CN103690936A - 经修饰的人类生长激素 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经冷冻干燥的激素组合物以及包含所述激素组合物的医药组合物；所述激素组合物包含人类生长激素（hGH）；所述人类生长激素包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在SEQ ID NO:2中位置35处的氨基酸是用一非天然编码的氨基酸取代；通过于取代SEQ ID NO:2中位置35处的非天然编码的氨基酸以及一30kDa线性聚乙二醇（PEG）分子之间形成一肟键，而使所述人类生长激素与所述聚乙二醇分子共价相连；其中，所述激素组合物为95%的纯hGH；其中，当经皮下投予哺乳动物时，所述生长激素的平均血清半衰期为包含无所述PEG的生长激素的组合物的血清半衰期的至少约7倍，且使胫骨长度增加。

Description

经修饰的人类生长激素
分案说明
本申请案是申请日为2005年12月21日，申请号为200580044464.1（国际申请号为PCT/US2005/046542），发明名称为“经修饰的人类生长激素”的专利申请的分案申请。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2004年12月22日申请的美国临时专利申请案第60/638,616号与2005年10月17日申请的美国临时专利申请案第60/727,996号的优先权，将所述申请案的说明书全文并入本文中。
技术领域
本发明涉及经至少一个非天然编码的氨基酸修饰的生长激素多肽。
背景技术
生长激素（GH）超基因家族（Bazan,F.Immunology Today11:350-354(1990);Mott,H.R.和Campbell,I.D.Current Opinion in Structural Biology5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.(1996)SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS）代表一组具有类似结构特征的蛋白质。此蛋白质家族中的每个成员皆包含一个四螺旋束，在图1中显示其一般结构。虽然在此家族中仍有较多成员有待于鉴别，但是其中的一些成员包括以下蛋白质：生长激素、催乳激素、胎盘催乳质、促红细胞生成素（EPO）、血栓形成素（TPO）、白细胞间介素-2（IL-2）、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12（p35亚单位）、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和心肌营养素-1（CT-1）（“GH超基因家族”）。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但它们具有类似的二级和三级结构。共有的结构特征使基因家族的新成员容易被鉴别。在图2、图3、图4和图5中分别显示家族成员hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的一般结构。
人类生长激素（hGH）为GH超基因家族成员之一。人类生长激素参与正常人类生长发育的许多调节。此种天然存在的单链垂体激素由191个氨基酸残基组成且具有约22kDa的分子量。hGH展现众多生物效应，尤其包括线性生长（体质形成，somatogenesis）、泌乳、巨噬细胞的活化以及类胰岛素效应和致糖尿病效应（Chawla,R.等人，Ann.Rev.Med.34:519-547(1983);Isaksson,O.等人，Ann.Rev.Physiol,47:483-499(1985);Hughes,J.与Friesen,H.，Ann.Rev.Physiol,47:469-482（1985））。
hGH的结构已为我们所熟知（Goeddel,D.等人，Nature281:544-548（1979）），并且已通过X射线结晶学求解出hGH的三维结构（de Vos,A.等人，Science255:306-312（1992））。所述蛋白质具有紧凑的球状结构，包含四个两亲α螺旋束，其被称为自N端开始的由环连接的A-D。hGH还含有四个半胱氨酸残基，其参与形成两个分子内二硫键：C53与C165配对且C182与C189配对。此激素不被糖基化且已在大肠杆菌（E.coli）中以分泌型表达（Chang,C等人，Gene55:189-196（1987））。
许多天然存在的hGH突变体已得以鉴别。这些突变体包括hGH-V（Seeburg,DNA1:239（1982）；美国专利第4,446,235号、第4,670,393号和第4,665,180号，其以引用的方式并入本文中）和含有hGH的残基32-46的缺失的20-kDa hGH（Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta925:314(1987);Lewis,U.等人，J.Biol.Chem.,253:2679-2687（1978））。此外，已经报道由转录后、翻译后、分泌、代谢加工和其它生理过程产生的众多hGH变异体（Baumann,G.,Endocrine Reviews12:424（1991））。
hGH的生物效应源自其与特定细胞受体的相互作用。此激素为包括胎盘催乳质和催乳激素的同源蛋白质的家族成员。然而，在家族成员之中，hGH为不寻常的，原因在于它呈现广泛的种特异性且与经克隆的体因性（somatogenic）受体（Leung,D.等人，Nature330:537-543（1987））或催乳激素受体（Boutin,J.等人，Cell53:69-77（1988））相结合。基于结构和生物化学研究，已经提出催乳结合域和体因性结合域的功能图（Cunningham,B.与Wells,J.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:3407（1991））。hGH受体为造血/细胞因子/生长因子受体家族的成员，所述家族包括一些其它生长因子受体，诸如，白细胞间介素（IL）-3、白细胞间介素-4和白细胞间介素-6受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）受体、促红细胞生成素（EPO）受体以及G-CSF受体。参见，Bazan,Proc.Natl.Acad.SciUSA87:6934-6938（1990）。细胞因子受体家族的成员含有四个保守的半胱氨酸残基和色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序，其刚好位于跨膜区外。保守序列被认为与蛋白质之间的相互作用有关，参见，例如，Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184:485-490（1992）。hGH与其受体（hGHbp）胞外域之间的相互作用为最为良好理解的激素-受体相互作用之一。高分辨率X射线结晶数据（Cunningham,B.等人，Science,254:821-825（1991））已经显示，hGH具有两个受体结合部位且使用分子上的独特部位依序地与两个受体分子相结合。将两个受体结合部位称为部位I与部位II。部位I包括螺旋D的羧基末端和螺旋A的部分以及A-B环，而部位II涵盖螺旋A的氨基端区和一部分螺旋C。GH与其受体的结合以部位I首先结合而依序发生。接着，部位II啮合第二GH受体，导致受体二聚和引起对激素产生细胞反应的细胞内信号传递路径的活化。已将G120R取代引入部位II中的hGH突变蛋白能与单个hGH受体结合，但不能使两个受体发生二聚化。突变蛋白估计可能通过占据受体部位但不使细胞内信号传递路径活化而在体外充当hGH拮抗剂（Fuh,G.等人，Science256:1677-1680（1992））。
重组hGH被用作治疗剂且已得到批准用于治疗许多适应症。hGH缺乏会导致（例如）侏儒症，此病症已经通过激素的外源性投药而得到十多年的成功治疗。除hGH缺乏以外，hGH还已被批准用于治疗肾衰竭（在儿童中）、特纳氏综合症（Turner's Syndrome）和AIDS患者的恶病质。近期，食品和药物管理局（FDA）已批准将hGH用于治疗非GH依赖性身材矮小。目前也正在对hGH用于治疗老年人的老龄化、虚弱、短肠综合症和充血性心力衰竭进行调查研究。hGH治疗的靶向群体包括患有特发性身材矮小（ISS）的儿童和具有类GHD症状的成年人。
目前，重组hGH是作为日用可注射产品来出售，其中目前市场上有五种主要产品：HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM（Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono）。然而，使用生长激素作为治疗剂的重大挑战是，蛋白质在活体内的半衰期短，且因此它必须通过每日的皮下注射来投予以获得最大疗效（MacGillivray等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.81:1806-1809（1996））。大量努力集中于通过降低生产成本、使将药投予患者更容易、改善功效和安全性概况以及产生将提供竞争性优势的其它性质来改善hGH促效剂和拮抗剂的投药的方法上。举例而言，Genentech与Alkermes以前出售Nutropin DepotTM，一种hGH的储库型（depot）配方，其用于儿科生长激素缺乏症。虽然储库型配方允许较低频率的投药（每2-3周一次而非每日一次），但它也伴有诸如生物利用率下降和注射部位处疼痛的不良副作用，并于2004年被撤出市场。近期，另一种产品PegvisomantTM（Pfizer）也已得到FDA的批准。PegvisomantTM为hGH的基因工程化类似物，它起着被指示用于治疗肢端肥大症的高选择性生长激素受体拮抗剂的作用（van der Lely等人，The Lancet358:1754-1759（2001））。尽管PegvisomantTM中的一些氨基酸侧链残基用聚乙二醇（PEG）聚合物得到衍生，但所述产品仍要每日投予一次，此表明药剂学性质不为最佳的。除聚乙二醇化和储库型配方之外，包括hGH吸入剂型和口服剂型的其它投药途径正处于临床前和临床研制的早期阶段，且均尚未获得FDA的批准。因此，对展现生长激素活性但也提供较长血清半衰期以及（因而）更好的hGH最佳治疗水平和增长的治疗半衰期的多肽存在需求。
亲水性聚合物聚(乙二醇)（简写为PEG）的共价连接为一种增加包括蛋白质、肽的许多生物学活性分子，且尤其为疏水性分子的水溶性、生物可用性，增加其血清半衰期，增加其治疗半衰期，调节其免疫原性，调节其生物活性或延长其循环时间的方法。已将PEG广泛地用于药品中，用在人工移植物上，且用于其中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性为很重要的其它应用中。为使PEG的所要性质最佳化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高，以赋予通常与PEG聚合物连接有关的有利特性（诸如，增加的水溶性和循环半衰期），同时不会对母体分子的生物活性产生不利影响。
PEG衍生物常常通过反应性化学官能团（诸如，赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基）、N端和碳水化合物部分连接于生物活性分子。蛋白质和其它分子常具有可用于聚合物连接的有限数量的反应性部位。通常，最适合于通过聚合物连接来修饰的部位在受体结合中发挥着重要作用，并且是保持分子的生物活性所必需的。从而，将聚合物链不加选择地连接至生物活性分子上的这些反应性部位常常会导致聚合物修饰分子的生物活性显著下降或甚至完全丧失。R.Clark等人，（1996），J.Biol.Chem,271:21969-21977。为形成具有赋予靶分子所要优势的足够聚合物分子量的结合物，现有技术方法通常涉及众多聚合物臂与分子的随机连接，进而增加了母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的危险性。
形成用于使PEG衍生物与蛋白质连接的基因座的反应性部位是为蛋白质结构所支配的。包括酶的蛋白质是由各种α-氨基酸序列所组成，所述α-氨基酸具有一般结构H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分（H2N--）与一邻近氨基酸的羧基部分（--COOH）连接以形成酰胺键，所述酰胺键可表示为--(NH--CHR--CO)n--，其中下标“n”可能为数百或数千。由R表示的片段可含有用于保持蛋白质生物活性并用于连接PEG衍生物的反应性部位。
举例而言，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位置以及α位置上存在有--NH2基团。ε--NH2在碱性pH条件下可自由反应。用PEG使蛋白质衍生化的领域中的许多技术已经贯注于研制用以连接至存在于蛋白质中的赖氨酸残基ε--NH2部分的PEG衍生物。“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”，Nektar MolecularEngineering Catalog，2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同局限性，即它们不能被选择性地定位于存在于蛋白质表面上的常为无数个的赖氨酸残基之中。在例如存在于酶活性部位中的赖氨酸残基对蛋白质活性为很重要的状况下，或在赖氨酸残基在调节蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用的状况下，如在受体结合部位的状况下，此种局限性可为重大局限性。
现有蛋白质PEG化方法的第二个且同等重要的复杂性为，PEG衍生物可与除了那些所希望的残基以外的残基发生不希望有的副反应。组氨酸含有结构上表示为--N(H)--的反应性亚氨基部分，但与ε--NH2反应的许多化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有结构上表示为-SH的游离巯基。在一些情况下，针对于赖氨酸的ε--NH2的PEG衍生物也会与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。此可产生PEG衍生化生物活性分子的复杂异质混合物，并且冒有破坏所靶向生物活性分子的活性的危险。将希望研制PEG衍生物，其允许将化学官能团引入蛋白质内的单个部位处，所述化学官能团接着将使一种或一种以上PEG聚合物能够与生物活性分子在蛋白质表面上明确且可预测的特定部位处选择性地偶合。
除赖氨酸残基之外，此项技术中的大量努力已针对于靶向其它氨基酸侧链（包括半胱氨酸、组氨酸和N端）的活化PEG试剂的研制。参见，例如，美国专利第6,610,281号，其以引用的方式并入本文中；和“Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation”，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。可使用定点突变和所属领域中已知的其它技术，将半胱氨酸残基以部位选择性方式引入蛋白质的结构中，且所得游离巯基部分可与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法是复杂的，原因在于游离巯基的引入会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性复杂化。因而，将希望拥有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其使一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性地偶合，而同时与巯基和通常存在于蛋白质中的其它化学官能团相容（即，不在不希望有的副反应中与巯基和通常存在于蛋白质中的其它化学官能团发生啮合）。
如从所属领域的抽样可见，这些已被研制用于连接蛋白质的侧链（特别为连接赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分）的衍生物中有许多已被证明在其合成和使用中是有问题的。一些衍生物与蛋白质形成不稳定的键，所述键易于发生水解且因此分解、降解或不然在水相环境中（诸如，在血流中）为不稳定的。一些衍生物形成较稳定的键，但在键形成之前易发生水解，此意谓PEG衍生物上的反应性基团可能会在可连接蛋白质之前失活。一些衍生物有一些毒性且因此较不适于在活体内使用。一些衍生物反应太慢以至于实际上不适用。一些衍生物通过与产生蛋白质活性的部位相连接而导致蛋白质活性的丧失。一些衍生物对其将连接的部位不为特异性的，此也会导致所要活性的丧失且导致缺乏结果的再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质有关的挑战，已经研制出稳定性更佳（例如，美国专利第6,602,498号，其以引用的方式并入本文中）或可与分子和表面上的硫醇部分发生选择性反应（例如，美国专利第6,610,281号，其以引用的方式并入本文中）的PEG衍生物。显然，在所属领域中需要在生理环境中为化学惰性的直到要求发生选择性反应以形成稳定化学键为止的PEG衍生物。
近期，已经报道蛋白质科学领域中的一种全新技术，其有希望克服与蛋白质部位特异性修饰相关的很多局限性。具体来说，已经将新的组分添加到原核生物大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli，E.coif）（例如，L.Wang等人，（2001），Science292:498-500）与真核生物酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae，S.cerevisiae）（例如，J.Chin等人，Science301:964-7（2003））的蛋白质生物合成机器中，所述机器已经使非遗传编码的氨基酸能够于活体内并入蛋白质中。使用所述方法，已经将许多具有新颖化学、物理或生物学性质的新氨基酸（包括光亲和标记和光致异构化氨基酸、光致交联氨基酸（参见，例如，Chin,J.W.等人，（2002）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024；和Chin,J.W.等人，（2002）J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027）、酮基氨基酸、含重原子的氨基酸和糖基化氨基酸）响应于琥珀密码子TAG有效地且以高保真度并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。参见，例如，J.W.Chin等人，（2002），Journal of the American Chemical Society124:9026-9027；J.W.Chin与P.G.Schultz（2002），ChemBioChem3(11):1135-1137；J.W.Chin等人，（2002），PNAS United States of America99:11020-11024；和L.Wang与P.G.Schultz，（2002），Chem.Comm.,1:1-11。所有文献的全文是以引用的方式并入。所述研究已经证明，有可能选择性地和照惯例地引入蛋白质中不存在的化学官能团（诸如，酮基、炔基和叠氮部分），所述化学官能团对于20种常见的遗传编码的氨基酸中存在的所有官能团而言为化学惰性的且可能用来有效地和选择性地发生反应以形成稳定的共价键。
将非遗传编码的氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入能提供天然存在的官能团（诸如，赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等）的有价值替代物的化学官能团。已知一些化学官能团对于20种常见的遗传编码的氨基酸中存在的官能团而言为惰性的但可完全且有效地发生反应以形成稳定的键。举例而言，在所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下于水性条件下发生胡氏根（Huisgen）[3+2]环加成反应。参见，例如，Tornoe等人，（2002）J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人（2002）Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。通过将叠氮部分引入蛋白质结构中，举例而言，我们能够并入对于蛋白质中存在的胺基、巯基、羧酸基和羟基而言为化学惰性的但也可顺利地和有效地与乙炔部分反应以形成环加成产物的官能团。重要的是在不存在乙炔部分的情况下，叠氮部分在其它蛋白质侧链存在下和在生理血条件下仍为化学惰性的且无反应性。
本发明尤其致力于解决与GH多肽活性和制造相关的难题，并也致力于制造具有改良生物学或药理学性质（诸如，改良治疗半衰期）的hGH多肽。
发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员，包括GH（例如，hGH）多肽。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含一种或一种以上翻译后修饰。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽与连接子、聚合物或生物活性分子相连接。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个另外的GH（例如，hGH）多肽相连接。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物相连接。在一些实施例中，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸是以连接子与水溶性聚合物相连接或是通过键与水溶性聚合物相连接。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，所述双官能聚合物与第二多肽相连接。在一些实施例中，所述第二多肽为GH（例如，hGH）多肽。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物相连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码的氨基酸。
GH（例如，hGH）的各区可如下说明，其中中间行表示hGH中的氨基酸位置。
螺旋A     螺旋B     螺旋C     螺旋D
[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]
N端     A-B环     B-C环     C-D环     C端
在一些实施例中，在如下对应于hGH二级结构的一个或一个以上下列区域中的任何位置处：1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸），将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入。在其它实施例中，在选自由下列各残基位置组成的群组的位置处用非天然编码的氨基酸取代：残基1-5、32-46、97-105、132-149和184-191（来自hGH SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中的一个或一个以上下列位置中：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:l或3的相应氨基酸）。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:l或3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155（SEQ IDNO:2，或SEQ ID NO:l或3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置30、74、103（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，在所述位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置30、35、74、92、103、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，在所述位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。
人类GH拮抗剂包括（但不限于）在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127处具有取代或在位置1处具有添加（即，在N端）或其任何组合（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1、3或任何其它GH序列中的相应氨基酸）的那些拮抗剂。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的亲和力相比较时调控GH（例如，hGH）多肽对GH（例如，hGH）多肽受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的稳定性相比较时使GH（例如，hGH）多肽稳定性增加的取代、添加或缺失。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含选自由下列各取代组成的群组的氨基酸取代：hGH SEQ ID NO:2中的F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D；H21N；G120A；R167N；D171S；E174S；F176Y、I179T或其任何组合。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的免疫原性相比较时调控GH（例如，hGH）多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的血清半衰期或循环时间相比较时调控GH（例如，hGH）多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的水溶性相比较时使GH（例如，hGH）多肽水溶性增加的取代、添加或缺失。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的溶解性相比较时使宿主细胞中产生的GH（例如，hGH）多肽的溶解性增加的取代、添加或缺失。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的表达或合成相比较时使宿主细胞中的GH（例如，hGH）多肽表达增强或使活体外合成增强的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hGH多肽包含氨基酸取代G120A。包含这种取代的hGH多肽保持促效剂活性且使宿主细胞中的表达水平保持或提高。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含当与相应无取代、添加或缺失的GH（例如，hGH）的蛋白酶抗性相比较时使GH（例如，hGH）多肽的蛋白酶抗性增强的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽中的氨基酸取代可以天然存在或非天然存在的氨基酸进行，其限制条件为至少一个取代是以非天然编码的氨基酸进行。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基、乙酰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有如下结构，
其中n为0-10，R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含氨基氧基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有如下结构，
Figure BDA0000437277490000102
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基、经取代的芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有如下结构，
Figure BDA0000437277490000111
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，多肽为GH（例如，hGH）多肽促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向促效剂。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向促效剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向促效剂包含非天然编码的氨基酸和一种或一种以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，与水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸存在于GH（例如，hGH）多肽的部位II区域（包含AC螺旋束表面、螺旋A的氨基末端区域和一部分螺旋C的蛋白质区域）内。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽通过防止GH（例如，hGH）多肽拮抗剂与第二个GH（例如，hGH）多肽受体分子相结合而防止GH（例如，hGH）多肽受体发生二聚。在一些实施例中，用非甘氨酸的氨基酸取代SEQ ID NO:2（hGH）中的G120。在一些实施例中，用精氨酸取代SEQ IDNO:2中的G120。在一些实施例中，用非天然编码的氨基酸取代SEQ ID NO:2中的G120。在一些实施例中，与水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸存在于GH（例如，hGH）多肽的受体结合区内或干扰GH（例如，hGH）多肽的受体结合。
本发明还提供经分离的核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID NO:21或22杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，所述选择密码子是选自由下列密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石（ochre）密码子、蛋白石密码子、单一密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
本发明还提供制备与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码的氨基酸的经分离的GH（例如，hGH）多肽与包含可与所述非天然编码的氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸对于水溶性聚合物具有反应性，所述水溶性聚合物另外对于20种常见氨基酸中的任一种却不具有反应性。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸对于连接子、聚合物或生物活性分子具有反应性，所述连接子、聚合物或生物活性分子另外对于20种常见氨基酸中的任一种却不具有反应性。
在一些实施例中，通过使包含含羰基的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽与包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应制得与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例中，通过酰胺键使氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基与聚(乙二醇)分子相连接。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码的氨基酸的多肽反应制得与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）多肽。
在一些实施例中，通过使包含含炔基的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应制得与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例中，通过酰胺键使叠氮基或炔基与聚(乙二醇)分子相连接。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮基的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应制得与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例中，通过酰胺键使叠氮基或炔基与聚(乙二醇)分子相连接。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有在约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有在0.1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分枝聚合物的各枝具有在1kDa与100kDa之间或在1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，与GH（例如，hGH）多肽相连接的水溶性聚合物包含聚亚烷基二醇部分。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基、氨基氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基部分且水溶性聚合物包含氨基氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含炔部分且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含叠氮部分且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明还提供包含含非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，使非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物相连接。
本发明还提供包含编码GH（例如，hGH）多肽的多聚核苷酸的细胞，所述多聚核苷酸包含选择密码子。在一些实施例中，所述细胞包含用于将非天然编码的氨基酸取代入GH（例如，hGH）多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制备包含非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在一定条件下培养包含编码GH（例如，hGH）多肽的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞以允许GH（例如，hGH）多肽表达；和纯化来自所述细胞和/或培养基的GH（例如，hGH）多肽。
本发明还提供使GH（例如，hGH）多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间延长的方法。本发明也提供调控GH（例如，hGH）多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码的氨基酸取代天然存在的GH（例如，hGH）多肽中的任何一个或一个以上氨基酸和/或使所述GH（例如，hGH）多肽与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子相连接。
本发明还提供用有效量的本发明的GH（例如，hGH）分子治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含将治疗有效量的包含GH（例如，hGH）多肽和医药学上可接受的载剂的医药组合物投予所述患者，所述GH（例如，hGH）多肽包含非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，使非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物相连接。
本发明还提供包含SEQ ID NO:1、2、3中所示的序列或任何其它GH多肽序列（除至少一个氨基酸被非天然编码的氨基酸取代以外）的GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例中，使所述非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物相连接。在一些实施例中，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，在选自由下列各残基位置组成的群组的位置处用非天然编码的氨基酸取代：来自SEQ ID NO:3（hGH）的残基1-5、82-90、117-134和169-176。
本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和GH（例如，hGH）多肽的医药组合物，所述GH（例如，hGH）多肽包含SEQ ID NO:1、2、3中所示的序列或任何其它GH多肽序列，其中至少一个氨基酸被非天然编码的氨基酸取代。在一些实施例中，所述非天然编码的氨基酸包含糖类部分。在一些实施例中，通过糖类部分使水溶性聚合物与所述多肽相连接。在一些实施例中，通过糖类部分使连接子、聚合物或生物活性分子与GH（例如，hGH）多肽相连接。
本发明还提供包含通过共价键与GH（例如，hGH）多肽在单个氨基酸处相连接的水溶性聚合物的GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，共价地与水溶性聚合物连接的氨基酸为存在于所述多肽中的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，于SEQ ID NO2的位置35、92、143或145处用非天然编码的氨基酸取代。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的GH（例如，hGH）多肽，其中通过以核糖体作用并入所述多肽中的非天然编码的氨基酸的官能团使所述连接子、聚合物或生物活性分子与所述多肽相连接。在一些实施例中，所述多肽被单PEG化。本发明也提供包含与一个或一个以上非天然编码的氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的GH（例如，hGH）多肽，其中以核糖体作用在预先选定的部位处使所述非天然编码的氨基酸并入所述多肽中。
在另一实施例中，包含一个或一个以上非天然存在的氨基酸的hGH多肽与另一包括（但不限于）PEG的分子的结合由于与所述非天然氨基酸结合所利用的独特化学反应而提供大体上纯的hGH。包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的hGH与另一诸如PEG的分子的结合可与在结合步骤之前或之后执行的其它纯化技术一起执行以提供大体上纯的hGH。
本发明进一步提供一种含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素（GH）的激素组合物，其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，所述GH为诸如至少约80%与SEQ ID NO:2相同的序列的人类生长激素（hGH）；在一些实施例中，所述序列为SEQ ID NO:2的序列。所述GH可包括一个或一个以上非天然编码的氨基酸（NEAA），诸如包括羰基（例如，酮基）的NEAA，诸如为对乙酰苯丙氨酸的NEAA。在一些实施例中，所述肟键是在NEAA与水溶性聚合物之间。所述GH可在对应于SEQID NO:2的位置35的位置处经对乙酰苯丙氨酸取代。在一些实施例中，所述水溶性聚合物包括一个或一个以上聚乙二醇（PEG）分子。所述PEG可为线性的，例如，分子量在约0.1kDa与约100kDa之间或在约1kDa与约60kDa之间或在约20kDa与约40kDa之间或为约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，所述PEG为分枝PEG，例如，分子量在约1kDa与约100kDa之间或在约30kDa与约50kDa之间或为约40kDa的分枝PEG。在一些实施例中，通过复数个共价键使GH与复数个水溶性聚合物相连接，其中至少一个共价键为肟键。在这些实施例中的一些实施例中，所述GH为人类生长激素（GH，例如，hGH），例如序列有至少约80%与SEQ ID NO:2相同的GH（例如，hGH）；在一些实施例中所述序列为SEQ ID NO:2的序列。在GH（例如，hGH）与复数个水溶性聚合物相连接的一些实施例中，所述GH包含复数个NEAA。
在一些实施例中，本发明提供一种含有包含SEQ ID NO:2序列的GH（例如，hGH）的GH组合物，其中通过肟键使GH（例如，hGH）与30kDa线性PEG相连接，且其中所述肟键是与在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处取代的对乙酰苯丙氨酸形成。
在一些实施例中，本发明提供一种含有通过肟键与至少一个线性PEG相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列且含有至少一个在一个或一个以上选自由下列各残基位置组成的群组的位置处取代的NEAA：残基1-5、6-33、34-74、75-96、97-105、106-129、130-153、154-183和184-191。在一些实施例中，在一个或一个以上选自由下列各残基位置组成的群组的位置处用NEAA取代：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192（即，在蛋白质的羧基端）。在一些实施例中，在一个或一个以上选自由残基位置35、92、131、134、143和145组成的群组的位置处用NEAA取代。在一些实施例中，在一个或一个以上选自由残基位置30、35、74、92、103、143和145组成的群组的位置处用NEAA取代。在一些实施例中，在一个或一个以上选自由残基位置35、92、143和145组成的群组的位置处用NEAA取代。在一些实施例中，在位置35处用NEAA取代。在一些实施例中，至少一个NEAA为对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，PEG的分子量在约0.1kDa与约100kDa之间，或在约1kDa与约60kDa之间，或在约20kDa与约40kDa之间，或为约30kDa。
在其它实施例中，本发明提供一种制备通过肟键与水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）的方法，其包含使包含含羰基的NEAA的GH（例如，hGH）在适于形成肟键的条件下与PEG羟基胺接触。所述NEAA可含有酮基，例如，羰基。NEAA可为对乙酰苯丙氨酸。在含有对乙酰苯丙氨酸的一些实施例中，在GH（例如，hGH）中对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置处用所述对乙酰苯丙氨酸取代。在一些实施例中，PEG羟基胺为单甲氧基PEG（MPEG）羟基胺。在一些实施例中，MPEG羟基胺为线性的，例如约20-40kDa或约30kDa的线性MPEG。在一些实施例中，MPEG羟基胺为线性30kDa单甲氧基-PEG-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐。在一些实施例中，通过将（i）编码GH（例如，hGH）的核酸（其中所述核酸已被修饰以便为NEAA并入提供选择密码子）和（ii）NEAA引入一有机体中来制得包含NEAA的GH（例如，hGH），所述有机体的细胞机器能够响应于（i）核酸的选择密码子将NEAA并入蛋白质中。在一些实施例中，形成肟键的反应条件包括将MPEG与GH（例如，hGH）混合以产生MPEG-GH（例如，hGH）混合物，其中MPEG:GH（例如，hGH）的比为约5至10，pH为约4至6；和在室温下将所述MPEG-GH（例如，MPEG-hGH）混合物轻柔搅拌约10至50小时。在一些实施例中，所述方法进一步包括将GH（例如，hGH）纯化（例如）至纯度为至少约99%。
细胞机器包括（但不限于）正交tRNA和/或氨酰基tRNA合成酶。
在其它实施例中，本发明提供一种含有激素组合物与医药学上可接受的赋形剂的医药组合物，所述激素组合物包含通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素，其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，GH为例如为hGH的GH。在一些实施例中，GH包含NEAA。在一些实施例中，水溶性聚合物包含PEG，诸如线性PEG。在一些实施例中，PEG为约30kDa的线性PEG，且GH为在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸35的位置处经对乙酰苯丙氨酸取代的GH（例如，hGH），且在对乙酰苯丙氨酸与PEG之间形成肟键。
在一些实施例中，本发明提供一种通过将有效量的激素组合物投予需要治疗的个体进行治疗的方法，所述激素组合物含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素（GH），其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，GH为hGH。在一些实施例中，GH包含NEAA。在一些实施例中，水溶性聚合物包含PEG，诸如线性PEG。在一些实施例中，PEG为约30kDa的线性PEG，且GH为在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸35的位置处经对乙酰苯丙氨酸取代的hGH，且在对乙酰苯丙氨酸与PEG之间形成肟键。在一些实施例中，所治疗的个体为人类。在一些实施例中，所治疗的个体患有儿科生长激素缺乏症、特发性身材矮小、儿童期发作的成年人生长激素缺乏症、成年期发作的成年人生长激素缺乏症或继发性生长激素缺乏症。在一些实施例中，GH为hGH。在一些实施例中，GH包含NEAA。在一些实施例中，水溶性聚合物包含PEG，诸如线性PEG。在一些实施例中，PEG为约30kDa的线性PEG，且GH（例如，hGH）是在对应于SEQID NO:2的氨基酸35的位置处经对乙酰苯丙氨酸取代，且在对乙酰苯丙氨酸与PEG之间形成肟键。
在一些实施例中，本发明提供一种通过将有效量的激素组合物投予需要治疗的个体进行治疗的方法，所述激素组合物包含通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素（GH），其中所述水溶性聚合物为线性聚合物，且其中以每周仅一次、每两周一次或每月一次的频率投予所述激素组合物。在一些实施例中，所述聚合物为PEG。在一些实施例中，所述GH包含NEAA。在一些实施例中，通过肟键使所述聚合物与所述GH相连接。
在一些实施例中，本发明提供一种包含GH（例如，hGH）的激素组合物，其中当经皮下投予哺乳动物时所述GH（例如，hGH）的平均血清半衰期为至少约12小时。在一些实施例中，GH（例如，hGH）包含NEAA。在一些实施例中，所述激素组合物进一步含有水溶性聚合物，诸如，PEG，例如，线性PEG。
在一些实施例中，本发明提供一种包含与PEG相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中当经皮下投予哺乳动物时所述GH（例如，hGH）的平均血清半衰期为包含无PEG的GH（例如，hGH）的组合物的血清半衰期的至少约7倍。
附图说明
附图说明
图1显示四螺旋束蛋白的一般结构图。
图2显示四螺旋束蛋白生长激素（GH）的一般结构图。
图3显示四螺旋束蛋白促红细胞生成素（EPO）的一般结构图。
图4显示四螺旋束蛋白干扰素α-2（IFNα-2）的一般结构图。
图5显示四螺旋束蛋白粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的一般结构图。
图6显示考马斯（Coomassie）亮蓝染色SDS-PAGE，其展示在以下位置中的各个位置处包含非天然编码的氨基酸对乙酰苯丙氨酸的hGH的表达：Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143或K145。
图7，A图和图7，B图显示包含非天然编码的氨基酸的hGH（B图）和野生型hGH（A图）在IM9细胞中的生物活性的图。
图8显示展示包含非天然编码的氨基酸的hGH的产生的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，所述hGH是通过PEG（5kDa、20kDa和30kDa）与其的共价连接而PEG化。
图9显示展示包含非天然编码的氨基酸的hGH的多种PEG化形式在IM9细胞中的生物活性的图。
图10，A图-此图图示hGH的一级结构，其中指示胰蛋白酶裂解部位并且用箭头说明非天然的氨基酸取代F92pAF（根据Becker等人Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4):326-337修改所得的图）。图10，B图-显示由包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽产生的肽（标记为A）、由包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽产生的肽（标记为B）和由WHO rhGH产生的肽（标记为C）的叠加的胰蛋白酶图。图10，图C-显示来自B图的峰9的放大。
图11，A图和B图显示经纯化的PEG-hGH多肽的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析。
图12显示hGH二聚体分子在IM9细胞中的生物活性的图。
图13，A图-显示测量通过具有G120R取代的hGH拮抗剂使pSTAT5磷酸化的IM-9检定数据的图。图13，B图-显示测量通过具有在相同位置处（G120）并入的非天然氨基酸的hGH多肽使pSTAT5磷酸化的IM-9检定数据的图。
图14显示表明图13，B图中所示的hGH拮抗剂的二聚体在IM-9检定中也缺乏生物活性的图。
图15显示比较包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽与未PEG化的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。
图16显示比较包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。
图17显示比较包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。一次向大鼠投予2.1mg/kg。
图18，A图-显示在投予单剂量的包含非天然编码的氨基酸（位置35、92）的PEG化hGH多肽后对大鼠体重增加的影响的图。图18，B图-显示在投予单剂量的包含非天然编码的氨基酸（位置35、92）的PEG化hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。图18，C图-显示在投予单剂量的包含非天然编码的氨基酸（位置92、134、145、131、143）的PEG化hGH多肽后对大鼠体重增加的影响的图。图18，D图-显示在投予单剂量的包含非天然编码的氨基酸（位置92、134、145、131、143）的PEG化hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。图18，E图-显示比较包含非天然编码的氨基酸（位置92、134、145、131、143）的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。
图19显示直链、30kDa的单甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐的结构图。
图20显示说明经氨基甲酸酯连接的氧基氨基衍生化PEG的合成的图。
图21呈现可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图22呈现合成可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图23呈现合成可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的基于酰胺的含羟胺PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图24呈现合成可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的基于氨基甲酸酯的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图25呈现合成可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的基于氨基甲酸酯的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图26呈现合成可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的简单的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图27呈现可用来修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG、经肟连接的非天然氨基酸多肽的含分枝PEG试剂的说明性、非限制性实例和一种所述试剂修饰基于羰基的非天然氨基酸多肽的用途。
图28呈现说明每周用安慰剂或剂量增加的PEG-ahGH或每天用安慰剂或健豪宁（Genotropin）治疗的切除垂体大鼠中的IGF-1血浆浓度的图。
图29呈现说明每周用安慰剂或PEG-ahGH或每天用安慰剂或健豪宁治疗的切除垂体大鼠中的胫骨长度的图。
图30呈现说明每周用安慰剂或PEG-ahGH或每天用安慰剂或健豪宁治疗的切除垂体大鼠中的体重变化百分比的图。
图31呈现说明第0天和第7天经皮下投予的PEG-ahGH的血浆浓度与时间的关系的图。
图32呈现说明以皮下或静脉内单剂量投予的PEG-a(met)hGH的血浆浓度与时间的关系的图。
具体实施方式
定义
应了解，本发明不受限于本文中所描述的特定方法、实验方案、细胞系、构建物和试剂，并且因而可能发生变化。也应了解，本文中所使用的术语仅是为了描述特定实施例，而不是用来限制本发明的范畴，本发明的范畴将仅受限于随附权利要求书。
除非上下文另有明确说明，否则如本文中和随附权利要求书中所使用的单数形式“一”和“所述”包括复数含义。因此，例如，提及一个（种）“hGH”是提及一个（种）或一个（种）以上如此的蛋白质且包括所属领域的技术人员已知的其等效物，等等。
除非另有说明，否则本文中所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法、装置和物质，但现在描述的是优选方法、装置和物质。
本文中所提及的所有公开案和专利是以引用的方式并入本文中，以达到描述和揭示（例如）在所述公开案中加以描述、可能与当前描述的发明结合使用的构建物和方法的目的。所提供的本文中论述的公开案仅为其在本申请案的申请日期之前的揭示案。本文在任何方面皆不应解释为承认本发明者无权由于现有发明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。
术语“大体上纯化的”指的是如下GH（例如，hGH）多肽，在以重组方法产生的GH（例如，hGH）多肽的情况下，其可大体上或基本上不含有通常伴有如见于在其天然存在的环境（即，天然细胞或宿主细胞）中的蛋白质或与所述蛋白质发生相互作用的组分。可大体上不含有细胞物质的GH（例如，hGH）多肽包括污染蛋白质低于约30%、低于约25%、低于约20%、低于约15%、低于约10%、低于约5%、低于约4%、低于约3%、低于约2%或低于约1%（以干重计）的蛋白质制剂。当GH（例如，hGH）多肽或其变异体是通过重组方法由宿主细胞产生时，蛋白质可以细胞干重的约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更低百分比的量存在。当GH（例如，hGH）多肽或其变异体是通过重组方法由宿主细胞产生时，蛋白质可以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低的细胞干重的量存在于培养基中。因而，如由本发明的方法产生的“大体上纯化的”GH（例如，hGH）多肽可具有至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度，特别地为具有至少约75%、80%、85%的纯度，且更特别地为具有至少约90%的纯度、至少约95%的纯度、至少约99%或更大值的纯度，所述纯度是通过诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法来测定。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”指的是包括不管用何种方法（例如，直接吸收、转导、f接合或此项技术中已知的产生重组宿主细胞的其它方法）插入的外源性多聚核苷酸的细胞。所述外源性多聚核苷酸可作为非整合载体，例如质粒，得以维持，或者，可整合到宿主基因组中。
如本文所使用的术语“培养基”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或硬质支撑物，其可支撑或含有任何宿主细胞和细胞内含物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌（Pseudomonas）宿主细胞。因而，所述术语可涵盖宿主细胞已生长于其中的培养基，例如，GH（例如，hGH）多肽已被分泌到其中的培养基，包括增殖阶段之前或之后的培养基。所述术语还可涵盖诸如在GH（例如，hGH）多肽为细胞内产生的且使宿主细胞溶解或分裂以释放出GH（例如，hGH）多肽的情况下，含有宿主细胞溶胞物的缓冲液或试剂。
如本文中关于蛋白质重折叠所使用的“还原剂”是定义为使巯基维持在还原状态且使分子内或分子间的二硫键还原的任何化合物或物质。合适的还原剂包括（但不限于）二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺（2-氨基乙硫醇）和还原型谷胱甘肽。所属领域的技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文中关于蛋白质重折叠所使用的“氧化剂”是定义为能够从正被氧化的化合物移去电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括（但不限于）氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤苏糖醇（oxidized erythreitol）和氧气。所属领域的技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文中所使用的“变性剂”是定义为将引起蛋白质发生可逆的解折叠的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度所决定。合适的变性剂可为离液剂、去污剂、有机溶剂、水可混溶性溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括（但不限于）尿素、胍和硫氰酸钠。可用的去污剂可包括（但不限于）强力去污剂（诸如，十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚（例如，吐温（Tween）或粹通（Triton）去污剂）、N-十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl））、温和非离子型去污剂（例如，毛地黄皂苷）、温和阳离子型去污剂（诸如，N->2,3-(二油酰氧基)-丙基-N,N,N-三甲铵）、温和离子型去污剂（例如，胆酸钠或脱氧胆酸钠）或两性离子型去污剂（包括（但不限于）磺基甜菜碱（Zwittergent，两性洗涤剂）、3-(3-胆酰胺丙基)二甲胺基-l-丙烷硫酸盐（CHAPS）和3-(3-胆酰胺丙基)二甲胺基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐（CHAPSO））。诸如乙腈、低碳烷醇（特别为C2-4烷醇，诸如，乙醇或异丙醇）或低碳烷二醇（特别为C2-4烷二醇，诸如，乙二醇）的有机水可混溶性溶剂可用作变性剂。可用于本发明的磷脂可为天然存在的磷脂（诸如，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇）或合成的磷脂衍生物或变体（诸如，二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱）。
如本文中所使用的“重折叠”描述就二硫键而言使含有二硫键的多肽从不恰当的折叠或解折叠状态转变为天然或恰当的折叠构象的任何过程、反应或方法。
如本文中所使用的“共折叠”特别指的是采用至少两条彼此间相互作用的多肽并使解折叠或不恰当折叠的多肽转变为天然、恰当折叠的多肽的重折叠过程、反应或方法。
如本文中所使用的“生长激素”或“GH”，不管其生物活性如何且此外不管其采用何种合成或制造方法（包括（但不限于）在活体外、在活体内通过核酸分子的显微注射而重组（无论自cDNA、基因组DNA、合成DNA产生还是自其它形式的核酸产生）的方法、合成方法、转基因方法和基因活化方法），其都应包括具有生长激素的至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，所述生长激素来自任何哺乳类动物（包括（但不限于）人（hGH）、牛（bGH）、猪）和其它牲畜或家畜（包括（但不限于）鸡），且包括其GH类似物、GH同功异型物、GH模拟物、GH片段、杂交GH蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚体、同源物、糖基化型变异体、变异体、剪接变异体和突变型蛋白。
术语“hGH多肽”涵盖包含一个或一个以上的氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。示范性取代包括（例如）天然hGH的位置41处赖氨酸的取代或位置176处苯丙氨酸的取代。在一些情况下，如果取代是在位置41处，那么取代物可为异亮氨酸或精氨酸残基，或如果位置为176，那么取代物为酪氨酸残基。位置F10可经（例如）A、H或I取代。位置M14可经（例如）W、Q或G取代。其它示范性取代包括任何包含（但不限于）下列各取代的取代或其组合：R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；R167E、D171S、E174S、F176Y；F10A、M14W、H18D、H21N；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、E174S、F176Y、I179T；F10H、M14G、H18N、H21N；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、T175T、I179T；或F10I、M14Q、H18E、R167N、D171S、I179T。参见，例如，美国专利第6,143,523号，其以引用的方式并入本文中。
已对天然存在的hGH中多个氨基酸位置上的示范性取代进行了描述，其包括增强促效剂活性、增强蛋白酶抵抗性、使多肽转化为拮抗剂等等的取代且由术语“hGH多肽”所涵盖。
促效剂GH（例如，hGH）序列包括（例如）包含以下修饰的天然存在的hGH序列：H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、I179T。参见，例如，美国专利第5,849,535号，其以引用的方式并入本文中。另外的促效剂hGH序列包括H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；或H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A。参见，例如，美国专利第6,022,711号，其以引用的方式并入本文中。包含H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A取代的hGH多肽提高在部位I对hGH受体的亲和力。参见，例如，美国专利第5,854,026号，其以引用的方式并入本文中。蛋白酶抗性增强的hGH序列包括（但不限于）在C-D环内包含一个或一个以上的氨基酸取代的hGH多肽。在一些实施例中，取代包括（但不限于）R134D、T135P、K140A和其任何组合。参见，例如，Alam等人（1998）J.Biotechnol.65:183-190。
人类生长激素拮抗剂包括（例如）在G120处具有取代（例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E）且有时进一步包括以下取代：H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A的那些人类生长激素拮抗剂。参见，例如，美国专利第6,004,931号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂在区域106-108或127-129中包含至少一个取代，此使得GH可充当拮抗剂。参见，例如，美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与水溶性聚合物相连接的存在于hGH分子的部位II结合区域中的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，hGH多肽进一步包含以下取代：H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T，且一取代在G120处（参见，例如，美国专利第5,849,535号）。
对于完整全长的天然存在的人类GH氨基酸序列以及成熟的天然存在的GH氨基酸序列和天然存在的突变体来说，分别参见本文中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3。在一些实施例中，本发明的GH多肽（例如，hGH多肽）大体上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或生长激素多肽的任何其它序列相同。举例来说，在一些实施例中，本发明的GH多肽（例如，hGH多肽）有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或生长激素多肽的任何其它序列相同。在一些实施例中，本发明的GH多肽（例如，hGH多肽）有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%与SEQ ID NO:2相同。大量天然存在的hGH突变体已得以鉴别。这些突变体包括hGH-V（Seeburg,DNA1:239（1982）；美国专利第4,446,235号、第4,670,393号和第4,665,180号，其以引用的方式并入本文中）和含有hGH的残基32-46的缺失的20-kDa hGH（SEQ ID NO:3）（Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta925:314（1987）；Lewis,U.等人，J.Biol.Chem.,253:2679-2687（1978））。在Igout,A.等人，NucleicAcids Res.17(10):3998（1989）中对胎盘生长激素进行了描述。此外，已经报道由转录后、翻译后、分泌、代谢加工和其它生理过程产生的众多hGH变异体，其包括蛋白水解分裂成的变异体或2链变异体（Baumann,G.,Endocrine Reviews12:424（1991））。在Lewis,U.J.等人，J.Biol.Chem.252:3697-3702（1977）、Brostedt,P.和Roos,P.,Prep.Biochem.19:217-229（1989）中描述了通过Cys-Cys二硫键直接连接的hGH二聚体。编码hGH突变体和突变hGH多肽的核酸分子已为我们所熟知且包括（但不限于）在美国专利第5,534,617号、第5,580,723号、第5,688,666号、第5,750,373号、第5,834,250号、第5,834,598号、第5,849,535号、第5,854,026号、第5,962,411号、第5,955,346号、第6,013,478号、第6,022,711号、第6,136,563号、第6,143,523号、第6,428,954号、第6,451,561号、第6,780,613号和美国专利申请公开案2003/0153003中所揭示的那些核酸分子，所述参考案以引用的方式并入本文中。
hGH的商业制剂是以下列名称出售：HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM（Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono）。
术语“hGH多肽”也包括天然存在hGH的医药学上可接受的盐和前药以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的hGH的促效剂、模拟物和拮抗剂变异体和其多肽融合物。在氨基端、羧基端或两端包含另外的氨基酸的融合物都为术语“hGH多肽”所涵盖。示范性融合物包括（但不限于）（例如）甲硫氨酰基生长激素（其中甲硫氨酸与由缺乏分泌信号肽或其部分的hGH的成熟形式的重组表达产生的hGH的N端相连接）、用于纯化目的的融合物（包括（但不限于）与聚组氨酸或亲和性抗原决定基形成的融合物）、与血清白蛋白结合肽形成的融合物和与血清蛋白（诸如，血清白蛋白）形成的融合物。以引用的方式并入本文中的美国专利第5,750,373号描述一种选择对于其相应受体分子具有改变的结合性质的新颖蛋白质（诸如，生长激素）和抗体片段变异体的方法。所述方法包含使编码所关注的蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基端结构域融合。
各种参考文献揭示通过聚合物结合或糖基化作用来修饰多肽。术语“hGH多肽”包括与聚合物（诸如，PEG）结合且可包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一个或一个以上另外的衍生形式的多肽。此外，hGH多肽可包含连接子或聚合物，其中所述连接子或聚合物所结合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或可利用此项技术中已知的技术（诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合）与天然编码的氨基酸结合。
已对hGH多肽的聚合物结合作用进行了报道。参见，例如，美国专利第5,849,535号、第6,136,563号和第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。美国专利第4,904,584号揭示PEG化赖氨酸缺失的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已经缺失或经任何其它氨基酸残基取代。WO99/67291揭示一种使蛋白质与PEG结合的方法，其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基缺失且在足以实现与蛋白质结合的条件下使蛋白质与PEG接触。WO99/03887揭示属于生长激素超家族的多肽的PEG化变异体，其中半胱氨酸残基已经由位于多肽指定区中的非必需氨基酸残基取代。WO00/26354揭示一种产生变应原性降低的糖基化多肽变异体的方法，所述糖基化多肽变异体当与相应母体多肽相比较时，其包含至少一个另外的糖基化作用部位。以引用的方式并入本文中的美国专利第5,218,092号揭示对粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和其它多肽的修饰，以便当与天然多肽相比较时引入至少一条另外的碳水化合物链。
术语“hGH多肽”也包括糖基化hGH以及（但不限于）在任何氨基酸位置处发生糖基化的多肽、N-连接或O-连接糖基化形式的多肽。含有单核苷酸变化的变异体也被视为hGH多肽的生物活性变异体。此外，也包括剪接变异体。术语“hGH多肽”也包括通过化学方式连接或表达为融合蛋白的任何一种或一种以上GH（例如，hGH）多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配位体或任何类型的其它生物活性分子的GH（例如，hGH）多肽杂二聚体、同源二聚体、杂多聚体或同源多聚体，以及含有（例如）特异性缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。
除非另有说明（即，当说明比较是基于SEQ ID NO:1、3或其它hGH序列时），否则对本文中描述的GH（例如，hGH）中的氨基酸位置的所有提及是基于SEQ ID NO:2中的位置。所属领域的技术人员将认识到，对应于SEQ ID NO:1、2、3或任何其它GH序列中的位置的氨基酸位置可在任何其它GH（例如，hGH）分子（诸如，GH，或hGH融合物、变异体、片段等）中容易地得到识别。举例而言，诸如BLAST的序列比对程序可用来比对和鉴别在蛋白质中对应于SEQ ID NO:1、2、3或其它GH序列中的位置的特定位置。本文中就SEQ ID NO:1、2、3或其它GH序列而言加以描述的氨基酸的取代、缺失或添加也是用来指本文中描述或此项技术中已知的GH或hGH融合物、变异体、片段等中的相应位置上的取代、缺失或添加，且显然由本发明所涵盖。
术语“hGH多肽”或“hGH”涵盖包含一个或一个以上的氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。本发明的hGH多肽可包含用一个或一个以上天然氨基酸进行的修饰连同一个或一个以上非天然氨基酸的修饰。已对天然存在的hGH多肽中多个氨基酸位置上的示范性取代进行了描述，所述示范性取代包括（但不限于）调控hGH多肽的一种或一种以上生物活性（诸如（但不限于）增强促效剂活性、增加多肽的溶解性、降低蛋白酶敏感性、使多肽转化为拮抗剂等）的取代，且术语“hGH多肽”涵盖所述示范性取代。
人类GH拮抗剂包括（但不限于）在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127处具有取代或在位置1处具有添加（即，在N端）或其任何组合（SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1、3或任何其它GH序列中的相应氨基酸）的那些拮抗剂。在一些实施例中，hGH拮抗剂在区域1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）中包含至少一个取代，此使得GH可充当拮抗剂。在其它实施例中，非天然编码的氨基酸的示范性并入部位包括在螺旋A的氨基端区域和一部分螺旋C之内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然编码的氨基酸取代G120。在其它实施例中，将上面列出的取代与使得hGH多肽成为hGH拮抗剂的另外取代组合。举例而言，在本文中所鉴别的位置中的一位置处用非天然编码的氨基酸取代，且同时在G120处引入取代（例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E）。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与水溶性聚合物相连接的存在于hGH分子受体结合区中的非天然编码的氨基酸。
在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽进一步包含调控GH或hGH多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例而言，添加、取代或缺失可调控GH（例如，hGH）的一种或一种以上的性质或活性。例如，添加、取代或缺失可以调控对GH（例如，hGH）多肽受体的亲和力，调控（包括（但不限于）增强或减弱）受体二聚化，稳定受体二聚体、循环半衰期，调控治疗半衰期，调控多肽稳定性，调控通过蛋白酶进行的裂解，调控剂量，调控释放或生物利用率，促进纯化，或改善或改变特定投药途径。同样地，GH（例如，hGH）多肽可包含改善多肽的检测（包括（但不限于）GFP）、纯化或其它特性的蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域（包括（但不限于）FLAG或聚组氨酸）或其它基于亲和力的序列（包括（但不限于）FLAG、聚组氨酸、GST等）或连接分子（包括（但不限于）生物素）。
术语“hGH多肽”也涵盖已连接的同源二聚体、杂二聚体、同源多聚体和杂多聚体，其包括（但不限于）直接通过非天然编码的氨基酸侧链与相同或不同的非天然编码的氨基酸侧链相连接或者与天然编码的氨基酸侧链相连接或者间接通过连接子相连接的那些同源二聚体、杂二聚体、同源多聚体和杂多聚体。示范性连接子包括（但不限于）小分子有机化合物、具有多种长度的水溶性聚合物（诸如，聚(乙二醇)或聚葡聚糖）或具有各种长度的多肽。
“非天然编码的氨基酸”指的是一种并非为20种常见氨基酸之一或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。可与术语“非天然编码的氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸”和”非天然存在的氨基酸”。术语“非天然编码的氨基酸”也包括（但不限于）通过天然编码的氨基酸（包括（但不限于）20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸）的修饰（例如，翻译后修饰）而出现但不是其自身通过翻译复合物而天然并入生长多肽链中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的实例包括（但不限于）N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸化酪氨酸。
“氨基端修饰基团”指的是可与多肽的氨基端相连接的任何分子。同样地，“羧基端修饰基团”指的是可与多肽的羧基端相连接的任何分子。末端修饰基团包括（但不限于）各种水溶性聚合物、肽或诸如血清白蛋白的蛋白质或使肽的血清半衰期延长的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应性部位”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”在此项技术中和在本文中是用来指分子的独特、可确定的部分或单元。在化学技术中所述术语的意义有些相同且在本文中用来表示执行某些功能或具有一些活性且与其它分子易发生反应的分子的部分。
术语“键”或“连接子”在本文中是用来指通常由于化学反应而形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定的键意谓在水中大体上为稳定的且在有效pH值下（包括（但不限于）在生理条件下）于一段长期时间内（或许甚至无限期地）不与水发生反应的键。水解不稳定或可降解的键意谓在水中或在水溶液（包括例如血液）中可降解的键。酶促不稳定或可降解的键意谓可被一种或一种以上的酶降解的键。如此项技术中所理解，PEG和相关聚合物可以在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上的末端官能团之间的连接子基团中包括可降解的键。举例而言，通过PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键一般在生理条件下水解而释放出试剂。其它水解可降解的键包括（但不限于）碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸酯基团反应而形成的磷酸酯键；为酰肼与醛的反应产物的腙键；为醛与醇的反应产物的缩醛键；为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；通过包括（但不限于）在聚合物（诸如，PEG）末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；和通过包括（但不限于）在聚合物末端的亚磷酰胺基团与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”当在本文中使用时意谓可影响生物系统、路径、分子的任何物理性质或生化性质或者与生物体（包括（但不限于）病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类）有关的相互作用的任何物质。详细来说，如本文中所使用的“生物活性分子”包括（但不限于）意欲用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或另外可增强人类或动物的身体或精神的良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括（但不限于）肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶粒。适于供本发明使用的生物活性剂的类别包括（但不限于）药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎药剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、甾族药剂、源自微生物的毒素等等。
“双官能聚合物”指的是包含两个离散官能团的聚合物，所述官能团能够特定地与其它部分（包括（但不限于）氨基酸侧基）反应以形成共价键或非共价键。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用来形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。用于使各种化合物与肽相连接的许多程序和连接子分子是已知的。参见，例如，欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，其以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”指的是包含两个或两个以上离散官能团的聚合物，所述官能团能够特定地与其它部分（包括（但不限于）氨基酸侧基）反应以形成共价键或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可为任何所要长度或分子量，且可加以选择以提供与GH（例如，hGH）分子相连接的一个或一个以上的分子之间的特定所要的间隔或构象。
在取代基是通过其从左到右书写的常规化学式来说明的情况下，其同样涵盖将由从右到左来书写结构而得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。
术语“取代基”包括（但不限于）“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”为产生稳定化合物的那些基团。合适的非干扰性取代基或基团包括（但不限于）卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代的苯基、甲苯甲酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)（其中m为1至8）、芳基、经取代的芳基、经取代的烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代的杂环基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C1-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)（其中各m为1至8）、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐的基团等等。如本文中所使用的各R为H、烷基或经取代的烷基、芳基或经取代的芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
术语“烷基”，除非另有说明，否则其单独地或作为另一取代基的一部分是意谓可为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的且可包括具有指定碳原子数（即，C1-C10意谓1至10个碳原子）的二价和多价基团的直链或支链或环状烃基或其组合。饱和烃基的实例包括（但不限于）如下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、（例如）正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等等。不饱和烷基为具有一个或一个以上的双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括（但不限于）乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和高碳同系物与异构体。除非另有说明，否则术语“烷基”也意欲包括下面较详细定义的那些烷基衍生物，诸如“杂烷基”。将限于烃基的烷基称为“纯烷基”。
术语“亚烃基”，其单独地或作为另一取代基的一部分是意谓源自烷烃的如下（但不限于）由结构-CH2CH2-与-CH2CH2CH2CH2-所例示的二价基团且进一步包括下面描述为“杂亚烃基”的那些基团。通常，烷基（或亚烃基）将具有1至24个碳原子，那些具有10个碳原子或更少碳原子的基团为本文所述的方法和组合物的特殊实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烃基”为一般具有8个或更少碳原子的链较短的烷基或亚烃基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”（或硫基烷氧基）是以其常规意义使用，且分别指的是通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分相连接的那些烷基。
术语“杂烷基”，除非另有说明，否则其单独地或与另一术语组合是意谓包含确定的碳原子数和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子的稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其中氮原子和硫原子视需要可被氧化且氮杂原子视需要可被季铵化。杂原子O、N和S以及Si可置于杂烷基的任何内部位置处或置于烷基与分子的其余部分相连接的位置处。实例包括（但不限于）-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，诸如，-CH2-NH-OCH3与-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烃基”，其单独地或作为另一取代基的一部分是意谓源自杂烷基的如下（但不限于）由-CH2-CH2-S-CH2-CH2-与-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示的二价基团。对于杂亚烃基而言，相同或不同的杂原子也可位于链的任一端或两端（包括（但不限于）亚烃基氧基、亚烃基二氧基、亚烃基氨基、亚烃基二氨基、氨基氧基亚烃基等等）。此外，对于亚烃基与杂亚烃基连接基团而言，连接基团的式的书写方向并不意味着连接基团的定向。例如，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-与-R'C(O)2-。
术语“环烷基”和“杂环烷基”，除非另有说明，否则其单独地或与其它术语组合是分别表示“烷基”与“杂烷基”的环状形式。因而，环烷基或杂环烷基可包括饱和、部分不饱和与完全不饱和的环键。另外，对杂环烷基而言，杂原子可位于杂环与分子的其余部分相连接的位置。环烷基的实例包括（但不限于）环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括（但不限于）l-(l,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语“杂环亚烃基”，其单独地或作为另一取代基的一部分是意谓源自杂环烷基的二价基团，且术语“环亚烃基”，其单独地或作为另一取代基的一部分是意谓源自环烷基的二价基团。
如本文中所使用的术语“水溶性聚合物”指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与GH（例如，hGH）多肽的连接可导致如下改变：包括（但不限于）相对于未修饰形式来说，血清半衰期得到延长或调控，或治疗半衰期得到延长或调控，免疫原性得到调控，诸如聚集体与多聚体形成的物理缔合特性得到调控，改变受体结合，和改变受体二聚化或多聚化。水溶性聚合物可具有其自身的生物活性或可不具有其自身的生物活性，并且可以用作连接子将GH（例如，hGH）与其它物质（包括（但不限于）一种或一种以上的GH（例如，hGH）多肽或一种或一种以上的生物活性分子）连接。合适的聚合物包括（但不限于）聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物（描述在美国专利第5,252,714号中，所述专利以引用的方式并入本文中）、单甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚顺丁烯二酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、包括硫酸葡聚糖的葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物（包括（但不限于）甲基纤维素和羧甲基纤维素）、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇和其衍生物、聚亚烷基二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括（但不限于）聚乙二醇与血清白蛋白。
如本文中所使用的术语“聚亚烷基二醇”或“聚(烯烃二醇)”指的是聚乙二醇（聚(乙二醇)）、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”和/或“聚乙二醇”涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量在0.1kDa与100kDa之间。举例而言，在诸如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications”（2001）的商业供应商的商品目录中列举了其它示范性实施例。
除非另有说明，否则术语“芳基”意谓多不饱和芳族烃取代基，其可为单环或稠合在一起或共价连接的多环（包括（但不限于）1至3环）。术语“杂芳基”指的是含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基（或环），其中氮原子和硫原子视需要可被氧化且氮原子视需要可被季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分相连接。芳基与杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基与杂芳基环系统中各者的取代基是选自下面所述的可接受取代基的群组。
为了简便起见，术语“芳基”当与其它术语（包括（但不限于）芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基）组合使用时包括如上所定义的芳基和杂芳基。因而，术语“芳基烷基”意欲包括芳基与烷基相连接的那些基团（包括（但不限于）苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等），其包括碳原子（包括（但不限于）亚甲基）已经为（例如）氧原子（包括（但不限于）苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基等等）所置换的那些烷基。
上面各术语（包括（但不限于）“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”）意欲包括所示基团的经取代的形式和未经取代的形式。下面提供各类基团的示范性取代基。
烷基和杂烷基（包括常称为亚烃基、烯基、杂亚烃基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团）的取代基可为多种选自（但不限于）以下基团的基团中的一个或一个以上的基团：-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2，数量在0至(2m'+l)范围内变化，其中m'为所述基团中的碳原子总数。R'、R"、R'"和R""各自独立指的是氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基（包括（但不限于）经1-3个卤素原子取代的芳基）、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。举例而言，当本发明的化合物包括多个R基团时，如同当R'、R"、R'"和R""基团中的多个基团存在时其各自是独立地加以选定的那样，各个R基团也是独立地加以选定的。当R'和R"与同一氮原子相连接时，它们可与所述氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。举例而言，-NR'R"意欲包括（但不限于）1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上面论述，所属领域的技术人员将了解，术语“烷基”意欲包括包含与非氢基团相键结的碳原子的基团，诸如卤烷基（包括（但不限于）-CF3和-CH2CF3）和酰基（包括（但不限于）-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等）。
类似于关于烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基可变化且是选自（但不限于）以下基团：卤素、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R"')-NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟基(C1-C4)烷氧基和氟基(C1-C4)烷基，数量在0至芳族环系统上的可用价总数范围内变化；且其中R'、R"、R'"和R""是独立选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例而言，当本发明的化合物包括多个R基团时，如同当R'、R"、R'"和R""基团中的多个基团存在时其各自是独立地加以选定的那样，各个R基团也是独立地加以选定的。
如本文中所使用的术语“经调控的血清半衰期”意谓经修饰的hGH的循环半衰期相对于其未修饰形式的正性或负性变化。血清半衰期是通过在投予hGH后的各个时间点采集血液样本并测定各个样本中的分子浓度来测量。血清浓度与时间的相互关系使得血清半衰期可计算。希望延长的血清半衰期具有至少约两倍，但是（例如）在其能提供令人满意的给药方案或避免毒性效应的情况下较小的延长可能是有用的。在一些实施例中，延长量为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文中所使用的术语“经调控的治疗半衰期”意谓治疗有效量的经修饰的hGH的半衰期相对于其未修饰形式的正性或负性变化。治疗半衰期是通过在投药后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效性质来测量。希望延长的治疗半衰期能提供特定有益的给药方案、特定有益的总剂量或避免不良效应。在一些实施例中，延长的治疗半衰期由增强的效能、修饰分子与其靶点的增强或减弱的结合、通过酶（诸如，蛋白酶）进行的分子分解的增强或减弱，或未修饰分子的另一参数或作用机理的增强（加）或减弱（小）而产生。
术语“分离”当应用于核酸或蛋白质时，其表示所述核酸或蛋白质不含有至少一些在天然状态下与其缔合的细胞组分，或表示所述核酸或蛋白质已经被浓缩到大于其在活体内或活体外产生的浓度的水平。其可呈均态。被分离的物质可呈干燥状态或半干状态，或者处于溶液（包括（但不限于）水溶液）状态。其可为包含另外的医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。纯度和均质性通常是使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定。为存在于制剂中的最主要物质的蛋白质是大体上纯化的。具体来说，被分离的基因是从侧接基因并编码不同于所关注的基因的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上为一条的带。确切地说，其可以意谓核酸或蛋白质的纯度为至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更大纯度。
术语“核酸”指的是呈单股链形式或双股链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特别限制，否则术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有特别限制，否则所述术语也指的是包括PNA（肽核酸）、用于反义技术中的DNA的类似物（硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等）的寡核苷酸类似物。除非另外指出，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指示的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而达成，其中一个或一个以上选定的（或全部）密码子的第三位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代（Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081（1991）；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608（1985）；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8:91-98（1994））。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用以用来指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上的氨基酸残基为非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用的术语涵盖具有任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”指的是天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见的氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，具有与氢、羧基、氨基和R基团键结的α碳的化合物，诸如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基团（诸如，正亮氨酸）或经修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
氨基酸在本文中可以通过其通常已知的3字母符号或者通过由IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推荐的1字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其通常被接受的单字母代码来提及。
“经保守修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列来说，“经保守修饰的变异体”指的是编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列时，指的是基本上相同的序列。由于遗传密码的简并，许多功能相同的核酸编码任何指定蛋白质。举例而言，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因而，在丙氨酸是由密码子来确定的每一个位置处，所述密码子能够被改变成所描述的任何对应密码子而不改变所编码的多肽。所述核酸变化是“静止变化”，其为一种保守修饰的变化。本文中编码多肽的每一个核酸序列也描述核酸的每一种可能的静止变化。所属领域的技术人员将认识到，核酸中的各个密码子（除通常仅为甲硫氨酸的密码子的AUG和通常仅为色氨酸的密码子的TGG外）能被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各种静止变化隐含在所描述的各个序列中。
关于氨基酸序列，所属领域的技术人员将认识到，改变、添加或除去所编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是一种“保守修饰的变化”，其中所述改变引起氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化学性质相似的氨基酸对氨基酸的取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表对于所属领域的技术人员来说是已知的。如此的经保守修饰的变异体是除本发明的多态变异体、种间同系物和等位基因之外的变异体并且不排除本发明的多态变异体、种间同系物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表对于所属领域的技术人员来说是已知的。以下八组各含有为彼此的保守取代的氨基酸：
1）丙氨酸（A）、甘氨酸（G）；
2）天门冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；
3）天门冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）；
4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）；
5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）、缬氨酸（V）；
6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）；
7）丝氨酸（S）、苏氨酸（T）；和
8）半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）
（参见，例如，Creighton，Proteins:Structures and Molecular Properties，W H Freeman&Co.；第二版（1993年12月））
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或百分比“同一性”指的是两个或两个以上为相同的序列或子序列。当在比较窗口上或指定区域上比较和比对最大对应性时，如使用以下序列比较算法（或所属领域的技术人员可利用的其它算法）中的一种算法或通过手工比对和目视检查而测得，如果序列具有为相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比（即，在规定区域上有至少约60%的同一性、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的同一性），那么所述序列就是“大体上相同的”。此定义也指的是测试序列的互补序列。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或存在于长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在未规定时，跨越多聚核苷酸或多肽的整个序列。
对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，（必要时）指定子序列坐标并且指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或可指定替代性参数。序列比较算法随后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文中所使用的“比较窗口”包括涉及具有选自由20到600、通常为约50到约200、更通常为约100到约150组成的群组中的任何一毗连位数的区段，其中在两个序列被最佳比对后，可将一序列与具有相同毗连位数的参考序列相比较。用于比较的序列比对方法对于所属领域的技术人员来说是已知的。用于比较的最佳序列比对，可包括（但不限于）通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'I.Acad.Sci.USA85:2444的寻找相似性方法，通过这些算法的计算机化实施（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA），或通过手工比对和目视检查（参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology（1995增刊））来进行。
适合用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别被描述于Altschul等人（1997）Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人（1990）J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过能在www.ncbi.nlm.nih.gov网址得到的National Center for Biotechnology Information而公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（用于核苷酸序列）使用字长（W）为11、期望值（E）为10、M=5、N=-4和两股链的比较作为默认值。就氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长为3和期望值（E）为10作为默认值，并且BLOSUM62记分矩阵（参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915）使用比对值（B）为50、期望值（E）为10、M=5、N=-4和两股链的比较作为默认值。BLAST算法通常是在“低复杂度”滤波器关闭时执行。
BLAST算法也执行两个序列之间的相似性的统计分析（参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787）。由BLAST算法提供的相似性的一种量度为最小和概率（P（N）），其表示两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率。举例而言，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么视所述核酸与参考序列相似。
短语“选择性地（或特异性地）与……杂交”指的是当一特定核苷酸序列存在于复杂混合物（包括（但不限于）总细胞或文库DNA或RNA）中时，在严格杂交条件下，分子仅与所述核苷酸序列结合、复合或杂交。
短语“严格杂交条件”指的是在如此项技术中已知的低离子强度和高温条件下，使DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列进行杂交。通常，在严格条件下，探针将与核酸的复杂混合物（包括（但不限于）总细胞或文库DNA或RNA）中的其靶子序列杂交，但不与所述复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将为不同的。较长的序列特别在较高的温度下杂交。核酸杂交的广泛指南可见于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays”（1993）中。通常，将严格条件选定为比在确定的离子强度、pH值下的特定序列的热力学熔点（Tm）低约5-10℃。Tm是在平衡状态下50%与靶互补的探针与靶序列杂交（因为在Tm下靶序列过量存在，所以在平衡状态下占用50%的探针）时的温度（在确定的离子强度、pH值和核酸浓度下）。严格条件可以是在7.0到8.3的pH值下，盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度（或其它盐）并且对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）来说，温度为至少约30℃且对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）来说，温度为至少约60℃的那些严格条件。严格条件也可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性杂交或特异性杂交来说，正信号可以为至少2倍背景杂交，视需要为10倍背景杂交。示范性严格杂交条件可如下：50%甲酰胺、5X SSC和1%SDS，在42℃下培育，或5X SSC、1%SDS，在65℃下培育，并在65℃下，在0.2X SSC和0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可执行5、15、30、60、120或120分钟以上。
如本文中所使用的术语“真核生物”指的是属于真核生物种系发生域（phylogeneticdomain Eucarya）的生物体，诸如，动物（包括（但不限于）哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟等）、纤毛虫、植物（包括（但不限于）单子叶植物、双子叶植物、藻类等）、真菌、酵母、鞭毛虫、微粒子虫目、原生生物等。
如本文中所使用的术语“非真核生物”指的是非真核有机体。举例而言，非真核有机体可属于真细菌（包括（但不限于）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）、嗜热细菌（Thermus thermophilics）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）等）种系发生域，或古菌（包括（但不限于）詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）、横川病毒（Methanobacterium thermoautotrophicum）、诸如沃氏嗜盐富饶菌（Haloferax volcanii）和嗜盐杆菌种（Halobacterium species）NRC-1的嗜盐杆菌属（Halobacterium）、闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）、激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）、堀越氏火球菌（Pyrococcus horikoshii）、嗜热菌敏捷气热菌（Aeuropyrum pernix）等）种系发生域。
如本文中所使用的术语“受检者”指的是动物，在一些实施例中为哺乳动物，并且在其它实施例中为人类，其为治疗、观察或实验的对象。
如本文中所使用的术语“有效量”指的是所投予的经修饰的非天然氨基酸多肽的量，其在某种程度上将减轻正治疗的疾病、病症或失调症的一种或一种以上的症状。可投予含有本文所述的经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物来用于预防性、增强性和/或治疗性的治疗。
术语“增强”意谓增加或延长所要效果的效力或持续时间。因此，就增强治疗剂的效果来说，术语“增强”指的是在效力或持续时间方面，增加或延长其它治疗剂对系统所起的效果的能力。如本文中所使用的“增强有效量”指的是足以增强所要系统中另一治疗剂的效果的量。当用于患者时，有效用于此用途的量将视疾病、失调症或病症的严重程度和病程、先前治疗、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断而定。
如本文中所使用的术语“经修饰”指的是对指定多肽所作的任何改变，诸如，改变多肽的长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰。术语“（经修饰的）”形式意谓所讨论的多肽视需要被修饰，即，所讨论的多肽可被修饰或不被修饰。
术语“经翻译后修饰的”指的是天然或非天然氨基酸在其已经并入多肽链中后对所述氨基酸所作的任何修饰。所述术语涵盖（仅举例来说）共翻译的活体内修饰、共翻译的活体外修饰（诸如，在无细胞翻译系统中）、翻译后的活体内修饰和翻译后的活体外修饰。
在预防性应用中，将含有经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物投予易于患上特定疾病、失调症或病症或者不然冒有患上特定疾病、失调症或病症的危险的患者。将所述量定义为“预防有效量”。在此种用途中，精确的量也视患者的健康状态、体重等等因素而定。所属领域的技术人员对通过常规实验（例如，剂量递增临床试验）来确定所述预防有效量有充分了解。
术语“经保护的”指的是防止化学反应性官能团在某些反应条件下发生反应的“保护基”或部分的存在。保护基将视被保护的化学反应性基团的类型而变化。举例而言，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基（t-Boc）和9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）的群组。如果化学反应性基团是硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团是诸如丁酸或丙酸的羧酸的基团，或羟基，那么保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。此项技术中已知的其它保护基，包括诸如Nvoc和MeNvoc的对光不稳定的基团，也可以用于本文所述的方法和组合物中或与本文所述的方法和组合物一起使用。此项技术中已知的其它保护基也可以用于本文所述的方法和组合物中或与本文所述的方法和组合物一起使用。
仅举例来说，封端基/保护基可以选自下列基团。
Figure BDA0000437277490000391
其它保护基是描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley&Sons,New York,NY,1999中，所述参考文献全文以引用的方式并入本文中。
在治疗应用中，将含有经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物投予已患有疾病、病症或失调症的患者，其量足以治愈或至少在某种程度上抑制疾病、失调症或病症的症状。将所述量定义为“治疗有效量”，并且其将视疾病、失调症或病症的严重程度和病程、先前治疗、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断而定。所属领域的技术人员对通过常规实验（例如，剂量递增临床试验）来确定所述治疗有效量有充分了解。
术语“治疗”是用来指预防性和/或治疗性治疗。
本文提供的非天然编码的氨基酸多肽可以包括经同位素标记的化合物，其具有一个或一个以上的为具有不同于自然界中常见的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子所置换的原子。能并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别诸如为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文所述的某些经同位素标记的化合物，例如将诸如3H和14C的放射性同位素并入其中的那些化合物，可用于药物和/或基质组织分布分析。另外，用诸如氘（即，2H）的同位素来取代能提供某些由于较高代谢稳定性而导致的治疗优势，例如，延长的活体内半衰期或降低的剂量需求。
包括（但不限于）非对映异构体、对映异构体和其混合物的所有异构体被视为本文所述的组合物的一部分。在另外或其它实施例中，非天然编码的氨基酸多肽在投予有需要的生物体后发生代谢而产生代谢物，随后所述代谢物用于产生所要效果，包括所要治疗效果。在其它或另外实施例中的是非天然编码的氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情况下，非天然编码的氨基酸多肽可以呈互变异构体形式存在。此外，本文所述的非天然编码的氨基酸多肽可以非溶剂化形式以及与诸如水、乙醇等等的医药学上可接受的溶剂一起形成的溶剂化形式存在。溶剂化形式也被视为在本文中有揭示。所属领域的技术人员将认识到，本文中的一些化合物可以若干互变异构形式存在。所有所述互变异构形式被视为本文所述的组合物的一部分。
除非另有说明，否则采用属于此项技术技能范围的质谱分析、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
实施方式
I.引言
在本发明中提供包含至少一个非天然氨基酸的GH（例如，hGH）分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的GH（例如，hGH）多肽包括至少一种翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一种翻译后修饰包含利用所属领域的技术人员已知的适用于特定反应性基团的化学方法将包含第二反应性基团的包括（但不限于）以下物质的分子与包含第一反应性基团的至少一个非天然氨基酸相连接：标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交联剂、放射性核素、细胞毒素化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、共价地或非共价地与其它分子相互作用的基团、光笼锁部分（photocaged moiety）、光化辐射可激发部分、光敏异构化部分、生物素、生物素的衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、伸长的侧链、经碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记的部分、生物物理学探针、发磷光的基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测的标记、小分子、量子点、纳米传导物、放射性核苷酸、放射性传导物、中子俘获剂或上述物质的任何组合或任何其它所要的化合物或物质。举例而言，所述第一反应性基团为炔基部分（包括（但不限于）在炔丙基有时也被称为乙炔部分时，在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中）且所述第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法。在另一个实施例中，第一反应性基团为叠氮基部分（包括（但不限于）在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中）且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰的GH（例如，hGH）多肽的某些实施例中，使用包含至少一种翻译后修饰的至少一个非天然氨基酸（包括（但不限于）含有酮基官能团的非天然氨基酸），其中所述至少一种翻译后修饰包含糖类部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在活体内于真核细胞中或于非真核细胞中进行。
在某些实施例中，蛋白质包括至少一种通过一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰一般不通过另一种宿主细胞类型来进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一种通过真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰一般不通过非真核细胞来进行。翻译后修饰的实例包括（但不限于）糖基化作用、乙酰化作用、酰化作用、脂质修饰、棕榈酰化作用、棕榈酸酯添加、磷酸化作用、糖脂键修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天门冬酰胺键使寡糖与天门冬酰胺相连接（包括（但不限于）其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等情况）。在另一个实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸键、GalNAc-苏氨酸键、GlcNAc-丝氨酸键或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖（包括（但不限于）Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等）与丝氨酸或苏氨酸相连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌序列或定位序列、抗原決定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等等。分泌信号序列的实例包括（但不限于）原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、5'最佳化以用于细菌表达的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸裂合酶分泌信号序列、OmpA分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括（但不限于）STII（原核）、Fd GIII和M13（噬菌体）、Bgl2（酵母）和源自转座子的信号序列bla。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或10个或10个以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可为相同的或不同的，例如，在蛋白质中可存在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的部位。在某些实施例中，存在于蛋白质的天然存在的形式中的至少一个（但少于总数）的特定氨基酸经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员（特别为hGH）的方法和组合物。将至少一个非天然编码的氨基酸引入GH超基因家族成员中可使得涉及（包括（但不限于））与一个或一个以上非天然编码的氨基酸的特定化学反应但不与通常存在的20种氨基酸反应的结合化学作用得以应用。在一些实施例中，包含非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员通过非天然编码的氨基酸的侧链与诸如聚乙二醇（PEG）的水溶性聚合物相连接。本发明提供一种用PEG衍生物选择性地修饰蛋白质的高效方法，其涉及响应于选择密码子将非遗传编码的氨基酸（包括（但不限于）含有在20种天然并入的氨基酸中不存在且包括（但不限于）酮部分、叠氮部分或乙炔部分的官能团或取代基的那些氨基酸）选择性并入蛋白质中，和随后用反应性适当的PEG衍生物来修饰那些氨基酸。一旦并入后，接着就能通过利用所属领域的技术人员已知的适用于存在于非天然编码的氨基酸中的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于本发明将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括（但不限于）分别使包括（但不限于）乙炔或叠氮衍生物发生胡氏根[3+2]环加成反应（参见，例如，Padwa,A.，在Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，（1991），Trost,B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页中；和Huisgen,R.，在1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，（1984），Padwa,A.编，Wiley，New York，第1-176页中）。
因为胡氏根[3+2]环加成方法涉及环加成反应而不是亲核取代反应，所以能以非常高的选择性对蛋白质进行修饰。其反应可以在室温、水性条件下通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中而以极佳的区域选择性（1,4>1,5）进行。参见，例如，Tornoe等人，（2002）J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人，（2002）Angew.Chem.Int. Ed.41:2596-2599；和WO03/101972。可以通过[3+2]环加成反应加入到本发明的蛋白质中的分子包括具有合适官能团或取代基的几乎任何分子，包括（但不限于）叠氮基或乙炔衍生物。这些分子可以分别加入到具有乙炔基的非天然的氨基酸（包括（但不限于）对炔丙基氧基苯丙氨酸）或具有叠氮基的非天然的氨基酸（包括（但不限于）对叠氮基苯丙氨酸）中。
由胡氏根[3+2]环加成反应得到的五元环在还原环境下一般不可逆，且在水性环境下于长期时间内具有抗水解稳定性。因此，多种物质的物理和化学特性可用本发明的活性PEG衍生物在要求高的水性条件下来修饰。甚至更为重要的是因为叠氮部分和乙炔部分相互间是特异性的（且例如不与20种常见的遗传编码的氨基酸中的任一种氨基酸反应），所以能以非常高的选择性在一个或一个以上的特定部位上对蛋白质进行修饰。
本发明也提供具有一个或一个以上的乙炔部分或叠氮部分的PEG衍生物和相关亲水性聚合物的具水溶性和水解稳定性的衍生物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对与已响应于选择密码子选择性地引入蛋白质中的叠氮部分偶合具有高度选择性。同样地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对与已响应于选择密码子选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有高度选择性。
更明确地说，叠氮部分包含（但不限于）烷基叠氮部分、芳基叠氮部分和该等叠氮部分的衍生物。只要维持乙炔特异反应性，烷基叠氮部分和芳基叠氮部分的衍生物可以包括其它取代基。乙炔部分包含烷基乙炔部分和芳基乙炔部分和各自的衍生物。只要维持叠氮特异反应性，烷基乙炔部分和芳基乙炔部分的衍生物可以包括其它取代基。
本发明提供具有各种官能团、取代基或部分的物质与包括（但不限于）以下物质的其它物质的结合物：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光致交联剂；放射性核素；细胞毒素化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅助因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸；DNA；RNA；反义多聚核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；共价地或非共价地与其它分子相互作用的基团；光笼锁部分；光化辐射可激发部分；光敏异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学裂解的基团；可光致裂解的基团；伸长的侧链；经碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；经同位素标记的部分；生物物理学探针；发磷光的基团；化学发光基团；电子密集基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记；小分子；量子点；纳米传导物；放射性核苷酸；放射性传导物；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所要化合物或物质。本发明也包括具有叠氮部分或乙炔部分的物质与具有相应乙炔部分或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可在蛋白质中含有具有乙炔官能团的非遗传编码的氨基酸的位置处与生物活性分子相偶合。PEG与生物活性分子相偶合的键接包括（但不限于）胡氏根[3+2]环加成键接。
此项技术中已充分确定PEG可用于修饰生物材料的表面（参见，例如，美国专利第6,610,281号；Mehvar,R.,J.Pharm Pharm Sci.,3(1):125-136（2000），其以引用的方式并入本文中）。本发明也包括包含具有一个或一个以上的反应性叠氮部位或乙炔部位的表面和一种或一种以上本发明的通过胡氏根[3+2]环加成键接与所述表面相偶合的含叠氮部分或乙炔部分的聚合物的生物材料。生物材料和其它物质也可通过不同于叠氮键接或乙炔键接的键接（诸如，通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键接）与叠氮或乙炔活化的聚合物衍生物相偶合以使叠氮部分或乙炔部分可用于随后反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮部分和含乙炔部分的聚合物的方法。在含叠氮部分的PEG衍生物的情况下，叠氮部分可直接与聚合物的碳原子相键结。或者，含叠氮部分的PEG衍生物可以通过使在一个末端具有叠氮部分的键接剂与常规的活化聚合物相连接来制备以便使所得的聚合物在其末端具有叠氮部分。在含乙炔部分的PEG衍生物的情况下，乙炔部分可以直接与聚合物的碳原子相键结。或者，含乙炔部分的PEG衍生物可以通过使在一个末端具有乙炔部分的键接剂与常规的活化聚合物相连接来制备以便使所得的聚合物在其末端具有乙炔部分。
更明确地说，在含叠氮部分的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物发生反应而产生在其上具有更具反应性的部分（诸如，甲磺酸盐、三氟乙磺酸盐、甲苯磺酸盐或卤素离去基团）的经取代聚合物。含有磺酰基酸卤化物、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和使用对于所属领域的技术人员来说是已知的。所得的经取代的聚合物接着发生反应而在聚合物的末端以叠氮部分取代所述更具反应性的部分。或者，具有至少一个活性的亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端具有叠氮部分的键接剂反应以便在PEG聚合物与键接剂之间形成共价键并且使叠氮部分位于聚合物的末端。包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等的亲核和亲电子部分对于所属领域的技术人员来说是已知的。
更明确地说，在含乙炔部分的PEG衍生物情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物发生反应而由含有乙炔部分的前体置换卤素或其它活化的离去基团。或者，具有至少一个活性的亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端具有乙炔部分的键接剂反应以便在PEG聚合物与键接剂之间形成共价键并且使乙炔部分位于聚合物的末端。在有机合成部分中和在PEG衍生物的制备和使用中卤素部分、活化的离去基团、亲核和亲电子部分的使用对于所属领域的技术人员而言是充分确定的。
本发明也提供一种对蛋白质进行选择性修饰以将其它物质（包括（但不限于）水溶性聚合物，诸如，PEG和PEG衍生物，其含有叠氮部分和乙炔部分）加入到经修饰的蛋白质中的方法。含叠氮部分和乙炔部分的PEG衍生物可用于改变生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性较为重要的表面和分子的性质，而同时提供使PEG衍生物与蛋白质相连接的比此项技术中先前已知的手段更具选择性的手段。
II.生长激素超基因家族
以下蛋白质包括由生长激素（GH）超基因家族的基因所编码的那些蛋白质（Bazan,F.,Immunology Today11:350-354(1990);Bazan,J.F.Science257:410-413（1992）；Mott,H.R.和Campbell,I.D.,Current Opinion in Structural Biology5:114-121（1995）；Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.,SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS（1996））：生长激素、催乳激素、胎盘催乳质、促红细胞生成素（EPO）、血栓形成素（TPO）、白细胞间介素-2（IL-2）、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12（p35亚单位）、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和心肌营养素-1（CT-1）（“GH超基因家族”）。可预期此基因家族的另外成员将在将来通过基因克隆和定序来鉴别。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列同一性，但是其具有类似的二级和三级结构。共有的结构特征使基因家族的新成员容易被鉴别并且使本文所述的非天然的氨基酸方法和组合物得以类似地加以应用。考虑到GH超基因家族的成员之间的结构同源性程度，可以利用本发明将非天然编码的氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。此蛋白质家族中的每个成员皆包含一个四螺旋束，在图1中显示其一般结构。在图2、图3、图4和图5中分别显示家族成员hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的一般结构。
包括G-CSF（Zink等人，FEBS Lett.314:435（1992）；Zink等人,Biochemistry33:8453（1994）；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5167（1993））、GM-CSF（Diederichs,K.等人，Science154:1779-1782（1991）；Walter等人，J.Mol.Biol224:1075-1085（1992））、IL-2（Bazan,J.F.和McKay,D.B.，Science257:410-413（1992））、IL-4（Redfield等人，Biochemistry30:11029-11035（1991）；Powers等人，Science256:1673-1677（1992））和IL-5（Milburn等人，Nature363:172-176（1993））的大量细胞因子的结构已经通过X射线衍射和NMR研究加以确定并且尽管缺乏显著的一级序列同源性，但是其显示就GH结构而言有惊人的保守性。基于建模和其它研究，IFN被认为是此家族的成员（Lee等人，J.Interferon Cytokine Res.15:341（1995）；Murgolo等人，Proteins17:62（1993）；Radhakrishnan等人，Structure4:1453（1996）；Klaus等人，J.Mol.Biol.274:661（1997））。基于建模和突变研究，EPO被认为是此家族的成员（Boissel等人，J.Biol.Chem.268:15983-15993（1993）；Wen等人，J.Biol.Chem.269:22839-22846（1994））。现认为所有上述细胞因子和生长因子构成一个大的基因家族。
除具有相似的二级和三级结构之外，此家族的成员共有的性质为其必定使细胞表面受体发生寡聚化以激活细胞内信号传递路径。包括（但不限于）GH和EPO的一些GH家族成员与单一类型的受体相结合并且使其形成同源二聚体。包括（但不限于）IL-2、IL-4和IL-6的其它家族成员与多于一种类型的受体相结合并且使所述受体形成杂二聚体或高级聚集体（Davis等人,（1993），Science260:1805-1808；Paonessa等人，（1995），EMBO J.14:1942-1951；Mott和Campbell,Current Opinion in Structural Biology5:114-121（1995））。突变研究已显示，这些其它的细胞因子和生长因子如同GH含有多个受体结合部位，通常为2个受体结合部位，并且依序结合其同源受体（Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology5:114-121（1995）；Matthews等人，（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9471-9476）。如同GH，这些其它的家族成员的主要受体结合部位主要存在于4个α螺旋和A-B环中。参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸在家庭成员之间不相同。与GH超基因家族的成员相互作用的大部分细胞表面受体在结构上是相关的并且构成第二个大的多基因家族。参见，例如，美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。
从GH超基因家族的各个成员的突变研究中得到的一般结论是连接α螺旋的环一般不趋向于涉及到受体结合中。特别是，短B-C环显现对于多数（如果不是所有的话）的家族成员的受体结合来说为非必需的。为此，在GH超基因家族的成员中，B-C环可以经如本文所述的非天然编码的氨基酸取代。A-B环、C-D环（和GH超家族的干扰素/IL-10样成员的D-E环）也可以经非天然存在的氨基酸取代。接近螺旋结构A并且远离最后螺旋结构的氨基酸也不趋向于涉及到受体结合中并且也可以是用于引入非天然存在的氨基酸的部位。在一些实施例中，在包括（但不限于）A-B、B-C、C-D或D-E环的前1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或7个以上的氨基酸的环结构内的任何位置处用非天然编码的氨基酸取代。在一些实施例中，在A-B、B-C、C-D或D-E环的后1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或7个以上的氨基酸内用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
包括（但不限于）EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干扰素的GH家族的某些成员含有N-连接和/或O-连接的糖。蛋白质中的糖基化作用部位几乎完全存在于环区域中而不存在于α螺旋束中。因为环区域一般不涉及到受体结合中并且因为其是用于糖基团的共价连接的部位，所以其可以是用于将非天然存在的氨基酸取代引入蛋白质中的有用部位。在蛋白质中包含N-连接和O-连接的糖基化作用部位的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸取代的部位，原因在于这些氨基酸是表面暴露的。因此，天然蛋白质能容许在这些部位可有庞大的糖基团与蛋白质相连接并且糖基化作用部位趋向于位于远离受体结合部位处。
有可能在将来发现GH超基因家族的其它成员。GH超基因家族的新成员可以通过对预测蛋白质序列的计算机辅助二级和三级结构分析以及通过经设计用来鉴别与特定靶相结合的分子的选择技术而鉴别。GH超基因家族的成员通常具有4个或5个通过非螺旋状氨基酸（环区域）连接的两亲螺旋结构。蛋白质可以在其N端含有疏水性信号序列以促进细胞分泌。这些后来发现的GH超基因家族的成员也包括在本发明中。相关申请案是2005年8月18日公开为WO05/074650的标题为“Modified Four Helical BundlePolypeptides and Their Uses”的国际专利申请案，其以引用的方式并入本文。
因此，提供生长激素超基因家族的描述，仅仅是出于说明性目的并且仅为实例，而并非为对本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外，在本申请案中提及GH多肽旨在使用这一通用术语作为任何GH超基因家族成员的实例。因此，应了解本文中关于hGH多肽或蛋白质所述的修饰和化学作用能同样地适用于GH超基因家族的任何成员，包括本文中特定列出的那些成员。
III.供本发明使用的一般重组核酸方法
在本发明的许多实施例中，将使用重组方法来分离、克隆且常常为用来改变编码所关注的GH（例如，hGH）多肽的核酸。将所述实施例用于（包括（但不限于））蛋白质表达或在源自GH（例如，hGH）多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间使用所述实施例。在一些实施例中，将编码本发明的多肽的序列可操纵地连接到异源启动子。宿主细胞中hGH的分离和GH的产生是在例如美国专利第4,601,980号、第4,604,359号、第4,634,677号、第4,658,021号、第4,898,830号、第5,424,199号、第5,795,745号、第5,854,026号、第5,849,535号、第6,004,931号、第6,022,711号、第6,143,523号和第6,608,183号中加以描述，所述专利以引用的方式并入本文中。
编码包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的核苷酸序列可以是基于包括（但不限于）具有SEQ ID NO:2（hGH）中所示的氨基酸序列的母体多肽的氨基酸序列来合成的，并且接着改变核苷酸序列以便实现相关氨基酸残基的引入（即，并入或取代）或除去（即，缺失或取代）。核苷酸序列可以便利地根据常规方法通过定点突变而被修饰。或者，核苷酸序列可以通过化学合成来制备，包括（但不限于）通过使用寡核苷酸合成器（其中寡核苷酸是基于所要多肽的氨基酸序列而设计）并且优先选择在将产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子来制备。举例而言，一些编码部分所要多肽的小寡核苷酸可以通过PCR、连接或连接链式反应来合成和装配。参见，例如，Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193（1991）；美国专利第6,521,427号，其以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示用于本发明的一般方法的基本文章包括Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual（第3版，2001）；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual（1990）；和Current Protocols inMolecular Biology（Ausubel等人编，1994）。
描述分子生物学技术的一般文章包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques.Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA（Berger）；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual（第2版），第1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989（“Sambrook”）和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.（经由1999年加以补充）（“Ausubel”）。这些文章描述突变，载体、启动子的使用和许多其它关于（包括（但不限于））基因或多聚核苷酸的产生的相关主题，所述基因或多聚核苷酸包括用于产生包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交的合成酶和其配对。
本发明中使用各种类型的突变用于各种目的，包括（但不限于）产生新颖的合成酶或tRNA，使tRNA分子突变，使编码合成酶的多聚核苷酸突变，产生tRNA库，产生合成酶库，产生选择密码子，使编码非天然氨基酸的选择密码子插入所关注的蛋白质或多肽中。所述突变包括（但不限于）定点突变、随机点突变、同源重组、DNA改组或其它回归突变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的突变、寡核苷酸定向突变、经硫代磷酸酯修饰的DNA突变、使用缺口双链DNA的突变等等或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株的突变、限制-选择和限制-纯化、缺失突变、通过总基因合成的突变、双链断裂修复等等。包括（但不限于）涉及嵌合构建的突变也包括在本发明中。在一个实施例中，突变可通过天然存在的分子或已改变或突变的天然存在的分子的已知信息来加以指导，所述信息包括（但不限于）序列、序列比较、物理性质、二级、三级或四级结构、晶体结构等等信息。
本文中所见的文章和实例描述这些程序。其它信息见于以下公开案和其中引用的参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis:an overview,Anal Biochem.254(2):157-178（1997）；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374（1996）；Smith,In vitromutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462（1985）；Botstein&Shortle,Strategies andapplications of in vitro mutagenesis,Science229:1193-1201（1985）；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7（1986）；Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，在Nucleic Acids&Molecular Biology（Eckstein,F.和Lilley,D.MJ.编，Springer Verlag,Berlin）（1987）中；Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492（1985）；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382（1987）；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities,Science242:240-245（1988）；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directedmutagenesis using M13-derived vectors:an efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500（1982）；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clonedinto M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500（1983）；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oligonucleotide primersand a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350（1987）；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA,Nucl.Acids Res.13:8749-8764（1985）；Taylor等人，The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8785（1985）；Nakamaye&Eckstein,Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698（1986）；Sayers等人，5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl. Acids Res.16:791-802（1988）；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceof ethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814；Kramer等人，The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456（1984）；Kramer&Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367（1987）；Kramer等人，Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207（1988）；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999（1988）；Kramer等人，Differentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli,Cell38:879-887（1984）；Carter等人，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443（1985）；Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors,Methods in Enzymol.154:382-403（1987）；Eghtedarzadeh&Henikoff,Use ofoligonucleotides to generate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115（1986）；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil. Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423（1986）；Nambiar等人，Total synthesis and cloning ofa gene coding for the ribonuclease Sprotein,Science223:1299-1301（1984）；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for theα-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372（1988）；Wells等人，Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiplemutations at defined sites,Gene34:315-323（1985）；
Figure BDA0000437277490000501
等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale'shot-gun'gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316（1985）；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repairin plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,83:7177-7181（1986）；Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology4:450-455（1993）；Sieber等人，Nature Biotechnology,19:456-460（2001）；W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91（1994）；和I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8（1995）。有关许多上述方法的其它详细描述可见于Methods in Enzymology第154卷中，其也描述对使用各种突变方法的故障查找排除问题的有效控制。
（例如）用于例如使合成酶库突变或改变tRNA的本发明的突变的寡核苷酸通常是根据Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862，（1981）所述的固相亚磷酰胺三酯方法，如Needham-VanDevanter等人，Nucleic Acids Res.,12:6159-6168（1984）中所述（例如）使用自动合成器而化学合成。
本发明也涉及通过正交tRNA/RS对在活体内将非天然氨基酸并入的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。宿主细胞是用本发明的多聚核苷酸或包括本发明的多聚核苷酸的构建物（包括（但不限于）本发明的载体，其可例如为克隆载体或表达载体）而加以基因改造（包括（但不限于）转化、转导或转染）。举例而言，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和待衍生化的蛋白质的编码区域可操纵地连接到在所要宿主细胞中起作用的基因表达控制元件。载体可（例如）呈质粒、粘质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸露的多聚核苷酸或结合的多聚核苷酸形式。载体是通过包括以下方法的标准方法引入细胞和/或微生物中：电穿孔（Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824（1985））、由病毒载体感染、在小珠或粒子的基质中或在表面上具有核酸的小粒子的高速弹道渗透作用（Klein等人，Nature327.70-73（1987））和/或诸如此类。
经改造的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述营养培养基在适当时为了诸如筛选步骤、活化启动子或选择转化体的活性而加以改质。可视需要将这些细胞在转基因生物体中培养。包括（但不限于）关于细胞分离和培养（例如，关于随后的核酸分离）的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss,New York和其中所引用的参考文献；Payne等人（1992）Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips（编）（1995）Plant Cell,Tissue and Organ Culture；FundamentalMethods Springer Lab Manual,Springer-Verlag（Berlin Heidelberg New York）和Atlas和Parks（编）The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。
将靶核酸引入细胞中的一些熟知的方法是可利用的，其中的任何方法可用于本发明中。这些方法包括：使接受者细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、抛射体轰击和用病毒载体进行感染（下文中进一步讨论）等。细菌细胞可用来增大含有本发明的DNA构建物的质粒的数量。使细菌生长到对数期并且细菌中的质粒可通过此项技术中已知的各种方法来分离（参见，例如，Sambrook）。此外，用于从细菌中纯化质粒的试剂盒是市售的（参见，例如，均来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；和来自Qiagen的QIAprepTM）。然后对经分离和纯化的质粒进一步加以处理以产生用来转染细胞或并入相关载体中以感染生物体的其它质粒。典型的载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及启动子（可用于调节特定靶核酸的表达）。载体视需要包含基因表达盒，所述表达盒含有至少一个独立的终止子序列、允许盒在真核生物或原核生物或两种生物中复制的序列（包括（但不限于）穿梭载体）和适于原核系统和真核系统的选择标记物。载体适于在原核生物、真核生物或两种生物中复制和整合。参见，Gillam&Smith,Gene8:81（1979）；Roberts等人，Nature,328:731（1987）；Schneider,E.等人，Protein Expr. Purif.6(1):10-14（1995）；Ausubel,Sambrook,Berger（所有同上）。可用于克隆的细菌和噬菌体的目录（例如）由ATCC提供，例如由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage（1992）Ghema等人（编）。关于定序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序和基础的理论观点也见于Watson等人（1992）Recombinant DNA（第2版）Scientific American Books,NY中。此外，基本上任何核酸（和几乎任何经标记的核酸，无论是标准物还是非标准物）可为从各种商业来源中的任何来源定购的常规物或标准物，所述商业来源诸如Midland Certified Reagent Company（Midland,TX，可在www.mcrc.com上获得）、The Great American Gene Company（Ramona,CA，可在www.genco.com上获得）、ExpressGen Inc.（Chicago,IL，可在www.expressgen.com上获得）、Operon Technologies Inc.（Alameda,CA）和许多其它商业来源。
（a）选择密码子
本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例而言，选择密码子包括（但不限于）单一的三碱基密码子、无义密码子（诸如包括（但不限于）琥珀密码子（UAG）、赭石密码子或蛋白石密码子（UGA）的终止密码子）、非天然密码子、4个或4个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域的技术人员容易了解，能被引入所要基因或多聚核苷酸中的选择密码子的数量范围较宽，包括（但不限于）在编码至少部分hGH多肽的单一多聚核苷酸中，存在1个或1个以上、2个或2个以上、3个或3个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上的选择密码子。
在一个实施例中，方法涉及使用选择密码子，其为用于在细胞中活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸的终止密码子。例如，产生识别包括（但不限于）UAG的终止密码子的O-tRNA，并且通过O-RS以所要的非天然氨基酸使其发生氨基酰化。天然存在的宿主的氨酰基-tRNA合成酶不能识别此O-tRNA。常规的定点突变能用来在所关注的多肽中的关注部位处引入包括（但不限于）TAG的终止密码子。参见，例如，Sayers,J.R.等人（1988），5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis.Nucleic Acids Res,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注的多肽的核酸在活体内结合时，非天然氨基酸是响应于UAG密码子而得以并入以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
非天然氨基酸的活体内并入能在不显著干扰真核宿主细胞的情况下完成。举例而言，因为UAG密码子的抑制功效视包括（但不限于）琥珀抑制tRNA的O-tRNA与真核释放因子（包括（但不限于）eRF）（其与终止密码子相结合并且引发生长中的肽从核糖体释放）之间的竞争而定，所以抑制功效可通过（包括（但不限于））增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节。
非天然氨基酸也能由稀有密码子编码。例如，当活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，已经证明稀有的精氨酸密码子AGG有效于通过经丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。参见，例如，Ma等人，Biochemistry,32:7939（1993）。在此种情况下，合成tRNA与作为较少物质存在于大肠埃希氏杆菌中的天然存在的tRNAArg竞争。一些生物体不使用所有的三联体密码子。藤黄微球菌（Micrococcus luteus）中的未指定的密码子AGA已经被用于在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。参见，例如，Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.,25:4685（1997）。可产生本发明的组分以在活体内使用这些稀有密码子。
选择密码子也包含扩展密码子，包括（但不限于）4个或4个以上碱基密码子，诸如4个、5个、6个或6个以上碱基密码子。四碱基密码子的实例包括（但不限于）AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包括（但不限于）AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包括基于移码抑制使用扩展密码子。4个或4个以上碱基密码子可使包括（但不限于）一个或一个以上非天然氨基酸插入相同蛋白质中。例如，在具有反密码子环（例如，具有至少8-10个核苷酸的反密码子环）的突变O-tRNA（包括（但不限于）特定移码抑制tRNA）存在下，4个或4个以上碱基密码子可被读取为单个氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码包括（但不限于）至少四碱基密码子、至少五碱基密码子或至少六碱基密码子或至少六个以上碱基密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可在相同细胞中使用4个或4个以上碱基密码子编码多个非天然氨基酸。参见，Anderson等人，（2002）Exploring the Limitsof Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244;Magliery,(2001)Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons andIdentification of"Shifty"Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli,J. Mol.Biol.307:755-769。
举例而言，使用活体外生物合成方法，4-碱基密码子已经被用来将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见，例如，Ma等人，（1993）Biochemistry,32:7939；和Hohsaka等人，（1999）J.Am.Chem.Soc,121:34。通过两个经化学酰化的移码抑制tRNA使用CGGG和AGGU同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物活体外并入抗生蛋白链菌素中。参见，例如，Hohsaka等人，（1999）J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子（N可为U、A、G或C）的能力，并且发现四联体UAGA能通过具有UCUA反密码子的tRNALeu以13到26%的效率解码，同时在0或-1框架中很少发生解码。参见，Moore等人，（2000）J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，基于稀有密码子或无义密码子的扩展密码子可用于本发明中，其可减少在其它不需要的部位的错义读取和移码抑制。
对指定的系统来说，选择密码子还可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源性系统不使用（或很少使用）天然碱基密码子。举例而言，所述系统包括缺乏能识别出天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子是稀有密码子的系统。
选择密码子视需要包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有的遗传字母表。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定的和选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真度有效地酶促并入DNA中以及在新生的非天然碱基对合成后有效的连续引物延伸。可适合于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括（例如）Hirao等人，（2002）An unnatural base pair for incorporating aminoacid analogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182。也参见Wu,Y.等人，（2002）J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。
对活体内使用来说，非天然核苷为膜可透过的并且被磷酸化而形成相应的三磷酸盐。此外，增加的遗传信息是稳定的并且不会被细胞酶破坏。Benner和其他人早先尝试利用不同于典型的沃森-克里克（Watson-Crick）对中的那些模式的氢键键合模式，其中最值得注意的实例是iso-C:iso-G对。参见，例如，Switzer等人，（1989）J.Am.Chem.Soc,111:8322；和Piccirilli等人，（1990）Nature,343:33；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602。这些碱基一般而言在某种程度上与天然碱基错配并且不能酶促地复制。Kool和同事证明，碱基之间的疏水性堆积相互作用能代替氢键键合以促使碱基对的形成。参见，Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602；和Guckian和Kool，（1998）Angew.Chem.Int. Ed.Engl.,36,2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成了一系列非天然疏水性碱基并对其作了研究。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对稳定，并且可有效地通过大肠埃希氏杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段（Klenow fragment，KF）并入DNA中。参见，例如，McMinn等人，（1999）J.Am.Chem.Soc,121:11585-6；和Ogawa等人，（2000）J.Am.Chem.Soc,122:3274。3MN:3MN自身配对能通过KF以足以达成生物功能的效率和选择性来合成。参见，例如，Ogawa等人，（2000）J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，两个碱基充当进一步复制的链终止子。最近，已经发展出可用来复制PICS自身配对的突变DNA聚合酶。此外，可复制7AI自身配对。参见，例如，Tae等人，（2001）J.Am.Chem.Soc,123:7439。还已研制出新颖的金属碱基配对Dipic:Py，其在结合铜（II）后形成稳定的配对。参见，Meggers等人，（2000）J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为扩展密码子和非天然密码子本质上与天然密码子正交，所以本发明的方法可以利用这种性质来产生其正交tRNA。
翻译旁路系统也可用来将非天然氨基酸并入所要多肽中。在翻译旁路系统中，大的序列被并入基因中但不被翻译成蛋白质。序列含有充当诱导核糖体跳过序列并且在插入物的下游恢复翻译的提示的结构。
在某些实施例中，本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽（或其部分）是由核酸编码。通常，核酸包含至少1个选择密码子、至少2个选择密码子、至少3个选择密码子、至少4个选择密码子、至少5个选择密码子、至少6个选择密码子、至少7个选择密码子、至少8个选择密码子、至少9个选择密码子、10个或10个以上选择密码子。
编码所关注的蛋白质或多肽的基因可使用所属领域的技术人员所熟知和本文中描述的方法而发生突变以包括（例如）一个或一个以上用于并入非天然氨基酸的选择密码子。举例而言，使所关注的蛋白质的核酸突变而包括供以并入一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。本发明包括任何所述变异体，其包括（但不限于）突变体，（例如）包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质形式。同样地，本发明也包括相应的核酸，即，具有编码一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。
可以容易地使编码所关注的蛋白质（诸如hGH多肽）的核酸分子发生突变以在多肽的任何所要位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸被广泛地用来将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或各种其它分子引入到所关注的蛋白质上。适用于将半胱氨酸并入多肽的所要位置中的方法对于所属领域的技术人员来说是已知的，诸如描述于以引用的方式并入本文中的美国专利第6,608,183号中的那些方法和标准突变技术。
IV.非天然编码的氨基酸
有种类繁多的非天然编码的氨基酸适合用于本发明中。可将任何数量的非天然编码的氨基酸引入GH（例如，hGH）多肽中。一般说来，相对于20种常见的、遗传编码的氨基酸（即，丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）而言，引入的非天然编码的氨基酸大体上为化学惰性的。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括可有效地和选择性地与在20种常见氨基酸中不存在的官能团（包括（但不限于）叠氮基、酮基、醛基和氨基氧基）反应以形成稳定的结合物的侧链官能团。举例而言，因为叠氮官能团和炔官能团选择性地发生反应形成胡氏根[3+2]环加成产物，所以包括含有叠氮基官能团的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽可与含有炔部分的聚合物（包括（但不限于）聚(乙二醇)）或第二多肽反应而形成稳定的结合物。
α-氨基酸的一般结构说明如下（式I）。
Figure BDA0000437277490000551
非天然编码的氨基酸通常为具有上面所列的式的任何结构，其中R基团是不同于20种天然氨基酸中所用取代基的任何取代基，并且可以适用于本发明中。因为本发明的非天然编码的氨基酸通常仅在侧链的结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码的氨基酸与包括（但不限于）天然或非天然编码的氨基酸的其它氨基酸形成酰胺键，所述酰胺键是以与其在天然存在的多肽中形成的方式相同的方式来形成。然而，非天然编码的氨基酸具有使其与天然氨基酸区别开的侧链基团。举例而言，R视需要包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼基、氰基-、卤基-、酰肼基、烯基、炔基、醚基、硫醇基、硒基-、磺酰基-、硼酸基、酉朋酸基、磷酸基、膦酰基、膦基、杂环基、烯酮基、亚胺基、醛基、酯基、硫代酸基、羟胺基、氨基等等或其任何组合。可适用于本发明的其它所关注的非天然存在的氨基酸包括（但不限于）包含可光活化的交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、共价地或非共价地与其它分子相互作用的氨基酸、光笼锁和/或可光敏异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、诸如经糖取代的丝氨酸的糖基化氨基酸、经其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光致裂解的氨基酸、当与天然氨基酸比较时具有伸长侧链（包括（但不限于）聚醚或长链烃，包括（但不限于）大于约5个或大于约10个碳）的氨基酸、经碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。
可以适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示范性非天然编码的氨基酸包括（但不限于）具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔反应性基团的那些氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含糖类部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天门冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例也包括其中氨基酸与糖类之间的天然存在的N-键或O-键为自然界中不常见的共价键（包括（但不限于）烯烃键、肟键、硫醚键、酰胺键等等）所置换的实例。所述氨基酸的实例也包括不常见于天然存在的蛋白质中的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等等。
本文所提供的许多非天然编码的氨基酸可购自（例如）Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）、Novabiochem（a division of EMD Biosciences,Darmstadt,Germany）或Peptech（Burlington,MA,USA）。不能购得的那些氨基酸是视需要根据本文中所提供的或使用所属领域的技术人员已知的标准方法来合成。有关有机合成技术，例如参见Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，（1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.）；March的Advanced Organic Chemistry（第3版，1985,Wiley and Sons,New York）；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry（第3版，A部分和B部分，1990,PlenumPress,New York）。又参见美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可以适用于本发明的非天然氨基酸也视需要包含经修饰的主链结构，包括（但不限于）如由式II和式III的结构所说明，
Figure BDA0000437277490000571
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可为相同或不同且通常包含S或O，并且R和R'视需要为相同或不同的且通常是选自上文关于式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组成列项以及氢。举例而言，本发明的非天然氨基酸视需要包含如由式II和式III所说明的氨基或羧基上的取代。这种类型的非天然氨基酸包括（但不限于）α-羟酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括（但不限于）具有对应于常见的20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链的那些氨基酸。此外，在α-碳处的取代视需要包括（但不限于）诸如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等的L-氨基酸、D-氨基酸或α-α-二取代的氨基酸。其它结构替代物包括诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物的环状氨基酸、诸如经取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸的β氨基酸和γ氨基酸。
许多非天然氨基酸是基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等等的天然氨基酸，并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括（但不限于）对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中经取代的酪氨酸包含（包括（但不限于））酮基（包括（但不限于）乙酰基）、苯甲酰基、氨基、肼基、羟胺基、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃基、饱和或不饱和烃基、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等等。此外，也涵盖经多取代的芳基环。可以适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括（但不限于）α-羟基衍生物、γ-取代的衍生物、环状衍生物和经酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可以适用于本发明的苯丙氨酸类似物的实例包括（但不限于）对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含（包括（但不限于））羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、叠氮基、碘基、溴基、酮基（包括（但不限于）乙酰基）、苯甲酰基、炔基等等。可以适用于本发明的非天然氨基酸的特定实例包括（但不限于）对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等等。可以适用于本发明的各种非天然氨基酸的结构的实例是提供于（例如）标题为“In vivoincorporation of unnatural amino acids.”的WO2002/085923中。就其它甲硫氨酸类似物来说，也可参见Kiick等人，（2002）Incorporationof azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudingerligation,PNAS99:19-24，其以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸（诸如，对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸）的GH（例如，hGH）多肽的组合物。也提供包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸且包括（但不限于）蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可（包括（但不限于）共价地）与正交tRNA相键结，其包括（但不限于）通过氨基-酰基键共价地与正交tRNA相键结，共价地与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH相键结等等。
经由可并入蛋白质中的非天然氨基酸的化学部分向蛋白质提供各种优点和处理。举例而言，酮基官能团的独特反应性允许以许多含肼或含羟胺试剂中的任何一种试剂在活体外和在活体内对蛋白质作选择性修饰。重原子非天然氨基酸（例如）可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸部位特异性地引入重原子也为重原子提供选择位置的选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸（包括（但不限于）具有二苯甲酮和芳基叠氮化物（包括（但不限于）苯基叠氮化物）侧链的氨基酸）（例如）容许蛋白质的有效活体内和活体外光致交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括（但不限于）对叠氮基苯丙氨酸和对苯甲酰基苯丙氨酸。具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质因此可通过光反应性基团的激发-提供瞬时控制而随意地交联。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可经同位素标记的（包括（但不限于））甲基取代，所述同位素标记的（包括（但不限于））甲基作为（包括（但不限于））与核磁共振和振动光谱学一起使用的局部结构和动力学的探针。炔基或叠氮基官能团（例如）允许通过[3+2]环化加成反应用分子选择性地修饰蛋白质。
在氨基端并入多肽中的非天然的氨基酸可包含为不同于20种天然氨基酸中所用取代基的任何取代基的R基团，和不同于通常存在于α-氨基酸（参见式I）中的NH2基团的第二反应性基团。类似的非天然氨基酸可在羧基端并入，其具有不同于通常存在于α-氨基酸（参见式I）中的COOH基团的第二反应性基团。
本发明的非天然氨基酸可以加以选择或设计而提供在20种天然氨基酸中难以获得的其它特征。举例而言，非天然氨基酸可以视需要加以设计或选择而改变所述非天然氨基酸并入到其中的蛋白质的生物学性质。举例而言，以下性质可以视需要通过使非天然氨基酸包含于蛋白质中而改变：毒性、生物分布、溶解性、稳定性（例如，热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、抗酶促降解稳定性等等）、提纯和处理的容易性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子（例如，共价地或非共价地）发生反应的能力等等。
非天然氨基酸（含有羰基、类羰基、掩蔽的羰基、受保护的羰基和羟胺基）的结构 和合成
在一些实施例中，本发明提供一种通过肟键与水溶性聚合物（例如，PEG）相连接的GH（例如，hGH）。
许多类型的非天然编码的氨基酸适合于形成肟键。这些氨基酸包括（但不限于）含有羰基、二羰基或羟胺基的非天然编码的氨基酸。所述氨基酸是描述于美国专利申请案第60/638,418号、第60/638,527号和第60/639,195号（标题为“Compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”，2004年12月22日申请）中，所述申请案的全文以引用的方式并入本文中。所述氨基酸也描述于美国专利申请案第60/696,210号、第60/696,302号和第60/696,068号（标题为“Compositionscontaining,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”，2005年7月1日申请）中，所述申请案的全文以引用的方式并入本文中。非天然编码的氨基酸也描述于2002年4月19日申请的美国专利申请案第10/126,931号和2002年4月19日申请的美国专利申请案第10/126,927号中，所述申请案的全文以引用的方式并入本文中。
本发明的一些实施例利用在一个或一个以上位置处经氨基酸对乙酰苯丙氨酸取代的GH（例如，hGH）多肽。对-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于以引用的方式并入的Zhang,Z.,等人，Biochemistry42:6735-6746（2003）中。其它含羰基或二羰基的氨基酸可由所属领域的技术人员类似地来制备。此外，在美国专利申请案第10/126,931号的图4、图24-34和图36-39中提供包括在本文中的非天然氨基酸的非限制性示范性合成，所述申请案的全文以引用的方式并入本文中。
具有亲电子反应性基团的氨基酸容许发生各种反应而与分子相连接，尤其通过亲核加成反应与分子相连接。所述亲电子反应性基团包括羰基（包括酮基和二羰基）、类羰基（其具有与羰基（包括酮基和二羰基）相似的反应性且在结构上与羰基相似）、掩蔽的羰基（其可容易地转化为羰基（包括酮基和二羰基））或受保护的羰基（其在去保护后具有与羰基（包括酮基和二羰基）相似的反应性）。所述氨基酸包括具有式（IV）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000601
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
J为
Figure BDA0000437277490000611
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
各R"独立地为H、烷基、经取代的烷基或保护基，或当一个以上R"基团存在时，两个R"视需要形成杂环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
R3和R4中的各者独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代的低碳烷基，或R3和R4或两个R3基团视需要形成环烷基或杂环烷基；
或者-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个羰基（包括二羰基）、受保护的羰基（包括受保护的二羰基）或掩蔽的羰基（包括掩蔽的二羰基）的二环或三环环烷基或杂环烷基；
或者-J-R基团一起形成包含至少一个羰基（包括二羰基）、受保护的羰基（包括受保护的二羰基）或掩蔽的羰基（包括掩蔽的二羰基）的单环或二环环烷基或杂环烷基；
其限制条件为当A为亚苯基并且各R3为H时，B是存在的；和当A为-(CH2)4-并且各R3为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；和当A和B不存在并且各R3为H时，R不为甲基。
此外，包括具有式（V）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000612
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
其限制条件为当A为亚苯基时，B为存在的；和当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；和当A和B不存在时，R不为甲基。
此外，包括具有式（VI）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000621
其中：
B为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基。
此外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视需要为氨基受保护的群组、羧基受保护的化合物或其盐。此外，可将以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
此外，包括以下具有式（VII）的结构的氨基酸，
其中：
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；且n为0到8；
其限制条件为当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。
此外，包括以下氨基酸：
Figure BDA0000437277490000651
和
Figure BDA0000437277490000652
其中所述化合物视需要为氨基受保护的化合物，视需要为羧基受保护的化合物，视需要为氨基受保护且羧基受保护的化合物，或其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
此外，包括以下具有式（VIII）的结构的氨基酸，
其中A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸。
此外，包括以下具有式（IX）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000661
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
其中各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基。
此外，包括以下氨基酸：
Figure BDA0000437277490000671
，其中所述化合物视需要为氨基受保护的化合物，视需要为羧基受保护的化合物，视需要为氨基受保护且羧基受保护的化合物，或其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
此外，包括以下具有式（X）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000672
其中B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；且n为0到8。
此外，包括以下氨基酸：
Figure BDA0000437277490000681
和
其中所述化合物视需要为氨基受保护的化合物，视需要为羧基受保护的化合物，视需要为氨基受保护且羧基受保护的化合物，或其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
除单羰基结构之外，本文所述的非天然氨基酸可包括诸如二羰基、类二羰基、掩蔽的二羰基和受保护的二羰基的基团。
举例而言，包括以下具有式（XI）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000683
其中A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸。
此外，包括以下具有式（XII）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000691
B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
其中各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基。
此外，包括以下氨基酸：
Figure BDA0000437277490000701
其中所述化合物视需要为氨基受保护的化合物，视需要为羧基受保护的化合物，视需要为氨基受保护且羧基受保护的化合物，或其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
此外，包括以下具有式（XIII）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000702
其中B为可选的，并且当存在时为选自由下列各基团组成的群组的连接子：低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、低碳杂亚烃基、经取代的低碳杂亚烃基、-O-、-O-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S-、-S-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-S(O)k-（其中k为1、2或3）、-S(O)k(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')CO-(亚烃基或经取代的亚烃基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基；且n为0到8。
此外，包括以下氨基酸：
Figure BDA0000437277490000711
和
Figure BDA0000437277490000712
其中所述化合物视需要为氨基受保护的化合物，视需要为羧基受保护的化合物，视需要为氨基受保护且羧基受保护的化合物，或其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。
此外，包括以下具有式（XIV）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000721
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；并且L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XIV-A）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000722
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XIV-B）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000731
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XV）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000741
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9各自是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基胺基、卤素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成=O或环烷基，或其中任何基团与邻近的R8基团可一起形成环烷基。
此外，包括以下具有式（XV-A）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000742
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9各自是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基胺基、卤素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成=O或环烷基，或其中任何基团与邻近的R8基团可一起形成环烷基。
此外，包括以下具有式（XV-B）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000751
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9各自是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基胺基、卤素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成=O或环烷基，或其中任何基团与邻近的R8基团可一起形成环烷基。
此外，包括以下具有式（XVI）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000761
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XVI-A）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000762
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XVI-B）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000771
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
L为亚烃基、经取代的亚烃基、N(R')(亚烃基)或N(R')(经取代的亚烃基)，其中R'为H、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括具有式（XVII）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000781
其中：
A为可选的，并且当存在时为低碳亚烃基、经取代的低碳亚烃基、低碳环亚烃基、经取代的低碳环亚烃基、低碳亚链烯基、经取代的低碳亚链烯基、亚炔基、低碳杂亚烃基、经取代的杂亚烃基、低碳杂环亚烃基、经取代的低碳杂环亚烃基、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚芳基、经取代的杂亚芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
M为
Figure BDA0000437277490000782
其中(a)表示与A基团的键结，且(b)表示与相应羰基的键结，R3和R4是独立地选自H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视需要形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
T3为一个键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸。
此外，包括具有式（XVIII）的结构的氨基酸，
其中：
M为-C(R3)-、
其中(a)表示与A基团的键结，且(b)表示与相应羰基的键结，R3和R4是独立地选自H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视需要形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
T3为一个键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；
R1为可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2为可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多聚核苷酸；
各Ra是独立地选自由下列各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'（其中k为1、2或3）、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代的烷基。
此外，包括具有式（XIX）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000801
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基；且
T3为O或S。
此外，包括具有式（XX）的结构的氨基酸，
Figure BDA0000437277490000802
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代的烷基、环烷基或经取代的环烷基。
此外，包括以下具有式（XXI）的结构的氨基酸：
Figure BDA0000437277490000803
对-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于以引用的方式并入的Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746（2003）中。其它含羰基或二羰基的氨基酸可由所属领域的技术人员类似地来制备。此外，在图4、图24-34和图36-39中提供本文所包括的非天然氨基酸的非限制性示范性合成。
在一些实施例中，对包含非天然氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例而言，可用于结合反应的醛官能团可以由具有邻近氨基和羟基的官能团产生。在生物活性分子为多肽的情况下，例如，可在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下使用N端丝氨酸或苏氨酸（其可以正常地存在或可以通过化学或酶促消化而被暴露）来产生醛官能团。参见，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3:262-268（1992）；Geoghegan,K.&Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146（1992）；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269:7224-7230（1994）。然而，此项技术中已知的方法只限于肽或蛋白质的N端处的氨基酸。
在本发明中，可以将具有邻近的羟基和氨基的非天然氨基酸作为“掩蔽的”醛官能团并入多肽中。例如，5-羟基赖氨酸具有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常包含在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其它部位处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型的反应包含将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠添加到多肽的缓冲溶液中，接着在暗处培育约10分钟。参见，例如，美国专利第6,423,685号。
羰基或二羰基官能团可以在温和的条件下于水溶液中选择性地与含羟胺的试剂发生反应以形成相应的在生理条件下稳定的肟键。参见，例如，Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481（1959）；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899（1995）。而且，羰基或二羰基的独特反应性容许在其它氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见，例如，Cornish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151（1996）；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146（1992）；Mahal,L.K.等人，Science276:1125-1128（1997）。
非天然氨基酸（含羟胺的氨基酸）的结构和合成
美国临时专利申请案第60/638,418号的全文是以引用的方式并入本文。因而，在美国临时专利申请案第60/638,418号的V章节（标题为“Non-natural Amino Acids”）、B部分（标题为“Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids:Hydroxylamine-Containing Amino Acids”）中提供的揭示内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物（包括式I-XXXV）、技术和策略，所述适用程度就如同所述揭示内容是完全由本文中所提供的那样。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明的许多非天然氨基酸是可购得的，（例如）可购自Sigma（USA）或Aldrich（Milwaukee,WI,USA）。不能购得的那些氨基酸是视需要根据本文中所提供的或根据各种公开案中所提供的或使用所属领域的技术人员已知的标准方法来合成。有关有机合成技术，参见，例如，Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry（1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.）；March的Advanced Organic Chemistry（第3版，1985,Wiley and Sons,New York）；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry（第3版，A部分和B部分，1990,Plenum Press,New York）。描述非天然氨基酸的合成的其它公开案包括（例如）标题为“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”的WO2002/085923；Matsoukas等人，（1995）J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid fromPhthylated Intermediates.J.Chem.Soc,3315-3319；Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am. Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等人（1988）Absolute Configuration of theEnantiomers of7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamineanalogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H.(1989)Synthesis of4-Substituted Prolines as Conformationally ConstrainedAmino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.50:1239-1246；Barton等人，（1987）Synthesis of Novelalpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistiy:Synthesis of L-andD-alpha-Amino-Adipic Acids,L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron43:4297-4308；和Subasinghe等人，（1992）Quisqualic acidanalogues:synthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and theiractivity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。也可参见标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US2004/0198637号，其是以引用的方式并入本文中。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸容许发生各种反应而与分子（包括但不限于PEG或其它水溶性分子）相连接，尤其通过亲核加成或醇醛缩合反应与所述分子相连接。
示范性含羰基的氨基酸可表示如下，其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基；并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，并且R2为简单烷基（即，甲基、乙基或丙基），并且酮部分是位于相对于烷基侧链的对位上。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，并且R2为简单烷基（即，甲基、乙基或丙基），并且酮部分是位于相对于烷基侧链的间位上。
对-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746（2003）中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基的氨基酸可由所属领域的技术人员类似地来制备。
在一些实施例中，对包含非天然编码的氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例而言，可用于结合反应的醛官能团可以由具有邻近氨基和羟基的官能团产生。在生物活性分子为多肽的情况下，例如，可在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下使用N端丝氨酸或苏氨酸（其可以正常地存在或可以通过化学或酶促消化而被暴露）来产生醛官能团。参见，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3:262-268（1992）；Geoghegan,K.&Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146（1992）；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269:7224-7230（1994）。然而，此项技术中已知的方法只限于肽或蛋白质的N端处的氨基酸。
在本发明中，可以将具有邻近的羟基和氨基的非天然编码的氨基酸作为“掩蔽的”醛官能团并入多肽中。例如，5-羟基赖氨酸具有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常包含在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其它部位处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型的反应包含将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠添加到多肽的缓冲溶液中，接着在暗处培育约10分钟。参见，例如，美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文中。
羰基官能团可以在温和条件下于水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性地发生反应以分别形成相应的在生理条件下稳定的腙键、肟键或缩氨基脲键。参见，例如，Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481（1959）；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899（1995）。而且，羰基的独特反应性容许在其它氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见，例如，Cornish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151（1996）；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146（1992）；Mahal,L.K.等人，Science276:1125-1128（1997）。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团（诸如，肼、酰肼或氨基脲）的非天然编码的氨基酸容许与各种亲电子基团发生反应而形成结合物（包括但不限于与PEG或其它水溶性聚合物反应形成结合物）。
示范性含肼、酰肼或氨基脲部分的氨基酸可表示如下，
Figure BDA0000437277490000841
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，n为4，R1不存在，并且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在，并且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，并且氧原子是位于芳基环上的脂族基团的对位。
含酰肼、肼和氨基脲部分的氨基酸可从商业来源获得。例如，L-谷氨酸-γ-酰肼可购自Sigma Chemical（St.Louis,MO）。不可购得的其它氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。参见，例如，美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文中。
含有具有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可与各种含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效地并有选择性地发生反应。参见，例如，Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899（1995）。酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使得其当与20种常见氨基酸上存在的亲核基团（包括（但不限于）丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸和N端的氨基）相比较时对于醛、酮和其它亲电子基团具有更显著的反应性。
C.含有氨基氧基的氨基酸
含有氨基氧基（也称为羟胺基）的非天然编码的氨基酸容许与各种亲电子基团发生反应而形成结合物（包括（但不限于）与PEG或其它水溶性聚合物反应形成结合物）。如同肼、酰肼和氨基脲，氨基氧基的增强的亲核性允许其与各种含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效地并有选择性地发生反应。参见，例如，Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899（1995）；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736（2001）。尽管与肼基的反应产物为相应的腙，然而肟一般由氨基氧基与含羰基的基团（诸如，酮基）的反应产生。
含有氨基氧基的示范性氨基酸可表示如下，
Figure BDA0000437277490000851
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y为C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，并且Y存在。一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0，并且Y不存在。
含有氨基氧基的氨基酸可从易于获得的氨基酸前体（高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸）进行制备。参见，例如，M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858（2003）。某些含有氨基氧基的氨基酸（诸如，L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸）已从天然来源分离出（Rosenthal,G,Life Sci.60:1635-1641（1997））。其它含有氨基氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。
D.叠氮化物和炔反应性基团
叠氮化物和炔官能团的独特反应性使得其极其适用于选择性修饰多肽和其它生物分子。对一般的反应性化学条件来说，有机叠氮化物（尤其为脂族叠氮化物）和炔通常是稳定的。特别的是，对于天然存在的多肽中存在的20种常见的氨基酸的侧链（即，R基团）来说，叠氮化物和炔官能团是惰性的。然而，在进入进一步的研究时，显示出叠氮基和炔基的“弹簧加压式（spring-loaded）”特性并且其可有选择地且有效地通过胡氏根[3+2]环加成反应进行反应而产生相应的三唑。参见，例如，Chin J.等人，Science301:964-7（2003）；Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193（2003）；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027（2002）。
因为胡氏根环加成反应涉及选择性环加成反应（参见，例如，Padwa,A.，在COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷（Trost,B.M.编，1991），第1069-1109页中；Huisgen,R.，在1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，（Padwa,A.编，1984），第1-176页中）而不是亲核取代，所以具有含叠氮化物和炔部分的侧链的非天然编码的氨基酸的并入允许所得多肽在非天然编码的氨基酸的位置处被选择性修饰。涉及含有叠氮化物或炔部分的GH（例如，hGH）多肽的环加成反应可在室温、水性条件下通过在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂的存在下添加Cu(II)（包括（但不限于）以催化量的CuSO4形式）而进行。参见，例如，Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193（2003）；Tornoe,C.W.等人，J.Org.Chem.67:3057-3064（2002）；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599（2002）。示范性还原剂包括（包括（但不限于））抗坏血酸盐、金属铜、奎宁（quinine）、对苯二酚、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe 2+、Co 2+和施加的电位。
在一些情况下，其中叠氮化物与炔之间的胡氏根[3+2]环加成反应是所要的，GH（例如，hGH）多肽包含包括炔部分的非天然编码的氨基酸，并且将与所述氨基酸相连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行相反反应（即，通过氨基酸上的叠氮部分和存在于水溶性聚合物上的炔部分反应）。
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有芳基酯部分的水溶性聚合物发生反应且适当地通过芳基膦部分加以官能化而产生酰胺键。芳基膦基使叠氮化物原位还原并且所得胺接着有效地与邻近的酯键发生反应而产生相应的酰胺。参见，例如，E.Saxon和C.Bertozzi,Science287,2007-2010（2000）。含有叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物（包括（但不限于）2-氨基-6-叠氮基-l-己酸）或芳基叠氮化物（对-叠氮基-苯丙氨酸）。
含有芳基酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可表示如下，
Figure BDA0000437277490000861
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基。示范性R基团包括（但不限于）-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R"'和R""各自独立地指的是氢、经取代的或未经取代的杂烷基、经取代的或未经取代的芳基（包括（但不限于）经1-3个卤素取代的芳基）、经取代的或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。举例而言，当本发明的化合物包括多个R基团时，如同当R'、R"、R'"和R""基团中的多个基团存在时其各自是独立地加以选定的那样，各个R基团也是独立地加以选定的。当R'和R"与同一氮原子相连接时，其可与所述氮原子相组合形成5元环、6元环或7元环。举例而言，-NR'R"意欲包括（但不限于）1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上面论述，所属领域的技术人员将了解，术语“烷基”意欲包括包含与非氢基团相键结的碳原子的基团，诸如卤烷基（包括（但不限于）-CF3和-CH2CF3）和酰基（包括（但不限于）-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等）。
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有硫酯部分的水溶性聚合物发生反应且适当地通过芳基膦部分加以官能化而产生酰胺键。芳基膦基使叠氮化物原位还原并且所得胺接着有效地与硫酯键发生反应而产生相应的酰胺。含有硫酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可表示如下，
其中n为1-10；X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基且W为水溶性聚合物。
示范性含炔部分的氨基酸可表示如下，
Figure BDA0000437277490000872
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0并且乙炔部分是位于相对于烷基侧链的对位上。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且炔丙基氧基是位于相对于烷基侧链的对位上（即，O-炔丙基-酪氨酸）。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在并且m为0（即，炔丙基甘氨酸）。
含炔部分的氨基酸是可以购得的。举例而言，炔丙基甘氨酸可以从Peptech（Burlington,MA）购得。或者，含炔部分的氨基酸可根据标准方法来制备。举例而言，对炔丙基氧基苯丙氨酸可（例如）如Deiters,A.等人，J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783（2003）中所述来合成，并且4-炔基-L-苯丙氨酸可如Kayser,B.等人，Tetrahedron53(7):2475-2484（1997）中所述来合成。其它含炔部分的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。
示范性含叠氮化物部分的氨基酸可表示如下，
Figure BDA0000437277490000881
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代的烷基、经取代的芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，并且叠氮部分是位于烷基侧链的对位上。在一些实施例中，n为0-4，并且R1和X不存在，并且m为0。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为2，并且β-叠氮基乙氧基部分是位于相对于烷基侧链的对位上。
含叠氮化物部分的氨基酸可以从商业来源获得。举例而言，4-叠氮基苯丙氨酸可从Chem-Impex International,Inc.（Wood Dale,IL）获得。对于不可购得的那些含叠氮化物部分的氨基酸来说，叠氮基能使用所属领域的技术人员已知的标准方法相对容易地制得，包括（但不限于）通过合适离去基团（包括（但不限于）卤化物、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐基团）的置换或通过经适当保护的内酯的开环相对容易地制得。参见，例如，March的Advanced Organic Chemistry（第3版，1985，Wiley and Sons，New York）。
E.氨基硫醇反应性基团
经β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使得其极其适用于通过形成噻唑烷对含有醛基的多肽和其它生物分子进行选择性修饰。参见，例如，J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，可将经β-取代的氨基硫醇氨基酸并入GH（例如，hGH）多肽中，并接着与包含醛官能团的水溶性聚合物发生反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物结合物或其它负载物能通过形成噻唑烷与包含经β-取代的氨基硫醇氨基酸的GH（例如，hGH）多肽相偶合。
非天然氨基酸的细胞吸收
细胞的非天然氨基酸吸收是通常在设计和选择（包括（但不限于））用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时所考虑的一个问题。举例而言，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些化合物不太可能为细胞可透过的。天然氨基酸是通过许多基于蛋白质的运输系统而被吸收到真核细胞中。可进行快速筛选，其评定哪种非天然氨基酸（如果有的话）被细胞吸收。参见，例如，在（例如）标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US2004/0198637号（其以引用的方式并入本文中）和Liu,D.R.&Schultz,P.G.(1999)Progress toward theevolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96:4780-4785中的毒性检定。虽然吸收容易通过各种检定来分析，但是设计经受细胞吸收路径的非天然氨基酸的另一选择为提供生物合成路径以在活体内产生氨基酸。
（i）非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成路径已经存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。虽然特定的非天然氨基酸的生物合成方法可能在自然界（包括（但不限于）在细胞中）不存在，但是本发明提供所述方法。举例而言，非天然氨基酸的生物合成路径是视需要在宿主细胞中通过添加新的酶或改变现有的宿主细胞路径来产生。其它新的酶视需要为天然存在的酶或人工发展的酶。举例而言，对氨基苯丙氨酸的生物合成（如标题为“In vivoincorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923的一个实例中所呈现）依赖于添加来自其它生物体的已知酶的组合。这些酶的基因能通过以包含基因的质粒使细胞转化而引入真核细胞中。基因当在细胞中表达时提供酶促路径以合成所要化合物。视需要添加的酶的类型的实例提供于下面实例中。其它的酶序列可见于（例如）基因库（Genbank）中。也视需要以同样方式将人工发展的酶添加到细胞中。如此，操纵细胞的细胞器和资源来产生非天然氨基酸。
各种方法可用于产生供生物合成路径使用或用于发展现有路径的新颖的酶。例如，视需要将包括（但不限于）如由Maxygen,Inc.开发的递归性重组（可在www.maxygen.com上获得）用于开发新颖的酶和路径。参见，例如，Stemmer(1994),Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling,Nature370(4):389-391；和Stemmer，（1994），DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。同样地，视需要将由Genencor开发的DesignPathTM（可在www.genencor.com上获得）用于代谢路径工程化，包括（但不限于）用于将用以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径工程化。此技术使用新的基因（包括（但不限于）通过功能基因组而鉴别的那些基因）和分子进化与设计的组合而在宿主生物体中重建现有路径。Diversa Corporation（可在www.diversa.com上获得）也提供用于快速筛选基因文库和基因路径的技术，包括（但不限于）用来产生新的路径。
通常，通过本发明的工程化生物合成路径产生的非天然氨基酸是以包括（但不限于）天然细胞量的足以达成有效的蛋白质生物合成但不达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以这种方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。一旦通过包含用以产生特定路径所要的酶的基因的质粒使细胞转化并且产生非天然的氨基酸后，活体内选择就视需要用来进一步优化用于核糖体蛋白合成和细胞生长的非天然氨基酸的产生。
（b）具有非天然氨基酸的多肽
可出于包括（但不限于）以下目的的各种目的来进行非天然氨基酸的并入：调节蛋白质结构和/或功能的改变，改变大小、酸度、亲核性、氢键键合、疏水性、蛋白酶靶部位的可接近性，靶向一个部分（包括（但不限于）蛋白质阵列的部分），添加生物活性分子，连接聚合物，连接放射性核素，调控血清半衰期，调控组织穿透率（例如，肿瘤），调控主动运输，调控组织、细胞或器官特异性或分布，调控免疫原性，调控蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质能具有增强的或甚至全新的催化性质或生物物理学性质。举例而言，以下性质视需要可通过使非天然氨基酸包含于蛋白质中而改变：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化性质、催化能力、半衰期（包括（但不限于）血清半衰期）、与其它分子反应（包括（但不限于）共价地或非共价地）的能力等等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于（包括（但不限于））新颖的疗法、诊断法、催化酶、工业酶、结合蛋白质（包括（但不限于）抗体）和（包括（但不限于））蛋白质结构和功能的研究。参见，例如，Dougherty，（2000）UnnaturalAmino Acids as Probes of Protein Structure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一方面，组合物包括至少一种蛋白质，所述蛋白质具有至少1个非天然氨基酸，包括（但不限于）具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个或10个以上的非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可为相同的或不同的，包括（但不限于）在蛋白质中可存在包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或10个以上不同的非天然氨基酸的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或10个以上不同的部位。在另一方面，组合物包括存在于蛋白质中的特定氨基酸中的至少一个（但少于全部）经非天然氨基酸取代的蛋白质。对指定的具有多个非天然氨基酸的蛋白质来说，所述非天然氨基酸可为相同的或不同的（包括（但不限于）蛋白质可包括2个或2个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括2个相同的非天然氨基酸）。对指定的具有2个以上非天然氨基酸的蛋白质来说，所述非天然氨基酸可为相同的、不同的或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少1个不同的非天然氨基酸的组合。
所关注的具有至少1个非天然氨基酸的蛋白质或多肽是本发明的一特征。本发明也包括具有至少1个使用本发明的组合物和方法产生的非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂（包括（但不限于）医药学上可接受的赋形剂）也可与蛋白质一起存在。
就在真核细胞中产生所关注的具有至少1个非天然氨基酸的蛋白质或多肽来说，所述蛋白质或多肽通常将包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少1个非天然氨基酸和至少1种通过真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并不通过原核细胞进行。举例而言，翻译后修饰包括（包括（但不限于））糖基化作用、乙酰化作用、酰化作用、脂质修饰、棕榈酰化作用、棕榈酸酯添加、磷酸化作用、糖脂键修饰、糖基化作用等等。在一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天门冬酰胺键将寡糖（包括（但不限于）(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc）与天门冬酰胺相连接。参见表1，其列出了真核蛋白质的N-连接的寡糖的一些实例（也可存在其它残基，表中未显示）。在另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸键或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸键或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖（包括（但不限于）Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等）与丝氨酸或苏氨酸相连接。
表1：通过GlcNAc-键合的寡糖的实例
在另一方面，翻译后修饰包括对前体（包括（但不限于）降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原（preproparathyroid）激素、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原（prepro-opiomelanocortin）、阿黑皮素原（pro-opiomelanocortin）等）进行蛋白水解加工，装配到多亚单位蛋白质中或进行大分子装配，翻译到细胞中的另一个部位（包括（但不限于）翻译到诸如内质网、高尔基体（Golgi apparatus）、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等的细胞器中，或通过分泌路径）。在某些实施例中，蛋白质包含分泌序列或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等等。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,963,495号和第6,436,674号详细描述了经设计用来改进GH（例如，hGH）多肽的分泌的构建物。
非天然氨基酸的一个优点是其提供可用来添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中于活体内或于活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸达成。举例而言，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应达成。当前用于选择性修饰蛋白质的多数反应涉及在亲核和亲电子反应搭配物之间形成共价键，包括（但不限于）α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下的选择性是由蛋白质中的亲核残基的数量和可接近性所决定。在本发明的蛋白质中，可采用其它更具有选择性的反应，诸如在活体外和在活体内的非天然酮基-氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。参见，例如，Cornish等人，（1996）J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151；Mahal等人，（1997）Science,276:1125-1128；Wang等人，（2001）Science292:498-500；Chin等人，（2002）J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027；Chin等人，（2002）Proc.Natl.Acad. Sci.,99:11020-11024；Wang等人，（2003）Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61；Zhang等人，（2003）Biochemistry,42:6735-6746；和Chin等人，（2003）Science,301:964-7，所有文献以引用的方式并入本文中。此允许用包括荧光团、交联剂、糖类衍生物和细胞毒素分子的许多试剂来选择性地标记几乎任何蛋白质。也参见标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第6,927,042号，其以引用的方式并入本文中。包括（但不限于）通过叠氮基氨基酸的翻译后修饰也可通过施陶丁格（Staudinger）连接（包括（但不限于）用三芳基膦试剂）来进行。参见，例如，Kiick等人，（2002）Incorporation of azides into recombinantproteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS99:19-24。
本发明提供另一种高效的选择性修饰蛋白质的方法，其涉及响应于选择密码子将包括（但不限于）含有叠氮化物或炔基部分的非天然氨基酸遗传地并入蛋白质中。接着这些氨基酸侧链可分别通过包括（但不限于）胡氏根[3+2]环加成反应（参见，例如，Padwa,A.，在Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，（1991），Trost,B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页中；和Huisgen,R.，在1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，（1984）Padwa,A.编，Wiley，New York，第1-176页中）用包括（但不限于）炔基或叠氮化物衍生物来修饰。因为这种方法涉及环加成而不是亲核取代，所以蛋白质可以极高的选择性来加以修饰。此反应可以在室温、水性条件下通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中而以极佳的区域选择性（1,4>1,5）进行。参见，例如，Tornoe等人，（2002）J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人，（2002）Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一种方法是利用四半胱氨酸基序进行的双砷化合物上的配合基交换，参见，例如，Griffin,等人，（1998）Science281:269-272。
能通过[3+2]环加成加入到本发明的蛋白质中的分子包括具有叠氮化物或炔基衍生物部分的几乎任何分子。分子包括（但不限于）染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物（包括（但不限于）聚乙二醇的衍生物）、光致交联剂、细胞毒素化合物、亲和标记、生物素的衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽（或更多）、多聚核苷酸（包括（但不限于）DNA、RNA等）、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物等等。这些分子能分别加入到具有炔基的非天然氨基酸（包括（但不限于）对炔丙基氧基苯丙氨酸）或具有叠氮基的非天然氨基酸（包括（但不限于）对叠氮基苯丙氨酸）中。
V.包含非遗传编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽的活体内产生
本发明的GH（例如，hGH）多肽可在活体内使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶来添加在天然存在的系统中未被编码的氨基酸或用其进行取代而产生。
用于产生使用在天然存在的系统中未被编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法是描述在（例如）美国专利申请公开案2003/0082575（第10/126,927号）和2003/0108885（第10/126,931号）中，所述参考文献以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于对翻译系统来说为内源性的（并且因此有时被称作“正交的”）合成酶和tRNA而起作用的翻译机器。通常，翻译系统包含正交tRNA（O-tRNA）和正交氨酰基tRNA合成酶（O-RS）。通常，在翻译系统中O-RS优先地以至少一种非天然存在的氨基酸使O-tRNA氨基酰化，并且O-tRNA识别出至少一种不能被所述系统中的其它tRNA识别出的选择密码子。所述翻译系统因此响应于经编码的选择密码子将非天然编码的氨基酸插入到系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸“取代”到经编码的多肽中的位置中。
各种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶已经在所属领域中被描述用于将特定的合成氨基酸插入到多肽中，并且一般适用于本发明。举例而言，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:56-61（2003）和Zhang,Z.等人，Biochem.42(22):6735-6746（2003）中。示范性O-RS或其部分是通过多聚核苷酸序列来编码，并且其包括美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，各个公开案以引用的方式并入本文中。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述在美国专利申请公开案2003/0082575（第10/126,927号）和2003/0108885（第10/126,931号）中，所述公开案以引用的方式并入本文中。
叠氮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例是描述在Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027（2002）中。对-叠氮基-L-苯丙氨酸的示范性O-RS序列包括（但不限于）如美国专利申请公开案2003/0108885（第10/126931号）中揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64，所述公开案以引用的方式并入本文中。适用于本发明的示范性O-tRNA序列包括（但不限于）如美国专利申请公开案2003/0108885（第10/126,931号）中揭示的核苷酸序列SEQID NO:1-3，所述公开案以引用的方式并入本文中。对特定的非天然编码的氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例是描述在美国专利申请公开案2003/0082575（第10/126,927号）中，所述公开案以引用的方式并入本文中。使含酮基的氨基酸和含叠氮基的氨基酸并入酿酒酵母（S.cerevisiae）中的O-RS和O-tRNA是描述在Chin,J.W.等人，Science301:964-967（2003）中。
已经报道了一些其它的正交对。已描述源自酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基（参见，例如，Liu,D.R.和Schultz,P.G.（1999）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785）、天冬氨酰基（参见，例如，Pastrnak,M.等人，（2000）Helv.Chim.Acta83:2277-2286）和酪氨酰基（参见，例如，Ohno,S.等人，（1998）J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)1124:1065-1068；和Kowal,A.K.等人，（2001）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273）系统用于将非天然氨基酸潜在地并入大肠杆菌中。已描述源自大肠杆菌谷氨酰胺酰基（参见，例如，Kowal,A.K.等人，（2001）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273）和酪氨酰基（参见，例如，Edwards,H.和Schimmel,P.（1990）Mol.Cell. Biol.10:1633-1641）合成酶的系统适用于酿酒酵母。已将大肠杆菌酪氨酰基系统用于将3-碘基-L-酪氨酸活体内并入哺乳动物细胞中。参见，Sakamoto,K.等人，（2002）Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及编码非天然编码的氨基酸的特异性密码子的选择。虽然能使用任何密码子，但是通常需要选择很少或从未用于表达O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的细胞中的密码子。举例而言，示范性密码子包括无义密码子，诸如，终止密码子（琥珀密码子、赭石密码子和蛋白石密码子）；4个或4个以上碱基密码子；和很少使用或未曾使用的其它天然3碱基密码子。
可使用此项技术中已知的突变方法（包括（但不限于）部位特异性突变、盒式突变、限制性选择性突变等）将特异性选择密码子引入GH（例如，hGH）多聚核苷酸编码序列中的适当位置中。
用于产生可用来并入非天然编码的氨基酸的蛋白质生物合成机器组分（诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对）的方法是描述在Wang,L.等人，Science292:498-500（2001）；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027（2002）；Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746（2003）中。用于活体内并入非天然编码的氨基酸的方法和组合物是描述在美国专利申请公开案2003/0082575（第10/126,927号）中，所述公开案以引用的方式并入本文中。用于选择适用于生物体的活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575（第10/126,927号）和2003/0108885（第10/126,931号）中，所述公开案以引用的方式并入本文中。标题为“SiteSpecific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins”的PCT公开案第WO04/035743号（其全文以引用的方式并入本文中）描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO04/094593号（其全文以引用的方式并入本文中）描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组的正交氨酰基-tRNA合成酶（O-RS）的方法包含：（a）产生源自于来自第一生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶（RS）的（视需要为突变体）RS的库，所述第一生物体包括（但不限于）诸如詹氏甲烷球菌、横川病毒、嗜盐杆菌属、大肠埃希氏杆菌、闪烁古生球菌（A.fulgidus）、激烈火球菌（P.furiosus）、堀越氏火球菌（P.horikoshii）、嗜热菌敏捷气热菌（A.pernix）、嗜热栖热菌（T.thermophilus）等等的原核生物，或真核生物；（b）选择（和/或筛选）RS（视需要为突变体RS）库的成员，所述成员在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的存在下使正交tRNA（O-tRNA）氨酰化，从而提供活性（视需要为突变体）RS的集合；和/或（c）选择（视需要通过负性选择）集合的活性RS（包括（但不限于）突变RS），所述活性RS在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先地使O-tRNA氨酰化，从而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优先地以非天然编码的氨基酸使O-tRNA氨酰化。
在一个实施例中，RS是非活性RS。非活性RS能通过使活性RS突变而产生。举例而言，非活性RS能通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变成包括（但不限于）丙氨酸的不同氨基酸而产生。
突变RS的库能使用此项技术中已知的各种技术（包括（但不限于）基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的突变）来产生。举例而言，突变RS能通过部位特异性突变、随机突变、差异产生重组突变、嵌合构建、合理设计和通过本文中所述的或此项技术中已知的其它方法来产生。
在一个实施例中，选择（和/或筛选）RS（视需要为突变RS）库的包括（但不限于）在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的存在下使正交tRNA（O-tRNA）氨酰化的活性成员包括：将包括（但不限于）抗生素抗性基因等的正性选择或筛选标记和（视需要为突变的）RS库引入多个细胞中，其中所述正性选择和/或筛选标记包含至少一个包括（但不限于）琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石密码子的选择密码子；使所述多个细胞在选择剂的存在下生长；鉴别在选择和/或筛选剂存在下通过抑制正性选择或筛选标记中的至少一个选择密码子存活（或显示特异性反应）的细胞，从而提供含有活性（视需要为突变的）RS的集合的正性选定的细胞的子集。视需要可改变选择和/或筛选剂浓度。
在一方面，正性选择标记是氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因，并且选择密码子是CAT基因中的琥珀终止密码子。视需要地，正性选择标记是β-内酰胺酶基因，并且选择密码子是β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。在另一方面，正性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记（包括（但不限于）细胞表面标记）。
在一个实施例中，负性选择或筛选集合的在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰化的活性RS（视需要为突变的）包括：将负性选择或筛选标记与来自正性选择或筛选的活性（视需要为突变的）RS的集合一起引入第二生物体的多个细胞中，其中所述负性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子（包括（但不限于）抗生素抗性基因，包括（但不限于）氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因）；和鉴别在经非天然编码的氨基酸和筛选或选择剂补充的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应但在未经非天然编码的氨基酸和选择或筛选剂补充的第二培养基中未能存活或未显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选的细胞。举例而言，CAT鉴别方案视需要在适当的O-RS重组体的确定中起正性选择和/或负性筛选的作用。例如，视需要在含有具有或不具有一个或一个以上非天然编码的氨基酸的CAT（其包含至少一个选择密码子）的生长培养盘上复制克隆的集合。因此认为，唯独在含有非天然编码的氨基酸的培养盘上生长的群落含有重组O-RS。在一方面，选择（和/或筛选）剂的浓度是可变化的。在一些方面中，第一生物体和第二生物体是不同的。因此，第一生物体和/或第二生物体视需要包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠埃希氏杆菌、真菌、酵母、古菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。
在另一个实施例中，筛选或选择（包括（但不限于）负性选择）集合的活性（视需要为突变的）RS包括：使来自正性选择步骤（b）的活性突变RS的集合分离；将负性选择或筛选标记和活性（视需要为突变的）RS的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中所述负性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子（包括（但不限于）包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，包括（但不限于）核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶（barnase）基因）；和鉴别在未经非天然编码的氨基酸补充的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应但在经非天然编码的氨基酸补充的第二培养基中未能存活或未显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选的细胞，其中至少一种重组O-RS对于非天然编码的氨基酸来说为特异性的。在一方面，至少一个选择密码子包含约2个或2个以上的选择密码子。所述实施例视需要可包括其中至少一个选择密码子包含2个或2个以上的选择密码子和其中第一生物体和第二生物体不同（包括（但不限于）各个生物体视需要为（包括（但不限于））原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠埃希氏杆菌、真菌、酵母、古菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等）。此外，一些方面包括其中负性选择标记包含核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶基因（其包含至少一个选择密码子）。其它方面包括其中筛选标记视需要包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。在本文中的实施例中，筛选和/或选择视需要包括筛选和/或选择严格性的变化。
在一个实施例中，产生至少一种重组的正交氨酰基-tRNA合成酶（O-RS）的方法可进一步包含：（d）使至少一种重组O-RS分离；（e）产生第二组源自所述至少一种重组O-RS的O-RS（视需要为突变的）；和（f）重复步骤（b）和（c）直到获得包含优先使O-tRNA氨酰化的能力的突变O-RS为止。视需要重复步骤（d）-（f），包括（但不限于）重复至少约两次。在一方面，第二组源自至少一种重组O-RS的突变O-RS可通过包括（但不限于）随机突变、部位特异性突变的突变、重组或其组合而产生。
在上述方法中，包括（但不限于）正性选择/筛选步骤（b）、负性选择/筛选步骤（c）或正性和负性选择/筛选步骤（b）和（c）两者的选择/筛选步骤的严格性视需要包括改变选择／筛选严格性。在另一实施例中，正性选择/筛选步骤（b）、负性选择/筛选步骤（c）或正性和负性选择/筛选步骤（b）和（c）两者包含使用报道体，其中所述报道体是通过荧光活化细胞分选法（FACS）来检测或其中所述报道体是通过发光来检测。视需要地，报道体是在细胞表面上、在噬菌体展示系统等上展示，并且是基于涉及非天然编码的氨基酸或类似物的亲和力或催化活性而选择。在一个实施例中，突变的合成酶是在细胞表面上、在噬菌体展示系统等上展示。
产生重组的正交tRNA（O-tRNA）的方法包括：（a）产生源自于来自第一生物体的至少一种包括（但不限于）抑制tRNA的tRNA的突变tRNA的库；（b）选择（包括（但不限于）负性选择）或筛选所述库的在不存在来自第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶（RS）的情况下被来自第二生物体的RS氨酰化的（视需要为突变的）tRNA，从而提供tRNA（视需要为突变体）的集合；和（c）选择或筛选tRNA（视需要为突变体）集合的被所引入的正交RS（O-RS）氨酰化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别出选择密码子并且未被来自第二生物体的RS有效识别出，并且被O-RS优先地氨酰化。在一些实施例中，至少一种tRNA是抑制tRNA且/或包含天然和/或非天然碱基的单一的3碱基密码子，或是无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有改善的正交性。应了解，在一些实施例中，O-tRNA视需要可无需修饰即从第二生物体输入到第一生物体中。在各种实施例中，第一生物体和第二生物体是相同的或不同的，并且视需要是选自（包括（但不限于））原核生物（包括（但不限于）詹氏甲烷球菌、横川病毒、大肠埃希氏杆菌、嗜盐杆菌属等）、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是视需要地被非天然编码的氨基酸氨酰化，其中所述非天然编码的氨基酸是在活体内天然地或通过遗传处理而加以生物合成。视需要将非天然编码的氨基酸添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中。
在一方面，选择（包括（但不限于）负性选择）或筛选库的被氨酰基-tRNA合成酶氨酰化的（视需要为突变的）tRNA（步骤（b））包括：将毒性标记基因和（视需要为突变的）tRNA库引入到来自第二生物体的多个细胞中，其中所述毒性标记基因包含至少一个选择密码子（或导致产生毒性剂或静化剂的基因或对生物体为必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子）；和选择存活的细胞，其中所述存活的细胞含有包含至少一种正交tRNA或非功能性tRNA的（视需要为突变的）tRNA的集合。举例而言，存活的细胞可通过使用细胞密度比较率检定加以选择。
在另一方面，毒性标记基因可包括2个或2个以上的选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因是核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶基因，其中所述核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶基因包含至少一个琥珀密码子。视需要地，核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶基因可包括2个或2个以上的琥珀密码子。
在一个实施例中，选择或筛选（视需要为突变的）tRNA的集合的被所引入的正交RS（O-RS）氨酰化的成员可包括：将正性选择或筛选标记基因连同O-RS和（视需要为突变的）tRNA的集合引入到来自第二生物体的多个细胞中，其中正性标记基因包含抗药性基因（包括（但不限于）β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子）或对生物体为必需的基因或导致毒性剂解毒的基因；和鉴别在包括（但不限于）抗生素的选择或筛选剂的存在下生长的存活细胞或经筛选的细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞的集合，其中响应于至少一个选择密码子，至少一种重组tRNA被O-RS氨酰化并且将氨基酸插入到为正性标记基因所编码的翻译产物中。在另一实施例中，选择和/或筛选剂的浓度是可变化的。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包括：（a）产生源自于来自第一生物体的至少一种tRNA的突变tRNA的库；（b）负性选择或筛选所述库的在不存在来自第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶（RS）的情况下被来自第二生物体的RS氨酰化的（视需要为突变的）tRNA，从而提供（视需要为突变的）tRNA的集合；（c）选择或筛选（视需要为突变的）tRNA的集合的被所引入的正交RS（O-RS）氨酰化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别出选择密码子并且未被来自第二生物体的RS有效识别出，并且优先被O-RS氨酰化。所述方法也包括（d）产生源自于来自第三生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶（RS）的（视需要为突变的）RS的库；（e）选择或筛选突变RS库的在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的存在下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰化的成员，从而提供活性（视需要为突变的）RS的集合；和（f）负性选择或筛选所述集合的在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰化的活性（视需要为突变的）RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码的氨基酸为特异性的重组O-RS和至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例而言，特异性O-tRNA/O-RS对可包括（包括（但不限于））mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如，mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等等。另外，所述方法包括其中第一生物体和第三生物体是相同的（包括（但不限于）詹氏甲烷球菌）。
用于选择适用于第二生物体的活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也包括在本发明中。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或得到的氨酰基-tRNA合成酶（RS）引入到来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入到来自第二生物体的复制细胞组中；和选择在第一组中存活但在复制细胞组中未能存活的细胞，或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中未产生所述反应的细胞，其中第一组和复制细胞组是在选择或筛选剂的存在下生长，其中存活细胞或经筛选的细胞包含适用于第二生物体的活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检定。可改变选择或筛选剂的浓度。
本发明的生物体包含各种生物体和各种组合。举例而言，本发明的方法的第一生物体和第二生物体可为相同的或不同的。在一个实施例中，生物体视需要为原核生物，包括（但不限于）詹氏甲烷球菌、横川病毒、嗜盐杆菌属、大肠埃希氏杆菌、闪烁古生球菌（A.fulgidus）、激烈火球菌（P.furiosus）、堀越氏火球菌（P.horikoshii）、嗜热菌敏捷气热菌（A.pernix）、嗜热栖热菌等等。或者，生物体视需要包含真核生物，包括（但不限于）植物（包括（但不限于）诸如单子叶植物或双子叶植物的复杂植物）、藻类、原生生物、真菌（包括（但不限于）酵母等）、动物（包括（但不限于）哺乳动物、昆虫、节肢动物等）等等。在另一个实施例中，第二生物体是原核生物，包括（但不限于）詹氏甲烷球菌、横川病毒、嗜盐杆菌属、大肠埃希氏杆菌、闪烁古生球菌（A.fulgidus）、嗜盐杆菌属、激烈火球菌（P.furiosus）、堀越氏火球菌（P.horikoshii）、嗜热菌敏捷气热菌（A.pernix）、嗜热栖热菌等等。或者，第二生物体可为真核生物，包括（但不限于）酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，第一生物体和第二生物体是不同的。
VI.非天然存在的氨基酸在GH（例如，hGH）多肽中的定位
本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在的氨基酸并入GH（例如，hGH）多肽中。一个或一个以上非天然存在的氨基酸可以在不破坏多肽活性的特定位置处并入。此可通过进行“保守性”取代而实现，所述“保守性”取代包括（但不限于）以疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、庞大的氨基酸取代庞大的氨基酸、亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或将非天然存在的氨基酸插入不为活性所需的位置中。
GH（例如，hGH）的各区可如下说明，其中hGH中的氨基酸位置表示于中间一行中（SEQ ID NO:2）。
螺旋A     螺旋B     螺旋C     螺旋D
[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]
N端    A-B环    B-C环    C-D环    C端
可采用各种生物化学和结构方法来选择用于在GH（例如，hGH）多肽内以非天然编码的氨基酸进行取代的所要部位。所属领域的技术人员易于了解，所述多肽链的任何位置是适于选择的以并入非天然编码的氨基酸，并且为了任何特定的所要目的或不为任何特定的所要目的，选择可以基于合理设计或通过随机选择进行。选择所要部位可以用于产生具有任何所要性质或活性的GH（例如，hGH）分子（包括（但不限于）促效剂、超促效剂、反向促效剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂），用于二聚体或多聚体形成，与天然分子相比较不改变活性或性质，或调节多肽的任何物理性质或化学性质（诸如溶解性、聚集性或稳定性）。举例而言，可使用此项技术中已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描法来鉴别GH（例如，hGH）多肽的生物活性所需的多肽位置。参见，例如，Cunningham,B.和Wells,J.,Science,244:1081-1085（1989）（鉴别出14个对GH（例如，hGH）生物活性很关键的残基）和Cunningham,B.等人，Science243:1330-1336（1989）（使用同系物扫描突变法鉴别抗体和受体抗原决定基）。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号描述通过利用靶物质鉴别影响多肽活性的活性结构域对多肽（诸如，hGH）的结构和功能进行系统分析的方法，所述专利是以引用的方式并入本文中。除通过丙氨酸或同系物扫描突变法而鉴别为对生物活性很关键的那些残基以外的残基可以为以非天然编码的氨基酸进行取代的良好候选残基，此视所寻求的多肽的所要活性而定。或者，鉴别为对生物活性很关键的部位也可以为以非天然编码的氨基酸进行取代的良好候选部位，此也视所寻求的多肽的所要活性而定。另一种替代选择将为简单地以非天然编码的氨基酸在多肽链上的各个位置处进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域的技术人员易于了解，用于选择将非天然氨基酸取代到任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法适用于本发明。
也可研究含有缺失的hGH多肽的天然存在的突变体的结构和活性以确定可能容许以非天然编码的氨基酸进行取代的蛋白质区域。关于hGH，参见，例如，Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta,925:314（1987）；Lewis,U.等人，J.Biol.Chem.,253:2679-2687（1978）。以类似方式，可使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别担负结合hGH受体的hGH区域。参见，例如，Cunningham,B.等人，Science243:1330-1336（1989）；Mills,J.等人，Endocrinology,107:391-399（1980）；Li,C.,Mol.Cell.Biochem.,46:31-41（1982）（表明残基134与149之间的氨基酸可缺失而活性不会丧失）。一旦可能不容许以非天然编码的氨基酸进行取代的残基已经除去后，就可根据hGH和其结合蛋白质的三维晶体结构来研究在各个剩余位置上所建议的取代的影响。关于hGH，参见de Vos,A.等人，Science,255:306-312（1992）；hGH的所有晶体结构可在蛋白质数据库（Protein Data Bank）（包括3HHR、1AXI和1HWG）（PDB，可在www.rcsb.org上获得）中获得，所述蛋白质数据库为含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中式数据库。如果三维结构数据不可获得，那么可以建立研究多肽的二级和三级结构的模型。因此，所属领域的技术人员可易于鉴别可经非天然编码的氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中，本发明的GH（例如，hGH）多肽包含一个或一个以上位于不会破坏多肽的螺旋或β折叠二级结构的蛋白质区域中的非天然存在的氨基酸。
并入非天然编码的氨基酸的示范性残基可以是那些排除在可能的受体结合区域（包括（但不限于）部位I和部位II）外的残基，可以是那些完全地或部分地暴露于溶剂的残基，那些与邻近残基的氢键键合相互作用最小或与邻近残基无氢键键合相互作用的残基，可以是那些最低限度地暴露于邻近反应性残基的残基，并且可以是那些在如通过与其受体结合或未结合的hGH的三维的晶体结构、二级、三级或四级结构所预测的高度挠性的（包括（但不限于）C-D环）或结构上刚性的（包括（但不限于）B螺旋）区域中的残基。
在一些实施例中，在如下对应于hGH二级结构的一个或一个以上下列区域中的任何位置处将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入：对应于来自SEQ ID NO:2的1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）的位置。在其它实施例中，本发明的GH多肽（例如，hGH多肽）包含至少一个非天然存在的氨基酸，所述非天然存在的氨基酸取代位于GH（例如，hGH）的至少一个区域中的至少一个氨基酸，所述区域是选自由对应于以下区域的区域组成的群组：SEQ ID NO:2的N端（1-5）、A-B环的N端（32-46）、B-C环（97-105）、C-D环（132-149）和C端（184-191）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码的氨基酸是在GH（例如，hGH）的一个或一个以上的以下位置处并入，所述位置对应于：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:l或3的相应氨基酸）。
并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位包括对应于以下位置的部位：位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。
并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的子集包括对应于以下位置的部位：位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187或其任何组合（来自SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。GH（例如，hGH）的晶体结构和其与GH（例如，hGH）受体的相互作用的研究表明这些氨基酸残基的侧链是完全地或部分地可为溶剂所接近，并且非天然编码的氨基酸的侧链可以远离蛋白质表面而指向溶剂中。
并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位置包括对应于以下位置的部位：位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。GH（例如，hGH）的晶体结构和其与GH（例如，hGH）受体的相互作用的研究表明这些氨基酸残基的侧链是完全地暴露于溶剂的并且天然残基的侧链指向溶剂中。
并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的子集包括对应于以下位置的部位：位置30、74、103或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的另一个子集包括对应于以下位置的部位：位置35、92、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的又一个子集包括对应于以下位置的部位：位置35、92、131、134、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的又一个子集包括对应于以下位置的部位：位置30、35、74、92、103、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ IDNO:1或3的相应氨基酸）。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的又一个子集包括对应于以下位置的部位：位置35、92、143、145或其任何组合（来自SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在某些实施例中，并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的部位包括对应于位置35（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）的部位。
在一些实施例中，并入GH（例如，hGH）中的至少一个非天然编码的氨基酸含有羰基（例如，酮基）。在某些实施例中，并入GH（例如，hGH）中的至少一个非天然编码的氨基酸是对乙酰苯丙氨酸。在GH（例如，hGH）含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，并入GH（例如，hGH）中的多个非天然编码的氨基酸是对乙酰苯丙氨酸。在GH（例如，hGH）含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，并入GH（例如，hGH）中的大体上所有的非天然编码的氨基酸是对乙酰苯丙氨酸。
在一些实施例中，非天然存在的氨基酸是在包括（但不限于）对应于以下位置的位置的一个或一个以上位置处与水溶性聚合物相连接：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在一定位置处相连接，所述位置包括（但不限于）对应于30、35、74、92、103、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）这些位置中的一个或一个以上位置的位置。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在一定位置处相连接，所述位置包括（但不限于）对应于35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）这些位置中的一个或一个以上位置的位置。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在一定位置处相连接，所述位置包括（但不限于）对应于35、92、131、134、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）这些位置中的一个或一个以上位置的位置。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在一定位置处相连接，所述位置包括（但不限于）对应于30、35、74、92、103、145或其任何组合（来自SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）这些位置中的一个或一个以上位置的位置。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在一定位置处相连接，所述位置包括（但不限于）对应于35、92、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）这些位置中的一个或一个以上位置的位置。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物在对应于（但不限于）位置35（来自SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）的位置处相连接。
在一些实施例中，与GH（例如，hGH）相连接的水溶性聚合物包括一个或一个以上聚乙二醇分子（PEG）。聚合物（例如，PEG）可以是线性或分枝的。通常，用于本发明中的线性聚合物（例如，PEG）可以具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kDa的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。通常，用于本发明中的分枝聚合物（例如，PEG）可以具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。诸如PEG的聚合物在本文中有进一步描述。在某些实施例中，GH（例如，hGH）与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的键是肟键。
本发明的某些实施例涵盖包括通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的GH（例如，hGH）的组合物，其中所述共价键是肟键。在一些实施例中，水溶性聚合物为PEG，例如，线性PEG。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的至少一个线性PEG的一些实施例中，所述PEG可以具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kDa的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的至少一个分枝PEG的一些实施例中，所述PEG可以具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，所述PEG具有约40kDa的分子量。在一些实施例中，GH为例如hGH的GH，且在这些实施例中的某些实施例中，GH（例如，hGH）具有至少约80%与SEQ ID NO:2相同的序列；在一些实施例中，GH（例如，hGH）具有为SEQ ID NO:2的序列的序列。在一些实施例中，GH（例如，hGH）含有至少一个非天然编码的氨基酸；在这些实施例中的一些实施例中，至少一个肟键是在非天然编码的氨基酸与至少一个水溶性聚合物之间。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸含有羰基，诸如，酮基；在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，对乙酰苯丙氨酸是在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处进行取代。
因此，在一些实施例中，本发明提供一种通过共价键与至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接的GH（例如，hGH），其中所述共价键为肟键。在某些实施例中，水溶性聚合物为PEG，且所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kDa的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在某些实施例中，水溶性聚合物为PEG，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，所述PEG具有约40kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种GH（例如，hGH），其中所述GH（例如，hGH）含有非天然编码的氨基酸，其中GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，并且其中所述共价键为非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的肟键。在一些实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处将非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kDa的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，所述PEG具有约40kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种GH（例如，hGH），其中所述GH（例如，hGH）含有为含羰基的非天然编码的氨基酸的非天然编码的氨基酸，其中GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，并且所述共价键为非天然编码的含羰基的氨基酸与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的肟键。在一些实施例中，在对应于SEQID NO:2的位置35的位置处将非天然编码的含羰基的氨基酸并入GH（例如，hGH）中。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kD的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，所述PEG具有约40kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种含有包括酮基的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH），其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，并且其中所述共价键是含有酮基的非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的肟键。在一些实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处将含有酮基的非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kD的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，所述PEG具有约40kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种含有为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH），其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，并且其中所述共价键是对乙酰苯丙氨酸与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的肟键。在一些实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处将对乙酰苯丙氨酸并入GH（例如，hGH）中。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kD的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的线性PEG的某些实施例中，所述PEG具有约30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。在涵盖通过肟键与GH（例如，hGH）相连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的分子量。
在某些实施例中，本发明提供一种GH（例如，hGH），其包括SEQ ID NO:2，并且其中所述GH（例如，hGH）是在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处经对乙酰苯丙氨酸取代，所述对乙酰苯丙氨酸是通过肟键与分子量为约30kDa的线性PEG相连接。
在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置30、35、74、92、103、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、131、134、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置30、35、74、92、103、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、143、145或其任何组合（来自SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于位置35（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，PEG可以具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kD的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置30、35、74、92、103、143、145（SEQID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、131、134、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置30、35、74、92、103、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于以下位置的位置：位置35、92、143、145或其任何组合（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明提供一种包括通过肟键与至少一个PEG（例如，线性PEG）相连接的GH（例如，hGH）的激素组合物，其中所述GH（例如，hGH）包含SEQID NO:2的氨基酸序列，并且其中GH（例如，hGH）含有在一个或一个以上位置处进行取代的至少一个为对乙酰苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸，所述位置包括（但不限于）对应于位置35（来自SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，PEG可以具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kD的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。
在一些实施例中，本发明提供一种GH（例如，hGH），其中所述GH（例如，hGH）含有至少一个非天然编码的氨基酸，其中GH是通过共价键与多个水溶性聚合物（例如，多个PEG）相连接，其中一个或一个以上共价键是在至少一个非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物（例如，PEG）之间的肟键。GH（例如，hGH）可以与约2-100个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约2-50个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约2-25个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约2-10个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约2-5个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约5-100个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约5-50个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约5-25个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约5-10个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约10-100个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约10-50个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约10-20个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约20-100个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约20-50个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接，或与约50-100个水溶性聚合物（例如，PEG）相连接。可在本文所述的任何位置处将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中。在一些实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处将至少一个非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括至少一个为含有羰基的非天然编码的氨基酸的非天然编码的氨基酸，例如，含有酮基的非天然编码的氨基酸，诸如，对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，GH（例如，hGH）包括对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置35的位置处将对乙酰苯丙氨酸并入GH（例如，hGH）中，其中对乙酰苯丙氨酸是通过肟键与聚合物中的一个（例如，PEG中的一个）相连接。在一些实施例中，至少一个水溶性聚合物（例如，PEG）是通过与至少一个非天然编码的氨基酸的共价键而与GH（例如，hGH）相连接。在一些实施例中，所述共价键为肟键。在一些实施例中，多个水溶性聚合物（例如，PEG）是通过与多个非天然编码的氨基酸的共价键而与GH（例如，hGH）相连接。在一些实施例中，至少一个共价键为肟键；在一些实施例中，多个共价键为肟键；在一些实施例中，大体上所有的键为肟键。多个水溶性聚合物（例如，PEG）可为线性聚合物、分枝聚合物或其任何组合。在并入一个或一个以上线性PEG的实施例中，线性PEG具有约0.1kDa到约100kDa的分子量，或具有约1kDa到约60kDa的分子量，或具有约20kDa到约40kDa的分子量，或具有约30kDa的分子量。在并入一个或一个以上分枝PEG的实施例中，分枝PEG具有约1kDa到约100kDa的分子量，或具有约30kDa到约50kDa的分子量，或具有约40kDa的分子量。应了解，采用多个水溶性聚合物（例如，PEG）的实施例一般而言将采用分子量比使用单个PEG的实施例低的所述聚合物。因而，在一些实施例中，多个PEG的总分子量为约0.1-500kDa，或为约0.1-200kDa，或为约0.1-100kDa，或为约1-1000kDa，或为约1-500kDa，或为约1-200kDa，或为约1-100kDa，或为约10-1000kDa，或为约10-500kDa，或为约10-200kDa，或为约10-100kDa，或为约10-50kDa，或为约20-1000kDa，或为约20-500kDa，或为约20-200kDa，或为约20-100kDa，或为约20-80kDa，为约20-60kDa，为约5-100kDa，为约5-50kDa，或为约5-20kDa。
人类GH拮抗剂包括（但不限于）在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127处具有取代或在位置1处具有添加（即，在N端）或其任何组合（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1、3或任何其它GH序列中的相应氨基酸）的那些拮抗剂。
可将各种非天然编码的氨基酸取代到或并入GH（例如，hGH）多肽中的指定位置。一般而言，基于GH（例如，hGH）多肽与其受体的三维晶体结构的研究、保守性取代的优选（即，基于芳基的非天然编码的氨基酸，诸如对乙酰苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp）和所属领域的技术人员希望引入GH（例如，hGH）多肽中的特异性结合化学作用（例如，如果所属领域的技术人员想要实现与具有炔部分的水溶性聚合物的胡氏根[3+2]环加成作用或与具有又并入膦部分的芳基酯的水溶性聚合物的酰胺键形成作用，那么就引入4-叠氮基苯丙氨酸），选择适于并入的特定的非天然编码的氨基酸。
在一个实施例中，方法另外包括：将非天然的氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然的氨基酸包含第一反应性基团；和使蛋白质与包含第二反应性基团的分子（包括（但不限于）标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交联剂、放射性核素、细胞毒素化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖的官能团、共价地或非共价地与其它分子相互作用的基团、光笼锁部分、光化辐射可激发部分、光敏异构化部分、生物素、生物素的衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光致裂解的基团、伸长的侧链、经碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记的部分、生物物理学探针、发磷光的基团、化学发光基团、电子密集基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测的标记、小分子、量子点、纳米传导物、放射性核苷酸、放射性传导物、中子俘获剂或上述物质的任何组合或任何其它所要化合物或物质）接触。所述第一反应性基团与所述第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成作用使分子与非天然的氨基酸相连接。在一个实施例中，第一反应性基团是炔基或叠氮基部分，并且第二反应性基团是叠氮基或炔基部分。举例而言，第一反应性基团是炔基部分（包括（但不限于）在非天然的氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中），并且第二反应性基团是叠氮基部分。在另一个实例中，第一反应性基团是叠氮基部分（包括（但不限于）在非天然的氨基酸对-叠氮基-L-苯丙氨酸中），并且第二反应性基团是炔基部分。
在一些情况下，将使非天然编码的氨基酸取代与GH（例如，hGH）多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响GH（例如，hGH）多肽的其它生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以增加GH（例如，hGH）多肽的稳定性（包括（但不限于）对蛋白水解降解的抗性）或增加GH（例如，hGH）多肽对其受体的亲和力。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含选自由下列各取代组成的群组的氨基酸取代：SEQID NO:2中的F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D；H21N；G120A；R167N；D171S；E174S；F176Y、I179T或其任何组合。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以增加GH（例如，hGH）多肽的溶解性（包括（但不限于）当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时）。在一些实施例中，添加、取代或缺失可以增加在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后的多肽溶解性。在一些实施例中，除适于并入导致在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后的多肽溶解性增加的非天然的氨基酸的部位之外，还选择适于以天然编码的或非天然的氨基酸进行取代的其它部位。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽包含另一添加、取代或缺失，其调控对GH（例如，hGH）多肽受体的亲和力，调控（包括（但不限于）增强或减弱）受体二聚化，稳定受体二聚体，调控循环半衰期，调控释放或生物利用率，促进纯化，或改善或改变特定投药途径。举例而言，除引入如本文所述的一个或一个以上非天然编码的氨基酸外，还引入一个或一个以上的以下取代来增加GH（例如，hGH）变异体对其受体的亲和力：F10A、F10H或F10I；M14W、M14Q或M14G；H18D；H21N；R167N；D171S；E174S；F176Y和I179T。同样地，GH（例如，hGH）多肽可包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域（包括（但不限于）FLAG或聚组氨酸）或其它基于亲和力的序列（包括（但不限于）FLAG、聚组氨酸、GST等）或连接分子（包括（但不限于）生物素），其改善检测（包括（但不限于）GFP）、纯化、通过组织或细胞膜的运输、前药释放或活化、hGH大小减缩或多肽的其它特性。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸的取代产生GH（例如，hGH）拮抗剂。适于并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性部位的子集包括：位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或位置1前的添加（SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1、3或任何其它GH序列的相应氨基酸）。在一些实施例中，GH（例如，hGH）拮抗剂包含使得GH充当拮抗剂的在以下区域中的至少一个取代：1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）。在其它实施例中，并入非天然编码的氨基酸的示范性部位包括在螺旋A的氨基端区域和一部分螺旋C内的残基。在另一个实施例中，以诸如对-叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然编码的氨基酸取代G120。在其它实施例中，将上面列出的取代与其它取代组合，使得GH（例如，hGH）多肽成为GH（例如，hGH）拮抗剂。举例而言，在本文中所鉴别的位置中的一个位置处以非天然编码的氨基酸取代，且同时在G120处引入取代（例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E）。在一些实施例中，GH（例如，hGH）拮抗剂包含与水溶性聚合物相连接的存在于GH（例如，hGH）分子受体结合区域中的非天然编码的氨基酸。
在一些情况下，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上的氨基酸经一个或一个以上的非天然编码的氨基酸取代。在一些情况下，GH（例如，hGH）多肽另外包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上的一个或一个以上非天然编码的氨基酸对天然存在的氨基酸的取代。举例而言，在一些实施例中，GH（例如，hGH）的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代：1-5（N端）；32-46（A-B环的N端）；97-105（B-C环）；和132-149（C-D环）；和184-191（C端）。在一些实施例中，GH（例如，hGH）的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代：1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）。在一些情况下，一个或一个以上非天然编码的残基是与一个或一个以上较低分子量的线性或分枝PEG（质量大约5-20kDa或更小）相连接，进而相对于与单个、较高分子量的PEG相连接的物质来说，其使结合亲和力增强并且血清半衰期相当。
在一些实施例中，以下GH（例如，hGH）的残基中至多两个残基在以下位置处经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代：位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187。在一些情况下，进行以下成对的取代中的任何取代：K38X*和K140X*；K41X*和K145X*；Y35X*和E88X*；Y35X*和F92X*；Y35X*和Y143X*；F92X*和Y143X*，其中X*表示非天然编码的氨基酸。适于并入两个或两个以上非天然编码的氨基酸的优选部位包括以下残基的组合：位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187。适于并入两个或两个以上非天然编码的氨基酸的特别优选的部位包括以下残基的组合：位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155。
适于将两个或两个以上非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）中的优选部位包括以下残基的组合：来自SEQ ID NO:2的位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）或其任何组合。
VII.在非真核生物和真核生物中的表达
为获得克隆GH（例如，hGH）多聚核苷酸的高水平表达，所属领域的技术人员通常将编码本发明的GH（例如，hGH）多肽的多聚核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，且若对于编码蛋白质的核酸而言，则其还含有用于翻译起始的核糖体结合部位。合适的细菌启动子对所属领域的技术人员来说是已知的并且描述（例如）于Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表达本发明的GH（例如，hGH）多肽的细菌表达系统可在（包括（但不限于））大肠杆菌、芽胞杆菌种（Bacillus sp.）、荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌属（Salmonella））中得到（Palva等人，Gene:22:229-235（1983）；Mosbach等人，Nature302:543-545（1983））。用于所述表达系统的试剂盒是可购得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统对所属领域的技术人员来说是已知的并且也是可购得的。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶（上面所描述）表达本发明的GH（例如，hGH）多肽的情况下，供表达的宿主细胞是基于其使用正交组分的能力加以选择。示范性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌（Gram-positive bacteria）（包括（但不限于）短小芽胞杆菌（B.brevis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）或链霉菌属（Streptomyces））和革兰氏阴性细菌（Gram-negative bacteria）（大肠杆菌、荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌菌）以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视需要包括（包括（但不限于））至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然氨基酸的蛋白质，或包括可用活体内蛋白质产生方法（本文中提供有关重组蛋白质产生和纯化的详细资料）获得的量。另一方面，所述蛋白质视需要是以在包括（但不限于）细胞溶胞产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液（包括（但不限于），为包括（但不限于）约1nl到约100L之间的任何数量的体积）中包括（但不限于）每升至少10微克的蛋白质、每升至少50微克的蛋白质、每升至少75微克的蛋白质、每升至少100微克的蛋白质、每升至少200微克的蛋白质、每升至少250微克的蛋白质、每升至少500微克的蛋白质、每升至少1毫克的蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上的蛋白质的浓度存在组合物中。在真核细胞中产生大量（包括（但不限于），比通常可能以包括（但不限于）活体外翻译的其它方法所产生的量大的量）的包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质是本发明的一特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例而言，包含非天然氨基酸的蛋白质可以在细胞提取物、细胞溶胞产物、培养基、缓冲液等中的如下浓度产生：包括（但不限于）至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少l毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20毫克/升、至少30毫克/升、至少40毫克/升、至少50毫克/升、至少60毫克/升、至少70毫克/升、至少80毫克/升、至少90毫克/升、至少100毫克/升、至少200毫克/升、至少300毫克/升、至少400毫克/升、至少500毫克/升、至少600毫克/升、至少700毫克/升、至少800毫克/升、至少900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的蛋白质。
I.表达系统、培养和分离
GH（例如，hGH）多肽可以在包括（例如）酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌的许多合适的表达系统中表达。示范性表达系统的描述提供于下文。
酵母如本文所使用的术语“酵母”包括能够表达编码GH（例如，hGH）多肽的基因的各种酵母中的任何酵母。所述酵母包括（但不限于）产子囊孢子酵母（内孢霉目（Endomycetales））、产担子孢子酵母（basidiosporogenous yeast）和属于不完全菌类（芽生菌目（Blastomycetes））群组的酵母。产子囊孢子酵母分为2个科，蚀精霉科（Spermophthoraceae）和酵母科（Saccharomycetaceae）。后者包含4个亚科，裂殖酵母亚科（Schizosaccharomycoideae）（例如，裂殖酵母属（genus Schizosaccharomyces））、拿逊酵母亚科（Nadsonioideae）、油脂酵母亚科（Lipomycoideae）和酵母亚科（Saccharomycoideae）（例如，毕赤氏酵母属（genera Pichia）、克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）和酵母菌属（Saccharomyces））。产担子孢子酵母包括担子菌白冬孢酵母属（genera Leucosporidium）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、线黑粉菌属（Filobasidium）和香灰拟锁担菌属（Filobasidiella）。属于不完全菌类（芽生菌目）群组的酵母分为2个科，掷孢酵母科（Sporobolomycetaceae）（例如，掷孢酵母属（genera Sporobolomyces）和布勒弹孢酵母属（Bullera））和隐球酵母科（Cryptococcaceae）（例如，念珠菌属（genus Candida））。
供本发明使用的特别受关注的是以下物种内的物种：毕赤氏酵母属、克鲁维酵母菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、汉逊酵母属（Hansenula）、球拟酵母属（Torulopsis）和念珠菌属，包括（但不限于）巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）、顾勒莫蒂毕赤酵母（P.guillerimondii）、酿酒酵母（S.cerevisiae）、卡尔斯伯酵母（S.carlsbergensis）、糖化酵母（S.diastaticus）、道格拉斯酵母（S.douglasii）、克鲁维尔酵母（S.kluyveri）、诺本斯酵母（S.norbensis）、卵形酵母（S.oviformis）、乳酸克鲁维酵母（K.lactis）、脆壁克鲁维酵母（K.fragilis）、白色念珠菌（C.albicans）、麦芽糖假丝酵母（C.maltosa）和多型汉逊酵母（H.polymorpha）。
选择用于表达GH（例如，hGH）多肽的合适酵母是属于所属领域的技术人员的技能范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，合适的宿主可以包括显示具有（例如）良好的分泌能力、低蛋白水解活性、良好的分泌能力、良好的可溶性蛋白质产生和整体稳健性的那些宿主。酵母一般可从包括（但不限于）以下来源的各种来源获得：Yeast GeneticStock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California（Berkeley，CA）和American Type Culture Collection（“ATCC”）（Manassas，VA）。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已经用作重组载体或其它转移DNA的接受者的酵母。所述术语包括已经接受重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的子代。应了解，由于偶然的或有意的突变，单一亲代细胞的子代在形态学方面或在与原始亲代互补的染色体组DNA或总DNA方面可以不必完全相同。与待通过诸如编码GH（例如，hGH）多肽的核苷酸序列的存在的相关性质表征的亲代十分相似的亲代细胞的子代包括在此定义所指的子代中。
已经研制包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体用于转化到许多酵母宿主中。举例而言，已经研制用于酿酒酵母的表达载体（Sikorski等人，GENETICS(1989)122:19；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153:163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75:1929）；用于白色念珠菌的表达载体（Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6:142）；用于麦芽糖假丝酵母的表达载体（Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25:141）；用于多型汉逊酵母的表达载体（Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132:3459；Roggenkamp等人，MOL.GENETICS AND GENOMICS(1986)202:302）；用于脆壁克鲁维酵母的表达载体（Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158:1165）；用于乳酸克鲁维酵母的表达载体（De Louvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154:737；Van denBerg等人，BIOTECHNOLOGY(NY)(1990)8:135）；用于勒莫蒂毕赤酵母的表达载体（Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25:141）；用于巴斯德毕赤酵母的表达载体（美国专利第5,324,639号、第4,929,555号和第4,837,148号；Gregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5:3376）；用于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的表达载体（Beach等人，NATURE(1982)300:706）；和用于解脂耶罗威亚酵母（Y.lipolytica）的表达载体；用于构巢曲霉（A.nidulans）的表达载体（Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112:284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26:205-221；和Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81:1470-74）；用于黑霉菌（A.niger）的表达载体（Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4:475-479）；用于里氏木霉（T.reesia）的表达载体（EP0244234）；和用于诸如脉孢菌属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）、弯颈霉属（Tolypocladium）的丝状真菌的表达载体（WO91/00357），各个参考文献是以引用的方式并入本文中。
酵母载体的控制序列对所属领域的技术人员来说是已知的，并且包括（但不限于）来自诸如以下基因的基因的启动子区域：醇脱氢酶（ADH）（EP0284044）；烯醇酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶（GAP或GAPDH）；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶（PyK）（EP0329203）。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可以提供有用的启动子序列（Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1）。供酵母宿主使用的其它合适的启动子序列可以包括3-磷酸甘油酸激酶（Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255:12073）和诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶的其它糖酵解酶（Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17:4900；Hess等人，J.ADV.ENZYME REG.(1969)7:149）的启动子。对于通过生长条件控制转录具有额外优点的可诱导酵母启动子可以包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。适用于酵母表达的合适的载体和启动子进一步描述于EP0073657中。
酵母增强子也可以与酵母启动子一起使用。另外，合成的启动子也可以起酵母启动子的作用。举例而言，酵母启动子的上游激活序列（UAS）可以与另一酵母启动子的转录激活区域相接合，产生合成的杂交启动子。所述杂交启动子的实例包括与GAP转录激活区域相连接的ADH调控序列。参见，美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式并入本文中。杂交启动子的其它实例包括由与诸如GAP或PyK的糖酵解酶基因的转录激活区域组合的ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列组成的启动子。参见，EP0164556。此外，酵母启动子可以包括具有结合酵母RNA聚合酶并且引发转录的能力的非酵母源的天然存在的启动子。
可以包含部分酵母表达载体的其它控制元件包括（例如）来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子（Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385）。另外，来自2μ质粒源的复制起点适用于酵母。适用于酵母的合适的选择基因是存在于酵母质粒中的trp1基因。参见，Tschumper等人，GENE(1980)10:157；Kingsman等人，GENE(1979)7:141。trp1基因为无法在色氨酸中生长的酵母突变菌株提供选择标记物。同样地，缺Leu2的酵母菌株（ATCC20,622或38,626）是通过带有Leu2基因的已知质粒来补充。
将外源性DNA引入酵母宿主中的方法对所属领域的技术人员来说是已知的，并且通常包括（但不限于）用碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞或原生质球状体的转化。举例而言，酵母的转化可根据Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130:946中所述的方法进行。然而，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合的用于将DNA引入细胞中的其它方法也可以如SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING:A LAB.MANUAL（2001）中一般所述来使用。接着可以使用所属领域的技术人员已知的标准技术培养酵母宿主细胞。
用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其它方法对所属领域的技术人员来说是已知的。一般参见，美国专利公开案第20020055169号、美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号和第5,089,398号；美国再审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO99/07862；WO98/37208；和WO98/26080；欧洲专利申请案EP0946736；EP0732403；EP0480480；WO90/10277；EP0340986；EP0329203；EP0324274和EP0164556。也参见Gellissen等人，ANTONIE VANLEEUWENHOEK(1992)62(l-2):79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6):423-488；Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185:3-7，各个参考文献是以引用的方式并入本文中。
酵母宿主菌株在扩增阶段可使用所属领域的技术人员已知的标准补料分批发酵方法生长于发酵罐中。由于特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制的模式的差异，可对发酵方法加以调适。举例而言，酵母菌属酵母宿主的发酵可能需要单一的葡萄糖进料、复合氮源（例如，酪蛋白水解产物）和多次维生素补充。相比之下，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物质进料，但仅需要简单的铵（氮）盐以获得最佳生长和表达。参见，例如，美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9:95；和Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113，其是以引用的方式并入本文中。
然而，独立于所采用的酵母宿主菌株，所述发酵方法可以具有某些共有特征。举例而言，可在扩增阶段将通常为碳的生长限制性营养物添加到发酵罐中以允许最大程度的生长。另外，发酵方法一般采用经设计而含有足够量的碳、氮、基本盐、磷和其它微量营养物（维生素、痕量矿物质和盐等)的发酵培养基。适于供毕赤氏酵母使用的发酵培养基的实例是描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，所述专利以引用的方式并入本文中。
经杆状病毒感染的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”指的是可用作或已经用作重组载体或其它转移DNA的接受者的昆虫。所述术语包括已经被转染的原始昆虫宿主细胞的子代。应了解，由于偶然的或有意的突变，单一亲代细胞的子代在形态学方面或在与原始亲代互补的染色体组DNA或总DNA方面可以不必完全相同。与待通过诸如编码GH（例如，hGH）多肽的核苷酸序列的存在的相关性质表征的亲代十分相似的亲代细胞的子代包括在此定义所指的子代中。
用于表达GH（例如，hGH）多肽的合适昆虫细胞的选择对所属领域的技术人员来说是已知的。一些昆虫物种在此项技术中得到充分的描述并且是可购得的，包括埃及伊蚊（Aedes aegypti）、家蚕（Bombyx mori）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适的宿主可以包括显示尤其具有良好的分泌能力、低蛋白水解活性和整体稳健性的那些宿主。昆虫一般可从包括（但不限于）以下来源的各种来源获得：Insect GeneticStock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California（Berkeley,CA）；和American Type Culture Collection（“ATCC”）（Manassas，VA）。
通常，经杆状病毒感染的昆虫表达系统的组分包括转移载体，通常为细菌质粒，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入待表达的异源基因的适宜的限制性部位；具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒（此允许异源基因在杆状病毒基因组中的同源重组）；和适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。用于构建载体、转染细胞、挑取蚀斑、使细胞生长于培养物中等的材料、方法和技术在此项技术中为已知的并且描述这些技术的手册是可获得的。
在将异源基因插入转移载体中后，载体和野生型病毒基因组被转染到昆虫宿主细胞中，在所述宿主细胞中所述载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒并且鉴别和纯化重组蚀斑。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以来自（例如）Invitrogen Corp.（Carlsbad,CA）的试剂盒形式购得。这些技术一般为所属领域的技术人员所知并且在以引用的方式并入本文的SUMMERS和SMITH,TEXAS AGRICULTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN NO.1555（1987）中进行了全面描述。也参见，RICHARDSON,39METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUSEXPRESSION PROTOCOLS（1995）；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY16.9-16.11（1994）；KING和POSSEE,THE BACULOVIRUSSYSTEM:A LABORATORY GUIDE（1992）；和O'REILLY等人，BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL（1992）。
实际上，使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统的各种异源蛋白质的产生对所属领域的技术人员来说是已知的。参见，例如，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO02/06305；WO01/90390；WO01/27301；WO01/05956；WO00/55345；WO00/20032；WO99/51721；WO99/45130；WO99/31257；WO99/10515；WO99/09193；WO97/26332；WO96/29400；WO96/25496；WO96/06161；WO95/20672；WO93/03173；WO92/16619；WO92/02628；WO92/01801；WO90/14428；WO90/10078；WO90/02566；WO90/02186；WO90/01556；WO89/01038；WO89/01037；WO88/07082，所述参考文献是以引用的方式并入本文中。
适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体在此项技术中是已知的并且包括（例如）源自为不依赖于辅助病毒（helper）的病毒表达载体的杆状病毒苜蓿银纹夜蛾（Autographacalifornica）核型多角体病毒（AcNPV）的昆虫表达和转移载体。源自此系统的病毒表达载体一般使用强病毒性多角体蛋白基因启动子来促使异源基因的表达。一般参见O'Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORYMANUAL（1992）。
在将外源基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列（若有需要时）、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分装配成中间错位构建物（转移载体）。常将中间错位构建物维持在诸如能够稳定维持在诸如细菌的宿主中的染色体外元件（例如，质粒）的复制子中。复制子将会具有复制系统，因此允许其得以维持在用于克隆和扩增的合适宿主中。更明确地说，质粒可以含有多角体蛋白多聚腺苷酸化信号（Miller,ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42:177）以及用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核生物氨苄青霉素（ampicillin）抗性（amp）基因和复制起点。
用于将外源基因引入AcNPV中的一种常用转移载体是pAc373。也已经设计了许多其它已为所属领域的技术人员所知的载体，包括（例如）pVL985，其将多角体蛋白起始密码子从ATG改变成ATT，并且在ATT下游的32个碱基对处引入BamHI克隆部位。参见Luckow和Summers，VIROLOGY170:31（1989）。其它可购得的载体包括（例如）PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）。
在插入异源基因后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。用于将异源DNA引入杆状病毒的所要部位中的方法在此项技术中是已知的。参见，SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO.1555（1987）；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156；Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31。举例而言，插入可为通过同源双交换重组插入到诸如多角体蛋白基因的基因中；插入也可为插入到经设计于所要的杆状病毒基因中的限制性内切酶部位中。参见，Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91。
转染可以通过电穿孔完成。参见，TROTTER和WOOD,39METHODS INMOLECULAR BIOLOGY（1995）；Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。或者，可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。参见，例如，Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37:6050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570；Schmidt等人，PROTEINEXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12:323；Siffert等人，NATURE GENETICS(1998)18:45；TILKTNS等人，CELL BIOLOGY:A LABORATORY HANDBOOK145-154（1998）；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10:263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17:491；Kost等人，GENE(1997)190:139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37):22376；Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2):766；和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。可购得的脂质体包括（例如）
Figure BDA0000437277490001231
和（Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA）。另外，可以使用磷酸钙转染。参见，TROTTER和WOOD,39METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1995）；Kitts,NAR(1990)18(19):5667；和Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是任何能够结合杆状病毒RNA聚合酶并且引发将编码序列（例如，结构基因）下游（3'）转录成mRNA的DNA序列。启动子将具有通常位于最接近于编码序列的5'端的转录起始区域。所述转录起始区域通常包括RNA聚合酶结合部位和转录起始部位。杆状病毒启动子也可以具有称为增强子的第二域，如果存在，那么其通常远离结构基因。此外，表达可为调节型的或为组成型的。
在感染循环的后期充分转录的结构基因提供特别有用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多角体蛋白质的基因（FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES（1986）；EP0127839和0155476）和编码p10蛋白质的基因（Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69:765）的序列。
将新形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中，并且随后可以通过所属领域的技术人员已知的技术来纯化已生长的蚀斑。参见，Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENTSTATION BULLETIN NO.1555（1987）。
已经研制出用于感染到一些昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。例如，已经研制尤其用于埃及伊蚊（ATCC第CCL-125号）、家蚕（ATCC第CRL-8910号）、黑腹果蝇（ATCC第1963号）、草地夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见，Wright,NATURE(1986)321:718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56:153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156。一般参见，Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25:225。更明确地说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括（但不限于）Sf9（草地夜蛾）（ATCC第CRL-1711号）、Sf21（草地夜蛾）（Invitrogen Corp.，目录第11497-013号（Carlsbad，CA））、Tri-368（粉纹夜蛾）和High-FiveTMBTI-TN-5B1-4（粉纹夜蛾）。
用于在杆状病毒/表达中直接表达和融合表达异源多肽的细胞和培养基是可购得的，并且细胞培养技术对所属领域的技术人员来说一般是已知的。
大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物细菌表达技术对所属领域的技术人员来说是已知的。用于细菌宿主中的各种各样的载体是可获得的。载体可以是单拷贝或低度多拷贝或高度多拷贝载体。载体可以用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的大量文献、许多载体的商业可获性并且还鉴于描述载体和其限制性酶切图与特征的手册，在此不需要广泛讨论。如所熟知的，载体通常涉及供选择用的标记物，所述标记物可以提供细胞毒素剂抗性、原营养或免疫性。常常存在提供不同特征的多个标记物。
细菌启动子是任何能够结合细菌RNA聚合酶并且引发将编码序列（例如，结构基因）下游（3'）转录成mRNA的DNA序列。启动子将具有通常位于最接近于编码序列的5'端的转录起始区域。所述转录起始区域通常包括RNA聚合酶结合部位和转录起始部位。细菌启动子也可以具有称为操纵子的第二域，其可以与RNA合成开始处的邻近RNA聚合酶结合部位重叠。因为基因阻遏蛋白可以结合操纵子并且进而抑制特定基因的转录，所以操纵子容许负调控（可诱导的）的转录。组成型表达可以在不存在诸如操纵子的负调控元件时发生。另外，正调控可以通过基因活化蛋白结合序列来达成，如果所述基因活化蛋白结合序列存在，那么其通常最接近于RNA聚合酶结合序列（5'）。基因活化蛋白的一个实例是分解代谢物活化蛋白（CAP），其帮助引发lac操纵子在大肠埃希氏杆菌（大肠杆菌，E.coli）中的转录[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18:173]。经调控的表达因此可以是正性的或负性的，进而增强或减少转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括源自诸如半乳糖、乳糖（lac）[Chang等人，NATURE(1977)198:1056]和麦芽糖的糖代谢酶的启动子序列。其它实例包括源自诸如色氨酸（trp）的生物合成酶的启动子序列[Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES.(1980)8:4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；欧洲专利公开案第036776号和第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶（bla）启动子系统[Weissmann(1981)"The cloning of interferonand other mistakes."In Interferon3（I.Gresser编）]、噬菌体λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用诸如T7启动子的强启动子来诱导高水平的GH（例如，hGH）多肽。所述载体的实例对所属领域的技术人员来说是已知的并且包括来自Novagen的pET29系列和描述在以引用的方式并入本文的WO99/05297中的pPOP载体。所述表达系统在宿主中产生高水平的GH（例如，hGH）多肽，而不会危害到宿主细胞生存能力或生长参数。pET19（Novagen）是在此项技术中已知的另一种载体。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也起细菌启动子的作用。举例而言，一个细菌启动子或噬菌体启动子的转录活化序列可以与另一个细菌启动子或噬菌体启动子的操纵子序列相接合，产生合成的杂交启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例而言，tac启动子是受lac阻遏物调控的由trp启动子和lac操纵子序列组成的杂交trp-lac启动子[Amann等人，GENE(1983)25:167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括具有结合细菌RNA聚合酶并且引发转录的能力的非细菌来源的天然存在的启动子。非细菌来源的天然存在的启动子也能与相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为经偶合的启动子系统的实例[Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189:113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂交启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成（EP公开案第267851号）。
除功能启动子序列之外，有效的核糖体结合部位也可用于外源基因在原核生物中的表达。在大肠杆菌中，核糖体结合部位被称为夏那-道格诺（Shine-Dalgarno，SD）序列并且包括起始密码子（ATG）和定位于起始密码子的上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人，NATURE(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'端之间的碱基配对而促进mRNA与核糖体结合[Steitz等人“Geneticsignals and nucleotide sequences in messenger RNA”，在Biological Regulation andDevelopment:Gene Expression（R.F.Goldberger编，1979）中]。用弱的核糖体结合部位表达真核生物基因和原核生物基因[Sambrook等人，“Expression of cloned genes inEscherichia coli”，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”指的是可用作或已经用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的子代。应了解，由于偶然的或有意的突变，单一亲代细胞的子代在形态学方面或在与原始亲代互补的染色体组DNA或总DNA方面可以不必完全相同。与待通过诸如编码GH（例如，hGH）多肽的核苷酸序列的存在的相关性质表征的亲代十分相似的亲代细胞的子代包括在此定义所指的子代中。
用于表达GH（例如，hGH）多肽的合适宿主细菌的选择对所属领域的技术人员来说是已知的。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可以包括显示尤其具有良好的内含体形成能力、低蛋白水解活性和整体稳健性的那些宿主。细菌宿主一般可从包括（但不限于）以下来源的各种来源获得：Bacterial Genetic Stock Center,Department ofBiophysics and Medical Physics,University of California（Berkeley,CA）；和American TypeCulture Collection（“ATCC”）（Manassas，VA）。工业发酵/医药发酵一般使用源自K菌株（例如，W3110）的细菌或源自B菌株（例如，BL21）的细菌。因为这些菌株的生长参数是十分熟知的和稳固的，所以其是尤其有用的。另外，这些菌株是非致病性的，出于安全性和环境原因这点在商业上很重要。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括（但不限于）BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本发明的方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主是蛋白酶负菌株，包括（但不限于）OMP-和LON-。宿主细胞菌株可以是假单胞菌种，包括（但不限于）荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知命名为菌株MB101的荧光假单胞菌生物型1可用于重组生产并且可用于治疗性蛋白质生产工艺。假单胞菌表达系统的实例包括从Dow Chemical Company获得的作为宿主菌株的系统（Midland，MI，可在www.dow.com上获得）。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,755,465号和第4,859,600号描述假单孢菌菌株作为用于GH（例如，hGH）产生的宿主细胞的用途。
一旦重组宿主细胞菌株已经建立（即，表达构建物已经被引入宿主细胞中并且具有适当的表达构建物的宿主细胞被分离）后，就在适于产生GH（例如，hGH）多肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。如易于为所属领域的技术人员所了解，培养重组宿主细胞菌株的方法将视所利用的表达构建物的性质和宿主细胞的特性而定。通常使用所属领域的技术人员已知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是培养在含有碳、氮和无机盐的可吸收源并且（视需要）含有维生素、氨基酸、生长因子和其它所属领域的技术人员已知的蛋白质培养补充物的液体培养基中。用于培养宿主细胞的液体培养基可以视需要含有用以防止不希望有的微生物生长的抗生素或抗真菌剂和/或包括（但不限于）抗生素（用以选择含有表达载体的宿主细胞）的化合物。
重组宿主细胞可以分批或以连续形式培养，同时细胞收集（在GH（例如，hGH）多肽细胞内积聚的情况下）或培养物上清液的收集呈分批或连续形式。对在原核宿主细胞中产生来说，分批培养和细胞收集为优选的。
本发明的GH（例如，hGH）多肽通常是在重组系统中表达后被纯化。GH（例如，hGH）多肽可以通过此项技术中已知的各种方法从宿主细胞或培养基中加以纯化。在细菌宿主细胞中产生的GH（例如，hGH）多肽可能是难溶的或不溶的（呈内含体形式）。在本发明的一个实施例中，可容易地在GH（例如，hGH）多肽中进行氨基酸取代，选择所述取代是为了利用本文所揭示的方法以及此项技术中已知的那些方法增加重组产生的蛋白质的溶解性。在不溶性蛋白质的情况下，蛋白质可以通过离心从宿主细胞溶胞产物收集并且可以进一步继之以细胞的均质化。在难溶性蛋白质的情况下，可以添加包括（但不限于）聚乙烯亚胺（PEI）的化合物以诱导部分可溶的蛋白质发生沉淀。所沉淀的蛋白质然后可便利地通过离心分离来收集。可以使用所属领域的技术人员已知的各种方法使重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放内含体。可以使用包括（但不限于）酶促细胞破碎、超声处理、杜恩斯（dounce）均质化或高压释放破碎的熟知技术进行宿主细胞破碎或均质化过程。在本发明的方法的一个实施例中，使用高压释放技术使大肠杆菌宿主细胞破碎以释放GH（例如，hGH）多肽的内含体。在处理GH（例如，hGH）多肽的内含体时，可有利地使重复的均质化时间缩到最短以使内含体的产量达到最大，而没有由于诸如增溶、机械剪切或蛋白质水解的因素引起的损失。
接着可以使用此项技术中已知的许多合适的增溶剂中的任何一种使不溶性或所沉淀的GH（例如，hGH）多肽溶解。可以用尿素或盐酸胍使GH（例如，hGH）多肽溶解。应使所溶解的GH（例如，hGH）多肽的体积最小化以便可以使用便于管理的批量大小来大批产生。此因素在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业设置中可能是很重要的。另外，当以大规模商业设置来制造GH（例如，hGH）多肽时，尤其是用于人类医药用途时，应避免可损坏机器和容器或蛋白质产物本身的苛刻化学品（如果可能的话）。在本发明的方法中已经显示较温和的变性剂尿素可用来代替较苛刻的变性剂盐酸胍而使GH（例如，hGH）多肽内含体溶解。尿素的使用会显著降低对在GH（例如，hGH）多肽的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备造成损坏的风险，同时有效地使GH（例如，hGH）多肽内含体溶解。
在可溶性hGH蛋白质的情况下，hGH可以分泌到周质空间中或分泌到培养基中。另外，可溶性hGH可以存在于宿主细胞的细胞质中。在执行纯化步骤之前，可能需要将可溶性hGH浓缩。所属领域的技术人员已知的标准技术可以用来使来自（例如）细胞溶胞产物或培养基的可溶性hGH浓缩。另外，所属领域的技术人员已知的标准技术可用来使宿主细胞破碎并且从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性hGH。
当GH（例如，hGH）多肽作为融合蛋白产生时，可以将融合序列移除。融合序列的移除可以通过酶促裂解或化学裂解达成。融合序列的酶促移除可以使用所属领域的技术人员已知的方法达成。用于移除融合序列的酶的选择将由融合的特性所决定，并且如将易于为所属领域的技术人员所了解，反应条件将通过酶的选择来确定。化学裂解可以使用所属领域的技术人员已知的包括（但不限于）溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂的试剂来完成。经裂解的GH（例如，hGH）多肽可以通过所属领域的技术人员已知的方法从经裂解的融合序列中纯化。如将易于为所属领域的技术人员所了解，所述方法将由融合序列和GH（例如，hGH）多肽的特性和性质所决定。用于纯化的方法可包括（但不限于）尺寸排阻色谱法、疏水性相互作用色谱法、离子交换色谱法或透析或其任何组合。
也可以将GH（例如，hGH）多肽纯化以从蛋白质溶液移除DNA。DNA可以通过诸如沉淀或离子交换色谱法的此项技术中已知的任何合适方法移除，也可以通过用诸如（但不限于）硫酸鱼精蛋白的核酸沉淀剂产生沉淀而移除。可以使用包括（但不限于）离心或过滤的标准的熟知方法使GH（例如，hGH）多肽与所沉淀的DNA分离。宿主核酸分子的移除在GH（例如，hGH）多肽待用来治疗人类的设定中是一个重要因素，并且本发明的方法使宿主细胞DNA降低到医药学上可接受的水平。
小规模发酵或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达，包括（但不限于）发酵罐、摇瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌槽式生物反应器系统。这些方法中的每一种方法可以分批方法、进料-分批方法或连续模式方法来执行。
本发明的人类GH多肽一般可使用此项技术中的标准方法回收。举例而言，培养基或细胞溶胞产物可经离心或过滤以移除细胞残骸。可以将上清液浓缩或稀释到所要体积或透滤到合适的缓冲液中以调节制剂供进一步纯化。本发明的GH（例如，hGH）多肽的进一步纯化包括使GH（例如，hGH）多肽变异体的脱去酰氨基的形式和截短形式与完整形式分离。
可以采用以下示范性程序中的任何程序来纯化本发明的GH（例如，hGH）多肽：亲和色谱法；阴离子或阳离子交换色谱法（使用包括（但不限于）DEAE SEPHAROSE）；硅石色谱法；反相HPLC；凝胶过滤（使用包括（但不限于）SEPHADEX G-75）；疏水性相互作用色谱法；尺寸排阻色谱法；金属螯合色谱法；超滤/透滤法；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱法；电泳程序（包括（但不限于）制备性等电聚焦）、差异溶解性法（包括（但不限于）硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或提取法。
本发明的蛋白质，包括（但不限于）包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等等，可根据所属领域的技术人员已知的和所使用的标准程序来部分地或大体上纯化到均质。因此，本发明的多肽可通过包括（但不限于）硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取法、柱色谱法、亲和柱色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、羟磷灰石色谱法、外源凝集素色谱法、凝胶电泳等的所属领域的技术人员已知的许多方法中的任何方法来回收和纯化。可按需要在制造正确折叠的成熟蛋白质时使用蛋白质重折叠步骤。在需要高纯度的最终纯化步骤中可采用高效液相色谱法（HPLC）、亲和色谱法或其它合适的方法。在一个实施例中，将所制造的抗非天然氨基酸（或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽）的抗体用作纯化试剂，包括（但不限于）用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或肽的基于亲和力的纯化的纯化试剂。一旦多肽按需要被部分地纯化或纯化到均质后，就视需要将其用于多种功用，包括（但不限于）用作检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、科研试剂和/或用作抗体产生的免疫原。
除本文所提及的其它参考文献之外，各种纯化/蛋白质折叠方法对所属领域的技术人员来说是已知的，包括（但不限于）在以下参考文献中所述的那些方法：R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.（1982）；Deutscher,Methods in Enzymology，第182卷： Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.（1990）；Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins,Academic Press,Inc.；Bollag等人（1996）Protein Methods，第2版，Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ；Harris和Angal，（1990）Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Press atOxford,Oxford,England；Harris和Angal，Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Scopes,(1993)Protein Purification: Principles and Practice，第3版，Springer Verlag,NY；Janson和Ryden，（1998）Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH,NY；和Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ；和其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生所关注的具有非天然氨基酸的蛋白质或多肽的一个优点是蛋白质或多肽通常将折叠成其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化后，蛋白质或肽可具有与相关多肽的所要构象不同的构象。在本发明的一方面，视需要使所表达的蛋白质变性并且随后使其复性。此是利用此项技术中已知的方法来实现，包括（但不限于）通过将伴侣蛋白（chaperonin）添加到所关注的蛋白质或多肽中，通过使蛋白质溶解在诸如盐酸胍的离液剂中，通过利用蛋白质二硫键异构酶等来实现。
一般来说，有时需要使所表达的多肽变性和还原并且接着使多肽重折叠成优选构象。举例而言，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到所关注的翻译产物中。使蛋白质还原、变性和复性的方法对所属领域的技术人员来说是已知的（参见，上述参考文献和Debinski等人，（1993）J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan（1993）Bioconiug.Chem.,4:581-585；和Buchner等人，（1992）Anal.Biochem.,205:263-270）。例如，Debinski等人描述内含体蛋白质在胍-DTE中的变性和还原。蛋白质可在含有包括（但不限于）氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重折叠。可使重折叠试剂流动或以另外的方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或反之亦然。
在原核产生GH（例如，hGH）多肽的情况下，如此产生的GH（例如，hGH）多肽可为错误折叠的并且因此缺乏生物活性或具有降低的生物活性。蛋白质的生物活性可以通过“重折叠”而恢复。一般来说，错误折叠的GH（例如，hGH）多肽是通过使用（例如）一种或一种以上离液剂（例如，尿素和/或胍）和能够使二硫键还原的还原剂（例如，二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇、2-ME）使多肽链溶解（其中GH（例如，hGH）多肽也是不溶的）、解折叠和还原而重折叠。接着在中等浓度的离液剂下添加氧化剂（例如，氧、胱氨酸或胱胺），其使得二硫键再形成。GH（例如，hGH）多肽可以使用此项技术中已知的标准方法而重折叠，诸如在以引用的方式并入本文的美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法。GH（例如，hGH）多肽也可以与其它蛋白质共折叠而形成杂二聚体或杂多聚体。
在重折叠或共折叠后，可以对GH（例如，hGH）多肽进行进一步纯化。GH（例如，hGH）的纯化可以使用所属领域的技术人员已知的各种技术来实现，所述技术包括疏水性相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、亲和色谱法等或其任何组合。额外的纯化也可以包括使经纯化的蛋白质干燥或沉淀的步骤。
在纯化后，GH（例如，hGH）可以通过包括（但不限于）透滤和透析的此项技术中已知的多种方法中的任何方法被交换到不同的缓冲液中和/或被浓缩。以单一纯化的蛋白质形式提供的GH（例如，hGH）可以经受聚集和沉淀。
经纯化的GH（例如，hGH）可以是至少90%纯的（如通过反相高效液相色谱法RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE所测量）或至少95%纯的，或至少98%纯的，或至少99%或99%以上纯的。不管GH（例如，hGH）的纯度的确切数值是多少，对用作医药产品或用于诸如与水溶性聚合物（诸如，PEG）的结合的进一步处理来说，GH（例如，hGH）是足够纯的。
某些GH（例如，hGH）分子可以在不存在其它活性成分或蛋白质（不同于赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等）时用作治疗剂，或其可以与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法各种分离步骤中的任何一步骤可以针对包含GH（例如，hGH）多肽的宿主细胞的细胞溶胞产物、提取物、培养基、内含体、周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料执行，或针对由任何分离步骤得到的任何GH（例如，hGH）多肽混合物执行，所述分离步骤包括（但不限于）亲和色谱法、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、高效液相色谱法（“HPLC”）、反相HPLC（“RP-HPLC”）、扩张床吸附或其任何组合和/或重复，并且可以任何适当的顺序执行。
在执行本文所述的技术中所使用的设备和其它必需要材料是可购得的。泵、流分收集器、监测器、记录器和完整系统可从（例如）Applied Biosystems（Foster City，CA）、Bio-Rad Laboratories,Inc.（Hercules，CA）和Amersham Biosciences,Inc.（Piscataway,NJ）获得。包括（但不限于）交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可从所述公司获得。
诸如洗涤和洗脱的本文中所述的柱色谱法中的平衡和其它步骤，可使用诸如泵的专用设备更快速地完成。可购得的泵包括（但不限于）
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泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。
流分收集器的实例包括RediFrac流分收集器、FRAC-100和FRAC-200流分收集器和
Figure BDA0000437277490001312
流分收集器（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。混合器也是可获得的以形成pH值和线性浓度梯度。可购得的混合器包括梯度混合器GM-1和线上混合器（In-Line Mixer）（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。
色谱法过程可以使用任何可购得的监测器来监测。所述监测器可用来搜集如UV、pH值和电导率的信息。检测器的实例包括监测器UV-1、
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S II、监测器UV-MII、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和电导率监测器（AmershamBiosciences，Piscataway，NJ）。实际上，包括来自Amersham Biosciences（Piscataway，NJ）的各种
Figure BDA0000437277490001314
系统的完整系统是可购得的。
在本发明的一个实施例中，例如，GH（例如，hGH）多肽可以通过首先使所得的经纯化的GH（例如，hGH）多肽在尿素中变性，接着稀释到含有还原剂（诸如，DTT）的PH值合适的TRIS缓冲液中而还原和变性。在另一个实施例中，使GH（例如，hGH）多肽在浓度范围为约2M到约9M之间的尿素中变性，接着稀释到pH值在约5.0到约8.0范围内的TRIS缓冲液中。然后可培养所述实施例的重折叠混合物。在一个实施例中，将重折叠混合物在室温下培养4小时到24小时。接着可对经还原和变性的GH（例如，hGH）多肽混合物进行进一步分离或纯化。
如本文中所述，可对第一GH（例如，hGH）多肽混合物的pH值加以调节，然后执行任何随后的分离步骤。另外，可以使用此项技术中已知的技术使第一GH（例如，hGH）多肽混合物或其任何随后的混合物浓缩。此外，可以使用所属领域的技术人员已知的技术将包含第一GH（例如，hGH）多肽混合物或其任何随后的混合物的洗脱缓冲液换成适于下一分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱在一个实施例中并且作为一可选的、额外的步骤，可针对第一GH（例如，hGH）多肽混合物执行离子交换色谱。一般参见ION EXCHANGECHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES AND METHODS（目录第18-1114-21号，AmershamBiosciences（Piscataway，NJ））。可购得的离子交换柱包括
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和
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柱（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。所述柱利用强阴离子交换剂，诸如，
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Fast Flow、
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High Performance和
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XL；强阳离子交换剂，诸如，
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High Performance、
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FastFlow和
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XL；弱阴离子交换剂，诸如，
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Fast Flow；和弱阳离子交换剂，诸如，
Figure BDA00004372774900013210
Fast Flow（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。可以在纯化过程的任何阶段时针对GH（例如，hGH）多肽执行阴离子或阳离子交换柱色谱法，以分离大体上纯化的GH（例如，hGH）多肽。阳离子交换色谱步骤可以使用任何合适的阳离子交换基质来执行。可用的阳离子交换基质包括（但不限于）纤维性的、多孔的、无孔的、微粒状的、珠状的或交联的阳离子交换基质材料。所述阳离子交换基质材料包括（但不限于）纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、硅石、聚醚或任何前述材料的复合材料。
阳离子交换基质可以是包括强阳离子交换剂和弱阳离子交换剂的任何合适的阳离子交换剂。强阳离子交换剂可以在宽的pH值范围内保持离子化状态并且因而可以能够在宽的pH值范围内结合GH（例如，hGH）。然而，弱阳离子交换剂可以随pH值的变化失去离子化。举例而言，当pH降低到约pH4或pH5以下时，弱阳离子交换剂可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括（但不限于）诸如磺丙基（SP）、磺酸甲酯（S）或磺乙基（SE）的带电官能团。阳离子交换基质可以是优选具有约2.5到约6.0的GH（例如，hGH）结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约pH2.5到约pH5.5的GH（例如，hGH）结合pH值范围。阳离子交换基质可以是具有约3.0的GH（例如，hGH）结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可以是优选具有约6.0到约8.0的GH（例如，hGH）结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可以是优选具有约8.0到约12.5的GH（例如，hGH）结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约pH8.0到约pH12.0的GH（例如，hGH）结合pH值范围。
在装载GH（例如，hGH）之前，可以（例如）使用若干柱体积的稀释的弱酸（例如，4个柱体积的pH值为3的20mM乙酸）来使阳离子交换基质平衡。平衡后，可以添加GH（例如，hGH），并且可在洗脱大体上纯化的GH（例如，hGH）之前又使用诸如弱乙酸或磷酸溶液的弱酸溶液将柱子洗涤一次到若干次。举例而言，可使用大约2-4个柱体积的pH值为3的20mM乙酸来洗涤柱子。也可以使用用（例如）2-4个柱体积的pH值为5.5的0.05M乙酸钠或pH值为5.5的与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠的额外洗涤。或者，利用此项技术中已知的方法，可以使用若干柱体积的稀释的弱碱来使阳离子交换基质平衡。
或者，大体上纯化的GH（例如，hGH）可以通过使阳离子交换剂基质与具有足够低的pH值或离子强度的缓冲液接触来洗脱以将GH（例如，hGH）从基质中置换出来。洗脱缓冲液的pH值可以在pH值约为2.5到pH值约为6.0的范围内变化。更明确地说，洗脱缓冲液的pH值可以在pH值约为2.5到pH值约为5.5、pH值约为2.5到pH值约为5.0的范围内变化。洗脱缓冲液可以具有约3.0的pH值。另外，洗脱缓冲液的量可以大幅变化并且将一般在约2个柱体积到约10个柱体积的范围内。
在GH（例如，hGH）多肽吸附于阳离子交换剂基质后，大体上纯化的hGH多肽可以通过使基质与具有足够高的pH值或离子强度的缓冲液接触来洗脱以将GH（例如，hGH）多肽从基质中置换出来。可在此使用的用于大体上纯化的GH（例如，hGH）多肽的高pH值洗脱的合适缓冲液包括（但不限于）浓度在至少约5mM到至少约100mM的范围内变化的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱可以按照所属领域的技术人员已知的合适方案来执行RP-HPLC以纯化蛋白质。参见，例如，Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230（1982）；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268:112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359:391-402。可以针对GH（例如，hGH）多肽执行RP-HPLC以分离大体上纯化的GH（例如，hGH）多肽。就这点来说，可以使用具有多种长度（包括（但不限于）至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20，或至少约C3到至少约C18）的烷基官能基的经硅石衍生的树脂。或者，可以使用聚合树脂。例如，可以使用为苯乙烯聚合物树脂的TosoHaas AmberchromeCG1000sd树脂。也可以使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可以用诸如乙醇的溶剂对RP-HPLC柱进行洗涤。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
含有离子配对剂和有机改性剂（诸如，甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇）的合适洗脱缓冲液可用来将GH（例如，hGH）多肽从RP-HPLC柱上洗脱下来。最常用的离子配对剂包括（但不限于）乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲铵、四丁铵和三乙铵乙酸盐。可以使用一种或一种以上梯度或等度条件来执行洗脱，其中梯度条件经优选以使分离时间缩短并且使峰宽减小。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。可用于本文中的合适洗脱缓冲液的实例可以包括（但不限于）乙酸铵和乙腈溶液。
疏水性相互作用色谱法纯化技术可以针对GH（例如，hGH）多肽执行疏水性相互作用色谱法（HIC）。一般参见，HYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES AND METHODS（目录第18-1020-90号），Amersham Biosciences（Piscataway，NJ），其是以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可以包括（但不限于）经烷基或芳基取代的基质，诸如，经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、硅石、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质；和混合型树脂，包括（但不限于）聚乙烯胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质。用于疏水性相互作用柱色谱的市售来源包括（但不限于）
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和
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柱（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。简单地说，在装载之前，可以使用所属领域的技术人员已知的标准缓冲液（诸如，乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES）来使HIC柱平衡。硫酸铵可以用作装载HIC柱的缓冲液。在装载GH（例如，hGH）多肽后，接着可以使用标准缓冲液和条件对柱子进行洗涤以移除不需要的材料但使GH（例如，hGH）多肽保持在HIC柱上。可以用约3个柱体积到约10个柱体积的标准缓冲液（尤其诸如含有EDTA和浓度比平衡缓冲液低的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液）来洗脱GH（例如，hGH）多肽。使用（例如）磷酸钾梯度的递减线性盐梯度也可用来洗脱GH（例如，hGH）分子。然后可（例如）通过诸如透滤或超滤的过滤作用将洗脱液浓缩。可以利用透滤来移除用来洗脱GH（例如，hGH）多肽的盐。
其它纯化技术可以针对第一GH（例如，hGH）多肽混合物或其任何随后的混合物执行使用（例如）凝胶过滤（GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS（目录第18-1022-18号，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ），其是以引用的方式并入本文中）、羟磷灰石色谱法（合适的基质包括（但不限于）HA-Ultrogel、High Resolution（Calbiochem）、CHT陶瓷羟磷灰石（BioRad）、Bio-Gel HTP羟磷灰石（BioRad））、HPLC、扩张床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一个分离步骤以移除任何过量的盐并且以合适的缓冲液置换之前的缓冲液，以用于下一个分离步骤或甚至用于最终药物产品的调配。
可以使用所属领域的技术人员已知的技术在本文所述的各个步骤时监测包括大体上纯化的GH（例如，hGH）多肽的GH（例如，hGH）多肽的产率。所述技术也可以用来评估最终分离步骤后的大体上纯化的GH（例如，hGH）多肽的产率。举例而言，可以使用具有各种烷基链长度的一些反相高压液相色谱（诸如，氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC）柱中的任何柱以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC来监测GH（例如，hGH）多肽的产率。
在本发明的特定实施例中，各个纯化步骤后的GH（例如，hGH）的产率可以是各个纯化步骤的起始物质中的GH（例如，hGH）的至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%。
纯度可以使用诸如SDS-PAGE的标准技术来测定或通过使用西方墨点（Westernblot）和ELISA检定测量GH（例如，hGH）多肽而测定。例如，可以产生抗从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离得到的蛋白质的多克隆抗体。抗体也可用来探测污染宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4（Vydac）由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。将GH（例如，hGH）多肽与蛋白质性杂质分离是基于疏水性相互作用的强度的差异。使用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度来执行洗脱。制备性HPLC是使用不锈钢柱（装有2.8升到3.2升的Vydac C4硅胶）来执行。羟磷灰石Ultrogel洗脱液是通过添加三氟乙酸而酸化，并且将其装载到Vydac C4柱上。为进行洗涤和洗脱，使用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集流分并且立即用磷酸盐缓冲液中和。将在IPC限度内的GH（例如，hGH）多肽流分合并。
DEAE琼脂糖凝胶（Pharmacia）材料由共价地与琼脂糖凝胶珠粒表面结合的二乙氨基乙基（DEAE）组成。GH（例如，hGH）多肽与DEAE基团的结合为离子相互作用所介导。乙腈和三氟乙酸通过柱子而不保留。在这些物质已经被洗掉后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱子来移除痕量杂质。接着用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱子并且用离子强度增加的缓冲液洗脱GH（例如，hGH）多肽。用DEAE琼脂糖凝胶快速流（DEAESepharose fast flow）装填柱子。调节柱体积以保证GH（例如，hGH）多肽装载量在3-10mg GH（例如，hGH）多肽/ml凝胶的范围内。用水和平衡缓冲液（磷酸钠/磷酸钾）洗涤柱子。装载经合并的HPLC洗脱液流分并且用平衡缓冲液洗涤柱子。然后，用洗涤缓冲液（乙酸钠缓冲液）洗涤柱子，接着用平衡缓冲液进行洗涤。随后，用洗脱缓冲液（氯化钠、磷酸钠/磷酸钾）从柱子洗脱GH（例如，hGH）多肽并且根据主洗脱图以单一流分收集。将DEAE琼脂糖凝胶柱的洗脱液调节到规定的电导率。将所得的药物无菌过滤到特氟隆瓶（Teflon bottle）中并且在-70℃下储存。
可以采用的其它方法包括（但不限于）用以移除内毒素的步骤。内毒素是位于诸如大肠埃希氏菌的革兰氏阴性宿主细胞的外膜上的脂多糖（LPS）。降低内毒素水平的方法对所属领域的技术人员来说是所知的并且包括（但不限于）使用硅石支撑物、玻璃粉或羟磷灰石、反相色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、阴离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、这些方法的组合等的纯化技术。可能需要修改或需要其它方法以将诸如共迁移的蛋白质的污染物从所关注的多肽移除。用于测定内毒素水平的方法对所属领域的技术人员来说是已知的并且包括（但不限于）鲎阿米巴样细胞溶胞产物（LimulusAmebocyte Lysate）（LAL）检定。
多种方法和程序可用来评估包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）蛋白质的产率和纯度，所述方法和程序包括（但不限于）布拉德福（Bradford）检定、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、考马斯亮蓝（coomassie）染色SDS-PAGE、质谱分析（包括但不限于MALDI-TOF）和所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。
其它方法包括（但不限于）：与蛋白质染色方法结合使用的SDS-PAGE、免疫墨点法（immunoblotting）、基质辅助激光解吸／电离-质谱分析法（MALDI-MS）、液相色谱/质谱分析法、等电聚焦、分析性阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
VIII.替代系统中的表达
已经采用一些策略以在非重组宿主细胞、经突变处理的宿主细胞中或在无细胞系统中将非天然的氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制造本发明的GH（例如，hGH）多肽。具有反应性侧链的诸如Lys、Cys和Tyr的氨基酸的衍生化会导致赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供一种并入非天然氨基酸的直接方法。随着肽片段的酶促连接和天然化学性连接的新近发展，有可能制造较大的蛋白质。参见，例如，P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem,69:923（2000）。化学性肽连接和天然化学性连接是描述在美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO03/042235中，所述参考文献是以引用的方式并入本文中。将经所要的非天然氨基酸化学性酰化的抑制tRNA加入到能够维持蛋白质生物合成的活体外提取物中的一般活体外生物合成方法已经被用来将超过100个的非天然氨基酸部位特异性地并入具有几乎任何尺寸的各种蛋白质中。参见，例如，V.W.Cornish、D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621（1995）；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,A general method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science244:182-188（1989）；和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosyntheticsite-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014（1989）。已经将宽范围的官能团引入蛋白质中以用于研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机制和信号转导。
开发一种称为选择性压力并入的活体内方法以利用野生型合成酶的杂乱性（promiscuity）。参见，例如，N.Budisa、C.Minks、S.Alefelder、W.Wenger、F.M.Dong、L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13:41（1999）。使其中供给细胞特定的天然氨基酸的相关代谢路径被切断的营养缺陷型菌株在含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中生长，同时靶基因的转录受到抑制。在静止生长期开始时，天然氨基酸被耗尽并且为非天然氨基酸类似物所置换。诱导重组蛋白质的表达导致含有非天然类似物的蛋白质的累积。举例而言，使用这种策略，已经将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中并且在UV光谱中呈现可容易被鉴别的两个特征性肩状突起，参见，例如，C.Minks、R.Huber、L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，284:29（2000）；已经将三氟甲硫氨酸用来置换噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以便通过19F NMR研究其与壳寡糖配位体的相互作用，参见，例如，H.Duewel、E.Daub、V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36:3404（1997）；并且已经将三氟亮氨酸并入以代替亮氨酸，从而导致亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。参见，例如，Y.Tang、G.Ghirlanda、W.A.Petka、T.Nakajima、W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew Chem.Int.Ed.Engl.，40:1494（2001）。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白质中以在X射线结晶分析中促进相的溶解。参见，例如，W.A.Hendrickson、J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，9:1665（1990）；J.O.Boles、K.Lewinski、M.Kunkle、J.D.Odom、B.Dunlap、L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1:283（1994）；N.Budisa、B.Steipe、P.Demange、C.Eckerskorn、J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.，230:788（1995）；以及N.Budisa、W.Karnbrock、S.Steinbacher、A.Humm、L.Prade、T.Neuefeind、L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.，270:616（1997）。也已将具有烯烃或炔官能团的甲硫氨酸类似物有效地并入，从而允许通过化学方法对蛋白质作另外修饰。参见，例如，J.C.van Hest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，428:68（1998）；J.C.van Hest、K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.，122:1282（2000）；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56:9487（2000）；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，其是以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于通过氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，一般而言，所述氨酰基-tRNA合成酶需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，其已经在有限的情况下得以实现。举例而言，在大肠埃希氏杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶（PheRS）中用Gly置换Ala294会增大底物结合袋的尺寸，并且导致tRNAPhe被对氯苯丙氨酸（p-Cl-Phe）酰化。参见，M.Ibba、P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33:7107（1994）。具有这种突变体PheRS的大肠埃希氏杆菌菌株容许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸以取代苯丙氨酸。参见，例如，M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364:272（1995）；和N.Sharma、R.Furter、P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467:37（2000）。同样地，显示靠近大肠埃希氏杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合部位的点突变Phe130Ser容许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地得以并入。参见，F.Hamano-Takaku、T.Iwama、S.Saito-Yano、K.Takaku、Y.Monden、M.Kitabatake、D.Soll和S.Nishimura，J.Biol.Chem.，275:40324（2000）。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略是修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区别结构上与同源天然氨基酸相似的氨基酸并且因此不能活化所述氨基酸。这种错误在独立部位被校正，其使来自tRNA的错载的氨基酸脱去酰基以维持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶的校对活性丧失，那么经错误活化的结构类似物可以避开编辑功能并且被并入。最近已经用缬氨酰基-tRNA合成酶（ValRS）证明了这种方法。参见，V.Doring、H.D.Mootz、L.A.Nangle、T.L.Hendrickson、V.de Crecy-Lagard、P.Schimmel和P.Marliere，Science，292:501（2001）。ValRS可用Cys、Thr或氨基丁酸盐（Abu）将tRNAVal错误氨基酰化；这些非同源氨基酸随后通过编辑域而被水解。在大肠埃希氏杆菌染色体发生随机突变后，选择在ValRS的编辑部位具有突变的突变大肠埃希氏杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS不正确地用Cys装载tRNAVal。因为Abu在空间上类似于Cys（Cys的-SH基团经Abu中的-CH3取代），所以当这种突变大肠埃希氏杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示，在天然蛋白质中，约24%的缬氨酸在各个缬氨酸位置为Abu所置换。
固相合成和半合成方法也允许用于含有新颖氨基酸的大量蛋白质的合成。例如，参见以下公开案和其中所引用的参考文献，如下所示：Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232（1961）；Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment,J.Am Chem,88(24):5914-5919（1966）；Kaiser,E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes,Acc Chem Res,22:47-54（1989）；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810（1987）；Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225（1992）；Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3):255-301（1981）；Offord,R.E.Protein engineering by chemical means?Protein Eng.,1(3):151-157（1987）；和Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C.,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed Peptide Ligase forTotal Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243（1994）。
已经将化学修饰用来在活体外将包括辅助因子、自旋标记和寡核苷酸的各种非天然侧链引入蛋白质中。参见，例如，Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403（1987）；Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymaticspecificity,Annu Rev Biochem,54:565-595（1985）；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemicalmutation of enyzme active sites,Science,226(4674):505-511（1984）；Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401（1968）；Polgar,L.et M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154（1966）；和Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combiningsites,Science,242(4881):1038-1040（1988）。
或者，已经将采用经化学修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法用来在活体外将一些生物物理学探针并入所合成的蛋白质中。参见以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62:483-514（1993）；和Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequenceof nascent preprolactin of the54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608（1986）。
以前已经显示，可通过将经化学性氨基酰化的抑制tRNA加入到用含有所要琥珀无义突变的基因程序化的蛋白质合成反应中，而在活体外将非天然氨基酸部位特异性地并入蛋白质中。利用这些方法，所属领域的技术人员可使用特定氨基酸营养缺陷型菌株以关系密切的结构同源物取代许多常见的20种氨基酸（例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸）。参见，例如，Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general methodfor site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244:182-188（1989）；M.W.Nowak等人，Science268:439-42（1995）；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural aminoacid into a polypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014（1989）；N.Budisa等人，FASEB J.13:41-51（1999）；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.，第202卷，301-336（1992）；和Mendel,D.,Cornish,V.W.&Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62（1995）。
举例而言，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA并且以非天然氨基酸将其化学性氨基酰化。可将常规的定点突变用来在蛋白质基因中的所关注的部位处引入终止密码子TAG。参见，例如，Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802（1988）。当使经酰化的抑制tRNA和突变基因在活体外转录/翻译系统中组合时，响应于UAG密码子将非天然氨基酸并入，得到在指定位置处含有那个氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验和用α-羟酸的实验证明，仅在由UAG密码子指定的位置处并入所要的氨基酸，并且这种氨基酸不在蛋白质中的任何其它部位并入。参见，例如，Noren等人，同上；Kobayashi等人，（2003）Nature Structural Biology10(6):425-432；和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins,Science,255(5041):197-200（1992）。
可以通过包括（但不限于）化学氨基酰化或酶促氨基酰化的任何方法或技术以所要的氨基酸使tRNA氨基酰化。
氨基酰化可以通过氨酰基tRNA合成酶或通过包括（但不限于）核糖酶的其它酶促分子来完成。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事（Cech,1987,Science,236:1532-1539；McCorkle等人，1987,Concepts Biochem.64:221-226）证明了可充当催化剂的天然存在的RNA（核糖酶）的存在。然而，尽管仅已显示这些天然RNA催化剂可对用于裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但是核糖酶的人为进化的最近发展已经将催化作用的功用（repertoire）扩展到各种化学反应。研究已经鉴别了能在其自身(2')3'-端上催化氨酰基-RNA键的RNA分子（Illangakekare等人，1995Science267:643-647）和可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子（Lohse等人，1996，Nature381:442-444）。
以引用的方式并入本文中的美国专利申请公开案2003/0228593描述构建核糖酶的方法和其在用天然编码的和非天然编码的氨基酸使tRNA发生氨基酰化中的用途。包括（但不限于）核糖酶的可使tRNA氨基酰化的酶促分子的底物固定化形式可以使经氨基酰化的产物的有效亲和纯化能够实现。合适的底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。用于氨基酰化的核糖酶的底物固定化形式的产生和用途是描述在Chemistry andBiology2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，所述参考文献是以引用的方式并入本文中。
化学性氨基酰化方法包括（但不限于）由Hecht和同事（Hecht,S.M.Acc.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G.;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988,27,7254;Hecht,S.M.;Alford,B.L.;Kuroda,Y.;Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517）和由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其他人（Cornish,V.W.;Mendel,D.;Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C.;Schultz,P.G.Science1989,244,182;Bain,J.D.;Glabe,C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等人，Nature1992,356,537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等人，Science,1995,268,439；Saks,M.E.等人，J.Biol.Chem.1996,271,23169；Hohsaka,T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999,121,34）提出的避免在氨基酰化中使用合成酶的那些方法，所述参考文献是以引用的方式并入本文中。所述方法或其它化学性氨基酰化方法可用来使tRNA分子发生氨基酰化。
用于产生催化性RNA的方法可以涉及产生随机化核糖酶序列的独立集合、针对所述集合执行定向进化、为所要的氨基酰化活性筛选所述集合和选择显示所要的氨基酰化活性的那些核糖酶的序列。
核糖酶可包含有利于酰化活性的基序和/或区域，诸如，GGU基序和U富集区域。举例而言，已经报道U富集区域可有利于氨基酸底物的识别，并且GGU基序可与tRNA的3'端形成碱基对。在组合时，GGU基序和U富集区域同时有利于氨基酸和tRNA的同时识别，并且进而助于tRNA的3'端的氨基酰化。
核糖酶可通过使用与tRNAAsn CCCG结合的部分随机化的r24mini进行活体外选择，接着通过活性克隆中存在的一致序列的系统工程化而产生。由这种方法获得的示范性核糖酶被称为“Fx3核糖酶”并且描述在美国公开申请案第2003/0228593号中，所述申请案的内容是以引用的方式并入本文中，所述核糖酶充当用于合成装载同源非天然氨基酸的各种氨酰基-tRNA的多用途催化剂。
底物上的固定化可用来使经氨基酰化的tRNA的有效亲和纯化能够实现。合适的底物的实例包括（但不限于）琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。核糖酶可通过利用RNA的化学结构而固定于树脂上，诸如RNA的核糖上的3'-顺式二醇可经高碘酸盐氧化而产生相应的二醛以助于RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原性胺化作用使树脂与核糖酶之间的相互作用成为不可逆的键。氨酰基-tRNA的合成可通过这种柱上氨基酰化技术而大大促进。Kourouklis等人（Methods2005；36:239-4）描述一种基于柱的氨基酰化系统。
经氨基酰化的tRNA的分离可以各种方式实现。一种合适的方法是利用缓冲液（诸如，具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl（pH7.0）、10mM EDTA的缓冲液或仅为EDTA缓冲水（pH7.0））从柱子洗脱经氨基酰化的tRNA。
可将经氨基酰化的tRNA加入到翻译反应中以便并入氨基酸，在由翻译反应制得的多肽中的选定位置上tRNA被所述氨基酸氨基酰化。可以使用本发明的经氨基酰化的tRNA的翻译系统的实例包括（但不限于）细胞溶胞产物。细胞溶胞产物提供为从输入mRNA进行多肽的活体外翻译所必需的反应组分。所述反应组分的实例包括（但不限于）核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延伸因子以及与翻译相关的其它因子。另外，翻译系统可以是批式翻译或分区翻译（compartmentalizedtranslation）。批式翻译系统在单一隔室中组合反应组分，而分区翻译系统使翻译反应组分与可抑制翻译功效的反应产物分开。所述翻译系统是可购得的。
此外，可以使用偶合转录/翻译系统。偶合转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，此mRNA又被反应组分翻译。可购得的偶合转录/翻译系统的一个实例是快速翻译系统（Rapid Translation System，RTS，Roche Inc.）。所述系统包括含有用于提供诸如核糖体和翻译因子的翻译组分的大肠杆菌溶胞产物的混合物。另外，包括RNA聚合酶以用于将输入DNA转录成用于翻译的mRNA模板。RTS可以通过置于反应隔室（包括供应/消耗隔室和转录/翻译隔室）之间的膜使反应组分隔开而采用分区翻译。
tRNA的氨基酰化可以通过包括（但不限于）移转酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白质等的其它试剂来执行。
Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4):759-69中描述一种将蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽化学性连接（表达蛋白连接）的方法。
也已使用显微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见，例如，M.W.Nowak、P.C.Kearney、J.R.Sampson、M.E.Saks、C.G.Labarca、S.K.Silverman、W.G.Zhong、J.Thorson、J.N.Abelson、N.Davidson、P.G.Schultz、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268:439（1995）；和D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4:645（2000）。用以下活体外制得的两种RNA物质共同注射爪蟾卵母细胞（Xenopus oocyte）：编码在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的靶蛋白质的mRNA，和经所要的非天然氨基酸氨基酰化的琥珀抑制tRNA。接着，卵母细胞的翻译机器在由UAG所指定的位置处将非天然氨基酸插入。这种方法已使得一般不符合活体外表达系统的整合膜蛋白的活体内结构-功能研究得以进行。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，参见，例如，G.Turcatti、K.Nemeth、M.D.Edgerton、U.Meseth、F.Talabot、M.Peitsch、J.Knowles、H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，271:19991（1996）；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中的表面暴露残基，参见，例如，J.P.Gallivan、H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4:739（1997）；使用笼形酪氨酸类似物以实时监测离子通道中的构象改变，参见，例如，J.C.Miller、S.K.Silverman、P.M.England、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20:619（1998）；和使用α羟基氨基酸以改变离子通道构架用于探测其门控机制。参见，例如，P.M.England、Y.Zhang、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，96:89（1999）；和T.Lu、A.Y.Ting、J.Mainland、L.Y.Jan、P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4:239（2001）。
在活体内将非天然氨基酸直接并入蛋白质中的能力提供包括（但不限于）以下优点的多种优点：突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性，和这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断用途中的使用。使具有各种尺寸、酸性、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸包括到蛋白质中的能力可大大地扩大我们合理地和系统地操纵蛋白质的结构的能力，以探测蛋白质功能并且产生具有新颖性质的新型蛋白质或生物体。
在部位特异性地并入对氟苯丙氨酸的一次尝试中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于对氟苯丙氨酸抗性、苯丙氨酸营养缺陷型大肠埃希氏杆菌菌株中。参见，例如，R.Furter,Protein Sci.,7:419（1998）。
也有可能使用无细胞（活体外）翻译系统获得本发明的GH（例如，hGH）多聚核苷酸的表达。翻译系统可以是细胞系统或无细胞系统，并且可以是原核系统或真核系统。细胞翻译系统包括（但不限于）诸如透性化细胞的全细胞制剂或细胞培养物，其中可将所要的核酸序列转录成mRNA并且将mRNA翻译。无细胞翻译系统是可购得的并且许多不同的类型和系统是熟知的。无细胞系统的实例包括（但不限于）诸如大肠埃希氏杆菌溶胞产物的原核生物溶胞产物，和诸如小麦胚芽提取物、昆虫细胞溶胞产物、兔网状细胞溶胞产物、兔卵母细胞溶胞产物和人类细胞溶胞产物的真核生物溶胞产物。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或经别的方式修饰时，真核生物提取物或溶胞产物可为优选的，这是因为许多所述修饰仅在真核系统中为可能的。这些提取物和溶胞产物中的一些是可购得的（Promega;Madison,Wis.;Stratagene;La Jolla,Calif.;Amersham;Arlington Heights,I11.;GIBCO/BRL;Grand Island,N.Y.）。诸如含有微粒体膜的犬胰腺提取物的膜提取物也是可用的，其可用于翻译分泌蛋白。在可包括mRNA作为模板（活体外翻译）或者DNA作为模板（组合的活体外转录和翻译）的这些系统中，活体外合成是通过核糖体来引导。已经对开发无细胞蛋白质表达系统作出了相当多的努力。参见，例如，Kim,D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering,74:309-316（2001）；Kim,D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters,22,1537-1542，（2000）；Kim,D.M.和J.R.Swartz，BiotechnologyProgress,16,385-390，（2000）；Kim,D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology andBioengineering,66,180-188，（1999）；和Patnaik,R.和J.R.Swartz，Biotechniques24,862-868，（1998）；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353；WO90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可以应用于表达包含非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。参见，例如，R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94:12297-12302（1997）；A.Frankel等人，Chemistry&Biology10:1043-1050（2003）。在这种方法中，与嘌呤霉素相连接的mRNA模板在核糖体上被翻译成肽。如果已经修饰一个或一个以上的tRNA分子，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已经读出最后的mRNA密码子后，嘌呤霉素俘获肽的C端。如果在活体外检定中发现所得的mRNA-肽结合物具有引人关注的性质，那么其特性可容易地从mRNA序列显示出。因此，所属领域的技术人员可以筛选包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽的库以鉴别具有所要性质的多肽。近期已经报道，用经纯化的组分进行活体外核糖体翻译使得经非天然编码的氨基酸取代的肽可合成。参见，例如，A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100:6353（2003）。
也可以使用重构翻译系统。经纯化的翻译因子的混合物以及经诸如起始因子-1（IF-1）、IF-2、IF-3（α或β）、延伸因子T（EF-Tu）或终止因子的经纯化的翻译因子补充的溶胞产物或溶胞产物的组合也已经成功地用来将mRNA翻译为蛋白质。无细胞系统也可以是偶合转录/翻译系统，其中如Current Protocols in Molecular Biology（F.M.Ausubel等编者，Wiley Interscience，1993）中所述将DNA引入系统中、转录成mRNA并且翻译mRNA，所述参考文献由此以引用的方式特别地并入。在真核转录系统中转录的RNA可以呈异核RNA（hnRNA）或5'-端帽（7-甲基鸟嘌呤核苷）和3'-端多聚A有尾成熟mRNA形式，此在某些翻译系统中可为有利条件。举例而言，加帽mRNA是以高效率在网状细胞溶胞产物系统中被翻译。
IX.与GH（例如，hGH）多肽偶合的大分子聚合物
本文中所述的对非天然氨基酸多肽的各种修饰可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现。这些修饰包括将包括（但不限于）以下物质的另一官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光致交联剂；放射性核素；细胞毒素化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅助因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸；DNA；RNA；反义多聚核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；共价地或非共价地与其它分子相互作用的基团；光笼锁部分）；光化辐射可激发部分；光敏异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学裂解的基团；可光致裂解的基团；伸长的侧链；经碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；经同位素标记的部分；生物物理学探针；发磷光的基团；化学发光基团；电子密集基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记；小分子；量子点；纳米传导物；放射性核苷酸；放射性传导物；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所要的化合物或物质。作为本文中所述组合物、方法、技术和策略的一个说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物添加至非天然氨基酸多肽中，条件是针对其所述的组合物、方法、技术和策略也适用于（在有必要时，加以适当修饰且对于其，所属领域的技术人员能利用本文中的揭示内容来进行）添加其它官能性物质，其包括（但不限于）以上所列出的官能性物质。
可将多种大分子聚合物和其它分子连接到本发明的GH（例如，hGH）多肽以调节GH（例如，hGH）多肽的生物学性质，且/或为GH（例如，hGH）分子提供新的生物学性质。这些大分子聚合物可通过天然编码的氨基酸、非天然编码的氨基酸、或天然或非天然氨基酸的任何官能性取代基或添加至天然或非天然氨基酸的任何取代基或官能团而与GH（例如，hGH）多肽相连接。所述聚合物的分子量可处于宽广范围内，包括（但不限于）处于约100Da与约100,000Da或以上之间。所述聚合物的分子量可为处于约100Da与约100,000Da之间，包括（但不限于）100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，所述聚合物的分子量可为处于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，所述聚合物的分子量可为处于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，所述聚合物的分子量可为处于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，所述聚合物的分子量可为处于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，所述聚合物的分子量可为处于约10,000Da与40,000Da之间。
本发明提供聚合物:蛋白质结合物的大体上均质的制剂。如本文中所用的“大体上均质的”意谓经观察，聚合物:蛋白质结合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质结合物具有生物学活性且本文中所提供的本发明“大体上均质的”PEG化GH（例如，hGH）多肽制剂是为足够均质以展现均质制剂的优点的那些制剂，例如在临床应用中易于预测批量间的药物代谢动力学性质。
所属领域的技术人员也可以选择制备聚合物:蛋白质结合物分子的混合物，并且本文中所提供的优点为，所属领域的技术人员可以选择单聚合物:蛋白质结合物包括于混合物中的比例。因此，若有必要时，所属领域的技术人员可以制备具有所连接的各种数量的聚合物部分（即，二-、三-、四-等）的各种蛋白质的混合物，并且将所述结合物与使用本发明的方法制备的单聚合物:蛋白质结合物组合，并且得到具有预定比例的单聚合物:蛋白质结合物的混合物。
所选择的聚合物可为水溶性的，以便使与其连接的蛋白质不会在水性环境（诸如生理环境）中发生沉淀。此聚合物可为分枝的或未分枝的。对于最终产物制剂的治疗用途而言，此聚合物将为医药学上可接受的。
聚合物的实例包括（但不限于）聚烷基醚和其烷氧基封端类似物（例如，聚氧乙烯乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其甲氧基或乙氧基封端类似物，尤其为聚氧乙烯乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG）；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉；聚烷基噁唑啉和聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺（例如聚羟丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物）；聚羟烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如脱乙酰几丁质、丁二酰脱乙酰几丁质、羧甲基几丁质、羧甲基脱乙酰几丁质；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天门冬氨酸、聚天冬酰胺；顺丁烯二酸酐共聚物，诸如：苯乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚顺丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和前述聚合物的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，此就如同其在反应混合物中的浓度将变化一样。一般而言，最佳比率（就存在最小过量的未反应的蛋白质或聚合物的反应的效率而言）可由所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数目所决定。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可以与蛋白质连接的聚合物分子的数量就越少。同样地，在优化这些参数时，应考虑聚合物的分枝。通常，分子量越高（或分枝越多），聚合物:蛋白质比率就越高。
如本文中所用，并且当涵盖PEG:GH（例如hGH）多肽结合物时，术语“治疗有效量”指的是为患者提供所要益处的量。此量将根据个体不同而变化，并且将视若干因素（包括患者的总体身体状况和待治疗病症的潜在病因）而定。用于治疗的GH（例如，hGH）多肽的量提供可接受的变化率并且将所要的反应维持在有益水平。本发明组合物的治疗有效量可由所属领域的技术人员使用公开可用的材料和程序来容易地确定。
水溶性聚合物可为任何结构形式，包括（但不限于）直链、分叉或分枝。通常，水溶性聚合物为聚(亚烃基二醇)，诸如聚(乙二醇)（PEG），但也可采用其它水溶性聚合物。例如，将PEG用于描述本发明的某些实施例。
PEG是为人熟知的水溶性聚合物，其为市售的或可根据所属领域的技术人员已知的方法（Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138至161页），通过乙二醇的开环聚合而制备。术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，不考虑PEG的大小或末端的修饰，并且可通过下式表示为与GH（例如，hGH）多肽连接：
XO-(CH2CH2Ｏ)n-CH2CHZ-Y，
其中n为2至10,000且X为H或包括（但不限于）C1-4烷基、保护基或末端官能团的末端修饰。
在一些情况下，本发明中所用的PEG在一末端上以羟基或甲氧基为终止，即X为H或CH3（“甲氧基PEG”）。或者，PEG可以反应性基团为终止，由此形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括那些常用于与20种常见氨基酸中存在的官能团反应的反应性基团（包括（但不限于）顺丁烯二酰亚胺基团、经活化的碳酸酯（包括（但不限于）对硝基苯基酯）、经活化的酯（包括（但不限于）N-羟基丁二酰亚胺、对硝基苯基酯）和醛）以及对于20种常见氨基酸为惰性但与存在于非天然编码的氨基酸中的互补官能团起特异性反应的官能团（包括（但不限于）叠氮基、炔基）。应注意，在上式中以Y表示的PEG的另一端将经由天然存在的氨基酸或非天然编码的氨基酸直接地或间接地连接于GH（例如，hGH）多肽。举例而言，Y可为连接到多肽的胺基（包括（但不限于）赖氨酸的ε胺或N-末端）的酰胺键、氨基甲酸酯键或脲键。或者，Y可为连接到硫醇基（包括（但不限于）半胱氨酸的硫醇基）的顺丁烯二酰亚胺键。或者，Y可为连接到通常经由20种常见氨基酸不易接近的残基的键。举例而言，可使PEG上的叠氮基与GH（例如，hGH）多肽上的炔基反应，以形成胡氏根[3+2]环加成产物。或者，可使PEG上的炔基与存在于非天然编码的氨基酸中的叠氮基反应，以形成类似产物。在一些实施例中，可在适宜时，使强亲核物质（包括（但不限于）肼、酰肼、羟胺、氨基脲）与存在于非天然编码的氨基酸中的醛基或酮基反应，以形成腙、肟或缩氨基脲，其在一些情形下可通过用适当还原剂处理而进一步还原。或者，强亲核物质可通过非天然编码的氨基酸并入GH（例如，hGH）多肽中，并且用于优先地与存在于水溶性聚合物中的酮基或醛基反应。
PEG的任何分子质量可按实际需要来使用，其根据需要包括（但不限于）约100道尔顿（Da）至100,000Da或以上（有时包括（但不限于）0.1至50kDa或10至40kDa）。PEG的分子量可处于宽广范围内，其包括（但不限于）处于约100Da与约100,000Da或以上之间。PEG的分子量可为处于约100Da与约100,000Da之间，包括（但不限于）100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约10,000Da与40,000Da之间。也可使用支链PEG，其包括（但不限于）其中各链具有1至100kDa范围内（包括（但不限于）1至50kDa或5至20kDa）分子量的PEG分子。支链PEG的各链的分子量可为（包括（但不限于））处于约1,000Da与约100,000Da或以上之间。支链PEG的各链的分子量可为处于约1,000Da与约100,000Da之间，包括（但不限于）100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量为处于约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量为处于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量为处于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量为处于约5,000Da与20,000Da之间。在（包括（但不限于））Shearwater Polymers,Inc.catalog,Nektar Therapeutics catalog（其以引用的方式并入本文中）中描述宽广范围的PEG分子。
一般而言，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。举例而言，具有适于与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮基部分的PEG衍生物可用于使PEG连接于如本文中所述的非天然编码的氨基酸。如果非天然编码的氨基酸包含叠氮部分，那么PEG通常将含有炔基部分以形成[3+2]环加成产物，或为含有膦基的活化PEG物质（即，酯、碳酸酯）以形成酰胺键。或者，如果非天然编码的氨基酸包含炔部分，那么PEG通常将含有叠氮部分以形成[3+2]胡氏根环加成产物。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，那么PEG通常将包含有效亲核物质（包括（但不限于）酰肼、肼、羟胺、氨基脲官能团），以便分别形成相应腙键、肟键和缩氨基脲键。在其它替代实施例中，可使用上述反应性基团的反向定向基团，即可使非天然编码的氨基酸中的叠氮基部分与含有炔基的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的GH（例如，hGH）多肽变异体含有可与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的化学官能团反应的化学官能团。
本发明在一些实施例中提供含有叠氮基的聚合物衍生物和含有乙炔基的聚合物衍生物，其包含具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。此水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解，多种水溶性聚合物（包括（但不限于）聚乙二醇和其它相关聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)）也适用于本发明的实践，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用预期涵盖且包括所有这些分子。术语PEG包括（但不限于）任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、分枝PEG、侧接PEG（即具有一个或一个以上侧接于聚合物主链的官能团的PEG或相关聚合物）或其中具有可降解的键的PEG。
PEG通常为透明、无色、无嗅、可溶于水、对热稳定的、对许多化学试剂呈惰性、不会水解或变质且通常为无毒的。聚(乙二醇)被视为是生物相容的，也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不会造成损害。更明确地说，PEG是大体上非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫响应。当在体内连接于具有一些理想功能的分子（诸如生物活性剂）时，PEG倾向于掩蔽此试剂且可减少或消除任何免疫响应，以便使生物体可容许此试剂的存在。PEG结合物不会倾向于产生实质的免疫反应或引起凝结或其它不良效应。具有式-CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2-的PEG（其中n为约3至约4000，通常为约20至约2000）适用于本发明。具有约800Da至约100,000Da分子量的PEG在本发明的一些实施例中作为聚合物主链尤其有用。PEG的分子量可处于宽广范围内，其包括（但不限于）处于约100Da与约100,000Da或以上之间。PEG的分子量可为处于约100Da与约100,000Da之间，包括（但不限于）100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为处于约10,000Da与40,000Da之间。
聚合物主链可为直链的或分枝的。分枝聚合物主链在所属领域中一般为已知的。通常，分枝聚合物具有一个中心分枝核心部分和复数个连接到此中心分枝核心的直链聚合物链。PEG一般是以分枝形式使用，此形式可通过氧化乙烯对多种多元醇（诸如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨醇）的加成而制备。中心分枝部分也可由若干种氨基酸（诸如赖氨酸）衍生得到。分枝聚(乙二醇)可以由通式R(-PEG-OH)m表示，其中R是衍生自核心部分（诸如甘油、甘油低聚物或季戊四醇），并且m表示臂数。诸如美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO96/21469；和WO93/21259（其各者的全文以引用的方式并入本文中）中所述的那些PEG分子的多臂PEG分子也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为由PEG(--YCHZ2)n表示的分叉PEG形式，其中Y为连接基团，并且Z是通过一连串的具有指定长度的原子与CH连接的活化末端基团。
另一种分枝形式，即侧接PEG，沿着PEG主链而非PEG链末端上具有诸如羧基的反应性基团。
除了这些PEG形式以外，聚合物也可经制备而在主链中具有弱的或可降解的键。举例而言，PEG可经制备而在聚合物主链中具有易于水解的酯键。如下所示，此水解作用会导致聚合物裂解成具有较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域的技术人员了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，其包括（但不限于）本文中揭示的那些形式。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明。合适的聚合物的实例包括（但不限于）诸如聚(丙二醇)（“PPG”）的其它聚(亚烃基二醇)，其共聚物（包括（但不限于）乙二醇和丙二醇的共聚物）、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链中各链的分子量可变化，但其通常在约800Da至约100,000Da的范围内，往往为约6,000Da至约80,000Da的范围内。聚合物主链中各链的分子量可为处于约100Da与约100,000Da之间，其包括（但不限于）100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物主链中各链的分子量为处于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链中各链的分子量为处于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链中各链的分子量为处于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链中各链的分子量为处于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链中各链的分子量为处于约10,000Da与40,000Da之间。
所属领域的技术人员将认识到，大体上水溶性主链的前述列举决非详尽无遗，而仅仅为说明性的，并且将具有上述特性的所有聚合材料均视为适用于本发明。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能性”的，意谓聚合物主链具有至少两个，且可能多达约300个经官能团官能化或活化的末端。多官能聚合物衍生物包括（但不限于）具有两个末端的直链聚合物，其中各末端键结至可能为相同或不同的官能团。
在一些实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-N＝N＝N，
其中：
N=N=N为叠氮基部分；
B为连接部分，其可存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可存在或不存在，且其可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括（但不限于）含有至多18个且可能含有1至10个碳原子的多重官能化烷基。烷基链中可包括杂原子，诸如氮、氧或硫。烷基链也可在杂原子处分枝。连接部分A和B的其它实例包括（但不限于）含有至多10个且可能含有5至6个碳原子的多重官能化芳基。此芳基可经又一个碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。合适连接基团的其它实例包括那些在美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596（其各以引用的方式并入本文中）中所述的连接基团。所属领域的技术人员将认识到，连接部分的前述列举绝非详尽无遗的，而仅为说明性的，且将具有上述特性的所有聚合材料均视为适用于本发明。
适于用作X的官能团的实例包括（但不限于）羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯（诸如N-羟基丁二酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯）、活性碳酸酯（诸如N-羟基丁二酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯）、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物官能团。如所属领域的技术人员所了解，所选择的X部分应与叠氮基相容，以免与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物为同双官能性（homobifunctional），此意谓第二官能团（即X）也为叠氮基部分；或为杂双官能性，此意谓第二官能团为不同官能团。
术语“经保护”指的是防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分的存在。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例而言，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基（t-Boc）和9-芴基甲氧羰基（Fmoc）的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸（诸如丁酸或丙酸）或羟基，那么保护基可为苄基或烷基（诸如甲基、乙基或叔丁基）。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明。
文献中末端官能团的特定实例包括（但不限于）N-丁二酰亚胺基碳酸酯（参看例如美国专利第5,281,698号、第5,468,478号）、胺（参看例如Buckmann等人Makromol.Chem.182:1379(1981)，Zalipsky等人Eur.Polym.J.19:1177(1983)）、酰肼（参看例如Andresz等人Makromol.Chem.179:301(1978)）、丁二酰亚胺基丙酸酯和丁二酰亚胺基丁酸酯（参看例如Olson等人于Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications,第170至181页,Harris&Zalipsky Eds.,ACS,Washington,D.C.,1997；也参看美国专利第5,672,662号）、丁二酰亚胺基丁二酸酯（参看例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人Makromol.Chem.180:1381(1979)）、丁二酰亚胺酯（参看例如美国专利第4,670,417号）、苯并三唑碳酸酯（参看例如美国专利第5,650,234号）、缩水甘油醚（参看例如Pitha等人Eur.J Biochem.94:11(1979),Elling et al,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991)）、氧羰基咪唑（参看例如Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983)、Tondelli等人J.Controlled Release1:251(1985)）、对硝基苯基碳酸酯（参看例如Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；和Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991)）、醛（参看例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)、美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号）、顺丁烯二酰亚胺（参看例如Goodson等人Biotechnology(NY)8:343(1990),Romani et al.in Chemistry of Peptides and Proteins2:29(1984)和Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992)）、邻吡啶基二硫化物（参看例如Woghiren等人Bioconj.Chem.4:314(1993)）、丙烯醇（参看例如Sawhney等人Macromolecules,26:581(1993)）、乙烯砜（参看例如美国专利第5,900,461号）。所有上述文献和专利均以引用的方式并入本文中。
在本发明的特定实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N，
其中：
X为如上所述的官能团；且
n为约20至约4000。
在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)n-W-N＝N＝N，
其中：
W为包含1至10个碳原子的脂族或芳族连接子部分；
n为约20至约4000；且
X为如上所述的官能团，m为1与10之间。
本发明的含叠氮基的PEG衍生物可通过所属领域中已知的和/或本文中所揭示的多种方法制备。在一种以下所示的方法中，使具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主链、具有键结至第一官能团的第一末端和键结至合适离去基团的第二末端的聚合物主链与叠氮基阴离子（其可与若干合适反离子（包括钠离子、钾离子、叔丁基铵离子等）中的任何一离子配对）反应。此离去基团经受亲核置换且被叠氮基部分置换，得到所要含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如其所示，用于本发明的合适聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适离去基团。合适官能团的实例包括（但不限于）羟基、经保护羟基、乙缩醛、烯基、胺、氨基氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、顺丁烯二酰亚胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮官能团。合适离去基团的实例包括（但不限于）氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯和甲苯磺酸酯基团。
在本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的另一种制备方法中，使具有叠氮基官能团的连接剂与具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中此连接剂具有官能团，其将选择性地与PEG聚合物上的化学官能团反应，以形成含叠氮基的聚合物衍生物产物，其中叠氮基通过连接基团与聚合物主链隔开。
下文显示示范性反应流程：
X-PEG-M+N-连接子-N＝N=N→PG-X-PEG-连接子－N＝N＝N，
其中：
PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团，诸如烷氧基或如上所述的官能团；且
M为不与叠氮基官能团反应但将有效地且选择性地与N官能团反应的官能团。
合适官能团的实例包括（但不限于）：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨基氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核物质，那么M为离去基团。
粗产物的纯化可通过已知方法完成，这些方法包括（但不限于）产物沉淀，继而在必要时层析。
在下文中显示在PEG二胺的情况下的更特别的实例，其中这些胺中的一种受保护基团部分（诸如叔丁基-Boc）保护，且使所得单保护PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N=N=N。
在此情况下，可使用多种活化剂（诸如亚硫酰二氯或碳化二亚胺试剂以及N-羟基丁二酰亚胺或N-羟基苯并三唑）将胺基偶合至羧酸基，以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的连接子部分之间形成胺键。当成功形成胺键后，所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基衍生物可直接用于修饰生物活性分子，或其可经进一步精制以加入其它有用官能团。举例而言，N-叔丁氧羰基可通过用强酸处理而水解，以生成ω-胺基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作合成把（synthetic handle）以加入其它有用官能团（诸如顺丁烯二酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等），用以形成有价值的杂双官能性试剂。
杂双官能性衍生物在需要其将不同分子连接至聚合物的各末端时特别适用。举例而言，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许具有活化亲电子基团的分子（诸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等）连接至PEG的一个末端，且允许具有乙炔基的分子连接至PEG的另一个末端。
在本发明的另一实施例中，聚合物具有以下结构：
X-A-POLY-B-C≡C-R，
其中：
R可为H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可存在或不存在，且其可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括（但不限于）含有至多18个且可能含有1至10个碳原子的多重官能化烷基。烷基链中可包括杂原子，诸如氮、氧或硫。烷基链也可在杂原子处分枝。连接部分A和B的其它实例包括（但不限于）含有至多10个且可能含有5至6个碳原子的多重官能化芳基。此芳基可经又一个碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。合适连接基团的其它实例包括那些在美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596（其各以引用的方式并入本文中）中所述的连接基团。所属领域的技术人员将认识到，连接部分的前述列举绝非详尽无遗的，而仅预期为说明性的，且将具有上述特性的多种聚合材料均视为适用于本发明。
适于用作X的官能团的实例包括（但不限于）羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯（诸如N-羟基丁二酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯）、活性碳酸酯（诸如N-羟基丁二酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯）、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和乙炔基。如我们所了解，所选择的X部分应与叠氮基相容，以免与叠氮基发生反应。含乙炔基的聚合物衍生物为同双官能性（homobifunctional），意谓第二官能团（即X）也为乙炔基部分；或为杂双官能性，意谓第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH，
其中：
X为如上所述的官能团；
n为约20至约4000；且
m为1与10之间。
在下文中显示各杂双官能性PEG聚合物的特定实例。
本发明的含乙炔基的PEG衍生物可使用所属领域的技术人员已知的和/或本文中所揭示的方法来制备。在一种方法中，使具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主链、具有键结至第一官能团的第一末端和键结至合适亲核基团的第二末端的聚合物主链与具有乙炔基官能团和离去基团（其适于与PEG上的亲核基团反应）的化合物反应。当具有亲核部分的PEG聚合物和具有离去基团的分子组合时，此离去基团经受亲核置换且被亲核部分置换，得到所要的含乙炔基聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEC-Nu-A-C≡CR'
如其所示，用于此反应的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔基官能团反应的官能团。
Nu的实例包括（但不限于）胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯、酰肼、氨基氧基，其主要经由SN2型机制进行反应。Nu基团的其它实例包括那些将主要经由亲核加成反应进行反应的官能团。L基团的实例包括氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯和甲苯磺酸酯基团以及其它预期经受亲核置换的基团，如酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯和其它预期经受亲核物质加成的亲电子基团。
在本发明的另一实施例中，A为1至10个碳原子的脂族连接子或6至14个碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适离去基团。
在本发明的含乙炔基聚合物衍生物的另一种制备方法中，使具有约800Da至约100,000Da平均分子量、在一个末端上具有经保护官能团或封端剂且在另一末端上具有合适离去基团的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
在下文中显示示范性反应流程：
X-PEG-L+-C≡CR'→X-PEG-C≡CR'
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为封端基团，诸如烷氧基或上文所述的官能团；且
R'为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，或经取代烷基、经取代烷氧基、经取代芳基或经取代芳氧基。
在上述实例中，离去基团L应具有足够反应性，以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时经受SN2型置换。完成离去基团经乙炔阴离子SN2置换所需的反应条件对于所属领域的技术人员而言为已知的。
粗产物的纯化通常可通过所属领域中已知的方法来完成，这些方法包括（但不限于）产物沉淀，继而在必要时层析。
可将水溶性聚合物连接至本发明的GH（例如，hGH）多肽。水溶性聚合物可经由并入GH（例如，hGH）多肽中的非天然编码的氨基酸，或非天然编码的或天然编码的氨基酸的任何官能团或取代基，或加入到非天然编码的或天然编码的氨基酸的任何官能团或取代基而连接。或者，水溶性聚合物是经由天然存在的氨基酸（包括（但不限于）半胱氨酸、赖氨酸或N-末端残基的胺基）连接至其中并入非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。在一些情况下，本发明的GH（例如，hGH）多肽包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上的非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码的氨基酸连接于水溶性聚合物（包括（但不限于）PEG和/或低聚糖）。在一些情况下，本发明的GH（例如，hGH）多肽另外包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上连接至水溶性聚合物的天然编码的氨基酸。在一些情况下，本发明的GH（例如，hGH）多肽包含一个或一个以上连接至水溶性聚合物的非天然编码的氨基酸和一个或一个以上连接至水溶性聚合物的天然存在的氨基酸。在一些实施例种，用于本发明的水溶性聚合物相对于非结合形式而言可增强GH（例如，hGH）多肽的血清半衰期。
可调节连接至本发明的GH（例如，hGH）多肽的水溶性聚合物的数量（即PEG化或糖基化的程度），以提供改变的（包括（但不限于）增加的或减少的）药理学特征、药物代谢动力学特征或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，GH（例如，hGH）多肽的半衰期相对于未经修饰多肽而言增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核性基团（即酰肼、肼、羟胺或氨基脲）的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，包括含羰基的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽经含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分（其直接连接至PEG主链）的PEG衍生物修饰。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000（即，平均分子量为5至40kDa）。
在一些实施例中，含肼或含酰肼部分的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000，且X视需要为可存在或不存在的羰基（C=O）。
在一些实施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000。
在本发明的另一实施例中，包括含羰基氨基酸的GH（例如，hGH）多肽经含有末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分（其经由酰胺键连接至PEG主链）的PEG衍生物修饰。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH２O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000（即，平均分子量为5至40kDa）。
在一些实施例中，含肼或含酰肼部分的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH20)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10，n为100至1,000，且X视需要为可存在或不存在的羰基（C=O）。
在一些实施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000。
在本发明的另一实施例中，包括含羰基氨基酸的GH（例如，hGH）多肽经含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰，其中此分枝PEG的各链具有10至40kDa范围内且可能为5至20kDa范围内的分子量。
在本发明的另一实施例中，包含非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽经具有分枝结构的PEG衍生物修饰。举例而言，在一些实施例中，肼末端或酰肼末端PEG衍生物将具有下列结构：
[RO-(CH2CH2Ｏ)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000，且X视需要为可存在或不存在的羰基（C=O）。
在一些实施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CN2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），X视需要为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2至10且n为100至1,000。
在一些实施例中，含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NN2，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），X视需要为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2至10且n为100至1,000。
水溶性聚合物连接至hGH多肽的程度和部位可调节hGH多肽至hGH多肽受体在部位1上的结合。在一些实施例中，本发明提供通过肟键与至少一个PEG相连接的GH（例如hGH），其中此反应中用于形成肟键的PEG为直链、30kDa的单甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐，如图19中所示。图20呈现在本发明特定实施例的合成中适用的直链、30kDa的单甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐的合成的说明性实例。
仅举例而言而不作为对于与本文中所述组合物、方法、技术和策略一同使用的PEG试剂类型或种类的限制，图21呈现含羟胺PEG试剂的其它说明性实例（这些PEG试剂可与含羰基的非天然氨基酸多肽反应以形成连接至PEG基团的含肟非天然氨基酸多肽）以及含羰基PEG试剂的实例（这些PEG试剂可与含肟非天然氨基酸多肽或含羟胺非天然氨基酸多肽反应以形成连接至PEG基团的新的含肟非天然氨基酸多肽）。图22呈现用于形成含羟胺PEG试剂、或含羟胺PEG试剂的经保护形式、或含羟胺PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的四个说明性实例。图23呈现用于形成酰胺连接的含羟胺PEG试剂、或酰胺连接的含羟胺PEG试剂的经保护形式、或酰胺连接的含羟胺PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的一个说明性实例。图24和图25呈现用于形成氨基甲酸酯连接的含羟胺PEG试剂、或氨基甲酸酯连接的含羟胺PEG试剂的经保护形式、或氨基甲酸酯连接的含羟胺PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的一个说明性实例。图26呈现用于形成简单的含羟胺PEG试剂、或简单的含羟胺PEG试剂的经保护形式、或简单的含羟胺PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的一个说明性实例。此外，图27呈现具有连接PEG基团的多个分枝的含羟胺试剂的说明性实例，且进一步显示一种如此的含羟胺多PEG分枝试剂与含羰基非天然氨基酸多肽反应以形成具有连接多PEG分枝基团的含肟非天然氨基酸多肽的反应。
适用于本发明的水溶性聚合物（例如PEG）的其它实例（例如经修饰能够形成肟键的PEG）可见于美国专利申请案第60/638,418号；第60/638,527号和于2004年12月22日申请的题为"Compositions containing,methods involving,and uses of non-naturalamino acids and polypeptides,"的第60/639,195号，其全文以引用的方式并入本文中。其也在美国专利申请案第60/696,210号；第60/696,302号和于2005年7月1日申请的题为"Compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids andpolypeptides,"的第60/696,068中描述，所述参考文献全文以引用的方式并入本文中。
水溶性聚合物连接至hGH多肽的程度和部位可调节GH（例如，hGH）多肽至GH（例如，hGH）多肽受体在部位1上的结合。在一些实施例中，键经如此地配置以便使GH（例如，hGH）多肽与GH（例如，hGH）多肽受体在部位1上以约400nM或以下的Kd、以150nM或以下的Kd且在一些情况下以100nM或以下的Kd（Kd按照诸如Spencer等人,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)中所述的平衡结合检定所测量）结合。
用于聚合物活化以及肽结合的方法和化学反应在文献中有所描述，且在所属领域中为已知的。用于聚合物活化的常用方法包括（但不限于）使用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤化物、三氯三嗪等来活化官能团（参看R.F.Taylor,(1991),PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL ANDAPPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson等人,(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES,Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.,等人,Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACSSymposium Series Vol.469,American Chemical Society,Washington,D.C.1991）。
关于PEG官能化和结合作用的一些综述和专论是可用的。参看（例如）Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:第325-373页(1985)；Scouten,Methods in Enzymology135:第30-65页(1987)；Wong等人,Enzyme Microb.Technol.14:第866-874页(1992)；Delgado等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems9:第249-304页(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:第150-165页(1995)。
用于聚合物活化的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189，并且可找到用于经活化聚合物与酶之间的结合作用的方法，这些酶包括（但不限于）凝血因子VIII（WO94/15625）、血红蛋白（WO94/09027）、载氧分子（美国专利第4,412,989号）、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶（Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:第141-52页(1985)）。所引用的全部文献和专利均是以引用的方式并入本文中。
通过任何便利方法进行含有非天然编码的氨基酸（诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸）的GH（例如，hGH）多肽的PEG化（即，加入任何水溶性聚合物）。举例而言，用末端为炔基的mPEG衍生物使GH（例如，hGH）多肽PEG化。简而言之，于室温下在搅拌情况下将过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡H添加至含对叠氮基-L-Phe的GH（例如，hGH）多肽的水溶液中。通常使用具有与反应进行时所处的pH值（一般约为pH值4至10）接近的pKa的缓冲液将所述水溶液缓冲。举例而言，用于在pH值7.5下PEG化的合适缓冲液的实例包括（但不限于）HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监测pH值，且在必要时进行调节。通常允许此反应持续约1至48小时。
随后使反应产物经受疏水相互作用色谱法处理，以使PEG化GH（例如，hGH）多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和PEG化GH（例如，hGH）多肽的任何高分子量复合物（其可在未阻断PEG在分子两端上均受活化时而形成），从而使GH（例如，hGH）多肽变异体分子交联。疏水相互作用色谱法期间的条件为如此，以便使游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流过管柱，同时任何经交联的PEG化GH（例如，hGH）多肽变异体复合物在所要形式（其含有一个与一个和一个以上PEG基团结合的GH（例如，hGH）多肽变异体分子）之后洗脱。合适条件将视交联复合物对于所要结合物的相对大小而变化，且可由所属领域的技术人员容易地确定。含有所要结合物的洗脱液通过超滤而浓缩且通过透滤脱盐。
必要时，由疏水色谱法获得的PEG化GH（例如，hGH）多肽可进一步通过所属领域的技术人员已知的程序中的一种和一种以上程序而纯化，这些程序包括（但不限于）亲和色谱法；阴离子交换或阳离子交换色谱法（其使用包括（但不限于）DEAE琼脂糖凝胶）；硅石色谱法；反相HPLC；凝胶过滤（使用包括（但不限于）SEPHADEX G-75）；疏水性相互作用色谱法；尺寸排阻色谱法（size-exclusion chromatography）；金属螯合色谱法；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱焦聚；置换色谱法；电泳程序（包括（但不限于）制备性等电聚焦）；差异溶解性法（包括（但不限于）硫酸铵沉淀）；或提取法。表观分子量可以通过将GPC与球状蛋白质标准相比而估算（Preneta,AZ in PROTEINPURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris&Angal,编)IRL Press1989,第293-306页）。GH（例如hGH）-PEG结合物的纯度可通过蛋白水解降解（包括（但不限于）胰蛋白酶裂解）继而进行质谱分析来评估。Pepinsky RB.,等人,J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
也通过任何便利方法进行含有含羰基非天然编码的氨基酸（诸如对乙酰基-L-苯丙氨酸）的GH（例如，hGH）多肽的PEG化（即，加入任何水溶性聚合物）。作为非专有实例，使用氨基氧基乙胺氨基甲酸酯mPEG衍生物（其分子量为约0.1至100kDa、或约1至100kDa、或约10至50kDa、或约20至40kDa、或例如30kDa的）将含有含羰基非天然编码的氨基酸（例如对乙酰基-L-苯丙氨酸）的GH（hGH）多肽PEG化。简而言之，于室温下在搅拌情况下将过量的固体MPEG-羟基胺，例如mPEG(30,000)-O-CO-NH-(CH2)2-ONH3 +（线性30kDa单甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐，30K MPEG-羟基胺）添加至含有对乙酰基-L-苯丙氨酸的GH（例如，hGH）多肽的水溶液中。PEG:GH（例如，hGH）的摩尔比可为约2至15、或约5至10、或约5、6、7、8、9或10。通常使用具有与反应进行时所处的pH值（一般约为pH值2至8）接近的pKa的缓冲液将所述水溶液缓冲。举例而言，用于在pH值4.0下PEG化的合适缓冲液的实例包括（但不限于）通过添加乙酸而调节至pH4.0的乙酸钠/甘氨酸缓冲液。通常允许此反应于室温下轻柔摇动下持续约1至60小时、或约10至50小时、或约18至48小时、或约39至50小时。PEG化可通过SDS凝胶确定。
随后使反应产物经受从（例如）游离30K MPEG-羟基胺和PEG化GH（例如，hGH）多肽的任何高分子量复合物（其可在未阻断PEG在分子两端上均受活化时而形成）纯化，从而使GH（例如，hGH）多肽变异体分子交联。可使用任何合适的纯化方法，例如管柱色谱法（诸如使用SourceQ缓冲液A和SourceQ缓冲液B进行的SourceQ管柱色谱）。反应混合物可用TRIS碱和SourceQ缓冲液A以及MilliQ水进行稀释，随后加载至管柱上。含有所要结合物的洗脱液可进一步通过超滤而浓缩且通过透滤脱盐。
必要时，由色谱法获得的PEG化GH（例如，hGH）多肽可进一步通过所属领域的技术人员已知的和本文中所述（参看例如上文）的程序中的一种和一种以上程序而纯化。可以高于50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%或99.99%的纯度获得最终的PEG化GH（例如，hGH）多肽。纯度可通过所属领域中已知的方法测定。评估纯度的示范性非限制性方法包括SDS-PAGE、使用西方墨点法和ELISA检定测量GH（例如，hGH）多肽、Bradford检定、质谱（包括（但不限于）MALDI-TOF）、HPLC方法（诸如RP HPLC、阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC）和所属领域的技术人员已知的其它用于表征蛋白质的方法。
与本发明的GH（例如，hGH）多肽中的氨基酸相连接的水溶性聚合物可无限制地经进一步衍生或取代。
含叠氮基的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有叠氮基部分（其将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的炔基部分反应）的PEG衍生物修饰GH（例如，hGH）多肽。一般而言，这些PEG衍生物将具有1至100kD且在一些实施例中为10至40kDa的平均分子量。
在一些实施例中，末端为叠氮基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000（即，平均分子量为5至40kDa）。
在另一实施例中，末端为叠氮基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10，p为2至10且n为100至1,000（即，平均分子量为5至40kDa）。
在本发明的另一实施例中，用含有末端叠氮基部分的分枝PEG衍生物（其中所述PEG的各链具有10至40kDa且可能为5至20kDa范围内的分子量）修饰GH（例如，hGH）多肽。举例而言，在一些实施例中，末端为叠氮基的PEG衍生物将具有下列结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10，p为2至10且n为100至1,000，且X视需要为O、N、S或羰基（C=O），其在各种情况下可存在或不存在。
含炔基的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有炔基部分（其将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的叠氮基部分反应）的PEG衍生物修饰GH（例如，hGH）多肽。
在一些实施例中，末端为炔基的PEG衍生物将具有下列结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10且n为100至1,000（即，平均分子量为5至40kDa）。
在本发明的另一实施例中，用含有末端叠氮基部分或末端炔基部分（其通过酰胺键与PEG主链相连接）的PEG衍生物修饰包含含炔基非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。
在一些实施例中，末端为炔基的PEG衍生物将具有下列结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10，p为2至10且n为100至1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端炔基部分的分枝PEG衍生物（其中所述PEG的各链具有10至40kDa且可能为5至20kDa范围内的分子量）修饰包含含叠氮基氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。举例而言，在一些实施例中，末端为炔基的PEG衍生物将具有下列结构：
[RO(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH，
其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2至10，p为2至10且n为100至1,000，且X视需要为O、N、S或羰基（C=O），或不存在。
含膦部分的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有经活化官能团（包括（但不限于）酯、碳酸酯）且进一步包含芳基膦基团（其将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的叠氮基部分反应）的PEG衍生物修饰GH（例如，hGH）多肽。一般而言，这些PEG衍生物将具有1至100kD且在一些实施例中为10至40kDa的平均分子量。
在一些实施例中，所述PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BDA0000437277490001661
其中n为1至10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中，所述PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BDA0000437277490001662
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示范性R基团包括（但不限于）-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、卤基、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R"'和R""各自独立地指的是氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基（其包括（但不限于）经1至3个卤原子取代的芳基）、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。举例而言，当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，各R基团是是独立地加以选择的；就如同当R'、R"、R"'和R""中的一个以上基团存在时，R'、R"、R"'和R""基团各自是独立地加以选择的那样。当R'和R"与同一个氮原子相连接时，其可与此氮原子组合以形成5元、6元或7元环。举例而言，-NR'R"意谓包括（但不限于）1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据以上对取代基的论述，所属领域的技术人员将了解，术语“烷基”意谓包括包含与非氢基团键结的碳原子的基团，诸如卤代烷基（包括（但不限于）-CF3和-CH2CF3）和酰基（包括（但不限于）-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等）。
其它PEG衍生物和一般PEG化技术
可与GH（例如，hGH）多肽相连接的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括在下列专利案中所述的那些PEG分子以及PEG化方法：美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号；第5,629,384号；第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5,473,034号；第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号；第5,990,237号；第5,900,461号；第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号；第5,808,096号；第5,612,460号；第5,324,844号；第5,252,714号；第6,420,339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,747,646号；第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912号；WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316，其以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子可以任何形式使用，包括（但不限于）单链、支链、多臂链、单官能性、多官能性或其任何组合。
增强对血清白蛋白的亲和力
也可将多种分子与本发明的GH（例如，hGH）多肽融合，以调节GH（例如，hGH）多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，将分子与本发明的GH（例如，hGH）多肽相连接或融合，以增强对于动物的内源性血清白蛋白的亲和性。
举例而言，在一些情况下，进行GH（例如，hGH）多肽与白蛋白结合序列的重组融合。示范性白蛋白结合序列包括（但不限于）来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域（参看例如Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996)和Sjolander等人,J,Immunol.Methods201:115-123(1997)），或白蛋白结合肽（诸如在例如Dennis等人,J.Biol.Chem.277:第35035-35043页(2002)中所述）。
在其它实施例中，使用脂肪酸将本发明的GH（例如，hGH）多肽酰化。在一些实施例中，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参看例如Kurtzhals等人,Biochem.J.312:第725-731页(1995)。
在其它实施例中，本发明的GH（例如，hGH）多肽是与血清白蛋白（包括（但不限于）人类血清白蛋白）直接融合。所属领域的技术人员将认识到，也可使多种其它分子与本发明的GH（例如，hGH）多肽相连接，以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.GH（例如，hGH）多肽的糖基化
本发明包括其中并入一个或一个以上具有糖类残基的非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。这些糖类残基可为天然的（包括（但不限于）N-乙酰基氨基葡萄糖）或非天然的（包括（但不限于）3-氟半乳糖）。这些糖类可通过N连接或O连接的糖苷键（包括（但不限于）N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸）或非天然键（包括（但不限于）肟或相应C连接或S连接的糖苷）与非天然编码的氨基酸相连接。
可将糖类（包括（但不限于）糖基）部分添加至活体内或活体外的GH（例如，hGH）多肽。在本发明的一些实施例中，使用以氨基氧基衍生的糖类来修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽，以产生通过肟键相连接的相应糖基化多肽。一旦连接至非天然编码的氨基酸后，就可通过用糖基转移酶和其它酶处理将糖类进一步精制，以产生与GH（例如，hGH）多肽结合的低聚糖。参看例如H.Liu等人J.Am.Chem.Soc.125:第1702-1703页(2003)。
在本发明的一些实施例中，使用作为氨基氧基衍生物而制备的、具有确定结构的聚糖来直接修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。所属领域的技术人员将认识到，可使用其它官能团（包括叠氮基、炔基、酰肼、肼、和氨基脲）将糖类连接至非天然编码的氨基酸。
在本发明的一些实施例中，接着可通过（包括（但不限于））分别与（包括（但不限于））炔基或叠氮基衍生物的胡氏根[3+2]环加成反应来修饰包含叠氮基或含炔基非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽。此方法允许以极高的选择性来修饰蛋白质。
XI.GH超基因家族成员二聚体和多聚体
本发明也提供GH超基因家族成员的组合（包括（但不限于）GH，例如hGH和hGH类似物），诸如同源二聚体、杂二聚体、同源多聚体或杂多聚体（即，三聚体或四聚体等），其中含有一个或一个以上非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员多肽（诸如GH，例如hGH）与另一个GH超基因家族成员或其变异体或非GH超基因家族成员或其变异体的任何其它多肽结合，直接或通过连接子而连接至多肽主链。由于其分子量相较于单体而言较高，因此GH超基因家族成员（诸如GH，例如hGH）二聚体或多聚体结合物可展现新的或所要的特性，其包括（但不限于）不同药理特性、药物代谢动力学特性、药效特性、相对于单体GH超基因家族成员的经调节半衰期或经调节血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的GH超基因家族成员（诸如GH，例如hGH）二聚体将调节GH超基因家族成员受体的二聚作用。在其它实施例中，本发明的GH超基因家族成员二聚体或多聚体将充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、促效剂或抑扬第剂。
在一些实施例中，存在于含有二聚体或多聚体的GH（例如hGH）中的一个或一个以上GH（例如hGH）分子包含与存在于部位II结合区域内的水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸。因而，二聚体或多聚体的各个分子易于通过部位I界面与GH（例如，hGH）多肽受体结合，但不可通过部位II界面与第二GH（例如，hGH）多肽受体结合。因此，GH（例如，hGH）多肽二聚体或多聚体可与两个不同GH（例如，hGH）多肽受体中各受体的部位I结合部位结合，但由于GH（例如，hGH）多肽分子具有连接至存在于部位II区域中的非遗传编码氨基酸的水溶性聚合物，因此GH（例如，hGH）多肽受体无法与GH（例如，hGH）多肽配位体的部位II区域结合，且二聚体或多聚体充当GH（例如，hGH）多肽拮抗剂。在一些实施例中，存在于含有二聚体或多聚体的GH（例如hGH）中的一个或一个以上GH（例如hGH）分子包含与存在于部位I结合区域内的水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸，以允许与部位II区域结合。或者，在一些实施例中，存在于含有二聚体或多聚体的GH（例如hGH）中的一个或一个以上GH（例如hGH）分子包含与不存在于部位I或部位II结合区域内的水溶性聚合物相连接的非天然编码的氨基酸，以便使两个区域均可结合。在一些实施例中，使用具有部位I可用、部位II可用或两者均可用的GH（例如hGH）分子组合。GH（例如hGH）分子组合（其中至少一个分子具有可用于结合的部位I，且至少一个分子具有可用于结合的部位II）可提供具有所要活性或特性的分子。另外，同时具有可用于结合的部位I和部位II的GH（例如hGH）分子组合可产生超促效GH（例如hGH）分子。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽（包括（但不限于））通过Asn-Lys胺键或Cys-Cys二硫化物而直接连接。在一些实施例中，经连接的GH超基因家族成员多肽和/或经连接的非GH超基因家族成员将包含不同的非天然编码的氨基酸以便于二聚作用，其包括（但不限于）在第一GH（例如，hGH）多肽的一个非天然编码的氨基酸中的炔基和在在第二GH超基因家族成员多肽的第二非天然编码的氨基酸中的叠氮基将通过胡氏根[3+2]环加成结合连接。或者，第一GH超基因家族成员和/或经连接的非GH超基因家族成员、包含含酮基非天然编码的氨基酸的多肽可结合连接至包含含羟胺非天然编码的氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽，这些多肽通过形成相应的肟而进行反应。
或者，两个GH超基因家族成员多肽和/或经连接的非GH超基因家族成员通过连接子连接。可使用任何杂双官能性或同双官能性连接子来连接两个GH超基因家族成员和/或经连接的非GH超基因家族成员、多肽（其可具有相同或不同的一级序列）。在一些实施例中，用于将GH超基因家族成员和/或经连接的非GH超基因家族成员、多肽连接在一起的连接子可为双官能性PEG试剂。此连接子可具有宽广范围的分子量或分子长度。较大分子量或较小分子量的连接子可用于在GH超基因家族成员与连接实体之间、或GH超基因家族成员与GH超基因家族成员受体之间、或连接实体与GH超基因家族成员受体之间提供所要空间关系或构造。具有较长分子长度或较短分子长度的连接子也可用于在GH超基因家族成员与连接实体之间、或GH超基因家族成员与其受体之间、或连接实体与GH超基因家族成员受体之间提供所要空间和挠性。类似地，具有特殊形状或构造的连接子可用于在GH超基因家族成员到达目标之前或之后对GH超基因家族成员或连接实体赋予特殊形状或构造。这种对于GH超基因家族成员与连接实体之间的空间关系的优化可为分子提供新的、接调节的或所要的特性。
在一些实施例中，本发明提供水溶性双官能性连接子，其具有哑铃结构，此结构包括：a）位于聚合物主链的至少第一端上的叠氮基、炔基、肼、酰肼、羟胺或含羰基部分；和b）位于聚合物主链第二端上的至少一个第二官能团。此第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例而言，此分枝分子结构可为树枝状的。
在一些实施例中，本发明提供包含一个或一个以上GH超基因家族成员（诸如GH，例如hGH）的多聚体，其通过与具有以下结构的水溶性活化聚合物反应而形成：
R-(CH2CH2o)n-O-(CH2)m-X，
其中n为5至3,000，m为2至10，X可为叠氮基、炔基、肼、酰肼、氨基氧基、羟胺、乙酰基或含羰基部分，且R为封端基团、官能团或离去基团，其可与X相同或不同。R可为（例如）选自由下列各基团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基丁二酰亚胺酯、1-苯并三唑基酯基、N-羟基丁二酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。
XII.hGH多肽活性和hGH多肽对于hGH多肽受体的亲和性的测量
[586]可按照McFarland等人,Science,245:第494-499页(1989)和Leung,D.等人,Nature,330:第537-543页(1987)中所述制备hGH受体。hGH多肽活性可使用标准或已知的活体内或活体外检定测定。举例而言，在hGH存在情况下增殖的细胞系（例如表达hGH受体或催乳受体的细胞系）可用于监测hGH受体结合。参看例如Clark,R.等人,J.Biol.Chem.271(36):第21969页(1996)；Wada等人,Mol.Endocrinol.12:第146-156页(1998)；Gout,P.W.等人Cancer Res.40,第2433-2436页(1980)；WO99/03887。对于包含非天然氨基酸的非PEG化或PEG化hGH多肽而言，激素对于其受体的亲和性可通过使用BIAcoreTM生物传感器（Pharmacia）来测量。参看例如美国专利第5,849,535号、Spencer,S.A.等人,J.Biol.Chem.,263:第7862-7867页(1988)。用于测试hGH活性的活体内动物模型包括那些在（例如）Clark等人,J.Biol.Chem.271(36):第21969-21977页(1996)中所述的模型。可按照Cunningham,B.等人,Science,254:第821-825页(1991)和Fuh,G.等人,Science,256:第1677-1680页(1992)中所述进行对于包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽的二聚能力的检定。所有引用的文献和专利以引用的方式并入本文中。
关于检定方法的文献编辑并非详尽无遗的，且所属领域的技术人员将认可适用于测试所要最终结果的其它检定。
XIII.对于效能、功能性活体内半衰期和药物代谢动力学参数的测量
本发明的一个重要方面为通过hGH多肽（在有或无多肽与水溶性聚合物部分的结合的情况下）的构造所获得的延长的生物学半衰期。hGH多肽血清浓度的迅速降低已使得评估对于使用结合或非结合hGH多肽和其变异体的治疗的生物反应具有重要性。在皮下或静脉注射投药后，本发明的结合或非结合hGH多肽和其变异体也可具有持久血清半衰期，使得通过（例如）ELISA方法或通过初级筛选检定进行测量成为可能。可使用购自BioSource International（Camarillo,CA）或Diagnostic Systems Laboratories（Webster,TX）的ELISA或RIA套组。如本文中所述进行活体内生物半衰期的测量。
包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的效能和功能性活体内半衰期可根据Clark,R.等人,J.Biol.Chem.271(36):第21969-21977页(1996)中所述的方法测定。
包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的药物代谢动力学参数可在普通Sprague-Dawley雄性大鼠（N=5只动物/治疗组）中评估。动物将接受25μg/大鼠静脉内或50μg/大鼠皮下的单次剂量，根据预先确定的时程（一般涵盖对于包含非天然编码的氨基酸、未与水溶性聚合物结合的GH（例如，hGH）多肽而言约6小时，而对于包含非天然编码的氨基酸且与水溶性聚合物结合的GH（例如，hGH）多肽而言约4天）采集大约5至7份血样。在若干物质中充分研究了GH（例如，hGH）多肽的药物代谢动力学数据，且可将其与对于包含非天然编码的氨基酸的GH（例如，hGH）多肽所获得的数据直接进行比较。关于与GH（例如，hGH）多肽相关的研究，参看Mordenti J.等人,Pharm.Res.8(ll):第1351-59页(1991)。
药物代谢动力学参数也可在灵长类动物（例如猕猴）中评估。通常，以皮下或静脉内的方式投予单次注射，且随时间监测血清GH（例如hGH）含量。关于进一步描述，
参看例如“实例”。
在一些实施例中，本发明提供在以皮下方式投予哺乳动物时具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或16个小时以上的平均血清半衰期的GH（例如hGH）。在一些实施例中，本发明提供在以皮下方式投予哺乳动物时具有至少约0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或12个小时以上的平均血清半衰期的GH（例如hGH）。“平均”血清半衰期是至少三个动物、或至少四个动物、或至少五个动物、或五个以上动物的平均值。在一些实施例中，哺乳动物为大鼠；在一些实施例中，哺乳动物为灵长类动物，诸如猕猴，或诸如人类。在一些实施例中，本发明提供PEG化GH（例如PEG化hGH），其在以皮下方式投予时具有相当于非PEG化形式GH（例如hGH）的平均血清半衰期至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或50倍以上的平均血清半衰期。在一些实施例中，本发明提供PEG化GH（例如PEG化hGH），其在以静脉内方式投予时具有相当于非PEG化形式GH（例如hGH）的平均血清半衰期至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或50倍以上的平均血清半衰期。“平均”血清半衰期是至少三个动物、或至少四个动物、或至少五个动物、或五个以上动物的平均值。在一些实施例中，哺乳动物为大鼠；在一些实施例中，哺乳动物为灵长类动物，诸如猕猴，或诸如人类。在一些实施例中，GH为GH（例如hGH）。在一些实施例中，生长激素通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接，其中所述共价键为肟键。GH可为GH（例如hGH）。在一些实施例中，GH（例如hGH）包括非天然编码的氨基酸，诸如含羰基非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为含酮基氨基酸，例如对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，GH（例如hGH）含有非天然编码的氨基酸，例如在GH（例如hGH）中对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上进行取代的对乙酰苯丙氨酸。水溶性聚合物可为PEG。合适PEG包括线性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定实施例中，PEG为约0.1至100kDa、或约1至100kDa、或约10至50kDa、或约20至40kDa、或约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，医药组合物含有通过肟键与30kDa的PEG相连接的GH（例如hGH），其中所述肟键在位于对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上的对乙酰苯丙氨酸与PEG之间。
根据本发明的GH（例如，hGH）多肽的特定活性可通过所属领域中已知的多种检定测定。根据本发明所获得且纯化的GH（例如，hGH）多肽突变型蛋白或其片段的生物活性可通过本文中所述或引用的方法、或所属领域的技术人员已知的方法来测试。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质（包括（但不限于）GH（例如hGH）、合成酶、包含一个或一个以上氨基酸的蛋白质等）视需要（包括（但不限于））与合适医药载剂组合用于治疗用途。举例而言，所述组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括（但不限于）盐水、经缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。使配方适于投药。一般而言，投予蛋白质的方法对于所属领域的技术人员为已知，且可应用于投予本发明的多肽。
在一些实施例中，本发明提供含有激素组合物（其包含通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素，其中所述共价键为肟键）的医药组合物；以及医药学上可接受的赋形剂。GH可为hGH。在一些实施例中，GH（例如hGH）包括非天然编码的氨基酸，诸如含羰基非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为含酮基氨基酸，例如对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，GH（例如hGH）含有非天然编码的氨基酸，例如在GH（例如hGH）中对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上进行取代的对乙酰苯丙氨酸。水溶性聚合物可为PEG。合适PEG包括线性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定实施例中，PEG为约0.1至100kDa、或约1至100kDa、或约10至50kDa、或约20至40kDa、或约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，医药组合物含有通过肟键与30kDa的PEG相连接的GH（例如hGH），其中所述肟键在位于对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上的对乙酰苯丙氨酸与PEG之间。
根据所属领域的技术人员已知的方法，视需要在一个或一个以上适当的活体内和/活体外动物疾病模型中测试本发明的包含一个或一个以上多肽的治疗组合物，以确认效能、组织新陈代谢且估算剂量。具体来说，可通过本文中非天然氨基酸相对于天然氨基酸同源物（包括（但不限于）经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的GH（例如，hGH）多肽与天然氨基酸GH（例如，hGH）多肽的比较），即在相关检定中的活性、稳定性或其它合适量度来初步确定剂量。
通过通常用于将分子引入与血液或组织细胞的最终接触的任何途径进行投药。以任何合适方式投予本发明的非天然氨基酸多肽，视需要使用一种或一种以上医药学上可接受的载剂。在本发明文中投予所述多肽的合适方法是可用的，且尽管可使用一种以上的途径来投予特定组合物，但特定途径通常可提供相较于其它途径更直接且更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂在某种程度上由所投予的特定组合物以及用于投予所述组合物的方法而确定。因此，本发明的医药组合物存在多种合适的配方。
本发明的hGH多肽（包括（但不限于）PEG化hGH）可通过任何适用于蛋白质和多肽的常规途径投予，这些途径包括（但不限于）非经肠方式，例如注射或输注（包括（但不限于）皮下或静脉内或任何其它形式的注射或输注。多肽组合物可通过若干途径投予，这些途径包括（但不限于）经口腔、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含非天然氨基酸多肽的组合物（经修饰或未经修饰）也可经由脂质体投予。所述投药途径和适当配方对于所属领域的技术人员通常为已知。包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽（包括（但不限于）PEG化hGH）可单独使用或与其它合适组分（诸如医药载剂）结合使用。
也可将包含非天然氨基酸的GH（例如，hGH）多肽单独地或与其它合适组分结合制于气溶胶配方中（即其可为“喷雾状”），以经由吸入投予。可将气溶胶配方置于加压的可接受推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
适用于非经肠投药（诸如通过关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径）的配方包括水性和非水性的等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得此配方与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。hGH的配方可存在于单位剂量或多剂量密封容器（诸如安瓿和管瓶）中。
非经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗（包括（但不限于）那些用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞间介素、抗体和/或任何其它以医药方式传递的蛋白质）的投药途径，连同当前所用的配方，提供优选投药途径和本发明多肽的优选配方。
根据应用，在本发明文中投予患者的剂量足以随时间在患者体内具有有益的治疗反应或其它适当活性。通过特定载体或配方的效能、所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期、患者的病症以及待治疗患者的体重和表面积确定剂量。也通过伴随在特定患者体内投予特定载体、配方等的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小。
在确定于疾病（包括（但不限于）癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS或类似疾病）的治疗或预防中待投予的载体或配方的有效量时，医师评估循环血浆水平、配方毒性、疾病的进程和/或在何处产生抗非天然氨基酸多肽抗体。
对于（例如）70千克的患者所投予的剂量通常在与当前所用针对相应组合物的改变活性或血清半衰期进行调节的治疗蛋白的剂量相等的范围内。本发明的载体或配方可通过任何已知常规治疗（包括投予抗体、投予疫苗、投予细胞毒素剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸同源物、生物反应修饰剂等）对治疗状况进行补充。
对于投药而言，按照通过相应配方的LD-50或ED-50和/或对（包括（但不限于））如对应于患者的的质量和整体健康应用时各种浓度下非天然氨基酸的任何副作用的观测所确定的比率投予本发明的配方。可通过单次剂量或分次剂量完成投药。
如果经受配方输注的患者患上发烧、受寒或肌肉疼痛，那么他/她可服用适当剂量的阿司匹林（aspirin）、布洛芬（ibuprofen）、醋氨酚（acetaminophen）或其它解热镇痛药。对于输注有反应（诸如发烧、肌肉疼痛或受寒）的患者在继续输注阿司匹林（aspirin）、醋氨酚（acetaminophen）或（包括（但不限于））苯海拉明（diphenhydramine）之前前驱用药30分钟。度冷丁（Meperidine）是用于不能对解热药和抗组胺剂作出快速反应的更严重受寒和肌肉疼痛。根据反应的严重程度减缓或停止细胞输注。
本发明的人类GH多肽可直接投予哺乳动物受检者。通过任何常用于将hGH多肽引入受检者的途径进行投药。根据本发明实施例的hGH多肽组合物包括那些适用于口腔、直肠、局部、吸入（包括（但不限于）经由气溶胶）、颊内（包括（但不限于）舌下）、阴道、非经肠（包括（但不限于）皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内）、局部（即皮肤和粘膜表面，包括气管表面）和经皮投药的组合物，然而在任何给定情况下的最合适途径将视所治疗病症的性质和严重程度而定。投药可为局部的或全身的。化合物的配方可存在于单剂量或多剂量密封容器（诸如安瓿和管瓶）中。本发明的GH（例如，hGH）多肽以单位剂量可注射形式（包括（但不限于）溶液、悬浮液或乳浊液）与医药学上可接受的载剂在混合物中制备。本发明的GH（例如，hGH）多肽也可通过连续输注（使用包括（但不限于）小型真空泵（诸如渗透泵））、独立大丸剂或缓释储库型配方投予。
适于投药的配方包括水性和非水性溶液、等张无菌溶液，其可含有使得此配方等张的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。溶液和悬浮液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
冷冻干燥是一种常用于表达蛋白质的技术，其用于从所述蛋白质制备中移除水分。冷冻干燥或冻干法是一种将待干燥的材料首先冷冻接着通过在真空环境中升华将冰或冷冻溶剂移除的方法。在预先冻干配方中可能包括赋形剂，以增强冷冻干燥过程期间的稳定性且/或改良冻干产物在存储时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)第26-30页(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):第285-291页(1991)。
药物的喷雾干燥对于所属领域的技术人员也为已知。举例而言，参看Broadhead,J.等人在Drug Dev.hid.Pharm,18(11&12),第1169-1206页(1992)中的"The Spray Dryingof Pharmaceuticals,"。除了小分子药物以外，已将多种生物材料喷雾干燥，且这些材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一种适用的技术，因为其可在一步过程中使液体药物制备转化为精细、无尘或凝聚的粉末。基本技术包含下列四个步骤：a）将馈料溶液雾化为喷雾；b）喷雾-空气接触；c）喷雾干燥；d）将经干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号（其以引用的方式并入本文中）描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂在某种程度上通过所投予的特定组合物以及用于投予所述组合物的特定方法确定。因此，本发明的医药组合物存在多种合适配方（包括视需要的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂）（参看例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版本，1985)）。
合适载剂包括缓冲剂，其含有丁二酸、磷酸、硼酸、HEPES、柠檬酸、组氨酸或组氨酸衍生物、咪唑、乙酸、重碳酸和其它有机酸；抗氧化剂，其包括（但不限于）抗坏血酸；低分子量多肽，其包括（但不限于）那些小于约10个残基的多肽；蛋白质，其包括（但不限于）血清白蛋白、动物胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，其包括（但不限于）聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，其包括（但不限于）甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，其包括（但不限于）海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，其包括（但不限于）EDTA；二价金属离子，其包括（但不限于）锌离子、钴离子或铜离子；糖醇，其包括（但不限于）甘露醇或山梨醇；成盐反离子，其包括（但不限于）TweenTM（包括（但不限于）Tween80（聚山梨酸酯80）和Tween20（聚山梨酸酯20）、PluronicsTM和其它聚醚酸，其包括（但不限于）聚醚酸F68（泊洛沙姆（poloxamer）188）或PEG。合适表面活性剂包括（例如但不限于）基于聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-poly(氧化乙烯)（即(PEO-PPO-PEO)）或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)（即(PPO-PEO-PPO)）或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO可以商标PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM（BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.）购得，且进一步在美国专利第4,820,352号（其全文以引用的方式并入本文中）中描述。其它乙烯/聚乙烯嵌段聚合物可为合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于针对一种或一种以上压力（其包括（但不限于）由搅动导致的压力）使PEG化hGH稳定。上述有些试剂可称为“膨胀剂”。有些也可称为“紧张性修饰剂”。
本发明的GH（例如，hGH）多肽（其包括那些与诸如PEG的水溶性聚合物相连接的GH）也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分来投予。持续释放组合物包括（但不限于）成形物品形式（其包括（但不限于）薄膜或微胶囊）的半透性聚合物基质。持续释放基质包括生物相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)（Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:第267-277页(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:第98-105页(1982)）、乙烯基乙酸乙酯（Langer等人，见上文）或聚-D-(-)-3-羟基丁酸（EP133,988）、聚丙交酯（聚乳酸）（美国专利第3,773,919号；EP58,481）、聚乙交酯（乙醇酸的聚合物）、聚丙交酯-乙交酯共聚物（乳酸和乙醇酸的共聚物）聚酐、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物（Sidman等人,Biopolymers,22,第547-556页(1983)）、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸（诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸）、多聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物也包括以脂质体包被的化合物。通过下列自身已知的方法制备含有此化合物的脂质体：DE3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:第3688-3692页(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:第4030-4034页(1980)；EP52,322；EP36,676；美国专利第4,619,794号；EP143,949；美国专利第5,021,234；日本专利申请案第83-118008号；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324。所有引用的文献和专利以引用的方式并入本文中。
通过例如下列文献和专利中所述的方法可制备以脂质体包被的GH（例如，hGH）多肽：DE3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:第3688-3692页(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:第4030-4034页(1980)；EP52,322；EP36,676；美国专利第4,619,794号；EP143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案第83-118008号；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324。脂质体的组成和大小为人熟知或能够由所属领域的技术人员容易地以实验方式测定。脂质体的一些实例在例如以下文献和专利中描述：Park JW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:第1327-1331页(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(eds):MEDICALAPPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人在Teicher B(ed):CANCERDRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)中的Liposomal drug delivery systems forcancer therapy；Park JW等人,Clin.Cancer Res.8:第1172-1181页(2002)；Nielsen UB等人,Biochim.Biophys.Acta1591(1-3):第109-118页(2002)；Mamot C等人,Cancer Res.63:第3154-3161页(2003)。所有引用的文献和专利以引用的方式并入本文中。
在本发明文中投予患者的剂量应足以随时间在患者体内引起有益反应。一般而言，每剂中非经肠投予的本发明GH（例如，hGH）多肽的医药学上有效总量在以患者体重计约0.01μg/kg/日至约100μg/kg、或约0.05mg/kg至约1mg/kg的范围内，然而这应视疗法而定。给药频率也应视疗法而定，且相较于经认可适用于人类的市售GH（例如，hGH）多肽产品而言，其频率可能更高或更低。一般而言，可通过上述任何投药途径来投予本发明的PEG化GH（例如，hGH）多肽。在一些实施例这，本发明提供一种组合物，其在本文中所述的对于存储和给药服法足够稳定的医药组合物中包含本文中所述的任何GH（例如，hGH）多肽。测试稳定性的方法在所属领域中为已知。
XV.本发明的GH（例如，hGH）多肽的治疗用途
本发明的GH（例如，hGH）多肽适用于治疗各种病症。
本发明的GH（例如，hGH）促效剂多肽可适用于（例如）治疗生长缺陷、免疫失调，且适用于促进心脏功能。患有生长缺陷的个体包括（例如）患有特纳氏综合症（Turner'sSyndrome）的个体、GH缺陷个体（包括儿童）、在生长板闭合前经历约2至3年其正常生长曲线出现生长缓慢或延迟的儿童（有时也称为“矮小正常儿童”）和其中已用化学方式（即通过糖皮质激素治疗）或通过自然条件（诸如在其中IGF-I对GH的反应自然减少的成年患者中）阻断胰岛素样生长因子（IGF-I）对GH的反应的个体。本发明的hGH多肽可适用于治疗患有下列病症的个体：儿科生长激素缺乏症、特发性身材矮小、儿童期发作的成年人生长激素缺乏症、成年期发作的成年人生长激素缺乏症或继发性生长激素缺乏症。经诊断患有成年期生长激素缺乏症的成年人可能具有垂体肿瘤或放射物。病症（包括（但不限于）代谢综合症、颅脑损伤、肥胖症、骨质疏松症或抑郁症）可能会导致成年人中的类似生长激素缺乏的症状。
促效剂GH（例如，hGH）变异体可以通过增加哺乳动物的免疫功能起作用以刺激其免疫系统，无论此增加是由于抗体调节还是细胞调节，且无论免疫系统对于经GH（例如，hGH）多肽治疗的宿主为内源性的还是从供体移植至接受GH（例如，hGH）多肽的宿主受体（如在骨髓移植中）。“免疫失调”包括其中个体的免疫系统具有少于正常的免疫系统的对抗原的抗体或细胞反应的任何病症，包括（但不限于）那些由于药物（例如化学治疗）治疗而小脾免疫性降低的个体。患有免疫失调的个体的实例包括（例如）老年患者、经受化学治疗或放射治疗的个体、重病初愈的个体或将要接受外科手术的个体、患有AIDS的个体、患有先天性和后天性B细胞缺乏症（诸如低丙种球蛋白血症、常见变体丙种球蛋白缺乏症和选择性免疫球蛋白缺乏症（例如IgA缺乏症））的患者、受诸如狂犬病病毒的病毒（其具有相较于患者的免疫反应更短的潜伏时间）感染的患者；和患有遗传性失调症（诸如diGeorge综合症）的患者。
本发明的GH（例如，hGH）拮抗剂多肽可用于治疗巨人症和肢端肥大症、糖尿病和由糖尿病产生的并发症（糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变）、血管性眼病（例如包括增生性血管再生）、肾病和GH反应性恶性肿瘤。
血管性眼病包括（例如）视网膜病（由（例如）早产儿贫血病或镰状细胞贫血症引起）和黄斑变性。
GH反应性恶性肿瘤包括（例如）威尔姆氏肿瘤（Wilm's tumor）、肉瘤（例如，骨源性肉瘤）、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和甲状腺癌，以及表达GH受体mRNA的组织的癌症（即，胎盘、胸腺、脑、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、气管、脊髓、视网膜、淋巴结的癌和来自伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）、结直肠癌、肺癌、淋巴性白血病和黑素瘤的癌症）。
举例而言，本发明的GH（例如，hGH）促效剂多肽可用于治疗慢性肾衰竭、与慢性肾机能不全（CRI）相关的生长障碍、与特纳氏综合症（Turner's Syndrome）相关的身材矮小、儿科普来德-威利综合症（Prader-Willi Syndrome）（PWS）、患有消瘦或恶病质的HIV患者、小于孕龄（SGA）出生的儿童、肥胖症和骨质疏松症。
GH（例如，hGH）的平均量可改变，且尤其应以合格医师的推荐和处方为基础。GH（例如，hGH）的准确量是一个关于优选的问题，其为以下因素所支配：所治疗病症的准确类型、所治疗患者的病症以及组合物中的其它成份。本发明也提供治疗有效量的另一种活性剂的投药。可由所属领域的技术人员基于使用hGH的治疗容易地确定待投予的量。
本发明的医药组合物可用常规方式制造。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗方法，其包括将有效量的激素组合物投予需要治疗的个体，所述激素组合物含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素（GH），其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，所述方法包括将GH（例如，hGH）投予个体（例如人类）。在一些实施例中，GH（例如，hGH）包括非天然编码的氨基酸，诸如含羰基的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为含酮基的氨基酸，例如对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，GH（例如hGH）含有非天然编码的氨基酸，例如在GH（例如hGH）中对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上进行取代的对乙酰苯丙氨酸。水溶性聚合物可为PEG。合适PEG包括线性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定实施例中，PEG为约0.1至100kDa、或约1至100kDa、或约10至50kDa、或约20至40kDa、或约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，医药组合物含有通过肟键与30kDa的PEG相连接的GH（例如hGH），其中所述肟键在位于对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸35的位置上的对乙酰苯丙氨酸与PEG之间。在一些实施例中，受治疗的个体患有儿科生长激素缺乏症、特发性身材矮小、儿童期发作的成年人生长激素缺乏症、成年期发作的成年人生长激素缺乏症或继发性生长激素缺乏症。
如本文中所述且如所属领域中已知，可以任何合适形式、途径、剂量、频率和持续时间将GH（例如，hGH）投予个体。在一些实施例中，本发明提供一种治疗方法，其包括将有效量的激素组合物投予需要治疗的个体，所述激素组合物含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物相连接的生长激素（GH），其中所述水溶性聚合物为线性聚合物，且其中所述激素组合物是以每隔一天仅约一次，或每3天、4天、5天或6天一次，每周一次，每8天、9天、10天、11天、12天或13天一次，每两周一次，每15天、16天、17天、18天、19天或20天一次，每三周一次，每22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天一次，每月一次或小于约每月一次的频率给药。应了解，投药频率可根据个体或（更通常）治疗专家的判断而改变，且可使用任何频率组合。在一些实施例中，GH组合物是以每周仅约一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的频率投予。在一些实施例中，GH组合物是以每周仅约一次、每两周一次或每月一次的频率投予。在一些实施例中，GH组合物是以每周仅约一次的频率投予。在一些实施例中，GH组合物是以每两周仅约一次的频率投予。在一些实施例中，GH组合物是以每月仅约一次的频率投予。
本发明也提供治疗有效量的另一种活性剂连同本发明的hGH一起的投药。可由所属领域的技术人员基于使用hGH的治疗容易地确定待投予的量。
本发明的医药组合物可用常规方式制造。
实例
提供下列实例来说明（但不限制）所主张的发明。
实例1
此实例描述多种用于选择将非天然编码的氨基酸并入hGH中的优选部位的潜在标准设置中的一种。
此实例展示如何选择hGH多肽中的优选部位，以用于引入非天然编码的氨基酸。将由与受体（hGHbp）细胞外域的两个分子复合的hGH组成的晶体结构3HHR用于确定可引入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的优选位置。利用其它hGH结构（例如，1AXI）检验晶体结构数据集之间的一级和二级结构元素的潜在改变。这些结构的坐标可从蛋白质数据库（PDB）（Bernstein等人J.Mol.Biol.1997,112,第535页）获得，或经由www.rcsb.org上的The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB获得。结构化模型3HHR含有完整成熟的22kDa hGH序列，但残基148至153和C端F191残基除外（由于在晶体结构不规则而将其忽略）。存在两个由C53和C165以及C182和C185形成的二硫桥键。在此实例中所用的序列编号与SEQ ID NO:2中所示的成熟hGH（22kDa变异体）的氨基酸序列相对应。
使用下列标准来估算用于引入非天然编码的氨基酸的各hGH位置：残基（a）不应干扰基于3HHR、1AXI和1HWG（与hGHbp单体或二聚体结合的hGH的结晶学结构）的结构分析的hGHbp结合，（b）不应受丙氨酸或同系物扫描突变的影响（Cunningham等人Science(1989)244:1081-1085和Cunningham等人Science(1989)243:1330-1336），（c）应为表面暴露的且展现与周围残基的范德华力（van der Waals）或氢键键合相互作用为最小，（d）在hGH变异体中应缺失或应为可变的（例如Tyr35、Lys38、Phe92、Lysl40），（e）在经非天然编码的氨基酸取代后将导致保守性变化，（f）可见于高度挠性的区域（包括（但不限于）CD环）中或结构上为刚性的区域（包括（但不限于）螺旋B）中。此外，利用Cx程序（Pintar等人(2002)Bioinformatics,18,第980页）针对hGH分子进行其他计算，以估算各蛋白质原子的凸出程度。因此，在一些实施例中，在（但不限于）hGH的下列位置中的一个或多个位置处将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155（SEQ IDNO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置30、74、103（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸），用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置1前（即，在N端）、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192（即，在蛋白质的羧基端）（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3的相应氨基酸）。在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸）。
在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸）。
在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸）。
在一些实施例中，在包括（但不限于）下列位置的这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置30、74、103（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸）。在一些实施例中，在所述位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置30、35、74、92、103、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应氨基酸）。在一些实施例中，在所述位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物相连接：位置35、92、143、145（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的相应氨基酸）。
一些用于产生hGH拮抗剂的部位包括：位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或在位置1前的添加，或其任何组合（SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它GH序列中的相应氨基酸）。利用促效剂设计的标准（c）-（e）选择这些部位。拮抗剂设计也可包括部位I残基的定点修饰，以增加对hGHbp的结合亲和性。
实例2
此实例详细描述hGH多肽（包括大肠杆菌（E.coli）中的非天然编码的氨基酸）的克隆和表达。此实例也描述一种用于评估经修饰hGH多肽的生物活性的方法。
在美国专利第4,601,980号；第4,604,359号；第4,634,677号；第4,658,021号；第4,898,830号；第5,424,199号和第5,795,745号中详细描述用于克隆hGH和其片段的方法，所述专利是以引用的方式并入本文中。在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中分别显示编码全长hGH或缺少N端信号序列的hGH成熟形式的cDNA。
使用包含正交tRNA（O-tRNA）和正交氨酰基tRNA合成酶（O-RS）的引入翻译系统来表达含有非天然编码的氨基酸的hGH。O-RS优选地使具有非天然编码的氨基酸的O-tRNA氨基酰化。所述翻译系统又响应于所编码的选择密码子，将非天然编码的氨基酸插入hGH中。
表2：O-RS和O-tRNA序列。
Figure BDA0000437277490001841
Figure BDA0000437277490001851
用含有经修饰hGH基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对（对于所要非天然编码的氨基酸为特异性的）的质粒转化大肠杆菌（E.coli）以允许将非天然编码的氨基酸部位特异性地并入hGH多肽中。经转化大肠杆菌（E.coli）（在37℃下于含有0.01至100mM的特定非天然编码的氨基酸的培养基中生长）以高保真度和高效率表达经修饰的hGH。含有非天然编码的氨基酸的经His标记的hGH以内含体或聚集体的形式由大肠杆菌（E.coli）宿主细胞产生。在6M胍HCl中于变性条件下将所述聚集体溶解且亲和纯化。通过在4℃下于50mM TRIS-HC1，pH8.0，40μM CuSO4和2%（w/v）N-十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）中过夜透析进行重折叠。接着将所述材料对20mM TRIS-HC1，pH8.0，100mM NaCl，2mM CaCl2透析，继而移除His标记。参看Boissel等人,(1993)J.Bio.Chem.268:15983-93。用于hGH纯化的方法对于所属领域的技术人员而言为已知的，且是通过SDS-PAGE、西方墨点分析或电喷雾离子阱质谱等来确认。
图6为经纯化hGH多肽的SDS-PAGE。使用ProBond镍螯合树脂（Invitrogen,Carlsbad,CA）经由由制造商提供的标准His标记蛋白纯化程序，继而通过阴离子交换柱来纯化经His标记的突变体hGH蛋白，然后加载至凝胶上。色带1显示分子量标记，且色带2表示未并入非天然氨基酸的N-His hGH。色带3至10含有N-His hGH突变体，其分别在位置Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143和K145中的各位置上包含非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸。
为进一步评估经修饰hGH多肽的生物活性，使用对hGH与其受体相互作用的下游标记进行测量的检定。hGH与其内源性产生的受体的相互作用导致转录家族成员的信号转导子和激活子（STAT5）在人类IM-9淋巴细胞系中发生酪氨酸磷酸化。从IM-9cDNA库中鉴别STAT5的两种形式，STAT5A和STAT5B。参看例如Silva等人,Mol.Endocrinol.(1996)10(5):第508-518页。由于大鼠生长激素或人类催乳激素均不导致可检测的STAT5磷酸化作用，所以IM-9细胞上的人类生长激素受体对于人类生长激素是选择性的。重要的是，大鼠GHR（L43R）细胞外域和具有hGH的G120R有效地竞争hGH刺激的pSTAT5磷酸化。
用本发明的hGH多肽刺激IM-9细胞。人类IM-9淋巴细胞是购自ATCC（Manassas,VA），且使其在补充有丙酮酸钠、青霉素、链霉素（Invitrogen,Carlsbad,San Diego）和10%热失活胎牛血清（Hyclone,Logan,UT）的RPMI1640中生长。将IM-9细胞在检定培养基（不含酚红的RPMI、10mM Hepes、1%热失活的经炭/葡聚糖处理的FBS、丙酮酸钠、青霉素和链霉素）中饥饿一夜，随后在37℃下用12点剂量范围的hGH多肽刺激10分钟。用1%甲醛固定经刺激细胞，之后用90%冰冷甲醇在冰上透化1小时。通过在室温下使用初级磷酸化STAT5抗体（Cell Signaling Technology,Beverly,MA）进行细胞内染色30分钟，接着用PE结合二级抗体染色，从而检测STAT5磷酸化水平。利用FACSArray进行样品采集，用Flowjo软件（Tree Star Inc.,Ashland,OR）分析所采集的数据。根据利用SigmaPlot以平均荧光强度（MFI）相对蛋白质浓度所绘制的剂量响应曲线得到EC50值。
下文表3概述所产生的关于突变体hGH多肽的IM-9数据。使用所述人类IM-9细胞来测试在不同位置处具有非天然氨基酸取代的各种hGH多肽。特定而言，图7，A图显示经His标记的hGH多肽的IM-9数据，且图7，B图显示经His标记的hGH（包含取代Y143的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸）的IM-9数据。使用同样的检定来评估包含非天然氨基酸的PEG化hGH多肽的生物活性。
Figure BDA0000437277490001871
实例3
此实例详细描述含羰基的氨基酸的引入以及随后与含氨基氧基的PEG的反应。
此实例展示一种用于产生hGH多肽的方法，所述hGH多肽中并入含酮基的非天然编码的氨基酸，其随后与分子量大约为5,000的含氨基氧基的PEG发生反应。根据实例1（hGH）的标准所确定的残基35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、120、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155中的各者独立地经具有下列结构的非天然编码的氨基酸取代：
Figure BDA0000437277490001872
用于将对乙酰苯丙氨酸部位特异性地并入hGH中的序列为SEQ ID NO:2（hGH）和SEQ ID NO:4（muttRNA,詹氏甲烷球菌
Figure BDA0000437277490001873
）和16、17或18（TyrRS LW1、5或6）（上文实例2中所述）。
一旦经修饰后，包含含羰基氨基酸的hGH多肽变异体即与以下形式的含氨基氧基的PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为3且N为大约5,000的分子量。使以10mg/mL溶解于25mM MES（Sigma Chemical,St.Louis,MO）pH6.0、25mM Hepes（Sigma Chemical,St.Louis,MO）pH7.0或10mM乙酸钠（Sigma Chemical,St.Louis,MO）pH4.5中的经纯化的含有对乙酰苯丙氨酸的hGH与10至100倍过量的含氨基氧基的PEG反应，接着在室温下搅拌10至16小时（Jencks,W.J.Am.Chem.Soc.1959,81,第475页）。接着将PEG-hGH稀释至合适缓冲液中，以供立即纯化和分析。
实例4
与包括通过酰胺键与PEG相连接的羟胺基团的PEG的结合。
使用实例3中所述的程序使具有下列结构的PEG试剂与含酮基的非天然编码的氨基酸偶合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2，
其中R=甲基，n=4且N为大约20,000的分子量。反应条件、纯化条件和分析条件如实例3中所述。
实例5
此实例详细描述将两种不同的非天然编码的氨基酸并入hGH多肽中。
此实例说明一种用于产生hGH多肽的方法，所述hGH多肽中并入在下列残基中的两个位置处包含酮基官能团的非天然编码的氨基酸：E30、E74、Y103、K38、K41、K140和K145。除了在核酸内的两个不同部位处引入选择密码子以外，按照实例1和2中所述制备hGH多肽。
实例6
此实例详细描述hGH多肽与含酰肼的PEG的结合和随后的原位还原。
根据实例2和3中所述的程序制备其中并入含羰基氨基酸的hGH多肽。一旦经修饰后，具有下列结构的含酰肼PEG即与所述hGH多肽结合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2，
其中R=甲基，n=2且N=10,000的分子量，且X为羰基（C=O）。使经纯化的含有对乙酰苯丙氨酸的hGH以0.1-10mg/mL之间的浓度溶解于25mM MES（SigmaChemical,St.Louis,MO）pH6.0、25mM Hepes（Sigma Chemical,St.Louis,MO）pH7.0或10mM乙酸钠（Sigma Chemical,St.Louis,MO）pH4.5中，使其与1至100倍过量的含酰肼PEG反应，并且通过添加溶解于H2O中的储备1M NaCNBH3（Sigma Chemical,St.Louis,MO）直到10至50mM的最终浓度使相应腙原位还原。在暗处于4℃到室温下反应18至24小时。通过添加1M Tris（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH值为约7.6）直至50mM的最终Tris浓度来中止反应，或将反应物稀释至合适缓冲液中以供立即纯化。
实例7
此实例详细描述将含炔基的氨基酸引入hGH多肽中以及以mPEG-叠氮化物衍生化。
以下残基：35、88、91、92、94、95、99、101、131、133、134、135、136、140、143、145和155各自经下列非天然编码的氨基酸（hGH；SEQ ID NO:2）取代：
Figure BDA0000437277490001891
用于将对炔丙基酪氨酸部位特异性地并入hGH中的序列为SEQ ID NO:2（hGH）、SEQ ID NO:4（muttRNA,詹氏甲烷球菌
Figure BDA0000437277490001892
）和9、10或11（上文实例2中所述）。在大肠杆菌（E.coli）中表达含有炔丙基酪氨酸的hGH多肽，且使用实例3中所述的条件将其纯化。
使经纯化的含有炔丙基酪氨酸的hGH以0.1至10mg/mL溶解于PB缓冲液（100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH=8）中，且将10至1000倍过量的含叠氮基的PEG添加至反应混合物中。接着将催化量的CuSO4和Cu丝添加至反应混合物中。在培养所述混合物（包括（但不限于）室温下或37℃下约4小时，或4℃下过夜）之后，添加H2O且通过透析膜过滤所述混合物。可通过（包括（但不限于））实例3中所述的程序分析此样品的加成。
在此实例中，PEG将具有下列结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3，
其中R为甲基，n为4且N为10,000的分子量。
实例8
此实例详细描述在hGH多肽中大型疏水性氨基酸经炔丙基酪氨酸取代。
存在于hGH下列区域中的一区域内的Phe、Trp或Tyr残基：1-5（N端）、6-33（螺旋A）、34-74（螺旋A与螺旋B之间的区域，A-B环）、75-96（螺旋B）、97-105（螺旋B与螺旋C之间的区域，B-C环）、106-129（螺旋C）、130-153（螺旋C与螺旋D之间的区域，C-D环）、154-183（螺旋D）、184-191（C端）（SEQ ID NO:2），如实例7中所述经下列非天然编码的氨基酸取代：
Figure BDA0000437277490001901
一旦经修饰后，PEG即连接至包含含炔基氨基酸的hGH多肽变异体。所述PEG将具有下列结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，
且偶合程序将遵循实例7中的程序。此将产生包含与天然存在的大型疏水性氨基酸中的一种大致同配（isosteric）的非天然编码的氨基酸的hGH多肽变异体，且其在多肽内的不同部位处经PEG衍生物修饰。
实例9
此实例详细描述为一个或一个以上PEG连接子所隔开的hGH多肽同源二聚体、杂二聚体、同源多聚体或杂多聚体的产生。
使实例7中所制造的含炔基hGH多肽变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3，
其中n为4且PEG具有大约5,000的平均分子量，以产生相应的hGH多肽同源二聚体，其中两个hGH分子实体上为PEG所隔开。以类似的方式，可使hGH多肽与一个或一个以上的其它多肽偶合，以形成杂二聚体、同源多聚体或杂多聚体。将如同实例7和3般进行偶合、纯化和分析。
实例10
此实例详细描述糖类部分与hGH多肽的偶合。
下列残基中的一残基：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187（hGH，SEQ ID NO:2），如实例3中所述经下列非天然编码的氨基酸取代：
一旦经修饰后，包含含羰基氨基酸的hGH多肽变异体，即与N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的β连接氨基氧基类似物反应。将hGH多肽变异体（10mg/mL）和氨基氧基糖类（21mM）在水性100mM乙酸钠缓冲液（pH5.5）中混合，且在37℃下培养7至26小时。通过于环境温度下将糖类结合hGH多肽（5mg/mL）与UDP-半乳糖（16mM）和β-l,4-半乳糖基转移酶（galacytosyltransferase）（0.4单位/mL）一起在150mM HEPES缓冲液（pH7.4）中培养48小时，以酶促方式使第二糖类偶合至第一糖类（Schanbacher等人J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061）。
实例11
此实例详细描述PEG化hGH多肽拮抗剂的产生。
下列残基中的一残基：1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123或127（hGH，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或3中的相应氨基酸），如实例3所述经下列非天然编码的氨基酸取代。
Figure BDA0000437277490001921
一旦经修饰后，包含含羰基氨基酸的hGH多肽变异体就将与以下形式的含氨基氧基的PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为4且N为20,000的分子量，以产生包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽拮抗剂，其在多肽内的单一部位处经PEG衍生物修饰。如同实例3般进行偶合、纯化和分析。
实例12
其中hGH分子为直接连接的hGH多肽同源二聚体、杂二聚体、同源多聚体或杂多聚体的产生
包含含炔基氨基酸的hGH多肽变异体可直接偶合至另一包含含叠氮基氨基酸的hGH多肽变异体，其各自包含在（包括（但不限于））实例10中所述部位上的非天然编码的氨基酸取代。此将产生相应的hGH多肽同源二聚体，其中两个hGH多肽变异体在部位II结合界面处实体连接。以类似的方式，可使hGH多肽偶合至一个或一个以上的其它多肽，以形成杂二聚体、同源多聚体或杂多聚体。如同实例3、6和7般进行偶合、纯化和分析。
实例13
Figure BDA0000437277490001922
使聚亚烃基二醇（P-OH）与烷基卤（A）反应以形成醚（B）。在所述化合物中，n为1至9的整数且R'可为直链或支链、饱和或不饱和C1至C20烷基或杂烷基。R'也可为C3至C7饱和或不饱和环烷基或环状杂烷基、经取代或未经取代的芳基或杂芳基，或经取代或未经取代的烷芳基（所述烷基为C1至C20饱和或不饱和烷基）或杂烷芳基。通常，PEG-OH为具有800至40,000道尔顿（Da）分子量的聚乙二醇（PEG）或单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。
实例14
mPEG-OH+Br-CH2-C=CH→mPEG-O-CH2-C=CH
用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH（mPEG-OH20kDa；2.0g；0.1mmol，Sunbio）。接着将炔丙基溴溶于二甲苯中的80重量%溶液（0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich）和催化量的KI添加至所述溶液中，且将所得混合物加热至回流历时2小时。接着添加水（1mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2（25mL）并将有机层分离，经无水Na2SO4干燥，且将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚（150mL）中。收集所得沉淀，用若干份冷乙醚洗涤并且干燥，以得到炔丙基-O-PEG。
实例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH（mPEG-OH20kDa；2.0g；0.1mmol，Sunbio）。接着将50当量的5-溴基-1-戊炔（0.53mL，5mmol，Aldrich）和催化量的KI添加至所述混合物中。将所得混合物加热至回流历时16小时。接着添加水（1mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2（25mL）且将有机层分离，经无水Na2SO4干燥，且将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚（150mL）中。收集所得沉淀，用若干份冷乙醚洗涤并干燥，以得到相应的炔。在类似反应中可使用5-氯基-1-戊炔。
实例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH十Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CHxC6H40-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
首先向3-羟基苄醇（2.4g，20mmol）于THF（50mL）和水（2.5mL）中的溶液中添加粉末状氢氧化钠（1.5g，37.5mmol），接着添加炔丙基溴溶于二甲苯中的80重量%溶液（3.36mL，30mmol）。将反应混合物回流加热历时6小时。向所述混合物中添加10%柠檬酸（2.5mL）且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯（3×15mL）萃取残余物，且用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤组合有机层，经MgSO4干燥，并且浓缩，以得到3-炔丙基氧基苄醇。
在0℃下将甲烷磺酰氯（2.5g，15.7mmol）和三乙胺（2.8mL，20mmol）添加至化合物3（2.0g，11.0mmol）于CH2Cl2中的溶液中，且将反应物置于冰箱中历时16小时。通常的处理（work-up）得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。使所述油（2.4g，9.2mmol）溶解于THF（20mL）中，且添加LiBr（2.0g，23.0mmol）。将反应混合物加热至回流历时1小时，接着冷却至室温。向混合物中添加水（2.5mL）且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯（3×15mL）萃取残余物，且用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤组合有机层，经无水Na2SO4干燥并浓缩，以得到所要溴化物。
将mPEG-OH20kDa（1.0g，0.05mmol，Sunbio）溶解于THF（20mL）中，且在冰浴中冷却溶液。在剧烈搅拌情况下经过若干分钟的时段添加NaH（6mg，0.25mmol），继而添加上文中所获得的溴化物（2.55g，11.4mmol）和催化量的KI。移除冷却浴，且将所得混合物加热至回流历时12小时。向混合物中添加水（1.0mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2（25mL）且将有机层分离，经无水Na2SO4干燥，且将体积减少至大约2mL。逐滴添加至醚溶液（150mL）得到白色沉淀，将其收集以得到PEG衍生物。
实例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C=CR’→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C=CR'
也可通过将含有末端官能团的聚(乙二醇)聚合物偶合至含有如上文所示的炔基官能团的反应性分子，从而获得含有末端炔基的聚(乙二醇)聚合物。n为1与10之间。R'可为H或C1至C4的小烷基。
实例18
(1)HO2C-(CH2)2-C=CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CN2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸（2.943g，3.0mmol）溶解于CH2Cl2（25mL）中。添加N-羟基丁二酰亚胺（3.80g，3.3mmol）和DCC（4.66g，3.0mmol），且将溶液在室温下过夜搅拌。所得粗NHS酯7不经进一步纯化即用于下步反应。
将具有5,000Da分子量的mPEG-NH2（mPEG-NH2，1g，Sunbio）溶解于THF（50mL）中，且将混合物冷却至4℃。在剧烈搅拌情况下逐份添加NHS酯7（400mg，0.4mmol）。在温至室温的同时允许将混合物搅拌3小时。接着添加水（2mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2（50mL）且将有机层分离，经无水Na2SO4干燥，且将体积减少至大约2mL。将此CH2C12溶液逐滴添加至醚（150mL）。收集所得沉淀且在真空下干燥。
实例19
此实例呈现聚(乙二醇)的甲磺酰酯的制备，所述聚(乙二醇)的甲磺酰酯也可被称为聚(乙二醇)的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯。相应的甲苯磺酸酯和卤化物可通过类似程序制备。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
将150mL甲苯中的mPEG-OH（分子量=3,400，25g，10mmol）在氮气下共沸蒸馏2小时，且将溶液冷却至室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺（15mmol）添加至所述溶液中。在冰浴中冷却所述溶液，且逐滴添加1.2mL的经蒸馏的甲烷磺酰氯（15mmol）。将溶液在室温下于氮气氛中过夜搅拌，且通过添加2mL无水乙醇来中止反应。在真空下将混合物蒸发以移除溶剂（主要为甲苯以外的溶剂），过滤，再次在真空下浓缩，接着沉淀至100mL乙醚中。用若干份冷乙醚洗涤滤液且在真空中干燥，以得到甲磺酸酯。
将甲磺酸酯（20g，8mmol）溶解于75ml THF中，且将溶液冷却至4℃。向经冷却溶液中添加叠氮化钠（1.56g，24mmol）。在氮气下将反应物加热至回流历时2小时。接着蒸发溶剂且用CH2Cl2（50mL）稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机馏分，且经无水MgSO4干燥。将体积减少至20mL，且通过添加到150mL冷的无水醚中使产物沉淀。
实例20
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法制造4-叠氮基苄醇，所述专利是以引用的方式并入本文中。在0℃下将甲烷磺酰氯（2.5g，15.7mmol）和三乙胺（2.8mL，20mmol）添加至4-叠氮基苄醇（1.75g，11.0mmol）于CH2Cl2中的溶液中，且将反应物置于冰箱中历时16小时。通常的处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。使所述油（9.2mmol）溶解于THF（20mL）中，且添加LiBr（2.0g，23.0mmol）。将反应混合物加热至回流历时1小时，接着冷却至室温。向混合物中添加水（2.5mL）且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯（3×15mL）萃取残余物，且用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤组合有机层，经无水Na2SO4干燥且浓缩，以得到所要溴化物。
用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理mPEG-OH20kDa（2.0g，0.1mmol，Sunbio），且将溴化物（3.32g，15mmol）连同催化量的KI一起添加至混合物中。将所得混合物加热至回流历时12小时。向混合物中添加水（1.0mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2（50mL）且将有机层分离，经无水Na2SO4干燥，且将体积减少至大约2mL。逐滴添加至醚溶液（150mL）中得到沉淀，将其收集以得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H（分子量3,400Da，2.0g）溶解于饱和NaHCO3水溶液（10mL）中，且将溶液冷却至0℃。在剧烈搅拌情况下添加3-叠氮基-1-N-羟基丁二酰亚胺基丙酸酯（5当量）。在3小时后，添加20ml H2O且在室温下将混合物再搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节为3，且添加NaCl直至大约15重量%的浓度。用CH2Cl2（100mL×3）萃取反应混合物，经Na2SO4干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物且在真空下干燥，以得到ω-羧基-叠氮化PEG衍生物。
实例22
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
在剧烈搅拌情况下，向乙炔锂于THF中的溶液（4当量）（如所属领域中所知而制备，且经冷却至-78℃）中逐滴添加溶解于THF中的mPEG-OM溶液。在3小时后，允许将反应物温至室温且通过添加1mL丁醇而中止反应。接着添加20mL H2O，且在室温下将混合物再搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节为3，且添加NaCl直至大约15重量%的浓度。用CH2Cl2（100mL×3）萃取反应混合物，经Na2SO4干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物且在真空下干燥，以得到l-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇（mPEG）。
实例23
使用下列文献中所述的方法将含叠氮基的氨基酸和含乙炔基的氨基酸部位选择性地并入蛋白质中：L.Wang等人,(2001),Science292:498-500；J.W.Chin等人,Science301:964-7(2003))；J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society124:9026-9027；J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002),Chem Bio Chem3(11):1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024；和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。一旦并入氨基酸后，即在37℃下，于pH值为8的磷酸盐缓冲液（PB）中，在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg Cu丝的情况下进行与0.01mM蛋白质的环加成反应，历时4小时。
实例24
此实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸（pAF）和m-PEG-羟胺衍生物的合成。
使用先前在Zhang,Z.,Smith,B.A.C,Wang,L.,Brock,A.,Cho,C.&Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)42,6735-6746中所述的程序合成外消旋pAF。
完成下列程序以合成m-PEG-羟胺衍生物。向(N-叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸（0.382g，2.0mmol）和1,3-二异丙基碳二亚胺（0.16mL，1.0mmol）于二氯甲烷（DCM，70mL）中的溶液（其在室温下被搅拌1小时）中添加甲氧基-聚乙二醇胺（m-PEG-NH2，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，购自BioVectra）和二异丙基乙胺（0.1mL，0.5mmol）。将反应产物在室温下搅拌48小时，接着浓缩至约100mL。将混合物逐滴添加至冷醚（800mL）中。使叔丁氧羰基保护产物沉淀析出，并通过过滤收集，用醚（3×100mL）洗涤。通过在DCM（100mL）中再溶解和在醚（800mL）中沉淀两次将其进一步纯化。在真空中干燥，得到7.2g（96%）产物，此通过NMR和Nihydrin测试确认。
于0℃下在50%TFA/DCM（40mL）中进行上面所获得的受保护产物（7.0g）的去叔丁氧羰基反应历时1小时，接着于室温下进行1.5小时。在真空中移除大多数TFA后，通过将二噁烷（1mL）中的4N HCl添加至残余物中而使羟胺衍生物的TFA盐转化为HCl盐。将沉淀溶解于DCM（50mL）中，且在醚（800mL）中再次沉淀。通过过滤收集最终产物（6.8g，97%），用醚（3×100mL）洗涤，在真空中干燥，将其储存在氮气下。使用相同程序合成其它PEG（5K，20K）羟胺衍生物。
实例25
此实例描述用于包含非天然氨基酸的hGH多肽的表达方法和纯化方法。已用正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和hGH构建物转化宿主细胞。
使来自经转化DH10B（fis3）细胞的冷冻甘油储备物的少许穿刺培养物（stab）首先于37℃下在具有100μg/ml氨苄青霉素（ampicillin）的2ml确定成分培养基（补充有亮氨酸、异亮氨酸、痕量金属和维生素的葡萄糖基本培养基）中生长。当OD600达到2至5时，将60μl转移至60ml具有100μg/ml氨苄青霉素的新鲜确定成分培养基中，且再次在37℃下生长至2至5的OD600。将50ml培养物转移到5升发酵罐（Sartorius BBI）中的2升具有100μg/ml氨苄青霉素的确定成分培养基中。以碳酸钾将发酵罐pH值控制在pH6.9，温度控制在37℃，空气流动速率为5lpm，且用聚亚烷基消泡剂KFO Fl19（Lubrizol）控制泡沫。自动调节搅拌器的速度以维持溶解氧水平大于30%，且如果搅拌器的速度达到其最大值，那么使用纯氧气来补充空气喷射。在37℃下8小时后，以指数级的增加率馈入确定成分培养基50倍浓度的培养物，以维持0.15小时-1的特定生长率。当OD600达到大约100时，添加对乙酰苯丙氨酸的外消旋混合物至3.3mM的最终浓度，且将温度降至28℃。在0.75小时后，添加异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷至0.25mM的最终浓度。使细胞在28℃下再生长8小时，粒化，且在-80℃下冷冻直至进一步处理。
使用ProBond镍螯合树脂（Invitrogen,Carlsbad,CA），经由由Invitrogen的说明书所提供的标准His标记蛋白纯化程序，继而通过阴离子交换柱，来纯化经His标记的突变体hGH蛋白。
将经纯化的hGH浓缩至8mg/ml，且将缓冲液改为反应缓冲液（20mM乙酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，pH4.0）。以20:1的PEG:hGH摩尔比将MPEG-羟基胺粉末添加至hGH溶液中。在28℃加以轻柔振荡的情况下进行反应历时2天。经由阴离子交换柱自未反应的PEG和hGH纯化PEG-hGH。
通过三种检定来评估各PEG化突变体hGH的品质，然后进入动物实验。通过在非还原性条件（Invitrogen）下用MES SDS电泳缓冲液进行4%至12%丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝胶电泳来检验PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝（Coomassie blue）将凝胶染色。根据光密度分析扫描，PEG-hGH带的纯度大于95%。通过动力学LAL检定使用购自Charles River Laboratories（Wilmington,MA）的KTA2套组来测试各PEG-hGH的内毒素水平，且其为小于5EU/剂量。使用IM-9pSTAT5生物检定（在实例2中提及）评估PEG-hGH的生物活性，且EC50值为小于15nM。
实例26
此实例描述用于评估包含非天然氨基酸的hGH多肽的纯化和均质性的方法。
图8为在位置92上包含非天然氨基酸的hGH多肽的SDS-PAGE。凝胶的色带3、4和5显示在位置92上包含共价连接至5kDa、20kDa或30kDa PEG分子的对乙酰苯丙氨酸的hGH。在图11中显示其它包含非天然氨基酸的PEG化hGH多肽。将5μg的各PEG-hGH蛋白质加载至各SDS-PAGE上。图11，A图：色带1，分子量标记；色带2，WHO rhGH参比标准（2μg）；色带3和7，30KPEG-F92pAF；色带4，30KPEG-Y35pAF；色带5，30KPEG-R134pAF；色带6，20KPEG-R134pAF；色带8，WHO rhGH参比标准（20μg）。图11，B图：色带9，分子量标记；色带10，WHO rhGH参比标准（2μg）；色带11，30KPEG-F92pAF；色带12，30KPEG-K145pAF；色带13，30KPEG-Y143pAF；色带14，30KPEG-G131pAF；色带15，30KPEG-F92pAF/G120R；色带16，WHO rhGH参比标准（20μg）。图9显示PEG化hGH多肽（5kDa、20kDa或30kDa）在IM-9细胞中的生物活性；方法是如实例2中所述执行。
hGH-PEG结合物的纯度可通过蛋白水解降解（包括（但不限于）胰蛋白酶裂解）继而进行质谱分析来评估（Pepinsky RB.,等人,J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)）。用于进行胰蛋白酶消化的方法也在European Pharmacopoeia(2002)第四版，第1938页中有描述。对所述方法进行修改。将样品在50mM TRIS-HC1（pH7.5）中过夜透析。以66:1的质量比将rhGH多肽与胰岛素（经TPCK处理的胰蛋白酶，Worthington）一起在37℃水浴中培养4小时。将样品在冰上培养若干分钟，以中止消化反应且随后在HPLC分析期间维持在6℃。将经消化的样品（约200μg）加载至0.1%三氟乙酸中的25×0.46cm Vydac C-8柱（5μm粒径，
Figure BDA0000437277490001991
孔径）上，且在30℃下用0至80%梯度的乙腈经70分钟以1ml/分钟的流动速率洗脱。通过214nm下的吸光率监测胰蛋白酶肽的洗脱。
图10，A图图示hGH的一级结构，其中指示胰蛋白酶裂解部位并且用箭头说明非天然的氨基酸取代F92pAF（根据Becker等人Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4):326-337修改所得的图）。B图显示由包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽产生的肽（30K PEG His6-F92pAF rhGH，标记为A）、由包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽产生的肽（His6-F92pAF rhGH，标记为B）和由野生型hGH产生的肽（WHO rhGH，标记为C）的叠加的胰蛋白酶图。WHO rhGH和His6-F92pAF rhGH的胰蛋白酶图的比较仅显示两个峰移位（肽峰1和肽峰9），而其余的峰是相同的。这些差异是由在经表达His6-F92pAF rhGH的N端上His6的加成所引起的，其导致峰1移位；而峰9的移位是由残基92上经对乙酰苯丙氨酸取代而引起的。C图显示对来自B图的峰9的放大。His6-F92pAF与30K PEG His6-F92pAF rhGH胰蛋白酶图的比较显示在His6-F92pAF rhGH的PEG化后峰9消失，由此确认所述修饰对于肽9为特异性的。
实例27
此实例描述由各自包含非天然氨基酸的两个hGH多肽所形成的同源二聚体。
图12将在位置92上包含对乙酰苯丙氨酸取代的经His标记的hGH多肽和与具有实例25中所述用于hGH的PEG化的官能团和反应性的双官能性连接子连接在一起的此经修饰多肽的同源二聚体的IM-9检定结果进行比较。
实例28
此实例描述充当hGH拮抗剂的单体和二聚体hGH多肽。
其中将G120R取代引入部位II中的hGH突变型蛋白能够与单hGH受体结合，但不能使两个受体二聚。所述突变型蛋白可能通过在不活化细胞内发信路径的情况下占据受体部位，从而充当活体外的hGH拮抗剂（Fuh,G.等人Science256:1677-1680(1992)）。图13，A图显示测量通过具有G120R取代的hGH使pSTAT5磷酸化的IM-9检定数据。如图13，B图中所示，具有相同位置（G120）处并入的非天然氨基酸的hGH多肽导致也可充当hGH拮抗剂的分子。将图13，B图中所示的hGH拮抗剂的二聚体构建为与具有实例25中所述用于hGH的PEG化的官能团和反应性的双官能性连接子连接在一起。图14显示此二聚体在IM-9检定中也缺少生物活性。
进行其它检定以比较包含G120pAF取代的hGH多肽与通过PEG连接子连接的经G120pAF修饰hGH多肽的二聚体。剂量响应范围内的单体和通过pEG连接子所连接的二聚体竞争WHO hGH诱导的STAT5磷酸化。也进行表面受体竞争研究，以显示单体和二聚体与GH竞争在IM-9和大鼠GHR（L43R）/BAF3细胞上的细胞表面受体结合。所述二聚体充当比单体更有效的拮抗剂。
表4显示来自所述研究的数据。
Figure BDA0000437277490002001
Figure BDA0000437277490002011
实例29
此实例详细描述hGH活性和hGH多肽对于hGH受体亲和性的测量。
大鼠GH受体的克隆和纯化将大鼠GH受体的细胞外域（GHR ECD，氨基酸S29-T238）克隆至pET20b载体（Novagen）的与C端6His标记同框的Nde I和Hind III部位之间。引入L43至R的突变以进一步接近人类GH受体结合部位（Souza等人,ProcNatl Acad Sci U S A.(1995)92(4):959-63）。通过在30℃下以0.4mM IPTG诱导4至5小时，从而在BL21（DE3）大肠杆菌（E.coli）细胞（Novagen）中产生重组蛋白。将细胞溶解后，通过在具有30mL的50mM Tris（pH7.6）、100mM NaCl、1mM EDTA、1%Triton X-100的杜恩斯组织匀浆器（dounce）中再悬浮而洗涤四次，且用相同缓冲液（不含Triton X-100）洗涤两次。在此，内含体由95%以上的GHR ECD组成，且使其溶解于0.1M Tris（pH11.5）、2M尿素中。借助于使内含体溶液的等分试样通过S100（Sigma）凝胶过滤柱（经50mM Tris（pH7.8）、1M L-精氨酸、3.7mM胱胺、6.5mM半胱胺平衡），从而完成重折叠。使含有可溶性蛋白质的流分组合且对50mM Tris（pH7.6）、200mM NaCl、10%甘油透析。简短地将样品离心分离以移除任何沉淀，且根据制造商说明书用Talon树脂（Clontech）的等分试样培养。在用补充有5mM咪唑的20体积透析缓冲液进行洗涤后，在透析缓冲液中用120mM咪唑洗脱蛋白质。最终，将样品对于50mM Tris（pH7.6）、30mM NaCl、1mM EDTA、10%甘油过夜透析，简短地离心分离以移除任何沉淀，调节至20%的最终甘油浓度，在-80℃下等分和存储。使用经计算的消光系数ε=65,700M-1*μm-1通过OD（280）测量蛋白质浓度。
GH至GHR的结合的Bio coreTM分析
使用如制造商所推荐的标准胺偶合程序，将大约600至800RU的可溶性GHR ECD固定于BiacoreTMCM5芯片上。即使大部分受体通过此技术失活，由实验方法发现这种程度的固定化也足以产生约100至150RU的最大特异性GH结合响应，且在结合动力学上无显著变化。参看例如Cunningham等人J Mol Biol.(1993)234(3):554-63和WellsJA.Proc Natl Acad Sci USA(1996)93(1):1-6)。
将HBS-EP缓冲液（BiacoreTM，Pharmacia）中各种浓度的野生型突变体GH（0.1至300nM）以40μl/分钟的流动速率历时4至5分钟注射于GHR表面上，且在注射后对分裂监测15分钟。通过15秒脉冲的4.5M MgCl2使表面再生。在至少100次再生循环后仅观测到最小的的结合亲和性损失（1%至5%）。未固定受体的参比细胞用于扣除任何缓冲液体积效应和非特异性结合。
使用BiaEvaluation4.1软件（BIACORETM）来处理由GH滴定实验获得的动力学结合数据。“二价分析物”联合模型提供令人满意的配置（fit）（chi2值通常低于3），与建议的连续1:2（GH:GHR）二聚作用相符（Wells JA.Proc Natl Acad Sci U S A(1996)93(1):1-6）。将平衡分裂常数（Kd）作为个别比率常数（koff/kon）计算。
表5显示使用固定于CM5芯片上的大鼠GHR ECD（L43R）来自BiacoreTM的结合参数。
Figure BDA0000437277490002021
Figure BDA0000437277490002031
GHR稳定细胞系
使IL-3依赖性小鼠细胞系（BAF3）以常规方式在RPMI1640、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、10%热失活胎牛血清、50μM2-巯基乙醇和作为IL-3源的10%WEHI-3细胞系经调节培养基中通过。所有细胞培养物均保持在37℃下5%CO2的潮湿气氛中。
使用BAF3细胞系建立大鼠GHR（L43R）稳定细胞克隆，2E2-2B12-F4。简而言之，用15μg含有全长大鼠GHR（L43R）cDNA的线性化pcDNA3.1质体使1×107个中度融合的BAF3细胞电极化。允许经转染细胞恢复48小时，接着通过在含有800μg/ml G418和5nM WHO hGH的培养基中限制性稀释进行克隆。GHR表达转染子通过用抗人类GHR抗体（R&D Systems,Minneapolis,MN）的表面染色来识别，且在FACS Array（BDBiosciences,San Diego,CA）上分析。接着根据对BrdU增殖检定（如下文中所述）中WHO hGH的增殖活性来筛选表达良好GHR等级的转染子。稳定转染的大鼠GHR（L43R）细胞克隆建立于所要转染子在1.2mg/ml G418和5nM hGH存在下、具有表面受体表达和增殖能力的恒定外形的另外两轮重复亚克隆。由此建立的细胞克隆（2E2-2B12-F4）以常规方式保存于BAF3培养基（在无hGH的情况下加上1.2mg/mlG418）中。通过BrdU标记的增殖
将血清饥饿大鼠GHR（L43R）表达BAF3细胞系（2E2-2B12-F4）以5×104个细胞/孔的密度涂于96孔盘中。用12点剂量范围的hGH蛋白使细胞活化，且同时用50μMBrdU（Sigma,St.Louis,MO）进行标记。培养48小时后，在室温下用100μl的BD细胞固定/细胞透化（cytofix/cytoperm）溶液（BD Biosciences）使细胞固定/透化30分钟。为暴露BrdU抗原决定基，在37℃下用30μg/孔的Dnase（Sigma）将经固定/透化的细胞处理1小时。使用APC结合抗BrdU抗体（BD Biosciences）的萤光免疫检验染色实现在FACS Array上的样品分析。
表6显示如pSTAT5（IM-9）和BrdU增殖检定中所概述的PEG hGH突变体的生物活性。对于检定之间的比较，WHO hGH表达为一致的。
Figure BDA0000437277490002032
Figure BDA0000437277490002041
实例30
此实例描述用于测量PEG化hGH的活体外和活体内活性的方法。
细胞结合检定
在不存在或存在各种浓度（体积：10μl）未标记GH、hGH或GM-CSF的情况下，且在存在125I-GH（大约100,000cpm或1ng）的情况下，于0℃下将两份细胞（3×l06）在PBS/1%BSA（100μl）中培养90分钟（总体积：120μl）。接着使细胞在350μl塑料离心分离管中通过200μl冰冷FCS重新悬浮和分层，且离心分离（1000g；1分钟）。通过切断管的末端来收集小球，且在γ计数器（Packard）中对小球和上清液独立计数。
按照无竞争者存在下的总结合（复制品的平均值）减去100倍过量未标记GH存在下的结合（非特异性结合）（cpm）来测定特异性结合（cpm）。对所用的各细胞类型测量非特异性结合。使用相同制备的125I-GH在不同天进行实验，且应显示内在一致性。125I-GH说明与产生GH受体的细胞的结合。所述结合以视剂量而定的方式受未标记天然GH或hGH限制，但不受GM-CSF或其它消极控制限制。hGH竞争天然125I-GH（类似于天然GH）结合的能力暗示，受体可同等地充分识别两种形式。
PEG化hGH的活体内研究
对小鼠或大鼠投予PEG-hGH、未经修饰hGH和缓冲溶液。结果将显示本发明的PEG化hGH相较于通过显著增加体重而展现的未经修饰hGH而言优越的活性和持久的半衰期。
结合和非结合hGH和其变异体在活体内半衰期的测量。
所有动物实验均在AAALAC认可的设备中和St.Louis University的InstitutionalAnimal Care and Use Committee认可的协议下进行。大鼠单独地居住于具有12小时明/暗循环室内的笼子中。为动物提供经检定的Purina饲料5001和无限量的水。对于切除垂体的大鼠，饮用水额外地含有5%葡萄糖。
药物代谢动力学研究
通过三种检定来评估PEG化突变体hGH的品质，随后进入动物实验。通过在非还原性条件（Invitrogen,Carlsbad,CA）下用MES SDS电泳缓冲液进行4%至12%丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶电泳来检验PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝（Coomassie blue）将凝胶染色。根据光密度分析扫描，PEG-hGH带的纯度大于95%。通过动力学LAL检定使用购自Charles River Laboratories（Wilmington,MA）的KTA2套组来测试各PEG-hGH的内毒素水平，且其小于5EU/剂量。使用IM-9pSTAT5生物检定（在实例2中所述）评估PEG-hGH的生物活性，且EC50值经确认小于15nM。
将经PEG修饰的生长激素化合物的药物代谢动力学彼此比较，且与从Charles RiverLaboratories获得的雄性Sprague-Dawley大鼠（261至425g）体内的非PEG化生长激素进行比较。以外科手术方式在颈动脉中安装导管，用于血液收集。在成功的导管安装之后，将动物分配至治疗组（每组3至6只），随后给药。按照1mg/kg化合物（以剂量体积计为0.41-0.55ml/kg）对动物皮下给药。在多个时间点经由留置导管采集血样，且采集至涂覆EDTA的微离心管中。在离心分离后采集血浆，且在-80℃下存储直至分析。使用购自BioSource International（Camarillo,CA）或Diagnostic Systems Laboratories（Webster,TX）的抗体夹心生长激素ELISA套组测量化合物浓度。使用与给药类似物相应的标准计算浓度。使用建模程序WinNonlin（Pharsight，4.1版）估算药物代谢动力学参数。使用具有线性增加/对数减少（linear-up/log-down）梯形积分的无间隔分析，且对浓度数据均一地加权。
图15显示在大鼠体内单次皮下给药后的平均（+/-S.D.）血浆浓度。对大鼠（n=每组3至4）提供1mg/kg hGH野生型蛋白（WHO hGH）、经His标记hGH多肽（his-hGH）或在位置92上包含共价连接至30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸的经His标记hGH多肽（30KPEG-pAF92(his)hGH）的单次大丸剂剂量。根据所指示的时间间隔和采集血浆样品，且检定所述的注射化合物。30KPEG-pAF92(his)hGH具有相较于控制hGH而言显著扩展的循环。
图16显示在大鼠体内单次皮下给药后的平均（+/-S.D.）血浆浓度。对大鼠（n=每组3至6）提供1mg/kg蛋白质的单次大丸剂剂量。将在6个不同位置中的各位置上包含共价连接至30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸的hGH多肽与WHO hGH和(his)-hGH进行比较。根据所指示的时间间隔和采集血浆样品，且检定所述的注射化合物。表7显示图16中所示hGH多肽单剂量投药的药物代谢动力学参数值。通过无间隔分析（Pharsight，4.1版）估算浓度相对时间的曲线。所示值为平均值（+/-标准偏差）。Cmax：最大浓度；terminal t1/2：末端半衰期；AUC0->inf：在外推至无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均停留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：未期期间分布的表观体积。
表7：对普通雄性Sprague-Dawley大鼠单剂量1mg/kg大丸剂皮下投药的药物代谢动力学参数值。
Figure BDA0000437277490002061
药效研究
从Charles River Laboratories获得切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠。在3至4周大时以外科手术方式切除垂体。允许动物适应3周的时段，在此期间监测体重。将研究开始前7天时段内具有0至8g体重增加的动物包括于其中，且随机分至治疗组。对大鼠皮下投予大丸剂剂量或日剂量。在整个研究期间，每日依序地将大鼠称重、麻痹、抽血和给药（当合适时）。使用经肝素化的毛细管从眶窦采血，且将血样置于经EDTA涂覆的微离心管中。通过离心分离分离血浆且在-80℃下保存直至分析。
图17显示在切除垂体的大鼠体内单次皮下给药后的平均（+/-S.D.）血浆浓度。对大鼠（n=每组5至7）提供2.1mg/kg蛋白质的单次大丸剂剂量。显示来自在两个不同位置（位置35、92）中各位置上包含共价连接至30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸的hGH多肽的结果。根据所指示的时间间隔和采集血浆样品，且检定所述的注射化合物。
肽IGF-1为生长调节素或类胰岛素生长因子的家族成员。IGF-1介导生长激素的多种促生长效应。针对所提供的大鼠/小鼠IGF-1标准物（Diagnosic Systems Laboratories）使用竞争结合酶免疫检定套组来测量IGF-1浓度。通过t测试使用双尾分布（不成对、等方差）来测定显著差异。图18，A图显示切除垂体的大鼠体内化合物的评估。对大鼠（n=每组5至7只）皮下提供单次剂量或日剂量。每日依序将动物地称重、麻醉、抽血和给药（当合适时）。显示对于安慰剂治疗、野生型hGH（hGH）、经His标记的hGH（(his)hGH）和在位置35和92上包含共价连接至30kDa PEG的对乙酰苯丙氨酸的hGH多肽治疗的体重结果。图18，B图——显示在包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH多肽单次剂量投药后，对于循环血浆IGF-1水平的影响的图。线条表示标准偏差。在图18，A图中，30KPEG-pAF35(his)hGH化合物在第9天的体重增加在统计上不同于(p<0.0005)30KPEG-pAF92(his)hGH化合物（在其中观测到更大体重增加）。
图18，C图显示切除垂体的大鼠体内化合物的评估。对大鼠（n=每组11）皮下提供大丸剂剂量或日剂量。每日依序地将动物称重、麻醉、抽血和给药（当合适时）。对于安慰剂治疗、野生型hGH（hGH）和在位置92、134、145、131和143上包含共价连接至30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸的hGH多肽显示体重结果。图18，图D——图表显示相较于安慰剂治疗和野生型hGH而言，在包含非天然编码的氨基酸（位置92、134、145、131、143）的PEG化hGH多肽单次剂量投药后对于循环血浆IGF-1水平的影响。图18，图E显示对应于包含非天然编码的氨基酸（位置92、134、145、131、143）的PEG化hGH多肽的平均（+/-S.D.）血浆浓度。根据所指示的时间间隔和采集血浆样品，且检定所述的注射化合物。线条表示标准偏差。
实例31
包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH的安全性和/或效能的人体临床试验。
目的对皮下投予的包含非天然编码的氨基酸的PEG化重组人类hGH与一种或一种以上市售hGH产品（包括（但不限于）HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM（Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono））的安全性和药物代谢动力学进行比较。
患者将18名年龄在20与40岁之间、体重在60与90kg之间的健康志愿者加入研究中。受检者对于血液或血浆化学以及尿毒物学筛检、HIV筛检和B型肝炎表面抗原将没有任何临床上显著的异常实验值。其不应具有下列任何迹象：高血压；任何原发性血液病的病史；显著肝病、肾病、心血管病、胃肠病、泌尿生殖病、新陈代谢病、神经病的病史；贫血症或癫痫（seizure disorder）的病史；对于细菌或哺乳动物衍生产物、PEG或人类血清白蛋白的已知敏感；习惯性大量饮用含咖啡因的饮料；参与任何其它临床试验或曾在开始研究30天内进行输血或献血；曾在开始研究3个月内暴露于hGH；曾在开始研究7天内患病；以及对于研究前的体检或开始研究14天内的临床实验室评估具有显著异常性。所有受检者对于安全性均为可评估的，且如期采集用于药物代谢动力学分析的所有血液采样。所有研究均根据institutional ethics committee认可和患者同意而进行。
研究设计此将为对于健康男性志愿者的阶段I、单中心、开放标记、随机分组、二阶段交叉研究。将18名受检者随机地分配为两个治疗序列组（9名受检者/组）。使用等剂量的包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH和所选择的市售产品，经过两个独立的给药阶段将GH作为大丸剂在大腿上部皮下注射。市售产品的投药剂量和频率应如包装标签所指示。通过包括额外的受检者组可将使用市售产品的额外给药、给药频率或其它所要参数添加至研究中。通过14天的淘汰（washout）期分隔各给药阶段。在每两个给药阶段之前的12小时和之后的72小时内将受检者限制于研究中心内，但在给药阶段之间不作限制。如果对于PEG化hGH还存在额外给药、频率或其它参数需要测试，那么可添加额外的受检者组。经认可为人类使用的多种GH配方可用于此研究。HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM（Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono）为经认可为人类使用的市售GH产品。hGH的实验配方为包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH。
血液采样通过投予hGH前后的直接静脉穿刺连续抽血。在给药（3基线样品）之前约30、20和10分钟以及给药之后的下列大约时间获得用于测定血清GH浓度的静脉血样（5mL）：30分钟以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时。将各血清样品分为两份等分试样。所有血清样品均在-20℃下存储。在干冰上装载血清样品。在第1天的初始给药之前（立即）、第4天早晨、第16天给药之前（立即）和第19天早晨进行空腹临床实验室测试（血液学、血清化学性质和尿分析）。
生物分析方法ELISA套组程序（Diagnostic Systems Laboratory[DSL],Webster TX）用于测定血清GH浓度。
安全性测定在每次给药（第1天和第16天）前以及每次给药后6、24、48和72小时记录生命征象。安全性测定是以不良事件的发生率和类型以及临床实验室测试相较于基线的变化为依据的。另外，对相较于研究之前在生命征象测量（包括血压）和体检结果中的变化进行评估。
数据分析通过用各给药之后的值减去平均基线GH浓度（通过对来自给药前30、20和10分钟采集的三份样品的GH含量取平均值而测定），对给药后的血清浓度值校正给药前的基线GH浓度。如果给药前血清GH浓度低于检定的量化含量，那么其不包括在平均值的计算中。由已校正给药前的基线GH浓度的血清浓度数据测定药物代谢动力学参数。通过模型独立方法在Digital Equipment Corporation VAX8600计算机系统上使用最新版本的BIOAVL的软件计算药物代谢动力学参数。测定下列药物代谢动力学参数：峰值血清浓度（Cmax）；至峰值血清浓度的时间（tmax）；利用梯形积分规则计算的从0到最后血液采样时间（AUC0-72）的浓度-时间曲线下的面积；和经由消除率常数计算的末端消除半衰期（t1/2）。通过对数-线性浓度-时间曲线的末端线性区域中连续数据点的线性回归来估算消除率常数。对于各治疗计算药物代谢动力学参数的平均值、标准偏差（SD）和变差系数（CV）。计算参数平均值的比例（防腐配方/非防腐配方）。
安全性结果不良事件的发生率在治疗组中平均分布。不存在相较于基线或研究前临床实验室测试或血压的临床上显著变化，且不存在相较于研究前关于体检结果和生命征象测量的明显变化。两个治疗组的安全性概况应表达为相似。
药物代谢动力学结果在所测量的各时间点上将所有18名受检者服用单次剂量的一种或一种以上市售hGH产品（包括（但不限于）HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM（Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono））后的平均血清GH浓度-时间概况（未校正基线GH含量）与包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH进行比较。所有受检者应具有正常生理范围内的给药前基线GH浓度。由已校正给药前平均基线GH浓度的血清数据测定药物代谢动力学参数，且测定Cmax和tmax。所选择临床比较仪（HumatropeTM（Eli Lilly&Co.）、NutropinTM（Genentech）、NorditropinTM(Novo-Nordisk）、GenotropinTM（Pfizer）和Saizen/SerostimTM（Serono））的平均tmax显著短于包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH的平均tmax。相较于包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH的末端半衰期，市售hGH产品的末端半衰期值显著更短。
尽管本研究在健康男性受检者中进行，但在其它患者群体中也可预期类似的吸收特征和安全性概况；诸如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、自体贮存式程序中的患者或预定进行选择性外科手术的患者。总之，经皮下投予的单剂量包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH将为安全的，且健康男性受检者对其有良好耐药力。根据比较性不良事件的发生率、临床实验室值、生命征象和体检结果，市售形式的hGH和包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH的安全性概况将相等。包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH潜在地为患者和保健提供者提供较大临床效用。
实例32
在下列实例中，ahGH和PEG-ahGH分别为hGH和在位置35上具有对乙酰苯丙氨酸的SEQ ID NO:2的PEG化hGH，且在所述PEG化hGH中PEG通过以对乙酰苯丙氨酸所形成的肟键连接，其中PEG为线性30kDa PEG。
STAT5磷酸化检定
hGH与其受体的相互作用导致信号转导物和转录家族成员激活物（STAT5）在人类IM-9淋巴细胞系中的酪氨酸磷酸化。通过用浓度渐增的ahGH和PEG-ahGH活化IM-9细胞，继而对磷-STAT5细胞内萤光免疫检验法染色，从而测定ahGH和PEG-ahGH的浓度（要求50%最大STAT5磷酸化（EC50））。根据世界卫生组织WHO）标准hGH的EC50作为1.0，测出ahGH相较于WHO hGH的相对EC50为1.1，而PEG-ahGH的相对EC50为10.9。
实例33：
增殖检定
借助于响应生长激素而增殖的细胞系在活体外测定PEG-ahGH活性。所述细胞系的一个实例为称作2E2-2B12-F4的大鼠GHR[L43R]/BAF3细胞克隆，其为通过使用大鼠GHR（在位置43上具有Leu至Arg的取代）稳定转染小鼠BAF3细胞所产生的细胞系。大鼠受体中Leu-43至Arg-43的转化使得大鼠GHR更“与人类相似”，且因此实现有效hGH结合。采用活化分离大鼠GHR[L43R]/BAF3细胞的溴脱氧尿苷（BrdU）标记来提供一种用于生长激素诱导增殖定量的高分离度、无辐射性方法。将WHO hGH的EC50设定为一致，测出ahGH和PEG-ahGH相较于WHO hGH的EC50分别为1.06±0.29（n=11）和5.37±1.23（n=9）。
实例34.
PEG化hGH的效能研究
在生长激素缺乏的大鼠模型中进行临床前的效能研究。在所述模型中，于大约4周大时以外科手术方式切除垂体腺。在术后监测这些切除垂体大鼠的体重，将研究开始前7天时段内显示小于7.5g体重增加的动物视为成功切除垂体的，且将其随机分入治疗组。将显示大于2.5g体重减少的动物视为不健康的，且排除在研究之外。大约在术后3周开始所述研究。
每周用安慰剂或渐增的PEG-ahGH剂量对动物给药（即，在第0天和第7天给药）。一个额外治疗组每天服用健豪宁（genotropin）或安慰剂。每天在给药前对体重和血液采样。所有动物在第14天死亡。图28显示整个研究期间的血浆IGF-1水平。观测到稳固的、视剂量而定的IGF-1增加。
在每次给药间隔后观测到IGF-1Cmax视剂量而定的增加。从第一次给药开始的Cmax值的曲线拟合将最小（Eo）和最大（Emax）IGF-1Cmax分别估算为136.7和1,136.2ng/mL，且测出ED50为0.136mg/kg（表8）。
血浆IGF-1水平也显示在表达为AUC时明显的视剂量而定的增加。对于此参数而言，将AUC表达为高于有效IGF-1血浆水平的AUC。先前的工作显示，基线以上34ng/mL的持续IGF-1浓度导致切除垂体大鼠的体重增加。在当前研究中，贯穿所述研究从安慰剂组测定的基线IGF-1水平为128ng/mL。128ng/mL以上34ng/mL的增量估算为162ng/mL的有效IGF-1水平。因此162ng/mL以上的AUC是完整的。通过此分析，在每次给药间隔后观测到在有效水平以上的视剂量而定的AUC增加。从第一次给药开始的AUC值的曲线拟合将Eo和Emax IGF-1AUC分别估算为0和5,029.8ngXhr/mL，且测出所述参数的ED50为0.909mg/kg（表8）。
测定IGF-1水平在第一次给药后的估算有效水平以上的诱导持续时间。在较高剂量下，IGF-1水平在第二次给药前未返回基线。在这些情况下，使用经计算的末端斜率将IGF-1浓度外推至有效水平。通过此估算，IGF-1浓度在有效水平以上的持续时间视剂量而定的增加是显而易见的。曲线拟合将最小和最大持续时间分别估算为0和8.84天，且测出所述参数的ED50为0.173mg/kg（表8）。
将骨生长用作额外药效量度来计算PEG-ahGH ED50。在研究结束时从各动物采集胫骨，且浸液固定于10%经中性缓冲的福尔马林（formalin）中，继而进行放射线照相。在图29中显示结果。经PEG-ahGH治疗的动物的胫骨长度存在明显的视剂量而定的增加。此外，相较于每天经健豪宁治疗的动物而言存在剂量节约效应。经7天的时间间隔所投予的健豪宁的量等于每周（即，第0天和第7天）提供的2.1mg/kg的PEG-ahGH。对于0.42至1.0mg/kg的PEG-ahGH显示与健豪宁类似的胫骨长度增加的诱导。这对于PEG-ahGH而言表示相较于健豪宁大于或等于50%的剂量节约效应。
PEG-ahGH也诱导体重视剂量而定的增加（图30）。此外，如同胫骨长度增加的诱导，PEG-ahGH优于健豪宁的剂量节约效应是显而易见的。使用0.3mg/kg/天的健豪宁每日治疗诱导起始于第0天在第14天27.74（+/-7.92）%的体重变化。以与GH相等量投予的PEG-ahGH（即2.1mg/kg在第0天和第7天）诱导相较于健豪宁更大的体重增加。此剂量的PEG-ahGH导致起始于第0天在第14天33.66（+/-7.55）%的体重变化。通过以1.0mg/kg较低剂量在第0天和第7天投予的PEG-ahGH所诱导体重百分比变化诱导在第14天27.02（+/-3.97）%的体重变化。此导致对于PEG-ahGH近似50%的剂量节约效应。每周2.1mg/kg剂量的非PEG化GH投药无法诱导体重增加。
第14天体重百分比变化的曲线拟合将最小和最大体重百分比变化（由PEG-ahGH诱导）分别估算为7.17和50.65。通过此曲线，测出所述参数的ED50为1.097mg/kg（表8）。
表8.使用PEG-ahGH的效能研究结果
Figure BDA0000437277490002121
对于采集以用于IGF-1浓度测定的相同血浆样品也用于检定PEG-ahGH浓度。所用ELISA检定是专用于hGH的，其对于PEG-ahGH显示较低但仍稳固的响应，且不用于检测大鼠GH。在图31中显示PEG-ahGH血浆浓度-时间图。发生视剂量而定的PEG-ahGHCmax增加。PEG-ahGH在循环中的持续时间以及总PEG-ahGH AUC以视剂量而定的方式增加。每日投予的健豪宁在血浆中不可检测，可能是因为快速清除。PEG-ahGH暴露结果支持上文所示的视剂量而定的效能。
上述切除垂体大鼠的研究已显示下列内容：
1.PEG-ahGH视剂量而定地增加IGF-1血浆浓度。有效水平以上的IGF-1Cmax以及IGF-1AUC和持续时间均视剂量而定地增加。
2.胫骨长度和体重视剂量而定地增加。
3.说明相较于每日投予的健豪宁而言大于或等于50%的剂量节约。
4.PEG-ahGH显示Cmax、AUC和持续性在循环中视剂量而定的增加，其与以上药效效应相关。
实例35
药物代谢动力学研究
大鼠药物代谢动力学
在上文实例34中显示以各种剂量在大鼠疾病模型中投予的PEG-ahGH的血浆浓度相对于时间的概况。
灵长类药物代谢动力学
在猕猴中评估不同之处仅在于分子在N端位置上含有甲硫氨酸的PEG-ahGH类型（PEG-a(met)hGH）的药物代谢动力学性质（图32）。
分别以0.75mg/kg或0.15mg/kg的皮下或静脉内剂量投予PEG-a(met)hGH的单次注射。相较于在具有PEG-ahGH的大鼠中的7.05（+/-0.47）小时，表观末端半衰期为12.23（+/-1.72）小时。静脉内投药的半衰期为6.42（+/-0.51）小时。经剂量校正的AUC值对于皮下和静脉内给药分别为362,443和312,440ngXhrXkg/mL/mg。算出通过皮下投药的生物活性为116%。
实例36
在临床方案中所提议的剂量和给药服法的基本原理
通过下列在动物中的研究来确定PEG化GH在人体中的最优服法。
大鼠效能研究——在临床前效能研究中所观测的剂量节约（即与健豪宁可比的效能，但具有较少PEG-ahGH剂量）用于人体中生物活性所需的剂量估算。
在大鼠和猕猴中的药物代谢动力学评估——使用异速生长尺度来估算人体中的药物代谢动力学参数。
在大鼠和猕猴中的单剂量急性安全性研究用于评估暴露且测定NOAEL（未观测不良效应水平）。
大鼠一个月重复剂量GLP安全性研究——在暴露于高于最大推荐人类剂量（MRHD）2倍、6倍和20倍剂量一个月后评估安全性。对于儿科GHD而言，MRHD=0.36mg/kg/周。
猕猴一个月重复剂量GLP安全性研究——在暴露于高于最大推荐人类剂量（MRHD）2倍、10倍和30倍剂量一个月后评估安全性。对于儿科GHD而言，MRHD=0.36mg/kg/周。
大鼠六个月重复剂量GLP安全性研究。在给药暴露六个月以使大鼠中的暴露为人类中MRHD下所观测到的暴露的1至2倍和10倍后评估安全性。
猕猴六个月重复剂量GLP安全性研究。在给药暴露六个月以使猕猴中的暴露为人类中MRHD下所观测到的暴露的1至2倍和10倍后评估安全性。
应了解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明的目的，且根据其作出的各种修改或变化将易于为所属领域的技术人员想到，且将包括于本申请案的精神和范围以及随附权利要求的范畴内。本申请案中引用的所有公开案、专利、专利申请案和/或其它文献为了所有目的起见是以引用的方式全部并入本文中，其引用程度就如同个别地将各个公开案、专利、专利申请案和/或其它文献为了所有目的起见以引用的方式并入一样。
表9：所引用的序列。
Figure BDA0000437277490002141
Figure IDA0000437277570000011
Figure IDA0000437277570000021
Figure IDA0000437277570000031
Figure IDA0000437277570000041
Figure IDA0000437277570000051
Figure IDA0000437277570000061
Figure IDA0000437277570000071
Figure IDA0000437277570000081
Figure IDA0000437277570000101
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Figure IDA0000437277570000131
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Figure IDA0000437277570000161
Figure IDA0000437277570000171

Claims (4)

1.一种经冷冻干燥的激素组合物，其包含人类生长激素（hGH）；所述人类生长激素包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在SEQ ID NO:2中位置35处的氨基酸是用一非天然编码的氨基酸取代；通过于取代SEQ ID NO:2中位置35处的非天然编码的氨基酸以及一30kDa线性聚乙二醇（PEG）分子之间形成一肟键，而使所述人类生长激素与所述聚乙二醇分子共价相连；其中，所述激素组合物为95%的纯hGH；其中，当经皮下投予哺乳动物时，所述生长激素的平均血清半衰期为包含无所述PEG的生长激素的组合物的血清半衰期的至少约7倍，且使胫骨长度增加。
2.一种医药组合物，其包含：
（i）权利要求1所述的激素组合物；和
（ii）医药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述组合物包含医药学上可接受的注射用配方液。
4.根据权利要求1所述的激素组合物，其中当经皮下投予哺乳动物时，所述激素组合物具有至少约12小时的平均血清半衰期。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140402

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