CN102232085A - 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途。

Description

修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
技术领域
本发明涉及经至少一个非天然编码的氨基酸修饰的猫、犬和马促红细胞生成素多肽。
背景技术
生长激素(GH)超基因家族(贝赞F.(Bazan，F.)，现代免疫学(Immunology Today)，11：350-354(1991)；莫特H.R.(Mott，H.R.)和坎贝尔I.D.(Campbell，I.D.)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology)5：114-121(1995)；西文诺曼O.(Silvennoinen，O.)和艾利J.N.(Ihle，J.N.)(1996)造血细胞因子受体的信号传导(SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS))代表了一组具有类似结构特征的蛋白质。尽管这一家族中仍有较多的成员有待鉴别，但一些家族成员包括下述各物：生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、血栓形成素(thrombopoietin，TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和心肌营养素-1(cardiotrophin-1，CT-1)(“GH超基因家族”)。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使得易于鉴别出基因家族的新成员。
GH超基因家族的一个成员是猫促红细胞生成素(feline erythropoietin，fEPO)。天然存在的促红细胞生成素(EPO)是在哺乳动物肾脏和肝中产生的分子量为34千道尔顿(kDa)的糖蛋白激素。EPO是红细胞生成过程中的关键组分，可诱导祖先红细胞增殖和分化。EPO的活性还与包括球蛋白和碳酸酐酶在内的多种红细胞特异性基因的活化相关。例如参见邦德伦特(Bondurant)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)5：675-683(1985)；考雷(Koury)等人，细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)126：259-265(1986)。
促红细胞生成素受体(EpoR)是造血/细胞因子/生长因子受体家族的成员，这一家族包括数种其它生长因子受体，例如白细胞介素(IL)-3、IL-4和IL-6受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体以及催乳激素和生长激素受体。参见贝赞(Bazan)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA)87：6934-6938(1990)。细胞因子受体家族的成员含有4个保守半胱氨酸残基和刚好位于跨膜区外部的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序。这些保守序列被认为涉及蛋白质-蛋白质相互作用。例如参见千叶(Chiba)等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochim.Biophys.Res.Comm)184：485-490(1992)。
美国专利第5,441,868号、第5,547,933号、第5,618,698号和第5,621,080号描述了编码人EPO的DNA序列，以及具有天然存在的EPO的部分或全部一级结构构象和生物特性的分离多肽。
EPO的生物作用是来源于其与特定细胞受体的相互作用。人们已经充分了解了EPO与其受体细胞外结构域(EPObp)之间的相互作用。高分辨率x射线晶体学数据显示，EPO具有两个受体结合位点，并依序使用分子上的不同位点结合两个受体分子。这两个受体结合位点称为位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基末端以及部分螺旋A和A-B环，而位点II涵盖螺旋A的氨基末端区和一部分螺旋C。EPO与其受体的结合是依序发生的，其中位点I首先结合。接着，位点II与第二个EPO受体接合，引起受体二聚化以及细胞内信号传导路径的活化，从而产生细胞对激素的反应。
重组人EPO可用作治疗剂，并且已经被批准用于治疗人类个体。EPO缺乏会引起贫血，例如，这已经通过外源投予激素成功地进行治疗。
贫血可大致分为两类：再生性和非再生性贫血。再生性贫血倾向于由失血引起，或是由免疫系统引起红细胞破坏所致。另一方面，非再生性贫血是骨髓没有或无法对贫血作出反应的病症。引起贫血的常见原因是慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)，而其它病例中大部分是由感染猫白血病毒(feline leukemia virus，FeLV)所引起。这两种病症是导致宠物猫死亡的1号(FeLV)和2号(CRF)原因。人们已经使用hEPO来治疗猫贫血。不幸的是，当使用hEPO治疗猫贫血时，会出现有关免疫原性的问题，而且用hEPO治疗的猫中约25％到33％出现红细胞再生障碍性贫血(red cell aplasia，RCA)。曾进行了多项研究，包括用重组hEPO治疗患有CRF的11只猫和6只狗的研究，尽管重组hEPO在某种程度上显示出增加红细胞(RBC)和网织红细胞计数的能力，但11只猫中有5只产生了抗r-hEPO抗体(LD考基尔(LD Cowgill)等人，美国兽医协会杂 志(J Am Vet Med Assoc.)1998年2月15日；212(4)：521-8)。利用26只测试猫个体进行了有关重组猫促红细胞生成素(rfEPO)的安全性和功效的研究，发现尽管RBC和网织红细胞计数也有所升高，但26只猫中有8只(即，超过30％)产生了抗r-fEPO抗体(JE雷多夫(JE Randolph)等人，美国兽医研究杂志(Am J Vet Res.)2004年10月；65(10)：1355-66)。在另一项研究中，对由10只猫构成的研究组投予含有猫促红细胞生成素cDNA的重组2型腺相关病毒(rAAV2)载体，发现在所有用载体处理的猫中都检测到了rAAV2抗体，1只猫患上纯红细胞再生障碍性贫血，而用较低量处理的猫未显示出作用(MC沃克(MC Walker)等人，美国兽医研究杂志(Am J Vet Res.)2005年3月；66(3)：450-6)。
共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为了使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高，以便赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团(例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分)与生物活性分子键联。蛋白质和其它分子通常具有少数反应性位点可供聚合物连接。通常，最适于经由聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加选择地将聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点连接，通常会使经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.克拉克(R.Clark)等人，(1996)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271：21969-21977。为了形成具有足够聚合物分子量以赋予目标分子所需优势的结合物，现有技术方法通常涉及将多个聚合物臂与分子随机连接，由此增加了母体分子生物活性降低乃至完全丧失的风险。
形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)是由各种α-氨基酸序列构成，这些序列的一般结构为H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)连接形成酰胺键，其可表示为--(NH--CHR--CO)n--，其中下标“n”可等于数百或数千。R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。
举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在--NH2部分。ε--NH2在碱性pH条件下自由反应。用PEG进行蛋白质衍生化领域中的很多技术都是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH2部分的PEG衍生物。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation)”，奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共有的局限性，即，无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基上。在赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这将会成为显著的局限性。
现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的难题在于，PEG衍生物可与除所需残基外的其它残基发生不必要的副反应。组氨酸含有结构以--N(H)--表示的反应性亚氨基部分，而许多与ε--NH2反应的衍生物也可与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离硫氢基，结构以-SH表示。在一些情况下，针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这样可产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均匀混合物，并且有破坏目标生物活性分子活性的风险。需要开发出这样的PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使一种或一种以上PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子选择性偶合。
除赖氨酸残基外，此项技术中还曾就开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂进行了大量尝试。美国专利第6,610,281号。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives forAdvanced PEGylation)”，奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第1-17页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其它技术，将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且由此得到的游离硫氢基部分可与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方式，其能使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即，不会与之发生不必要的副反应)。
从此项技术的抽样(sampling)中可以了解到，所开发的用于连接蛋白质侧链，尤其赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多此类衍生物都证实在合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，这些键将经历水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物可形成较为稳定的键，但会在形成键之前经历水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性，因此不太适于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为了克服用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质所带来的问题，人们开发出了更为稳定(例如，美国专利第6,602,498号)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281)的PEG衍生物。此项技术中无疑需要在生理环境中具化学惰性，而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。
近来，已经报导了蛋白质科学中的一种全新技术，这项技术有望克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限。具体点说，已将新的组分加入到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)(例如参见L.王(L.Wang)等人，(2001)，科学(Science)292：498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia，S.cerevisiae)(例如J.秦(J.Chin)等人，科学301：964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，使得所述机器能够在体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。已使用这一方法，对琥珀密码子TAG作出反应，以高保真度将大量具有新颖化学、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和性标记和光敏异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸。例如参见J.W.秦(J.W.Chin)等人，(2002)，美国化学协会杂志 (Journal of the American Chemical Society)124：9026-9027；J.W.秦和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，(2002)，化学与生物化学(ChemBioChem)11：1135-1137；J.W.秦等人，(2002)，美国国家科学院院刊(PNAS United States of America)99：11020-11024；和L.王(L.Wang)和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，(2002)，化学通讯(Chem.Comm.)，1-10。这些研究已证实，有可能选择性地以常规方式引入一些化学官能团，例如炔基和叠氮部分，这些官能团不存在于蛋白质中，对20种常见的基因编码氨基酸中所见的所有官能团具化学惰性，并能用于有效且选择性反应而形成稳定共价键。
将非基因编码氨基酸并入蛋白质的能力允许引入可向天然存在的官能团(例如赖氨酸的-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)提供有价值的替代选择的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的基因编码氨基酸中所见的官能团呈惰性，但能干净且有效地反应以形成稳定键。例如此项技术中已知，叠氮基和乙炔基在催化量铜存在下，可在水性条件中进行胡伊斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。例如参见托尼诺(Tornoe)等人，(2002)有机化学(Org.Chem.)67：3057-3064；和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)41：2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白质结构中，就能够并入对蛋白质中所见的胺、硫氢基、羧酸、羟基具化学惰性，但也可与乙炔部分平稳且有效地反应而形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基仍保留化学惰性，而且在其它蛋白质侧链存在时在生理条件下不发生反应。
本发明将特别针对与EPO的活性和制备有关的问题，并且还针对具有改进的生物或药理学特性(例如改进的治疗半衰期)的hEPO多肽的制备。
发明内容
本发明提供包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽。
在一些实施例中，fEPO多肽与第二fEPO连接。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是一种双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，所述第二多肽是fEPO多肽。
在一些实施例中，fEPO多肽包含至少两个氨基酸，连接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下一个或一个以上对应于二级结构的区域中的任一位置：1-7(N末端)、8-26(A螺旋)、27-54(A螺旋与B螺旋之间的区域)、55-83(B螺旋)、84-89(B螺旋与C螺旋之间的区域)、90-112(C螺旋)、113-137(C螺旋与D螺旋之间的区域)、138-161(D螺旋)、162-166(C末端)、39-41(β折叠1)、133-135(β折叠2)、47-52(微型B环)、114-121(微型C环)、34-38(A螺旋与反平行β1折叠之间的环)、51-57(B′螺旋的C末端、B′螺旋与B螺旋之间的环以及B螺旋的N末端)、82-92(B螺旋与C螺旋之间的区域)和120-133(C′螺旋与反平行β折叠2之间的区域)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165和166。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158，159、160、161、162、163、164、165和166。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者：1、2、3、4、5、6、17、21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165和166。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者：1、2、3、4、5、6、17、18、21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165和166。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸：21、24、27、28、30、31、34、36、37、38、40、55、68、72、76、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、136和162。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置：21、24、38、83、85、116和119。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸：18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸：53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸：18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置：53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸：123、124、125、126、127、128、129和130。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置：123、124、125、126、127、128、129和130。
在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽对促红细胞生成素受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加宿主细胞中产生的fEPO多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO：2中选自由以下(但不限于)各氨基酸组成的群组的氨基酸取代：N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126，及其组合。在一些实施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO：4中选自由以下(但不限于)各氨基酸组成的群组的氨基酸取代：N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126，及其组合。
在一些实施例中，可以用天然存在或非天然存在的氨基酸取代fEPO多肽中的氨基酸，只要至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行即可。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构：
Figure BPA00001374088100081
其中n为0到10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽，或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽，或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
Figure BPA00001374088100091
其中n为0到10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基，或不存在；X为O、N、S，或不存在；m为0到10；R2为H、氨基酸、多肽，或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽，或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
Figure BPA00001374088100092
其中n为0到10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S，或不存在；m为0到10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，所述多肽是促红细胞生成素激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，促红细胞生成素激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸存在于fEPO的位点2区域内(蛋白质中涵盖AC螺旋束正面的区域)。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸连接到水溶性聚合物的fEPO多肽通过防止fEPO拮抗剂结合于第二个fEPO受体分子，来防止fEPO受体二聚化。在一些实施例中，SEQID NO：2中的L108经除亮氨酸外的氨基酸取代。在一些实施例中，SEQ ID NO：2中的L108经精氨酸或赖氨酸取代。在一些实施例中，SEQ ID NO：2中的L108经非天然编码氨基酸取代。
本发明也提供分离的核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID NO：24、25、26或27杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子。
本发明也提供与水溶性多肽连接的fEPO多肽的制备方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离的fEPO多肽与水溶性聚合物接触，所述水溶性聚合物包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分。在一些实施例中，并入fEPO中的非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，而水溶性聚合物另外对20种常见氨基酸中任一者无反应性。
在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的fEPO多肽与包含氨氧基、羟胺基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的fEPO多肽。在一些实施例中，氨氧基、羟胺基、肼基、酰肼基或氨基脲基是经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含非天然编码氨基酸的多肽反应，来制备与水溶性聚合物连接的fEPO多肽，所述非天然编码氨基酸包含羟胺基、酰肼基或氨基脲基。
在一些实施例中，通过使包含含炔基氨基酸的fEPO多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应，来制备与水溶性聚合物连接的fEPO多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮基氨基酸的fEPO多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应，来制备与水溶性聚合物连接的fEPO多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量介于约1kDa与约100kDa之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量介于约1kDa与约50kDa之间。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分支聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分支聚合物中各个分支的分子量介于1kDa与100kDa之间，或介于1kDa与50kDa之间。
在一些实施例中，与fEPO连接的水溶性聚合物包含聚亚烷基二醇部分。在一些实施例中，并入fEPO中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、乙酰基、氨氧基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入fEPO中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、羟胺部分、酰肼部分或氨基脲部分。在一些实施例中，并入fEPO中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入fEPO中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明也提供包含fEPO多肽和医药学上可接受的载剂的组合物，所述fEPO多肽包含非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供包含编码fEPO多肽的多聚核苷酸的细胞，所述多聚核苷酸包含选择密码子。在一些实施例中，所述细胞包含正交RNA合成酶和/或正交tRNA，用于将非天然编码氨基酸取代入fEPO多肽。
本发明也提供包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的制备方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许表达fEPO多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码fEPO多肽的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基中纯化出fEPO多肽。
本发明也提供增加fEPO的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在的fEPO中的任一个或一个以上氨基酸，和/或将fEPO多肽与水溶性聚合物连接。
本发明也提供用有效量本发明的fEPO分子治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含对患者投予治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包含fEPO多肽和医药学上可接受的载剂，所述fEPO多肽包含非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明也提供包含SEQ ID NO：1、2、3或4中所示的序列的fEPO多肽，但至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置进行取代，所述位置包括(但不限于)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的1-6、21-40、68-89、116-136、162-166，或者SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的相应氨基酸位置。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和fEPO多肽，所述fEPO多肽包含SEQ ID NO：1、2、3或4中所示的序列，其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代。本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和fEPO多肽，所述fEPO多肽包含SEQ ID NO：2或4中所示的序列，其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物是经由糖部分与多肽连接。
附图说明
图1-人和猫促红细胞生成素的序列比对图。
图2-显示基因库(Genbank)中所保藏的两个序列(基因库寄存编号：U00685和基因库寄存编号：L10606)之间的差异和共有序列(consensus sequence)的图。
图3-显示带有高和低亲和力受体的4螺旋束蛋白促红细胞生成素(EPO)的一般结构的图。
图4-显示带有高和低亲和力受体的4螺旋束蛋白促红细胞生成素(EPO)的一般结构的备选图。
图5-显示一部分所选用于并入非天然编码氨基酸的位点的图。
图6-显示一部分所选用于并入非天然编码氨基酸的位点的俯视图。
图7-显示一部分所选用于并入非天然编码氨基酸的位点的侧视图，其中突出显示了靠近糖基化位点的那些位点。
图8-一部分所选用于并入非天然编码氨基酸的位点的图表，其中显示了SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4中天然存在的氨基酸和氨基酸位置以及这些位点的平均Cx。
图9-一部分所选用于并入非天然编码氨基酸的位点的图表，其中显示了SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4中天然存在的氨基酸和氨基酸位置以及这些位点的平均Cx。
图10a-在450nm下的光学密度与调配物缓冲液浓度的关系的曲线图。
图10b-在450nm下的光学密度与内毒素浓度的关系的曲线图。
图11-TF-1增殖分析的图。
图12-fEPO受体在结合配体后发生同型二聚体化的图。
图13-在450nm下的OD与fEPO浓度增加的关系的图，其显示出钟形剂量反应曲线。
图14-显示不同的TF-1细胞接种密度。本图表明，例如已知JAK-STAT信号转导路径，为了得到对fEPO反应的最佳活性，fEPO与fEPO受体之间的比率应为1∶2。
图15-确定细胞饥饿是否与细胞分化同步且产生较大的动态范围的实验结果的图，结果表明，这并非特别有益。
图16-用于TF-1分析的条件的图，其中接种密度为20,000，培育时间为72小时，fEPO起始浓度为500ng/ml且稀释倍数为2.5倍。
图17-测量分析稳固性的图表，提供了有关细胞传代次数、EC50、OD和动态范围的数据。
图18-利用野生型fEPO和调配物缓冲液进行的TF-1分析性能的图表和曲线图。
图19-比较人与猫的野生型EPO的分析性能的曲线图。
图20-测量的OD与不同浓度的经CHO调节和未调节的培养基的关系的曲线图，其中以野生型fEPO作为对照。
图21-比较递减浓度的野生型fEPO、CHO/PEI+1.25ng/mL fEPO及单独CHO/PEI和其测量的OD的曲线图。
图22-与野生型fEPO相比较，并有非天然氨基酸pAF的fEPO变异体的相对活性的图表和曲线图。
图23-在特定位点并有pAF的数种fEPO变异体和其各自的ED50ng/mL测量值的柱形图。
图24-比较在4度和零下80度下储存5周的E72fEPO变异体与野生型fEPO的曲线图及其OD。
图25-Lucy F载体的示意图，其中显示了tRNA、相关转录元件的基因和tRNA合成酶的位置。
图26-Irwin载体的示意图，其中显示了tRNA、相关转录元件的基因和tRNA合成酶的位置。
图27-针对猫促红细胞生成素的Lucy F中抑制表达构建体Nat L BB-Opti FEPO的示意图。
图28-针对猫促红细胞生成素的Irwin中抑制表达构建体Nat L BB-Opti FEPO的示意图。
图29-描绘编码具有轻链和重链基因的普通抗体的本发明抑制表达构建体的示意图。
图30-显示在pAF存在下利用ELISA测量的fEPO变异体的抑制水平的柱形图(OD-50)。
图31-显示利用SDS-PAGE进行的聚乙二醇化fEPO迁移的比较。泳道1-3：20kDaPEG与fEPO R53pAF变异体的反应物。泳道1：R53、8μg fEPO装载量，无PEG。泳道2：R53聚乙二醇化，2μg fEPO装载量。泳道3：R53聚乙二醇化，8μg fEPO装载量。泳道4-6：30kDa PEG与fEPO P129pAF变异体的反应物。泳道4：P129、8μg fEPO装载量，无PEG。泳道5：P129聚乙二醇化，2μg fEPO装载量。泳道6：P129聚乙二醇化，8μg fEPO装载量。泳道7-9：40kDa PEG与fEPO Y49pAF变异体的反应物。泳道7：Y49、8μg fEPO装载量，无PEG。泳道9：Y49聚乙二醇化，8μg fEPO装载量。泳道9：Y49聚乙二醇化，2μg fEPO装载量。在38kDa处的水平箭头指示未聚乙二醇化的fEPO迁移的位置。加框的长方形指示聚乙二醇化fEPO迁移的区域。
图32-显示fEPO D55和P129pAF变异体的聚乙二醇化反应(30kDa)的SDS-PAGE凝胶，其中显示了这两种聚乙二醇化变异体。泳道1：D55，无PEG。泳道2：D55聚乙二醇化。泳道3：野生型fEPO，未培育。泳道4：P129、8μg fEPO装载量，无PEG。泳道5：P129聚乙二醇化，2μg fEPO装载量。泳道6：P129聚乙二醇化，8μg fEPO装载量。在38kDa处的水平箭头指示未聚乙二醇化的fEPO迁移的位置。加框的长方形指示聚乙二醇化fEPO迁移的区域。
图33-显示fEPO A1 pAF变异体的成功聚乙二醇化反应(30kDa)的SDS-PAGE凝胶。泳道1显示野生型fEPO、8μg装载量，未培育；且泳道2：显示聚乙二醇化A1。
图34-cEPO(SEQ ID NO：31)与fEPO(SEQ ID NO：4)氨基酸序列的比较，这两者之间显示出94％同源性。
图35-eEPO(SEQ ID NO：33)与fEPO(SEQ ID NO：4)氨基酸序列的比较，这两者之间显示出94％同源性。
图36-显示由实例32中进行的实验得到的各种治疗对血细胞比容(hematocrit)和红细胞(RBC)的影响的曲线图。
具体实施方式
定义
应了解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，因此其可变化。还应了解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。
除非本文中另作清楚指示，否则如本文和随附权利要求中使用的单数形式“一”和“所述”包括多个参考物。因此，例如，提到一“fEPO”是指提到一个或一个以上所述蛋白质，并且包括所属领域技术人员已知的其等效物等。
除非另作定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可使用与本文中所述相似或相同的任何方法、装置和材料来实施或测试本发明，但现仅描述优选方法、装置和材料。
本文中提到的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中，旨在描述和揭示例如这些公开案中所述的可能与本发明结合使用的构建体和方法。本文所讨论的公开案仅提供本申请案申请日期之前的揭示内容。本文在任何方面都不应解释为承认本发明者无权由于现有发明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。
术语“实质上纯化”是指fEPO实质上或基本上不含如在天然存在的环境(即，天然细胞，或在重组产生的fEPO的情况下是指宿主细胞)中所见的通常伴随所述蛋白质或与所述蛋白质相互作用的组分。实质上不含细胞材料的fEPO包括污染蛋白质小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的蛋白质制剂。当利用宿主细胞重组产生fEPO或其变异体时，所述蛋白质可以占细胞干重约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更低的量存在。当利用宿主细胞重组产生fEPO或其变异体时，所述蛋白质可以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低细胞干重存在于培养基中。因此，当借助于例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳等适当方法测定时，由本发明方法制得的“实质上纯的”fEPO可具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体地至少约75％、80％、85％的纯度水平，且更具体地至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更高的纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多聚核苷酸的细胞，而不管用于插入的方法如何，例如直接摄取、转导、f配对，或此项技术中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法。外源多聚核苷酸可以保持非整合载体(例如质粒)的形式，或者可被整合到宿主基因组中。
本文中使用的术语“培养基”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或含有任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌，以及细胞内容物。因此，这一术语可涵盖已经生长宿主细胞的培养基，例如已经分泌fEPO的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。这一术语还可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，例如fEPO是在细胞内产生并且宿主细胞溶解或破裂而释放fEPO的情形。
本文中使用的“IRES”或内部核糖体进入位点为所属领域技术人员所知。IRES是使内部核糖体进入/结合足以在针对不依赖于帽子的翻译(cap-independent translation)的分析(例如美国专利第6,715,821号中所述的双顺反子报告基因分析)中起始翻译的核酸分子(例如mRNA分子)区。mRNA分子内IRES的存在使得连接蛋白编码序列发生不依赖于帽子的翻译，否则其将不会进行翻译。IRES最初是在微RNA病毒(picornaviruse)中鉴别出来，并且被视为不依赖于帽子的翻译的范例。所有微RNA病毒的5′UTRS都很长，并且通过直接募集和结合核糖体来介导翻译的起始，由此阻遏最初的帽子结合步骤。
在病毒mRNAS中常常会发现IRES元件，但在非病毒mRNAs中则很少见到。截至目前，显示在相应5′UTRS中含有功能性IRES元件的非病毒mRNAS包括编码以下各物的mRNAS：免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)(马克捷克D.J.(Macejak，D.J.)等人，自然(Nature)353：90-94(1991))；果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)(奥尔S.K.(Oh，S.K.)等人，基因研究(Genes Dev.)6：1643-53(1992))；和Ultrabithoran(叶X.(Ye，X.)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)17：1714-21(1997))；纤维母细胞生长因子2(维格纳(Vagner)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)15：35-47(1915))；起始因子(戈恩(Gan)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273：5006-12(1992))；癌基因蛋白质c-myc(纳姆布鲁(Nambru)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：32061-6(1995)；斯坦利M.(Stonely M.)癌基因(Oncogene)16：423-8(1998))；血管内皮生长因子(VEGF)(斯坦恩J.(Stein J.)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)18：3112-9(1998))。细胞IRES元件与IRES序列或相互之间没有明显的序列或结构相似性，因此可使用翻译分析加以鉴别。另一已知的IRES是美国专利第6,171,821号(以全文引用方式并入本文中)中所揭示的XIAP IRES。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“还原剂”定义为使硫氢基保持还原态并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。适当还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法中。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“氧化剂”定义为能够从所氧化的化合物中去除电子的任何化合物或材料。适当氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫苏糖醇、氧化的赤藓醇和氧。所属领域技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
本文中使用的“变性剂”定义为会使蛋白质可逆展开的任何化合物或材料。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。适当变性剂可为离液剂、清洁剂、水混溶性有机溶剂、磷脂或者两种或两种以上所述试剂的组合。适当离液剂包括(但不限于)脲、胍和硫代氰酸钠。有用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂，例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如，Tween或Triton清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和的非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷)；温和的阳离子型清洁剂，例如N-＞2，3-(二油酰基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和的离子型清洁剂(例如，胆酸钠或去氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，包括(但不限于)硫代甜菜碱(sulfobetaine)(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。水混溶性有机溶剂，例如乙腈、低碳数烷醇(尤其C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)或低碳数烷二醇(尤其C2-C4烷二醇，例如乙二醇)，可用作变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在的磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成磷脂衍生物或变异体，例如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱。
本文中使用的“再折叠”是针对二硫键，其描述了将含有二硫键的多肽从未适当折叠或展开的状态转变成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
本文中使用的“共折叠”特指使用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，这些多肽彼此相互作用，并且使展开或不恰当折叠的多肽转变成天然的、适当折叠的多肽。
本文中使用的“促红细胞生成素”或“EPO”应包括具有猫促红细胞生成素(fEPO)的至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，以及促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素同工型(例如美国专利第5,856,298号中所述者，该专利以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素模拟物(例如美国专利第6,310,078号中所述者，该专利以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素片段、杂交促红细胞生成素蛋白、融合蛋白低聚物和多聚物、同系物、糖基化模式变异体和突变蛋白(mutein)，不管其生物活性如何，而且也不管其合成或制造方法如何，所述方法包括(但不限于)重组(由cDNA或是基因组DNA产生)、合成法、转基因法和基因活化的方法。促红细胞生成素的具体实例包括(但不限于)依泊汀α(epoetin alfa)(例如美国专利第4,667,016号；第4,703,008号；第5,441,868号；第5,547,933号；第5,618,698号；第5,621,080号；第5,756,349号；和第5,955,422号中所述者，这些专利都以引用的方式并入本文中)、达贝泊汀α(darbepoetin alfa)(例如欧洲专利申请案EP640619中所述)、DYNEPOTM(依泊汀δ)、人促红细胞生成素类似物(例如国际专利申请案WO9966054以及美国专利第6,548,653号和第5,888,772号中所述的人血清白蛋白融合蛋白，这些专利都以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素突变体(例如国际专利申请案WO9938890，以及美国专利第6,489,293号；第5,888,772号；第5,614,184号；和第5,457,089号中所述者，这些专利都以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素ω(可由美国专利第5,688,679号；第6,099,830号；第6,316,254号；和第6,682,910号中所述的人促红细胞生成素基因的ApaI限制性片段产生，所述专利都以引用的方式并入本文中)、改变的糖基化人促红细胞生成素(例如国际专利申请案WO9911781和EP1064951中所述者)和结合PEG的促红细胞生成素类似物(例如WO9805363以及美国专利第5,643,575号；第6,583,272号；第6,340,742号；和第6,586,398号中所述者，这些专利都以引用的方式并入本文中)。经修饰以用于表达内源人促红细胞生成素的细胞系的具体实例描述于国际专利申请案WO9905268和WO9412650，以及美国专利第6,376,218号中，这些专利都以引用的方式并入本文中。
术语“猫促红细胞生成素(fEPO)”或“fEPO多肽”是指如上文所述的促红细胞生成素或EPO，以及保留天然存在的fEPO的至少一种生物活性的多肽。fEPO多肽包括天然存在的猫促红细胞生成素的医药学上可接受的盐和前药，和所述盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的人促红细胞生成素的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体，及其多肽融合物。fEPO多肽和模拟物的实例包括美国专利第6,310,078号；第5,106,954号；第6,703,480号；第6,642,353号；第5,986,047号；和第5,712,370号中所述者，这些专利都以引用的方式并入本文中。术语“fEPO多肽”内也涵盖在氨基末端、羧基末端或二者处包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基促红细胞生成素，其中甲硫氨酸与fEPO的N末端连接；用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)聚组氨酸或亲和表位)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。天然存在的fEPO核酸和氨基酸序列已为人们所知。有关完整的天然存在fEPO氨基酸序列以及成熟的天然存在hEPO氨基酸序列，分别参见本文中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。有关完整的共有fEPO氨基酸序列以及成熟的共有fEPO氨基酸序列，分别参见本文中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4实质上一致。人们也已知编码fEPO突变体和突变fEPO多肽的核酸分子。fEPO突变体的实例包括美国专利第6,489,293号；第6,153,407号；第6,048,971号；第5,614,184号；和第5,457,089中所述者，这些专利都以引用的方式并入本文中。
促红细胞生成素或fEPO具有多种生物活性，包括(但不限于)结合于其受体，使其受体二聚化；刺激红细胞产生；和刺激细胞增殖。促红细胞生成素和hEPO的生物活性的部分实例描述于以下专利中：美国专利第6,676,947号；第6,579,525号；第6,531,121号；第6,521,245号；第6,489,293号；第6,368,854号；第6,316,254号；第6,268,336号；第6,239,109号；第6,165,283号；第5,986,047号；第5,830,851号；和第5,773,569号，这些专利都以引用的方式并入本文中。
fEPO的生物活性片段/变异体包括含有192个氨基酸的基因产物，在这些氨基酸中，前26个氨基酸在分泌期间裂解，且后4个氨基酸中的一个或一个以上氨基酸在形成成熟形式的促红细胞生成素期间去除(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。术语“fEPO多肽”也包括糖基化形式，其中N连接的糖基化位点在24、38和83位，而O连接的糖基化位点在126位(竹内(Takeuchi)等人(1988)JBC 263：3657-3663；佐佐木(Saski)等人(1988)生物化学(Biochemistry)27；8618-8626)。含有单核苷酸变化(即，S104N和L105F、P122Q、E13Q、Q58→QQ、G113R)的变异体也被视为hEPO的生物活性变异体(杰克布斯(Jacobs)等人，(1985)自然(Nature)313：806-810；船越(Funakoshi)等人，(1993)生物化学与生物物理学研究协会(Biochem.Biophys.Res.Comm.)195：717-722)。术语“fEPO多肽”也包括通过化学方式连接或表达为融合蛋白的fEPO异型二聚体、同型二聚体，fEPO的异型多聚体或同型多聚体，或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、配体或任何类型的其它活性分子(赛特考斯基(Sytkowski)等人，(1998)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95(3)：1184-8；和赛特考斯基等人(1999)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274(35)：24773-8；以及美国专利第6,187,564号、第6,703,480号、第5,767,078号，都以引用的方式并入本文中)，以及含有特定缺失但仍保留生物活性的多肽类似物(波塞尔(Boissel)等人，(1993)JBC 268：15983-15993；文(Wen)等人，(1994)JBC 269：22839-22846；比托夫(Bittorf)等人，(1993)FEBS 336：133-136；和美国专利第6,153,407号，以引用的方式并入本文中)。
除非另作说明(即，当声明比较是基于SEQ ID NO：3时)，否则本文中所述fEPO中提到的所有氨基酸位置都是基于SEQ ID NO：2中的位置。所属领域技术人员应理解，对应于SEQ ID NO：2中各位置的氨基酸位置可容易地在fEPO融合体、变异体、片段等中鉴别出来。举例来说，可使用例如BLAST等序列比对程序来比对和鉴别一种蛋白质中与SEQ ID NO：2中的位置对应的特定位置。本文中参照SEQ ID NO：2描述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算指在本文中所述或此项技术中已知的fEPO融合体、变异体、片段等中相应位置的取代、缺失或添加，且这些都明确地涵盖在本发明内。
术语“fEPO多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的fEPO多肽。所描述的在天然存在的fEPO中多个氨基酸位置的例示性取代包括(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等的取代，且这些都涵盖在术语“fEPO多肽”中。
猫EPO拮抗剂包括(但不限于)在低亲和力受体结合位点(位点2)中所发现的V11、R14、Y15、D96、K97、S100、R103、S104、T107、L108和R110(包括(但不限于)V11S、R14Q、Y15I、S100E、R103A、S104I和L108K，参见埃罗特(Elliot)等人，1993)处具有取代的拮抗剂。在一些实施例中，fEPO拮抗剂在10-15或100-108区域内包含至少一个取代，其使得fEPO充当拮抗剂。例如参见埃罗特(Elliot)等人，1993，和查斯曼(Cheetham)等人，1998。在一些实施例中，fEPO拮抗剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸，其存在于hEPO分子的位点2结合区内。在一些实施例中，fEPO多肽甚至通过含有以下取代来进行进一步修饰：V11S、R14Q、Y15I、S100E、R103A、S104I和L108K。
在一些实施例中，fEPO多肽进一步包含调节fEPO生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可调节对fEPO受体的亲和力、调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节多肽稳定性、调节剂量、调节释放或生物利用率、便利纯化，或者改良或改变特定投药途径。类似地，fEPO多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合结构域(包括(但不限于)FLAG或聚组氨酸)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、聚组氨酸、GST等)或改良对于多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特质的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语“fEPO多肽”还涵盖fEPO同型二聚体、异型二聚体、同型多聚体和异型多聚体，其经由非天然编码氨基酸侧链直接连接于相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、连接于天然编码氨基酸侧链，或经由连接子间接连接。例示性连接子包括(但不限于)水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)或葡聚糖；或者多肽。
“非天然编码氨基酸”是指不属于20种常见氨基酸中的一者或者不为吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。术语“非天然编码氨基酸”包括(但不限于)通过修饰天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸，或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然产生，但本身未借助翻译复合物并入到正生长的多肽链中的氨基酸。并非天然编码的天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修饰基团”是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白)，或者增加肽的血清半衰期的其它部分。
此项技术中和本文中使用的术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”是指分子中截然不同的、可定义的部分或单元。这些术语在某种程度上与在化学领域中的含义同义，且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。
本文中使用的术语“键”或“连接子”是指通常由化学反应形成的基团或键结，并且通常为共价键。水解稳定性键是指，这些键在水中实质上稳定，并且在有用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)可在一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解性键是指，这些键可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解性键是指，这些键可经一种或一种以上酶降解。此项技术中应了解，PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中包括可降解的键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键一般会在生理条件下水解，释放出所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸与醇的反应产物的原酸酯键；由(包括(但不限于))聚合物(例如PEG)末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；和由(包括(但不限于))聚合物末端的亚磷酰胺基(phosphoramidite group)与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
当用于本文中时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”是指可影响生物有机体(包括(但不限于)病毒、细菌、真菌、植物、动物和人类)的任何物理或化学特性的任何物质。具体说来，本文中使用的生物活性分子包括(但不限于)拟用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其它动物的疾病，或以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂等。
“双官能聚合物”是指包含两个个别官能团的聚合物，这两个官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应，形成共价或非共价键。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团以及可与第二生物组分上的基团反应的另一基团的双官能连接子，可用于形成一种结合物，这种结合物包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分。已知许多用于连接各种化合物与肽的程序和连接分子。例如参见欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，这些专利都以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上个别官能团的聚合物，这些官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应，形成共价或非共价键。
当用从左向右书写的常规化学式说明取代基时，这些取代基同样涵盖由从右向左书写结构所得到的化学上一致的取代基，例如，-CH2O-与-OCH2-相同。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”是得到稳定化合物的那些基团。适当的非干扰性取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O-(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2，其盐等。本文中使用的各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另作规定，否则单独或作为另一取代基的部分的术语“烷基”是指具有指定碳原子数(即，C1-C10是指1到10个碳)的直链或支链或者环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单或多不饱和的，并且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)例如以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和烷基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高级同系物和异构体。除非另作说明，否则术语“烷基”还打算包括下文更为详细地定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。局限于烃基的烷基称为“同系烷基(homoalkyl)”。
单独或作为另一取代基的部分的术语“亚烷基”是指衍生自烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且另外包括下文描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)会具有1到24个碳原子，而本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”是一般具有8个或更少碳原子的短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)是以其常规含义使用，并且指分别经由氧原子、氨基或硫原子与分子其余部分连接的那些烷基。
除非另作规定，否则单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”是指稳定的直链或支链或者环状烃基，或其组合，其是由规定数量的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选经氧化，且氮杂原子可任选经季铵化。杂原子O、N以及S和Si可位于杂烷基的任一内部位置或在烷基与分子其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基的部分的术语“亚杂烷基”是指衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。另外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团的化学式的书写方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另作规定，否则单独或与其它术语组合时术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和与不饱和的环键。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
本文中使用的术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与fEPO连接可产生的改变包括(但不限于)相对于未修饰的形式，血清半衰期增加或受调节，或者治疗半衰期增加或受调节；免疫原性受调节；物理缔合特征(例如聚集和多聚体形成)受调节；受体结合改变；和受体二聚化或多聚化改变。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性。适合的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、低聚糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
本文中使用的术语“聚烷二醇”是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性与分支聚合物，且平均分子量介于1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于例如商业供应商目录中，例如肖尔沃特公司(Shearwater)的目录“生物医学用聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications)”(2001)。
除非另作规定，否则术语“芳基”是指可为单环或是稠合在一起或共价连接的多个环(优选1到3个环)的多不饱和芳香烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选经氧化，且氮原子任选经季铵化。杂芳基可经由杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每一芳基和杂芳基环系统的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为简洁起见，术语“芳基”当与其它术语(包括(但不限于)芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”拟包括芳基与烷基连接的那些基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经被例如氧原子置换的那些烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述每一术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都打算包括所述基团的经取代和未取代形式。下文将提供各类基团的例示性取代基。
烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自包括(但不限于)以下各基团的多个基团中的一个或一个以上基团：-OR′、＝O、＝N R′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其数量在0到(2m′+1)的范围内，其中m′为所述基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各独立地指氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的芳基(包括(但不限于)1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。当本发明化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。当R′与R″连接到同一氮原子时，其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″拟包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”拟包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与针对烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基可不同，并且选自(但不限于)：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量在0到芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中R′、R″、R″′和R″″独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。
本文中使用的术语“经调节的血清半衰期”是指经修饰生物活性分子的循环半衰期相对于其未修饰形式的正或负改变。血清半衰期是通过在投予生物活性分子后的各个时间点时取得血样，并测定各样品中所述分子的浓度而测量得到。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期理想的是增加至少约两倍，但例如在其增加可获得令人满意的给药方案或避免有毒作用的情况下，较少的增加也是有用的。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
本文中使用的术语“经调节的治疗半衰期”是指治疗有效量的经修饰生物活性分子的半衰期相对于其未修饰形式的正或负改变。治疗半衰期是通过测量投药后各个时间点时的药物动力学和/或药效特性来测量。治疗半衰期增加理想的是得到特别有益的给药方案、特别有益的总剂量，或避免不合需要的作用。在一些实施例中，治疗半衰期增加是由效力增加、经修饰分子与其目标的结合增加或减少、或未修饰分子的另一参数或作用机制增加或减少所引起。
当用于核酸或蛋白质时，术语“经分离”表示，所述核酸或蛋白质实质上不含在天然状态中与其缔合的其它细胞组分。其可为均质态。经分离的物质可为干燥或半干燥状态；或呈溶液形式，包括(但不限于)水溶液。纯度和均质性通常是使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。蛋白质，作为一种在制剂中存在的主要物质，是实质上纯化的。具体说来，经分离基因与侧接所述基因且编码除相关基因外的蛋白质的开放式阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质上产生一条谱带。具体说来，这一术语是指，所述核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更高纯度。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，及其聚合物。除非特别限制，否则这一术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，这些核酸的结合特性与参考核酸类似，并且代谢方式也与天然存在的核苷酸类似。除非另作指示，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(贝赞(Batzer)等人，核酸研究(Nucleic Acid Res.)19：5081(1991)；大冢(Ohtsuka)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260：2605-2608(1985)；和卡索尔(Cassol)等人(1992)；罗斯里尼(Rossolini)等人，分子与细胞探针(Mol.Cell.Probes)8：91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。本文中使用的这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(即抗原)，其中氨基酸残基是借助于共价肽键连接。
抗体是对特定抗原展现结合特异性的蛋白质。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白，由两个一致轻链(L)和两个一致重链(H)构成。每一轻链经由一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同型的重链之间二硫键的数量不同。每一重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫桥。每一重链的一端具有一可变结构域(VH)，接着为多个恒定结构域。每一轻链的一端具有一可变结构域(VL)，另一端具有一恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。特定氨基酸残基被认为可形成轻链与重链可变结构域之间的界面。
术语“可变”是指可变结构域中某些部分的序列在抗体间差别极大，并且负责各特定抗体对其特定抗原的结合特异性的事实。然而，可变性并不是均匀分布于整个抗体可变结构域中。而是集中于轻链和重链可变结构域中三个称为互补决定区(CDR)的区段中。可变结构域中保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR区，主要采用β-折叠构型，经由三个或四个CDR连接，这些CDR形成连接β-折叠结构的环，而在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链中的CDR通过FR区而紧密地保持在一起，并与来自另一链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点(参见卡贝特(Kabat)等人，免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生部(Public Health Service，National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Md.)(1991))。
恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，而是展现各种效应功能。抗体或免疫球蛋白可视其重链恒定区的氨基酸序列而归为不同类别。免疫球蛋白存在5种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而这些类别中有数类可再分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。在各种人免疫球蛋白类别中，仅已知人IgG1、IgG2、IgG3和IgM可活化补体。
在体内，通过抗原选择主要由体细胞高诱变(somatic hypermutagenesis)所产生的亲和力较高的抗体变异体，来驱动抗体的亲和力成熟。在二级或三级反应的优势生殖系基因看起来不同于一级或二级反应的生殖系基因时，常常会发生“谱系移位(repertoireshift)”。
通过在体外将突变引入抗体基因中，并使用亲和力选择来分离具有改良亲和力的突变体，可以复制免疫系统的亲和力成熟过程。可以将这些突变抗体呈现于丝状噬菌体或如酵母等微生物的表面上，并且可根据对抗原的亲和力或与抗原的解离动力学(解离速率)来选择抗体。豪金斯(Hawkins)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，226：889-896(1992)。曾使用CDR步行诱变技术(CDR walking mutagenesis)来使结合1型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)的人包膜糖蛋白gp120的人类抗体(巴贝斯III(Barbas III)等人，PNAS(USA)91：3809-3813(1994)；和杨(Yang)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)254：392-403(1995))；和抗c-erbB-2单链Fv片段(斯奇尔(Schier)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)263：551567(1996))亲和力成熟。已使用抗体链改组和CDR诱变使针对HIV第三高变环的高亲和力人类抗体亲和力成熟(辛普森(Thompson)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)256：77-88(1996))。贝林特(Balint)和拉瑞克(Larrick)，基因(Gene)137：109-118(1993)描述了一种计算机辅助的寡脱氧核糖核苷酸定向扫描诱变方法，利用此方法，可针对改良变异体同时并彻底地搜索一可变区基因的所有CDR。使用初始的有限诱变策略，使全部6个CDR的每一位置突变，随后表达，并针对包括最高亲和力突变体的组合文库进行筛选，由此使αvβ3特异性人源化抗体亲和力成熟(吴(Wu)等人，PNAS(USA)95：6037-6-42(1998))。查斯维尔(Chiswell)和麦克卡福提(McCafferty)，生物技术趋势(TIBTECH)10：80-84(1992)；以及雷德尔(Rader)和巴贝斯III(Barbas III)现代生物技术观点(Current Opinionin Biotech.)8：503-508(1997)中概述了噬菌体呈现的抗体。在上述文献中报导的突变抗体相比亲本抗体具有改良亲和力的每一情况下，突变抗体的CDR中具有氨基酸取代。
本文中的“亲和力成熟”是指增强抗体对其抗原的亲和力的过程。使亲和力成熟的方法包括(但不限于)计算机筛选方法和实验方法。
本文中的“抗体”是指由一个或一个以上实质上由全部或一部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白基因包括(但不限于)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。本文中的抗体拟包括全长抗体和抗体片段，并且包括任何有机体中天然存在的或经过工程改造(例如变异体)的抗体。
“抗体片段”是指除全长形式外的任何抗体形式。本文中的抗体片段包括作为存在于全长抗体内的较小组分的抗体，以及经过工程改造的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区等(梅纳德(Maynard)和乔吉奥(Georgiou)，2000，生物医学工程评述(Annu.Rev.Biomed.Eng.)2：339-76；哈德森(Hudson)，1998，现代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol.)9：395-402)。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指基础化学结构与天然存在氨基酸相同的化合物，即，α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在氨基酸相同的基础化学结构。
本文中氨基酸可以利用普遍已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸也可以利用其普遍认可的单字母代码提及。
“保守修饰变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，“保守修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上一致的序列。由于遗传密码具有简并性，使得大量功能一致的核酸可编码任何指定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每一位置，所述密码子可变成任一所述的相应密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，是保守修饰变异的一种。本文中编码一种多肽的每一核酸序列也描述这一核酸的每一可能的沉默变异。所属领域技术人员将认识到，核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸唯一密码子的AUG，和通常为色氨酸唯一密码子的TGG除外)可经修饰而得到功能一致的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异暗含于每一所述序列中。
对于氨基酸序列，所属领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列个别取代、缺失或添加是“保守修饰变异体”，其中所述改变引起化学上类似的氨基酸对某一氨基酸的取代。此项技术中众所周知提供功能类似的氨基酸的保守取代表。这些保守修饰变异体除了是多形态变异体外且不排除多形态变异体，还是本发明的种间同系物和等位基因。
以下八个群组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，
(例如参见科雷敦(Creighton)，蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures andMolecular Properties)(WH弗雷曼出版社(W H Freeman & Co.)；第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性”百分比是指两个或两个以上序列或子序列相同。当使用以下序列比较算法中的一者或通过手工比对和目测来测量，在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内约60％一致、任选约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致)，那么所述序列“实质上一致”。此定义也指测试序列的互补性。一致性可存在于长至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或长75到100个氨基酸或核苷酸的区域，或者(未指定时)跨越整个多聚核苷酸或多肽序列。
为进行序列比较，通常一个序列充当参考序列，供测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定替代参数。随后序列比较算法基于这些程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
本文中使用的“比较窗”包括具有选自由20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150组成的群组的相邻位置数量中的任一者的区段，其中在最佳比对两个序列后，序列可与相邻位置数量相同的参考序列相比较。此项技术中众所周知供比较的序列比对方法。可利用(包括(但不限于))史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(1970)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2：482c的局部同源性算法；尼德尔曼(Needleman)和伍思奇(Wunsch)(1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443的同源性比对算法；皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)(1988)美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)85：2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575位理学博士，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))；或者手工比对和目测(例如参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(1995增补版))，来进行供比较的序列最佳比对。
适用于测定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于奥特查尔(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nuc.Acids Res.)25：3389-3402；和奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410中。进行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公共可用。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，和比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3且期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参见赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤器。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见卡尔琳(Karlin)和奥特查尔(Altschul)(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性度量为最小和概率(smallest sumprobability，P(N))，其可指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的概率。举例来说，如果在将测试核酸与参考核酸相比较时，最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01最优选小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列类似。
短语“与……选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中时，分子只与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”是指此项技术中已知的低离子强度和高温条件。通常，在严格条件下，探针将与其在复杂核酸混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中的目标子序列杂交，而不与这一复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件与序列相关，并且会随环境不同而不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于迪杰森(Tijssen)，生物化学和分子生物学技术--核酸探针杂交(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes)，“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid assays)”(1993)中。通常，在指定离子强度pH值下，选择的严格条件比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时有50％与目标互补的探针与目标序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当目标序列过量存在时，在Tm下，平衡时有50％探针被占据)。严格条件可为在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约60℃的条件。严格条件也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可为背景杂交的至少两倍，任选为背景杂交的10倍。例示性严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，且在65℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
本文中使用的术语“真核生物”是指属于真核系统发生域的有机体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫、原生生物等。
“真核细胞”包括例如哺乳动物细胞，例如CHO、骨髓瘤、BHK、免疫细胞、昆虫细胞、禽类细胞、两栖动物细胞(例如青蛙的卵母细胞)、真菌和酵母细胞。酵母包括例如酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyce)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、耶氏酵母(Yarrowia)、毕赤酵母(Pichia)等。特别优选用于表达的酵母包括甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)菌株，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、汉逊酵母(Hansenula)、炭角菌属(polymorpha)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermordii)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、inositovera毕赤酵母等。(例如参见美国专利第4,812,405号、第4,818,700号、第4,929,555号、第5,736,383号、第5,955,349号、第5,888,768号和第6,258,559号，各以引用的方式并入本文中用于所有目的)。这些和其它专利进一步描述了适用于便利在酵母中表达异源基因(例如本发明中的蛋白质基因)的启动子、终止子、增强子、信号序列以及其它调控序列。
本文中使用的术语“转化”应以广义使用，意思指将DNA引入受体宿主细胞以改变基因型并由此引起受体细胞的改变的任何方法。
本文中使用的术语“非真核生物”是指非真核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真细菌系统发生域，包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、极端嗜热细菌(Thermus thermophilics)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)等；或古菌系统发生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌属NRC-1(Halobacterium species NRC-1))、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈嗜热球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等。
本文中使用的术语“个体”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物，优选是哺乳动物，最优选是人。
详细说明
所属领域技术人员将能够开发和使用下文所提供的相同方法：猫促红细胞生成素的组合物及其相关方法、犬促红细胞生成素(cEPO)(SEQ ID NO：31成熟氨基酸序列、SEQ ID NO：30全长氨基酸序列)和马促红细胞生成素(eEPO)(SEQ ID NO：33成熟氨基酸序列、SEQ ID NO：32全长氨基酸序列)相关性组合物和方法、cEPO和eEPO多肽中并入非天然编码氨基酸的cEPO和eEPO相关性组合物和方法。这些多肽也可如本文中所揭示一般使用，以治疗有需要的猫或其它动物，或者其可用于治疗犬或马。图34和35提供了本文中较为详细地论述的cEPO和eEPO与fEPO(166个氨基酸)的166个氨基酸序列中每一者的比较，而且本发明还支持SEQ ID NO.31(cEPO)和SEQ ID NO.33(eEPO)中非天然编码氨基酸的取代、添加或缺失。
I.引言
本发明中提供包含至少一个非天然氨基酸的猫EPO分子。在本发明某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的EPO包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域一般技术人员一般已知适于特定反应性基团的化学方法，将包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)染料；聚合物，包括(但不限于)聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；亲和标记；生物素衍生物；树脂；第二蛋白质或多肽；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA)等)与包含第一反应性基团的至少一个非天然氨基酸连接。举例来说，第一反应性基团为炔部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中所述炔丙基有时也称为乙炔部分)，而第二反应性基团为叠氮部分，并利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔部分。在本发明经修饰fEPO的某些实施例中，使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中体内进行。
在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由一个宿主细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键将低聚糖与天冬酰胺连接在一起(包括(但不限于)低聚糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形)。在另一实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将低聚糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接在一起。在某些实施例中，本发明蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。
相关蛋白质或多肽可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或者10个或更多个非天然氨基酸。这些非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，天然存在的蛋白质型式中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员，尤其fEPO的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入例如fEPO等GH超基因家族成员中，可允许应用结合化学(conjugation chemistry)，其涉及(包括(但不限于))与一个或一个以上非天然编码氨基酸发生特定化学反应，而不与通常存在的20种氨基酸反应。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员(例如fEPO)经由非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种利用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及作为对选择密码子的反应，将非基因编码氨基酸(包括(但不限于)含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的那些氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)叠氮或乙炔部分)选择性并入蛋白质中，随后利用适当的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。并入后，接着就可通过利用所属领域一般技术人员已知适于天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法都适用于本发明中，用以将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)与(包括(但不限于))乙炔或叠氮衍生物分别发生胡伊斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应(例如参见帕德瓦A.(Padwa，A.)有机合成大全(Comprehensive Organic Synthesis)，第4卷.(1991)托斯特B.M.(Trost，B.M.)编，波格蒙出版社(Pergamon)，牛津(Oxford)，第1069-1109页；和胡伊斯根R.(Huisgen，R.)1，3-偶极环加成化学(1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry)，(1984)，帕德瓦A.(Padwa，A.)编，威立出版公司(Wiley)，纽约(New York)，第1-176页)。
由于胡伊斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，故可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可在室温下，于水性条件中，通过将催化量的亚铜盐添加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4＞1,5)进行。例如参见托尼诺(Tornoe)等人，(2002)有机化学(Org.Chem.)67：3057-3064；和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德国 应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)41：2596-2599；和WO 03/101972。可通过[3+2]环加成反应加到本发明蛋白质中的分子包括具有适当官能团或取代基(包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。这些分子可分别加到具有乙炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。
由胡伊斯根[3+2]环加成反应产生的5元环在还原环境中通常是不可逆的，并且可在水性环境中长时间对水解稳定。因此，可在苛求的水性条件下，用本发明的活性PEG衍生物改变多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是，由于叠氮和乙炔部分彼此具有特异性(并且例如不会与20种常见的基因编码氨基酸中的任一者反应)，故可在一个或一个以上特定位点中以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明还提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与作为对选择密码子的反应而选择性引入蛋白质中的叠氮部分偶合。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与作为对选择密码子的反应而选择性引入蛋白质中的乙炔部分偶合。
更具体点说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔，以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要保持叠氮基特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物(例如PEG)、蛋白质、药物、小分子、生物材料，或任何其它合乎需要的化合物或物质。本发明也包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可与生物活性分子在此蛋白质中含有带乙炔官能团的非基因编码氨基酸的位置处偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成产物。
此项技术中充分确定，可以使用PEG修饰生物材料的表面(例如参见美国专利第6,610,281号；米赫瓦R.(Mehvar，R.)，药学杂志(J.Pharmaceut.Sci.)，3(1)：125-136(2000)，以引用的方式并入本文中)。本发明还包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料，和通过胡伊斯根[3+2]环加成键与所述表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或含乙炔聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键以外的其它键(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)与叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶合，由此留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮基和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下，叠氮基可与聚合物的碳原子直接键接。或者，可将在一端具有叠氮部分的连接剂与常规活化聚合物连接，从而使所得聚合物在其一端具有叠氮部分，以此来制备含叠氮基的PEG衍生物。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可与聚合物碳原子直接键接。或者，可将一端具有乙炔部分的连接剂与常规活化聚合物连接，从而使所得聚合物在其一端具有乙炔部分，以此制备含乙炔的PEG衍生物。
更具体点说，在含叠氮基PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物进行反应，产生具有更强反应性部分(例如甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基、甲苯磺酸酯基或卤素离去基团)的经取代聚合物。所属领域技术人员众所周知含有磺酸卤化物、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和使用。随后，所得经取代聚合物可发生反应，以用聚合物末端的叠氮部分取代所述反应性更强的部分。或者，具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有叠氮基的连接剂发生反应，由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键，且所述叠氮部分位于聚合物的一端。所属领域技术人员众所周知亲核部分和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。
更具体点说，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物可发生反应，以代替含有乙炔部分的前体中的卤素或其它活化的离去基团。或者，具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有乙炔的连接剂发生反应，由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键，且所述乙炔部分位于聚合物的一端。卤素部分、活化的离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成中的使用以及PEG衍生物的制备和使用已经得到了此项技术从事人员的充分确认。
本发明也提供一种用于选择性修饰蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质中的方法，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物，例如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。可以使用含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物改变表面和分子的特性(其中生物相容性、稳定性、溶解性和免疫原性缺乏是重要的)，同时提供一种选择性高于此项技术中先前已知者的将PEG衍生物与蛋白质连接的方式。
II.生长激素超基因家族
以下蛋白质包括由生长激素(GH)超基因家族基因所编码的蛋白质(贝赞F.(Bazan，F.)，现代免疫学(Immunology Today)11：350-354(1991)；贝赞J.F.科学(Science)257：410-411(1992)；莫特H.R.(Mott，H.R.)和坎贝尔I.D.(Campbell，I.D.)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology)5：114-121(1995)；西文诺曼O.(Silvennoinen，O.)和艾利J.N.(Ihle，J.N.)，造血细胞因子受体的信号传导(SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS)(1996))：生长激素、泌乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15、抑瘤素M、纤毛神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和心营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。预期将来将通过基因克隆和测序来鉴别此基因家族的其它成员。尽管GH超基因家族成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使得易于鉴别出这一基因家族的新成员。已知GH超基因家族成员间的结构同源性程度，因此，可以使用本发明，将非天然编码氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。
已经借助于X射线衍射和NMR研究测定了多种细胞因子的结构，所述细胞因子包括G-CSF(希尔C.P.(Hill，C.P.)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5167(1993))、GM-CSF(戴德瑞奇斯K.(Diederichs，K.)等人，科学(Science)154：1779-1782(1991)；沃尔特(Walter)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：1075-1085(1992))、IL-2(贝赞J.F.(Bazan，J.F.)，科学257：410-411(1992)；马克雷D.B.(McKay，D.B.)，科学，257：412(1992))、IL-4(雷德菲尔德(Redfield)等人，生物化学(Biochemistry)30：11029-11035(1991)；鲍尔斯(Powers)等人，科学，256：1673-1677(1992))和IL-5(米尔伯恩(Milburn)等人，自然(Nature)363：172-176(1993))，并且这些结构尽管缺乏显著的一级序列同源性，但仍展示GH结构惊人的保守。根据建模和诱变研究，EPO被认为是这一家族的成员(波塞尔(Boissel)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：15983-15993(1993)；文(Wen)等人，生物化学杂志，269：22839-22846(1994))。大量其它细胞因子和生长因子，包括纤毛神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、抑瘤素M、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15以及α、β、ω、τ和γ干扰素，都属于此家族(如莫特(Mott)和坎贝尔(Campbell)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in StructuralBiology)5：114-121(1995)；西文诺曼(Silvennoinen)和艾利(Ihle)(1996)造血细胞因子受体的信号传导(SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS)中所评论)。现认为，上述所有细胞因子和生长因子构成一个大的基因家族。
除共有相似的二级和三级结构外，此家族的成员还共有一种特性，即其必须寡聚化细胞表面受体以活化细胞内信号传导路径。一些GH家族成员(包括(但不限于)GH和EPO)结合单一类型的受体，并且使其形成同型二聚体。其它家族成员(包括(但不限于)IL-2、IL-4和IL-6)结合一种以上类型的受体，并且使这些受体形成异型二聚体或更高级的聚集物(戴维斯(Davis)等人，(1993)科学(Science)260：1805-1808；鲍尼萨(Paonessa)等人，1995)欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)14：1942-1951；莫特(Mott)和坎贝尔(Campbell)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in StructuralBiology)5：114-121(1995))。诱变研究已显示，与GH一样，这些其它细胞因子和生长因子含有多个(通常两个)受体结合位点，并且依次结合其同源受体(莫特(Mott)和坎贝尔(Campbell)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology)5：114-121(1995)；马特鲁斯(Matthews)等人，(1996)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：9471-9476)。与GH一样，这些其它家族成员的主要受体结合位点主要出现在四个α螺旋和A-B环中。各家族成员之间在螺旋束中参与受体结合的具体氨基酸有所不同。与GH超基因家族成员相互作用的大部分细胞表面受体具有结构相关性，并且包含另一大的多基因家族。例如参见美国专利第6,608,183号。
从有关GH超基因家族各个成员的突变研究得到的一般结论为：连接α螺旋的环一般倾向于与受体结合无关。具体来说，在大部分(如果并非全部)家族成员中，短B-C环看似对于受体结合并不重要。出于此原因，在GH超基因家族成员中，B-C环可经如本文中所述的非天然编码氨基酸取代。A-B环、C-D环(和GH超家族的类干扰素/IL-10成员的D-E环)也可经非天然存在的氨基酸取代。最接近螺旋A并且远离最后一个螺旋的氨基酸也倾向于与受体结合无关，并且也可能是引入非天然存在的氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然编码氨基酸取代环区域内的任何位置，包括(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7个或更多氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代发生于A-B、B-C、C-D或D-E环的最后1、2、3、4、5、6、7个或更多个氨基酸内。
GH家族的某些成员，包括(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干扰素，都含有N连接和O连接糖。蛋白质中的糖基化位点几乎只出现在环区域中，而不出现在α螺旋束中。由于环区域一般与受体结合无关，并且由于其为糖基共价连接的位点，故其可以成为将非天然存在的氨基酸取代到蛋白质中的有用位点。由于蛋白质中包含N连接和O连接糖基化位点的氨基酸表面暴露，故这些氨基酸可为非天然存在的氨基酸取代的位点。因此，天然蛋白质可容许庞大糖基在这些位点连接到蛋白质，并且糖基化位点倾向于远离受体结合位点。
将来将有可能发现GH基因家族的其它成员。可以通过所预测蛋白质序列的计算机辅助二级和三级结构分析来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族成员通常具有四个或五个通过非螺旋氨基酸(环区域)相连接的两亲性螺旋。蛋白质可在其N末端含有疏水性信号序列，以促进从细胞中分泌。所述后来发现的GH超基因家族成员也包括在本发明内。
本申请案中提到fEPO多肽是打算使用fEPO作为GH超基因家族成员的一个实例。因此，应了解，本文中在提到fEPO时所描述的修饰和化学同样适用于GH超基因家族的任何其它成员，包括本文中特别列出者。
III.由单一表达构建体产生单一或多个相关基因产物且用于本发明中的表达系统
本文中描述由单一表达构建体或由多个表达构建体产生单一或多个相关基因产物的新颖表达系统。在一个实施例中，本发明包括一种真核抑制表达系统，其中由编码抑制所需所有元件的单一载体转录相关抑制性蛋白质基因，以使其包括人工氨基酸。具体点说，这一表达系统含有能够在真核宿主细胞中表达蛋白质以使所述蛋白质含有人工氨基酸的载体。所述表达系统含有能够在真核宿主细胞中表达蛋白质以使所述蛋白质含有非天然氨基酸的载体。所述表达系统含有能够在真核宿主细胞中表达蛋白质以使所述蛋白质含有非天然编码氨基酸(例如(但不限于)，对乙酰基苯丙氨酸(pAF))的载体。这些表达载体可包含以下可操作性连接的元件：单一或多个抑制tRNA序列拷贝，包括在真核细胞中可操作的启动子和转录终止子；连接到编码欲表达(抑制)的任何相关基因的DNA序列的启动子；和连接到哺乳动物功能性tRNA合成酶编码区的启动子。本发明一个实施例是含有抑制表达载体的哺乳动物细胞，以及在用所述抑制表达载体转染的哺乳动物中产生功能性抑制蛋白质的方法。
本发明也涉及在真核宿主细胞中经由表达系统在适宜的表达水平上功能性蛋白质的抑制表达。在一个实施例中，本发明涉及使用抑制表达系统，在真核细胞、优选哺乳动物细胞、真菌或酵母细胞，更优选(中国仓鼠卵巢)CHO细胞中功能性蛋白质的抑制表达。
更具体点说，本发明一个实施例涉及使用抑制表达系统，在真核细胞(例如哺乳动物细胞、真菌或酵母细胞)中功能性蛋白质的抑制表达，其中所有抑制元件都含在单一载体中。本发明一个实施例涉及使用抑制表达系统，在(中国仓鼠卵巢)CHO细胞(ATCC存储的细胞以及已知变异体，和所属领域技术人员已知可用于代替CHO细胞的细胞和/或细胞系)中功能性蛋白质的抑制表达，其中所有抑制元件都含在单一载体中。在本发明这一实施例的一方面中，哺乳动物细胞中功能性蛋白质的抑制表达包含使用一种抑制表达系统，其包含tRNA、tRNA合成酶和相关蛋白质的转录/翻译元件。
本发明另一实施例选择包括单一或多个在独立转录方向上有效调节细胞内表达水平的tRNA元件。在另一实施例中，本发明选择包括单一转录单元，其编码有待引入人工氨基酸的单一相关蛋白质。本发明另一实施例选择包括多个转录单元，其编码有待在一个或两个蛋白质中引入人工氨基酸的多个相关蛋白质或其中的亚基(例如抗体轻链和重链)。
本发明另一实施例是一种分泌抑制蛋白质的真核细胞系，例如CHO细胞系，其中所述蛋白质是经由本文中所述的抑制表达系统表达。在一些实施例中，真核细胞是CHO细胞或酵母细胞，例如毕赤酵母(Pichia)。本发明另一实施例是一种包含能够产生功能性抑制蛋白质的抑制表达系统的哺乳动物或酵母细胞培养物。含有本发明的抑制表达序列的载体可以引入所述哺乳动物或酵母细胞中。在细胞培养期间，可以将所需的外源DNA序列引入目标哺乳动物或酵母细胞中，以便随机或经由同源重组将外源DNA插入哺乳动物或酵母细胞的基因组中。视所用序列而定，可以从细胞培养物的生物质中或从细胞培养基中回收功能性抑制蛋白质。
本发明又一实施例是一种产生功能性抑制蛋白质的方法，其包含培养含有抑制表达系统的真核细胞，优选哺乳动物或酵母细胞，所述抑制表达系统表达抗体轻链和重链序列；并从细胞培养物中回收功能性抗体。可在分批补料式细胞培养中，在经过优化以获得最大商业产出的条件下，产生适于治疗应用的量的功能性抗体。举例来说，在连续控制葡萄糖含量的分批补料式培养中生长的CHO细胞可历经至少12天或更长时间产生重组蛋白质。例如参见美国专利第6,180,401号中有关通过分批补料式培养中生长的细胞产出重组蛋白质的论述。
根据本发明，可表达出多种不同类型的蛋白质。蛋白质的类型包括单一多肽，或多个组装的多肽，例如(但不限于)抗体。出于本发明的目的，可以使用多种抑制表达载体系统。举例来说，抑制表达载体可含有来源于细菌和动物病毒的DNA元件，所述细菌例如(但不限于)：大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)；所述动物病毒例如为牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。此外，还可通过引入一个或一个以上允许选择转染的宿主细胞的标记物，来选择染色体中整合入抑制表达构建体DNA的细胞。所述标记物可提供所属领域技术人员已知用于选择的任何方式，包括(但不限于)营养缺陷型宿主的原营养型、杀生物剂(例如抗生素)抗性或重金属(例如铜)抗性。选择性标记物可以与欲表达的DNA序列直接连接，或通过共转化引入同一细胞中。可用于优化mRNA的合成的其它元件可包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
更常见的是，一旦制备出了编码蛋白质亚基的载体或DNA序列，就可将表达载体引入适宜的宿主细胞中。也就是说，可以转化宿主细胞。将质粒引入宿主细胞中可以利用所属领域技术人员众所周知的各种技术实现。这些技术包括(但不限于)转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、利用包膜DNA进行细胞融合、显微注射、PEI和完整病毒感染。参见瑞吉维A.A.G.(Ridgway，A.A.G.)，“哺乳动物表达载体(Mammalian Expression Vectors)”第24.2章，第470-472页，维克特斯(Vectors)，罗德谷兹(Rodriguez)和丹哈特(Denhardt)编，(布特沃斯公司(Butterworths)，马萨诸塞州波士顿(Boston，Mass.)1988)。对于稳定整合的载体，最优选经由电穿孔将质粒引入宿主中。转化的细胞是在适于产生蛋白质的条件下生长，并针对蛋白质合成进行分析。用于鉴别和定量相关基因产物的例示性分析技术包括酶联免疫吸附剂分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassa，RIA)或荧光活化的细胞分选器分析(fluorescence-activated cell sorter analysis，FACS)、免疫组织化学等。
在本发明一个实施例中，用于表达蛋白质的宿主细胞系是哺乳动物来源的。所属领域技术人员可以容易地确定适于表达所需基因产物的宿主细胞或细胞系。例示性宿主细胞系包括(但不限于)DG44和DUXB11(DHFR缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系)、CHO-K1衍生物、CHO-S、HELA(人子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3×63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。特别优选CHO细胞。宿主细胞或细胞系通常是从商业供应商、美国组织培养物保藏中心(American Tissue CultureCollection)或从公开的文献中获得。
体外生产允许按比例扩大，从而使用抑制表达系统产生大量所需的多肽。在组织培养条件下培养真核细胞(例如哺乳动物和酵母细胞)的技术是此项技术中已知的，并且包括例如在气升式反应器或连续搅拌式反应器中均质悬浮培养；或例如在中空纤维、微囊体中，或在琼脂糖微珠或陶瓷管壳上固定或截留细胞培养物。对于分离和回收抗体，可以首先例如通过用硫酸铵沉淀、针对吸湿性材料(例如PEG)透析、经由选择性膜过滤等，来浓缩培养物上清液中的免疫球蛋白。必要时和/或需要时，通过常规色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、经由DEAE-纤维素进行的色谱法或(免疫)亲和色谱法，来纯化多价抗体的浓缩溶液。
在本发明一个实施例中，用于表达的真核细胞是哺乳动物或酵母细胞。在本发明另一实施例中，用于表达的真核细胞是CHO细胞。在本发明又一实施例中，用于表达的真核细胞是能够有效培养以产生大量蛋白质的其它细胞。如上文所述，用于并入本发明抑制表达系统中的蛋白质基因的获得或克隆方法是在所属领域一般技术人员的范围内。如所述，这些蛋白质基因可编码成熟基因、全长蛋白质，或者这些基因可例如经由嵌合作用(chimerization)、人源化、结构域缺失或位点特异性诱变进行修饰。由本发明系统产生的蛋白质包括全长蛋白质、成熟蛋白质、裂解的蛋白质、未裂解的蛋白质、本文中揭示的蛋白质、抗体、抗体片段(包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab′)2)、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区等。
在本发明一个实施例中，表达系统在真核细胞(非限制性实例：哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、成纤维细胞系和骨髓瘤细胞)中产生蛋白质。在一个实施例中，使用CHO细胞作为抑制表达系统的宿主，所述抑制表达系统包含顺反子，其包含以下序列：tRNA序列基因、在用于表达的特定真核细胞中起作用的真核启动子序列，例如CMV、SV40早期或肌动蛋白启动子序列，优选CMV；编码相关蛋白质的DNA序列，优选在其5′端，为真核分泌前导序列；和侧接的5′起始和3′终止密码子，以及在其3′末端的多聚腺苷酸序列。
一般说来，所用根据本发明抑制和表达的蛋白质可呈多种结合(即免疫结合物)或未结合形式中的任一种。具体点说，本发明蛋白质可与细胞毒素结合，例如放射性同位素、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素或前药。在特别优选的实施例中，根据本发明表达系统产生的蛋白质可例如通过结合于放射性同位素或生物活性肽来进行修饰。适用于本发明中的放射性同位素的实例包括90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re，使用多种众所周知的螯合剂或直接标记中的任一种。在一个实施例中，经结合和未结合的蛋白质可一起用于同一治疗方案中，例如用于当前批准的使用泽娃灵(Zevalin)的治疗方案中，以治疗某些非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma)。
在其它实施例中，本发明蛋白质可包括在组合物中，所述组合物包含与例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycine)和淋巴激活素(lymphokine)(例如干扰素)等药物、前药或生物反应调节剂偶合的经修饰蛋白质。本发明其它实施例包含使用结合于例如蓖麻毒素或白喉毒素等特定生物毒素的经修饰蛋白质。在其它实施例中，经修饰蛋白质可与其它免疫活性配体(例如抗体或其片段)形成复合物，其中所得分子结合于赘生性细胞和任选的效应细胞(例如T细胞)。在其它实施例中，经修饰蛋白质可与其它免疫活性配体(例如抗体或其片段)形成复合物，其中所得分子结合于赘生性细胞和效应细胞(例如T细胞)。所用经结合和/或未结合经修饰蛋白质的选择将视癌症的类型和阶段、辅助治疗(例如化疗或外照射)的使用和患者的状况而定。应了解，所属领域技术人员可根据本文中的教示容易地作出此类选择。
本发明将借助非限制实例2、3和4作进一步说明。
IV.用于本发明的一般重组核酸方法
在本发明多个实施例中，将使用重组方法来分离、克隆和通常改变编码相关fEPO的核酸。所述实施例用于(包括(但不限于))蛋白质表达或产生源于fEPO多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的过程中。在一些实施例中，编码本发明多肽的序列可操作性地连接到异源启动子。hEPO的分离描述于例如美国专利第5,441,868号、第5,547,933号、第5,618,698号、第5,621,080号和第6,544,748号中，且人体细胞中EPO的产生描述于例如WO 93/09222中，各说明书都以引用的方式并入本文中，并且这些教示可由所属领域技术人员用于分离和产生fEPO。
可根据母体多肽的氨基酸序列，包括(但不限于)具有SEQ ID NO：2(或SEQ ID NO：4，或者必要时，其它已知序列或SNPs)中所示的氨基酸序列，合成编码包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的核苷酸序列，随后改变所述核苷酸序列，由此引入(即，并入或取代)或去除(即，缺失或取代)相关氨基酸残基。宜根据常规方法，利用定点诱变来修饰核苷酸序列。或者，可利用化学合成来制备核苷酸序列，所述化学合成包括(但不限于)使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列来设计)且优选选择产生重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装数个编码所需多肽多个部分的小寡核苷酸。例如参见布兰妮(Barany)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)88：189-193(1991)；美国专利6,521,427，其都以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明的一般使用方法的基础教材包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)(第3版，2001)；克林格(Kriegler)，基因转移和表达实验手册(Gene Transferand Expression：A Laboratory Manual)(1990)；和现代分子生物学技术(Current Protocolsin Molecular Biology)(奥斯贝尔(Ausubel)等人编，1994)。
描述分子生物技术的一般教材包括伯格(Berger)和吉米尔(Kimmel)，分子克隆 技术指南，酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques.Methods in Enzymology) 第152卷，学术出版公司(Academic Press，Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA)(伯格)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning-A  Laboratory Manual)(第2版)第1-3卷，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)，1989(“萨姆布鲁克”)；和现代分子生 物学技术(Current Protocols in Molecular Biology.)，F.M.奥斯贝尔(F.M.Ausubel)等人编，现代技术(Current Protocols)，格里尼出版公司(Greene Publishing Associates，Inc)与约翰威立父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)的合资公司，(1999增刊)(“奥斯贝尔”)。这些教材描述了诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关的课题，这些相关课题涉及(包括(但不限于))包括用于产生包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对的基因的产生。
多类诱变方法可用于本发明中以实现多种目的，包括(但不限于)产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码相关蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用带缺口双链DNA的诱变等，或其任何组合。其它适合的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双链断裂修复等。本发明中还包括(包括(但不限于))涉及嵌合构建体的诱变。在一个实施例中，可利用有关天然存在分子或者改变或突变的天然存在分子的已知信息，包括(但不限于)序列、序列比较、物理特性、晶体结构等，来指导诱变。
本文中所见的教材和实例描述了这些程序。其它信息可见于文中所引用的以下公开案和参考文献：林(Ling)等人，DNA诱变方法综述(Approaches to DNA mutagenesis：anoverview)，分析生物化学(Anal Biochem.)254(2)：157-178(1997)；戴勒(Dale)等人，使用硫代磷酸酯法的寡核苷酸定向随机诱变法(Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method)，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)57：369-374(1996)；史密斯(Smith)，体外诱变(In vitro mutagenesis)，遗传学评述(Ann. Rev.Genet.)19：423-462(1985)；博思汀(Botstein)和肖特勒(Shortle)，体外诱变策略和应用(Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，科学(Science)229：1193-1201(1985)；卡特(Carter)，定点诱变(Site-directed mutagenesis)，生物化学杂志(Biochem. J.)237：1-7(1986)；库克尔(Kunkel)，寡核苷酸定向诱变效率(The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis)，核酸与分子生物学(Nucleic Acids & Molecular  Biology)(艾克斯廷F.(Eckstein，F.)和李磊D.M.J.(Lilley，D.M.J.)编，柏林施普林格出版社(Springer Verlag，Berlin))(1987)；库克尔，在无表型选择情况下快速而高效的定点诱变(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，美 国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：488-492(1985)；库克尔等人，在无表型选择情况下快速而高效的定点诱变，酶学方法(Methods in Enzymol.)154，367-382(1987)；贝斯(Bass)等人，具有新DNA结合特异性的突变Trp阻遏子(Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities)；科学(Science)242：240-245(1988)；酶 学方法(Methods in Enzymol.)100：468-500(1983)；酶学方法154：329-350(1987)；佐勒(Zoller)和史密斯(Smith)，使用M13源性载体的寡核苷酸定向诱变：一种在任何DNA片段中产生点突变的通用有效程序(Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of pointmutations in any DNA fragment)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，10：6487-6500(1982)；佐勒和史密斯，克隆到M13载体中的DNA片段的寡核苷酸定向诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors)，酶学方 法(Methods in Enzymol.)100：468-500(1983)；佐勒和史密斯，寡核苷酸定向诱变：一种使用两个寡核苷酸引物和单链DNA模板的简单方法(Oligonucleotide-directedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNAtemplate)，酶学方法154：329-350(1987)；泰勒(Taylor)等人，在限制性酶反应中使用硫代磷酸酯修饰的DNA来制备带切口DNA(The use of phosphorothioate-modified DNA inrestriction enzyme reactions to prepare nicked DNA)，核酸研究13：8749-8764(1985)；泰勒等入，使用硫代磷酸酯修饰的DNA以高频率快速产生寡核苷酸定向突变(The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA)，核酸研究13：8765-8787(1985)；纳卡玛(Nakamaye)和艾克斯廷(Eckstein)，硫代磷酸酯基团的限制性内切核酸酶Nci I裂解抑制以及其在寡核苷酸定向诱变中的应用(Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage byphosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸 研究14：9679-9698(1986)；塞尔斯(Sayers)等人，用于基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的Y-T外切核酸酶(Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸研究16：791-802(1988)；塞尔斯等人，含硫代磷酸酯的DNA通过在溴化乙锭存在下与限制性内切核酸酶反应来进行链特异性裂解(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restrictionendonucleases in the presence of ethidium bromide)，(1988)核酸研究16：803-814；克拉莫(Kramer)等人，用于构建寡核苷酸定向突变的带缺口双链DNA方法(The gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction)，核酸研究12：9441-9456(1984)；克拉莫和菲特兹(Fritz)，经由带缺口双链DNA的寡核苷酸定向突变构建(Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA)，酶学 方法154：350-367(1987)；克拉莫等人，在寡核苷酸定向突变构建的带缺口双链DNA方法中酶促体外反应的改进(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed construction of mutations)，核酸研究16：7207(1988)；菲特兹等人，寡核苷酸定向突变构建：无体外酶促反应的带缺口双链DNA程序(Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedurewithout enzymatic reactions in vitro)，核酸研究16：6987-6999(1988)；克拉莫等人，点错配修复(Point Mismatch Repair)，细胞(Cell)38：879-887(1984)；卡特(Carter)等入，使用M13载体改进寡核苷酸定点诱变(Improved oligonucleotide site-directedmutagenesis using M13 vectors)，核酸研究13：4431-4443(1985)；卡特，使用M13载体改进寡核苷酸定向诱变(Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors)，酶学方法154：382-403(1987)；艾格达乍德赫(Eghtedarzadeh)和汉尼科夫(Henikoff)，使用寡核苷酸产生大缺失(Use of oligonucleotides to generate largedeletions)，核酸研究14：5115(1986)；威尔斯(Wells)等人，形成氢键对于稳定枯草杆菌蛋白酶的过渡态的重要性(Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing thetransition state of suhtilisin)，英国皇家化学协会期刊(Phil.Trans.R.Soc.Lond.)A 317：415-423(1986)；纳姆拜耳(Nambiar)等人，编码核糖核酸酶S蛋白的基因的总合成和克隆(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein)，科学223：1299-1301(1984)；萨克玛(Sakmar)和克拉那(Khorana)，牛视杆外节鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导蛋白)α亚基的基因的总合成和表达(Total synthesis and expressionof a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein(transducin))，核酸研究14：6361-6372(1988)；威尔斯等人，盒式诱变：一种在指定位点产生多个突变的有效方法(Cassette mutagenesis：an efficient method forgeneration of multiple mutations at defined sites)，基因(Geme)34：315-323(1985)；格拉托姆
Figure BPA00001374088100461
等人，利用小规模“鸟枪”基因合成法进行寡核苷酸定向诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis)，核酸研究13：3305-3316(1985)；曼德克(Mandecki)，大肠杆菌质粒中寡核苷酸定向双链破裂修复“一种位点特异性诱变方法(Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis)，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad，Sci.USA)，83：7177-7181(1986)；阿诺德(Arnold)，针对不常见环境的蛋白质工程改造(Protein engineering for unusual environments)，现代生物技术观点 (Current Opinion in Biotechnology)4：450-455(1993)；塞尔波(Sieber)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，19：456-460(2001)；W.P，C.斯蒂姆(W.P，C.Stemmer)，自 然(Nature)370，389-91(1994)；和I.A.罗瑞莫(I.A.Lorimer)，I.帕斯坦(I.Pastan)，核 酸研究23，3067-8(1995)。关于上述众多方法的其它细节可见于酶学方法第154卷中，其中也描述了对于与各种诱变方法相关的故障检修问题的有效控制。
本发明还涉及经由正交tRNA/RS对在体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。利用本发明的多聚核苷酸或包括本发明多聚核苷酸的构建体，包括(但不限于)本发明的载体(其可为例如克隆载体或表达载体)，对宿主细胞进行基因工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)。载体可为例如质粒、细菌、病毒、裸多聚核苷酸或经结合多聚核苷酸的形式。可通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(弗洛姆(Fromm)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)82，5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道穿透(科莱恩(Klein)等人，自然(Nature)327，70-73(1987))。
可在经改变而适用于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养工程改造过的宿主细胞。这些细胞可任选培养入转基因生物体中。用于(包括(但不限于))细胞分离和培养(例如用于随后的核酸分离)的其它有用参考文献包括弗莱希利(Freshney)(1994)动物细胞培养基础技术手册(Culture of Animal Cells，a  Manual of Basic Technique)，第3版，纽约威立-利斯出版公司(Wiley-Liss，New York)，及其中所引用的参考文献；佩尼(Payne)等人(1992)在液体系统中的植物细胞和组织 培养(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)，约翰威立父子公司(John Wiley &Sons，Inc.)，纽约州纽约市(New York，NY)；盖姆伯格(Gamborg)和菲利普斯(Phillips)(编)(1995)植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell，Tissue and Organ Culture)；基本方法施普林格实验手册(Fundamental Methods Springer Lab Manual)，施普林格-维拉格(Springer-Verlag)(柏林，海德堡纽约(Berlin Heidelberg New York)，以及奥特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)微生物培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993)CRC出版社，佛罗里达州伯克莱屯(Boca Raton，FL)。
可使用将目标核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参见萨姆布鲁克(Sambrook))。另外，也可购买许多试剂盒来从细菌中纯化质粒(例如参见EasyPrepTM、FlexiPrepTM，都来自法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)；StrataCleanTM，来自赛特杰公司(Stratagene)；和QIAprepTM，来自凯杰公司(Qiagen))。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，来用于转染细胞，或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定目标核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)，以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参见盖里姆(Gillam)和史密斯(Smith)，基因(Gene)8：81(1979)；罗伯茨(Roberts)等人，自然(Nature.)328：731(1987)；斯奇尼德尔E.(Schneider，E.)等人，蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)6435：10(1995)；奥斯贝尔(Ausubel)，萨姆布鲁克(Sambrook)，伯格(Berger)(都同上文)。举例来说，ATCC(例如由ATCC出版的细菌和噬菌体的ATCC目录(The ATCC  Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)吉赫纳(Gherna)等人(编))提供了可用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学其它方面的其它基本程序以及基础理论讨论也见于沃特森(Watson)等人(1992)重组DNA(Recombinant DNA) 第2版，科学美国人(Scientific American Books)，纽约(NY)。另外，基本上任何核酸(和几乎任何带标记的核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源例如米德兰标准试剂公司(Midland Certified ReagentCompany)(德克萨斯州米德兰(Midland，TX)，mcrc.com)、美国基因公司(The GreatAmerican Gene Company)(加利福尼亚州雷蒙钠(Ramona，CA)，可见于万维网genco.com)、艾普斯基因公司(ExpressGen Inc.)(伊利诺伊州芝加哥(Chicago，IL)，可见于万维网expressgen.com)、欧普隆技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda，CA))和许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子可扩充蛋白质生物合成机器的遗传密码框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特的三碱基密码子、无义密码子(例如终止密码子，其包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域一般技术人员易于了解，可引入所需基因中的选择密码子的数目范围很广，包括(但不限于)在编码至少一部分fEPO的单一多聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子，在真核细胞中于体内并入非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，并通过带有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。天然存在的宿主氨酰基-tRNA合成酶不识别这一O-tRNA。可以使用常规定点诱变在相关多肽中的相关位点引入终止密码子，包括(但不限于)TAG。例如参见赛尔斯J.R.(Sayers，J.R.)等人，(1988)，用于基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5′，3′外切核酸酶(5′，3′Exonuclease inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.)核酸研究(Nucleic Acids  Res.)791-802。当在体内组合O-RS、O-tRNA和编码相关多肽的核酸时，对UAG密码子反应而并入非天然氨基酸，从而得到在特定位置含有所述非天然氨基酸的多肽。
可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下在体内并入非天然氨基酸。举例来说，由于对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制子tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合于终止密码子并启动核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可通过(包括(但不限于))增加O-tRNA和/或抑制子tRNA的表达水平来调节抑制效率。
选择密码子还包含延长的密码子，其包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，例如，四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的一个特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括(但不限于))一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在突变O-tRNA存在下，(包括(但不限于))具有反密码子环(例如，具有至少8-10个核苷酸的反密码子环)的特定移码抑制tRNA，四个或四个以上碱基的密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括(但不限于))至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。由于存在256个可能的四碱基密码子，故可在同一细胞中使用四个或四个以上碱基的密码子编码多个非天然氨基酸。参见安德森(Anderson)等人，(2002)探究密码子和反密码子尺寸的极限(Exploring the Limits ofCodon and Anticodon Size)，化学与生物学(Chemistry and Biology.)9：237-244；麦格赖瑞(Magliery)，(2001)扩充遗传密码：大肠杆菌中四碱基密码子的有效抑制剂的选择和利用文库方法鉴别“移码”四碱基密码子(Expanding the Genetic Code：Selection ofEfficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codonswith a Library Approach in Escherichia coli.)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)307：755-769。
举例来说，已使用四碱基密码子，使用体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见马(Ma)等人，(1993)生物化学(Biochemistry)，32：7939；和阳司(Hohsaka)等人，(1999)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)，121：34。曾使用CGGG和AGGU在体外利用两种以化学方式酰基化的移码抑制子tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)中。例如参见阳司(Hohsaka)等人，(1999)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)，121：12194。在体内研究中，莫尔(Moore)等人检查了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可以由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框内极少解码。参见莫尔(Moore)等人，(2000)分 子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，298：195。在一个实施例中，可将基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子用于本发明中，这样可减少错义通读(missense readthrough)和在其它不想要位点的移码抑制。
对于给定系统，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子任选包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充现有的遗传密码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数量从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定且具选择性的碱基配对、利用聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中，以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可经修改而适用于诸方法和诸组合物的非天然碱基对的描述包括例如海奥(Hirao)等人，(2002)用于将氨基酸类似物并入蛋白质中的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues intoprotein)，自然—生物技术(Nature Biotechnology)，20：177-182。其它相关出版物列于下文中。
对于体内使用，非天然核苷可透过膜，并且经磷酸化而形成相应的三磷酸酯。此外，增加的遗传信息也很稳定，不会被细胞酶破坏。本纳(Benner)和其它人先前的尝试利用了不同于标准沃特森-克里克(Watson-Crick)对的氢键模式，其中最值得关注的实例为iso-C:iso-G对。例如参见斯维泽(Switzer)等人，(1989)美国化学协会杂志(J.Am. Chem.Soc.)，111：8322；和皮克瑞利(Piccirilli)等人，(1990)自然(Nature)，343：33；库尔(Kool)，(2000)现代化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)，4：602。一般说来，这些碱基在某种程度上与天然碱基错配，并且无法酶促复制。库尔(Kool)和同事证实，碱基之间的疏水堆积相互作用可替代氢键来驱动碱基对的形成。参见库尔(Kool)，(2000)现代化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)，4：602；和库克安(Guckian)及库尔，(1998)德国应用化学杂志(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，36，2825。在致力于开发满足所有上述需求的非天然碱基对的过程中，查鲁兹(Schultz)、罗姆斯伯格(Romesberg)和同事已经系统地合成和研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对稳定，并且能够利用大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段(KF)有效地并入DNA中。例如参见麦克米恩(McMinn)等人，(1999)美国化学协会杂志(J. Am.Chem.Soc.)，121：11586；以及小川(Ogawa)等人，(2000)美国化学协会杂志，122：3274。3MN：3MN自身对可通过KF以足以获得生物功能的效率和选择性合成。例如参见小川等人，(2000)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，122：8803。然而，这两种碱基都充当进一步复制的链终止子。近来已开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，还可复制7AI自身对。例如参见泰厄(Tae)等人，(2001)美国化 学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，123：7439。也已开发出新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定对。参见麦格斯(Meggers)等人，(2000)美国化学协会杂志(J. Am.Chem.Soc.)，122：10714。由于延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，故本发明方法可利用这一特性产生其正交tRNA。
翻译旁路系统(translational bypassing system)也可用于在所需多肽中并入非天然氨基酸。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有的结构可充当诱导核糖体越过所述序列并继续在插入序列下游翻译的提示(cue)。
在某些实施例中，本发明方法和/或组合物中的相关蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或更多个选择密码子。
可使用所属领域技术人员众所周知且本文中在“诱变和其它分子生物学技术”下描述的方法，来诱变编码相关蛋白质或多肽的基因，以使其包括例如一个或一个以上选择密码子，用以并入非天然氨基酸。举例来说，诱变相关蛋白质的核酸，以使其包括一个或一个以上选择密码子，从而并入一个或一个以上非天然氨基酸。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变异体(包括(但不限于)突变体)形式。类似地，本发明还包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码相关蛋白质(例如fEPO)的核酸分子突变，以在多肽的任何所需位置引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入到相关蛋白质上。所属领域中众所周知适于将半胱氨酸并入fEPO多肽的所需位置中的方法，例如美国专利第6,608,183号(以引用的方式并入本文中)中所述的方法，以及标准诱变技术。
V.非天然编码氨基酸
很多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。许多非天然编码氨基酸都可引入fEPO中。一般说来，引入的非天然编码氨基酸对20种常见的基因编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与未见于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮、醛和氨氧基)有效且选择性反应形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，可以使包括含叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的fEPO多肽与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))或者含炔部分的第二多肽反应，形成稳定结合物，这一结合物是由叠氮基与炔官能团选择性反应而形成胡伊斯根[3+2]环加成产物得到。
α-氨基酸的一般结构如下所示：
Figure BPA00001374088100521
非天然编码氨基酸通常为具有上文所列式的任何结构，其中R基团是除20种天然氨基酸中所用外的任何取代基，并且都可适用于本发明中。由于本发明非天然编码氨基酸仅侧链结构不同于天然氨基酸，故非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键的方式与其在天然存在多肽中形成的方式相同。然而，非天然编码氨基酸的侧链基团使其与天然氨基酸相区别。举例来说，R任选包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酸基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等，或其任何组合。适用于本发明中的其它相关的非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽(photocaged)和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解氨基酸、侧链比天然氨基酸长的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5或大于约10个碳)、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。
适用于本发明中并且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、羟胺、酰肼、氨基脲、叠氮基和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-天冬酰胺和O-甘露糖氨基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在的N键或O键由自然界中不常见的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。所述氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文中提供的许多非天然编码氨基酸可从市场上购得，例如购自西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))、诺瓦生物科技公司(Novabiochem)(EMD生物科技公司(EMD Biosciences)的分公司，位于德国达姆施塔特(Darmstadt，Germany))或派普科技公司(Peptech)(美国马萨诸塞州伯灵顿(Burlington，MA，USA))。非市售的非天然氨基酸可任选根据本文中提供或使用所属领域技术人员已知的标准方法合成。有关有机合成技术，例如参见弗雷斯敦(Fessendon)和弗雷斯敦的有机化学(Organic Chemistry)，(1982，第2版，维拉德格兰特出版社(Willard Grant Press)，马萨诸塞州波士顿(Boston Mass.))；马奇(March)的高等有 机化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版，1985，威立父子出版公司(Wiley and Sons)，纽约(New York))；以及卡雷(Carey)和萨德伯格(Sundberg)的高等有机化学(第3版，第A和B部分，1990，派拉蒙出版社(Plenum Press)，纽约)。还参见美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，都以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸外，适用于本发明中的非天然氨基酸还任选包含经修饰的主链结构，包括(但不限于)如式II和III的结构所示：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；且R和R′任选相同或不同，通常选自与上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基相同的组分清单以及氢。举例来说，如式II和III所示，本发明的非天然氨基酸任选在氨基或羧基中包含取代。此类非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，其包括(但不限于)侧链与常见20种天然氨基酸对应或具有非天然侧链。此外，α-碳处的取代任选包括(但不限于)L、D或α-α双取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物，以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸都是基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等，并且都适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中这些经取代酪氨酸包含(包括(但不限于))酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。此外，也涵盖多取代的芳基环。适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中所述取代基包含(包括(但不限于))羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。适用于本发明中的非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、对炔丙氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙氧基-苯丙氨酸等。适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构实例提供于例如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivoincorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物，还参见柯克(Kiick)等人，(2002)利用施陶丁格尔接合将叠氮基并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligtation)，PNAS 99：19-24。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对-(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的fEPO的组合物。还提供包含对-(炔丙氧基)-苯丙氨酸和(包括(但不限于))蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一方面，包括对-(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键接(包括(但不限于)共价)，包括(但不限于)，经由氨酰基键与正交tRNA共价键接、与正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共价键接等。
可通过非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分将为蛋白质提供多种益处和操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许在体外和体内利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一种选择性修饰蛋白质。举例来说，重原子非天然氨基酸可用于定相(phasing)x射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性地引入重原子还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和叠氮芳基(包括(但不限于)叠氮苯基)侧链的氨基酸)允许在体内和体外有效地使蛋白质光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过提供光反应性基团的时间控制激发使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学探针(包括(但不限于)使用核磁共振和振动光谱)的同位素标记(包括(但不限于))甲基取代。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明中的许多非天然氨基酸可从市场上购得，例如购自西格玛公司(Sigma)(美国)或阿尔德里奇公司(Aldrich)(美国威斯康辛州密尔沃基(Milwaukee，WI，USA))。非市售的非天然氨基酸任选可根据本文中所提供或根据各种公开案中所提供或者使用所属领域技术人员已知的标准方法合成。有关有机合成技术，例如参见弗雷斯敦(Fessendon)和弗雷斯敦的有机化学(Organic Chemistry)，(1982，第2版，维拉德格兰特出版社(Willard Grant Press)，马萨诸塞州波士顿(Boston Mass.))；马奇(March)的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版，1985，威立父子出版公司(Wileyand Sons)，纽约(New York))；以及卡雷(Carey)和萨德伯格(Sundberg)的高等有 机化学(第3版，第A和B部分，1990，派拉蒙出版社(Plenum Press)，纽约)。描述非天然氨基酸合成的其它出版物例如包括：WO 2002/085923，标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids)”；马托索卡斯(Matsoukas)等人，(1995)药物化学杂志(J.Med.Chem.)，38，4660-4669；金F.E.(King，F.E.)和凯德D.A.A.(Kidd，D.A.A.)(1949)由邻苯二甲酰化中间物合成谷氨酰胺以及谷氨酸γ-二肽的新方法。(A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid fromPhthylated Intermediates.)化学协会杂志(J.Chem.Soc.)3315-3319；弗雷德曼O.M.(Friedman，O.M.)和查特瑞提R.(Chatterrji，R.)(1959)作为抗肿瘤剂的模型底物的谷氨酰胺衍生物的合成。(Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates forAnti-Tumor Agents.)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)81，3750-3752；克莱格J.C.(Craig，J.C.)等人(1988)7-氯-4[[4-(二乙氨基)-1-甲基丁基]氨基]喹啉(氯喹)的绝对构型。(Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).)有机化学杂志(J.Org. Chem.)53，1167-1170；阿佐雷M.(Azoulay，M.)，维尔蒙特M.(Vilmont，M.)和弗莱皮尔F.(Frappier，F.)(1991)作为潜在抗疟药的谷氨酰胺类似物(Glutamine analogues asPotential Antimalarials)，欧洲药物化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)26，201-5；库斯基宁A.M.P.(Koskinen，A.M.P.)和雷珀特H.(Rapoport，H.)(1989)作为构象受限氨基酸类似物的4-取代脯氨酸的合成。(Synthesis of 4-Substituted Prolines as ConformationallyConstrained Amino Acid Analogues.)有机化学杂志54，1859-1866；克雷斯廷B.D.(Christie，B.D.)和雷珀特H.，(1985)由L-天冬酰胺合成光学纯六氢吡啶的方法。(Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine).经由氨基酸脱羰基和亚胺离子环化全合成(+)阿扑长春胺的应用(Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine throughAmino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.)有机化学杂志1989：1859-1866；巴顿(Barton)等人，(1987)使用自由基化学合成新颖的α-氨基酸和衍生物：合成L-和D-α-氨基-己二酸、L-α-氨基庚二酸和适合的不饱和衍生物(Synthesis ofNovel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L- andD-alhpa-Amino-Adipic Acids，L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.)四面体通讯(Tetrahedron Lett.)43：4297-4308；和萨贝辛赫(Subasinghe)等人，(1992)使君子氨酸类似物：合成β-杂环2-氨基丙酸衍生物和其在新颖的使君子氨酸敏感性位点的活性(Quisqualic acid analogues：synthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site.)药物化学杂志35：4602-7。还参见2002年12月22日申请的标题为“蛋白质阵列(ProteinArrays)”的专利申请案，代理人案号P1001US00。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸能够进行多种反应，经由亲核加成或醛醇缩合反应等连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)。
例示性含羰基氨基酸可如下所示：
Figure BPA00001374088100571
其中n为0到10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于张Z.(Zhang，Z.)等人，生物化学(Biochemistry)42：6735-6746(2003)中，以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员可以用类似方式制备其它含羰基氨基酸。
在一些实施例中，对包含非天然编码氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生适用于结合反应(conjugationreaction)的醛官能团。例如，当生物活性分子为多肽时，可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(通常存在或者可经由化学或酶消化而暴露)，在温和氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参见盖特纳(Gaertner)等人，生物结合物化学(Bioconjug.Chem.)3：262-268(1992)；乔治格K.(Geoghegan，K.)和斯托赫J.(Stroh，J.)，生物结合物化学，3：138-146(1992)；盖特纳等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：7224-7230(1994)。然而，此项技术中已知的方法局限于肽或蛋白质N末端的氨基酸。
在本发明中，可将带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸以“经遮蔽”醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸在邻近ε胺处带有羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下加入摩尔数过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠添加到多肽缓冲溶液中，随后在暗处培育约10分钟。例如参见美国专利第6,423,685号。
在温和条件下，羰基官能团可与含肼、含酰肼、含羟胺或含氨基脲的试剂在水溶液中选择性反应，分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。例如参见杰克斯W.P.(Jencks，W.P.)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)81，475-481(1959)；邵J.(Shao，J.)和泰姆J.P.(Tam，J.P.)，美国化学协会杂志，117：3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其它氨基酸侧链存在下进行选择性修饰。例如参见柯尼西V.W.(Cornish，V.W.)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)118：8150-8151(1996)；乔治格K.F.(Geoghegan，K.F.)和斯托赫J.G.(Stroh，J.G.)，生物结合物化学(Bioconjug.Chem.)3：138-146(1992)；马赫尔L.K.(Mahal，L.K.)等人，科学(Science)276：1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电基团反应形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物形成结合物)。
例示性含肼、含酰肼或含氨基脲的氨基酸可如下所示：
Figure BPA00001374088100581
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，n为4，R1不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸可从商业来源获得。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可购自西格玛化学品公司(Sigma Chemical)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。其它非市售氨基酸可由所属领域技术人员制备。例如参见美国专利第6,281,211号。
含有带酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。例如参见邵J.(Shao，J.)和泰姆J.(Tam，J.)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)117：3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基，或赖氨酸和N末端的氨基)相比较，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团反应性明显较高。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电基团反应，形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物的结合物)。与肼、酰肼和氨基脲类似，增强氨氧基的亲核性使其能够与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。例如参见邵J.(Shao，J.)和泰姆J.(Tam，J.)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)117：3893-3899(1995)；H.杭(H.Hang)和C.贝托兹(C.Bertozzi)，化学研究述评(Acc.Chem.Res.)34：727-736(2001)。与肼基反应得到相应腙，而肟一般是由氨氧基与含羰基基团(例如酮)反应得到。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下所示：
其中n为0到10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0到10；Y为＝C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1且Y存在。在一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可由容易得到的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。例如参见M.卡拉索科(M.Carrasco)和R.布朗(R.Brown)，有机化学杂志(J.Org.Chem.)68：8853-8858(2003)。已经从天然来源中分离出某些含氨氧基的氨基酸，例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(罗森纳G.(Rosenthal，G.)，生命科学(Life Sci.)60：1635-1641(1997))。所属领域技术人员可以制备出其它含氨氧基的氨基酸。
D.叠氮基和炔反应性基团
叠氮基和炔官能团的独特反应性使其特别适用于选择性修饰多肽和其它生物分子。有机叠氮化物，尤其是脂肪族叠氮化物，以及炔一般对常用化学反应条件稳定。具体说来，叠氮基和炔官能团对天然存在多肽中所见的20种常见氨基酸的侧链(即，R基)呈惰性。但当紧密接近时，会呈现叠氮基和炔基的“弹簧加压(spring-loaded)”性，并且其经由胡伊斯根[3+2]环加成反应有效且选择性反应，产生相应的三唑。例如参见秦J.(Chin J.)等人，科学(Science)301：964-7(2003)；王Q.(Wang，Q.)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)125，3192-3193(2003)；秦J.W.(Chin，J.W.)等人，美国化学协会杂志，124：9026-9027(2002)。
由于胡伊斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参见帕德瓦A.(Padwa，A.)，有机合成大全(COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS)，第4卷，(托斯特B.M.(Trost，B.M.)编，1991)，第1069-1109页；胡伊斯根R.(Huisgen，R.)，1，3-偶极环加成化学(1，3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY)，(帕德瓦A.编，1984)，第1-176页)而非亲核取代反应，故并入带有含叠氮基和含炔侧链的非天然编码氨基酸允许在非天然编码氨基酸位置对所得多肽进行选择性修饰。可在室温下，于水性条件下，通过在用于将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂存在下，添加催化量的Cu(II)(包括(但不限于)催化量CuSO4的形式)，原位进行涉及含叠氮基或含炔的fEPO的环加成反应。例如参见王Q.(Wang，Q.)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)125，3192-3193(2003)；托尼诺C.W.(Tornoe，C.W.)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)67：3057-3064(2002)；罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)41：2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括(但不限于))抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和所施加的电位。
在需要叠氮基与炔之间发生胡伊斯根[3+2]环加成反应的一些情况下，fEPO多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸，且欲与所述氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行相反的反应(即，氨基酸上的叠氮基部分与水溶性聚合物上存在的炔部分反应)。
叠氮基官能团也可与含有芳基酯且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键的水溶性聚合物选择性反应。芳基膦基在原位还原叠氮基，随后所得胺与邻近的酯键有效反应，产生相应酰胺。例如参见E.萨龙(E.Saxon)和C.波特兹(C.Bertozzi)，科学(Science)287，2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示：
Figure BPA00001374088100611
其中X可为O、N、S，或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R″′和R″″各独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。当本发明化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。当R′与R″连接到同一氮原子时，其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″拟包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”拟包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮基官能团还可与含有硫酯且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键的水溶性聚合物选择性反应。芳基膦基于原位还原叠氮基，随后所得胺与硫酯键有效反应，产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示：
Figure BPA00001374088100612
其中n为1到10；X可为O、N、S，或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
例示性含炔氨基酸可如下所示：
Figure BPA00001374088100621
其中n为0到1O；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基，或不存在；X为O、N、S，或不存在；m为0到10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，且乙炔部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且炔丙氧基位于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在，且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自派普科技公司(Peptech)(马萨诸塞州伯灵顿(Burlington，MA))。或者，可根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，可例如根据戴特斯A.(Deiters，A.)等人，美国化学协会杂志(J，Am.Chem.Soc.)125：11782-11783(2003)中所述，合成对炔丙氧基苯丙氨酸，并且可根据凯瑟B.(Kayser，B.)等人，四面体通讯(Tetrahedron)53(7)：2475-2484(1997)中所述，合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域技术人员可以制备出其它含炔氨基酸。
例示性含叠氮基氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且R1和X不存在，且m＝0。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为2，且β-叠氮基乙氧基部分位于烷基侧链的对位。
含叠氮基氨基酸可从商业来源得到。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可从凯姆英派国际公司(Chem-Impex International，Inc.)(伊利诺伊州伍德戴尔(Wood Dale，IL))获得。对于那些非市售的含叠氮基氨基酸，可使用所属领域技术人员已知的标准方法，包括(但不限于)经由适当离去基团置换(包括(但不限于)卤基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或经由使适当保护的内酯开环，相对容易地制备出叠氮基。例如参见马奇(March)的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版，1985，威立父子出版公司(Wileyand Sons)，纽约(New York))。
E.氨基硫醇反应性基团
β取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其特别适用于经由形成噻唑烷来选择性修饰多肽和其它含有醛基的生物分子。参见例如J.邵(J.Shao)和J.泰姆(J.Tam)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1995，117(14)3893-3899。在一些实施例中，可将β取代的氨基硫醇氨基酸并入fEPO多肽中，随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，可经由形成噻唑烷，将水溶性聚合物、药物结合物或其它有效负荷与包含β取代的氨基硫醇氨基酸的fEPO多肽偶合。
非天然氨基酸的细胞摄取
真核细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择(包括(但不限于))并入蛋白质中的非天然氨基酸时常常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明，这些化合物不太可能渗透细胞。天然氨基酸是经由一系列基于蛋白质的转运系统吸收到真核细胞中。可进行快速筛选来评估哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如参见，例如2002年12月22日申请的标题为“蛋白质阵列(Protein Arrays)”的申请案，代理人案号P1001US00；以及林D.R.(Liu，D.R.)和查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)(1999)朝向具有扩充的遗传密码的生物体的进化发展(Progress toward the evolution of anorganism with an expanded genetic code.)美国国家科学院院刊(PNAS United States)96：4780-4785中的毒性分析。尽管易于利用各种分析法来分析摄取，但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方法是提供在体内产生氨基酸的生物合成路径。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中存在许多生物合成路径来产生氨基酸和其它化合物。特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括(但不限于)真核细胞)中，而本发明提供了此类方法。举例来说，在宿主细胞中，通过添加新颖酶，或改变现存的宿主细胞路径，来任选产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新颖酶任选为天然存在酶或人工开发酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivoincorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中的实例所提供)依赖于添加来自其它生物体的已知酶组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。任选添加的酶类型的实例提供于下文的实例中。其它酶序列可见于例如基因库(Genbank)中。也任选以相同方式将人工开发酶添加到细胞中。以此方式，利用细胞机器和细胞资源产生非天然氨基酸。
多种方法可用来产生用于生物合成路径或用于发展现存路径中的新颖酶。举例来说，任选使用包括(但不限于)麦克西根公司(Maxygen，Inc.)开发的递归重组法(recursiverecombination)(可见于万维网www.maxygen.com)来开发新颖酶和路径。例如参见斯蒂姆(Stemmer)(1994)，在体外利用DNA改组快速进化蛋白质(Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling)，自然(Nature)370(4)：389-391；和斯蒂姆，(1994)，通过随机断裂和再组装进行DNA改组：体外重组以供分子进化(DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution)，美国国家 科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)91：10747-10751。类似地，任选使用杰能科公司(Genencor)(可见于万维网genencor.com)开发的DesignPathTM进行代谢路径的工程改造，包括(但不限于)工程改造某条路径以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。这项技术使用新基因(包括(但不限于)利用功能性基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现存路径。迪文萨公司(Diversa Corporation)(可见于万维网diversa.com)也提供迅速筛选基因和基因路径文库的技术来(包括(但不限于)建立新路径。
通常，利用本发明的工程改造的生物合成路径所产生的非天然氨基酸的浓度足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。在体内以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞，并产生非天然氨基酸后，任选使用体内选择，以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
并入非天然氨基酸可实现多个目的，包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶目标位点的可接近性；靶向某一部分(包括(但不限于)用于蛋白质分析)等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有较强或者甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说，任选通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变以下特性：毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括(但不限于))新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括(但不限于)抗体)以及(包括(但不限于))蛋白质结构和功能研究。例如参见道格悌(Dougherty)，(2000)作为蛋白质结构和功能探针的非天然氨基酸(Unnatural AminoAcids as Probes of Protein Structure and Function)，现代化学生物学观点(Current Opinion  in Chemical Biology.)4：645-652。
在本发明一方面中，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多个)非天然氨基酸的蛋白质。这些非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的非天然氨基酸。在另一方面，组合物包括蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)，所述蛋白质可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或者可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可相同、不同，或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽是本发明的一个特征。本发明也包括使用本发明组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行的。举例来说，翻译后修饰包括(包括(但不限于))乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。在一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键连接低聚糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬酰胺。参看表1，其列出了真核蛋白质的N连接低聚糖的一些实例(也可存在其它未展示的残基)。在另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键连接低聚糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸。
表1：经由GlcNAc键连接的低聚糖实例
Figure BPA00001374088100661
在又一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降钙素前体、降钙素基因相关的肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、前胰岛素、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工；组装成多亚基蛋白质或大分子组装物；翻译到细胞中另一位点(包括(但不限于)细胞器，例如内质网、高尔基体(golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞体内进行或在体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白质中，可在体外和体内使用其它更具选择性的反应，例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参见柯尼西(Cornish)等人(1996)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)118：8150-8151；马赫尔(Mahal)等人(1997)，科学(Science)276：1125-1128；，王(Wang)等人(2001)，科 学(Science)292：498-500；秦(Chin)等人(2002)，美国化学协会杂志124：9026-9027；秦等人(2002)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：11020-11024；王等人(2003)，美国国家科学院院刊，100：56-61；张(Zhang)等人(2003)，生物化学 (Biochemistry)，42：6735-6746；和秦等人(2003)，科学，出版中。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子在内的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。还参见2003年1月16日申请的标题为“糖蛋白的合成(Glycoprotein synthesis)”的专利申请案第10/686,944号，以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括(但不限于)经由叠氮基氨基酸修饰)也可通过施陶丁格尔接合(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参见柯克(Kiick)等人，(2002)利用施陶丁格尔接合将叠氮基并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinantproteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation)，PNAS 99：19-24。
本发明提供另一种选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及作为对选择密码子的反应而将(包括(但不限于))含叠氮或炔部分的非天然氨基酸以遗传方式并入蛋白质中。随后，可通过与(包括(但不限于))炔基或叠氮衍生物分别发生(包括(但不限于))胡伊斯根[3+2]环加成反应(例如参见帕德瓦A.(Padwa，A.)，有机合成大全 (Comprehensive Organic Synthesis)，第4卷.(1991)托斯特B.M.(Trost，B.M.)编，波格蒙出版社(Pergamon)，牛津(Oxford)，第1069-1109页；和胡伊斯根R.(Huisgen，R.)1，3-偶极环加成化学(1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry)，(1984)，帕德瓦A.(Padwa，A.)编，威立出版公司(Wiley)，纽约(New York)，第1-176页)来修饰这些氨基酸侧链。由于此方法涉及环加成而非亲核取代反应，故可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可在室温下，于水性条件中，通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4＞1,5)进行。例如参见托尼诺(Tornoe)等人，(2002)有机化学 (Org.Chem.)67：3057-3064；和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德国应用化学 (Angew.Chem.Int.Ed.)41：2596-2599。可使用的另一方法是利用四半胱氨酸基序的双砷化合物上的配体交换，例如参见格里夫林(Griffin)等人，(1998)科学(Science)281：269-272。
可经由[3+2]环加成反应加到本发明蛋白质中的分子包括具有叠氮基或炔基衍生物的几乎任何分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别添加到具有炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸。
VI.体内产生包含非基因编码氨基酸的fEPO
可以使用经修饰tRNA和tRNA合成酶添加或取代在天然存在系统中不编码的氨基酸，而在体内产生本发明的fEPO多肽。
使用天然存在系统中不编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的产生方法描述于例如美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)中，其以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统内源性合成酶和tRNA起作用(因此有时称为“正交”)的翻译机器。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先使翻译系统中具有至少一个非天然存在氨基酸的O-tRNA氨酰基化，并且O-tRNA识别至少一个不被所述系统中其它tRNA所识别的选择密码子。因此，翻译系统作为对所编码的选择密码子的反应而将非天然编码氨基酸插入所述系统中产生的蛋白质中，由此将氨基酸“取代”入所编码多肽的某一位置中。
此项技术中已经描述了多种用于将特定合成氨基酸插入多肽中的正交tRNA和氨酰基-tRNA合成酶，并且其一般都适用于本发明中。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于王L(Wang，L)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100：56-61(2003)和张Z.(Zhang，Z.)等人，生物化学(Biochem.)42(22)：6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多聚核苷酸序列编码，并且包括美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)(都以引用的方式并入本文中)中所揭示的氨基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)，都以引用的方式并入本文中。
叠氮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于秦J.W.(Chin，J.W.)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)124：9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(序号10/126,931；以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927；以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3。对特定非天然编码氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氨基酸与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于秦J.W.(Chin，J.W.)等人，科学(Science)301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但一般需要选择很少或从未用于表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子，例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基的密码子；和很少或未使用过的其它天然三碱基密码子。
可使用此项技术中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制性选择性诱变等)将特定选择密码子引入fEPO多聚核苷酸编码序列的适当位置中。
可用来并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机器组件(例如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的产生方法描述于王L.(Wang，L.)等人，科学(Science)292：498-500(2001)；秦J.W.(Chin，J.W.)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)124：9026-9027(2002)；张Z(Zhang，Z)等人，生物化学(Biochemistry)42：6735-6746(2003)中。用于体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其以引用的方式并入本文中。用于选择在生物体体内翻译系统中使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931)中，其以引用的方式并入本文中。
产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)由第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS文库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌(P.horikoshii)、嗜热泉生古细菌、极端嗜热细菌等，或真核生物体；(b)在RS(任选突变RS)文库中选择(和/或筛选)在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，由此提供活性(任选突变)RS的集合；和/或(c)在所述集合中选择(任选通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，由此提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨酰基化。
在一个实施例中，RS为无活性RS。可通过使活性RS突变来产生无活性RS。举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或更多个氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生无活性RS。
可使用此项技术中已知的各种技术产生突变RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可利用位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构建体、合理设计以及本文中所述或此项技术中已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中，在RS(任选突变RS)文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括：将阳性选择或筛选标记物(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(任选突变)RS文库引入多个细胞中，其中所述阳性选择和/或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在选择剂存在下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记物中的所述至少一个选择密码子来鉴别在选择剂和/或筛选剂存在下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(任选突变)RS的集合的经阳性选择的细胞的子集。任选可改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
在一方面，阳性选择标记物为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因，且在CAT基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。阳性选择标记物任选为β-内酰胺酶基因，且在β-内酰胺酶基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。在另一方面，阳性筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物，或基于亲和性的筛选标记物(包括(但不限于)细胞表面标记物)。
在一个实施例中，在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(任选突变RS)包括：将阴性选择或筛选标记物与来自阳性选择或筛选的活性(任选突变)RS的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或不显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞。举例来说，在测定适当O-RS重组体时，CAT鉴别方案任选充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，在存在或不存在一个或一个以上非天然编码氨基酸的情况下，任选于含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆体集合。因此，仅在含有非天然编码氨基酸的板上生长的集落被认为含有重组O-RS。在一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一生物体与第二生物体不同。因此，第一和/或第二生物体任选包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物，或基于亲和性的筛选标记物。
在另一个实施例中，在所述集合中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(任选突变)RS包括：自阳性选择步骤(b)分离出活性突变RS的集合；将阴性选择或筛选标记物和活性(任选突变)RS的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或不显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。在一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例任选可包括：所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且第一与第二生物体不同(包括(但不限于)，各生物体任选为(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记物包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记物任选包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和性的筛选标记物的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择任选包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(任选突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)，直到获得能够优先使O-tRNA氨酰基化的突变O-RS。任选将步骤(d)到(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。在一方面，可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
上述方法中选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度任选包括改变选择/筛选严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是利用荧光活化细胞分选法(FACS)检测，或其中报告基因是通过发光检测。报告基因任选展示于细胞表面上、噬菌体展示上等，并且是根据涉及非天然编码氨基酸或其类似物的亲和性或催化活性来选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制子tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下由第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA，从而提供tRNA(任选突变)的集合；以及(c)在所述tRNA(任选突变)集合中选择或筛选由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，不由第二生物体的RS有效识别，并由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制子tRNA，和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA的正交性得到改进。应了解，在一些实施例中，无需修饰即可任选将O-tRNA从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一生物体与第二生物体相同或不同，并且任选选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA任选经非天然编码氨基酸氨酰基化，其中所述非天然编码氨基酸是在体内天然生物合成的，或是通过基因操作来生物合成的。任选将非天然编码氨基酸添加到至少第一或第二生物体的生长培养基中。
在一方面，在文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选由氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(任选突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(任选突变)tRNA文库引入第二生物体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因，或生物体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(任选突变)tRNA的集合。举例来说，可使用比较比率细胞密度分析(comparison ratio cell density assay)来选择存活细胞。
在另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因任选可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，在(任选突变)tRNA的集合中选择或筛选由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(任选突变)tRNA的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因，或使毒性剂解毒的基因；和鉴别在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)存在下生长的存活或筛选细胞，从而提供具有所述至少一种重组tRNA的细胞集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化，并对所述至少一个选择密码子反应而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，选择剂和/或筛选剂的浓度不同。
本发明提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在第一生物体的RS的情况下由第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA，从而提供(任选突变)tRNA的集合；(c)在(任选突变)tRNA的集合中选择或筛选由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，不由第二生物体的RS有效识别，并由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS的文库；(e)在突变RS文库中选择或筛选在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(任选突变)RS的集合；和(f)在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(任选突变)RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。本发明包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，例如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一生物体与第三生物体相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中还包括选择用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入第二生物体的复制细胞组(duplicate cell set)中；和选择在复制细胞组中不能存活而在第一组中存活的细胞，或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组都是在选择剂或筛选剂存在下生长，其中存活或经筛选细胞包含用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括体内互补分析。选择剂或筛选剂的浓度可变化。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明方法中的第一生物体与第二生物体可相同或不同。在一个实施例中，生物体任选为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，生物体任选包含真核生物体，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二生物体为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，第二生物体可为真核生物体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一生物体与第二生物体不同。
VII.fEPO中非天然存在氨基酸的定位
本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入fEPO中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入不破坏多肽活性的特定位置。这可以通过进行“保守”取代实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，用大体积氨基酸取代大体积氨基酸，用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸；和/或通过将非天然存在氨基酸插入非活性所需的位置中实现。
fEPO的各个区域可说明如下，其中fEPO中氨基酸的位置在中间一行中指明：
Figure BPA00001374088100741
可使用多种生物化学和结构方法来选择fEPO多肽内供非天然编码氨基酸取代的理想位点。所属领域一般技术人员易于了解，多肽链中的任何位置都适合选择用于并入非天然编码氨基酸，并且选择可建立在合理设计的基础上或者通过随机选择以实现任何或非特别的所需目的。选择的理想位点可用于产生具有任何所需特性或活性的fEPO分子，包括(但不限于)激动剂、超级激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂；用于形成二聚体或多聚体；活性或特性相比天然分子无改变；或者操纵多肽的任何物理或化学特性，例如溶解性、聚集作用或稳定性。举例来说，可使用此项技术中已知的丙氨酸扫描或同系物扫描法，来鉴别fEPO生物活性所必需的多肽位置。例如参见比托夫T.(Bittorf，T.)等人，FEBS，336：133-136(1993)(鉴别EPO活性的关键残基)；文D.(Wen，D.)等人，JBC，269：22839-22846(1994)(丙氨酸扫描诱变，用于鉴别功能上重要的hEPO结构域)；和埃利奥特S.(Elliot，S.)等人，血液(Blood)，89：493-502(1997)(鉴别hEPO与人EPO受体之间的关键静电相互作用)。视期望寻求的多肽活性而定，除经丙氨酸或同系物扫描诱变鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者，视期望寻求的多肽活性而定，鉴别为对生物活性至关重要的位点也可成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法为，利用非天然编码氨基酸在多肽链上的各个位置中简单地进行连续取代，并观察对多肽活性的影响。所属领域一般技术人员易于了解，选择任何多肽中供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
也可检查含有缺失的天然存在fEPO突变体的结构和活性，以确定可能容忍非天然编码氨基酸取代的蛋白质区域。例如参见比托夫T.(Bittorf，T.)等人，FEBS，336：133(1993)；文D.(Wen，D.)等人，JBC，269：22839(1994)。在去除了可能无法容忍非天然编码氨基酸取代的残基后，就可由fEPO和其结合蛋白的三维结构检查在各剩余位置处所建议取代的影响。参见赛义德(Syed)等人，自然(Nature)，395：511(1998)，和查斯曼(Cheetham)等人，自然—结构生物学(Nature Structural Biology)，5：861(1998)；hEPO的x射线结晶学和NMR结构可见于蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB；www.rcsb.org，PDB标识符：1CN4、1EER和1BUY)，这是一个含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的中央数据库。因此，通过使用有关hEPO的已知信息，所属领域技术人员就能容易地鉴别出fEPO中可用非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置(参看图1)。
在一些实施例中，本发明的EPO多肽包含一个或一个以上位于不破坏EPO的螺旋或β折叠二级结构的蛋白质区域中的非天然存在氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入或取代入EPO中对应于二级结构的以下一个或一个以上区域：1-7(N末端)、8-26(A螺旋)、27-38(在A螺旋与B螺旋之间的区域)、39-41(β折叠1)、42-46(在β折叠1与微螺旋B′之间的区域)、47-52(微B′螺旋)、53-54(在微B′螺旋与B螺旋之间的区域)、55-83(B螺旋)、84-89(在B螺旋与C螺旋之间的区域)、90-113(C螺旋)、114-121(微C′螺旋)、122-132(在微C′螺旋与β折叠2之间的区域)、133-135(β折叠2)、136-137(在β折叠2与D螺旋之间的区域)、138-161(D螺旋)、162-166(C末端)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入EPO中以下一个位置中：1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165和166。在一些实施例中，本发明的EPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：21、24、27、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置：21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128。
并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括(但不限于)以下位点：除开位点I和位点II外；可完全或部分溶剂暴露；与邻近残基具有极少或无氢键相互作用；可在极低程度上暴露给邻近反应性残基；以及如hEPO与其受体的三维晶体结构所预测，可处在具有高度柔性(包括(但不限于)C-D环)或结构刚性(包括(但不限于)B螺旋)的区域中。
多种非天然编码氨基酸可取代或并入fEPO中的指定位置。总的说来，根据对fEPO与其受体的三维晶体结构的检查，对于保守取代(即，用含芳基非天然编码氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸，取代Phe、Tyr或Trp)的偏好，和希望引入fEPO多肽中的具体结合化学(包括(但不限于)，当希望实现与带有炔部分的水溶性聚合物的胡伊斯根[3+2]环加成，或与带有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺键，随后并入膦部分时，可引入4-叠氮基苯丙氨酸)，来选择供并入的特定非天然编码氨基酸。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)：染料；聚合物，包括(但不限于)聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；亲和标记；生物素衍生物；树脂、第二蛋白质或多肽；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)等)接触。第一反应性基团与第二反应性基团发生[3+2]环加成反应，由此将所述分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，而第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)，而第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，而第二反应性基团为炔基部分。
用于并入非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括(但不限于)1、2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136和162。对hEPO的晶体结构和其与hEPO受体相互作用的检查，以及连同当前提交的有关fEPO申请一起所提供的分子模型表明，这些氨基酸残基的侧链可完全或部分让溶剂接近，并且非天然编码氨基酸的侧链可远离蛋白质表面而指进溶剂中。
向fEPO中并入非天然编码氨基酸的例示性位置包括21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162。对hEPO的晶体结构和其与hEPO受体相互作用的检查表明，这些氨基酸残基的侧链可完全暴露给溶剂，并且天然残基的侧链指进溶剂中。
在一些情况下，非天然编码氨基酸取代或并入将会与fEPO多肽内的其它添加、取代或缺失组合，以影响fEPO的其它生物特性。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加fEPO多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解性降解的抗性)或增加fEPO多肽对促红细胞生成素受体的亲和力。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加fEPO多肽的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，为了增加fEPO在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后的溶解性，除并入非天然编码氨基酸的另一位点外还选择供天然编码或非天然编码氨基酸取代的位点。fEPO中供氨基酸取代以增加溶解性的所述位点的实例为N36、Q86、G113和/或Q115，其可经Lys、Arg、Glu或任何其它带电的天然编码或非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，fEPO多肽包含调节对fEPO受体的亲和力；调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚化；使受体二聚体稳定；调节循环半衰期；调节释放或生物利用率；便利纯化；或者改进或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。类似地，fEPO多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合结构域(包括(但不限于)FLAG或聚组氨酸)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、聚组氨酸、GST等)或改进对于多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特质的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
举例来说，除如本文中所述引入一个或一个以上非天然编码氨基酸外，还可引入以下一个或一个以上取代：S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A和K154A，以增加fEPO变异体对其受体的亲和力(文(Wen)等人(1994)JBC 269：22839-22846)。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生fEPO拮抗剂。用于并入非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括：10、11、14、15、96、97、100、103、104、107、110。(埃利奥特(Elliot)等人(1997)血液(Blood)89：493-502；和查斯曼(Cheetham)等人(1998)自然—结构生物学(Nature Structural Biology)5：861-866)。在其它实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括在A螺旋的氨基末端区域和一部分C螺旋内的残基。在另一实施例中，用例如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸等非天然编码氨基酸取代L108。在其它实施例中，将上文所列的取代与使fEPO多肽成为fEPO拮抗剂的其它取代组合。举例来说，用非天然编码氨基酸取代本文中鉴别的一个位置，同时在L108处引入取代(包括(但不限于)L108K、L108R、L108H、L108D或L108E)。
在一些情况下，用非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。在一些情况下，fEPO多肽进一步包括非天然编码氨基酸对天然存在氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代。举例来说，在一些实施例中，fEPO的以下区域中至少两个残基经非天然编码氨基酸取代：1-7(N末端)、8-26(A螺旋)、27-38(在A螺旋与B螺旋之间的区域)、39-41(β折叠1)、42-46(在β折叠1与微螺旋B′之间的区域)、47-52(微B′螺旋)、53-54(在微B′螺旋与B螺旋之间的区域)、55-83(B螺旋)、84-89(在B螺旋与C螺旋之间的区域)、90-113(C螺旋)、114-121(微C′螺旋)、122-132(在微C′螺旋与β折叠2之间的区域)、133-135(β折叠2)、136-137(在β折叠2与D螺旋之间的区域)、138-161(D螺旋)、162-166(C末端)。在一些情况下，将两个或两个以上非天然编码残基与一种或一种以上分子量较低的线性或分支PEG(质量为约5-20kDa)连接，由此得到相比与单一较高分子量的PEG连接的物质有所增强的结合亲和力和与之相当的血清半衰期。
在一些实施例中，以下位置的至多两个残基经非天然编码氨基酸取代：1、2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136和162。因此，在一些情况下，进行以下任一取代对：N24X*和G113X*；N38X*和Q115X*；N36X*和S85X*；N36X*和A125X*；N36X*和A128X*；Q86X*和S126X*，其中X*表示非天然编码氨基酸。优选并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的位点包括以下残基的组合：21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162。特别优选并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的位点包括以下残基的组合：21、24、38、83、86、89、116、119、124、125、126、127、128、129、130和162。
VIII.非真核细胞和真核细胞中的表达
为了高水平表达克隆的fEPO多聚核苷酸，通常将编码本发明fEPO多肽的多聚核苷酸亚克隆到一种表达载体中，这种表达载体含有可引导转录的强启动子、转录/翻译终止子，以及(如果针对编码蛋白质的核酸)用于起始翻译的核糖体结合位点。适合的细菌启动子是此项技术中众所周知的，并且例如描述于萨姆布鲁克(Sambrook)等人和奥斯贝尔(Ausubel)等人中。
用于表达本发明fEPO多肽的细菌表达系统可从(包括(但不限于))大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门氏菌属中获得(帕尔瓦(Palva)等人，基因(Gene)22：229-235(1983)；莫斯贝奇(Mosbach)等人，自然(Nature)302：543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒在市面上有售。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是此项技术众所周知的，并且在市面上也有销售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)表达本发明fEPO多肽的情况中，供表达的宿主细胞是根据其使用正交组件的能力来选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)或枯草杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述，可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。在一方面，组合物任选包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白质，或者利用体内蛋白质制备方法可达到的量(关于重组蛋白制备和纯化的细节如本文中所提供)。在另一方面，组合物中存在的蛋白质在(包括(但不限于))细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)体积(包括(但不限于))在约1nl到约100L间的任何体积)中的浓度任选为(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质或更高。本发明的一个特征为，在真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于用其它方法(包括(但不限于)体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够生物合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。举例来说，产生的包含非天然氨基酸的蛋白质在细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中的浓度为(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更多蛋白质。
表达系统、培养和分离
fBPO可在许多适合的表达系统(包括例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。下文将描述例示性表达系统。
酵母本文中使用的术语“酵母”包括能够表达编码fEPO的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。酵母菌科是由四个亚科组成：裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。
供本发明使用的特别值得关注的为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
选择适于表达fEPO的酵母是在所属领域一般技术人员的技能范围内。在选择供表达的酵母宿主时，适合的宿主可包括显示例如良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的酵母宿主。酵母通常可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Yeast Genetic StockCenter，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American TypeCulture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。这一术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲以相关特性(例如存在编码fEPO的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞后代。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体，用于转化到许多酵母宿主中。举例来说，已经开发出用于以下各生物体的表达载体：酿酒酵母(希寇斯基(Sikorski)等人，遗传学(GENETICS)(1998)122：19；埃托(Ito)等人，应用细菌学杂志(J.BACTERIOL.)(1983)153：163；海因伦(Hinnen)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1978)75：1929)；白色念珠菌(科特兹(Kurtz)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1986)6：142)；麦芽糖假丝酵母(库尼则(Kunze)等人，基础微生物学杂志(J.BASIC MICROBIOL.)(1985)25：141)；汉森酵母(格林森(Gleeson)等人，普通与应用微生物学杂志(J.GEN.MICROBIOL.)(1986)132：3459；罗格坎普(Roggenkamp)等人，分子遗传学和基因组(MOL.GEN.GENET.)(1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母(达斯(Das)等人，应用细菌学杂志(1984)158：1165)；乳酸克鲁维酵母(德拉文科特(DeLouvencourt)等人，应用细菌学杂志(1983)154：737；范登伯格(Van den Berg)等人，生物技术(纽约)(BIO/TECHNOLOGY(NY))(1990)8：135)；谷勒氏酵母(库尼则等人，基础微生物学杂志(1985)25：141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号和第4,837,148号；克雷格(Cregg)等人，分子细胞生物学(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(比奇(Beach)和纳斯(Nurse)等人，自然(NATURE)(1981)300：706)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(达维多(Davidow)等人，现代遗传学(CURR.GENET).(1985)10：380(1985)；盖拉丁(Gaillardin)等人，现代遗传学(1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)(伯伦斯(Ballance)等人，生物化学与生物物理研究通讯(BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN)(1983)112：284-89；迪尔伯恩(Tilburn)等人，基因(GENE)(1983)26：205-221；和耶尔敦(Yelton)等人，美国国家科学院院刊(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.niger)(凯里(Kelly)和海因斯(Hynes)，欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)(1985)4：475479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0 244 234)；和丝状真菌，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO91/00357)。
所属领域技术人员众所周知用于酵母载体的控制序列，并且所述序列包括(但不限于)以下基因的启动子区：例如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供有用的启动子序列(宫之原(Miyanohara)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1983)80：1)。适用于酵母宿主的其它启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(海泽曼(Hitzeman)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM)(1980)255：2073)；和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(霍兰德(Holland)等人，生物化学(BIOCHEMISTRY)(1978)17：4900；海斯(Hess)等人，酶调控进展杂志(J.ADV.ENZYME REG.)(1969)7：149))的启动子。具有由生长条件控制的额外转录优点的诱导性酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、氮代谢相关性降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达中的载体和启动子进一步描述于EP0 073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(upstream activating sequence，UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列结合糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区所组成的启动子。参见EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包括能够结合酵母RNA聚合酶并起始转录的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体一部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(霍兰德(Holland)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM.)(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点也适用于酵母。适用于酵母中的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参见迪斯查普(Tschemper)等人，基因(GENE)(1980)10：157；金戈斯曼(Kingsman)等人，基因(1979)7：141。trp1基因对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供选择标记。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是由带有Leu2基因的已知质粒补充。
所属领域一般技术人员众所周知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，并且这些方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据萧(Hsiao)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1979)76：3829和范索里格(Van Solingen)等人，应用细菌学杂志(J.BACT.)(1977)130：946中所述的方法来转化酵母。然而，也可如萨姆布鲁克(SAMBROOK)等人，分子克隆实验手册(MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL)(2001)中一般性描述，使用其它方法将DNA引入细胞中，例如核注射法、电穿孔法或原生质体融合法。随后，可使用所属领域一般技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域一般技术人员众所周知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其它方法。一般参见美国专利申请案第20020055169号；美国专利第6,361,969号、第6,312,923号、第6,183,985号、第6,083,723号、第6,017,731号、第5,674,706号、第5,629,203号、第5,602,034号和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/078621、WO 98/37208和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946736、EP 0 732 403、EP 0 480 480、EP 0 460 071、EP 0 340 986、EP 0 329 203、EP 0 324274和EP 0 164 556中。也参见格里森(Gellissen)等人，列文虎克(ANTONIE VANLEEUWENHOEK)(1992)62(1-2)：79-93；罗曼诺斯(Romanos)等人，酵母(YEAST)(1992)8(6)：423-488；格利德尔(Goeddel)，酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)(1990)185：3-7。
在使用所属领域一般技术人员众所周知的标准分批进料发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可适合用于解释特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和微量矿物进料，而只需要简单铵(氮)盐以达最佳生长和表达。例如参见美国专利第5,324,639号；埃利奥特(Elliott)等人，蛋白质化学杂志(J.PROTEIN CHEM.)(1990)9：95；和菲斯查克(Fieschko)等人，生物技术与生物工程(BIOTECH.BIOENG.)(1987)29：1113。
然而，这些发酵方法可能具有某些与所用酵母宿主菌株无关的常见特征。举例来说，在扩增期间，可将限制生长的养分(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法一般使用的发酵培养基是设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、微量矿物和盐等)。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。这一术语包括经过转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲以相关特性(例如存在编码fEPO多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞的后代。
所属领域一般技术人员众所周知适用于表达fEPO的昆虫细胞的选择。此项技术中充分描述了数种昆虫种类，并且在市面上有售，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择供表达的昆虫宿主时，合适的宿主可包括显示(尤其)良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。
一般说来，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组件包括：转移载体，通常为细菌质粒，其含有杆状病毒基因组的片段和供插入欲表达的异源基因的适宜限制性位点；序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的野生型杆状病毒(此使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞，和生长培养基。此项技术中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术，并且可以使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，在宿主细胞中，载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如英杰公司(Invitrogen Corp.)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。所属领域一般技术人员一般已知这些技术，且其充分描述于萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)中，此文献以引用的方式并入本文中。还参见理查德森(RICHARDSON)，39分子生物学方法：杆状病毒表达技术(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUSEXPRESSION PROTOCOLS)(1995)；奥斯贝尔(AUSUBEL)等人，现代分子生物学技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)16.9-16.11(1994)；金(KING)和普斯伊(POSSEE)，杆状病毒系统实验指南(THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE)(1992)；和奥雷利(O′REILLY)等人，杆状病毒表达载体实验手册(BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL)(1992)。
事实上，此项技术中众所周知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来产生各种异源蛋白质的方法。例如参见，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/03628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082。
此项技术中已知可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包括例如从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，这是一种不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。一般参见雷利(Reilly)等人，杆状病毒表达载体实验手册(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：ALABORATORY MANUAL)(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、相关编码序列和转录终止序列的上述组件组装到中间错位构建体(intermediatetransplacement construct)(转移载体)中。中间错位构建体通常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件，例如质粒)中。复制子将具有复制系统，由此使其能保持在适于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(米勒(Miller)，微生物学年鉴(ANN.REV.MICROBIOL.)(1988)42：177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素(ampicillin)抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经设计出所属领域技术人员已知的许多其它载体，包括例如pVL985，其中将多角体蛋白的起始密码子由ATG变为ATT，并将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参见鲁克诺(Luckow)和萨姆斯(Summers)，病毒学(VIROLOGY)17：31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。此项技术中已知将异源DNA引入杆状病毒中的所需位点中的方法。参见萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)；史密斯(Smith)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1983)3：2156；鲁克诺(Luckow)和萨姆斯(Summers)，病毒学(VIROLOGY)(1989)17：31中。举例来说，可通过同源双交叉重组来插入例如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程改造的限制酶位点中。参见米勒(Miller)等人，生物学论文集(BIOESSAYS)(1989)4：91。
可利用电穿孔法来实现转染。参见托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物学方法(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1995)；曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70：3501。或者，可以使用脂质体，利用重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参见，利伯曼(Liebman)等人，生物技术(BIOTECHNIQUES)(1999)26(1)：36；格拉芙斯(Graves)等人，生物化学(BIOCHEMISTRY)(1998)37：6050；野村(Nomura)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM.)(1998)273(22)：13570；斯奇米特(Schmidt)等人，蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSION ANDPURIFICATION)(1998)12：323；西弗特(Siffert)等人，自然·遗传(NATURE GENETICS)(1998)18：45；迪尔金斯(TILKINS)等人，细胞生物学实验手册(CELL BIOLOGY：A LABORATORYHANDBOOK)145-154(1998)；蔡(Cai)等人，蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSIONANDPURIFICATION)(1997)10：263；多夫林(Dolphin)等人，自然·遗传(1997)17：491；科斯特(Kost)等人，基因(GENE)(1997)190：139；杰克博森(Jakobsson)等人，生物化学杂志(1996)271：22203；洛韦思(Rowles)等人，生物化学杂志(1996)271(37)：22376；雷沃瑞(Reverey)等人，生物化学杂志(1996)271(39)：23607-10；斯坦利(Stanley)等人，生物化学杂志(1995)270：4121；西斯科(Sisk)等人，病毒学杂志(J.VIROL.)(1994)68(2)：766；以及彭(Peng)等人，生物技术(BIOTECHNIQUES)(1993)14.2：274。市售脂质体包括例如Cellfectin和Lipofectin
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(英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。另外，也可使用磷酸钙转染。参见托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物学方法(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1995)；凯特(Kitts)，NAR(1990)18(19)：5667；以及曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3′)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5′端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可为受调控或组成性的。
在感染周期末期大量转录的结构基因提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因(弗雷森(FRIESEN)等人，杆状病毒基因表达的调控(TheRegulation of Baculovirus Gene Expression)，杆状病毒分子生物学(THE MOLECULARBIOLOGY OF BACULOVIRUSES)(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因(沃拉克(Vlak)等人，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1988)69：765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中，随后可利用所属领域技术人员已知的技术来纯化生长的斑块。参见米勒(Miller)等人，生物学论文集(BIOESSAYS)(1989)4：91；萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)。
已经开发出了用于感染到数种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发(尤其)用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见WO89/046,699；怀特(Wright)，自然(NATURE)(1986)321：718；卡博耐尔(Carbonell)等人，病毒学杂志(J.VIROL.)(1985)56：153；史密斯(Smith)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1983)3：2156。一般参见弗雷瑟(Fraser)等人，体外细胞和发育生物学(IN VITRO CELL.DEV.BIOL.)(1989)25：225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(英杰公司(Invitrogen Corp.)，目录号11497-013(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
可在市面上购得用于在杆状病毒/表达中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基，且所属领域一般技术人员一般已知细胞培养技术。
大肠杆菌 此项技术中众所周知细菌表达技术。有多种载体可用于细菌宿主中。这些载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在丰富的有关载体的文献、许多载体在市面上有售以及甚至存在描述载体和其限制性图谱及特征的手册，故无需在这里深入讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记物，这些标记物可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记物，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3″)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5′端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵基因的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(诱导性)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因，并由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(例如操纵基因)的情况下，可发生组成性表达。另外，利用基因活化蛋白结合序列可实现正调控，当存在这一序列时，其通常接近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(cataboliteactivator protein，CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[雷波德(Raibaud)等人，遗传学年鉴(ANNU.REV.GENET.)(1984)18：173]。因此，表达的调控可为正调控或负调控，由此增强或减弱转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[常(Chang)等人，自然(NATURE)(1977)198：1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[古德尔(Goeddel)等人，核酸研究(Nuc.ACIDS RES.)(1980)8：4057；耶尔弗顿(Yelverton)等人，核酸研究(NUCL.ACIDS RES.)(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号和第121775号]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[威瑟曼(Weissmann)(1981)“干扰素和其它错误的克隆(The cloning of interferon and other mistakes.)”，干扰素(Interferon)3(I.格雷瑟(I.Gresser)编)]、噬菌体λPL[施马塔克(Shimatake)等人，自然(NATURE)(1981)292：128]和T5[美国专利第4,689,406号]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(例如T7启动子)来诱导高水平的fEPO。此项技术中众所周知所述载体的实例，且其包括来自诺杰公司(Novagen)的pET29系列和WO99/05297中描述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高水平fEPO，同时不会损害宿主细胞生存力或生长参数。
另外，自然界中不存在的合成启动子也可充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列构成的杂合trp-lac启动子，其受lac阻遏物调控[阿曼恩(Amann)等人，基因(GENE)(1983)25：167；德波尔(de Boer)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI).(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其能够与细菌RNA聚合酶结合并起始转录。也可将非细菌来源的天然存在启动子与相容性RNA聚合酶偶合以便在原核生物中高水平表达一些基因。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的一个实例[斯蒂尔(Studier)等人，分子生物学杂志(J.MOL.BIOL.)(1986)189：113；塔波(Tabor)等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.)(1985)82：1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区组成(欧洲公开案第267851号)。
除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点还可用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作沙恩-达尔加诺(Shine-Dalgarno，SD)序列，且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的3-9个核苷酸长的序列[沙恩(Shine)等人，自然(NATURE)(1975)254：34]。据悉，SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[斯特兹(Steitz)等人，“信使RNA中的基因信号和核苷酸序列(Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA)”，生物调控和发育：基因表达(Biological Regulation andDevelopment：Gene Expression)(R.F.古德伯格(R.F.Goldberger)编，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[萨姆布鲁克(Sambrook)等人，“在大肠杆菌中表达克隆的基因(Expression of cloned genes in Escherichia coli)”，分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。这一术语包括经过转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲以相关特性(例如存在编码fEPO的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞的后代。
所属领域一般技术人员众所周知适用于表达fEPO的宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括显示(尤其)具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。细菌宿主一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(BacterialGenetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University ofCalifornia(Berkeley，CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。工业/医药发酵一般使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株为非病原性的，而出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。在本发明方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主为BL21菌株。在本发明方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主为缺乏蛋白酶的菌株(protease minus strain)，包括(但不限于)OMP-和LON-。
一旦建立了重组宿主细胞株(即，已将表达构建体引入宿主细胞中，并分离出具有合适表达构建体的宿主细胞)，就在适于产生fEPO的条件下培养这一重组宿主细胞株。所属领域技术人员将了解，培养重组宿主细胞株的方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。通常使用此项技术中众所周知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的(assimilatable)碳源、氮源和无机盐源并任选含有维生素、氨基酸、生长因子和此项技术中众所周知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可任选含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物生长(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)。
重组宿主细胞可按分批或连续模式培养，其中细胞采集(在fEPO于细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备，优选分批培养和细胞采集。
本发明的fEPO通常在重组系统中表达之后加以纯化。可以利用此项技术中已知的多种方法，从宿主细胞中纯化fEPO。通常，在细菌宿主细胞中产生的fEPO具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明一个实施例中，利用本文中揭示的方法以及此项技术中已知的方法，可容易地在fEPO多肽中进行氨基酸取代，选择的这些取代目的在于增加重组产生的蛋白质的溶解性。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶解产物中收集蛋白质，随后可进一步进行细胞的匀浆化。在具有弱溶解性蛋白质的情况下，可添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(polyethylene imine，PEI)的化合物以诱导部分可溶蛋白质的沉淀。随后宜通过离心作用收集沉淀蛋白质。可使用所属领域技术人员众所周知的多种方法使重组宿主细胞破裂或匀浆化以从细胞内释放包涵体。可使用众所周知的技术来进行宿主细胞的破裂或匀浆化，这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波法、杜恩斯匀浆化(dounce homogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术来使大肠杆菌宿主细胞破裂，从而释放出fEPO的包涵体。已经发现，只利用大肠杆菌宿主细胞通过匀浆器一次，就可以增加呈包涵体形式的不溶性fEPO的产率。在处理fEPO包涵体时，宜使匀浆化时间的重复最少，以便使包涵体产率达到最大，而不会因例如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。
随后，可使用此项技术中已知的多种适合的增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的fEPO。优选用尿素或盐酸胍来溶解fEPO。应使所溶解fEPO-BP的体积最小，由此可使用方便管理的批量大小来产生大批次。在重组宿主可按数千升体积的批次生长的大规模商业环境中，这个因素相当重要。另外，当在大规模商业环境中制造fEPO时，特别是对于人类医药应用来说，如果可能的话，那么应避免会损害机器和容器的苛刻化学品(harsh chemicals)或蛋白质产物本身。本发明方法中已经显示，较温和的变性剂尿素可代替较苛刻的变性剂盐酸胍用于溶解fEPO包涵体。尿素的使用在有效溶解fEPO包涵体的同时，显著降低了对在fEPO的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备造成损害的风险。
当制备呈融合蛋白形式的fEPO时，优选去除融合序列。可通过酶促裂解或化学裂解，优选酶促裂解来去除融合序列。可使用所属领域技术人员众所周知的方法完成融合序列的酶促去除。如所属领域技术人员所了解的，对用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，而反应条件将受酶的选择限定。优选利用众所周知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的fEPO。如所属领域技术人员所了解的，这些方法将由融合序列和fEPO的身份和特性决定。纯化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法或透析法，或者其任何组合。
也优选纯化fEPO以从蛋白质溶液中去除DNA。可利用例如沉淀或离子交换色谱法等此项技术中已知的任何适当方法来去除DNA，但优选通过用核酸沉淀剂(例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括(但不限于)离心或过滤在内众所周知的标准方法使fEPO与沉淀DNA分离。在欲使用fEPO治疗人类的情况中，宿主核酸分子的去除是一个重要因素，并且本发明方法将宿主细胞DNA降低到医药学上可接受的水平。
小规模或大规模发酵方法也可用于蛋白质表达中，这些方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可通过分批、分批进料或连续模式过程进行。
一般使用此项技术中的标准方法来回收本发明的猫EPO多肽。举例来说，可对培养基或细胞溶解产物进行离心或过滤，以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或者透滤到适当缓冲液中以调节制剂供进一步纯化。本发明fEPO的进一步纯化包括从完整形式中分离出脱酰胺化和剪短形式的fEPO变异体。
以下任一种例示性程序可用于纯化本发明的fEPO多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC凝胶过滤(使用(包括(但不限于))SEPHADEX G-75)；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)，制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括(但不限于)，硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE；或萃取。
根据所属领域技术人员已知并使用的标准程序，可将本发明蛋白质(包括(但不限于)，包含非天然氨基酸的蛋白质、针对包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分纯化或实质上纯化到均质。因此，可利用此项技术中众所周知的多种方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。必要时，在制备正确折叠的成熟蛋白质时，可使用蛋白质再折叠步骤。可将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合的方法用于需要高纯度的最终纯化步骤中。在一个实施例中，将制备的针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质)的抗体用作纯化试剂(包括(但不限于))以供包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质的亲和力纯化。必要时，在部分纯化或达到均质后，任选将多肽用于多种应用，包括(但不限于)作为分析组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为产生抗体的免疫原。
除了本文中所述的其它参考文献之外，此项技术中众所周知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括(但不限于)以下文献中描述的方法：R.斯科普斯(R.Scopes)，蛋白质纯化 (Protein Purification)，施普林格-维拉格出版公司(Springer-Verlag)，纽约(N.Y.)(1982)；道彻尔(Deutscher)，酶学方法(Methods in Enzymology)第182卷：蛋白质纯化指南 (Guide to Protein Purification.)学术出版公司(Academic Press，Inc.)纽约(1990)；沙德拉(Sandana)，(1997)蛋白质的生物分离(Bioseparation of Proteins).学术出版公司；博拉格(Bollag)等人(1996)蛋白质方法(Protein Methods)，第2版 威立-利斯出版公司(Wiley-Liss)，纽约；沃克尔(Walker)，(1996)蛋白质技术手册(The Protein Protocols  Handbook)哈曼纳出版社(Humana Press)，新泽西(NJ)；哈瑞丝(Harris)和安吉拉(Angal)，(1990)蛋白质纯化应用：实用方法(Protein Purification Applications：A Practical  Approach)牛津IRL出版社(IRL Press at Oxford)，英格兰牛津(Oxford，England)；哈瑞丝和安吉拉，蛋白质纯化应用：实用方法牛津IRL出版社，英格兰牛津；斯科普(Scopes)，(1993)蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification：Principles and Practice) 第3版 施普林格-维拉格出版公司，纽约；杰森(Janson)和雷顿(Ryden)，(1998)蛋 白质纯化：原理、高分辨率方法和应用(Protein Purification：Principles.High Resolution  Methods and Applications)，第2版 威立VCH出版公司(Wiley-VCH)，纽约；和沃克尔(1998)，有关CD-ROM的蛋白质技术(Protein Protocols on CD-ROM)哈曼纳出版社，新泽西；以及其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽的一个优点在于，蛋白质或多肽通常折叠成其天然构象。然而，在本发明某些实施例中，所属领域技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明一个方面中，任选使表达的蛋白质或多肽变性，随后复性。这可利用此项技术中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)将伴侣蛋白(chaperonin)添加到相关蛋白质或多肽中；将蛋白质溶解于例如盐酸胍等离液剂中；利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说，有时候需要使表达的多肽变性和还原，随后使所述多肽再折叠成优选的构象。举例来说，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到相关翻译产物中。所属领域技术人员众所周知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参见上述参考文献，以及德宾斯基(Debinski)等人，(1993)生物化学志(J.Biol.Chem.)，268：14065-14070；克雷特曼(Kreitman)和帕斯坦(Pastan)(1993)生物结合物化学(Bioconjug.Chem.)，4：581-585；和布奇纳(Buchner)等人，(1992)分析生物化学(Anal.Biochem.)，205：263-270)。举例来说，德宾斯基(Debinski)等人描述了在胍-DTE中使包涵体蛋白质变性和还原。这些蛋白质可在含有(包括(但不限于))氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动，以便与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者反之亦然。
在原核产生fEPO的情况下，由此产生的fEPO可能错误折叠，并因此缺乏生物活性或具有较低生物活性。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般使用例如一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(2-ME))来溶解(其中fEPO也不可溶)、展开和还原多肽链，以使错误折叠的fEPO再折叠。随后在中等浓度的离液剂下，添加氧化剂(例如氧、胱氨酸或胱胺)，以便再形成二硫键。可使用此项技术中已知的标准方法再折叠fEPO，例如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法。fEPO也可与其它蛋白质共折叠，以形成异型二聚体或异型多聚体。再折叠或共折叠之后，优选进一步纯化fEPO。
一般纯化方法 可对包含fEPO的细胞溶解产物或者由任何分离步骤产生的任何fEPO混合物进行多种分离步骤中的任一种，包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附，或者其任何组合和/或重复，可按任何适当次序进行。
用于实施本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上都有销售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统都可从例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City，CA))、拜耳雷德实验公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(加利福尼亚州埃库莱斯(Hercules，CA))和安玛西亚生物科技公司(AmershamBiosciences，Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))获得。包括(但不限于)交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可从这些公司获得。
可使用专用设备(例如泵)更快速地实现平衡，以及本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤，例如洗涤和洗脱。市售的泵包括(但不限于)HILOAD
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泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences)，位于新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及SUPERFRAC
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馏分收集器(安玛西亚生物科技公司，位于新泽西州皮斯卡塔韦)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度的梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和在线混合器(In-Line Mixer)(安玛西亚生物科技公司，位于新泽西州皮斯卡塔韦)。
可使用任何市售监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、pH值和传导率等信息。检测器的实例包括监测器UV-1、UVICORD
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S II、监测器UV-M II、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(安玛西亚生物科技公司，位于新泽西州皮斯卡塔韦)。实际上，整个系统在市面上都有售，包括来自安玛西亚生物科技公司(位于新泽西州皮斯卡塔韦)的各种AKTA
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系统。
举例来说，在本发明的一个实施例中，可通过首先在尿素中使所得的纯化fEPO变性，接着在合适pH值下于含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原fEPO，并使其变性。在另一个实施例中，在尿素中在浓度介于约2M到约9M之间的范围内使fEPO变性，接着在pH值范围为约5.0到约8.0的TRIS缓冲液中稀释。随后可培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，在室温下，将再折叠混合物培育4小时到24小时。随后可进一步分离或纯化经还原和变性的fEPO混合物。如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调整第一fEPO混合物的pH值。另外，可使用此项技术中已知的技术来浓缩第一fEPO混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域一般技术人员众所周知的技术将包含第一fEPO混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液换成适于下一分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱 在一个实施例中，作为任选的额外步骤，可对第一fEPO混合物进行离子交换色谱。一般参见离子交换色谱法的原理和方法(ION EXCHANGECHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS)(目录号18-1114-21，安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences，Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))。市售离子交换柱包括HITRAP、HIPREP
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和HILOAD
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柱(安玛西亚生物科技公司，新泽西州皮斯卡塔韦)。这些柱利用强阴离子交换剂，例如Q SEPHAROSE
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Fast Flow、QSEPHAROSE
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High Performance和Q SEPHAROSE
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XL；强阳离子交换剂，例如SPSEPHAROSE
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High Performance、SP SEPHAROSE
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Fast Flow和SP SEPHAROSE
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XL；弱阴离子交换剂，例如DEAE SEPHAROSEFast Flow；和弱阳离子交换剂，例如CMSEPHAROSE
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Fast Flow(安玛西亚生物科技公司，新泽西州皮斯卡塔韦)。可在纯化过程的任何阶段对fEPO进行阳离子交换柱色谱以分离实质上纯化的fEPO。可使用任何适合的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。在将fEPO吸附到阳离子交换基质上之后，可通过使基质与pH值或离子强度足够高的缓冲液接触，从所述基质中置换出fEPO，来洗脱实质上纯化的fEPO。适用于实质上纯化fEPO的高pH值洗脱的缓冲液包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱可遵循所属领域一般技术人员已知的适合方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。例如参见皮尔森(Pearson)等人，分析生物化学(ANAL BIOCHEM.)(1982)124：217-230(1982)；瑞文斯(Rivier)等人，色谱学杂志(J.CHROM.)(1983)268：112-119；国谷(Kunitani)等人，色谱学杂志(1986)359：391-402。可对fEPO进行RP-HPLC以分离实质上纯化的fEPO。就此而言，可使用具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生化树脂。或者，可使用聚合性树脂。举例来说，可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，这是一种苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合性树脂。此外，可用例如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。含有离子配对剂和有机改性剂(例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗脱缓冲液都可用于从RP-HPLC柱洗脱fEPO。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和三乙基乙酸铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗脱，其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。适用于本文中的洗脱缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术 可对fEPO进行疏水相互作用色谱(HIC)。一般参见疏水相互作用色谱手册：原理和方法(HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHYHANDBOOK：PRINCIPLES AND METHODS)(目录号18-1020-90，安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences，Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))，以引用的方式并入本文中。适合的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，例如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括但不限于，聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)HITRAP
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、HIPREP
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和HILOAD
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柱(安玛西亚生物科技公司，新泽西州皮斯卡塔韦)。简单地说，在装载之前，可使用所属领域一般技术人员已知的标准缓冲液(例如乙酸/氯化钠溶液，或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。在装载fEPO后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的材料，但将fEPO保留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(例如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗脱fEPO。也可利用例如使用磷酸钾梯度的逐渐降低的线性盐梯度来洗脱fEPO分子。随后可例如通过过滤(例如透滤或超滤)来浓缩洗脱液。可利用透滤来去除用于洗脱fEPO的盐。
其它纯化技术可对第一fEPO混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(凝胶过滤的原理和方法(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS)(目录号18-1022-18，安玛西亚生物科技公司，新泽西州皮斯卡塔韦)，以引用的方式并入本文中)、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐，并用适合的缓冲液代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。在本文中所述的各个步骤中，可使用所属领域一般技术人员已知的技术监测fEPO(包括实质上纯化的fEPO)的产率。这些技术也可用于在最后的分离步骤后评估实质上纯化的fEPO的产率。举例来说，可使用具有多种烷基链长度的数个反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC中的任一种来监测fEPO的产率。
可使用例如SDS-PAGE等标准技术，或通过使用蛋白免疫印迹法(Western blot)和ELISA分析测量fEPO，来测定纯度。举例来说，可产生针对由阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收而分离的蛋白质的多克隆抗体。这些抗体也可用于探查污染性宿主细胞蛋白质的存在。
其它纯化程序包括美国专利第4,612,367号中所述的程序，并且包括(但不限于)(1)将包含fEPO多肽的混合物施加到pH值为约7到约9的反相大孔丙烯酸酯共聚物树脂载体上；和(2)用pH值为约7到约9并且含有以体积计约20％到约80％有机稀释剂的水性洗脱液从所述载体上洗脱fEPO多肽，所述有机稀释剂选自由丙酮、乙腈以及丙酮与乙腈的组合组成的群组。
纯化EPO蛋白质的典型方法揭示于1996年11月14日公开的颁予伯格(Burg)的WO 96/35718中，并且将于下文予以描述。Blue Sepharose(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia))由琼脂糖凝胶珠粒和共价结合于其表面上的汽巴蓝(Cibacron blue)染料组成。由于EPO与Blue Sepharose的结合比大多数非蛋白质污染物强，以致在此步骤中可以富集某些蛋白质杂质和PVA、EPO。通过增加盐浓度和pH来进行Blue Sepharose柱洗脱。用80-100 l Blue Sepharose填充所述柱，利用NaOH再生，并用平衡缓冲液(氯化钠/氯化钙和乙酸钠)平衡。装载经过酸化和过滤的发酵罐上清液。在装载完成后，首先用类似于平衡缓冲液的含有较高氯化钠浓度的缓冲液洗涤柱，并依序用TRIS-碱缓冲液洗涤。用TRIS-碱缓冲液洗脱产物，并根据主要洗脱曲线收集到单一洗脱部分中。
Butyl Toyopearl 650 C(东槽公司(Toso Haas))是一种共价偶合有脂肪族丁基残基的基于聚苯乙烯的基质。由于EPO与此凝胶的结合比大部分杂质和PVA都强，使得必需利用含有异丙醇的缓冲液对其进行洗脱。用30-40 l Butyl Toyopearl 650C装填柱，用NaOH再生，用TRIS-碱缓冲液洗涤，并用含有异丙醇的TRIS-碱缓冲液平衡。将BlueSepharose洗脱液调整到柱平衡缓冲液中异丙醇的浓度，并装载到柱上。随后，用具有较高异丙醇浓度的平衡缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(具有高异丙醇含量的TRIS-碱缓冲液)洗脱产物，并根据主要洗脱曲线收集到单一洗脱部分中。
羟基磷灰石超凝胶(Hydroxyapatite  Ultrogel；拜耳赛普公司(Biosepra))是由羟基磷灰石并入琼脂糖基质中(用以改进机械特性)而组成。EPO对羟基磷灰石具有低亲和力，因此可以在比蛋白质杂质低的磷酸盐浓度下洗脱。用30-40l羟基磷灰石超凝胶填充柱，并用磷酸钾/氯化钙缓冲液和NaOH、随后TRIS-碱缓冲液再生。接着，用含有少量异丙醇和氯化钠的TRIS-碱缓冲液进行平衡。将Butyl Toyopearl色谱的含EPO洗脱液装载到柱上。随后，用平衡缓冲液和不含异丙醇与氯化钠的TRIS-碱缓冲液洗涤柱。用含有低浓度磷酸钾的TRIS-碱缓冲液洗脱产物，并根据主要洗脱曲线收集到单一洗脱部分中。
RP-HPLC材料Vydac C4(维达科公司(Vydac))是由硅胶粒子组成，硅胶粒子表面带有C4-烷基链。EPO与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。洗脱是用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行的。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石超凝胶洗脱液，并将其装载于Vydac C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗涤和洗脱。收集各洗脱部分，并立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集在IPC限度内的EPO洗脱部分。
DEAE Sepharose(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia))材料是由二乙氨基乙基(DEAE)基团共价结合于琼脂糖凝胶珠粒的表面而组成。EPO与DEAE基团的结合是由离子相互作用所介导。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除微量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱，并用离子强度较高的缓冲液洗脱EPO。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调整柱体积，以确保EPO的装载量在每毫升凝胶3-10mg EPO的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载HPLC洗脱液的汇集洗脱部分，并用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)从柱洗脱EPO，并根据主要洗脱曲线收集于单一洗脱部分中。将DEAE Sepharose柱的洗脱液调整到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中，并在-70℃下储存。
多种方法和程序可用于评估包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的fEPO蛋白质的产率和纯度，包括(但不限于)布莱德福德分析(Bradford assay)、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯染色SDS-PAGE(coomassie stained SDS-PAGE)、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)，以及所属领域技术人员已知的其它表征蛋白质的方法。
IX.替代系统中的表达
已使用数种策略在非重组宿主细胞、诱变的宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的fEPO多肽。具有反应性侧链的氨基酸(例如Lys、Cys和Tyr)的衍生化会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也是一种并入非天然氨基酸的直截了当的方法。随着近来肽片段的酶促接合和天然化学接合的发展，有可能制造出更大的蛋白质。例如参见P.E.达沃森(P.E.Dawson)和S.B.H.肯特(S.B.H.Kent)，生物化学年评(Annu.Rev.Biochem.)，69：923(2000)。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制子tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的体外提取物中的一般体外生物合成方法，将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参见V.W.柯尼西(V.W.Cornish)，D.孟德尔(D.Mendel)和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed. Engl.)1995，34：621(1995)；C.J.诺伦(C.J.Noren)，S.J.安托尼-卡黑尔(S.J.Anthony-Cahill)，M.C.格雷夫斯(M.C.Griffith)，P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，用于将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation ofunnatural amino acids into proteins)，科学(Science)244：182-188(1989)；和J.D.贝恩(J.D.Bain)，C.G.格雷布(C.G.Glabe)，T.A.迪克斯(T.A.Dix)，A.R.查柏林(A.R.Chamberlin)，E.S.迪阿拉(E.S.Diala)，用于将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中的生物合成方法(Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)111：8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究。
已开发出一种称作选择性压力并入(selective pressure incorporation)的体内方法，来研究野生型合成酶的杂乱性(promiscuity)。例如参见N.鲍里斯(N.Budisa)，C.明克斯(C.Minks)，S.阿尔弗雷德(S.Alefelder)，W.温格尔(W.Wenger)，F.M.董(F.M.Dong)，L.莫罗德(L.Moroder)和R.胡波(R.Huber)，美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)，13：41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度天然氨基酸的基本培养基中，而目标基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽，并且被非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白表达将使含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，曾使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，所述苯丙氨酸在UV光谱中展现两个易于鉴别的特征性肩峰，例如参见C.明克斯(C.Minks)，R.胡波(R.Huber)，L.莫罗德(L.Moroder)和N.鲍里斯(N.Budisa)，分析生物化学(Anal.Biochem.)，284：29(2000)；曾使用三氟甲硫氨酸代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸，以利用19F NMR研究其与低聚壳聚糖配体的相互作用，例如参见H.杜威尔(H.Duewel)，E.道博(E.Daub)，V.罗宾逊(V.Robinson)和J.F.霍尼克(J.F.Honek)，生物化学(Biochemistry)，36：3404(1997)；以及已并入三氟亮氨酸代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参见Y.杨(Y.Tang)，G.格瑞兰达(G.Ghirlanda)，W.A.派特塔(W.A.Petka)，T.中岛(T.Nakajima)，W.F.德格雷多(W.F.DeGrado)和D.A.斯瑞尔(D.A.Tirrell)，德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.).40：1494(2001)。此外，还将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。参见例如W.A.汉迪克森(W.A.Hendrickson)，J.R.霍顿(J.R.Horton)和D.M.雷玛斯特(D.M.Lemaster)，欧洲分子生物学组织期刊(EMBO J.) ，9：1665(1990)；J.O.波利斯(J.O.Boles)，K.莱文斯基(K.Lewinski)，M.坤克(M.Kunkle)，J.D.奥多姆(J.D.Odom)，B.顿雷普(B.Dunlap)，L.勒博达(L.Lebioda)和M.哈塔达(M.Hatada)，自然结构生 物学(Nat.Struct.Biol.).1：283(1994)；N.布迪萨(N.Budisa)，B.斯特普(B.Steipe)，P.德曼基(P.Demange)，C.艾克斯柯恩(C.Eckerskorn)，J.科勒曼(J.Kellermann)和R.胡波(R.Huber)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.).230：788(1995)；和N.布迪萨(N.Budisa)，W.卡恩博克(W.Karnbrock)，S.斯坦恩布奇(S.Steinbacher)，A.汉姆(A.Humm)，L.普雷德(L.Prade)，T.纽费恩德(T.Neuefeind)，L.莫罗德(L.Moroder)和R.胡波(R.Huber)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).270：616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，由此允许借助化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参见J.C.M.范海斯特(J.C.M.vanHest)和D.A.特瑞尔(D.A.Tirrell)，欧 洲生物学化学会联盟通讯(FEBS Lett.)，428：68(1998)；J.C.M.范海斯特(J.C.M.vanHest)，K.L.奇科(K.L.Kiick)和D.A.特瑞尔，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc).122：1282(2000)；以及K.L.奇科和D.A.特瑞尔，四面体通讯(Tetrahedron)，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，都以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，而这种合成酶一般需要高选择性来确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已在少数情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，并引起对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参见M.爱博(M.Ibba)，P.卡斯特(P.Kast)和H.汉尼克(H.Hennecke)，生物化学(Biochemistry)，33：7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来替代苯丙氨酸。例如参见M.爱博(M.Ibba)和H.汉尼克(H.Hennecke)，欧洲生物学化学会 联盟通讯(FEBS Lett.).364：272(1995)；以及N.夏尔玛(N.Sharma)，R.福特(R.Furter)，P.卡斯特(P.Kast)和D.A.特瑞尔(D.A.Tirrell)，欧洲生物学化学会联盟通讯，467：37(2000)。类似地，已显示位于大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点附近的点突变Phe130Ser允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参见F.滨野高久(F.Hamano-Takaku)，T.岩间(T.Iwama)，S.齐藤矢野(S.Saito-Yano)，K.高久(K.Takaku)，Y.门田(Y.Monden)，M.北田(M.Kitabatake)，D.索尔(D.Soll)和S.西村(S.Nishimura)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，275：40324(2000)。
在体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一策略为修饰具有校对机制(proofreadingmechanism)的合成酶。这些合成酶不能区分结构与同源天然氨基酸类似的氨基酸并因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正，使得来自tRNA的错配(mischarged)氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能，并被并入。近来已利用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实了这种方法。参见V.道宁(V.Doring)，H.D.磨兹(H.D.Mootz)，L.A.南格(L.A.Nangle)，T.L.汉迪克森(T.L.Hendrickson)，范德克雷兹拉格德(V.de Crecy-Lagard)，P.斯奇迈尔(P.Schimmel)和P.丽尔(P.Marliere)，科学(Science)，292：501(2001)。ValRS可使带有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后经由编辑结构域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CH3置换)，以致当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示，在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已能够合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参见以下出版物和其中引用的参考文献：克里克F.J.C.(Crick，F.J.C.)，巴雷特L.(Barrett，L.)，布雷纳S.(Brenner，S.)，沃特托比R.(Watts-Tobin，R.)蛋白质遗传密码的一般性质。(General nature of the genetic code for proteins.)自然(Nature)，1227-1232(1961)；霍夫曼K.(Hofmann，K.)，伯恩H.(Bonn，H.)有关多肽的研究。XXXVI.吡唑-咪唑置换对S-肽片段的S-蛋白质活化效力的影响。(Studies on polypeptides.XXXVI.The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment)，美国化学杂志(J.Am Chem)，5914-5919(1966)；卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)生物活性肽和包括酶在内的蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologicallyactive peptides and proteins including enyzmes)，化学研究述评(Ace Chem Res)，47-54(1989)；中塚T.(Nakatsuka，T.)，佐佐木T.(Sasaki，T.)，卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)由半合成酶硫代枯草杆菌蛋白酶催化的肽片段偶合(Peptide segment coupling catalyzed bythe semisynthetic enzyme thiosubtilisin)，美国化学协会杂志(J Am Chem Soc)，3808-3810(1987)；斯奇诺泽M.(Schnolzer，M.)，肯特S B H.(Kent，S B H.)通过接合未受保护的合成肽构建蛋白质：主链经工程改造的HIV蛋白酶(Constructing proteins by dovetailingunprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease)，科学(Science)，221-225(1992)；查肯I.M.(Chaiken，I.M.)半合成肽和蛋白质(Semisynthetic peptides andproteins)，生物化学学报(CRC Crit Rev Biochem)，255-301(1981)；奥夫德R.E.(Offord，R.E.)如何借助化学方式进行蛋白质工程改造？(Protein engineering by chemical means？)蛋白质工程(Protein Eng.)，151-157(1987)；和杰克森D.Y.(Jackson，D.Y.)，伯尼尔J.(Burnier，J.)，权C(Quan，C)，斯坦利M.(Stanley，M.)，汤姆J.(Tom，J.)，威尔斯J.A.(Wells，J.A.)用于总体合成带有非天然催化残基的核糖核酸酶A的设计肽接合酶(A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with UnnaturalCatalytic Residues)，科学(Science)，243(1994)。
已使用化学修饰在体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸在内的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参见，克雷D.R.(Corey，D.R.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)杂交序列特异性单链脱氧核糖核酸酶的产生(Generation of a hybrid sequence-specificsingle-stranded deoxyribonuclease)，科学(Science)，1401-1403(1987)；卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)，劳伦斯D.S.(Lawrence D.S.)，洛克塔S.E.(Rokita，S.E.)酶特异性的化学修饰(The chemical modification of enzymatic specificity)，生物化学评论(Rev Biochem)，565-595(1985)；卡瑟E.T.，劳伦斯D.S.，酶活性位点的化学突变(Chemical mutation ofenyzme active sites)，科学，505-511(1984)；尼特K.E.(Neet，K.E.)，南西A(Nanci A)，柯西兰德D.E.(Koshland，D.E.)硫醇-枯草杆菌蛋白酶的特性(Properties ofthiol-subtilisin)，生物化学杂志(J Biol.Chem.)6392-6401(1968)；博拉格L.B.(Polgar，L.B.)，M.L.含有合成形成的活性位点的新酶。硫醇-枯草杆菌蛋白酶。(A new enzymecontaining a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.)美国化学协会杂志(J.Am  Chem Soc)，3153-3154(1966)；和波拉克S.J.(Pollack，S.J.)，中山G.(Nakayama，G.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)将亲核基团和光谱探针引入抗体结合位点中(Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites)，科学，1038-1040(1988)。
另外，也已经使用采用化学修饰氨酰基-tRNA的生物合成方法，将数种生物物理探针并入体外合成的蛋白质中。参见以下出版物和其中引用的参考文献：布伦纳J.(Brunner，J.)新的光标记和交联方法(New Photolabeling and crosslinking methods)，生物化学年 评(Annu.Rev Biochem)，483-514(1993)；和克雷格U.C.(Krieg，U.C.)，沃特P.(Walter，P.)，霍恩森A.E.(Hohnson，A.E.)信号识别粒子的54kDa多肽新生催乳激素前体的信号序列的光交联(Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad.Sci)，8604-8608(1986)。
先前已证实，在体外通过将以化学方式氨酰基化的抑制子tRNA添加到经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中，可将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用对于特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参见诺伦C.J.(Noren，C.J.)，安托尼-卡黑尔(Anthony-Cahill)，格雷夫斯M.C.(Griffith，M.C.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins)，科学(Science)，244：182-188(1989)；M.W.诺瓦克(M.W.Nowak)等人，科学，268：439-42(1995)；贝恩J.D.(Bain，J.D.)，格雷布C.G.(Glabe，C.G.)，迪克斯T.A.(Dix，T.A.)，查柏林A.R.(Chamberlin，A.R.)，迪阿拉E.S.(Diala，E.S.)将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中的生物合成方法(Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-naturalamino acid into a polypeptide)，美国化学协会杂志(J.Am Chem Soc)，111：8013-8014(1989)；N.鲍里斯(N.Budisa)等人，美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)13：41-51(1999)；埃尔曼J.A.(Ellman，J.A.)，孟德尔D.(Mendel，D.)，安托尼-卡黑尔S.(Anthony-Cahill，S.)，诺伦C.J.，查鲁兹P.G.，将非天然氨基酸位点特异性引入蛋白质中的生物合成方法(Biosynthetic method for introducing unnatural amino acidssite-specifically into proteins)，酶学方法(Methods in Enz.)，301-336(1992)；以及孟德尔D.，柯尼西V.W.(Cornish，V.W.)和查鲁兹P.G.，利用扩充的遗传密码进行定点诱变(Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code)，生物物理与生物大分子结构 评述(Annu Rev Biophys.Biomol Struct.)24，435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制子tRNA，并用非天然氨基酸以化学方式氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的相关位点处引入终止密码子TAG。例如参见赛尔J.R.(Sayers，J.R.)，斯奇米特W.(Schmidt，W.)，艾克斯坦F.(Eckstein，F.)5′，3′核酸外切酶在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸引导诱变中的应用(5′，3′Exonuclease inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸研究(Nucleic Acids  Res)，791-802(1988)。当将酰基化抑制子tRNA和突变基因组合于体外转录/翻译系统中时，对UAG密码子反应而并入非天然氨基酸，得到在指定位置含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe进行的实验和使用α-羟基酸进行的实验证实，仅在UAG密码子指定的位置处并入所需氨基酸，而且未在蛋白质中的任何其它位点并入此氨基酸。例如参见，诺伦(Noren)等人，同上文；小林(Kobayashi)等人，(2003)自然—结构生物学(NatureStructural Biology)10(6)：425-432；和埃尔曼J.A.(Ellman，J.A.)，孟德尔D.(Mendel，D.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)将新颖主链结构位点特异性并入蛋白质中(Site-specificincorporation of novel backbone structures into proteins)，科学(Science)，197-200(1992)。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见，M.W.诺瓦克(M.W.Nowak)，P.C.卡尔雷(P.C.Kearney)，J.R.萨普森(J.R.Sampson)，M.E.萨克斯(M.E.Saks)，C.G.拉伯卡(C.G.Labarca)，S.K.希文曼(S.K.Silverman)，W.G.钟(W.G.Zhong)，J.托森(J.Thorson)，J.N.阿贝森(J.N.Abelson)，N.戴维森(N.Davidson)，P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，D.A.道赫提(D.A.Dougherty)和H.A.莱斯特(H.A.Lester)，科 学(Science)，268：439(1995)；以及D.A.道赫提，化学生物学现代观点(Curr.Opin.Chem. Biol.)，4：645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)与体外产生的以下两种RNA物质共注射：在相关氨基酸位置具有UAG终止密码子的编码目标蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制子tRNA。随后，卵母细胞的翻译机器在UAG指定的位置插入非天然氨基酸。这种方法允许进行一般不适用于体外表达系统的整合膜蛋白的体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中，通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参见G.特卡提(G.Turcatti)，K.尼曼斯(K.Nemeth)，M.D.艾德格顿(M.D.Edgerton)，U.米瑟斯(U.Meseth)，F.塔拉波特(F.Talabot)，M.佩斯奇(M.Peitsch)，J.诺里斯(J.Knowles)，H.沃基尔(H.Vogel)和A.查利特(A.Chollet)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271：19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参见J.P.盖里梵(J.P.Gallivan)，H.A.莱斯特(H.A.Lester)和D.A.道赫提(D.A.Dougherty)，化学与生物学(Chem.Biol.)，4：739(1997)；使用经笼蔽的酪氨酸类似物实时监测离子通道的构象变化，例如参见J.C米勒(J.C.Miller)，S.K.希文曼(S.K.Silverman)，P.M.英格兰德(P.M.England)，D.A.道赫提和H.A.莱斯特，神经元(Neuron)，20：619(1998)；以及使用α羟基氨基酸改变离子通道主链以供探查其门控机制。例如参见P.M.英格兰德(P.M.England)，Y.张(Y.Zhang)，D.A.道赫提(D.A.Dougherty)和H.A.莱斯特(H.A.Lester)，细胞(Cell)，96：89(1999)；以及T.鲁(T.Lu)，A.Y.亭格(A.Y.Ting)，J.玛恩兰德(J.Mainland)，L.Y.简(L.Y.Jan)，P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)和J.杨(J.Yang)，自然—神经科学(Nat.Neurosci.)，4：239(2001)。
在体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力具有多种益处：突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白用于治疗性治疗的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展合理且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能，并产生具有新颖特性的新蛋白质或生物体。然而，过程是困难的，因为要在蛋白质翻译过程中达到高保真度则需要复杂的tRNA-合成酶相互作用性质。
在位点特异性地并入p-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参见R.佛特(R.Furter)，蛋白质科学(Protein Sci.)，7：419(1998)。
也可能使用无细胞(体外)翻译系统来表达本发明的fEPO多聚核苷酸。在这些可包括mRNA作为模板(体外翻译)或DNA作为模板(体外转录与翻译相结合)的系统中，体外合成是由核糖体所引导。曾进行过相当多的尝试来开发无细胞的蛋白质表达系统。例如参见，肯姆D.-M.(Kim，D.-M.)和J.R.斯沃兹(J.R.Swartz)，生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)，74：309-316(2001)；肯姆D.-M.和J.R.斯沃兹，生物技术通讯(Biotechnology Letters)，22，1537-1542，(2000)；肯姆D.-M.和J.R.斯沃兹，生物技术进展(Biotechnology Progress)，16，385-390，(2000)；肯姆D.-M.和J.R.斯沃兹，生物技术与生物工程，66，180-188，(1999)；以及帕特耐克R.(Patnaik，R.)和J.R.斯沃兹，生物技术(Biotechniques)24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，都以引用的方式并入本文中。另一种可用于表达包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参见R.罗伯特(R.Roberts)和J.斯佐塔克(J.Szostak)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.)(USA)94 12297-12302(1997)；A.弗兰克尔(A.Frankel)等人，化学与生物学(Chemistry & Biology)10，1043-1050(2003)。本方法中，在核糖体上将连接嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入所述肽中。在读取了最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽结合物在体外分析中具有引人关注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可筛选出包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的fEPO多肽的文库，以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用纯化的组分进行的体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参见A.福斯特(A.Forster)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.(USA))100 6353(2003)。
X.偶合fEPO的大分子聚合物
可将多种大分子聚合物和其它分子与本发明的fEPO多肽连接，以调节fEPO的生物特性，和/或对fEPO分子提供新颖生物特性。这些大分子聚合物可经由天然编码氨基酸、非天然编码氨基酸，或者天然或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加到天然或非天然氨基酸的任何取代基或官能团与fEPO连接。
本发明提供实质上均质的聚合物：蛋白质结合物制剂。本文中使用的“实质上均质”是指据观察，聚合物：蛋白质结合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物：蛋白质结合物具有生物活性，并且本文中提供的本发明“实质上均质”的聚乙二醇化fEPO制剂是足够均质以展现均质制剂的优势(例如，在临床应用中预测批间药物动力学的容易性)的制剂。
还可选择制备聚合物：蛋白质结合物分子的混合物，且本文提供的优势在于，可选择欲包括在混合物中的单聚物：蛋白质结合物(mono-polymer：protein conjugate)的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数量的连接聚合物部分(即，二聚体、三聚体、四聚体等)的混合物，并将所述结合物与使用本发明方法制备的单聚物：蛋白质结合物组合，得到具有预定的单聚物：蛋白质结合物比例的混合物。
所选聚合物可为水溶性聚合物，以致其连接的蛋白质不会在水性环境(例如生理环境)中沉淀。聚合物可为分支或未分支聚合物。对最终产品制剂的治疗性使用来说，聚合物应为医药学上可接受的。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，二者在反应混合物中的浓度也将变化。一般来说，可由所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量来确定最佳比率(就反应效率来说，因为存在极少量过量的未反应蛋白质或聚合物)。对于分子量，通常聚合物的分子量越高，则可与蛋白质连接的聚合物分子的数量就越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑聚合物的分支情况。一般来说，分子量越高(或分支越多)，则聚合物：蛋白质的比率就越高。
当涵盖PEG:fEPO结合物时，本文中使用的术语“治疗有效量”是指使血细胞比容增加从而对患者提供益处的量。所述量将随个体不同而不同，并且取决于多种因素，包括患者的总体身体状况和贫血症的潜在病因。举例来说，对于患有慢性肾衰竭的患者，fEPO的治疗有效量是每周3次，每次50到150个单位/公斤。疗法中使用的fEPO的量引起可接受的血细胞比容增加率，并将血细胞比容维持在有益的水平(通常为至少约30％，常常在30％到36％的范围内)。所属领域技术人员使用公开可用的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分支形式。通常，水溶性聚合物为聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG描述本发明的某些实施例。
PEG是一种众所周知的水溶性聚合物，其为市售产品，或者可根据此项技术中众所周知的方法，通过使乙二醇开环聚合来制备(萨德勒(Sandler)和卡罗(Karo)，聚合物合成(Polymer Synthesis)，学术出版社(Academic Press)，纽约(New York)，第3卷，第138-161页)。术语“PEG”广泛涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑PEG的尺寸或其末端修饰)，并且可由下式表示成与fEPO连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n为2到10,000，且X为H或末端修饰，包括(但不限于)C1-4烷基。
在一些情况下，本发明中使用的PEG在一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以用反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型的反应性基团可包括常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的那些反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活性碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活性酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，上式中以Y表示的PEG另一端将直接或经由天然存在或非天然编码氨基酸间接连接到fEPO多肽。举例来说，Y可为与多肽氨基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N末端)形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。或者，Y可为与硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)形成的马来酰亚胺键。或者，Y可为与经由20种常见氨基酸通常不可得的残基形成的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与fEPO多肽上的炔基反应形成胡伊斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应形成类似产物。在一些实施例中，强亲核基团(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮反应形成腙、肟或缩氨基脲，适当时，在一些情况下可通过用适当的还原剂处理，再将其还原。或者，强亲核基团可经由非天然编码氨基酸并入fEPO多肽中，并用来优先与水溶性聚合物中存在的酮基或醛基反应。
PEG的任何分子质量可视实际需要使用，包括(但不限于)约1,000Da到100,000Da，或必要时更高(包括(但不限于)有时为1-50kDa或10-40kDa)。还可使用支链PEG，包括(但不限于)各链MW在10-40kDa(包括(但不限于)5-20kDa)范围内的PEG。多种PEG分子描述于(包括(但不限于))肖尔沃特聚合物公司(Shearwater Polymers，Inc.)目录、奈克塔治疗品公司(Nektar Therapeutics)目录中，二者都以引用方式并入本文中。
一般来说，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，可使用带有供与氨基酸侧链反应的炔和叠氮部分的PEG衍生物将PEG与本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常会含有炔部分以形成[3+2]环加成产物，或者会含有含膦基的活性PEG物质(即，酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常会含有叠氮部分以形成[3+2]胡伊斯根环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么PEG通常会包含有效的亲核基团(包括(但不限于)酰肼、羟胺或氨基脲官能团)，以便分别形成相应腙、肟和缩氨基脲键。在其它替代性实例中，可将上述反应性基团的方向反过来，即，非天然编码氨基酸中的叠氮部分可与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的fEPO变异体含有可与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和含乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解，多种水溶性聚合物，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))，也适用于实践本发明，且术语PEG和聚(乙二醇)的使用意涵盖并包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、分支PEG、侧接PEG(即，有一个或一个以上官能团侧接到聚合物主链的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常透明，无色，无臭，可溶于水，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，并且一般无毒。聚(乙二醇)被认为是生物相容的，也就是说，PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更具体地说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说，PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与在体内具有某种所需功能的分子(例如生物活性剂)连接时，PEG倾向于遮蔽这种试剂，并且可减少或消除任何免疫反应，从而使生物体能够容忍所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫反应，或者引起凝血(clotting)或其它不合需要的作用。具有式-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n为约3到约4000，通常为约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明一些实施例中，分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其适用作聚合物主链。
聚合物主链可为线性或分支的。此项技术中一般已知分支聚合物主链。通常，分支聚合物具有中央分支核心部分和与中央分支核心连接的多个线性聚合物链。常用的PEG为分支形式，可通过将环氧乙烷与各种多元醇(例如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成来制备。中央分支部分也可从数种氨基酸(例如赖氨酸)衍生得到。分支聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R衍生自核心部分，例如甘油、甘油低聚物或季戊四醇，且m表示臂的数量。多臂PEG分子(例如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596、WO96/21469和WO 93/21259中所述的分子，各专利以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。
分支PEG也可为以PEG(--YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为连接基团，且Z为通过指定长度的原子链与CH连接的活性末端基团。
另一分支形式，即侧接PEG，具有沿PEG主链而不是在PEG链末端的反应性基团，例如羧基。
除这些形式的PEG外，聚合物还可制备成在主链中具有弱键或可降解键。举例来说，PEG可制备成在聚合物主链中具有可水解的酯键。如下文所示，此水解导致聚合物裂解成分子量较低的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-
所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括此项技术中已知的所有形式，包括(但不限于)本文中揭示的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。适合聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(亚烷基二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其四聚体、其混合物等。尽管聚合物主链各链的分子量可变化，但通常在约800Da到约100,000Da、常常约6,000Da到约80,000Da的范围内。
所属领域一般技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述清单并不详尽而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。
在本发明一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，意思是聚合物主链有至少两个末端且可能多达约300个末端经官能团官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，各末端与相同或不同官能团键接。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-N＝N＝N
其中：
N＝N＝N为叠氮部分；
B为连接部分，其可能存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可能存在或不存在，并且可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且更优选含有介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括杂原子，例如氮、氧或硫。烷基链还可在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且更优选含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些连接基团，所述专利各以全文引用的方式并入本文中。所属领域一般技术人员将认识到，连接部分的上述清单并不详尽而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧基、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、烯烃、酮和叠氮基。如所属领域技术人员所了解，所选X部分应能与叠氮基相容，因此不会与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能性(homobifunctional)的，意思指第二官能团(即，X)也为叠氮部分；或异双官能性的(heterobifunctional)，意思指第二官能团为不同官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或烷基(例如甲基、乙基或叔丁基)。此项技术中已知的其它保护基也可用于本发明中。
文献中末端官能团的具体实例包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(例如参见，美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参见，布克曼(Buckmann)等人，高分子化学(Makromol.Chem.)，182：1379(1981)；泽利浦斯基(Zalipsky)等人，欧洲聚合物杂志(Eur.Polym.J.)19：1177(1983))、酰肼(例如参见，安德瑞兹(Andresz)等人，高分子化学，179：301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(例如参见，奥尔森(Olson)等人，聚(乙二醇)的化学与生物应用(Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications)，第170-181页，哈里斯(Harris)和泽利浦斯基编，ACS出版社，华盛顿哥伦比亚特区(Washington，D.C.)，1997；还参见美国专利第5,672,662号)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(例如参见，阿布托斯奇(Abuchowski)等人，癌症生物化学与生物物理学(Cancer Biochem.Biophys.)7：175(1984)，以及卓普吉(Joppich)等人，高分子化学，180：1381(1979))、琥珀酰亚胺基酯(例如参见，美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参见，美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参见，皮萨(Pitha)等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem.)，94：11(1979)；艾琳(Elling)等人，应用生物化学与生物技术(Biotech.Appl.Biochem.)13：354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参见，比奥查普(Beauchamp)等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)，131：25(1983)；托德力(Tondelli)等人，控释杂志(J.Controlled Release)1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参见，沃尼斯(Veronese)等人，应用生物化学与生物技术，11：141(1985)；以及萨托(Sartore)等人，应用生物化学与生物技术，27：45(1991))、醛(例如参见，哈里斯(Harris)等人，聚合物科学杂志：聚合物化学版(J.Polym.Sci.Chem.Ed.)22：341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参见，古德森(Goodson)等人，生物技术(Bio/Technology)8：343(1990)；罗曼尼(Romani)等人，肽和蛋白质化学(Chemistry of Peptides and Proteins)2：29(1984))，以及克甘(Kogan)，合成通讯(Synthetic Comm.)22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参见，沃赫伦(Woghiren)等人，生物结合物化学(Bioconj.Chem.)4：314(1993))、丙烯醇(例如参见，萨赫雷(Sawhney)等人，高分子(Macromolecules)，26：581(1993))、乙烯基砜(例如参见，美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献都以引用的方式并入本文中。
在本发明某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N
其中：
X为如上文所述的官能团；且
n为约20到约4000。
在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N
其中：
W为包含介于1到10个之间的碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；
n为约20到约4000；且
X为如上文所述的官能团。
可通过此项技术中已知和/或本文中揭示的多种方法制备本发明的含叠氮基PEG衍生物。在下文所示的一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键接且第二末端与适当离去基团键接)与叠氮阴离子(其可与多种适合的平衡离子中的任一种配对，包括钠、钾、叔丁基铵等)反应。离去基团经历亲核置换且经叠氮部分置换，从而提供所需含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如所示，适用于本发明中的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)，X为不与叠氮基反应的官能团，且L为适当的离去基团。适合的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶，以及酮。适合离去基团的实例包括(但不限于)氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基。
在制备本发明含叠氮基聚合物衍生物的另一方法中，使带有叠氮基官能团的连接剂与平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链接触，其中所述连接剂带有会与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应形成含叠氮基聚合物衍生物产物的化学官能团，其中所述叠氮基经连接基团与聚合物主链分开。
例示性反应方案显示如下：
X-PEG-M+N-连接基团-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接基团-N＝N＝N
其中：
PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团，例如烷氧基或如上文所述的官能团；且
M为不与叠氮基官能团反应但与N官能团有效且选择性反应的官能团。
适合官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基团。
可利用已知方法纯化粗产物，所述方法包括(但不限于)沉淀产物，随后视需要进行色谱分离。
更具体实例展示于下文中，在PEG二胺的情况下，其中一个胺经例如叔丁基-Boc等保护基保护，且所得单保护PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N
在此情况下，可使用多种活化剂，例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑，将胺基与羧酸基偶合，从而在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后，可直接使用所得含N-叔丁基-Boc保护的叠氮基的衍生物修饰生物活性分子，或者可进一步精细设计以安装其它有用官能团。举例来说，可通过用强酸处理来水解N-t-Boc基团，产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作合成手柄(handle)来安装其它有用官能团，例如马来酰亚胺基、活性二硫化物、活性酯等，以便产生有价值的异双官能试剂。
当需要将不同分子与聚合物各末端连接时，异双官能衍生物特别有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG允许将具有活性亲电基团的分子(例如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)与PEG的一个末端连接，并将具有乙炔基的分子与PEG的另一末端连接。
在本发明另一实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-C≡C-R
其中：
R可为H或烷基、烯烃、烷氧基，或者芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可能存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可能存在或不存在，并且可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且更优选介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括杂原子，例如氮、氧或硫。烷基链还可在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且更优选含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请案2003/0143596中所述的那些连接基团，所述专利各以全文引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，连接部分的上述清单并不详尽而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的多种连接部分都适用于本发明中。
用作X的适当官能团的实例包括：羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃、酮和乙炔。如应了解的，所选X部分应能与乙炔基相容，以致不会与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能性的，意思指第二官能团(即，X)也为乙炔部分；或异双官能性的，意思指第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
其中：
X为如上文所述的官能团；
n为约20到约4000；且
m介于1与10之间。
各异双官能PEG聚合物的具体实例显示于下文中。
可使用所属领域技术人员已知和/或本文揭示的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键接且第二末端与适当亲核基团键接)与带有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基团的化合物反应。当将带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基团的分子组合时，所述离去基团经历亲核置换且经亲核部分置换，从而得到所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR′
如所示，用于所述反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)将主要经由SN2类机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要经由亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包括氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基，和预期会经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基，和预期会经历亲核试剂加成的其它亲电基团。
在本发明另一实施例中，A为具有1-10个之间碳原子的脂肪族连接基团或具有6-14个之间碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团，且L为适当的离去基团。
在制备本发明含乙炔聚合物衍生物的另一方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da且在一末端带有经保护官能团或封端剂以及在另一末端带有适当离去基团的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
例示性反应方案显示如下：
X-PEG-L+-C≡CR′→X-PEG-C≡CR′
其中：
PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团，例如烷氧基或如上文所述的官能团；且
R′为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或者经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中，离去基团L应具有足够的反应性以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时发生SN2型置换。此项技术中众所周知实现乙炔阴离子对离去基团的SN2置换所需的反应条件。
可借助于此项技术中已知的方法纯化粗产物，所述方法包括(但不限于)沉淀产物，随后视需要进行色谱分离。
可将水溶性聚合物与本发明的fEPO多肽连接。水溶性聚合物可经由并入fEPO多肽中的非天然编码氨基酸，或者非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基，或添加到非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物经由天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并有非天然编码氨基酸的fEPO多肽连接。在一些情况下，本发明的fEPO多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或低聚糖)连接。在一些情况下，本发明的fEPO多肽另外包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些情况下，本发明的fEPO多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未结合形式，本发明中使用的水溶性聚合物增加fEPO多肽的血清半衰期。
可调节与本发明fEPO多肽连接的水溶性聚合物的数量(即，聚乙二醇化或糖基化程度)，从而提供改变(包括(但不限于)增加或降低)的药理学、药物动力学或药效学特征，例如体内半衰期。在一些实施例中，fEPO的半衰期相对于未修饰多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明一个实施例中，利用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的fEPO多肽。
在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000，且X任选为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000。
在本发明另一实施例中，利用含有借助酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的fEPO多肽。
在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000，且X任选为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000。
在本发明另一实施例中，利用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分支PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的fEPO多肽，其中所述分支PEG各链的MW在10-40kDa的范围内，更优选为5-20kDa。
在本发明另一实施例中，利用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽。举例来说，在一些实施例中，以肼或以酰肼为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000，且X任选为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含有氨基脲基的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选为NH、O、S、C(O)，或不存在，m为2到10且n为100到1,000。
在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选为NH、O、S、C(O)，或不存在，m为2到10且n为100到1,000。
水溶性聚合物与fEPO连接的程度和位点可调节fEPO与fEPO受体在位点1的结合。在一些实施例中，键的布置应使得通过平衡结合分析所测量(例如斯派瑟(Spencer)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，263：7862-7867(1988)中所述的分析)，fEPO多肽与fEPO受体在位点1结合的Kd为约400nM或更低、150nM或更低，在一些情况下Kd为100nM或更低。
聚合物活化以及肽结合的方法和化学研究描述于文献中且为此项技术中所知。活化聚合物的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等官能团活化(参见R.F.泰勒(R.F.Taylor)，(1991)，蛋白质固定、基本原则和应用(PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALANDAPPLICATIONS)，马克戴克出版公司(Marcel Dekker)，纽约(N.Y.)；S.S.王(S.S.Wong)，(1992)，蛋白质结合和交联化学(CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSSLINKING)，CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton)；G.T.赫曼森(G.T.Hermanson)等人，(1993)，固定化亲和配体技术(IMMOBILIZED AFFINITY LIGANDTECHNIQUES)，学术出版社(Academic Press)，纽约(N.Y.)；度恩(Dunn，R.L.)等人编，聚合物药物与药物递送系统(POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS)，美国化学学会论文集(ACS Symposium Series)，第469卷，美国化学学会(American Chemical Society)，华盛顿哥伦比亚特区(Washington，D.C.)，1991)。
可利用有关PEG官能化和结合的数篇评论和专题文章。例如参见，哈里斯(Harris)，高分子化学与物理学(Macromol.Chem.Phys.)C25：325-373(1985)；司考顿(Scouten)，酶学方法(Methods in Enzymology)135：30-65(1987)；王(Wong)等人，酶学与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)14：866-874(1992)；戴尔盖多(Delgado)等人，治疗性药物载体系统的评述(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)9：249-304(1992)；泽利浦斯基(Zalipsky)，生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)6：150-165(1995)。
聚合物活化方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中，还可获得活性聚合物与酶之间结合的方法，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(沃伦瑟(Veronese)等人，应用生物化学与生物技术(App.Biochem.Biotech.)11：141-45(1985))。
含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的fEPO多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)是利用任何便利方法进行。举例来说，利用经炔封端的mPEG衍生物使fEPO多肽聚乙二醇化。简单地说，室温下，伴随搅拌，将过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH添加到含对叠氮基-L-Phe的fEPO水溶液中。通常，用pKa接近欲进行反应的pH值(一般为约pH 4-10)的缓冲液对水溶液进行缓冲。举例来说，适于pH 7.5下聚乙二醇化的缓冲液实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监测pH值，并视需要加以调节。反应通常持续约1到48小时。
随后，使反应产物经历疏水相互作用色谱以使聚乙二醇化的fEPO变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和聚乙二醇化fEPO多肽的任何高分子量复合物分离，所述高分子量复合物可在未封闭PEG的分子两端被活化而使fEPO变异体分子交联时形成。疏水相互作用色谱期间的条件应使游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流过柱，而任何交联的聚乙二醇化fEPO变异体复合物在含有与一个或一个以上PEG基团结合的一个fEPO变异体分子的所需形式之后洗脱。适当条件视交联复合物相对于所需结合物的相对尺寸而变化，且容易由所属领域技术人员确定。含有所需结合物的洗脱液利用超滤法浓缩并利用透滤法脱盐。
必要时，可借助于一种或一种以上所属领域技术人员已知的程序进一步纯化由疏水性色谱获得的聚乙二醇化fEPO，所述程序包括(但不限于)亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)、二氧化硅色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用(包括(但不限于)SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差示溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)或萃取。可通过GPC经由与球蛋白标准品比较来估算表观分子量(蛋白质纯化法：一种实用方法(PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH)(哈里斯(Harris)与安吉拉(Angal)编)IRL出版社，1989，293-306)。可通过蛋白水解性降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)随后进行质谱分析来评估fEPO-PEG结合物的纯度。派普斯基B.(Pepinsky B.)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmcol.& Exp.Ther.)297(3)：1059-66(2001)。
可在不受限制的情况下，对与本发明fEPO多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物进行进一步衍生化或取代。
含叠氮基PEG衍生物
在本发明另一实施例中，用含有会与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰fEPO多肽。一般来说，PEG衍生物的平均分子量在1到100kDa范围内，在一些实施例中在10到40kDa范围内。
在一些实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在另一实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，p为2到10且n为100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明另一实施例中，利用含有末端叠氮部分的分支PEG衍生物修饰包含含炔氨基酸的fEPO多肽，其中所述分支PEG各链的MW在10到40kDa的范围内，更优选为5到20kDa。举例来说，在一些实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，p为2到10，n为100到1,000，且X任选为O、N、S或羰基(C＝O)，其在各情况下可存在或不存在。
含炔PEG衍生物
在本发明另一实施例中，用含有会与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰fEPO多肽。
在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，且n为100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明另一实施例中，利用含有借助酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮基或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔非天然编码氨基酸的fEPO多肽。
在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，p为2到10且n为100到1,000。
在本发明另一实施例中，利用含有末端炔部分的分支PEG衍生物修饰包含含叠氮基氨基酸的fEPO多肽，其中所述分支PEG各链的MW在10到40kDa的范围内，更优选为5到20kDa。举例来说，在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2到10，p为2到10，n为100到1,000，且X任选为O、N、S或羰基(C＝O)，或不存在。
含膦PEG衍生物
在本发明另一实施例中，用含有活性官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)且另外包含会与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基的PEG衍生物修饰fEPO多肽。一般来说，PEG衍生物的平均分子量在1到100kDa范围内，在一些实施例中在10到40kDa范围内。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BPA00001374088101201
其中n为1到10；X可为O、N、S，或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BPA00001374088101202
其中X可为O、N、S，或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R″′和R″″各独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。当R′与R″连接到同一氮原子时，其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″拟包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”拟包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和通用聚乙二醇化技术
可与fEPO多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下专利中所述者：例如美国专利公开案第2004/0001838号、第2002/0052009号、第2003/0162949号、第2004/0013637号、第2003/0228274号、第2003/0220447号、第2003/0158333号、第2003/0143596号、第2003/0114647号、第2003/0105275号、第2003/0105224号、第2003/0023023号、第2002/0156047号、第2002/0099133号、第2002/0086939号、第2002/0082345号、第2002/0072573号、第2002/0052430号、第2002/0040076号、第2002/0037949号、第2002/0002250号、第2001/0056171号、第2001/0044526号、第2001/0027217号、第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号、第5,824,778号、第5,476,653号、第5,219,564号、第5,629,384号、第5,736,625号、第4,902,502号、第5,281,698号、第5,122,614号、第5,473,034号、第5,516,673号、第5,382,657号、第6,552,167号、第6,610,281号、第6,515,100号、第6,461,603号、第6,436,386号、第6,214,966号、第5,990,237号、第5,900,461号、第5,739,208号、第5,672,662号、第5,446,090号、第5,808,096号、第5,612,460号、第5,324,844号、第5,252,714号、第6,420,339号、第6,201,072号、第6,451,346号、第6,306,821号、第5,559,213号、第5,612,460号、第5,747,646号、第5,834,594号、第5,849,860号、第5,980,948号、第6,004,573号、第6,129,912号；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、WO 98/05363、EP 809 996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP400 472、EP 183 503和EP 154 316，所述专利都以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
增强对血清白蛋白的亲和力
也可将各种分子与本发明的fEPO多肽融合以调节fEPO的血清半衰期。在一些实施例中，将分子与本发明的fEPO多肽连接或融合以增强对动物体内内源血清白蛋白的亲和力。
举例来说，在一些情况下，制备fEPO多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参见马克雷德(Makrides)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)277：534-542(1996)，以及索兰德尔(Sjolander)等人，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)201：115-123(1997))，或白蛋白结合肽，例如丹尼斯(Dennis)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277：35035-35043(2002)中所述的肽。
在其它实施例中，利用脂肪酸将本发明的fEPO多肽酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参见卡兹霍尔(Kurtzhals)等人，生物化学杂志(Biochem.J.)312：725-731(1995)。
在其它实施例中，将本发明的fEPO多肽与血清白蛋白(包括(但不限于)人血清白蛋白)直接融合。参见例如美国专利第6,548,653号，其以引用的方式并入本文中。
所属领域技术人员将认识到，也可将多种其它分子与本发明中的fEPO连接，以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
XI.fEPO的糖基化
本发明包括并有一个或一个以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的fEPO多肽。糖残基可为天然(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包括(但不限于)3-氟半乳糖)的。可通过N或O连接糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或者相应的C或S连接糖苷)将糖与非天然编码氨基酸连接。
可将糖(包括(但不限于)糖基)部分在体内或体外添加到fEPO多肽中。在本发明一些实施例中，用经氨氧基衍生化的糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的fEPO多肽，以产生经由肟键连接的相应糖基化多肽。一旦与非天然编码氨基酸连接，即可利用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精心制作糖，从而产生结合fEPO多肽的低聚糖。例如参见H.刘(H.Liu)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)125：1702-1703(2003)。
在本发明一些实施例中，利用制备成氨氧基衍生物且具有指定结构的聚糖直接修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的fEPO多肽。所属领域技术人员将认识到，可使用其它官能团，包括叠氮基、炔、酰肼、肼和氨基脲，将糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明一些实施例中，随后可通过(包括(但不限于))分别与(包括(但不限于))炔基或叠氮基衍生物发生胡伊斯根[3+2]环加成反应，来修饰包含含叠氮基或含炔基非天然编码氨基酸的fEPO多肽。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
XII.GH超基因家族成员二聚体和多聚体
本发明也提供GH超基因家族成员组合(包括(但不限于)fEPO)同型二聚体、异型二聚体、同型多聚体或异型多聚体(即，三聚体、四聚体等)，其中例如fEPO等含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员多肽结合于另一GH超基因家族成员或其变异体，或者非GH超基因家族成员的任何其它多肽或其变异体，这一结合是直接结合于多肽主链或是经由连接子结合。由于与单体相比，GH超基因家族成员(例如fEPO)二聚体或多聚体结合物的分子量有所增加，故其可展现新颖或所需的特性，包括(但不限于)相对于单体GH超基因家族成员不同的药理学、药物动力学、药效学；经调节的治疗半衰期；或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的GH超基因家族成员(例如fEPO)二聚体将调节GH超基因家族成员受体的二聚化。在其它实施例中，本发明的GH超基因家族成员二聚体或多聚体将充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，含有fEPO的二聚体或多聚体中存在的一个或一个以上fEPO分子包含连接到水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，其存在于位点II结合区内。因此，所述二聚体或多聚体的各个fEPO分子可经由位点I界面结合fEPO受体，但不能经由位点II界面结合第二fEPO受体。因此，fEPO二聚体或多聚体可接合两个不同的fEPO受体各自的位点I结合位点，但由于fEPO分子具有水溶性聚合物连接到存在于位点II区中的非基因编码氨基酸，故fEPO受体无法接合fEPO配体的位点II区，且所述二聚体或多聚体充当fEPO拮抗剂。在一些实施例中，含有fEPO的二聚体或多聚体中存在的一个或一个以上fEPO分子包含连接到水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，其存在于位点I结合区内，由此允许结合于位点II区。或者，在一些实施例中，含有fEPO的二聚体或多聚体中存在的一个或一个以上fEPO分子包含连接到水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，其存在于非位点I或位点II结合区内的位点，由此使二者均可结合。在一些实施例中，使用在位点I、位点II或两者均可结合的fEPO分子的组合。至少一个具有可供结合的位点I且至少一个具有可供结合的位点II的fEPO分子的组合可提供具有所需活性或特性的分子。此外，位点I和位点II均可供结合的fEPO分子的组合可产生超级激动剂fEPO分子。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽是直接连接，包括(但不限于)经由Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键连接。在一些实施例中，连接的GH超基因家族成员多肽和/或连接的非GH超基因家族成员将包含不同的非天然编码氨基酸来促进二聚化，包括(但不限于)第一fEPO多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔与第二GH超基因家族成员多肽的第二非天然编码氨基酸中的叠氮基经由胡伊斯根[3+2]环加成结合。或者，可将包含含酮非天然编码氨基酸的第一GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽与包含含羟胺非天然编码氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽结合，且所述多肽经由形成相应肟来反应。
或者，两个GH超基因家族成员多肽和/或连接的非GH超基因家族成员是经由连接子连接。可使用任何异双官能连接子或同双官能连接子连接两个GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽，其可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽连接在一起的连接子可为双官能PEG试剂。
在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，所述结构包括：a)在聚合物主链至少第一端上的含叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分；和b)在聚合物主链第二端上的至少第二官能团。第二官能团与第一官能团可相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含分支分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分支分子结构可为树枝状。
在一些实施例中，本发明提供包含一个或一个以上GH超基因家族成员(例如fEP)的多聚体，其是由与水溶性活性聚合物反应而形成，所述聚合物具有以下结构：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n为约5到约3,000，m为2到10，X可为含叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分，且R为可与X相同或不同的封端基、官能团或离去基团。R例如可为选自由以下各基团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧基、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃和酮。
XIII.fEPO活性和fEPO对fEPO受体的亲和力的测量
可如美国专利第5,387,808号、第5,292,654号、第5,278,065号(以引用的方式并入本文中)中所述制备fEPO受体。可使用标准的体外或体内分析测定fEPO多肽的活性。举例来说，在fEPO存在下增殖的细胞系(包括(但不限于)UT-7细胞、TF-1细胞、FDCP-1/mEPOR或脾细胞)可用来监测fEPO受体结合。例如参见怀特顿(Wrighton)等人，(1997)自然—生物技术(Nature Biotechnology)15：1261-1265；美国专利第5,773,569号和第5,830,851号；以引用的方式并入本文中。对于包含非天然氨基酸的未聚乙二醇化或聚乙二醇化fEPO多肽，可使用BIAcoreTM生物传感器(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia))测量激素对其受体的亲和力。已知用于测试fEPO活性的体内动物模型(例如鼠类等)以及猫试验，其包括例如以下文献中所述者：美国专利第6,696,056号；寇兹(Cotes)等人，(1961)自然(Nature)191：1065-1067；美国专利申请公开案第2003/0198691号；和欧洲药典论坛—促红细胞生成素BRP生物学(Pharm Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio)1997(2)，都以引用的方式并入本文中。有关包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的fEPO多肽二聚化能力的分析可如美国专利第6,221,608号(以引用的方式并入本文中)中所述进行。
XIV.效力、功能性体内半衰期和药物动力学参数的测量
可以根据美国专利第6,586,398号、第5,583,272号和美国专利申请公开案第2003/0198691A1号中所述的方案，测定包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的效力和功能性体内半衰期，所述专利都以引用的方式并入本文中。
可利用正常的斯普拉格-道来(Sprague-Dawley)雄性大鼠评估包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的药物动力学参数(每一治疗组N＝5只动物)。使动物接收静脉内25微克/大鼠或皮下50微克/大鼠的单次剂量，并根据预定时程取得约5到7个血样，对于包含非天然编码氨基酸且未结合水溶性聚合物的fEPO多肽，所述时程一般包含约6小时，而对于包含非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物结合的fEPO多肽，一般包含约4天。已在数个物种中充分研究fEPO的药物动力学数据，并且可将其与由包含非天然编码氨基酸的fEPO所获得的数据直接比较。参见莫登提(Mordenti J.)等人，药物研究(Pharm.Res.)8(11)：1351-59(1991)。
可借助此项技术中已知的各种分析来测定本发明fEPO的比活性。本发明的纯化fEPO蛋白的生物活性应使得能够通过注射投予人类患者fEPO蛋白，而引起网织红细胞和红细胞的骨髓细胞产量相比未注射或对照个体组有所增加。可利用根据欧洲药典论坛—促红细胞生成素BRP生物学1997(2)(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2))的方法，测试根据本发明获得并纯化的fEPO突变蛋白或其片段的生物活性。用于测定fEPO活性的另一生物分析是正常红细胞(normocythaemic)小鼠分析(欧洲药典论坛—促红细胞生成素BRP生物学(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2))1997(2))。
XV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)包含一个或一个以上非天然氨基酸的fEPO、合成酶、蛋白质等)任选与(包括(但不限于))适当医药载剂组合用于治疗用途。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。调配物被制备成与投药模式相适应。一般来说，此项技术中众所周知投予蛋白质的方法，并且这些方法适用于投予本发明的多肽。
根据此项技术中众所周知的方法，任选在一个或一个以上适当的体外和/或体内动物疾病模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物，以便确定功效、组织代谢，并估计剂量。具体说来，最初可通过本文中非天然氨基酸相对于天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它适当测量标准(包括(但不限于)，将经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的EPO与天然氨基酸EPO相比较)(即，在相关分析中)来测定剂量。
投药是通过常用于引入分子最终使其与血液或组织细胞接触的任何途径进行。本发明的含非天然氨基酸多肽以任何适当的方式，任选与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投予。向患者投予本发明上下文中所述的这些多肽的适当方法都可使用，而且，尽管可使用一种以上途径投予特定组合物，但某种特定途径经常可提供比另一途径快捷和有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投予的特定组合物以及用于投予组合物的特定方法决定。因此，存在本发明医药组合物的多种适当调配物。
多肽组合物可通过多种途径投予，包括(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经由脂质体投予非天然氨基酸多肽组合物。所属领域技术人员一般已知所述投药途径和适当的调配物。
也可将非天然氨基酸多肽单独或与其它适当组分组合制成气雾剂调配物(即，其可经“雾化”)以经由吸入投予。可将气雾剂调配物放入例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等加压可接受的推进剂中。
适于不经肠投予(例如，经由关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径投予)的调配物包括水性与非水性等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定接受者的血液等渗的溶质；以及水性与非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。经包装核酸的调配物可提供于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中。
不经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体来说，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GCSF、GMCSF、IFNs、白细胞介素、抗体和/或任何其它以医药学方式递送的蛋白质的途径)以及当前使用的调配物，将提供适于本发明非天然氨基酸的优选投药途径以及调配物。
在本发明上下文中，取决于应用，投予患者的剂量足以在患者体内随时间引起有益的治疗反应，或(包括(但不限于))抑制病原体感染，或引起其它适当的活性。所述剂量由特定载体或调配物的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期，和患者的病状，以及欲治疗患者的体重或表面积决定。剂量大小还由在特定患者体内伴随投予特定载体、调配物等的任何不利副作用的存在、性质和程度等决定。
在确定治疗或预防疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)时应投予的载体或调配物的有效量时，医师将评估循环血浆水平、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
举例来说，投予70公斤患者的剂量通常在相当于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而调整。本发明的载体可通过任何已知的常规疗法，包括投予抗体、投予疫苗、投予细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等，来补充治疗条件。
对于投药，投予本发明调配物的速率由相关调配物的LD-50，和/或(包括(但不限于))当适用于患者的质量和总体健康状况时，各种浓度非天然氨基酸的任何副作用的观察结果决定。投药可经由单次剂量或分次剂量实现。
如果输注调配物的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其可接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。经历如发烧、肌肉疼痛和寒战等输注反应的患者，在将进行输注之前30分钟，预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或包括(但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。哌替啶(Meperidine)可用于不能对退热剂和抗组织胺快速反应的较为严重的寒战和肌肉疼痛。视反应的严重性而减慢或中断细胞输注。
本发明的猫EPO多肽可直接投予哺乳动物个体。投药是通过常用于将fEPO引入个体的任何途径进行。尽管在任何给定情况下，最适合的途径将视所治疗病状的性质和严重性而定，但是根据本发明实施例的fEPO多肽组合物包括适于以下投药的组合物：经口、直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、颊内(包括(但不限于)舌下)、阴道、不经肠(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜內、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和透皮投药。投药可为局部的或全身投药。化合物调配物可提供于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中。本发明的fEPO多肽可与医药学上可接受的载剂制备成呈单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物。本发明的fEPO多肽也可通过连续输注(包括(但不限于)使用微型泵，例如渗透泵)、单次团注或缓释积存式调配物投予。
适于投药的调配物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等渗的溶质的水性与非水性溶液、等渗无菌溶液，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性与非水性无菌悬浮液。溶液和悬浮液可由前文所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备得到。
本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投予的特定组合物以及用于投予组合物的特定方法决定。因此，存在本发明医药组合物(包括任选使用的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的多种适当调配物(例如参见雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1985)。
适合的载剂包括含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；二价金属离子，例如锌、钴或铜；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子(salt-forming counterion)，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
本发明的fEPO多肽，包括与例如PEG等水溶性聚合物连接的fEPO多肽，还可以通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分投予。持续释放组合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微胶囊的成形物件形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物相容性材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(朗格(Langer)等人，生物医用材料研究(J.Biomed.Mater.Res.)，15：267-277(1981)；朗格，化学技术(Chem.Tech.)，12：98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯(朗格等人，同上文)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯乙交酯共聚物(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.赛德曼(U.Sidman)等人，生物聚合物(Biopolymers)，22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。可利用本身已知的方法制备含有所述化合物的脂质体：DE 3,218,121；艾普斯坦(Eppstein)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，82：3688-3692(1985)；黄(Hwang)等人，美国国家科学院院刊，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。
可利用以下文献中所述的方法制备经脂质体包埋的fEPO多肽：例如DE 3,218,121；艾普斯坦(Eppstein)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，82：3688-3692(1985)；黄(Hwang)等人，美国国家科学院院刊，77：4030-4034(1980)；EP52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。脂质体的组成和尺寸已为人们所熟知，或者能够凭所属领域技术人员的经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于例如帕克JW(Park JW)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92：1327-1331(1995)；拉斯科D(Lasic D)和帕普卓普洛斯D(Papahadjopoulos D)(编)：脂质体的医学应用(MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES)(1998)；杜蒙德DC(DrummondDC)等人，用于癌症疗法的脂质体药物递送系统(Liposomal drug delivery systems forcancer therapy)，泰彻尔B(Teicher B)(编)：癌症药物新发现和开发(CANCER DRUGDISCOVERY AND DEVELOPMENT)(2002)；帕克JW等人，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)8：1172-1181(2002)；尼尔森UB(Nielsen UB)等人，生物化学与生物物理学文献(Biochim.Biophys.Acta)1591(1-3)：109-118(2002)；玛莫特C(Mamot C)等人，癌症研究(CancerRes.)63：3154-3161(2003)中。
在本发明的上下文中，投予患者的剂量应足以随时间在个体体内引起有益的反应。一般来说，每剂不经肠投予的本发明fEPO多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤患者体重约0.05毫克到每公斤患者体重约1毫克的范围内，但这应服从治疗判断。给药的频率也应服从治疗判断，并且可以比批准用于人类的市售EPO产品的频率更高或更低。一般可通过上述任何投药途径投予本发明的聚乙二醇化fEPO多肽。
XVI.本发明fEPO多肽的治疗应用
本发明的fEPO多肽适用于治疗多种病症。投予本发明的fEPO产物会使人体内形成红细胞。含有fEPO糖蛋白产物的医药组合物的调配浓度应能有效地以各种方式投予经历以红细胞产生较少或缺乏为特征的血液病症的人类患者，所述特征是单独出现或作为病状或疾病的一部分出现。fEPO糖蛋白产物的平均量可不同，具体地说，所述平均量应基于有资质医师的推荐和处方。fEPO的确切量应优先考虑例如以下因素：所治疗病状的确切类型、所治疗患者的状况以及组合物中的其它成分。由此，可以使用本发明的fEPO刺激红细胞产生，并校正降低的红细胞水平。最常见的是，红细胞水平因贫血症而降低。可利用本发明治疗的病状包括由肾功能下降或丧失(慢性肾衰竭)引起的贫血症、由骨髓抑制疗法(例如化疗或抗病毒药物，例如AZT)引起的贫血症、由非骨髓性癌症进展引起的贫血症和由病毒感染(例如HIV)引起的贫血症。也可治疗可能使其它健康个体患上贫血症的病状，例如预期在手术期间发生的血液流失。一般说来，可以用fEPO治疗的任何病状也可用本发明的PEG:fEPO结合物治疗。本发明还提供治疗有效量铁的投予，以便在疗法期间保持较高的红细胞生成。所属领域技术人员可基于利用fEPO的疗法容易地确定欲给予的量。
XVII.实例
提供的以下实例将说明而非限制本发明。
实例1
本实例描述用于选择在fEPO中并入非天然编码氨基酸的优选位点的众多可能标准组中的一者。
本实例说明如何选择fEPO多肽内供引入非天然编码氨基酸的优选位点。使用了分子模型和有关fEPO二级结构的已知信息来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。利用其它fEPO结构和有关fEPO的已知晶体结构信息来检查晶体结构数据集之间一级、二级或三级结构元件的潜在变化。这些结构的座标可从蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)(伯恩斯坦(Bernstein)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)1997，112，第535页)或经由结构生物信息学合作研究组织PDB(Research Collaboratorfor Structural Bioinformatics PDB)(http://www.rcsb.org)得到。除因晶体无序而疏漏的残基124-130、N末端A1和C末端T163、G164、D165和R166残基外，结构模型1CN4含有完整的成熟fEPO 18kDa序列。存在两个二硫桥，即由C7与C161和C29与C33所形成。
本实例中使用的序列编号是根据SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示的成熟fEPO(18kDa变异体)的氨基酸序列。
本实例描述用于选择在fEPO中并入非天然编码氨基酸的优选位点的众多可能标准组中的一者。使用下文所述的标准，用于位点特异性并入非天然编码氨基酸(例如对乙酰基-苯丙氨酸(pAF))的氨基酸位置为以下位置：53、55、116、89、72、86、128、129、130、131、132、133、134、135、31、163、120、76、24、38、37、49、83、21、36。使用了数种EPO晶体结构来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置：这些结构的座标可经由结构生物信息学合作研究组织(www.rcsb.org)从蛋白质数据库(PDB)得到(PDB IDs 1CN4、1EER和1BUY)。使用X射线晶体结构信息，利用Cx程序(品塔(Pintar)等人(2002)生物信息学(Bioinformatics)，2002，第18卷，第980页)来对fEPO分子进行溶剂可接近性计算。计算所有原子的溶剂可接近性，测定每一氨基酸残基的平均Cx值，并显示于图8和图9中。使用以下标准来评估fEPO中供引入非天然编码氨基酸的每一位置：残基(a)根据fEPO的结构分析以及fEPO与1CN4、1EER和1BUY的结构分析(hEPO结合hEPOpb的结晶学结构)，不应干扰任一fEPObp的结合；b)不应受到丙氨酸扫描诱变的影响(比托夫T.(Bittorf，T.)等人，FEBS，336：133-136(1993)，文D.(Wen，D.)等人，JBC，269：22839-22846(1994)，和埃利奥特S.(Elliot，S.)等人，血液(Blood)，89：493-502(1997))；(c)应为表面暴露的并展现最大Cx，从而与周围残基呈现最小范德华(van der Waals)或氢键相互作用；(d)应在fEPO变异体中缺失或可变异(比托夫T.(Bittorf，T.)等人，FEBS，336：133-136(1993)，文D.(Wen，D.)等人，JBC，269：22839-22846(1994))；(e)在用非天然编码氨基酸取代后会引起保守性变化；和(f)可在具有高柔性的区域(包括(但不限于)CD环)或具有结构刚性的区域(包括(但不限于)螺旋B)中发现。此外，利用Cx程序(品塔(Pintar)等人 生物信息学(Bioinformatics)，18，第980页)对fEPO分子进行进一步计算，以评估各蛋白质原子的突出程度(extent of protrusion)。因此，在一些实施例中，非天然编码氨基酸在fEPO中(但不限于)以下一个或一个以上位置进行取代：1位前(即，N末端)、1、2、3、4、7、8、9、10、13、17、20、21、24、25、27、30、31、32、34、36、37、38、40、43、49、50、52、53、54、55、56、58、65、68、69、72、75、76、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、92、93、110、111、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、139、159、161、162、163、164、165、166、167(即，蛋白质的羧基末端)，或其组合。
产生fEPO拮抗剂的一些位点包括：10、11、14、15、96、97、100、103、104、107、110。利用激动剂设计的标准(c)-(e)选择了这些位点。拮抗剂的设计还可包括位点1残基的定点修饰，以增加对fEPObp的结合亲和力。
图3-9显示了位置的模型和选择。图8显示在一些实施例中，非天然编码氨基酸在fEPO中(但不限于)以下一个或一个以上位置进行取代：53、55、116、89、72、86、128、129、130、131、132、133、134、135、31、163、120，或其组合。图9显示在一些实施例中，非天然编码氨基酸在fEPO中(但不限于)以下一个或一个以上位置进行取代：53、55、76、24、116、38、89、37、72、86、49、83、21、36、128、129、130、131、132、133，或其组合。
实例2
本实例详述在大肠杆菌中经修饰fEPO多肽的克隆和表达。
本实例说明如何在大肠杆菌中表达包括非天然编码氨基酸的fEPO多肽。编码fEPO的核苷酸序列的产生一般如马萨鲁(Matthews)等人，(1996)PNAS 93：9471-76中所述。胎肝、成体肝、胎肾和成体肾cDNA文库是克隆编码全长和成熟fEPO的cDNA的模板，其中胎肝得到最佳结果。用于克隆全长和成熟fEPO的引物可以是所属领域技术人员已知的引物，包括
5′cagttacatatgggagttcacgaatgtcctgcctgg3′SEQIDNO：21；和
5′cagttacatatgctccaccaagattaatctgtg3′SEQIDNO：22。可用于此克隆过程的3′引物序列的实例是5′ctgcaactcgagtcatctgtcccctgtcctgcag3′SEQIDNO：23。克隆的反应条件可为94℃下2分钟；以及94℃下30秒、50℃下1分钟、72℃下2分钟和72℃下7分钟，持续30个循环；随后在4℃下终止反应。鉴别出编码fEPO的分子，所述fEPO包括全长fEPO、缺乏N末端信号序列的fEPO的成熟形式，和SNP。在不改变氨基酸序列的情况下，优化供克隆和表达的序列，随后可将编码全长和成熟fEPO的cDNA插入表达载体中，例如pBAD HISc和pET20b表达载体。
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的引入翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的fEPO。O-RS优先利用非天然编码氨基酸将O-tRNA氨酰基化。接着，翻译系统对编码的选择密码子反应，将非天然编码氨基酸插入fEPO中。下表(表2)包括fEPO(全长和成熟fEPO)的序列，以及O-RS和O-tRNA序列，其中一部分用于这些实例中，其它部分用于hEPO，并且可用于或经过优化而用于fEPO。
表2：
Figure BPA00001374088101341
Figure BPA00001374088101351
表3
Figure BPA00001374088101361
Figure BPA00001374088101381
Figure BPA00001374088101391
Figure BPA00001374088101401
Figure BPA00001374088101411
Figure BPA00001374088101431
Figure BPA00001374088101441
Figure BPA00001374088101451
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Figure BPA00001374088101471
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Figure BPA00001374088101491
Figure BPA00001374088101511
Figure BPA00001374088101521
用含有经修饰fEPO基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然编码氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌，允许将非天然编码氨基酸位点特异性并入fEPO多肽中。37℃下，在含有0.01到100mM特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌以高保真度和效率表达经修饰fEPO。大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体的形式产生经His标记的含非天然编码氨基酸fEPO。溶解聚集体，并在变性条件下于6M盐酸胍中亲和纯化。通过在4℃下于50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)中透析过夜，来进行再折叠。随后针对20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析所述材料，接着去除His标签。参见波塞尔(Boissel)等人，(1993)268：15983-93。此项技术中众所周知fEPO的纯化方法(耐雷(Nahri)等人，(1991)JBC，第266卷，第23022-23026页；耐雷等人，(2001)蛋白质工程(ProteinEngineering)，第14卷，第135-140页；达岭(Darling)等人，(2002)生物化学(Biochemistry)第41卷，第14524-14531页；波塞尔(Boissel)等人，(1993)268：15983-93；和WO0032772A2)，并且可借助SDS-PAGE、蛋白免疫印迹分析或电喷雾电离-离子阱质谱(electrospray-ionization ion trap mass spectrometry)确认。
实例3
根据本发明，构建表达猫促红细胞生成素蛋白(fEPO)的抑制表达DNA表达载体。
A.表达载体的构建
图25中所绘示的表达构建体包含8个杂合tRNA基因拷贝，所述杂合tRNA基因编码能够在其同源tRNA合成酶作用下装上对乙酰基苯丙氨酸的tRNA转录物。每一tRNA基因拷贝包括H1启动子区、tRNA序列和聚合酶III转录终止信号。
在tRNA基因后是猿猴病毒SV40复制起点(SVO)，其在瞬时转染后便利表达构建体(载体)在COS细胞中的复制。
随后是相关基因序列的表达盒，在此情况下，所述相关基因序列是猫EPO编码区。在所述表达盒中，首先是人细胞巨化病毒启动子(CMV)，其驱动信使的表达。在此构建体中，所述信使编码猫促红细胞生成素(fEPO)，在其之前依序是天然信号肽(Nat L)。在所述信使之后是牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH)。
随后是表达盒，以小鼠β-球蛋白主要启动子(beta)开始，其位于所述表达盒内由此驱动编码优化的大肠杆菌乙酰苯丙氨酸tRNA合成酶(optimized E.coliacetylphenylalanine tRNA synthetase，OptEcAFRS)、鼠类二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)和沙门氏菌新霉素磷酸转移酶基因(Neo)序列的表达，所述OptEcAFRS、DHFR与Neo序列各自由来源于脑心肌炎病毒基因组的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)分隔开。在Neo序列之后是SV40早期聚腺苷酸化信号(SV)。
这一载体还含有在细菌中复制所需的序列，包括colE1复制起点(pUC Ori)和赋予氨苄青霉素(ampicillin)抗性的β-内酰胺酶基因(Amp)。
EMCV是市售的，cDNA是商业上合成到病毒基因组内的IRES区。对所述cDNA进行PCR(聚合酶链反应)扩增，以便扩增这一DNA，同时添加适于插到编码结构域之间的5′和3′端。834-836位的三核苷酸ATG(基因库寄存编号NC-001479)用作DHFR和Neo序列的起始密码子。
由于文献中指出，在IRES下游的开放阅读框的翻译不如上游的开放阅读框(以5′CAP起始的翻译)有效，故为了使克隆体选择变得容易，采取将DHFR和Neo基因放到独立IRES元件后的策略，以选择性削弱所述占优势的选择性标记物。
产生两种抑制表达载体型式，并称为Lucy F(图25)和Irwin(图26)。Lucy F含有8个tRNA基因拷贝、第二个IRES，和Neo基因。包括Neo基因将允许选择经由用G418处理稳定整合到细胞基因组中的质粒。相比之下，Irwin只含有4个tRNA基因拷贝，并且缺乏第二IRES和Neo。因此，Irwin的尺寸较小，并且更适于瞬时表达受抑制蛋白质，以产生实验水平的蛋白质产量。
B.CHO细胞表达
使用瞬时转染方案，将载体“含Nat L BB-Opti FEPO的Irwin”转染到CHO-S细胞中，所述载体的图谱描绘于图28中，且其序列如表3中所陈列，含有抑制元件并且编码猫EPO蛋白。同时利用野生型fEPO和22个fEPO变异体进行这些转染，以便将琥珀密码子放入编码区内，使其以保留fEPO生物活性和聚糖结构的方式经历抑制。22个fEPO变异体包括图30中所示者：K52、Q86、E89、E31、E21、E37、R131、K116、F133、L130、R53、Y49、T132、A1、S120、R76、P129、S36、D55、A128、E72、R163。实验结果显示，野生型序列表达良好，并且22个不同变异体的抑制表达变化很大，但这22个变异体中至少19个呈现可由ELISA检测的表达。因此，预期本发明抑制表达构建体的一个实施例将表达在多个位置具有琥珀抑制密码子的相关基因序列。
fEPO的瞬时表达可用来适应在产生例如等电点为约pH 4且fEPO高度糖基化(超过质量的40％；这可影响结合效率)的蛋白质过程中的一些技术难题以及适应某种位点可接近性，由此可以使用替代化学(alternate chemistry)和替代表达系统。
实例4
G418抗性细胞系的产生
在本实例中，抑制表达构建体编码在残基1位具有琥珀密码子代替正常丙氨酸残基的经修饰猫EPO。这一表达构建体称为“含Nat L BB-Opti FEPO的Lucy F”，其图谱描绘于图3中，且其序列如图4中所陈列。
将含Nat L BB-Opti FEPO A1的Lucy F(在A1位含有琥珀密码子)转染到CHO-DG44母细胞系中。在每一96孔板中，一式四份，使用0.5、1.0或2.0μg线性DNA转染106个CHO细胞。经由编码新霉素抗性标记物的表达构建体和含有G418的培养基(CHO-S-SFM II+HT)实现稳定转染细胞的优势选择。
鉴别出存活的孔，扩增到小规模(50ml)振荡培养物，并借助ELISA分析评估细胞生产力。获得多个G418抗性细胞分离株，其都产生易于检测的分泌fEPO。具体点说，测定其中两个，即5B5和15B3，在3-4天内分别产生0.07和0.1mg/L，或0.03皮克/细胞/天(pcd)。使用StemCell EPO ELISA KIT(针对人促红细胞生成素的免疫分析；目录号01630)，借助ELISA检测分泌的fEPO。
实例5
A.经由基因组扩增的表达增加
Lucy F抑制表达系统含有编码鼠类DHFR基因的表达盒。由于用于表达的母CHO-DG44细胞系完全缺乏DHFR酶活性(双缺失)，使得有可能通过在含有甲氨蝶呤(MTX)的培养基中进行生长选择来扩增整合的目标基因(鼠类DHFR)。在此扩增过程中，会同时扩增直接连接的蛋白质基因(在本实例中为fEPO)。因此，可能分离出产生较高量fEPO的细胞系。第一轮G418抗性细胞系的选择是利用5nM MTX进行。随后鉴别并表征产生最高量的细胞系(借助ELISA测定)。
使fEPO G418抗性细胞谱系5B5和15B3经历5nM MTX扩增。在每种情况下，扩增后抑制表达水平都有所升高，且列于下文中。
表4
Figure BPA00001374088101581
从上表中可以看出，在5nM MTX下扩增的表达水平升高约3-5倍。预期在逐渐增加的MTX浓度下，后续扩增将使生产力进一步增加。
实例6
在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中瞬时表达22个fEPO变异体。将这些fEPO变异体构建到含有tRNA和RS的表达载体中。将野生型fEPO构建到不含tRNA和RS的另一表达载体中。使用公司开发的转染方法，在pAF存在或不存在下，将质粒(变异与野生型fEPO)转染到CHO细胞中。
野生型fEPO和fEPO变异体的瞬时表达方法
在蒸馏水中制备聚乙烯亚胺(PEI；25kDa线性，来自普利科学公司(Polysciences))的1mg/ml溶液，使用前，将pH值调到7.2，并使用0.22μm过滤器进行无菌过滤。
将CHO细胞(英杰公司(Invitrogen))维持于补充有谷氨酰胺的CHO FreeStyle培养基中。在125ml Erlenmeyer烧瓶(来自康宁公司(Corning))中制备30mL培养液。转染前一天，以0.5×106/ml接种细胞。转染前，利用生长培养基将细胞密度调整到1×106个/mL。转染前，添加浓度为1mM的对乙酰基-苯丙氨酸。将DNA，即37μg DNA溶解于RPMI培养基中，随后将74μL 1mg/mL PEI溶液添加到含有DNA的RPMI培养基中。将其培育15分钟。随后，将DNA与PEI的混合物添加到125ml Erlenmeyer烧瓶中的30ml培养液中。随后，将烧瓶转移到37℃恒温培养箱中，转染后72小时，借助人ELISA分析定量上清液。图30显示了在pAF存在下fEPO变异体的抑制水平。
每一fEPO变异体的抑制水平不同，这是由pAF的位置所调节。在pAF存在下，ELISA分析未检测到K52、Q86和E89。在不存在pAF的情况下，ELISA分析未检测到fEPO变异体。也利用TF-1分析针对功能来分析上清液。本实验的结果显示于图30中。
实例7
TF-1增殖分析和TF-1功能性fEPO分析显示于图11-24中。在T-75烧瓶中，将TF-1细胞以150,000个细胞/毫升接种到生长培养基中过夜，并在分析当天，将细胞以20,000个细胞/孔接种到50μl分析培养基(图11)中。TF-1细胞购自ATCC，并且细胞系由红白血病患者的骨髓细胞建立。这一细胞系显示其生长与IL-1、GMcsf、EPO和fEPO相关。通过TF-1细胞对fEPO反应的增殖情况来测量活性。利用WST-8测量增殖程度。细胞线粒体脱氢酶将四唑盐wst-8裂解成甲臜(formazan)与活细胞的数量成正比。通过测量活细胞产生的甲臜染料溶液在450nm下的吸光度来对染料进行定量(图13、图16、图19、图20、图21)。在图13中，条件是每孔接种40,000、30,000、20,000和10,000个细胞的不同密度的TF-1细胞。使用两种不同的培育时间48小时和72小时，以及两种不同的fEPO浓度(2500ng/mL和500ng/mL)、两种不同的稀释方案(3倍和2.5倍)，并使用饥饿24小时的细胞和未饥饿的细胞。这些实验和功能分析的结果描述并显示于各图式和图式说明中。
实例8
野生型猫促红细胞生成素(fEPO)和fEPO的对乙酰基苯丙氨酸(pAF)变异体的 纯化，以及聚(乙二醇)与pAF变异体的选择性结合
fEPO和pAF变异体的纯化涉及浓缩和透滤，随后三个柱色谱步骤：苯基硼酸酯、阴离子交换和疏水相互作用。在进行聚乙二醇化之前，浓缩纯化的物质，并交换到聚乙二醇化缓冲液中。
UF/DF：浓缩细胞培养物上清液，并交换到X体积倍数(diavolume)的50mM HEPES(pH 8.5)中，随后使用连接到MasterFlex泵的Slice 200(萨托鲁斯(Sartorius Stedim))系统进行色谱柱装载。
苯基硼酸酯(PB)色谱
使用在50mM HEPES(pH 8.5)中平衡的ProSep PB柱，以负捕获模式进行苯基硼酸酯树脂色谱法。将物质收集到流过洗涤液(flow-through wash)(50mM HEPES，pH8.5)中。在50mM HEPES、50mM山梨糖醇(pH 8.5)、50mM Tris、6M尿素(pH 8.5)和100mM乙酸中，通过阶梯式洗脱去除杂质。
如上文所述，通过UF/DF将来自PB流过液的物质交换到20mM Tris(pH 8.0)中，随后装载到阴离子交换色谱柱上。
阴离子交换色谱(AEX)
使用装有Q Sepharose高效柱的XK 16柱(GE医疗集团，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))纯化物质，流速120cm/h。将物质装载到用20mM Tris(pH 8.0)平衡的柱上。使用线性AB梯度进行洗脱，其中缓冲液A＝20mM Tris(pH 8.0)，缓冲液B＝20mM Tris、500mM NaCl(pH 8.0)。收集固定体积的洗脱部分，并借助SDS-PAGE和抗EPO ELISA进行分析。
疏水相互作用色谱(HIC)
在3.5M硫酸铵中稀释含有fEPO的AEX汇集物，得到最终1.5M的硫酸铵浓度。将物质装载到用20mM Tris、1.5M硫酸铵(pH 8.0)平衡的Phenyl Sepharose高效树脂上，流速120cm/h。经20CV线性AB梯度进行洗脱，其中A＝20mM Tris、1.5M硫酸铵(pH 8.0)，且B＝20mM Tris、50％(体积比)乙二醇(pH 8.0)。收集固定体积的洗脱部分，并借助SDS-PAGE和抗EPO ELISA进行分析。
fEPOpAF变异体的聚乙二醇化
汇集相关洗脱部分，并用VivaSpin柱10 000MWCO，在15000x g下浓缩到约5mg/ml，每次离心10分钟。将样品交换到20mM乙酸钠、1mM EDTA(pH 4.0)中。使用20kD PEG-氧基胺(PEG-oxyamine)(萨布赖特公司(Sunbright)ME200-CA)和1％(重量/体积比)用乙酸调到pH 4.0的乙酰肼，使用12∶1(摩尔比)的PEG∶蛋白质，进行聚乙二醇化。在28℃下进行聚乙二醇化超过12小时，并借助SDS-PAGE分析(图31、图32和图33)。用30kDa PEG将变异体A1聚乙二醇化，用40kDa PEG将变异体Y49聚乙二醇化，用20kDa PEG将变异体R53聚乙二醇化，用30kDa PEG将变异体D55聚乙二醇化，用30kDa PEG将变异体P129聚乙二醇化。
实例9
本实例详述含羰基氨基酸的引入以及与含氨氧基PEG的后续反应。
本实例说明一种产生fEPO多肽的方法，这一多肽并有含酮非天然编码氨基酸，所述氨基酸随后与约5,000MW的含氨氧基PEG反应。用具有以下结构的非天然编码氨基酸分别取代残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128中的每一者：
Figure BPA00001374088101611
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入fEPO中的序列揭示于表2中，且序列(例如mutfRNA和TyrRS LW1、5或6)如上文所述。
一旦经修饰，就使包含含羰基氨基酸的fEPO变异体与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。使以10mg/mL溶解于25mM MES(西格玛化学品公司(Sigma Chemical)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))(pH 6.0)、25mM Hepes(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)(pH 7.0)中或者溶解于10mM乙酸钠(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)(pH 4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的纯化fEPO与10到100倍过量的含氨氧基PEG反应，随后在室温下搅拌10到16小时(杰克斯W.(Jencks，W.)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1959，81，第475页)。随后将PEG-fEPO稀释于适当缓冲液中以便立即进行纯化和分析。
实例10
与由羟胺基经由酰胺键与PEG连接组成的PEG的结合。
使用上文实例中所述的程序，将具有以下结构的PEG试剂与含酮非天然编码氨基酸偶合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R＝甲基，n＝4且N为约20,000MW。反应条件、纯化条件和分析条件如上文实例中所述。
实例11
本实例详述如何将两种不同的非天然编码氨基酸引入fEPO中。
本实例说明一种产生在以下残基中两个位置并有包含酮官能团的非天然编码氨基酸的fEPO多肽的方法：N24X*和G113X*；N38X*和Q115X*；N36X*和S85X*；N36X*和A125X*；N36X*和A128X*；Q86X*和S126X*，其中X*表示非天然编码氨基酸。如上文实例中所述制备fEPO多肽，但在核酸内两个不同位点引入抑制密码子。
实例12
本实例详述fEPO多肽与含酰肼PEG的结合以及随后的原位还原。
根据上文实例中所述的程序，制备并有含羰基氨基酸的fEPO多肽。修饰后，即将具有以下结构的含酰肼PEG与fEPO多肽结合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW，且X为羰基(C＝O)。使含对乙酰基苯丙氨酸的纯化fEPO以0.1到10mg/mL溶解于25mM MES(西格玛化学品公司(SigmaChemical)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))(pH 6.0)、25mM Hepes(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)(pH 7.0)中或者溶解于10mM乙酸钠(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)(pH 4.5)中，与10到100倍过量的含氨氧基PEG反应，并通过添加溶解于水中的1M NaCNBH3储备液(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)达到10到50mM最终浓度，来原位还原相应腙。所述反应在4℃到室温下于暗处进行18到24小时。通过添加约pH 7.6的1M Tris(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)达到50mM的最终Tris浓度来终止反应，或者稀释于适当缓冲液中以供立即纯化。
实例13
本实例详述将含炔氨基酸引入fEPO中的过程以及用mPEG-叠氮化物进行的衍生化。
用以下非天然编码氨基酸分别取代以下残基：21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128：
Figure BPA00001374088101621
用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入fEPO中的序列是muttRNA等，如上文实例中所述。使用上文所述的条件，在大肠杆菌中表达含炔丙基酪氨酸的fEPO多肽，并纯化。
将以介于0.1到10mg/mL之间浓度溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH＝8)中的含炔丙基-酪氨酸的纯化fEPO和10到1000倍过量的含叠氮基PEG添加到反应混合物中。随后将催化量的CuSO4和Cu线添加到反应混合物中。培育混合物(包括(但不限于)在室温或37℃下约4小时，或者在4℃下过夜)后，添加H2O并使混合物滤过透析膜。借助于(包括(但不限于))上文实例中所述的类似程序分析样品的加成反应。
在本实例中，PEG将具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。
实例14
本实例详述炔丙基酪氨酸对fEPO中大的疏水性氨基酸的取代。
如上文实例中所述，用非天然编码氨基酸取代fEPO中以下一个区域内存在的Phe、Trp或Tyr残基：1-7(N末端)、27-38(在A螺旋与B螺旋之间的区域)、39-41(β折叠1)、42-46(在β折叠1与微螺旋B′之间的区域)、47-52(微B′螺旋)、53-54(在微B′螺旋与B螺旋之间的区域)、84-89(在B螺旋与C螺旋之间的区域)、114-121(微C′螺旋)、122-132(在微C′螺旋与β折叠2之间的区域)、133-135(β折叠2)、136-137(在β折叠2与D螺旋之间的区域)、162-166(C末端)，所述非天然编码氨基酸如下：
Figure BPA00001374088101631
修饰后，即将PEG与包含含炔氨基酸的fEPO变异体连接。PEG将具有以下结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
并且偶合程序遵循上文实例中所述的程序。这将产生包含非天然编码氨基酸的fEPO变异体，所述非天然编码氨基酸与天然存在的大的疏水性氨基酸中的一者大致是等排的(isosteric)，并且在所述多肽内的不同位点经PEG衍生物修饰。
实例15
本实例详述如何产生由一个或一个以上PEG连接子分隔开的fEPO同型二聚体、异型二聚体、同型多聚体或异型多聚体。
使上文实例中所述的含炔fEPO变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n为4，且PEG的平均MW为约5,000；由此产生两个fEPO分子经由PEG物理分隔的相应fEPO同型二聚体。可以用类似方式使fEPO多肽与一种或一种以上其它多肽偶合，形成异型二聚体、同型多聚体或异源多聚体。偶合、纯化和分析都如上文实例中所述进行。
实例16
本实例详述糖部分与fEPO的偶合。
如上文实例中所述，用以下所示的非天然编码氨基酸取代一个以下残基：21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162。
Figure BPA00001374088101641
修饰后，即使包含含羰基氨基酸的fEPO变异体与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β连接的氨氧基类似物反应。将fEPO变异体(10mg/mL)和氨氧基糖(21mM)混入100mM乙酸钠缓冲水溶液(pH 5.5)中，并在37℃下培育7到26小时。通过在环境温度下，将结合糖的fEPO(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖基转移酶(0.4个单位/毫升)在150mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中培育48小时，在酶作用下，将第二糖与第一糖偶合(斯查布奇尔(Schanbacher)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1970，245，5057-5061)。
实例17
本实例详述如何产生聚乙二醇化fEPO拮抗剂。
如上文实例中所述，用以下所示的非天然编码氨基酸取代一个以下残基：21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162。
Figure BPA00001374088101651
修饰后，即使包含含羰基氨基酸的fEPO变异体与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基，n为4且N为20,000MW；由此产生包含非天然编码氨基酸的fEPO拮抗剂，并且在多肽内的单一位点经PEG衍生物修饰。偶合、纯化和分析都如上文实例中所述进行。
实例18
fEPO分子直接相连接的fEPO同型二聚体、异型二聚体、同型多聚体或异型多聚体的产生
可以将包含含炔氨基酸的fEPO变异体与包含含叠氮基氨基酸的另一fEPO变异体直接偶合，其各自在上文实例中所述的位点包含非天然编码氨基酸取代。这将产生两个fEPO变异体在位点2结合界面物理连接的相应fEPO同型二聚体。可以用类似方式使fEPO多肽与一种或一种以上其它多肽偶合，形成异型二聚体、同型多聚体或异型多聚体。偶合、纯化和分析都如上文实例中所述进行。
实例19
Figure BPA00001374088101652
使聚亚烷基二醇(P-OH)与烷基卤化物(A)反应，形成醚(B)。在这些化合物中，n为1到9的整数，且R′可为直链或支链、饱和或不饱和的C1到C20烷基或杂烷基。R′也可以为C3到C7饱和或不饱和环烷基或环杂烷基、经取代或未经取代的芳基或杂芳基，或经取代或未经取代的烷芳基(烷基为C1到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常，P-OH是分子量为800到40,000道尔顿(Da)的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例20
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol；新日生物技术公司(Sunbio))。随后将溶解于二甲苯中成为80重量％溶液的炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，阿尔德里奇公司(Aldrich))和催化量的KI添加到溶液中，并将所得混合物加热到回流，保持2小时。接着添加水(1mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集得到的沉淀，用数份冷乙醚洗涤，并干燥，得到炔丙基-O-PEG。
实例21
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol；新日生物技术公司(Sunbio))。随后，将50当量5-氯-1-戊炔(0.53mL，5mmol，阿尔德里奇公司(Aldrich))和催化量的KI添加到混合物中。将所得混合物加热到回流，保持16小时。接着添加水(1mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集得到的沉淀，用数份冷乙醚洗涤，并干燥，得到相应的炔。
实例22
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
向3-羟基苯甲醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先添加粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，随后添加溶解于二甲苯中成为80重量％溶液的炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。在回流下加热反应混合物6小时。向混合物中添加10％柠檬酸(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥并浓缩，得到3-炔丙氧基苯甲醇。
在0℃下，将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到化合物3(2.0g，11.0mmol)于CH2Cl2中的溶液中，并将反应物放入冰箱中，保持16小时。常规处理后，得到浅黄色油状的甲磺酸酯。将此油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流，保持1小时，随后冷却到室温。向混合物中添加水(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到所需溴化物。
将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，新日生物技术公司(Sunbio))溶解于THF(20mL)中，并在冰浴中冷却溶液。在用力搅拌下，经数分钟添加NaH(6mg，0.25mmol)，随后添加由上述获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。移开冷却浴，并将所得混合物加热到回流，保持12小时。将水(1.0)添加到混合物中，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。逐滴添加到乙醚溶液(150mL)中，得到白色沉淀，收集沉淀，得到PEG衍生物。
实例23
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR′→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR′
也可通过使含末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与上文所示的含有炔官能团的反应性分子偶合，获得含末端炔的聚(乙二醇)聚合物。
实例24
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)，并在室温下搅拌溶液过夜。所得粗NHS酯7不经进一步纯化即用于下一反应中。
将分子量为5,000Da的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，新日生物技术公司(Sunbio))溶解于THF(50mL)中，并将混合物冷却到4℃。在用力搅拌下，分数份添加NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时升温到室温。接着添加水(2mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(50mL)，并分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集所得沉淀，并在真空中干燥。
实例25
本实例提供聚(乙二醇)甲烷磺酰基酯(也可称为聚(乙二醇)甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可以用类似程序制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下，将mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)在150mL甲苯中共沸蒸馏2小时，并将溶液冷却到室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)添加到溶液中。在冰浴中冷却溶液，并逐滴添加1.2mL蒸馏过的甲烷磺酰氯(15mmol)。室温下，在氮气下搅拌溶液过夜，并通过添加2mL无水乙醇中止反应。在真空下蒸发混合物，去除溶剂(主要是除甲苯外的溶剂)，过滤，再次在真空下浓缩，随后沉淀到100mL乙醚中。用数份冷乙醚洗涤滤液，并在真空中干燥，得到甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中，并将溶液冷却到4℃。向冷却的溶液中添加叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下，将反应物加热到回流，保持2小时。随后蒸发溶剂，并用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机部分，并用无水MgSO4干燥。将体积减少到20ml，并通过添加到150ml冷无水乙醚来沉淀产物。
实例26
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可使用美国专利5,998,595中所述的方法制备4-叠氮基苯甲醇。在0℃下，将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到4-叠氮基苯甲醇(1.75g，11.0mmol)的CH2Cl2溶液中，并将反应物放入冰箱中，保持16小时。常规处理后，得到浅黄色油状的甲磺酸酯。将此油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流，保持1小时，随后冷却到室温。向混合物中添加水(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到所需溴化物。
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，新日生物技术公司(Sunbio))，并将溴化物(3.32g，15mmol)与催化量的KI添加到混合物中。将所得混合物加热到回流，保持12小时。将水(1.0)添加到混合物中，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。逐滴添加到乙醚溶液(150mL)中，得到沉淀，收集沉淀，得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例27
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于饱和NaHCO3水溶液(10mL)中，并将溶液冷却到0℃。在用力搅拌下，添加3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时后，添加20mL H2O，并在室温下，再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调到3，并添加NaCl达到约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物，并在真空下干燥，得到ω-羧基-叠氮基PEG衍生物。
实例28
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-OCH2-CH2-C≡C-H
用力搅拌下，向如此项技术中所知般制备并冷却到-78℃的乙炔锂(4当量)于THF中的溶液中逐滴添加mPEG-OMs溶解于THF中得到的溶液。3小时后，使反应物升温到室温，并通过添加1mL丁醇中止反应。随后添加20mL H2O，并在室温下，再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调到3，并添加NaCl达到约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物，并在真空下干燥，得到ω-羧基-叠氮基PEG衍生物。
实例29
使用以下文献中所述的方法，将含叠氮基和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白质中：L.王(L.Wang)等人(2001)，科学(Science)292：498-500；J.W.秦(J.W.Chin)等人，科学301：964-7(2003)；J.W.秦等人(2002)，美国化学协会杂志(Journal of the  American Chemical Society)124：9026-9027；J.W.秦和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，(2002)，化学与生物化学(ChemBioChem)11：1135-1137；J.W.秦等人(2002)，美国国家科学院 院刊(PNAS United States of America)99：11020-11024；以及L.王和P.G.查鲁兹，(2002)，化学通讯(Chem.Comm.)，1-10。并入氨基酸后，即在37℃下，于2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg铜线存在下，利用含0.01mM蛋白质的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer，PB；pH 8)进行环加成反应4小时。
实例30
利用正常红细胞小鼠分析测定聚乙二醇化fEPO的体外和体内活性
对小鼠投予PEG-fEPO、未修饰的fEPO和缓冲溶液。结果将显示，在每只小鼠使用相同剂量时，如由网织红细胞数量显著增加和网织红细胞数量最大值移位所指示，与未修饰的fEPO相比较，本发明的聚乙二醇化fEPO具有优良的活性和较长的半衰期。
此项技术中已知正常红细胞小鼠生物分析(欧洲药典论坛—促红细胞生成素BRP生物学(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio)1997(2))。用BSA-PBS稀释样品。对7到15周龄的正常健康小鼠皮下投予0.2ml本发明的聚乙二醇化fEPO。从投药后72小时开始，在4天期间，通过尾静脉穿刺抽取血液并稀释，以致在1ml 0.15μmol吖啶橙染色溶液中存在1μl血液。染色时间为3到10分钟。在流式细胞仪中，通过分析红色荧光直方图(每30,000个分析的血液细胞)以显微荧光法进行网织红细胞计数。每一研究组由每日5只小鼠组成，且只对小鼠抽取一次血液。
生物分析 此外，使用fEPO受体结合分析和细胞增殖分析(利用Ba/F3-fEPOR细胞增殖测定生物活性)评估本发明fEPO多肽的体外生物活性。各分析的方案描述于怀特顿(Wrighton)等人(1997)自然—生物技术(Nature Biotechnology)15：1261-1265，以及美国专利第5,773,569号和第5,830,851号中。根据本发明制备的fEPO多肽的EC50值是产生利用重组促红细胞生成素获得的最大活性50％所需的化合物浓度。
实例31
有关包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO的安全性和/或功效的临床试验
目标 比较皮下投予的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组猫EPO与市售hEPO产品PROCRIT或ARANESP的安全性和药物动力学。
患者 在此研究中登记18只外形(年龄和重量)类似的健康猫。个体无临床上显著异常的血液学或血清化学实验室值，以及具有阴性尿液毒理学筛选、HIV筛选和乙型肝炎表面抗原。其不应具有以下迹象中的任一者：高血压；任何原发性血液病病史；显著的肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖器、代谢、神经疾病的病史；贫血或癫痫病症的病史；对细菌或哺乳动物来源的产物、PEG或人血清白蛋白的已知敏感性；习惯并大量消费含有咖啡因(caffeine)的饮料；参与任何其它临床试验或在研究开始的30天内输过血或献过血；在研究开始的3个月内暴露于hEPO或fEPO；在研究开始的7天内生病；以及在研究前身体检查时或在研究开始的14天内的临床实验室评估时具有显著异常。可针对安全性评估所有个体，并且如期收集所有血液收集物以供药物动力学分析。所有研究都是在伦理委员会(institutional ethics committee)批准和患者同意的情况下进行。
研究设计 这是一项在健康雄性志愿者中的I期、单中心、开放标签、随机、二阶段交叉的研究。将18只个体随机分派到两个治疗序列组的一个中(每组9只个体)。在两个单独给药期中，使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO和所选市售产品，在大腿上部通过单次皮下注射(bolus s.c.injection)来投予EPO。市售产品的投药剂量和频率在包装标签中说明。需要时可通过包括其它个体组而将使用市售产品的其它给药、给药频率或其它参数加入到研究中。各给药期如人试验型式一样间隔一段时间截止期(例如，14天的清洗期(washout period))。在两个给药期中的每一个中给药之前至少12小时和之后72小时，将个体限定在研究中心，而在给药期之间不用。如果同时欲测试聚乙二醇化fEPO的其它给药、频率或其它参数，那么可添加其它个体组。本研究中可以使用批准使用的多种EPO调配物。以PROCRIT
Figure BPA00001374088101711
销售的依泊汀α和/或以ARANESP
Figure BPA00001374088101712
销售的达贝泊汀都是市售的EPO产品，也已经用于治疗动物。fEPO的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO。
血液取样在投予EPO之前和之后通过直接静脉穿刺抽取一系列血液。在给药前约30分钟、20分钟和10分钟时(3个基线样品)和给药后大约以下时间时获得静脉血样(5mL)供测定血清促红细胞生成素浓度：30分钟和1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时。将各血清样品分成两个等分试样。所有血清样品都在-20℃下储存。血清样品在干冰上运送。在第1天初始剂量之前立即、第4天早晨、第16天给药之前立即以及第19天早晨，进行空腹临床实验室试验(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 使用放射免疫(RIA)试剂盒程序(诊断系统实验公司(DiagnosticSystems Laboratory[DSL])，德克萨斯州韦伯斯特(Webster TX))测定血清促红细胞生成素浓度。市售RIA是一种双抗体竞争性方法，其使用针对尿促红细胞生成素的兔多克隆抗血清作为初级抗体，以及经125I标记的尿促红细胞生成素作为示踪剂。在标准和质量控制样品中，依泊汀α或达贝泊汀取代DSL试剂盒中提供的尿促红细胞生成素。分析中所用的标准浓度为7.8、15.6、31.3、50、62.5、100和125mIU/mL。灵敏度(定义为提供可接受精确度的最小标准的平均后退拟合(back-fit)值)为8.6mIU/mL，而分析范围经由质量控制稀释扩大到2,000mIU/mL。
安全性测定 在每次给药前立即(第1天和第16天)和每次给药后6、24、48和72小时时记录生命指征。安全性测定是建立在不利事件的发生率和类型以及临床实验室试验相比基线的改变的基础上。此外，评估生命指征测量(包括血压)和身体检查结果相比研究前的改变。
数据分析 通过从各给药后值减去平均基线促红细胞生成素浓度(经由对来自给药前30、20和10分钟时收集的三个样品的促红细胞生成素含量取平均值而测定)，来针对给药前基线促红细胞生成素浓度校正给药后血清浓度值。如果给药前血清促红细胞生成素浓度低于此分析的定量水平，那么这些给药前血清促红细胞生成素浓度不包括在平均值的计算中。由针对基线促红细胞生成素浓度校正的血清浓度数据确定药物动力学参数。在数字设备公司(Digital Equipment Corporation)的VAX 8600计算机系统上，使用最新版本的BIOAVL软件，通过模型独立方法计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(tmax)；使用线性梯形法则计算的从时间零点到最后一次血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及自消除速率常数计算的终末消除半衰期(t1/2)。消除速率常数是通过线性浓度对数-时间曲线图的终末线性区域中连贯数据点的线性回归来估算的。计算每种治疗的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保存的调配物/非保存的调配物)。
安全性结果 不利事件的发生率在治疗组之间均等分布。与基线或研究前临床实验室试验或血压相比不存在临床上显著的改变，并且身体检查结果和生命指征测量值与研究前相比不存在明显改变。两个治疗组的安全性特征应看起来相似。
药物动力学结果 将在接收单次剂量的市售hEPO(PROCRIT
Figure BPA00001374088101721
或ARANESP
Figure BPA00001374088101722
)之后所有18只个体的平均血清促红细胞生成素浓度-时间曲线(未针对基线促红细胞生成素含量校正)与聚乙二醇化fEPO和/或可用的研究或市售fEPO相比较。在每一测量的时间点，供比较的聚乙二醇化fEPO是本发明的一种，其包含非天然编码氨基酸。所有个体的给药前基线促红细胞生成素浓度应在正常生理范围内。由针对给药前平均基线促红细胞生成素浓度校正的血清数据确定药物动力学参数，并且确定Cmax和tmax。hEPO(PROCRIT
Figure BPA00001374088101723
)的平均tmax明显比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的tmax短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO的终末半衰期相比，hEPO(PROCRIT
Figure BPA00001374088101724
)的终末半衰期值明显较短。
尽管本研究是在健康个体中进行，但预期在其它患者群体中将存在类似的吸收特性和安全性特征，这些群体例如：患有癌症或慢性肾衰竭的患者、伴随损伤诱发性贫血的损伤后患者、儿科肾衰竭患者、在自体预存项目(autologous predeposit program)中的患者或预定择期手术的患者。
总之，皮下投予单次剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO是安全的，并且为健康个体良好耐受。基于相当的不利事件发生率、临床实验室值、生命指征和身体检查结果，研究/市售EPO、hEPO(PROCRIT)和包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO的安全性特征是等同的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化fEPO有潜力为患者以及保健护理者提供重大的临床效用。
实例32
聚乙二醇化fEPO变异体的体内活性
PEG对蛋白质活性持久性的影响至少部分取决于PEG的大小和结构(线性对分支)。利用健康猫来评估PEG大小不同的fEPO变异体增加血细胞比容(Hct)的能力比较。
在中国仓鼠卵巢细胞表达系统中表达在A1位含有对氨基苯丙氨酸(pAF)取代的重组fEPO变异体。在非天然氨基酸取代位点，用20kD、30kD或40kD氧氨基PEG对蛋白质进行聚乙二醇化。在由20mM NaPO4、140mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯-80(pH 6.2)组成的调配物缓冲液中调配聚乙二醇化fEPO变异体。
自A类供应商购得24只重约3-6kg的健康猫(12只雄性/12只雌性)，并使其适应研究场所、其饮食和饲养程序。登记到本研究前第14天和第7天，收集基线血样。给猫服镇静剂乙酰丙嗪(acepromazine)和异氟烷(isoflurine)，以减小收集血样的压力。选择无疾病临床病征且Hct值在健康猫的正常参考范围内的动物，登记到本研究中。
使用随机区组设计将猫分派到四个治疗组中的一个中，各治疗组之间的基线血细胞比容均等。
表5
  治疗   给药方案   动物数量
1)调配物缓冲液   SIDX1   6(3M/3F)
2)fEPO A1 pAF-20K PEG   8μg/kg，SIDX1   6(3M/3F)
3)fEPO A1 pAF-30K PEG   8μg/kg，SIDX1   6(3M/3F)
4)fEPO A1 pAF-40K PEG   8μg/kg，SIDX1   6(3M/3F)
治疗前第0天抽取动物血液，并称重。通过皮下注射对动物进行其指定的治疗一次。
治疗后第3、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38和42天，再收集血样。测定每一样品的血细胞比容。还测量每日饲料消耗，并且每日观察动物的任何健康问题。
各种治疗对血细胞比容和RBC的影响显示于图36中。
在给药3天内，利用20kD或30kD聚乙二醇化fEPO变异体，观察到Hct值相对于缓冲液对照组明显增加。到治疗后约10天，用40kD PEG变异体治疗的动物的Hct值相对于缓冲液对照组明显增加。用20kD PEG变异体治疗的动物在第10天、用30kDPEG变异体治疗的动物在第14天，以及用40kD PEG变异体治疗的动物在第17天，观察到最大Hct值。在给药后至少28天里，用20或30kD PEG变异体治疗的动物的血细胞比容明显高于缓冲液对照组。这些结果表明，每月投予PEG fEPO一次应足以支持较高Hct含量的维持。在研究期间，未观察到不良事件。
实例33
聚乙二醇化fEPO变异体对贫血猫的功效
可利用患有III期或IV期慢性肾病(CKD)的猫来评估聚乙二醇化fEPO变异体恢复患有贫血症的猫的正常红细胞(RBC)数量的能力。患有此病状的猫因肾实质细胞(其为内源fEPO的主要来源)丧失而展现中度到重度非再生性贫血。
为了评估聚乙二醇化fEPO增加患有CKD和贫血症的猫的红细胞数量的能力，使12只(6只雄性和6只雌性)重约3-6kg、具有CKD临床病史且血细胞比容＜30％的猫适应研究场所、其饮食和饲养程序。登记入本研究之前第14天和第7天收集的血样中的血细胞比容和RBC计数用作每只动物的基线对照值。
使用随机区组设计，将猫分派到3个治疗组中的一个中，各治疗组之间的基线血细胞比容和RBC均等。每一治疗组含有4只动物(2只雄性/2只雌性)。经由皮下注射投予一剂剂量在2-8□g/kg范围内的聚乙二醇化fEPO。
治疗后第3、7、10、14、17、21、24、28和31天，再收集血样。测定每一样品的血细胞比容和RBC计数。还测量每日饲料消耗，并且每日观察动物情绪低落和/或无精打采的临床病征并评分，以评估生活质量。
通过将治疗后的血细胞比容和RBC计数与投予蛋白质之前获得的基线值相比较，来确定功效。如果平均每日血细胞比容和RBC计数值相对于基线值展现统计学显著的增加，或者如果在治疗后期间的任一时间点，平均每日值增加达到这些参数的正常参考范围值内，那么认为所述蛋白质是有效的。
应了解，本文所述的实例和实施例仅出于说明性目的，并且将对所属领域技术人员暗示根据所述实例和实施例的各种修改或改变，这些修改和改变都将包括在本申请案的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。本文所引用的所有公开案、专利和专利申请案都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
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Figure IPA00001374087500021
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Claims (77)

1.一种猫促红细胞生成素(fEPO)多肽，其特征在于，包含非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽与至少一另一fEPO多肽连接。
3.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
4.根据权利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
5.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。
6.根据权利要求5所述的fEPO多肽，其特征在于，所述双官能聚合物与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的fEPO多肽，其特征在于，所述第二多肽为非fEPO多肽。
8.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，包含至少两个氨基酸连接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物。
9.根据权利要求8所述的fEPO多肽，其特征在于，至少一个与所述水溶性聚合物连接的氨基酸为非天然编码氨基酸。
10.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQ
ID NO：2中选自由残基1-7、27-54、84-89、114-137、162-166组成的群组的位置进行取代。
11.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQ
ID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165和166。
12.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136和162，以及其组合。
13.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQ
ID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130和162，以及其组合。
14.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128，以及其组合。
15.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：24、36、38、58、65、83、86、113、115、126和其组合。
16.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO多肽对促红细胞生成素受体的亲和力的取代、添加或缺失。
17.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
18.根据权利要求16所述的fEPO多肽，其特征在于，包含在SEQ ID NO：2中选自由但不限于以下组成的群组的氨基酸取代：S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A和K154A，以及其组合。
19.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，而所述水溶性聚合物另外对20种常见氨基酸中的任一种无反应性。
20.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
21.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基。
22.根据权利要求21所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
Figure FPA00001374088000021
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、
芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽，或氨基末端修饰基团；
且R4为H、氨基酸、多肽，或羧基末端修饰基团。
23.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
24.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
25.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含肼基。
26.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
27.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
28.根据权利要求27所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
Figure FPA00001374088000031
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
29.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含炔基。
30.根据权利要求29所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
Figure FPA00001374088000032
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
31.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于约1kDa与约100kDa之间。
32.根据权利要求31所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于1kDa与50kDa之间。
33.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含羰基氨基酸的fEPO多肽与包含氨氧基、羟胺基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应而制成。
34.根据权利要求33所述的fEPO多肽，其特征在于，所述氨氧基、羟胺基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键与所述聚(乙二醇)分子连接。
35.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含非天然编码氨基酸的多肽反应而制成，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、羟胺基、酰肼基或氨基脲基。
36.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含炔氨基酸的fEPO多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应而制成。
37.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含叠氮基氨基酸的fEPO多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应而制成。
38.根据权利要求36或37所述的fEPO多肽，其特征在于，所述叠氮基或炔基是经由酰胺键与所述聚(乙二醇)分子连接。
39.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是分支或多臂聚合物。
40.根据权利要求39所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分支聚合物各分支的分子量介于5kDa与30kDa之间。
41.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述多肽是促红细胞生成素拮抗剂。
42.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO：2中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基包括但不限于V11、R14、Y15、D96、K97、S100、R103、S104、T107、L108和R110，以及其组合。
43.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
44.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
45.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，连接到水溶性聚合物的所述非天然编码氨基酸是存在于所述fEPO多肽的位点II区内。
46.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，连接到水溶性聚合物的所述非天然编码氨基酸通过防止所述fEPO拮抗剂结合于第二个fEPO受体，来防止所述fEPO受体二聚化。
47.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，除亮氨酸外的氨基酸取代SEQID NO：2中的L108。
48.根据权利要求47所述的fEPO多肽，其特征在于，精氨酸取代SEQ ID NO：2中的L108。
49.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
50.根据权利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物经由糖部分与所述多肽连接。
51.一种分离的核酸，其特征在于，包含在严格条件下与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
52.根据权利要求51所述的分离的核酸，其特征在于，所述选择密码子选自由以下组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子。
53.一种制备根据权利要求4所述的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离的fEPO多肽与水溶性聚合物接触，所述水溶性聚合物包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分。
54.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
55.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且所述水溶性聚合物包含氨氧基、羟胺部分、酰肼部分或氨基脲部分。
57.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且所述水溶性聚合物包含叠氮部分。
58.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且所述水溶性聚合物包含炔部分。
59.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量介于约1kDa与约100kDa之间。
60.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分为分支或多臂聚合物。
61.一种组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的fEPO多肽和医药学上可接受的载剂。
62.根据权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
63.一种治疗所患病症受fEPO调节的患者的方法，其特征在于，包含对所述患者投予治疗有效量的根据权利要求61所述的医药组合物。
64.一种细胞，其特征在于，包含根据权利要求51所述的核酸。
65.根据权利要求64所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含正交tRNA合成酶和正交tRNA。
66.一种制备包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含，在允许表达所述包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码fEPO多肽且包含选择密码子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及从所述细胞中纯化所述fEPO多肽。
67.一种增加fEPO的血清半衰期或循环时间的方法，其特征在于，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在fEPO中的任一个或多个氨基酸。
68.一种fEPO多肽，其特征在于，由具有SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ IDNO：26或SEQ ID NO：27中所示序列的多聚核苷酸编码，在所述fEPO多肽中，至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代。
69.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
70.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
71.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO：3中选自由以下组成的群组的位置进行取代：残基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165和166。
72.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
73.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于约1kDa与约100kDa之间。
74.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于5kDa与40kDa之间。
75.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚乙二醇部分为分支或多臂聚合物。
76.一种医药组合物，其特征在于，包含根据权利要求68所述的fEPO多肽和医药学上可接受的载剂。
77.一种非人促红细胞生成素多肽，其特征在于，具有选自由SEQ ID NO：30；SEQID NO：31；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的群组的氨基酸序列，其中所述非人促红细胞生成素多肽包含非天然编码氨基酸取代或添加。
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