纯化hGH的方法在所属领域中众所周知且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等等确认。

图6为经纯化hGH多肽的SDS-PAGE。经由制造商提供的标准经His标记蛋白纯化程序来使用ProBond Nickel-Chelating Resin(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后在负载于凝胶上之前经由阴离子交换管柱来纯化经His标记的突变hGH蛋白。泳道1显示分子量标记且泳道2表示未并入非天然氨基酸的N-His hGH。泳道3-10含有分别在位置Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143和K145中的每一处包含非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的N-His hGH突变体。

为进一步分析经修饰hGH多肽的生物活性，使用测量hGH的下游标记与其受体的相互作用的检定。hGH与其内源产生的受体的相互作用导致人类IM-9淋巴细胞细胞系中的转录家族成员STAT5的信号转导因子和活化因子的酪氨酸磷酸化。由IM-9 cDNA文库鉴别两种形式的STAT5，即STATSA和STAT5B。例如参看Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5)：508-518。IM-9细胞上的人类生长激素受体对人类生长激素具有选择性，因为大鼠生长激素或人类促乳激素都不能导致可探测的STAT5磷酸化。重要的是，大鼠-GHR(L43R)细胞外域和具有G120R的hGH有效竞争防止hGH刺激的pSTAT5磷酸化。

用本发明的hGH多肽刺激IM-9细胞。人类IM-9淋巴细胞购自ATCC(Manassas，VA)且生长于补充有丙酮酸钠、青霉素、链霉素(Invitrogen，Carlsbad，San Diego)及10％热灭活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640中。使IM-9细胞在检定培养基中(无酚红的RPMI、10mM Hepes、1％热灭活木炭/右旋糖苷处理的FBS、丙酮酸钠、青霉素及链霉素)饥饿整夜，随后在37℃下用12点剂量范围的hGH多肽刺激10分钟。用1％甲醛固定受刺激的细胞，随后用90％冰冷甲醇在冰上渗透1小时。在室温下用第一磷酸基-STAT5抗体(CellSignaling Technology，Beverly，MA)进行细胞内染色，历时30分钟，然后用PE接合的第二抗体染色，从而探测STAT5磷酸化程度。在FACS阵列上执行样品获取，而所获取的数据在Flowjo软件(Tree Star Inc.，Ashland，OR)上分析。由利用SigmaPlot用平均荧光强度(MFI)对蛋白浓度绘制的剂量反应曲线得出EC50值。

下表3概述了由突变hGH多肽产生的IM-9数据。用如上所述的人类IM-9细胞来测试在不同位置具有非天然氨基酸取代的各种hGH多肽。特定而言，图7画面A展示经His标记的hGH多肽的IM-9数据，且图7画面B展示包含取代Y143的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸取代的经His标记的hGH的IM-9数据。使用相同检定来评估聚乙二醇化的包含非天然氨基酸的hGH多肽的生物活性。

表3
				GH	EC₅₀(nM)	GH	EC₅₀(nM)
WHOWT	0.4+0.1(n＝8)	N-6His G120R	＞200,000
				N-6His WT	0.6+0.3(n＝3)	N-6His G120pAF	＞200,000
大鼠GH WT	＞200,000	N-6His G131pAF	0.8±0.5(n＝3)
				N-6His Y35pAF	0.7+0.2(n＝4)	N-6His P133pAF	1.0
N-6His E88pAF	0.9	N-6His R134pAF	0.9±0.3(n＝4)
				N-6His Q91pAF	2.0+0.6(n＝2)	N-6His T135pAf	0.9
N-6His F92pAF	0.8±0.4(n＝9)	N-6His G136pAF	1.4
				N-6His R94pAF	0.7	N-6His F139pAF	3.3
N-6His S95pAF	16.7±1.0(n＝2)	N-6His K140pAF	2.7±0.9(n＝2)
				N-6His N99pAF	8.5	N-6His Y143pAF	0.8±0.3(n＝3)
N-6His Y103pAF	130,000	N-6His K145pAF	0.6±0.2(n＝3)
				N-6His Y111pAF	1.0	N-6HisA155pAF	1.3

表3
				GH	EC₅₀(nM)	GH	EC₅₀(nM)
WHOWT	0.4±0.1(n＝8)	G120R	＞200,000
				N-6His WT	0.6±0.3(n＝3)	G120pAF	＞200,000
大鼠GH WT	＞200,000	G131pAF	0.8±0.5(n＝3)
				Y35pAF	0.7±0.2(n＝4)	P133pAF	1.0
E88pAF	0.9	R134pAF	0.9±0.3(n＝4)
				Q91pAF	2.0±0.6(n＝2)	T135pAF	0.9
F92pAF	0.8±0.4(n＝9)	G136pAF	1.4
				R94pAF	0.7	F139pAF	3.3
S95pAF	16.7±1.0(n＝2)	K140pAF	2.7±0.9(n＝2)
				N99pAF	8.5	Y143pAF	0.8±0.3(n＝3)
Y103pAF	130,000	K145pAF	0.6+0.2(n-3)
				Y111pAF	1.0	A155pAF	1.3

实例3

本实例详述含羰基氨基酸的引入以及与含氨氧基的PEG的后续反应。

本实例证实用于产生4HB多肽的方法，所述多肽中并入随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应的含酮的非天然编码氨基酸。使根据实例1(hGH)的标准鉴别的残基35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、120、131、133、134、135、136、139、140、143、145与155中的每一者、根据实例32(hIFN)的标准鉴别的残基、根据实例36(Hg-CSF)的标准鉴别的残基59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167与171中的每一者或根据实例40(hEPO)的标准鉴别的残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127与128中的每一者独立经具有下列结构的非天然编码氨基酸取代：

用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入hGH中的序列为SEQ ID NO：2(hGH)和SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^Tyr _CUA)以及以上实例2中描述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入hIFN中的序列为SEQ ID NO：24(hIFN)和SEQ ID NO：4(muttRNA)以及以上实例2中描述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入hG-CSF中的序列为SEQ ID NO：29(hG-CSF)和SEQ ID NO：4(muttRNA)以及以上实例2中描述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入hEPO中的序列为SEQ ID NO：38(hEPO)和SEQ ID NO：4(muttRNA)以及以上实例2中描述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。

一旦经修饰，包含含羰基的氨基酸的4HB多肽变异体将与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。使含有以10mg/mL溶于25mMMES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中的对乙酰基苯丙氨酸的经纯化4HB与10-100倍过量的含氨氧基的PEG反应，且然后在室温下搅拌10-16小时(Jencks，W.J.Am.Chem.Soc.1959，81，第475页)。然后，将PEG-4HB稀释于适当缓冲液中以立即纯化与分析。

实例4

与由经由酰胺键连接于PEG的羟胺基组成的PEG接合。

使用实例3中描述的程序，使具有下列结构的PEG试剂偶合于含酮的非天然编码氨基酸：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-O-NH₂

其中R＝甲基，n＝4且N为约20,000MW。所述反应、纯化以及分析条件如实例3所述。

实例5

本实例详述将两种不同的非天然编码氨基酸引入4HB多肽中。

本实例证实用于产生hGH多肽的方法，所述多肽在下列残基中的两个位置并入包含酮官能基的非天然编码氨基酸：E30、E74、Y103、K38、K41、K140以及K145。如实例1和2所述来制备hGH多肽，例外为在核酸中的两个不同位点引入抑制密码子。

本实例证实用于产生hIFN多肽的方法，所述多肽在根据实例32鉴别的残基中的两个位置并入包含酮官能基的非天然编码氨基酸，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例32和33所述来制备hIFN多肽，例外为在核酸中的两个不同位点引入抑制密码子。

本实例证实用于产生hG-CSF多肽的方法，所述多肽在下列残基中的两个位置并入包含酮官能基的非天然编码氨基酸：W59X^*与T134X^*；L131X^*与S67X^*；S67X^*与Q91X^*；T134X^*与Ser77X^*(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例36和37所述来制备hG-CSF多肽，例外为在核酸中的两个不同位点引入抑制密码子。

本实例证实用于产生hEPO多肽的方法，所述多肽在下列残基中的两个位置并入包含酮官能基的非天然编码氨基酸：N24X^*与G113X^*；N38X^*与Q115X^*；N36X^*与S85X^*；N36X^*与A125X^*；N36X^*与A128X^*；Q86X^*与S126X^*，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例40和41所述来制备hEPO多肽，例外为在核酸中的两个不同位点引入抑制密码子。

实例6

本实例详述使4HB多肽与含酰肼的PEG接合且随后原位还原。

根据实例2与3、实例33与3、实例37与3以及实例41与3所述的程序来制备并入含羰基氨基酸的4HB多肽。一旦经修饰，使具有下列结构的含酰肼的PEG与4HB多肽接合：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW且X为羰基(C＝O)。将含对乙酰基苯丙氨酸的4HB以0.1-10mg/mL溶于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中，使其与1-100倍过量的含酰肼的PEG反应，且通过加入1M NaCNBH₃储备液(Sigma Chemical，St.Louis，MO)使对应的腙原位还原，使其溶于H₂O中，直到10-50mM的最终浓度。在暗处，在4℃至室温下进行反应，历时18-24小时。通过加入约pH7.6的1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)至50mM的最终Tris浓度来终止反应或稀释于适当缓冲液中用于立即纯化。

实例7

本实例详述将含炔的氨基酸引入4HB多肽中以及用mPEG-叠氮化物衍生。

下列残基35、88、91、92、94、95、99、101、131、133、134、135、136、140、143、145以及155各自经下列非天然编码氨基酸(hGH；SEQ ID NO：2)取代：

用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入hGH中的序列为SEQ ID NO：2(hGH)与SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^Tyr _CUA)以及以上实例2中描述的9、10或11。使根据实例32鉴别的hIFN的残基中的任一者经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入hIFN中的序列为SEQ ID NO：24(hIFN)与SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^Tyr _CUA)以及以上实例2中描述的9、10或11。hG-CSF的下列残基59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167以及171各自经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入hG-CSF中的序列为SEQ ID NO：29(hG-CSF)、SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^Tyr _CUA)以及以上实例2中描述的9、10或11。hEPO的下列残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127以及128各自经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入hEPO中的序列为SEQ ID NO：38(hEPO)、SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^Tyr _CUA)以及以上实例2中描述的9、10或11。使用实例3中描述的条件，使含有炔丙基酪氨酸的4HB多肽于大肠杆菌中表达且进行纯化。

使含有炔丙基酪氨酸的经纯化4HB以0.1-10mg/mL溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝8)中且将10-1000倍过量的含叠氮PEG加入反应混合物中。然后，将催化量的CuSO₄与Cu线加入反应混合物中。在培育所述混合物(包括但不限于在室温或37℃下约4小时，或在4℃下整夜)，加入H2O且通过透析膜过滤所述混合物。可通过(包括但不限于)实例3中描述的类似程序来分析所加入的样品。

在这个实例中，PEG将具有下列结构：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。

实例8

本实例详述用炔丙基酪氨酸取代4HB多肽中的大的疏水性氨基酸。

用实例7中描述的下列非天然编码氨基酸来取代存在于hGH的下列区域中的一者之中的Phe、Trp或Tyr残基：1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域、A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域、B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域、C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)(SEQ ID NO：2)。类似地，用实例7中描述的下列非天然编码氨基酸来取代存在于hIFN的下列区域中的一者之中的Phe、Trp或Tyr残基：1-9(N末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区域)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区域)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区域)、111-132(D螺旋)、133-136(D与E螺旋之间的区域)、137-155(E螺旋)、156-165(C末端)(如同在SEQ ID NO：24中，或其他IFN多肽中的对应氨基酸)。另外，用实例7中描述的下列非天然编码氨基酸来取代存在于hG-CSF的下列区域中的一者之中的Phe、Trp或Tyr残基：1-10(N末端)、11-39(A螺旋)、40-70(A螺旋与B螺旋之间的区域)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区域)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区域)、143-172(D螺旋)、173-175(C末端)，包括在A螺旋与B螺旋之间44-53处的短螺旋节段微小E螺旋，其是由3₁₀螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成(如同在SEQ ID NO：29中，以及SEQ ID NO：28或30(不具有作为分泌信号序列的N末端30个氨基酸)、35或36的对应氨基酸)。用实例7中描述的下列非天然编码氨基酸来取代存在于hEPO的下列区域中的一者之中的Phe、Trp或Tyr残基：1-7(N末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环、含β折叠1(39-41)以及微小B’螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环、含微小C’螺旋(114-121)以及β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C末端)：

一旦经修饰，PEG即连接于包含含炔氨基酸的4HB多肽变异体。所述PEG将具有下列结构：

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

且偶合程序将遵循实例7中的程序。这将产生包含非天然编码氨基酸的4HB多肽变异体，其大致上与天然产生的大的疏水性氨基酸中的一者等排且在多肽中的不同位点经PEG衍生物修饰。

实例9

这个实例详述由一个或一个以上PEG连接子隔开的4HB多肽同型二聚体、异质二聚体、同型多聚体或异质多聚体的产生。

使实例7中产生的含炔4HB多肽变异体与下列形式的双官能PEG衍生物反应：

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

其中n为4且PEG具有约5,000的平均MW，以产生对应4HB多肽同型二聚体，其中两个4HB分子由PEG物理分隔。4HB多肽可以类似方式与一个或一个以上其他多肽偶合以形成异质二聚体、同型多聚体或异质多聚体。如实例7与3执行偶合、纯化以及分析。

实例10

本实例详述糖部分与4HB多肽的偶合。

如实例3中所述，使下列残基中的一个残基经以下非天然编码氨基酸取代：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186以及187(hGH、SEQ ID NO：2)。类似地，使下列残基中的一个残基经以下非天然编码氨基酸取代：1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、91、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165(如同在SEQ ID NO：24中，或其他IFN多肽的对应氨基酸)。如实例3所述，使下列残基中的一个残基经以下非天然编码氨基酸取代：30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170以及171(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35、36或其他G-CSF多肽的对应氨基酸)。如实例3所述，使下列残基中的一个残基经以下非天然编码氨基酸取代：21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165、166(如同在SEQ ID NO：38中，或其他EPO多肽的对应氨基酸)。

一旦经修饰，使包含含羰基氨基酸的4HB多肽变异体与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β-连接氨氧基类似物反应。使4HB多肽变异体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)在100mM乙酸钠水性缓冲液(pH5.5)中混合且在37℃下培育7-26小时。在周围温度下，将糖接合的4HB多肽(5mg/mL)与150mMHEPES缓冲液(pH7.4)中的UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)一起培育48小时，从而使第二糖与第一糖酶促偶合(Schanbacher等人，J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。

实例11

本实例详述聚乙二醇化4HB多肽拮抗剂的产生。

如实例3中所述，使下列残基1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123或127(hGH；SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1或3中的对应氨基酸)中的一个残基经下列非天然编码氨基酸取代。如实例3中所述，使下列残基2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165(hIFN；SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)中的一个残基经下列非天然编码氨基酸取代；视所选位点与所要活性而定，包含所述取代中的一个取代的hIFN多肽可潜在充当弱拮抗剂或弱促效剂。如实例3中所述，使下列残基22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137(hIFN；SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)中的一个残基经下列非天然编码氨基酸取代。如实例3中所述，使下列残基6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145(hG-CSF；SEQ ID NO：29，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)中的一个残基经下列非天然编码氨基酸取代。如实例3中所述，使下列残基2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、91、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159(hEPO：SEQ ID NO：38，或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)中的一个残基经下列非天然编码氨基酸取代。

一旦经修饰，使包含含羰基氨基酸的4HB多肽变异体与下列形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为4且N为20,000MW，以产生包含非天然编码氨基酸的4HB多肽拮抗剂，其在多肽中的单一位点经PEG衍生物修饰。如实例3执行偶合、纯化以及分析。

实例12

产生4HB多肽同型二聚体、异质二聚体、同型多聚体或异质多聚体，其中4HB分子直接相连。

包含含炔氨基酸的4HB多肽变异体可直接偶合另一包含含叠氮基的氨基酸的4HB多肽变异体，其中每一者在(不限于)实例10所述的位点包含非天然编码氨基酸取代。这将产生对应的4HB多肽同型二聚体，其中两个4HB多肽变异体在位点II结合界面处物理接合。4HB多肽可以类似方式与一个或一个以上其他多肽偶合以形成异质二聚体、同型多聚体或异质多聚体。如实例3、6以及7执行偶合、纯化以及分析。

实例13

PEG-OH+Br-(CH₂)_n-C≡CR’→PEG-O-(CH₂)_n-C≡CR’

A B

使聚(亚烷基)二醇(P-OH)与卤代烷(A)反应以形成醚(B)。在这些化合物中，n为1-9的整数且R’可为直链或支链、饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基或杂烷基。R’也可为C₃-C₇饱和或不饱和环烷基或环杂烷基、经取代或未取代的芳基或杂芳基或经取代或未取代的烷芳基(烷基为C₁-C₂₀饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。一般，PEG-OH是分子量为800-40,000道尔顿(Da)的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

实例14

mPEG-OH+Br-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C≡CH

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。然后，将溶解于二甲苯中成为80重量％溶液的炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)以及催化量的KI加入所述溶液中，且将所得混合物加热至回流，历时2小时。然后，加入水(1mL)且在真空中去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)且分离有机层，以无水Na₂SO₄干燥，并且将体积减少至约2mL。将这一CH₂Cl₂溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用数份冷乙醚洗涤且干燥以提供炔丙基-O-PEG。

实例15

mPEG-OH+Br-(CH₂)₃-C≡CH→mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。然后，将50当量的5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)与催化量的KI加入所述混合物中。将所得混合物加热至回流，历时16小时。然后，加入水(1mL)且在真空中去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)且分离有机层，以无水Na₂SO₄干燥，并且将体积减少至约2mL。将这一CH₂Cl₂溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用数份冷乙醚洗涤且干燥以提供对应的炔。5-氯-1-戊炔可用于类似反应中。

实例16

(1)m-HOCH₂C₆H₄OH+NaOH+Br-CH₂-C≡CH→m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(2)m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH+MsCl+N(Et)₃→m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(3)m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH+LiBr→m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(4)mPEG-OH+m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C₆H₄O-CH₂-C≡CH

首先，向3-羟基苯甲醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，且然后加入炔丙基溴的溶液，其溶解于二甲苯(3.36mL，30mmol)中成为80重量％溶液。将反应混合物在回流下加热6小时。向所述混合物中加入10％柠檬酸(2.5mL)且在真空中去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，用MgSO₄干燥且浓缩以生成3-炔丙氧基苯甲醇。

在0℃下，将甲磺酰氯(2.5g，15.7mmol)以及三乙胺(2.8mL，20mmol)加入化合物3(2.0g，11.0mmol)于CH₂Cl₂中的溶液中且将反应置于冰箱中历时16小时。常用处理提供呈浅黄色油状的甲磺酸盐。将这一油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物在回流下加热1小时且然后将其冷却至室温。向所述混合物中加入水(2.5mL)且在真空中去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，用Na₂SO₄干燥且浓缩以生成所要溴化物。

将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中且将溶液在冰浴中冷却。加入NaH(6mg，0.25mmol)，同时剧烈搅拌数分钟时期，然后加入由上述步骤获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)与催化量的KI。去除冷却浴且将所得混合物加热至回流，历时12小时。将水(1.0mL)加入混合物中且在真空中去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)且分离有机层，以无水Na₂SO₄干燥，并且将体积减少至约2mL。向醚溶液(150mL)中逐滴加入会导致白色沉淀物，收集其以产生PEG衍生物。

实例17

mPEG-NH₂+X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR’→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR’

含末端炔的聚(乙二醇)聚合物也可通过使含有末端官能基的聚(乙二醇)聚合物与含有如上所示的炔官能基的反应性分子偶合来获得，n在1与10之间。R’可为H或C₁-C₄的小烷基。

实例18

(1)HO₂C-(CH₂)₂-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

(2)mPEG-NH₂+NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

使4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH₂Cl₂(25mL)中。加入N-羟基丁二酰亚胺(3.80g，3.3mmol)与DCC(4.66g，3.0mmol)并且在室温下整夜搅拌所述溶液。所得粗制NHS酯7无需进一步纯化即可用于以下反应中。

使分子量为5,000Da的mPEG-NH₂(mPEG-NH₂，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中且将所述混合物冷却至4℃。逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)，同时剧烈搅拌。将混合物搅拌3小时，同时升温至室温。然后，加入水(2mL)且在真空中去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(50mL)且分离有机层，以无水Na₂SO₄干燥，并且将体积减少至约2mL。将这一CH₂Cl₂溶液逐滴加入醚(150mL)中。收集所得沉淀物且在真空中干燥。

实例19

本实例表示制备聚(乙二醇)的甲磺酰酯，其也可称作聚(乙二醇)的甲磺酸酯(methanesulfonate或mesylate)。对应的甲苯磺酸酯与卤化物可通过类似程序制备。

mPEG-OH+CH₃SO₂Cl+N(Et)₃→mPEG-O-SO₂CH₃→mPEG-N₃

在氮气下，将150mL甲苯中的mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)共沸蒸馏2小时且将溶液冷却至室温。将40mL无水CH₂Cl₂以及2.1mL无水三乙胺(15mmol)加入溶液中。在冰浴中冷却溶液且逐滴加入1.2mL经蒸馏的甲磺酰氯(15mmol)。在氮气下于室温下将溶液搅拌整夜，并且通过加入2mL无水乙醇来中止反应。在真空中蒸发所述混合物以去除溶剂(主要是除甲苯以外的溶剂)，过滤，在真空中再次浓缩且然后使其沉淀于100mL乙醚中。用数份冷乙醚洗涤滤液且在真空中干燥以提供甲磺酸酯。

将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中且将溶液冷却至4℃。向冷却溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下，将反应加热至回流历时2小时。然后，蒸发溶剂且用CH₂Cl₂(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机馏分且用无水MgSO₄干燥。将体积减少至20ml且通过加入150ml冷无水醚使产物沉淀。

实例20

(1)N₃-C₆H₄-CO₂H→N₃-C₆H₄CH₂OH

(2)N₃-C₆H₄CH₂OH→Br-CH₂-C₆H₄-N₃

(3)mPEG-OH+Br-CH₂-C₆H₄-N₃→mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃

可使用美国专利5,998,595所述的方法产生4-叠氮基苯甲醇，所述专利以引用的方式并入本文中。在0℃下，将甲磺酰氯(2.5g，15.7mmol)与三乙胺(2.8mL，20mmol)加入4-叠氮基苯甲醇(1.75g，11.0mmol)于CH₂Cl₂中的溶液中且将反应置于冰箱中历时16小时。常用处理提供呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将这一油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流历时1小时且然后将其冷却至室温。向所述混合物中加入水(2.5mL)且在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，用无水Na₂SO₄干燥且浓缩以生成所要溴化物。

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)且将溴化物(3.32g，15mmol)连同催化量的KI加入混合物中。将所得混合物加热至回流，历时12小时。将水(1.0mL)加入混合物中且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)且分离有机层，以无水Na₂SO₄干燥，并且将体积减少至约2mL。向醚溶液(150mL)中逐滴加入会导致沉淀物，收集其以产生mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃。

实例21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H+N₃-CH₂CH₂CO₂-NHS→N₃-CH₂CH₂-C(O)NH-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H

将NH₂-PEG-G-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO₃(10mL)的饱和水溶液中且将溶液冷却至0℃。加入3-叠氮基-1-N-羟基丁二酰基丙酸盐(5当量)，同时剧烈搅拌。3小时后，在室温下加入20mL H₂O且将混合物另外搅拌45分钟。用0.5N H₂SO₄将pH值调节至3且加入NaCl至约15重量％的浓度。用CH₂Cl₂(100mL×3)萃取反应混合物，用Na₂SO₄干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀之后，通过过滤来收集产物且在真空中干燥以生成ω-羧基-叠氮PEG衍生物。

实例22

mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH₂-CH₂-C≡C-H

向如所属领域中已知所制备且在THF中冷却至-78℃的乙炔锂(4当量)的溶液中逐滴加入mPEG-OMs溶解于THF中的溶液，同时剧烈搅拌。3小时后，使反应升温至室温且通过加入1mL丁醇来中止反应。然后，在室温下加入20mLH₂O且将混合物另外搅拌45分钟。用0.5N H₂SO₄将pH值调节至3且加入NaCl直到约15重量％的浓度。用CH₂Cl₂(100mL×3)萃取反应混合物，用Na₂SO₄干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀之后，通过过滤来收集产物且在真空中干燥以生成1-(丁-3-炔氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

实例23

使用下列文献中所述的方法将含叠氮和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白中：L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500；J.W.Chin等人，Science301：964-7(2003)；J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，(2002)，Chem Bio Chem11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America99：11020-11024：以及L.Wane，&P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm..1-10。一旦并入氨基酸，在37℃下，在2mM PEG衍生物、1mM CuSO₄以及约1mg Cu线存在下用磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白执行环加成反应，历时4小时。

实例24

本实例描述了对乙酰基-D，L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羟胺衍生物的合成。

使用先前Zhang，Z.、Smith，B.A.C、Wang，L.、Brock，A.在Cho，C.&Schultz，P.G.，Biochemistry，(2003)42，6735-6746中描述的程序，合成外消旋pAF。

为合成m-PEG-羟胺衍生物，完成下列程序。向已在室温(RT)下搅拌1小时的(N-叔丁氧羰基-氨氧基)乙酸(0.382g，2.0mmol)和1，3-二异丙基碳化二亚胺(0.16mL，1.0mmol)于二氯甲烷(DCM，70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH₂，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，购自BioVectra)以及二异丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。将反应在RT下搅拌48小时，且然后浓缩至约100mL。逐滴将混合物加入冷醚(800mL)中。沉淀出受叔丁氧羰基保护的产物且通过过滤进行收集，用醚3×100mL洗涤。使其再溶解于DCM(100mL)中且在醚(800mL)中沉淀两次，从而进一步对其进行纯化。在真空中干燥产物，生成7.2g(96％)，通过NMR与Nihydrin测试加以确认。

在0℃下历时1小时且然后在RT下历时1.5小时，在50％TFA/DCM(40mL)中进行获自上述步骤的受保护产物(7.0g)的脱叔丁氧羰基作用。在真空中去除大部分TFA之后，通过向残余物中加入二恶烷(1mL)中的4N HCl将羟胺衍生物的TFA盐转化为HCl盐。使沉淀物溶解于DCM(50mL)中且再沉淀于醚(800mL)中。通过过滤来收集最终产物(6.8g，97％)，用醚3×100mL洗涤，在真空中干燥，储存于氮气下。使用相同程序来合成其他PEG(5K，20K)羟胺衍生物。

实例25

本实例描述用于包含非天然氨基酸的hGH多肽的表达与纯化方法。宿主细胞已用正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶以及hGH构筑体进行转化。

首先，在37℃下自经转化DH10B(tis3)细胞的冷冻甘油储备液中取出少量，使其在含有100μg/ml氨卡青霉素的2ml成份明确培养基(补充有亮氨酸、异亮氨酸、微量金属以及维生素的葡萄糖基本培养基)中生长。当OD₆₀₀达到2-5时，将60μl转移至含有100μg/ml氨卡青霉素的60ml新鲜成份明确培养基中且再次在37℃下生长至OD₆₀₀为2-5。将50ml培养物转移至5升发酵罐(Sartorius BBI)中含有100μg/ml氨卡青霉素的2升成份明确培养基中。用碳酸钾将发酵罐pH值控制在pH6.9，将温度控制在37℃，将空气流动速率控制在51pm，且用聚亚烷基消泡剂KFO F119(Lubrizol)控制泡沫。自动调节搅拌器速度以维持溶解氧含量≥30％且如果搅拌器速度达到其最大值，那么使用纯氧来补充空气喷射。在37℃下历时8小时之后，以按指数规律增加的速率向培养物中馈入成份明确培养基的50X浓缩液，以维持0.15小时^-1的特定生长速率。当OD₆₀₀达到约100时，加入对乙酰基-苯丙氨酸的外消旋混合物至3.3mM的最终浓度且将温度降低至28℃。0.75小时之后，加入异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷至0.25mM的最终浓度。使细胞在28℃下另外生长8小时，粒化且在-80℃下冷冻，直到进一步处理。

通过Invitrogen说明书提供的标准His标记蛋白纯化程序来使用ProBondNickel-Chelating Resin(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后借助于阴离子交换管柱来纯化经His标记的突变hGH蛋白。

将经纯化hGH浓缩至8mg/ml且将缓冲液交换为反应缓冲液(20mM乙酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA，pH4.0)。以20∶1的PEG∶hGH摩尔比率将MPEG-氧胺粉末加入hGH溶液中。反应在28℃下进行2天，同时轻微摇晃。经由阴离子交换管柱来将PEG-hGH从未反应的PEG以及hGH纯化。

在每种聚乙二醇化的突变hGH进入动物实验之前，通过三个检定来评估其品质。通过在非还原条件下，用MES SDS电泳缓冲液进行4-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶电泳，从而检测PEG-hGH的纯度(Invitrogen)。用库马斯蓝对凝胶染色。基于光密度分析扫描，PEG-hGH条带大于95％纯。使用来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA²试剂盒，通过动态LAL检定来测试每一PEG-hGH中的内毒素含量，且其小于每个剂量5EU。用IM-9pSTAT5生物检定(实例2中提及)来评估PEG-hGH的生物活性且EC₅₀值小于15nM。

实例26

本实例描述用于评估包含非天然氨基酸的hGH多肽的纯化和均一性的方法。

图8为在位置92包含非天然氨基酸的hGH多肽的SDS-PAGE。凝胶的泳道3、4以及5显示共价连接于5kDa、20kDa或30kDa PEG分子的在位置92包含对乙酰基-苯丙氨酸的hGH。包含聚乙二醇化的非天然氨基酸的额外hGH多肽显示于图11中。将5μg的每一PEG-hGH蛋白装载于每一SDS-PAGE上。图11画面A：泳道1，分子量标记；泳道2，WHO rhGH参考标准(2μg)；泳道3与7，30KPEG-F92pAF；泳道4，30KPEG-Y35pAF；泳道5，30KPEG-R134pAF；泳道6，20KPEG-R134pAF；泳道8，WHO rhGH参考标准(20μg)。图11画面B：泳道9，分子量标记；泳道10，WHO rhGH参考标准(2μg)；泳道11，30KPEG-F92pAF；泳道12，30KPEG-K145pAF；泳道13，30KPEG-Y143pAF；泳道14，30KPEG-G131pAF；泳道15，30KPEG-F92pAF/G120R；泳道16，WHOrhGH参考标准(20μg)。图9显示IM-9细胞中聚乙二醇化hGH多肽(5kDa、20kDa或30kDa PEG)的生物活性；如实例2所述来执行方法。

通过蛋白水解型降解(包括但不限于胰蛋白酶裂解)且随后通过质谱分析可评估hGH-PEG接合物的纯度。Pepinsky B.等人，J.Pharmcol&Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。用于执行胰蛋白酶消化的方法也描述于欧洲药典(European Pharmacopoeia)(2002)第4版第1938页中。对所述方法进行修正。在50mM TRIS-HCl(pH7.5)中透析样品整夜。在37℃水浴中，以66∶1的质量比将rhGH多肽与胰蛋白酶(经TPCK处理的胰蛋白酶，Worthington)一起培育4小时。在冰上培育样品数分钟以终止消化反应且随后在HPLC分析期间维持在4℃下。将经消化样品(约200μg)装载于0.1％三氟乙酸中的25×0.46cm VydacC-8管柱(5-μm粒径，100

孔径)上，且在30℃下以1ml/min的流动速率用0至80％乙腈的梯度历时70min进行洗脱。通过214nm下的吸光度来监控胰蛋白酶肽的洗脱。

图10画面A描述具有所示胰蛋白酶裂解位点和箭头所指的非天然氨基酸取代F92pAF的hGH的一级结构(从Becker等人，Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)：326-337修正的图)。画面B显示下列各肽的重叠胰蛋白酶图谱：由经聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(30K PEG His₆-F92pAFrhGH，经标记的A)；由包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(His₆-F92pAF rhGH，经标记的B)；以及由野生型hGH产生的肽(WHO rhGH，经标记的C)。WHO rhGH与His₆-F92pAF rhGH的胰蛋白酶图谱的比较揭示仅两个峰移动(肽峰1和肽峰9)且剩余峰相同。通过在经表达的His₆-F92pAF rhGH的N末端添加His₆来引起这些差异，从而导致峰1移动；而峰9的移动是通过用对乙酰基-苯丙氨酸取代苯丙氨酸的残基92而引起。画面C-显示来自画面B的峰9的放大图。His₆-F92pAF与30K PEG His₆-F92pAF rhGH胰蛋白酶图谱的比较揭示峰9在His₆-F92pAF rhGH聚乙二醇化后消失，因此证实修饰对肽9呈特异性。

实例27

本实例描述由各自包含非天然氨基酸的两个hGH多肽所形成的同型二聚体。

图12比较在位置92包含对乙酰基-苯丙氨酸取代的His标记hGH多肽与用具有如实例25所述用于聚乙二醇化hGH的官能基和反应性的双官能连接子所接合的这一经修饰多肽的同型二聚体的IM-9检定结果。

实例28

本实例描述充当hGH拮抗剂的单体和二聚体hGH多肽。

其中已在位点II引入G120R取代的hGH突变蛋白能够结合单一hGH受体，但不能使两个受体二聚。所述突变蛋白可能通过占据受体位点而不活化细胞内信号传输路径而充当体外hGH拮抗剂(Fuh，G.等人，Science 256：1677-1680(1992))。图13画面A显示测量用具有G120R取代的hGH进行的pSTAT5磷酸化的IM-9检定数据。在同一位置(G120)并入非天然氨基酸的hGH多肽导致如图13画面B所示也充当hGH拮抗剂的分子。构筑图13画面B所示的hGH拮抗剂的二聚体，其由具有如实例25所示用于聚乙二醇化hGH的官能基和反应性的双官能连接子接合。图14显示这个二聚体在IM-9检定中也缺乏生物活性。

执行额外检定，其比较包含G120pAF取代的hGH多肽与经由PEG连接子接合的经G120pAF修饰的hGH多肽的二聚体。WHO hGH诱导的STAT5磷酸化由剂量反应范围的单体以及由PEG连接子接合的二聚体竞争。也执行表面受体竞争研究，其显示单体和二聚体与GH竞争结合于IM-9和大鼠GHR(L43R)/BAF3细胞上的细胞表面受体。二聚体充当比单体更有效的拮抗剂。

表4显示这些研究的数据。

表4
				细胞系	IM-9	IM-9	大鼠GHR(L43R)/BAF3
检定	PSTAT5抑制	表面受体竞争	表面受体竞争
					IC₅₀(nM)	IC₅₀(nM)	IC₅₀(nM)
G120pAF单体	3.3	8.4	3.1
				(G120pAF)二聚体，PEG连接子	0.7	2.7	1.4

实例29

本实例详述hGH活性和hGH多肽对hGH受体的亲和力的测量。

大鼠GH受体的克隆和纯化将大鼠GH受体的细胞外域(GHR ECD，氨基酸S29-T238)在Nde I与Hind III位点之间克隆到pET20b载体(Novagen)中与C末端6His标签同框。引入L43至R的突变以进一步接近人类GH受体结合位点(Souza等人，Proc NatlAcad Sci USA.(1995)92(4)：959-63)。通过在30℃下用0.4mM IPTG诱导4-5小时而在BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)中产生重组蛋白。在溶解细胞之后，通过使颗粒物再悬浮于含有30mL 50mMTris(pH7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100的杜恩斯器具中而将所述颗粒物洗涤四次，且用不含Triton X-100的相同缓冲液洗涤两次。此时，包涵体是由超过95％的GHR ECD组成且在0.1M Tris(pH11.5)、2 M脲中溶解。通过使包涵体溶液的等分试样通过S100(Sigma)凝胶过滤管柱来完成再折叠，其中用50mM Tris(pH7.8)、1M L-精氨酸、3.7mM胱胺、6.5mM半胱胺平衡。合并含有可溶蛋白的部分且以50mM Tris(pH7.6)、200mM NaCl、10％甘油进行透析。根据制造商说明书，使样品短暂离心以去除任何沉淀物，并与Talon树脂(Clontech)的等分试样一起培育。在用补充有5mM咪唑的20倍体积的透析缓冲液洗涤树脂之后，用透析缓冲液中的120mM咪唑洗脱蛋白。最终，通过50mM Tris(pH7.6)、30mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油将样品透析整夜，短暂离心以去除任何沉淀物，调节至20％甘油最终浓度，分成等分试样且储存于-80℃下。使用所计算的消光系数ε＝65,700M^-1*cm^-1，由OD(280)来测量蛋白浓度。

GH与GHR的结合的Biocore^TM分析

使用制造商所推荐的标准胺偶合程序，将约600-800 RU的可溶GHR ECD固定于Biacore^TM CM5芯片上。即使这一技术会使大部分受体失活，用实验方法也发现这个固定水平足以产生约100-150 RU的最大特异性GH结合反应，而无明显的结合动力学改变。例如参看Cunningham等人，J Mol Biol.(1993)234(3)：554-63以及Wells JA.Proc Natl Acad Sci USA(1996)93(1)：1-6)。

以40μl/min的流动速率注射HBS-EP缓冲液(Biacore^TM，Pharmacia)中的各种浓度的野生型或突变型GH(0.1-300nM)经过GHR表面历时4-5分钟，且在注射后历时15分钟监控解离。通过15秒脉冲的4.5M MgCl₂使表面再生。在至少100个再生循环之后，观察到仅最少的结合亲和力损失(1-5％)。使用不含经固定受体的参考细胞来消减任何缓冲液体效应以及非特异性结合。

用BiaEvaluation 4.1软件(BIACORE^TM)处理获自GH滴定实验的动力学结合数据。“二价分析物”缔合模型提供令人满意的拟合(通常小于3的chi²值)，其与所提议的连续1∶2(GH∶GHR)二聚一致(Wells JA.Proc Natl Acad Sci USA(1996)93(1)：1-6)。以个别速率常数的比率(k_off/k_on)来计算平衡解离常数(K_d)。

表5表明使用固定于CM5芯片上的大鼠GHR ECD(L43R)由Biacore^TM计算的结合参数。

表5
				GH	k_on，×10^-5，1/M*s	koff，×10⁴，1/s	K_d，nM
WHOWT	6.4	3.8	0.6
				N-6His WT	9	5.6	0.6
大鼠GH WT	0.33	83	250
				N12pAF	12.5	4.6	0.4
R16pAF	6.8	4.8	0.7
				Y35pAF	7.8	5.3	0.7
E88pAF	6.8	5.4	0.8
				Q91pAF	6.6	4.9	0.7
F92pAJF	8.6	5.0	0.6
				R94pAF	5.6	6.0	1.1
S95pAF	0.7	3.1	4.3
				N99pAF	2.2	3.8	1.7
Y103pAF	-0.06	～6	＞100
				Y111pAF	8.4	4.8	0.6
G120R	2.2	22	10
				G120pAF	1.1	23	20

G131pAF	6.0	5.3	0.9
				P133pAP	6.4	4.9	0.8
R134pAF	8.4	5.8	0.7
				T135pAF	7.2	4.5	0.6
G136pAF	6.2	4.3	0.7
				F139pAF	6.8	4.4	0.7
K140pAF	7.2	3.7	0.5
				Y143pAF	7.8	6.7	0.9
K145pAF	6.4	5.0	0.8
				A155pAF	5.8	4.4	0.8
F92pAF-5KD PEG	6.2	2.3	0.4
				F92pAF-20KD PEG	1.7	1.8	1.1
F92pAF-30KD PEG	1.3	0.9	0.7
				R134pAF-5KD PEG	6.8	2.7	0.4
R134pAF-30KD PEG	0.7	1.7	2.4
				Y35pAF-30KD PEG	0.9	0.7	0.7
(G120pAF)二聚体	0.4	1.5	3.4
				(F92pAF)二聚体	3.6	1.8	0.5

GHR稳定细胞系

使IL-3依赖性小鼠细胞系BAF3在RPMI 1640、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、10％热灭活胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇以及作为IL-3来源的10％WEHI-3细胞系调节培养基中进行常规传代。在5％CO₂的潮湿气氛下，使所有细胞培养物维持于37℃下。

使用BAF3细胞系来建立大鼠GHR(L43R)稳定细胞克隆2E2-2B12-F4。简单而言，用含有全长大鼠GHR(L43R)cDNA的15μg线性化pcDNA3.1质粒对1×10⁷个中度融合的BAF3细胞进行电穿孔。通过限制在含有800μg/mlG418和5nM WHO hGH的培养基中的稀释使转染细胞在克隆之前恢复48小时。通过用抗人类GHR的抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行表面染色来鉴别表达GHR的转染子且在FACS阵列(BD Biosciences，San Diego，CA)上进行分析。然后，在BrdU增殖检定(如下文所述)中筛选表达良好水平的GHR的转染子抗WHO hGH的增殖活性。在1.2mg/ml G418和5nM hGH存在下，在所要转染子的另外两轮重复亚克隆中建立稳定转染的大鼠GHR(L43R)细胞克隆，同时存在表面受体表达和增殖能力的恒定概况。在不存在hGH的情形下，如此建立的细胞克隆2E2-2B12-F4常规维持于BAF3培养基加1.2mg/ml G418中。

通过BrdU标记进行增殖

以5×10⁴个细胞/孔的密度将血清饥饿的表达大鼠GHR(L43R)的BAF3细胞系2E2-2B12-F4涂于96孔培养盘中。用12点剂量范围的hGH蛋白活化细胞且同时用50μM BrdU(Sigma，St.Louis，MO)标记。在培养48小时之后，在室温下用100μl BD细胞固定/细胞渗透溶液(BD Biosciences)固定/渗透细胞历时30min。为暴露BrdU抗原决定部位，在37℃下用30μg/孔的DNase(Sigma)处理已固定/渗透的细胞历时1小时。用与APC接合的抗BrdU抗体(BDBiosciences)进行免疫荧光染色使样品分析能够在FACS阵列上进行。

表6显示如pSTAT5(IM-9)和BrdU增殖检定所概述的PEG hGH突变体的生物活性。作为整体表达WHO hGH以在检定之间进行对比。

表6
			hGH	pSTAT5 EC₅₀(nM)	增殖EC₅₀(nM)
WHOWT	1.0	1.0
			Y35pAF	1.3	1.6±0.8(n＝3)
Y35pAF-30KPEG	10	5.4±2.8(n＝4)
			Y35pAF-40KPEG	53.3	24.0+11.0(n＝3)
F92pAF	2.2±0.4(n＝9)	1.4±0.7(n＝4)
			F92pAF-5KPEG	5.1+0.4(n＝3)	ND
F92pAF-20KPEG	10.5+0.8(n＝3)	ND
			F92pAF-30KPEG	8.8±1.2(n＝8)	4.1±0.9(n＝3)
F92pAF/G120R	＞200,000	＞200,000
			F92pAF/G120R-30KPEG	＞200,000	＞200,000
G131pAF	2.3±1.8(n＝2)	2.1±1.1(n＝3)
			G131pAF-30KPEG	23.8±1.7(n＝2)	4.6±2.4(n＝3)
R134pAF	1.1±0.2(n＝2)	1.7±0.3(n＝3)
			R134pAF-20KPEG	5.3	ND
R134pAF-30KPEG	11.3±1.1(n＝2)	2.5±0.7(n＝4)
			Y143pAF	1.6±0.1(n＝2)	1.8±0.6(n＝2)
Y143pAF-30KPEG	12.3±0.9(n＝2)	6.6±2.7(n＝3)
			K145pAF	2.3±0.5(n＝2)	3.0±1.4(n＝2)
K145pAF-30KPEG	20.6±9.8(n＝2)	5.3±3.5(n＝3)

实例30

本实例描述用于测量聚乙二醇化hGH的体外及体内活性的方法。

细胞结合检定

在0℃下，在各种浓度(体积：10μl)的未标记GH、hGH或GM-CSF不存在或存在以及¹²⁵I-GH(约100,000cpm或1ng)存在的情形下，在PBS/1％BSA(100μl)中双重复培育细胞(3×10⁶)，历时90分钟(总体积：120μl)。然后，使细胞在350μl塑料离心管中的250μl冰冷FCS上再悬浮且分层，并离心(1000g；1分钟)。通过切断管末端来收集颗粒物且分别在γ计数器(Packard)中对颗粒物与上清液计数。

将特异性结合(cpm)确定为竞争试剂不存在的情形下的总结合(复本平均值)减去100倍过量的未标记GH存在下的结合(cpm)(非特异性结合)。测量所用细胞类型中的每一者的非特异性结合。使用相同的¹²⁵I-GH制剂，不在同一天进行实验且所述实验应展示内部一致性。¹²⁵I-GH证实结合至产生GH受体的细胞。所述结合以剂量依赖方式受到未标记天然GH或hGH的抑制，但并不受GM-CSF或其他阴性对照抑制。hGH竞争结合天然¹²⁵I-GH的能力类似于天然GH，说明受体同等地识别两种形式。

聚乙二醇化hGH的体内研究

将PEG-hGH、未修饰hGH与缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果显示本发明的聚乙二醇化hGH与未修饰hGH相比具有优良活性与延长的半衰期，如显著增加的体重所示。

测量接合与未接合hGH以及其变异体的体内半衰期

在AAALAC所认可的设施中且根据the Institutional Animal Care and UseCommittee of St.Louis University所批准的方案，进行所有动物实验。在具有12小时亮/暗循环的房间内，将大鼠个别地圈养于笼中。使动物任意取食合格的Purina啮齿动物固体食物5001与水。对于切除垂体的大鼠而言，饮用水额外含有5％葡萄糖。

药物动力学研究

在每种聚乙二醇化突变hGH进入动物实验之前，通过三个检定来评估其品质。通过在非还原条件下，用MES SDS电泳缓冲液进行4-12％丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝胶电泳，从而检测PEG-hGH的纯度(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用库马斯蓝对凝胶染色。基于光密度分析扫描，PEG-hGH条带大于95％纯。使用来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA²试剂盒，通过动态LAL检定来测试每一PEG-hGH中的内毒素含量，且其小于每个剂量5EU。用IM-9pSTAT5生物检定(实例2中提及)来评估PEG-hGH的生物活性且EC₅₀值证实小于15nM。

在获自Charles River Laboratories的雄性Sprague-Dawley大鼠(261-425g)中将经PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学特性彼此比较且与未聚乙二醇化生长激素相比较。通过手术将导管安装于颈动脉中以用于血液收集。在成功进行导管安装之后，在给药之前将动物指定治疗组(每组3-6只)。经皮下向动物投与剂量体积为0.41-0.55ml/kg的1mg/kg化合物。在各个时间点，经由留置导管收集血样且将其收集到经EDTA涂覆的微量离心管中。在离心之后收集血浆且将其储存于-80℃，直到分析。使用购自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗体夹心生长激素ELISA试剂盒来测量化合物浓度。使用对应于所投与的类似物的标准物来计算浓度。使用模型建立程序WinNonlin(Pharsight，version 4.1)来估算药物动力学参数。使用用线性向上/对数向下的梯形积分进行的无隔室分析，且对浓度数据进行均匀加权。

图15显示对大鼠投与单一皮下剂量之后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。使大鼠(n＝每组3-4只)服用单一剂量的1mg/kg hGH野生型蛋白(WHO hGH)、经His标记的hGH多肽(his-hGH)或共价连接于30kDa PEG(30KPEG-pAF92(his)hGH)的在位置92包含非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的经His标记的hGH多肽。以所示的时间间隔采集血浆样品且对其进行检定以分析所述的经注射化合物。30KPEG-pAF92(his)hGH具有与对照hGH相比显著延长的循环。

图16显示对大鼠投与单一皮下剂量之后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。使大鼠(n＝每组3-6只)服用单一剂量的1mg/kg蛋白。使共价连接于30kDa PEG的在六个不同位置中的每一位置包含非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽与WHO hGH以及(his)-hGH比较。以所示的时间间隔采集血浆样品且对其进行检定以分析所述的经注射化合物。表7显示图16所示的hGH多肽的单一剂量投与的药物动力学参数值。所示的值为平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；末期t_i/2：末期半衰期；AUC_0→inf’：浓度-时间曲线下面积外推至无限；Cl/f：表观总血浆清除率；MRT：平均停留时间；Vz/f：末期分布的表观体积。

表7：正常雄性Sprague-Dawley大鼠中单一剂量1mg/kg皮下投与的药物动力学参数值

化合物(n)

参数

Cmax(ng/ml)

末期t_1/2(h)

AUC_0→inf’(ngXhr/ml)

MRT(h)

Cl/f((ml/hr/kg)

Vz/f(ml/kg)

WHOhGH(3)

529(+127)

0.53(+0.07)

759(+178)

1.29(+0.05)

1,368(+327)

1051(+279)

(his)hGH(4)

680

0.61

1,03

1.30

974

853

(±167)

(±0.05)

3(±92)

(±0.17)

(±84)

(±91)

30KPEG-pAF35(his)hGH(4)

1,885(±1,011)

4.85(+0.80)

39,918(+22,683)

19.16(±4.00)

35(+27)

268(+236)

30KPEG-pAF92(his)hGH(6)

663(+277)

4.51(+0.90)

10,539(+6,639)

15.05(+2.07)

135(+90)

959(+833)

30KPEG-pAF131(his)hGH(5)

497(+187)

4.41(+0.27)

6,978(+2,573)

14.28(+0.92)

161(+61)

1,039(+449)

30KPEG-pAF134(his)hGH(3)

566(+204)

4.36(+0.33)

7,304(+2,494)

12.15(+1.03)

151(+63)

931(+310)

30KPEG-pAF143(his)hGH(5)

803(+149)

6.02(+1.43)

17,494(+3,654)

18.83(+1.59)

59(+11)

526(+213)

30KPEG-pAF145(his)hGH(5)

634(±56)

5.87(±0.09)

13,162(±6,726)

17.82(±0.56)

88(±29)

743(±52)

药效研究

切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠获自Charles River Laboratories。在3-4周龄时通过手术去除垂体。使动物适应3周时期，在此期间监控体重。包括在研究之前的7天时期内体重增量为0-8g的动物且将其随机分成治疗组。使大鼠经皮下服用单一剂量或每日剂量。在研究期间，每日且连续地对大鼠称重，麻醉，放血且给药(适当时)。使用肝素化毛细管自眼眶窦中收集血液且将其放置于经EDTA涂覆的微量离心管中。通过离心来分离血浆且将其储存于-80℃下，直到分析。

图17显示对切除垂体的大鼠投与单一皮下剂量之后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。使大鼠(n＝每组5-7只)服用单一剂量的2.1mg/kg蛋白。显示共价连接于30kDa PEG的在两个不同位置中的每一位置包含非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的结果。以所示的时间间隔采集血浆样品且对其进行检定以用于所述的经注射化合物。

肽IGF-1为生长调节素或类胰岛素生长因子家族中的成员。IGF-1调节生长激素的生长促进效应中的多种效应。使用对抗所提供的大鼠/小鼠IGF-1标准物(Diagnosic Systems Laboratories)的竞争性结合酶免疫检定试剂盒来测量IGF-1浓度。使用双尾分布、不成对、相等变异数，通过t测试来测定显著性差异。图18画面A显示切除垂体的大鼠中的化合物的评估。使大鼠(n＝每组5-7只)经皮下服用单一剂量或每日剂量。每日，连续地对大鼠称重，麻醉，放血且给药(适当时)。显示安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)、经His标记的hGH((his)hGH)以及共价连接于30kDa PEG的在位置35与92包含对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。图18画面B显示在投与单一剂量的聚乙二醇化的包含非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对血浆IGF-1含量的循环的影响。竖条代表标准偏差。在图18画面A中，关于30KPEG-pAF35(his)hGH化合物的第9天的体重增量在统计学上不同于关于30KPEG-pAF92(his)hGH化合物的体重增量，因为观察到更大体重增量。

图18画面C显示切除垂体的大鼠中的化合物的评估。使大鼠(n＝每组11只)经皮下服用单一剂量或每日剂量。每日，连续地对大鼠称重，麻醉，放血且给药(适当时)。显示安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)以及共价连接于30kDaPEG的在位置92、134、145、131以及143包含对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。图18画面E显示与安慰剂治疗以及野生型hGH相比，在投与单一剂量的聚乙二醇化的包含(位置92、134、145、131、143)非天然编码氨基酸的hGH多肽之后对血浆IGF-1含量的循环的影响。图18画面显示对应于聚乙二醇化的包含(92、134、145、131、143)非天然编码氨基酸的hGH多肽的平均(+/-S.D.)血浆浓度。以所示的时间间隔采集血浆样品且对其进行检定以分析所述的经注射化合物。竖条代表标准偏差。

实例31

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的安全性和/或功效的人类临床试验

目标在于对比经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hGH与市售hGH产品(包括但不限于Humatrope^TM(Eli Lilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono))的安全性和药物动力学。

患者 18个年龄为20-40岁且体重为60-90kg的健康志愿者参加本研究。所述受检者将不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选以及乙型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有下列情形的任何征兆：高血压；任何原发性血液学疾病病史；严重肝、肾、心血管、肠胃、泌尿生殖、代谢、神经疾病病史；贫血或癫痫症病史；已知对细菌性或哺乳动物来源产品、PEG或人类血清白蛋白过敏；惯常且大量饮用含有咖啡因的饮料的消费者；参与任何其他临床试验或在研究登记的30天内输血或献血；在研究登记的3个月内已暴露于hGH；在研究登记的7天内患病；以及在研究登记的14天内，在研究前身体检查或临床实验评估中存在显著异常。可评估所有受检者的安全性且按期收集用于药物动力学分析的所有血液收集物。所有研究都在机构伦理委员会的批准以及患者的同意下执行。

研究设计本设计将是健康男性志愿者的阶段I、单一中心、开放标记、随机化、二阶段交叉研究。将18个受检者随机指定为两个治疗序列组中的一组(9个受检者/组)。在大腿上段使用相同剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH和所选市售产品进行快速皮下注射，经过两个独立给药期来投与GH。包装标签指示市售产品的投与剂量和频率。可通过包括额外受检者组而将使用市售产品进行的额外给药、给药频率或其他所要参数加入研究中。以14天清除期隔开每个给药期。对于两个给药期中的每一者而言，在给药前至少12小时以及给药后72小时(但不在给药期之间)将受检者限制于研究中心。如果存在额外给药、频率或其他参数，那么可加入额外受检者组，以同样对其进行聚乙二醇化hGH测试。批准供人类使用的多种GH调配物可用于这个研究中。Humatrope^TM(Eli Lilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono))为批准供人类使用的市售GH产品。hGH的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH。

采血在投与hGH之前以及之后，通过直接静脉穿刺来抽取连续血液。在给药之前(3个基线样品)约30、20与10分钟以及大致在给药之后的下列时间获得用于测定血清GH浓度的静脉血样(5mL)：30分钟以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60与72小时。将各血清样品分成两个等分试样。将所有血清样品储存于-20℃下。在干冰上托运血清样品。在第1天的初始剂量之前(即刻)、第4天的早晨、第16天给药之前(即刻)以及第19天的早晨执行空腹临床实验测试(血液学、血清化学以及尿分析)。

生物分析方法将ELISA试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]，Webster TX)用于测定血清GH浓度。

安全性测定在每次给药(第1天及第16天)之前即刻以及在每次给药之后6、24、48与72小时记录生命指征。安全性测定是基于不利事件的发生率与类型以及临床实验测试中与基线的不同。此外，也评估与研究之前生命指征测量(包括血压与身体检查结果)的不同。

数据分析自给药后各值中的每一者减去通过计算给药之前30、20与10分钟时收集的三个样品的GH含量的平均值所测定的平均基线GH浓度，从而关于给药前基线GH浓度来校正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检定的定量含量，那么其并不包括于平均值的计算中。根据关于基线GH浓度校正的血清浓度数据来测定药物动力学参数。使用最新版本的BIOAVL软件，在Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统上通过模型独立方法来计算药物动力学参数。测定下列药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；达到峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形法则所计算的自时间零至最终采血时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及由计算机根据消除率常数所计算的末期消除半衰期(t_1/2)。通过对数线性浓度-时间曲线的末期线性区域中的连续数据点的线性回归来估算消除率常数。计算各治疗组的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)以及变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存的调配物/未保存的调配物)。

安全性结果在治疗组中同等分配不利事件的发生率。与基线或研究前临床实验测试或血压并无临床显著不同，且与研究前身体检查结果以及生命指征测量也无显著不同。两个治疗组的安全性曲线应看起来相似。

药物动力学结果在所测量的各时间点，将所有18个受检者在接收单一剂量的市售hGH产品(包括但不限于Humatrope^TM(Eli Lilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)与Saizen/Serostim^TM(Serono))中的一或多种产品之后的平均血清GH浓度-时间曲线(并未关于基线GH含量进行校正)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH相比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的给药前基线GH浓度。根据关于给药前平均基线GH浓度所校正的血清数据来测定药物动力学参数且测定C_max与t_max。所选临床对照试剂(Humatrope^TM(Eli Lilly&Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)、Saizen/Serostim^TM(Serono))的平均t_max显著小于包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的t_max。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的末期半衰期相比，所测试的市售hGH产品的末期半衰期值显著较小。

尽管本研究是在健康男性受检者中进行，预期类似的吸收特征以及安全性曲线也应存在于其他患者群体中；例如患癌或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、自体贮血方案中的患者或安排进行择期手术的患者。

总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH将是安全的且健康男性受检者可以很好的承受。基于不利事件的对照发生率、临床实验值、生命指征以及身体检查结果，市售形式的hGH与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的安全性曲线将是均等的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH潜在地为患者以及卫生保健提供者提供巨大的临床效用。

实例32

本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入hIFN中的优选位点的多组潜在标准之一。

本实例证实如何选择hIFN多肽中的优选位点以引入非天然编码氨基酸。使用具有PDB ID 1RH2以及NMR结构1ITF(24个不同NMR结构)的晶体结构来确定其中可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。这些结构的坐标可得自蛋白数据银行(PDB)或可经由The Research Collaborator forStructural Bioinformatics PDB得自万维网rcsb.org。

用于本实例中的序列编号是根据SEQ ID NO：24中所示的成熟hIFN的氨基酸序列。

下列标准是用于评估用于引入非天然编码氨基酸的hIFN的各位置：残基(a)不应干扰基于与hIFN接合的hIFNbp的结晶结构的结构分析的任一hIFNbp的结合；(b)不应受丙氨酸扫描突变诱发影响；(c)应表面暴露且展示与周围残基的最小范德华或氢键相互作用；(d)在hIFN变异体中应缺失或可变化；(e)在经非天然编码氨基酸取代之后导致保守改变；以及(f)可见于高度挠性区域(包括但不限于CD环)或结构刚性区域(包括但不限于螺旋B)中。用于现场评估的出版物包括：Bioconj.Chemistry 2001(12)195-202；Current PharmaceuticalDesign 2002(8)2139-2157；Neuroimmunology 2001(12)，857-859；BBRC 1994(202)1445-1451；Cancer Biotherapy+Radiopharmaceuticals 1998(第13卷)，143-153；Structure 1996(14)1453-1463；JMB 1997(274)661-675。此外，对hIFN分子执行其他计算，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)来估算各蛋白原子的突出程度。结果，在一些实施例中，在(不限于)hIFN的下列位置中的一个或一个以上位置处取代一个或一个以上非天然编码氨基酸(如同在SEQ ID NO：24中，或其他IFN的对应氨基酸)：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165或166(即羧基末端)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：100、106、107、108、111、113、114。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：41、45、46、48、49。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165。在一些实施例中，这些或其他位置的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，所述位置包括但不限于下列位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即羧基末端)。在一些实施例中，所述水溶性聚合物在一个或一个以上氨基酸位置偶合于IFN多肽：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161以及162(SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：23、25中的对应氨基酸，或任何其他IFN多肽)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸以提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165；视所选的指定位点与所要活性而定，包含所述取代中的一个取代的hIFN多肽可潜在充当弱拮抗剂或弱促效剂。人类IFN拮抗剂包括但不限于在22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137具有取代或其任何组合(hIFN；SEQID NO：24，或SEQ ID NO：23或25中的对应氨基酸)的那些拮抗剂。

实例33

本实例详述大肠杆菌中经修饰hIFN多肽的克隆与表达。

本实例证实如何可使包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽于大肠杆菌中表达。参看Nagata等人，Nature，第284卷，316-320(1980)与美国专利第4,364,863号。编码全长hIFN与缺乏N末端信号序列的成熟形式hIFN的cDNA分别示于SEQ ID NO：26与SEQ ID NO：27中。在不改变氨基酸序列的情形下优化克隆与表达序列之后，将编码全长与成熟hIFN的cDNA插入pBAD HISc、pET20b以及pET19b表达载体中。

使用包含正交tRNA(O-tRNA)与正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hIFN，如实例2中关于hGH表达所述。

实例34

本实例描述用于测量聚乙二醇化IFN的体外及体内活性的方法。

细胞结合检定

在0℃下，在各种浓度(体积：10μl)的未标记IFN、hIFN或GM-CSF不存在或存在以及¹²⁵I-IFN(约100,000cpm或1ng)存在的情形下，在PBS/1％BSA(100μl)中双重复培育细胞(3×10⁶)，历时90分钟(总体积：120μl)。然后，使细胞在350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上再悬浮且分层，并离心(1000g；1分钟)。通过切断管末端来收集颗粒物且分别在γ计数器(Packard)中对颗粒物与上清液计数。

将特异性结合(cpm)确定为竞争试剂不存在的情形下的总结合(复本平均值)减去100倍过量的未标记IFN存在下的结合(cpm)(非特异性结合)。测量所用细胞类型中的每一者的非特异性结合。使用相同的¹²⁵I-IFN制剂，不在同一天进行实验且所述实验应展示内部一致性。¹²⁵I-GH证实结合至Daudi细胞。所述结合以剂量依赖方式受到未标记天然IFN或hIFN的抑制，但并不受GM-CSF或其他阴性对照抑制。hIFN竞争结合天然¹²⁵I-IFN的能力类似于天然IFN，说明受体同等地识别两种形式。

聚乙二醇化IFN的体内研究

将PEG-hIFN、未修饰hIFN与缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果显示本发明的聚乙二醇化hIFN与未修饰hIFN相比具有优良活性与延长的半衰期，如每只小鼠使用相同剂量进行的病毒复制的显著增加的抑制作用所示。

测量接合与末接合hIFN以及其变异体的体内半衰期

使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周大)。在投与当天，测量每只动物的重量。在静脉内，将每kg体重100μg未接合与接合hIFN样品各自注射到三只大鼠的尾部静脉中。在注射后1分钟、30分钟、1、2、4、6以及24小时，在CO₂麻醉作用下自每只大鼠中抽出500μl血液。将血样在室温下储存1.5小时，然后通过离心进行血清分离(4℃，18000xg，5分钟)。将血清样品储存于-80℃下，直到分析当天。在冰上解冻样品之后，通过IFN体外活性检定来量化血清样品中的活性IFN的量。

抗病毒活性

所属领域的技术人员已知多种测量细胞抗病毒的耐性程度的检定(McNeillTA，J Immunol Methods.(1981)46(2)：121-7)。这些检定通常可分为三种类型：细胞变性效应的抑制；病毒斑形成；以及病毒产量减少。病毒细胞变性效应检定测量用IFN预处理且随后经病毒感染的细胞培养物中诱导的保护作用的程度。举例而言，水泡性口膜炎病毒是用于所述检定中的适当病毒。这个类型的检定便于筛选各种不同的IFN，因为其可在96孔培养盘中进行。斑减少检定测量经IFN处理的细胞培养物对斑形成病毒(举例而言，麻疹病毒)的耐性。这个检定的一个益处在于其允许精确测量斑形成的50％减少。最终，病毒产量检定测量在(例如)单一生长周期中由细胞释放的病毒的量。所述检定适用于测试IFN对抗不引起细胞变性效应或不在目标细胞培养物中生斑的病毒的抗病毒活性。感染的多重性(moi)是在使用斑减少或病毒产量检定时应考虑的重要因素。

其他临床重要干扰素特征也易于在实验室背景中检定。一个所述特征是干扰素多肽结合特异细胞表面受体的能力。举例而言，与IFNα-2b(所述IFN最常用于临床试验)相比，一些IFNα-2b展示不同的细胞表面特性。当IFNα-2b为有效抗病毒药剂时，其引起显著不利的副作用。展示与IFNα-2b不同的结合特性的干扰素不能引起相同副作用。因此，微弱地与IFNα-2b竞争细胞上的结合位点的干扰素具有临床重要性。竞争性干扰素结合检定在所属领域中众所周知(Hu等人，J Biol Chem.(1993)Jun 15；268(17)：12591-5；Di Marco等人，(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.202：1445-1451)。一般而言，所述检定涉及将细胞培养物细胞与¹²⁵I标记的IFNα-2b和相关未标记干扰素的混合物一起培育。然后，去除未结合干扰素，且测量结合标记的量(且延伸而言，结合的¹²⁵I标记的IFNα-2b)。通过对比竞争性干扰素存在或不存在的情形下结合细胞的标记的量可计算相对结合亲和力。

IFNα的另一显著效应是其抑制细胞生长的能力，这对于测定抗肿瘤作用具有显著重要性。生长抑制检定得到良好建立，且通常视细胞数或经滴定胸腺嘧啶核苷([³H]胸腺嘧啶核苷)或另一放射性标记的摄取而定。人类淋巴母细胞样Daudi细胞系已证明对IFNα极度敏感且其已用来测量多种IFNα与所衍生的杂交多肽中的抗增殖性活性(Meister等人，J Gen Virol.(1986)，8月；67(Pt8)：1633-43)。这个细胞系的用途已通过其在悬浮培养物中的生长能力而得到促进(Evinger和Pestka，(1981)Methods Enzymol.79：362-368)。IFNα也展示多种免疫调控活性(Zoon等人，(1986)In，The Biology of the Interferon System.Cantelland Schellenkens，Eds.，Martinus Nyhoff Publishers，Amsterdam)。

尽管IFN首先由病毒学家发现，但其首次临床使用(1979年)却是作为治疗剂用于骨髓瘤(Joshua等人，(1997)Blood Rev.11(4)：191-200)。IFNα已展示出有效对抗大量病毒、恶性、血管生成、过敏、发炎以及纤维变性来源的疾病(Tilg，(1997)Gastroenterology.112(3)：1017-1021)。另外也证明其可有效治疗转移性肾癌以及慢性骨髓性白血病(Williams和Linch，(1997)Br.J.Hosp.Med.57(9)：436-439)。IFN的临床使用可见于Gresser(1997)J.Leukoc.Biol.61(5)：567-574与Pfeffer(1997)Semin.Oncol.24(3 Suppl.9)：S9-S63S969。

实例35

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性和/或功效的人类临床试验

目标在于对比经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hIFN与市售hIFN产品Roferon A

或Intron A

的安全性和药物动力学。

患者 18个年龄为20-40岁且体重为60-90kg的健康志愿者参加本研究。所述受检者将不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选以及乙型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有下列情形的任何征兆：高血压；任何原发性血液学疾病病史；严重肝、肾、心血管、肠胃、泌尿生殖、代谢、神经疾病病史；贫血或癫痫症病史；已知对细菌性或哺乳动物来源产品、PEG或人类血清白蛋白过敏；惯常且大量饮用含有咖啡因的饮料的消费者；参与任何其他临床试验或在研究登记的30天内输血或献血；在研究登记的3个月内已暴露于hIFN；在研究登记的7天内患病；以及在研究登记的14天内，在研究前身体检查或临床实验评估中存在显著异常。可评估所有受检者的安全性且按期收集用于药物动力学分析的所有血液收集物。所有研究都在机构伦理委员会的批准以及患者的同意下执行。

研究设计本设计将是健康男件志愿者的阶段I、单一中心、开放标记、随机化、二阶段交叉研究。将18个受检者随机指定为两个治疗序列组中的一组(9个受检者/组)。在大腿上段使用相同剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN和所选市售产品进行快速皮下注射，经过两个独立给药期来投与IFN。包装标签指示市售产品的投与剂量和频率。可通过包括额外受检者组而将使用市售产品进行的额外给药、给药频率或其他所要参数加入研究中。以14天清除期隔开每个给药期。对于两个给药期中的每一者而言，在给药前至少12小时以及给药后72小时(但不在给药期之间)将受检者限制于研究中心。如果存在额外给药、频率或其他参数，那么可加入额外受检者组，以同样对其进行聚乙二醇化hIFN测试。经批准供人类使用的多种IFN调配物可用于这个研究中。Roferon A

和/或Intron A

为经批准供人类使用的市售IFN产品。hIFN的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN。

采血在投与hIFN之前以及之后，通过直接静脉穿刺来抽取连续血液。在给药之前(3个基线样品)约30、20与10分钟以及大致在给药之后的下列时间获得用于测定血清IFN浓度的静脉血样(5mL)：30分钟以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60与72小时。将各血清样品分成两个等分试样。将所有血清样品储存于-20℃下。在干冰上托运血清样品。在第1天的初始剂量之前即刻、第4天的早晨、第16天给药之前即刻以及第19天的早晨执行空腹临床实验测试(血液学、血清化学以及尿分析)。

生物分析方法将ELISA试剂盒程序(BioSource International(Camarillo，CA))用于测定血清IFN浓度。

数据分析自给药后各值中的每一者减去通过计算给药之前30、20与10分钟时收集的三个样品的IFN含量的平均值所测定的平均基线IFN浓度，从而关于给药前基线IFN浓度来校正给药后血清浓度值。如果给药前血清IFN浓度低于检定的定量含量，那么其并不包括于平均值的计算中。根据关于基线IFN浓度校正的血清浓度数据来测定药物动力学参数。使用最新版本的BIOAVL软件，在Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统上通过模型独立方法来计算药物动力学参数。测定下列药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；达到峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形法则所计算的自时间零至最终采血时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及由计算机根据消除率常数所计算的末期消除半衰期(t_1/2)。通过对数线性浓度-时间曲线的末期线性区域中的连续数据点的线性回归来估算消除率常数。计算各治疗组的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)以及变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存的调配物/未保存的调配物)。

药物动力学结果在所测量的各时间点，将所有18个受检者在接收单一剂量的市售hIFN(例如Roferon A

或Intron A)之后的平均血清IFN浓度-时间曲线(并未关于基线IFN含量进行校正)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN相比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的给药前基线IFN浓度。根据关于给药前平均基线IFN浓度所校正的血清数据来测定药物动力学参数且测定C_max与t_max。hIFN(例如Roferon

)的平均t_max显著小于包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的t_max。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的末期半衰期相比，hIFN(例如Intron A

)的末期半衰期值显著较小。

尽管本研究是在健康男性受检者中进行，但预期类似的吸收特征以及安全性曲线也应存在于其他患者群体中；例如患癌或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、自体贮血方案中的患者或安排进行择期手术的患者。

总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN将是安全的且健康男性受检者可以很好的承受。基于不利事件的对照发生率、临床实验值、生命指征以及身体检查结果，hIFN(例如Roferon A

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性曲线将是均等的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN潜在地为患者以及卫生保健提供者提供巨大的临床效用。

实例36

本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入hG-CSF中的优选位点的多组潜在标准之一。

本实例证实如何选择hG-CSF多肽中的优选位点以引入非天然编码氨基酸。由受体(hG-CSFbp)细胞外域的两个分子复合的hG-CSF的两个分子组成的晶体结构1CD9是用来确定其中可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。其他hG-CSF结构(包括但不限于1PGR、1RHG以及1GNC)是用来检查晶体结构数据集之间的一级、二级或三级结构单元的潜在变化。这些结构的坐标可得自蛋白数据银行(PDB)(Berstein等人，J.Mol Biol 1997，112，第535页)或可经由The Research Collaborator for Structural Bioinformatics PDB得自万维网rcsb.org。结构模型1CD9含有hG-CSF的完整成熟19kDa序列，但N末端残基1-4与残基129-136除外。存在由C37与C43以及C65与C75形成的两个二硫桥。

用于这个实例中的序列编号是根据SEQ ID NO：29中所示的成熟hG-CSF的氨基酸序列。

下列标准是用于评估用于引入非天然编码氨基酸的hG-CSF的各位置：残基(a)不应干扰基于1CD9以及1RHG(与hG-CSFbp接合的hG-CSF的结晶结构)的结构分析的任一hG-CSFbp的结合；(b)不应受丙氨酸扫描突变诱发影响(Reidhaar-Olson JF等人，Biochemistry(1996)Jul 16；35(28)：9034-41；Young DC等人，Protein Sci.(1997)Jun；6(6)：1228-36；Layton等人，(1997)JBC272(47)：29735-29741)；(c)应表面暴露且展示与周围残基的最小范德华或氢键相互作用；(d)在hG-CSF变异体中应缺失或可变化；(e)在经非天然编码氨基酸取代之后导致保守改变；以及(f)可见于高度挠性区域(包括但不限于CD环)或结构刚性区域(包括但不限于螺旋B)中。此外，对hG-CSF分子执行其他计算，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)来估算各蛋白原子的突出程度。结果，在一些实施例中，在(不限于)hG-CSF的下列位置中的一个或一个以上位置处取代一个或一个以上非天然编码氨基酸(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)。

在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170、171(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在下列位置中的一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然产生氨基酸：59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167以及171(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，所述位置包括但不限于下列位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136，137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即羧基末端)(SEQ IDNO：29，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。

产生hG-CSF拮抗剂的某些位点包括：6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145或其任何组合(如同在SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35或36中的对应氨基酸)。利用促效剂设计的标准(c)-(e)来选择这些位点。所述拮抗剂设计可包括受体结合区域的定点修饰以增加与hG-CSFbp的结合亲和力。

实例37

本实例详述大肠杆菌中的经修饰hG-CSF多肽的克隆与表达。

本实例证实如何可使包括非天然编码氨基酸的hG-CSF多肽于大肠杆菌中表达。举例而言，宿主细胞(例如大肠杆菌)中的hG-CSF的分离与G-CSF的产生描述于美国专利第4,810,643、4,999,291、5,580,755以及6,716,606号中，所述专利以引用的方式并入本文中。编码全长hG-CSF、hG-CSF的成熟形式(甲硫氨酰基hG-CSF)以及hG-CSF的成熟形式的变异体的cDNA分别示于SEQ IDNO：31、32与33中。在不改变氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的情形下优化克隆和表达序列之后，将编码全长与成熟hG-CSF的cDNA插入pBAD HISc、pET20b以及pET19b表达载体中。

使用包含正交tRNA(O-tRNA)与正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hG-CSF，如实例2中关于hGH表达所述。

实例38

聚乙二醇化hG-CSF的体外及体内活性

将PEG-hG-CSF、未修饰hG-CSF与缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果显示本发明的聚乙二醇化hG-CSF与未修饰hG-CSF相比具有优良活性与延长的半衰期，如每只小鼠使用相同剂量所产生的嗜中性白细胞的量的增加与白细胞数最大值的偏移所示。

³H-胸腺嘧啶核苷检定使用标准方法来执行³H-胸腺嘧啶核苷检定。骨髓获自处死的雌性Balb C小鼠。使骨髓细胞短暂悬浮、离心且再悬浮于生长培养基中。将含有大约10,000个细胞的160μl等分试样放置于96孔微量滴定盘的每个孔中。将已纯化G-CSF类似物(如上所制备)的样品加入各孔中且培育68小时。将滴定的胸腺嘧啶核苷加入孔中且使其另外培育5小时。在5小时培育时间之后，收获细胞，过滤且充分漂洗。将过滤器加入含有闪烁流体的小瓶中。计数β发射(LKB Betaplate闪烁计数器)。以三重测定来分析标准物与类似物，且通过适当稀释再检定实质上落到标准曲线以上或以下的样品。将结果报导为三重测定类似物数据相对于未改变重组人类G-CSF标准结果的平均值。

人类骨髓细胞的增殖诱导是基于增加的³H-胸腺嘧啶核苷并入来进行检定。用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia)使来自健康供体的人类骨髓经历密度缩减且使低密度细胞悬浮于含有10％胎牛血清以及谷氨酰胺青霉素-链霉素的Iscove培养基(GIBCO)中。随后，在5％CO₂的空气中，在37℃下将2×10⁴个人类骨髓细胞与96孔平底培养盘中的对照培养物或实例37的源自重组大肠杆菌的hG-CSF材料一起培育，历时2天。双重检定样品且浓度在10,000倍的范围内改变。然后，用0.5μCi/孔的³H-胸腺嘧啶核苷(New England Nuclear，Boston，Mass.)使培养物产生脉动，历时4小时。如Venuta等人，Blood，61，781(1983)所述来测量³H-胸腺嘧啶核苷摄取。在这个检定中，人类G-CSF分离物可诱导人类骨髓细胞中的³H-胸腺嘧啶核苷并入，其含量约为对照上清液的含量的4-10倍高。本发明的源自大肠杆菌的hG-CSF材料具有类似特性。

WEHI-3B D⁺分化诱导如Metcalf，Int.J.Cancer，25，225(1980)所述，在半固体琼脂培养基中检定本发明的hG-CSF多肽诱导鼠类骨髓性白血病细胞系WEHI-3B D⁺的分化的能力。在5％CO₂的空气中，在37℃下将重组hG-CSF产品和培养基对照与约60个WEHI-3B D⁺细胞/孔一起培育，历时7天。在24孔平底培养盘中培育样品且浓度在2000倍的范围内改变。菌落分为未分化、部分分化或完全分化菌落且用显微镜对菌落细胞数计数。发现源自大肠杆菌的hG-CSF材料能诱导分化。

CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM检定发现人类G-CSF和hG-CSF的天然分离物能引起骨髓细胞增殖及分化。使用来自健康人类志愿者的低密度、非附着性骨髓细胞，在CFU-GM[Broxmeyer等人，Exp.Hematol.，5，87(1971)]、BFU-E和CFU-GEMM检定[Lu等人，Blood，61，250(1983)]中测量这些活性。使用500单位的G-CSF或hG-CSF来执行CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM生物活性的对照。

用低密度非附着性骨髓细胞来执行菌落检定。用Ficoll-Hypaque(密度1.077g/cm³；Pharmacia)使人类骨髓细胞经历密度缩减。然后，在37℃下使低密度细胞再悬浮于含有胎牛血清的Iscove修饰Dulbecco培养基中且为附着将其置于Falcon组织培养皿(No.3003，Becton Dickinson，Cockeysville，Md.)中，历时1.5小时。

培养基对照是由Iscove修饰Dulbecco培养基加10％FCS、0.2mM氯化血红素和1单位重组促红细胞生成素组成。为进行CFU-GM检定，将1×10⁵个目标细胞涂板于1ml包括经补充的McCoy’s 5A培养基及10％热灭活胎牛血清的0.3％琼脂培养基中。对培养物进行菌落计分(每个聚集体超过40个细胞)且在培养第7天评估形态学。如四重测定培养盘所测定，菌落数显示为平均值±SEM。

为进行BFU-E和CFU-GEMM检定，将细胞(1×10⁵)加入Iscove修饰Dulbecco培养基(Gibco)、0.8％甲基纤维素、30％胎牛血清、0.05nM 2-巯基乙醇、0.2mM氯化血红素和1单位重组促红细胞生成素的1ml混合物中。在5％CO₂和5％O₂的潮湿气氛中，培育各皿。使用来自Reming Bioinstruments(Syracuse，N.Y.)的氧还原器来获得低氧压。在培育14天后，对菌落计分。如根据双重测定培养盘所测定，将菌落数确定为平均值±SEM。

预期在CFU-GM检定中形成的菌落都为氯乙酸酯酶阳性和非特异性酯酶(α-萘基乙酸酯酶)阴性，与颗粒细胞类型的菌落一致。当在CFU-GM检定中通过连续稀释进行检定时，预期天然G-CSF和hG-CSF具有约1×10⁸U/mg纯蛋白的比活性。重要的是，应注意hG-CSF极纯且因为其是在大肠杆菌中产生而不含其他潜在哺乳动物生长因子。因此，在重组促红细胞生成素存在下加入hG-CSF时，其能够支持混合菌落形成(CFU-GEMM)以及BFU-E。

细胞结合检定测试鼠类WEHI-3BD⁺和人类周边血液骨髓白血病细胞制剂(ANLL)结合¹²⁵I-G-CSF的能力。用PBS/1％BSA将鼠类和新近获得的人类周边血液骨髓白血病细胞洗涤三次。在0℃下，在各种浓度(体积：10μl)的未标记G-CSF、hG-CSF或GM-CSF不存在或存在以及¹²⁵I-G-CSF(约100,000cpm或1ng)存在的情形下，在PBS/1％BSA(100μl)中双重复培育WEHI-3BD⁺细胞(5×10⁶)或新鲜白血病细胞(3×10⁶)，历时90分钟(总体积：120μl)。然后，使细胞在350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上再悬浮且分层，并离心(1000g；1分钟)。通过切断管末端来收集颗粒物且分别在γ计数器(Packard)中对颗粒物与上清液计数。

将特异性结合(cpm)确定为竞争试剂不存在的情形下的总结合(复本平均值)减去100倍过量的未标记G-CSF存在下的结合(cpm)(非特异性结合)。测量所用细胞类型中的每一者的非特异性结合。使用相同的¹²⁵I-G-CSF制剂，不在同一天进行实验且所述实验应展示内部一致性。¹²⁵I-G-CSF证实结合至WEHI-3B D⁺白血病细胞。所述结合以剂量依赖方式受到未标记天然G-CSF或hG-CSF的抑制，但并不受GM-CSF抑制。hG-CSF竞争结合天然¹²⁵I-G-CSF的能力类似于天然G-CSF，说明受体同等地识别两种形式。

G-CSF诱导获自白血病患者的光密度骨髓细胞的粒细胞性及单核细胞性分化在单独培养基中或在1×10⁵个hG-CSF单元存在下，培养患者细胞，历时4天。在单独培养基中培育的获自对照培养物的细胞为前髓细胞类型，而在hG-CSF存在下培养的细胞将显示骨髓类型的成熟细胞，包括后髓细胞、巨大杆状及分叶嗜中性白细胞以及单核细胞。用显微镜评估至少100个细胞的实际分化。hG-CSF处理的细胞是由母细胞、髓细胞、后髓细胞、带状加分叶嗜中性白细胞、前单核细胞和单核细胞组成。预期对照细胞为母细胞。

测量接合和未接合hG-CSF以及其变异体的体内半衰期使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周大)。在投与当天，测量每只动物的重量。在静脉内，将每kg体重100μg未接合和接合hG-CSF样品各自注射到三只大鼠的尾部静脉中。在注射后1分钟、30分钟、1、2、4、6以及24小时，在CO₂麻醉作用下自每只大鼠中抽出500μl血液。将血样在室温下储存1.5小时，然后通过离心进行血清分离(4℃，18000xg，5分钟)。将血清样品储存于-80℃下，直到分析当天。在冰上解冻样品之后，通过G-CSF体外活性检定来量化血清样品中的活性G-CSF的量。

测量健康大鼠中接合和未接合hG-CSF以及其变异体的体内生物活性使用SPF Sprague Dawley大鼠的体内hG-CSF生物效应测量来评估接合和未接合G-CSF以及其变异体的生物功效。在开始研究当天，将大鼠随机分成6个组。使动物休息7天时期，其中排斥健康状况不良或具有极端重量的个体。在休息期开始时，大鼠的重量范围为250-270g。

在投与当天，使大鼠禁食16小时，然后每kg体重皮下注射100μghG-CSF或其变异体。将各hG-CSF样品注射到一组内的6只随机抽取大鼠中。在给药前及给药后6、12、24、36、48、72、96、120和144小时，自大鼠的尾部静脉中抽取300μg用EDTA稳定的血液的血样。分析血样的下列血液学参数：血红蛋白、红细胞数、血球比率、平均细胞体积、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、白细胞数、分化白细胞数(嗜中性白细胞、淋巴细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、单核细胞)。基于这些测量，评估接合和非接合hG-CSF以及其变异体的生物功效。

测量具有化学疗法诱导型中性白细胞减少的大鼠中接合与非接合hG-CSF 以及其变异体的体内生物活性将SPF Sprague Dawley大鼠用于这个分析。在开始研究当天，将大鼠随机分成6个组。使动物休息7天时期，其中排斥健康状况不良或具有极端重量的个体。在休息期开始时，大鼠的重量范围为250-270g。

在投与hG-CSF样品之前24小时，在腹膜内对大鼠注射每kg体重50mg环磷酰胺(CPA)以诱导中性白细胞减少，其可模拟由抗癌化学疗法引起的中性白细胞减少。在第0天，皮下注射每kg体重100μg hG-CSF或其变异体。将各hG-CSF样品注射到一组内的6只随机抽取大鼠中。在给药前与给药后6、12、24、36、48、72、96、120、144和168小时，自大鼠的尾部静脉中抽取300μg用EDTA稳定的血液的血样。分析血样的下列血液学参数：血红蛋白、红细胞数、血球比率、平均细胞体积、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、白细胞数、分化白细胞数(嗜中性白细胞、淋巴细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、单核细胞)。基于这些测量，评估接合与非接合hG-CSF以及其变异体的生物功效。

实例39

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的安全性和/或功效的人类临床试验

目标在于对比经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hG-CSF与市售hG-CSF产品NEULASTA

或NEUPOGEN

的安全性和药物动力学。

患者 18个年龄为20-40岁且体重为60-90kg的健康志愿者参加本研究。所述受检者将不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选以及乙型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有下列情形的任何征兆：高血压；任何原发性血液学疾病病史；严重肝、肾、心血管、肠胃、泌尿生殖、代谢、神经疾病病史；贫血或癫痫症病史；已知对细菌性或哺乳动物来源产品、PEG或人类血清白蛋白过敏；惯常且大量饮用含有咖啡因的饮料的消费者；参与任何其他临床试验或在研究登记的30天内输血或献血；在研究登记的3个月内已暴露于hG-CSF；在研究登记的7天内患病；以及在研究登记的14天内，在研究前身体检查或临床实验评估中存在显著异常。可评估所有受检者的安全性且按期收集用于药物动力学分析的所有血液收集物。所有研究都在机构伦理委员会的批准以及患者的同意下执行。

研究设计本设计将是健康男性志愿者的阶段I、单一中心、开放标记、随机化、二阶段交叉研究。将18个受检者随机指定为两个治疗序列组中的一组(9个受检者/组)。在大腿上段使用相同剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF和所选市售产品进行快速皮下注射，经过两个独立给药期来投与G-CSF。包装标签指示市售产品的投与剂量和频率。可通过包括额外受检者组而将使用市售产品进行的额外给药、给药频率或其他所要参数加入研究中。以14天清除期隔开每个给药期。对于两个给药期中的每一者而言，在给药前至少12小时以及给药后72小时(但不在给药期之间)将受检者限制于研究中心。如果存在额外给药、频率或其他参数，那么可加入额外受检者组，以同样对其进行聚乙二醇化hG-CSF测试。经批准供人类使用的多种G-CSF调配物可用于这个研究中。商标为NEUPOGEN的非格司亭和/或商标为NEULASTA的聚乙二醇化非格司亭为经批准供人类使用的市售G-CSF产品。hG-CSF的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF。

采血在投与hG-CSF之前以及之后，通过直接静脉穿刺来抽取连续血液。在给药之前(3个基线样品)约30、20与10分钟以及大致在给药之后的下列时间获得用于测定血清G-CSF浓度的静脉血样(5mL)：30分钟以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60与72小时。将各血清样品分成两个等分试样。将所有血清样品储存于-20℃下。在干冰上托运血清样品。在第1天的初始剂量之前即刻、第4天的早晨、第16天给药之前即刻以及第19天的早晨执行空腹临床实验测试(血液学、血清化学以及尿分析)。

生物分析方法将ELISA试剂盒程序(BioSource International(Camarillo，CA))用于测定血清G-CSF浓度。

数据分析自给药后各值中的每一者减去通过计算给药之前30、20与10分钟时收集的三个样品的G-CSF含量的平均值所测定的平均基线G-CSF浓度，从而关于给药前基线G-CSF浓度来校正给药后血清浓度值。如果给药前血清G-CSF浓度低于检定的定量含量，那么其并不包括于平均值的计算中。根据关于基线G-CSF浓度校正的血清浓度数据来测定药物动力学参数。使用最新版本的BIOAVL软件，在Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统上通过模型独立方法来计算药物动力学参数。测定下列药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；达到峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形法则所计算的自时间零至最终采血时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及由计算机根据消除率常数所计算的末期消除半衰期(t_1/2)。通过对数线性浓度-时间曲线的末期线性区域中的连续数据点的线性回归来估算消除率常数。计算各治疗组的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)以及变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存的调配物/未保存的调配物)。

药物动力学结果在所测量的各时间点，将所有18个受检者在接收单一剂量的市售hG-CSF(NEUPOGEN

或NEULASTA)之后的平均血清G-CSF浓度-时间曲线(并未关于基线G-CSF含量进行校正)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF相比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的给药前基线G-CSF浓度。根据关于给药前平均基线G-CSF浓度所校正的血清数据来测定药物动力学参数，且测定C_max与t_max。hG-CSF(NEUPOGEN)的平均t_max显著小于包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的t_max。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的末期半衰期相比，hG-CSF(NEUPOGEN

)的末期半衰期值显著较小。

总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF将是安全的且健康男性受检者可以很好的承受。基于不利事件的对照发生率、临床实验值、生命指征以及身体检查结果，hG-CSF(NEUPOGEN

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的安全性曲线将是均等的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF潜在地为患者以及卫生保健提供者提供巨大的临床效用。

实例40

本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入hEPO中的优选位点的多组潜在标准之一。

本实例证实如何选择hEPO多肽中的优选位点以引入非天然编码氨基酸。使用由与受体(hEPObp)细胞外域的两个分子复合的hEPO(具有位点突变，包括24、38、83)组成的晶体结构1CN4来确定其中可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。其他hEPO结构(包括但不限于1EER(24、28、83、121、122处的突变)以及1BUY)是用来检测晶体结构数据集之间的一级、二级或三级结构单元的潜在变化。这些结构的坐标可得自蛋白数据银行(PDB)(Berstein等人，J.Mol Biol 1997，112，第535页)或可经由The ResearchCollaborator for Structural Bioinformatics PDB得自万维网rcsb.org。结构模型1CN4含有hEPO的完整成熟18kDa序例，但晶体中因无序而省略的残基124-130、N末端A1以及C末端T163、G164、D165以及R166残基除外。存在由C7与C161以及C29与C33形成的两个二硫桥。

用于这个实例中的序列编号是根据SEQ ID NO：38中所示的成熟hEPO(18kDa变异体)的氨基酸序列。

下列标准是用于评估用于引入非天然编码氨基酸的hEPO的各位置：残基(a)不应干扰基于1CN4、1EER以及1BUY(与hEPObp接合的hEPO的结晶结构)的结构分析的任一hEPObp的结合；(b)不应受丙氨酸扫描突变诱发影响(Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)；Wen，D.等人，JBC 269：22839-22846(1994)；以及Elliott，S.等人，Blood，89：493-502(1997))；(c)应表面暴露且展示与周围残基的最小范德华或氢键相互作用；(d)在hEPO变异体中应缺失或可变化(Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)；Wen，D.等人，JBC269：22839-22846(1994))；(e)在经非天然编码氨基酸取代之后导致保守改变；以及(f)可见于高度挠性区域(包括但不限于CD环)或结构刚性区域(包括但不限于螺旋B)中。此外，对hEPO分子执行其他计算，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)来估算各蛋白原子的突出程度。结果，在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入hEPO的下列位置中的一个或一个以上位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16.17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)或其组合(SEQ ID NO：38，或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。

用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括但不限于EPO中的1、2、4、9、17、20、21、24、25、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、79、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136、159、162、163、164、165以及166(SEQID NO：38，或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位置包括21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165以及166(SEQ ID NO：38，或SEQID NO：37或39中的对应氨基酸)。

在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，所述位置包括但不限于下列位置：位置1之前(即N末端)、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即羧基末端)(SEQ ID NO：38，或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。在一些实施例中，这些或其他位置处的非天然产生氨基酸连接于水溶性聚合物，所述位置包括但不限于位置21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127以及128或其组合(SEQ ID NO：38，或SEQ ID NO：37或39中的对应氨基酸)。

产生hEPO拮抗剂的某些位点包括：2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159或其任何组合(hEPO；SEQ ID NO：38，或SEQID NO：37或39中的对应氨基酸)。利用促效剂设计的标准(c)-(e)来选择这些位点。所述拮抗剂设计也可包括位点1残基的定点修饰以增加与hEPObp的结合亲和力。

实例41

本实例详述大肠杆菌中的经修饰hEPO多肽的克隆与表达。

本实例证实如何可使包括非天然编码氨基酸的hEPO多肽于大肠杆菌中表达。编码hEPO的核苷酸序列的产生通常如Matthews等人，(1996)PNAS93：9471-76所述。胎儿肝、成人肝、胎儿肾与成人肾cDNA文库是用作克隆编码全长与成熟hEPO的cDNA的模板，其中胎儿肝产生最佳结果。用于克隆全长与成熟hEPO的引物分别为：

5’cagttacatatgggagttcacgaatgtcctgcctgg3’SEQ ID NO：44；以及

5’cagttacatatgctccaccaagattaatctgtg3’SEQ ID NO：45。3’引物序列为5’ctgcaactcgagtcatctgtcccctgtcctgcag3’SEQ ID NO：46。用于克隆的反应条件为：94℃，两分钟；94℃，30秒，30个周期；50℃，1分钟；72℃，2分钟；以及72℃，7分钟；然后，4℃，终止反应。将3个分子分别鉴别为编码全长hEPO、缺乏N末端信号序列的hEPO的成熟形式以及hEPO成熟形式的变异体，其各自显示于SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41以及SEQ ID NO：42中。在不改变氨基酸序列(SEQ ID NO：43)的情形下优化克隆与表达序列之后，将编码全长与成熟hEPO的cDNA插入pBAD HISc以及pET20b表达载体中。

实例42

通过正常红细胞性小鼠检定所测定的聚乙二醇化hEPO的体外及体内活性

将PEG-hEPO、未修饰hEPO与缓冲溶液投与小鼠。结果显示本发明的聚乙二醇化hEPO与未修饰hEPO相比具有优良活性与延长的半衰期，如每只小鼠使用相同剂量所产生的网状细胞的量的增加与网状细胞数最大值的偏移所示。

正常红细胞性小鼠生物检定在所属领域内为人所知(Pharai.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))。用BSA-PBS稀释样品。向7-15周大的正常健康小鼠经皮下投与0.2ml的本发明的聚乙二醇化hEPO。在投与后72小时开始的4天时期内，通过尾部静脉穿刺来抽取血液且进行稀释，以致1μl血液存在于1ml 0.15μmol的吖啶橙染色溶液中。染色时间为3至10分钟。使用显微荧光测定法，通过分析红色荧光柱形图(所分析的每30,000个血细胞)在流动血细胞计数器中执行网状细胞计数。所评估的各组是由每天5只小鼠组成，且所述小鼠仅出血一次。

生物检定另外，使用hEPO受体结合检定以及其中通过Ba/F3-huhEPOR细胞增殖来测定生物活性的细胞增殖检定，在体外生物活性方面评估本发明的hEPO多肽。各检定的实验方案描述于Wrighton等人，(1997)NatureBiotechnology 15：1261-1265以及美国专利第5,773,569与5,830,851号中。根据本发明制备的hEPO多肽的EC₅₀值是产生50％的由重组促红细胞生成素获得的最大活性所需的化合物浓度。

实例43

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的安全性和/或功效的人类临床试验

目标在于对比经皮下投与的包含非天然编码氧基酸的聚乙二醇化重组人类hEPO与市售hEPO产品PROCRIT或ARANESP

的安全性和药物动力学。

患者 18个年龄为20-40岁且体重为60-90kg的健康志愿者参加本研究。所述受检者将不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选以及乙型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有下列情形的任何征兆：高血压；任何原发性血液学疾病病史；严重肝、肾、心血管、肠胃、泌尿生殖、代谢、神经疾病病史；贫血或癫痫症病史；已知对细菌性或哺乳动物来源产品、PEG或人类血清白蛋白过敏；惯常且大量饮用含有咖啡因的饮料的消费者；参与任何其他临床试验或在研究登记的30天内输血或献血；在研究登记的3个月内已暴露于hEPO；在研究登记的7天内患病；以及在研究登记的14天内，在研究前身体检查或临床实验评估中存在显著异常。可评估所有受检者的安全性且按期收集用于药物动力学分析的所有血液收集物。所有研究都在机构伦理委员会的批准以及患者的同意下执行。

研究设计本设计将是健康男性志愿者的阶段I、单一中心、开放标记、随机化、二阶段交叉研究。将18个受检者随机指定为两个治疗序列组中的一组(9个受检者/组)。在大腿上段使用相同剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO和所选市售产品进行快速皮下注射，经过两个独立给药期来投与EPO。包装标签指示市售产品的投与剂量和频率。可通过包括额外受检者组而将使用市售产品进行的额外给药、给药频率或其他所要参数加入研究中。以14天清除期隔开每个给药期。对于两个给药期中的每一者而言，在给药前至少12小时以及给药后72小时(但不在给药期之间)将受检者限制于研究中心。如果存在额外给药、频率或其他参数，那么可加入额外受检者组，以同样对其进行聚乙二醇化hEPO测试。经批准供人类使用的多种EPO调配物可用于这个研究中。商标为PROCRIT的阿法依泊汀和/或商标为ARANESP

的达贝泊汀(darbepoitein)为经批准供人类使用的市售EPO产品。hEPO的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO。

采血在投与EPO之前以及之后，通过直接静脉穿刺来抽取连续血液。在给药之前(3个基线样品)约30、20与10分钟以及大致在给药之后的下列时间获得用于测定血清促红细胞生成素浓度的静脉血样(5mL)：30分钟以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60与72小时。将各血清样品分成两个等分试样。将所有血清样品储存于-20℃下。在干冰上托运血清样品。在第1天的初始剂量之前即刻、第4天的早晨、第16天给药之前即刻以及第19天的早晨执行空腹临床实验测试(血液学、血清化学以及尿分析)。

生物分析方法将放射免疫检定(RIA)试剂盒程序(Diagnostic SystemsLaboratory[DSL]，Webster TX)用于测定血清促红细胞生成素浓度。市售RIA为双抗体竞争性方法，其使用抗人类尿促红细胞生成素的兔多克隆抗血清作为第一抗体且使用¹²⁵I标记的人类尿促红细胞生成素作为示踪剂。在标准物与品质控制样品中，由阿法依泊汀或达贝泊汀替代DSL试剂盒中提供的尿促红细胞生成素。检定中使用的标准浓度为7.8、15.6、31.3、50、62.5、100以及125mIU/mL。定义为提供可接受的精确度的最低标准的平均返回拟合值的灵敏性为8.6mIU/mL，且在整个品质控制稀释中将检定范围扩展至2,000mIU/mL。

数据分析自给药后各值中的每一者减去通过计算给药之前30、20与10分钟时收集的三个样品的促红细胞生成素含量的平均值所测定的平均基线促红细胞生成素浓度，从而关于给药前基线促红细胞生成素浓度来校正给药后血清浓度值。如果给药前血清促红细胞生成素浓度低于检定的定量含量，那么其并不包括于平均值的计算中。根据关于基线促红细胞生成素浓度校正的血清浓度数据来测定药物动力学参数。使用最新版本的BIOAVL软件，在DigitalEquipment Corporation VAX 8600计算机系统上通过模型独立方法来计算药物动力学参数。测定下列药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；达到峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形法则所计算的自时间零至最终采血时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及由计算机根据消除率常数所计算的末期消除半衰期(t_1/2)。通过对数线性浓度-时间曲线的末期线性区域中的连续数据点的线性回归来估算消除率常数。计算各治疗组的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)以及变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存的调配物/未保存的调配物)。

药物动力学结果在所测量的各时间点，将所有18个受检者在接收单一剂量的市售hEPO(PROCRIT

或ARANESP)之后的平均血清促红细胞生成素浓度-时间曲线(并未关于基线促红细胞生成素含量进行校正)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO相比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的给药前基线促红细胞生成素浓度。根据关于给药前平均基线促红细胞生成素浓度所校正的血清数据来测定药物动力学参数，且测定C_max与t_max。hEPO(PROCRIT)的平均t_max显著小于包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的tmax。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的末期半衰期相比，hEPO(PROCRIT

)的末期半衰期值显著较小。

总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO将是安全的且健康男性受检者可以很好的承受。基于不利事件的对照发生率、临床实验值、生命指征以及身体检查结果，hEPO(PROCRIT

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的安全性曲线将是均等的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO潜在地为患者以及卫生保健提供者提供巨大的临床效用。

应了解本文所述的实例和实施例只是为了达到说明性目的，且建议所属领域的技术人员根据其作出各种修改或变化且其将包括在本申请案的精神和范围以及附属权利要求书的范畴内。本文基于所有目的而引用的所有公开案、专利以及专利申请案都以全文引用的方式并入本文中。

表8：所引用的4螺旋束序列

SEQ ID序号	序列名称
		1	hGH的全长氨基酸序列
2	hGH的成熟氨基酸序列(同功异型物1)
		3	其中缺失hGH的残基32-46的20-kDa hGH变异体
21	全长hGH的核苷酸序列
		22	成熟hGH的核苷酸序列
23	hIFN的全长氨基酸序列
		24	hIFN的成熟氨基酸序列
25	复合hIFN的成熟氨基酸序列
		26	全长hIFN的核苷酸序列
27	成熟hIFN cDNA的核苷酸序列
		28	hG-CSF的全长氨基酸序列
29	具有N末端M并缺少V66、S67以及E68的hG-CSF剪接变异体的成熟氨基酸序列
		30	缺少全长蛋白的V66、S67以及E68的全长剪接变异体
31	全长hG-CSF的核苷酸序列
		32	成熟hG-CSF cDNA的核苷酸序列
33	缺少V66、S67以及E68的成熟hG-CSF cDNA剪接变异体的核苷酸序列
		34	缺少V66、S67以及E68的成熟形式剪接变异体的核苷酸序列，最适于在大肠杆菌中表达成熟hG-CSF cDNA
35	变异体157 L→M(在dbSNP：2227329中)
		36	变异体174 A→T(在dbSNP：2227330中)
37	hEPO的全长氨基酸序列
		38	hEPO的成熟氨基酸序列
39	hEPO的成熟氨基酸序列的SNP变异体(G113R)
		40	全长hEPO cDNA的核苷酸序列
41	成熟hEPO cDNA的核苷酸序列
		42	G113R hEPO cDNA的核苷酸序列
43	最适于在大肠杆菌中表达成熟hEPO cDNA
		44	用于克隆全长hEPO cDNA的5’引物
45	用于克隆成熟hEPO cDNA的5’引物
		46	用于克隆全长与成熟hEPO cDNA的3’引物