EA008505B1 - Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека - Google Patents
Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека Download PDFInfo
- Publication number
- EA008505B1 EA008505B1 EA200400565A EA200400565A EA008505B1 EA 008505 B1 EA008505 B1 EA 008505B1 EA 200400565 A EA200400565 A EA 200400565A EA 200400565 A EA200400565 A EA 200400565A EA 008505 B1 EA008505 B1 EA 008505B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- ion
- pegylated
- agonist
- molecular weight
- amino
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Abstract
Согласно настоящему изобретению предложен химически модифицированный гормон роста человека (hGH), полученный путем связывания водорастворимого полимера с белком. Химически модифицированный белок по настоящему изобретению может иметь намного более продолжительную активность hGH, чем активность немодифицированного hGH, что дает возможность снизить дозу и создать благоприятные условия режима введения.
Description
В отношении настоящей заявки в соответствии с разделом 35 кодекса США, § 119, заявлен приоритет от 20 ноября 2001 года согласно временной заявке США серийный № 60/331,907, которая во всей своей полноте, как если бы она была написана здесь, включена путем ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к химической модификации гормона роста человека (ЕСН) и его вариантов-агонистов, в результате которой химические и/или физиологические свойства ЕСН могут быть изменены. Пэгилированный ЕСН может иметь увеличенную продолжительность пребывания в плазме, пониженную скорость клиренса, повышенную стабильность, пониженную антигенность или их комбинацию. Настоящее изобретение также относится к способам модификации йСН. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим модифицированный йСН. Еще одним воплощением является применение модифицированного йСН для лечения нарушений роста или развития.
Предшествующий уровень техники
Гормон роста человека (ЕСН) представляет собой белок, содержащий одну цепь из 191 аминокислот, поперечно-связанных двумя дисульфидными мостиками, и мономерная форма имеет молекулярную массу 22 кДа. Гормон роста человека секретируется гипофизом, а также может быть получен рекомбинантной генной инженерией. йСН вызывает рост всех тканей организма, которые способны расти. Рекомбинантный йСН коммерчески доступен в течение нескольких лет. На рынке имеется два типа терапевтически пригодных препаратов рекомбинантного йСН: аутентичный препарат, например Сепо1торш™ или №1торш™, и аналог с дополнительным метиониновым остатком на Ν-концевом конце, например 8ота!опотт™. ЕСН используют для стимуляции линейного роста у пациентов с гипогипофизарной карликовостью, которую также называют дефицитом гормона роста (СНЭ), или с синдромом Тернера, но предполагаются также другие показания, в том числе длительное лечение недостаточности роста у детей, которые родились с малым для гестационного возраста размером тела (8СА), для лечения пациентов с синдромом Прадера-Вилли (РУ 8), хронической почечной недостаточностью (СШ), связанным со СПИДом истощением и старением.
Основной биологический эффект гормона роста (СН) заключается в стимуляции роста молодых млекопитающих и сохранения тканей у более старых млекопитающих. Затрагиваемые системы органов включают скелет, соединительную ткань, мышцы и внутренние органы, такие как печень, кишечник и почки. Гормоны роста оказывают свое воздействие через взаимодействие со специфическими рецепторами на мембране клетки-мишени. йСН является членом семейства гомологичных гормонов, которые включают плацентарные лактогены, пролактины и другие генетические и видовые варианты гормона роста (№со11, С.8., е! а1. (1986) Епбосппе Ве\зе\\ъ 7: 169). Среди них ЕСН выделяется тем, что он проявляет широкую видоспецифичность и связывается либо с клонированным соматогенным рецептором (Ьеипд, ЭЛУ., е! а1. (1987) №11иге 330; 537), либо рецептором пролактина (Воибп, ЕМ., е! а1. (1988) Се11; 53: 69). Клонированный ген для йСН экспрессируется в секретируемой форме в ЕзсйепсЫа со11 (Сйапд, С.К, е! а1. (1987) Сепе 55: 189), и его ДНК и аминокислотная последовательность известны (Соеббе1, е! а1. (1979) №!ите 281: 544; Сгау, е! а1. (1985) Сепе 39: 247).
Г ормон роста человека (ЕСН) участвует в регуляции нормального роста и развития человека. Этот гипофизарный гормон проявляет множество биологических эффектов, включая линейный рост (соматогенез), лактацию, активацию макрофагов, инсулиноподобные и диабетогенные эффекты среди прочего (СйаЩа, РЖ. (1983) Апп. Кеу. Меб. 34, 519; Еб^атбз, С.К. е! а1. (1988) 8аепсе 239, 769; Тйотег, М.О., е! а1. (1988) 1. С1т. 1пуез!. 81: 745). Дефицит гормона роста у детей приводит к карликовости, которую успешно лечат в течение более чем десятилетия путем экзогенного введения йСН.
Гормон роста человека (ЕСН) представляет собой одноцепочечный полипептид, содержащий 191 аминокислоту (молекулярная масса 21500). Дисульфидные связи связывают положения 53 и 165 и положения 182 и 189 (Νίη11, Книге, Νο\ν Вю1оду, 230: 90 (1971)). ЕСН является сильнодействующим анаболическим агентом благодаря, в частности, удерживанию азота, фосфора, калия и кальция. Обработка гипофизэктомизированных крыс гормоном роста может восстанавливать по меньшей мере часть скорости роста крыс (Мооге е! а1., Епбосгшо1оду 122: 2920-2926 (1988)). Среди его наиболее выдающихся эффектов у гипогипофизарных (СН-дефицитных) субъектов ускоряется линейный рост кости-пластинки-хряща, что приводит к увеличению роста (Кар1ап, Сго\\И1 Эгоогбего ш Сййбгеп апб Або1езсеп!8 (8рт1пдйе1б, 1Ь: Сйат1е8 С. Тйотаз, 1964)).
йСН вызывает множество физиологических и метаболических эффектов в различных животных моделях, включая линейный рост кости, лактацию, активацию макрофагов, инсулиноподобные и диабетогенные эффекты и другое (К.К. СЕаν 1а е! а1., Аппи. Кеу. Меб. 34: 519 (1983); О.С.Р. Иакззоп е! а1., Аппи. Кеу. РЬ.у8ю1. 47, 483 (1985); С.К. Еб^атбз е! а1., 8с1епсе 239, 769 (1988); М.О. Тйотег апб М.Ь. Уапсе, 1. С1т. 1пуез!. 82: 745 (1988); ЕР. Нидйез апб Н.С. Епезеп, Аппи. Кеу. РЬу8ю1. 47: 469 (1985)). Известно, что особенно у женщин после менопаузы секреция СН снижается с возрастом (МШатб е! а1., №игоЫо1. Адтд, 11: 229-235 (1990); ТакайазЫ е! а1., №игоепбосгшо1оду М, Ь6-137-142 (1987); смотри также Кибтап е! а1., 1. Сйп. 1пуез!., 67: 1361-1369 (1981) и В1асктап, Епбосппо1оду апб Адшд, 16: 981 (1987)). Известно также, что некоторые проявления старения, в том числе уменьшение массы постной
- 1 008505 части тела, увеличение массы жировой ткани и истончение кожи, можно снижать путем обработки гормоном роста 3 раза в неделю (смотри, например, Кибтаи е! а1., N. Епд. ί. Меб, 323: 1-6 (1990) и сопроводительную статью Ωγ. Vаηсе в том же самом выпуске журнала (стр. 52-54)). Эти биологические эффекты являются результатом взаимодействия между БОН и специфическими клеточными рецепторами. Были клонированы два разных человеческих рецептора - БОН рецептор печени (Ω.\ν. Ьеипд е! а1., №1иге 330: 537 (1987)) и рецептор пролактина человека (ЕМ. Вои1ш е! а1., Мо1. Епбосппо1оду. 3: 1455 (1989)). Однако, вероятно, существуют другие, в том числе плацентарный рецептор лактогена человека (М. Егеетагк, М. Сотег, О. Котег, апб Б. Напб\\'егдег. Епбосппо1. 120: 1865 (1987)). Эти гомологичные рецепторы содержат гликозилированный внеклеточный гормонсвязывающий домен, единичный трансмембранный домен и цитоплазматический домен, которые значительно различается по последовательности и размеру. Предполагается, что один или более чем один рецептор играют определяющую роль в физиологической реакции на БОН.
Как правило, физиологически активные белки, введенные в организм, могут проявлять свою фармакологическую активность только в течение короткого периода времени из-за высокой скорости их клиренса в организме. К тому же относительная гидрофобность этих белков может ограничивать их стабильность и/или растворимость.
В целях снижения скорости клиренса, увеличения стабильности или аннулирования антигенности терапевтических белков были предложены способы, при которых белки химически модифицируют водорастворимыми полимерами. Химическая модификация этого типа может эффективно блокировать протеолитический фермент от физического контакта с главной цепью белка, тем самым предотвращая расщепление.
Химическое присоединение некоторых водорастворимых полимеров может эффективно снижать почечный клиренс благодаря увеличению гидродинамического объема молекулы. Дополнительные преимущества включают при определенных обстоятельствах увеличение стабильности и периода циркуляции терапевтического белка, увеличение растворимости и уменьшение иммуногенности. Полиалкиленоксид, в частности полиэтиленгликоль (РЕО), представляет собой одну такую химическую группировку, которая была использована в получении терапевтических белковых продуктов (глагол пэгилировать означает присоединять по меньшей мере одну молекулу РЕО). Было показано, что присоединение полиэтиленгликоля защищает от протеолиза (Баба, е! а1., 1. ЕегтеШабоп Вюепдшеегшд 71: 137-139 (1991)), и способы присоединения некоторых полиэтиленгликолевых группировок доступны (смотри патент США № 4179337, Ωηνίδ е! а1., №п-1ттиподешс Ро1урерббе8, выданный 18 декабря 1979, и патент ИБ 4002531, Воуег, Моббушд епхутех \νί11ι Ро1уе!Бу1епе О1усо1 апб Ргобис! Ргобисеб ТБегеЬу, выданный 11 января 1977; обзор смотри в АЬисБотек1 е! а1., ш Епхушех а§ Ωπίβδ. ЕБ. Но1сегЬегд апб 1. ВоЬегК еб§. рр. 367-383 (1981)).
Были использованы другие водорастворимые полимеры, такие как сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-
1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры).
Описан целый ряд примеров пэгилированных терапевтических белков. АЭАОЕ№\ пэгилированный препарат аденозиндеаминазы, одобрен для лечения тяжелого сочетанного иммунодефицитного заболевания. ΟNСΑБРΑΚ®, пэгилированная Ь-аспарагиназа, одобрен для лечения гиперчувствительных пациентов с ЛЬЕ (острый лифобластный лейкоз). Пэгилированная супероксиддисмутаза прошла клинические испытания для лечения травмы головы. Пэгилированный α-интерферон (ИБ 5738846, 5382657) одобрен для лечения гепатита; сообщается, что пэгилированная глюкоцереброзидаза и пэгилированный гемоглобин прошли предклинические испытания. Другим примером является пэгилированный 1Ь-6 (ЕР 0442724 под названием МобЖеб ЫЬ-6, в котором раскрыты молекулы полиэтиленгликоля, присоединенные к Ш-6).
Еще одним специфическим терапевтическим белком, который был химически модифицирован, является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-СБЕ). О-СБЕ индуцирует быструю пролиферацию и высвобождение нейтрофильных гранулоцитов в кровоток, тем самым обеспечивая терапевтический эффект в борьбе с инфекцией. В ЕР 0401384, опубликованном 12 декабря 1990, под названием СБетюа11у МобЖеб Огапи1осу!е Со1опу Б11ти1а1шд Еас!ог, описаны материалы и способы для получения О-СБЕ, к которому присоединяют молекулы полиэтиленгликоля. О модифицированном О-СБЕ и его аналогах сообщается также в ЕР 0473268, опубликованном 4 марта 1992, под названием Соибпиоик Ве1еа8е РБагтасеибса1 Сотромбощ Сотрпмпд а Ро1урерббе Соуа1еп11у Сонщда!еб То Α νη^ι· Бо1иЬ1е Ро1утег, где заявлено применение различных О-СБЕ и производных, ковалентно конъюгированных с частицами водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль. О модифицированном полипептиде, обладающем активностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, сообщается в ЕР 0335423, опубликованном 4 октября 1989. В ИБ 5824784 предложены способы Ν-концевой модификации белков или их аналогов и полученные композиции, включая новые композиции химически модифицированного по Ν-концу О-СБЕ. В ИБ 5824778 раскрыт химически модифицированный О-СБЕ.
Что касается полиэтиленгликоля, то множество средств было использовано для присоединения мо
- 2 008505 лекул полиэтиленгликоля к белку. Обычно молекулы полиэтиленгликоля связывают с белком через реакционноспособную группу, находящуюся на белке.
Аминогруппы, такие как, например, аминогруппы на лизиновых остатках или на Ν-конце, удобны для такого присоединения. Например, Коуег (патент υδ 4002531, упомянутый выше) констатирует, что для присоединения молекул полиэтиленгликоля к ферменту было использовано восстановительное алкилирование. В ЕР 0539167, опубликованном 28 апреля 1993, Аг1дй!, Ред 1т1ба!ек апб Рто!еш Оепуайуек ТйегеоГ, излагается, что пептиды и органические соединения со свободной(ыми) аминогруппой(ами) модифицируют имидатным производным РЕО или родственными водорастворимыми органическими полимерами. В И8 5298643 и И8 5637749 раскрыты РЕО-арилимидаты.
Сйато\у е! а1. (Вюсоищда!е Сйет. 5: 133-140 (1994)) сообщают о модификации СЭ4 иммуноадгезина монометоксиполиэтиленгликольальдегидом путем восстановительного алкилирования. Авторы сообщают, что 50% ί.Ό4-Ι§ было МеРЕО-модифицировано в условиях, позволяющих контролировать степень пэгилирования (с. 137 там же). Авторы также сообщают, что ίη νίΙΐΌ связывающая (с белком др 120) способность модифицированного 0Ό4-Ι§ снижается со скоростью, коррелирующей со степенью Ме-пэгилирования (там же). Патент ϋδ 4904584, 8йает, выданный 27 февраля 1990, относится к модифицированию ряда лизиновых остатков в белках для присоединения молекул полиэтиленгликоля через реакционноспособные аминогруппы.
Многие способы присоединения полимера к белку включают в себя использование группировки, которая действует в качестве связывающей группы. Однако такие группировки могут быть антигенными. Имеется тресилхлоридный способ, при котором не используется никакой связывающей группы, но этот способ может быть трудным для осуществления для получения терапевтических продуктов, поскольку использование тресилхлорида может приводить к образованию токсичных побочных продуктов (смотри Бтапак е! а1., в: 81аЫй1у оГ рто!ет рйаттасеийсак: ίη у1уо ра!йгаук оГ бедтаба!юп апб к!та!ед1ек Гог рто!еш к1аЫ1|/а1юп (Ебк. Айет, Т. апб Мапшпд, М.С.) Р1епит, №\ν Уотк, 1991. Также Ое1дабо е! а1., Соирйпд оГ РЕО !о Рто!еш Ву Асйуа!юп Айй Тгеку1 СЫопбе. Аррйса!юпк 1п 1ттипоаГГшйу Се11 Ртерата!юп, в 8ерата!юпк Иапд Ациеоик Рйаке 8ук!ешк, Аррйсайопк 1п Се11 Вю1оду апб Вю!есйпо1оду, Б1кйет е! а1., ебк. Р1епит Ргекк, №\ν Уотк, Ν.Υ., 1989, рр. 211-213).
Коке е! а1. (Вюсопщда!е Сйетщйу 2: 154-159 (1991)) сообщают о селективном присоединении линкерной группы карбогидразид к С-концевой карбоксильной группе белкового субстрата (инсулин).
АО 93/00109 относится к способу стимуляции чувствительных к ОН тканей млекопитающих или птиц, при котором поддерживают постоянную эффективную концентрацию ОН в плазме в течение периода времени 3 дня или более. Утверждается, что одним способом достижения такой концентрации в плазме является использование ОН, связанного с макромолекулярным веществом, таким как РЕО (полиэтиленгликоль). Утверждается, что связывание с макромолекулярным веществом приводит к увеличению периода полужизни. В АО 93/00109 сообщается о гормоне роста человека, пэгилированном с использованием тРЕО-альдегида-5000 и тРЕО-№гидроксисукцинимидилового эфира (тРЕО-NН8-5000). Использование тРЕО-ΝΗδ привело к гетерогенным смесям множества пэгилированных форм йОН. В АО 93/00109 также раскрыто использование тРЕО-малеимида для пэгилирования цистеиновых вариантов йОН.
В АО 99/03887 раскрыт цистеиновый вариант гормона роста, который пэгилируют. Обозначенный как ВТ-005, этот конъюгат претендует на то, чтобы быть более эффективным в стимуляции увеличения массы крыс с дефицитом гормона роста и чтобы иметь более длительный период полужизни, чем период полужизни йОН.
С1агк е! а1. также сообщили о гормоне роста человека, пэгилированном с использованием сукцинимидилового эфира карбоксиметилированного РЕО (1оитпа1 оГ Вю1одюа1 Сйетщйу 271: 21969-21977, 1996). С1агк е! а1. описывают производные йОН возрастающего размера, использующие тРЕО-ΝΠδ5000, которые селективно конъюгируются с первичными аминами. Возрастающие уровни РЕО модификации снижали сродство к своему рецептору и повышали ЕС50 в анализе, основанном на клетках, вплоть до 1500-кратной величины. В О1коп е! а1., Ро1утег Ртертт!к 38: 568-569, 1997 раскрыто применение Νгидроксисукцинимида (ΝΠ8) РЕО и сукцинимидилпропионата (8РА) РЕО для получения множества видов пэгилированного йОН.
В АО 94/20069 предсказательно раскрыт пэгилированный йОН как часть препарата для доставки в легкие.
В υδ 4179337 раскрыты способы пэгилирования ферментов и гормонов для получения физиологически активных, неиммуногенных, водорастворимых полипептидных конъюгатов. ОН упомянут как один пример гормона, который пэгилируют.
В ЕР 458064 А2 раскрыто пэгилирование введенных или природно присутствующих цистеиновых в соматотропине остатков. В ЕР 458064 А2 упоминается также включение двух цистеиновых остатков в петлю, называемую омега петлей, которая, как установлено, локализована на остатках 102-112 в дикого типа бычьем соматотропине. Более конкретно, в ЕР 458064 А2 раскрыта замена остатков под номерами 102 и 112 бычьего соматотропина от 8ет до Сук и от Туг до Сук, соответственно.
В АО 95/11987 предложено присоединение РЕО к тиольной группе цистеинового остатка, который
- 3 008505 либо присутствует в родительской молекуле, либо введен путем сайт-направленного мутагенеза. XV О 95/11987 относится к пэгилированию протеазы нексин-1, однако, предлагается также пэгилирование в целом ИОН и других белков.
В νθ 99/03887 раскрыт, например, гормон роста, модифицированный путем вставки дополнительных цистеиновых остатков вместо сериновых остатков и присоединения РЕО к введенным цистеиновым остаткам.
νθ 00/42175 относится к способу изготовления белков, содержащих свободные цистеиновые остатки для присоединения РЕО. В νθ 00/42175 раскрыты следующие мутеины ИОН: Т3С, 8144С и Т148С и их цистеин-пэгилирование.
νθ 9711178 (а также И8 5849535, И8 6004931 и И8 6022711) относится к применению вариантов ОН в качестве агонистов или антагонистов ИОН. В νθ 9711178 также раскрыто пэгилирование ИОН, включающее пэгилирование лизина и введение или замещение лизина (например, К168А и 172К). В νθ 9711178 также раскрыто замещение О120К.
В предыдущих сообщениях о пэгилировании ИОН требуется присоединение множества РЕО, приводящее к нежелательной гетерогенности продукта, для достижения гидродинамического объема, большего, чем отсечка 70К молекулярной массы почечной фильтрации, как описано КиаиЕ, М.1. с1 а1. в 1. ΒίοΙ. СИет. 263: 15064-15070, 1988.
Молекула ОН с более длительным полупериодом циркуляции могла бы снизить число необходимых введений и потенциально обеспечить более оптимальные терапевтические уровни ИОН с конкомитант-усиленным терапевтическим эффектом.
Согласно настоящему изобретению предложены химически модифицированные конъюгаты ИОН, имеющие пониженную гетерогенность, пониженную скорость клиренса, повышенную продолжительность пребывания в плазме, улучшенную растворимость, увеличенную стабильность, пониженную антигенность или их комбинации.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к химически модифицированному ИОН и его вариантам-агонистам, которые обладают по меньшей мере одним улучшенным химическим или физиологическим свойством, выбранным из, но не ограниченным ими, пониженной скорости клиренса, повышенной продолжительности пребывания в плазме, увеличенной стабильности, улучшенной растворимости и пониженной антигенности. Таким образом, как описано ниже более подробно, настоящее изобретение имеет целый ряд аспектов, относящихся к химическому модифицированию ИОН и его вариантов-агонистов, а также к конкретным модификациям с использованием различных полиэтиленгликолевых группировок.
Настоящее изобретение также относится к способам получения химически модифицированного ИОН и его вариантов-агонистов.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим химически модифицированный ИОН и его варианты-агонисты.
Модифицированный ИОН и его варианты-агонисты по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении, без ограничения, карликовости (ОНО), ОНО взрослых, синдрома Тернера, в длительном лечении недостаточности роста у детей, которые родились с малым для гестационного возраста размером тела (БОА), для лечения пациентов с синдромом Прадера-Вилли (Ρν8), хронической почечной недостаточностью (СШ), связанного со СПИДом истощения, старением, последней стадией почечной недостаточности и кистозным фиброзом.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет воспроизведение восстановительного и невосстановительного 8Э 8-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) анализа продуктов реакции ИОН и 20К РЕО-АБЭ и анионообменно очищенного 20К РЕО-АБИ ИОН. Дорожка 1. Белковые стандарты молекулярной массы. Дорожка 2. Восстановленный ИОН - 10 мкг. Дорожка 3. Реакционная смесь восстановленного 20К линейного РЕО-АБИ ИОН - 10 мкг. Дорожка 4. Восстановленный анионообменно очищенный 20К линейный РЕО-АБИ ИОН - 10 мкг. Дорожка 5. Слепой контроль. Дорожка 6. Невосстановленный ИОН - 10 мкг. Дорожка 7. Реакционная смесь невосстановленного 20К линейного РЕО-АБИ ИОН 10 мкг. Дорожка 8. Невосстановленный анионообменно очищенный 20К линейный РЕО-АБИ ИОН - 10 мкг. Дорожка 9. Слепой контроль. Дорожка 10. Белковые стандарты молекулярной массы.
Фиг. 2 представляет воспроизведение невосстанавительного 8Э8-РАСЕ анализа различных анионообменно очищенных пэгилированных молекул ИОН. Дорожка 1. Белковые стандарты молекулярной массы. Дорожка 2. ИОН - 10 мкг. Дорожка 2. 4-6 х 5К РЕО-8РА ИОН - 10 мкг. Дорожка 3. 20К линейный РЕО-АБИ ИОН - 10 мкг. Дорожка 4. 20К разветвленный РЕО-АБИ ИОН - 10 мкг. Дорожка 5. 40К разветвленный РЕО ИОН - 10 мкг.
Фиг. 3 показывает воспроизведения профилей КР-НРБС (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) элюирования трипсиновых гидролизатов ИОН, 40К Вг РЕО-АБИ ИОН и 40К Вг РЕО-ИН8 ИОН. РЕО, связанный преимущественно с Ν-концом ИОН (как показано в 40К Вг АБИ ИОН), приводит к снижению пика Ν-концевого (Т1) фрагмента с получением нового РЕОилированного Т1 пика.
- 4 008505
Фиг. 4 представляет сравнение ίη νίνο биоактивности непэгилированного БОН, дозированного ежедневно (0,3 мг/кг/сутки), с биоактивностью монопэгилированного БОН, дозированного подкожно (п.к.) 1 раз каждые 6 дней (1,8 мг/кг), иллюстрируя увеличение массы гипофизэктомизированных крыс в течение периода 11 суток.
Фиг. 5 представляет сравнение ίη νίνο биоактивности непэгилированного БОН, дозированного п.к. ежедневно (0,3 мг/кг/сутки), с биоактивностью 4-6 х 5К РЕО-8РА-БОН, монопэгилированного 20К разветвленным РЕО-ΑΕΌ БОН и монопэгилированного 40К разветвленным РЕС-АБЭ БОН, каждого дозированного п.к. 1 раз каждые 6 дней (1,8 мг/кг), иллюстрируя увеличение массы гипофизэктомированных крыс в течение периода 11 суток.
Фиг. 6 представляет сравнение ίη νίνο биоактивности непэгилированного БОН, дозированного п.к. ежедневно (0,3 мг/кг/сутки), с биоактивностью 4-6 х 5К РЕО-СМНВА-БОН, монопэгилированного 20К линейным АБЭ. монопэгилированного 30К линейным АБЭ. монопэгилированного 20К разветвленным РЕО-АБЭ БОН и монопэгилированного 40К разветвленным РЕО-АБЭ БОН, каждого дозированного п.к. 1 раз каждые 6 дней (1,8 мг/кг), иллюстрируя увеличение роста большеберцовой кости у гипофизэктомированных крыс в течение периода 11 суток.
Фиг. 7 представляет сравнение ίη νίνο биоактивности однократной 1,8 мг/кг п.к. дозы непэгилированного БОН, монопэгилированного 5К линейного РЕО-АБЭ БОН, монопэгилированного 20К линейного РЕО-АБЭ БОН, монопэгилированного 20К разветвленного РЕО-АБЭ БОН, монопэгилированного 20К линейного РЕО-гидразида БОН, монопэгилированного 30К линейного РЕО-АБЭ БОН, монопэгилированного 40К разветвленного РЕО-АБЭ БОН, 4-6 х 5К РЕО 8РА БОН, 4-6 х 5К РЕО-СМНВА БОН, иллюстрируя увеличение уровней 1ОЕ-1 в плазме у гипофизэктомированных крыс в течение периода 9 суток.
Подробное описание
БОН и его варианты-агонисты являются членами семейства рекомбинантных белков, описанных в И8 4658021 и И8 5633352. Их рекомбинантное получение и способы применения подробно описаны в υδ 4342832, υδ 4601980, υδ 4898830, υδ 5424199 и υδ 5795745.
Любой очищенный и выделенный БОН или его вариант-агонист, который продуцируется клеткамихозяевами, такими как Е. οοΐί и животные клетки, трансформированными или трансфицированными с использованием рекомбинантно-генетических методик, может быть использован в настоящем изобретении. Дополнительные варианты БОН описаны в заявке υδ δβτ. Νο. 07/715300, поданной 14 января 1991, в заявке υδ δβτ. Νο. 07/743614, поданной 9 августа 1991, и в №О 92/09690, опубликованной 11 января 1992. Среди них БОН или его вариант-агонист, который продуцируется трансформированной Е. οοΐί, особенно предпочтителен. Такой БОН или его вариант-агонист может быть получен в больших количествах с высокой чистотой и гомогенностью. Например, вышеуказанный БОН или его вариант-агонист может быть получен способом, описанным в υδ 4342832, υδ 4601980, υδ 4898830, υδ 5424199 и υδ 5795745. Термин по существу, имеет следующую аминокислотную последовательность означает, что вышеуказанная аминокислотная последовательность может включать в себя изменение одной или более чем одной аминокислоты (делецию, присоединение, вставку или замену), поскольку такие изменения не будут вызывать какого-либо неблагоприятного несходства в функции для БОН или его варианта-агониста. Более предпочтительно использовать БОН или его вариант-агонист, по существу, имеющий аминокислотную последовательность, в которую включены по меньшей мере один (одна) лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, неспаренный цистеиновый остаток, свободная Ν-концевая α-аминогруппа или свободная С-концевая карбоксильная группа.
В соответствии с настоящим изобретением полиэтиленгликоль ковалентно связан через аминокислотные остатки БОН или его варианта-агониста. Специалисту в данной области известно множество активированных полиэтиленгликолей, имеющих целый ряд различных функциональных групп, линкеров, конфигураций и молекулярных масс, которые могут быть использованы для создания конъюгатов РЕОБОН или конъюгатов РЕО-вариант-агонист БОН (смотри обзор в ΡοόοΓίδ М.1. е! а1., АБу. Эгид Эе1. Рсу. 54: 459-476, 2002; Наттщ ЕМ. е! а1., Эгид Оекуегу δуΐет8 40: 538-551, 2001). Аминокислотный остаток может представлять собой любой реакционноспособный остаток(ки), имеющий(ие), например, свободные амино-, карбоксильные, сульфгидрильные (тиольные), гидроксильные, гуанидинильные или имидизоильные группы, с которыми концевая реакционноспособная группа активированного полиэтиленгликоля может быть связана. Аминокислотные остатки, имеющие свободные аминогруппы, могут включать лизиновые остатки и/или Ν-концевой аминокислотный остаток, аминокислотные остатки, имеющие свободную карбоксильную группу, могут включать аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и/или С-концевые аминокислотные остатки, аминокислотные остатки, имеющие свободный сульфгидрил (тиол), такие как цистеин, аминокислотные остатки, имеющие свободный гидроксил, такие как серин или тирозин, аминокислотные остатки, имеющие свободный гуанидинил, такие как аргинин, и аминокислотные остатки, имеющие свободный имидизоил, такие как гистидин.
В другом воплощении оксимный химизм (Беннеих & ВегЮ/х! Т1Ь. ТесБ. 16: 506-513, 1998) используют для направленного воздействия на Ν-концевые сериновые остатки.
Полиэтиленгликоль, используемый согласно настоящему изобретению, не ограничен какой-либо конкретной формой или диапазоном молекулярной массы. Молекулярная масса полиэтиленгликоля мо
- 5 008505 жет находиться между 500 и 100000. Обычно используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 500-60000 и предпочтительно от 1000 до 40000. Более предпочтительно молекулярная масса составляет более 5000 до примерно 40000.
Еще в одном воплощении полиэтиленгликоль представляет собой разветвленный РЕО, имеющий более чем одну присоединенную РЕО группировку. Предпочтительные примеры разветвленных РЕО описаны в И8 5932462, И8 5342940, И8 5643575, И8 5919455, И8 6113906, И8 5183660, АО 02/09766, Кобета Υ., Вюсоищда1е Сйет181ту 5: 283-288 (1994) и ΥοιηοδοΚί е! а1., Лдпс. ΒίοΙ. СЙет., 52: 2125-2127, 1998. В предпочтительном воплощении молекулярная масса каждого полиэтиленгликоля разветвленного РЕО составляет 5000-20000.
Полиалкиленоксиды, особенно полиэтиленгликоли, связывают с ЙОН или его вариантом-агонистом через концевую реакционноспособную группу, которая может оставлять или может не оставлять связывающую группу (спейсер) между РЕО и белком. Для того, чтобы образовать конъюгаты ЙОН или его вариантов-агонистов по настоящему изобретению, полимеры, такие как полиалкиленоксид, превращают в активированные формы, как этот термин известен среднему специалисту в данной области. Например, реакционноспособная группа представляет собой концевую реакционноспособную группу, которая опосредует связь между химическими группировками на белке, такими как амино-, карбоксильные или тиольные группы, и полиэтиленгликолем. Обычно одну или обе концевые группы гидроксильного конца полимера (то есть альфа и омега концевые гидроксильные группы) превращают в реакционноспособные функциональные группы, которые дают возможность ковалентной конъюгации. Этот процесс часто называют активацией, а полиэтиленгликолевый продукт, имеющий реакционноспособную группу, здесь и далее называют активированным полиэтиленгликолем. Полимеры, содержащие как α, так и ε связывающие группы, называют бис-активированными полиалкиленоксидами и бифункциональными. Полимеры, содержащие одинаковую реакционноспособную группу на α и ε концевых гидроксилах, иногда называют гомобифункциональными или гомобис-активированными. Полимеры, содержащие разные реакционноспособные группы на α и ε концевых гидроксилах, иногда называют гетеробифункциональными (смотри, например, АО 01/26692) или гетеробис-активированными. Полимеры, содержащие одну реакционноспособную группу, называют моноактивированными полиалкиленоксидами или монофункциональными. Аналогично, другие, по существу, неантигенные полимеры являются активированными или функционализированными.
Таким образом, активированные полимеры подходят для опосредования связи между химическими группировками на белке, такими как α- или ε-амино-, карбоксильная или тиольная группы, и полиэтиленгликолем. бис-Активированные полимеры могут взаимодействовать таким образом с двумя белковыми молекулами или одной белковой молекулой и небольшой реакционноспособной молекулой в другом воплощении для эффективного образования белковых полимеров или конъюгатов белок-небольшая молекула через поперечные связи.
Функциональные группы, способные взаимодействовать либо с аминоконцевой α-аминогруппой, либо ε-аминогруппой лизинов, имеющихся на ЙОН или его варианте-аонисте, включают Ν-гидроксисукцинимидиловые эфиры, карбонаты, такие как η-нитрофенил или сукцинимидил (И8 5808096, 5612460, И8 5324844, И8 55122614); карбонилимидазол; азлактоны (Л8 5321095, И8 5567422); циклические имидтионы (И8 5405877, 5349001); изоцианаты или изотиоцианаты (Отееита1б Р.В.. 1. Огд. Сйет., 60: 331336,1995); тресилхлорид (ЕР 714402, ЕР 439508); галогенформиаты (АО 96/40792) и альдегиды.
Функциональные группы, способные взаимодействовать с карбоновокислотными группами, реакционноспособными карбонильными группами и окисленными углеводными группировками на ЙОН или его варианте-агонисте, включают первичные амины и гидразиновые и гидразидные функциональные группы, такие как ацилгидразиды, карбазаты, полукарбаматы, тиокарбазаты и т.д. (АО 01/70685).
Меркаптогруппы, если они имеются на ЙОН или его варианте-агонисте, также могут быть использованы в качестве мест присоединения для подходящим образом активированных полимеров с реакционноспособными группами, такими как тиолы, малеимиды, сульфоны и фенилглиоксали (смотри, например, патент США № 5093531, описание которого включено сюда изобретения путем ссылки). Другие нуклеофилы, способные взаимодействовать с электрофильным центром, включают, но не ограничиваются ими, например, гидроксил, амино, карбоксил, тиол, активный метилен и т. п.
Охвачены также полимеры, включающие в себя липофильные и гидрофильные группировки, раскрытые в И8 5359030 и И8 5681811, И8 5438040 и 5359030.
В АО 98/32466 также раскрыты галогенированные РЕО, которые могут взаимодействовать с амино-, тиольными группами и ароматическими гидроксигруппами, которые непосредственно ковалентно присоединяют РЕО к белку.
В одном предпочтительном воплощении изобретения вторичные аминные или амидные связи образуют с использованием Ν-концевой α-аминогруппы или ε-аминогруппы лизина ЙОН или его вариантаагониста и активированного РЕО. Еще в одном предпочтительном аспекте изобретения вторичную аминную связь образуют между Ν-концевой первичной α- или ε-аминогруппой ЙОН или его варианта-агониста и одноцепочечным или разветвленным РЕО альдегидом путем восстановления подходящим восстано
- 6 008505 вителем, таким как Ναί.’ΝΒΗ3. №1ВН3. пиридинборан и т.п., как описано в Сйатот с1 а1., Вюсоищда!е Сйет. 5: 133-140 (1994) и в υδ 5824784.
В предпочтительном воплощении по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 81%, предпочтительно по меньшей мере 82%, предпочтительно по меньшей мере 83%, предпочтительно по меньшей мере 84%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 86%, предпочтительно по меньшей мере 88%, предпочтительно по меньшей мере 89%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 91%, предпочтительно по меньшей мере 92%, предпочтительно по меньшей мере 93%, предпочтительно по меньшей мере 94%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 96%, предпочтительно по меньшей мере 97% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% полиэтиленгликоля находится на аминоконцевой α-аминогруппе.
В другом предпочтительном воплощении изобретения полимеры, активированные амидобразующими линкерами, такими как сукцинимидильные эфиры, циклические имидтионы или т.п., используют для осуществления образования связи между 11СН или его вариантом-агонистом и полимером (смотри, например, патент США № 5349001, патент США № 5405877 и Сгееита1б, е! а1., Сп!. Кеу. Тйет. Бтид Сатлет 8у§к. 17: 101-161, 2000, которые включены в данное описание изобретения путем ссылки). Один предпочтительный активированный полиэтиленгликоль, который может связываться со свободными аминогруппами 11СН или его варианта-агониста, представляет собой одноцепочечный или разветвленный Νгидроксисукцинилимидполиэтиленгликоль и может быть получен путем активации эфиров янтарной кислоты полиэтиленгликоля Ν-гидроксисукцинилимидом.
Другие предпочтительные воплощения изобретения включают использование других активированных полимеров для образования ковалентных связей этого полимера с 11СН или его вариантом-агонистом через ε-амино- или другие группы. Например, изоцианатные или изотиоцианатные формы терминально активированных полимеров могут быть использованы для образования связей на основе мочевины или тиомочевины с аминогруппами лизина (Сгееита1б К.В., 1. Отд. Сйет., 60: 331-336, 1995).
Еще в одном предпочтительном аспекте изобретения карбаматные (уретановые) связи образованы с аминогруппами белка, как описано в патентах ϋδ 5122614, 5324844 и 5612640, которые включены сюда путем ссылки. Примеры включают полимеры, активированные Ν-сукцинимидилкарбонатом, паранитрофенилкарбонатом и карбонилимидазолом. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения бензотриазолкарбонатное производное РЕС связано с аминогруппами на 11СН или его вариантеагонисте.
Другой аспект представляет собой пролекарство или форму пролонгированного высвобождения 11СН или его варианта-агониста, состоящую из водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль, присоединенного к молекуле 11СН или его варианта-агониста через функциональный линкер, который, безусловно, может быть разрушен ферментативным или рН-направленным гидролизом для высвобождения свободного 11СН или его варианта-агониста или другого производного 11СН или его вариантаагониста.
Пролекарство может также представлять собой двойное пролекарство (Виибдаагб ίη Абуаисеб Бшд-Оейуегу Ке\зе\\ъ 3: 39-65, 1989), предполагающее использование каскада латенциации. В таких системах гидролитическая реакция включает в себя начальную, скорость-ограничивающую (медленную) ферментативную или рН-направленную стадию и вторую стадию, включающую быстрый неферментативный гидролиз, который происходит только после протекания первой стадии. Такой высвобождаемый полимер обеспечивает получение белковых конъюгатов, которые недолговечны и могли бы действовать в качестве резервуара, который непрерывно высвобождает 11СН или его вариант-агонист. Такие функциональные линкеры описаны в И8 5614549; И8 5840900; И8 5880131; И8 5965119; И8 5965565; И8 6011042; И8 6153655; υδ 6180095 В1; υδ 6413507; Стееита1б КВ. е! а1., 1. Меб. Сйет. 42: 3657-3667, 1999; Бее, δ. е! а1., Вюсоищда!е Сйет. 12: 163-169, 2001; Сагтаи А.1. е! а1., ΕЕВδ Бей. 223: 361-365, 1987; ^одЫгеи С. е! а1., Вюсоищса!е Сйет. 4: 314-318, 1993; КоЬегй М.1. е! а1., 1. Рйатт. δα. 87: 1440-1445, 1998; 2йао X., ш Νίπΐΐι 1и!. δутρ. Кесеи! Α6ν. Эгид Бейуету δ\'8ΐ. 199; Сгееита1б КВ. е! а1., 1. Меб. Сйет. 43: 475-487, 2000; и Сгееита1б К.В. Стй. Кеу. Тйет. Эгид Сатег δ\'8ΐ. 17: 101-161, 2000. 2айр§ку е! а1., 284Ь 1и!. δутр. Ои сои!го11еб Ке1еа§е оГ ВюасДуе Ма!епак 1; 73-74, 2001.
Реакции конъюгирования, называемые реакциями пэгилирования, исторически осуществляли в растворе с молярным избытком полимера и безотносительно к тому, где полимер будет присоединяться к белку. Однако такие общие методики обычно оказывались не пригодными для конъюгирования биоактивных белков с неантигенными полимерами с одновременным сохранением достаточной биоактивности. Один способ сохранения биоактивности 11СН или его варианта-агониста заключается в том, чтобы в процессе присоединения полимера, по существу, избежать конъюгации тех реакционноспособных групп 11СН или его варианта-агониста, которые ассоциируются с сайтом(ами) связывания рецептора. Другой аспект настоящего изобретения заключается в создании способа конъюгирования полиэтиленгликоля с 11СН или его вариантом-агонистом с сохранением высоких уровней остаточной активности.
Химическая модификация посредством ковалентной связи может быть осуществлена в любых под- 7 008505 ходящих условиях, обычно принятых в реакции биологически активного вещества с активированным полиэтиленгликолем. Реакцию конъюгации проводят в относительно мягких условиях, чтобы избежать инактивации ИОН или его варианта-агониста. Мягкие условия включают поддержание рН реакционного раствора в пределах от 3 до 10 и температуры реакции в пределах от примерно 0 до 37°С. В случаях, когда реакционноспособные аминокислотные остатки в ИОН или его варианте-агонисте имеют свободные аминогруппы, вышеуказанную модификацию предпочтительно осуществляют в подходящем буфере (рН от 3 до 10), выбранном из неограниченного перечня, в том числе фосфатном, МЕ8. цитратном, ацетатном, сукцинатном или НЕРЕ8, в течение 1-48 ч при 4-37°С. При направленном воздействии на Ν-концевые аминогруппы реагентами, такими как РЕО альдегиды, предпочтительно поддерживают рН 4-8. Активированный полиэтиленгликоль можно использовать в примерно 0,05-100-кратном, предпочтительно примерно 0,01-2,5-кратном молярном количестве от числа свободных аминогрупп ИОН или его вариантаагониста. С другой стороны, если реакционноспособные аминокислотные остатки в ИОН или его варианте-агонисте имеют свободные карбоксильные группы, вышеуказанную модификацию предпочтительно проводят при рН от примерно 3,5 до примерно 5,5. Например, модификацию с полиоксиэтилендиамином проводят в присутствии карбодиимида (рН 3,5-5) в течение 1-24 ч при 4-37°С. Активированный полиэтиленгликоль можно использовать в 0,05-300-кратном молярном количестве от числа свободных карбоксильных групп ИОН или его варианта-агониста.
В отдельных воплощениях верхний предел количества полимера, включаемого в реакции конъюгации, превышает примерно 1:1 до степени, которая возможна для взаимодействия активированного полимера и ИОН или его варианта-агониста без образования значительного количества высокомолекулярных продуктов, то есть более примерно 20% конъюгатов, содержащих более чем примерно одну цепь полимера на молекулу ИОН или его варианта-агониста. Например, в данном аспекте изобретения предполагается, что соотношения вплоть до примерно 6:1 могут быть использованы для образования значительных количеств желаемых конъюгатов, которые затем могут быть выделены из любых высокомолекулярных продуктов.
В другом аспекте данного изобретения бифункционально активированные производные РЕО могут быть использованы для создания полимерного ИОН или его вариант-агонист-РЕО молекул, в которых множество молекул ИОН или его варианта-агониста поперечно-сшиты посредством РЕО. Хотя описанные здесь реакционные условия могут приводить к значительным количествам немодифицированного ИОН или его варианта-агониста, немодифицированный ИОН или его вариант-агонист легко можно рециклизовать в будущие партии для последующих реакций конъюгации. К удивлению, способы по настоящему изобретению производят очень мало, то есть менее примерно 30% и более предпочтительно менее примерно 10%, высокомолекулярных продуктов и продуктов, содержащих более одной полимерной цепи на ИОН или его варианте-агонисте. Эти реакционные условия резко отличаются от условий, обычно используемых для реакций полимерной конъюгации, где активированный полимер присутствует в несколько-кратном молярном избытке относительно мишени. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах от примерно 0,1/аминогруппа до примерно 50 экв. на эквивалент ИОН или его варианта-агониста. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах от примерно 1 до примерно 10 экв. на эквивалент ИОН или его варианта-агониста.
Реакции конъюгации по настоящему изобретению первоначально обеспечивают получение реакционной смеси или пула, содержащего моно- и ди-РЕО-ИОН конъюгаты, непрореагировавший ИОН, непрореагировавший полимер и обычно менее примерно 20% высокомолекулярных продуктов. Высокомолекулярные продукты включают конъюгаты, содержащие более одной цепи полимера и/или продукты полимеризованного РЕО-ИОН или его варианта-агониста. После удаления непрореагировавших продуктов и высокомолекулярных продуктов выделяют композиции, содержащие, главным образом, конъюгаты моно- и диполимер-ИОН или его вариант-агонист. Принимая во внимание тот факт, что конъюгаты по большей части включают одну цепь полимера, эти конъюгаты, по существу, являются гомогенными. Эти модифицированные ИОН или его варианты-агонисты обладают по меньшей мере примерно 0,1% ίη νίίτο биологической активности, связанной с нативным или немодифицированным ИОН или его вариантомагонистом, измеренной с использованием стандартных анализов пролиферации клеток ЕЭС-Р1 (С1агк с1 а1. 1оита1 οί Βίοίοβίοαΐ СИет181гу 271: 21969-21917, 1996), анализа связывания рецептора (И8 5057417) или роста гипофизэктомизированных крыс (С1агк е! а1. 1оита1 οί Βίοίοβίοαΐ СИетШгу 271: 21969-21977, 1996). Однако в предпочтительных аспектах изобретения модифицированный ИОН или его вариантагонист обладают примерно 25% ίη νίίτο биологической активности, более предпочтительно модифицированный ИОН или его вариант-агонист обладает примерно 50% ίη νίίτο биологической активности, более предпочтительно модифицированный ИОН или его вариант-агонист обладает примерно 75% ίη νίίτο биологической активности и наиболее предпочтительно модифицированный ИОН или его вариант-агонист обладает эквивалентной или улучшенной ίη νίίτο биологической активностью.
Способы по настоящему изобретению предпочтительно включают, скорее, ограниченные соотношения полимера и ИОН или его варианта-агониста. Так, было обнаружено, что конъюгаты ИОН или его варианта-агониста преимущественно ограничены продуктами, содержащими только одну цепь полимера. Более того, связывание полимера с реакционноспособными группами ИОН или его варианта-агониста
- 8 008505 является, по существу, менее случайным, чем когда используют более высокие молярные избытки полимерного линкера. Немодифицированный йСН или его вариант-агонист, присутствующий в реакционном пуле после завершения реакции конъюгации, может быть рециклизован в будущие реакционные смеси с использованием ионообменной хроматографии или размер-эксклюзионной хроматографии или подобных методик разделения.
Полиэтиленгликоль-модифицированный йСН или его вариант-агонист, а именно химически модифицированный белок по настоящему изобретению, может быть очищен от реакционной смеси общепринятыми способами, которые используют для очистки белков, такими как диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С), гельхроматография и электрофорез. Ионообменная хроматография особенно эффективна в удалении непрореагировавших полиэтиленгликоля и йСН или его варианта-агониста. В дополнительном воплощении изобретения продукты моно- и диполимер-йСН или его вариант-агонист выделяют из реакционной смеси, чтобы удалить высокомолекулярные продукты и немодифицированный йСН или его вариант-агонист. Разделение осуществляют путем помещения смешанных продуктов в буферный раствор, содержащий от примерно 0,5 до 10 мг/мл конъюгатов йСН или его вариант-агонист-полимер. Подходящие растворы имеют рН от примерно 4 до примерно 8. Растворы предпочтительно содержат одну или более чем одну буферную соль, выбранную из КС1, ИаС1, К2НРО4, КН2РО4, Ыа2НРО4, ЫаН2РО4, ЫаНСО3, ИаВО4, СН3СО2Н и ЫаОН.
В зависимости от реакционного буфера раствор полимерного конъюгата йСН или его варианта-агониста сначала можно подвергнуть буферному обмену/ультрафильтрации для удаления любого непрореагировавшего полимера. Например, раствор конъюгата РЕС-йСН или его вариант-агонист можно подвергнуть ультрафильтрации через отсекающую низкую молекулярную массу (от 10000 до 30000 Да) мембрану для удаления большей части нежелательных материалов, таких как непрореагировавший полимер, поверхностно-активные вещества, если они присутствуют, или т.п.
Фракционирование конъюгатов в пул, содержащий желаемые продукты, предпочтительно осуществляют с использованием среды ионообменной хроматографии. Такая среда способна селективно связывать конъюгаты РЕС-йСН или его вариант-агонист за счет разницы в заряде, которая варьирует предсказуемым до некоторой степени образом. Например, поверхностный заряд йСН или его варианта-агониста определяется числом доступных заряженных групп на поверхности белка. Эти заряженные группы обычно служат в качестве точки потенциального присоединения полиалкиленоксидных полимеров. Следовательно, конъюгаты йСН или его варианта-агониста будут иметь заряд, отличающийся от заряда других продуктов, что дает возможность селективного выделения.
Сильно полярные анионо- или катионообменные смолы, такие как соответственно четвертичные аминные или сульфопропиловые смолы, используют для способа по настоящему изобретению. Ионообменные смолы особенно предпочтительны. Неограниченный перечень охваченных коммерчески доступных катионообменных смол, подходящих для использования согласно настоящему изобретению, включает в себя ЗР-ййтар®, ЗР Зерйагоке НР® и 8Р Зерйагоке® Гак! Πο\ν. Другие подходящие катионообменные смолы, например З и СМ смолы, также могут быть использованы. Неограниченный перечень анионообменных смол, в том числе коммерчески доступных анионообменных смол, подходящих для использования согласно настоящему изобретению, включает в себя О-1Шгар®. О Зерйагоке НР® и О Зерйагоке® Гак( Πο\ν. Другие подходящие анионообменные смолы, например ЭЕЛЕ смолы, также могут быть использованы.
Например, анионо- или катионообменную смолу предпочтительно упаковывают в колонку и уравновешивают общепринятыми средствами. Используют буфер, имеющий такой же рН и осмолярность, как и раствор конъюгированного с полимером йСН или его варианта-агониста. Буфер для элюирования предпочтительно содержит одну или более чем одну соль, выбранную из КС1, ЫаС1, К2НРО4, КН2РО4, Иа2НРО4, ИаН2РО4, ИаНСО3, ИаВО4 и (ИН4)2СО3. Конъюгатсодержащий раствор затем адсорбируют на колонку с непрореагировавшим полимером, и некоторые высокомолекулярные продукты не удерживаются. При завершении загрузки градиентный поток буфера для элюирования с увеличением концентрации соли наносят на колонку для элюирования желаемой фракции конъюгированного с полиалкиленоксидом йСН или его варианта-агониста. Элюированные объединенные фракции предпочтительно ограничены однородными конъюгатами полимеров после стадии катионо- или анионообменного разделения. Любые неконъюгированные йСН или его вариант-агонист продукты затем можно удалить обратной промывкой колонки общепринятыми методами. При желании, далее моно- и мультипэгилированные йСН или его вариант-агонист продукты можно отделить друг от друга путем дополнительной ионообменной хроматографии или размер-эксклюзионной хроматографии.
Методики с многократными изократическими стадиями с увеличением концентрации соли или рН также могут быть использованы. Многократные изократические стадии элюирования с увеличением концентрации должны приводить к последовательному элюированию ди-, а затем моно-йСН или его вариант-агонист-полимерных конъюгатов.
Температурный диапазон для элюирования находится между примерно 4 и примерно 25°С. Предпочтительно элюирование проводят при температуре между от примерно 4 и примерно 22°С. Например, элюирование фракции РЕС-йСН или его вариант-агонист определяют по УФ-поглощению при 280 нм.
- 9 008505
Сбора фракции можно достичь через простые временные профили элюирования.
Поверхностно-активное вещество может быть использовано в способе конъюгирования полиэтиленгликолевого полимера с группировкой 11СН или его варианта-агониста. Подходящие поверхностноактивные вещества включают агенты ионного типа, такие как додецилсульфат натрия (8Ό8). Другие ионные поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат лития, четвертичные аммониевые соединения, таурохолевая кислота, каприловая кислота, декансульфоновая кислота и т.п., также могут быть использованы. Неионные поверхностно-активные вещества также могут быть использованы. Например, могут быть использованы такие материалы, как полиоксиэтиленсорбитаны (Тетеепз), полиоксиэтиленэфиры (Ттйопз). Смотри также ЫеидеЬаиег, А Ошбе ΐο 1Пе Рторетйек апб Изез о£ ЭеЮгдепЦ ίη Βίοίοβν апб Вюс11ет181гу (1992) Са1Ьюсйет Согр. Единственным ограничением на поверхностно-активные вещества, используемые в способах по настоящему изобретению, является то, что их используют в условиях и при концентрациях, которые не вызывают значительной необратимой денатурации 11СН или его варианта-агониста и не ингибируют полностью конъюгацию полимера. Поверхностно-активные вещества присутствуют в реакционных смесях в количествах от примерно 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,05 до 0,5% и наиболее предпочтительно от примерно 0,075 до 0,25%. Допускаются также смеси поверхностноактивных веществ.
Считается, что поверхностно-активные вещества обеспечивают временную обратимую защитную систему в процессе конъюгирования полимера. Было показано, что поверхностно-активные вещества избирательно препятствуют агрегации полимеров, в то же время давая возможность протекания конъюгации по лизину или аминоконцу.
Полиэтиленгликоль-модифицированный 11СН или его вариант-агонист по настоящему изобретению обладает более устойчивым фармакологическим эффектом, который, возможно, может быть связан с его пролонгированным периодом полужизни ίη νίνο.
К тому же полиэтиленгликоль-модифицированный 11СН или его вариант-агонист по настоящему изобретению может быть полезен для лечения гипогипофизарной карликовости (ОНО), недостаточности гормона роста у взрослых, синдрома Тернера, недостаточности роста у детей, которые родились с малым для гестационного возраста размером тела (8СА), синдрома Прадера-Вилли (РА8), хронической почечной недостаточности (СШ), связанного со СПИДом истощения и старения.
Полиэтиленгликоль-модифицированный 11СН или его вариант-агонист по настоящему изобретению может быть приготовлен в виде фармацевтических средств, содержащих также фармацевтически приемлемый разбавитель, агент для получения изотонического раствора, рН-кондиционер и т.п., для введения их пациенту.
Вышеуказанные фармацевтические средства можно вводить подкожно, внутримышечно, внутривенно, в легкие, интрадермально или перорально в зависимости от назначения лечения. Доза может зависеть также от вида и состояния нарушения у пациента, которого лечат, причем обычно она находится между 0,1 и 5 мг при инъекции и между 0,1 и 50 мг при пероральном введении для взрослого.
Охваченные полимерные вещества предпочтительно также водорастворимы при комнатной температуре. Неограниченный перечень таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры при условии сохранения водорастворимости блок-сополимеров.
В качестве альтернативы полимерам на основе РЕО могут быть использованы эффективно неантигенные материалы, такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов и т.п. Действительно, активация α- и ω-концевых групп этих полимерных веществ может быть осуществлена способами, подобными способам, используемым для превращения полиалкиленоксидов, и, следовательно, должна быть очевидна специалисту в данной области. Специалистам в данной области будет понятно, что вышеупомянутый перечень является просто иллюстративным и что имеются в виду все полимерные материалы, имеющие качества, описанные здесь. Для целей настоящего изобретения эффективно неантигенный означает все материалы, о котоых в данной области техники известно, что они нетоксичны и не вызывают заметного иммунногенного ответа у млекопитающих.
Определения
Ниже представлен перечень сокращений и их соответствующих значений, которые используются в материалах заявки взаимозаменяемо:
г грамм(ы) мг миллиграмм(ы) мл миллилитр(ы)
КТ комнатная температура
РЕО полиэтиленгликоль
Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок, процитированных в данном описании изобретения, включено сюда путем ссылки, как если бы каждая(ый) отдельная(ый) публикация, патент или патентная заявка были включены сюда специально и индивидуально.
Хотя вышеупомянутое изобретение подробно описано путем иллюстрации и приведения примера в
- 10 008505 целях ясности понимания специалистом, в свете данного изобретения, должно быть очевидно, что изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Следующие ниже примеры приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения, которое выше описано в более широких терминах.
В нижеследующих примерах ИОН представляет собой ЮН с последовательностью 8Εζ) Ю ΝΟ: 1. Понятно, что другие члены семейства полипептидов ИОН или его варианта-агониста также могут быть пэгилированы способом, аналогичным проиллюстрированному в последующих примерах.
Все процитированные ссылки, патенты или заявки во всей их полноте включены в данное описание изобретения путем ссылки, как если бы они были написаны здесь.
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано путем ссылки на следующие ниже примеры, которые, однако, не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1. Прямоцепочечный РЕС-АБП с молекулярной массой 20000 НСН.
О тРЕС— О-СН2СН2-СН
Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов НСН. монопэгилированных по Ν-концу, путем восстановительного алкилирования. Реагент метокси-линейный РЕСпропиональдегид с молекулярной массой приблизительно 20000 (8Нсаг\\а1сг Согр.) селективно связывали с Ν-концом НСН путем восстановительного аминирования, пользуясь разницей в величине относительной рКа первичного амина по Ν-концу против величин рКа первичных аминов по ε-аминоположению лизиновых остатков. НСН белок, растворенный в концентрации 10 мг/мл в 25 мМ МЕ8 (81дта СНсписа1. 81. Ьош8, МО) рН 6,0, 25 мМ Нерек (81дта СНсписа1. 81. Ьошк, МО) рН 7,0 или в 10 мМ ацетате натрия (8щта СНс11иса1. 81. Ьошк, МО) рН 4,5, подвергали взаимодействию с метокси-РЕС-пропиональдегидом, Μ-ΡΕΟ-ΑΕϋ (8Нсап\а1сг Согр., НшйкуШе, АЬ) путем добавления М-РЕС-АЕП до получения относительного молярного соотношения РЕС:11СН 0,1:0,7 на амин (возможно, 8% ацетонитрила также может быть добавлено). Реакции катализировали путем добавления исходного раствора 1М ΝηΕ’ΝΒΗι (8щта С11ет1са1, 81. Ьошк, МО), растворенного в Н2О, до конечной концентрации 10-50 мМ. Реакции проводили в темноте при температуре от 4°С до КТ в течение 18-24 ч. Реакции останавливали путем добавления 1М Тп5 (8щта С11ет1са1, 81. Ьошк, МО) ~рН 7,6 до конечной концентрации Тпк 50 мМ или разводили в подходящем буфере для немедленной очистки.
Пример 2. Прямоцепочечный РЕС-АБП с молекулярной массой 30000 НСН.
Реагент метокси-линейный РЕС-пропиональдегид с молекулярной массой 30000 (8Нсаг\\а1сг Согр.) связывали с Ν-концом 11СН, используя методику, описанную для примера 1.
Пример 3. Прямоцепочечный РЕС-АБП с молекулярной массой 5000 БОН.
Реагент метокси-линейный РЕС-пропиональдегид с молекулярной массой 5000 (Е1ика) связывали с Ν-концом 11СН, используя методику, описанную для примера 1.
Пример 4. Разветвленный РЕС-АБП с молекулярной массой 40000 БОН.
шРЕО-О—С-уН
Реагент метокси-разветвленный РЕС-альдегид (РЕС2-АЕО) с молекулярной массой 40000 (8Нсаг\\а1сг Согр.) связывали с Ν-концом 11СН, используя методику, описанную для примера 1.
Пример 5. Разветвленный РЕС-АБП с молекулярной массой 20000 НСН.
Реагент метокси-разветвленный РЕС-альдегид (РЕС2-АЕО) с молекулярной массой 20000 (8Нсаг\\а1сг Согр.) связывали с Ν-концом 11СН, используя методику, описанную для примера 1, с использованием молярных соотношений РЕС к 11СН от 0,1 до 0,5 на амин.
Пример 6. Прямоцепочечный 8РА-РЕС с молекулярной массой 30000 БОН.
-11 008505
Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов монопэгилированного НСН с использованием Ν-гидроксисукцинимидиловых (ΝΗ8) активных эфиров. Исходный раствор белка 11СН растворяли в концентрации 10 мг/мл в 0,25М НЕРЕ8 буфере, рН 7,2 (возможно, 8% ацетонитрила также может быть добавлено). Этот раствор затем подвергали взаимодействию с метоксиРЕСг-сукцинимидилпропионатом (8РА-РЕС) путем добавления 8РА-РЕС до получения относительного молярного соотношения РЕС:11СН от 0,1 до 0,65 на амин. Реакции проводили при температуре от 4°С до КТ в течение от 5 мин до 1 ч. Реакции останавливали путем снижения рН до 4,0 0,1н. уксусной кислотой или путем добавления 5-кратного молярного избытка Тп5 НС1.
Пример 7. Прямоцепочечный 8РА-РЕС с молекулярной массой 20000 11СН.
Реагент прямоцепочечный 8РА-РЕС с молекулярной массой 20000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с Ν-концом ИОН, используя методику, описанную для примера 6.
Пример 8. Прямоцепочечный биотин-8РА-РЕС с молекулярной массой 3400 11СН.
Реагент прямоцепочечный биотин- РЕ6-СО2-1\1Н8 с молекулярной массой 3400 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с ИОН, используя методику, описанную для примера 6.
Пример 9. Разветвленный ΝΗδ-РЕС с молекулярной массой 10000 11СН.
Разветвленный ΡΕΟ2-ΝΗ8 с молекулярной массой 10000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с 11СН. используя методику, описанную для примера 6.
Пример 10. Разветвленный ΝΗδ-РЕС с молекулярной массой 20000 11СН.
Разветвленный ΡΕΟ2-ΝΗ8 с молекулярной массой 20000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с 11СН. используя методику, описанную для примера 6.
Пример 11. Разветвленный ΝΗδ-РЕС с молекулярной массой 40000 11СН.
Разветвленный ΡΕΟ2-ΝΗ8 с молекулярной массой 40000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с 11СН. используя методику, описанную для примера 6.
Пример 12. Прямоцепочечный РЕС-ВТС с молекулярной массой 20000 ЮН.
РЕС-ВТС с молекулярной массой 20000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с ИОН, используя методику, описанную для примера 6. Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов пэгилированного ИОН с использованием бензотриазолкарбонатных производных РЕС.
Пример 13. Прямоцепочечный РЕС-88 с молекулярной массой 5000 11СН.
-12008505
Сукцинимидилсукцинат-РЕС с молекулярной массой 5000 (88-РЕС) (811саг\\а1сг Согр.) связывали с ИОН, используя методику, описанную для примера 6. Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов пэгилированного ИОН с использованием гидролизуемой связи.
Пример 14. Прямоцепочечный РЕС-СМ-НВА с молекулярной массой 20000 ИОН.
Карбоксиметилгидроксимасляную кислоту-РЕС с молекулярной массой 20000 (СМ-НВА-РЕС) (811сап\а1сг Согр.) связывали с ИОН, используя методику, описанную для примера 6. Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов пэгилированного ИОН с использованием гидролизуемой связи.
Пример 15. Прямоцепочечный 2-4 х РЕС-СМ-НВА с молекулярной массой 5000 ИОН.
РЕС-СМ-НВА с молекулярной массой 5000 (811саг\\а1сг Согр.) связывали с ИОН, используя процедуру, описанную для примера 13.
Пример 16. Прямоцепочечный ΗΖ-РЕС с молекулярной массой 20000 ИОН.
ΡΕβ~ΟΟΗ2ΟΟΝΗΝΗ2
Этот пример демонстрирует способ получения, по существу, гомогенных препаратов пэгилированного ИОН с использованием метокси-РЕС-гидразида, ΗΖ-РЕС, с молекулярной массой 20000 (811саг\\а1сг Согр.). Исходный раствор белка ИОН растворяли в концентрации 10 мг/мл в 10 мМ МЕ8, рН 4,0. Этот раствор затем подвергали взаимодействию с ΗΖ-РЕС путем добавления твердого вещества до получения относительного молярного соотношения РЕС:11СН от 0,1 до 5,0 на карбоксильную группу. Реакции катализировали карбодиимидом (ЕЭС, ЕОАС, ЕОЕС) в конечной концентрации от 2 до 4 мМ. Реакции осуществляли при 4°С в течение периода от 2 ч до в течение ночи или при комнатной температуре в течение периода от 10 мин до в течение ночи. Реакции останавливали путем удаления неконъютированного РЕС и карбодиимида путем очистки катионным обменом.
Пример 17. Мультипэгилированные продукты.
Модифицированные 11СН5. имеющие два или более присоединенных РЕС (мультипэгилированные), были получены также из продуктов примеров 1 и 4 и отделены от монопэгилированных продуктов с использованием анионообменной хроматографии. Модифицированные ИОН, имеющие два или более присоединенных РЕС (мультипэгилированные), также отделяли от монопэгилированных продуктов с использованием катионообменной хроматографии. Модифицированные ИОН, имеющие два или более присоединенных РЕС (мультипэгилированные), также были получены в примеров 2, 3, 5-13 и очищены аналогично примерам 1 и 4.
Пример 18. Очистка пэгилированного ИОН.
Пэгилированные ИОН продукты очищали от реакционной смеси до чистоты более 95% (8ЕС анализ) одностадийной ионообменной хроматографией.
Анионообменная хроматография
РЕС-11СН продукты очищали от реакционной смеси до чистоты более 95% (8ЕС анализ) одностадийной анионообменной хроматографией. Монопэгилированный ИОН очищали от немодифицированного ИОН и мультипэгилированных ИОН продуктов с использованием анионообменной хроматографии. Типичную реакционную смесь 20К альдегид ИОН (5-100 мг белка), как описано выше, очищали на ζ)8ср11аго5с Нйгар колонке (1 или 5 мл) (Ашегейаш Рйагтас1а Βίοίοοίι. Р|5са1а\\ау. N1) или О-8ср11аго5с £а§1 11ο\ν колонке (26/20, объем слоя 70 мл) (Ашегейаш Рйагтас1а Βίοΐεοίι, Р|5са1а\\ау. N1), уравновешенной в 25 мМ НЕРЕ8, рН 7,3 (буфер А). Реакционную смесь разбавляли 5-10-кратно буфером А и загружали на колонку со скоростью потока 2,5 мл/мин. Колонку промывали 8-колоночными объемами буфера А. Затем различные ИОН продукты элюировали с колонки в 80-100-колоночные объемы буфера А и линейный градиент ΝηΟ 0-100 мМ. Элюант контролировали по поглощению при 280 нм (А28С1) и 5 мл фракции собирали. Фракции объединяли по степени пэгилирования, например моно, ди, три и т.д. (как определено в примере 15). Пул затем концентрировали до 0,5-5 мг/мл в концентраторе СсШпргср ΥΜ10 (Апйсои, Тес1шо1о§у СогрогаОоп. ΝοΠίιΕοϊΌΐίβΙι. МА). Концентрацию белка в пуле определяли по А280, используя коэффициент экстинкции 0,78. Общий выход очищенного моно 20К РЕС-альдегид-ЬСН из этого процесса составил 25-30%.
Катионообменная хроматография
Катионообменную хроматографию проводят на высокоэффективной колонке 8Р 8ер11аго5С (Рйаппас1а ХК 26/20, объем слоя 70 мл), уравновешенной в 10 мМ ацетате натрия, рН 4,0 (буфер В). Реакционную смесь разбавляют 10-кратно буфером В и загружают на колонку со скоростью потока 5 мл/мин. Затем колонку промывают 5-колоночными объемами буфера В, а затем 5-колоночными объемами 12% буфера С (10 мМ ацетат, рН 4,5, 1М №1С1). После этого РЕС-11СН продукт элюируют с колонки линейным гра
-13 008505 диентом от 12 до 27% буфера С в 20-колоночные объемы. Элюант контролируют при 280 нм и собирают 10 мл фракции. Фракции объединяют по степени пэгилирования (моно, ди, три и т.д.), обменивают в 10 мМ ацетатный буфер, рН 4,5, и концентрируют до 1-5 мг/мл во встряхиваемой кювете, оснащенной мембраной Апйсои ΥΜ10. Концентрацию белка в пуле определяют по поглощению при А280 нм, используя коэффициент экстинкции 0,78. Общий выход монопэгилированного ИОН из этого процесса составляет от 10 до 50%.
Пример 19. Биохимическая характеризация.
Пулы очищенного пэгилированного ИОН характеризовали восстановительным и невосстановительным 8Э8-РАСЕ. неденатурирующей и денатурирующей размер-эксклюзионной хроматографией, аналитической анионообменной хроматографией, Ν-концевым секвенированием, хроматографией гидрофобного взаимодействия и НРЬС с обращенной фазой.
Размер-эксклюзионная хроматография-высокоэффективная жидкостная хроматография (8ЕС-НРБС) Неденатурирующая 8ЕС-НРБС.
Реакцию метокси-РЕС различных химизмов присоединения, размеров, линкеров и геометрий с БОН, пулы анионообменной очистки и конечные очищенные продукты оценивали с использованием неденатурирующей 8ЕС-НРБС. Аналитическую неденатурирующую 8ЕС-НРБС осуществляли с использованием колонки ТокоБаак С4()()()Р\УХБ. 7,8 мм х 30 см (ТокоБаак АшегеБаш Вю8с1еисе, Р|5са1а\\ау. N1) или Бирегбех 200 (АшегеБаш Вю8с1еисе, Р|5са1а\\ау. N1) в 20 мМ фосфате с рН 7,2, 150 мМ №1С1 при скорости потока 0,5 мл/мин. Пэгилирование сильно увеличивает гидродинамический объем белка, приводя к сдвигу к более раннему времени удерживания. Новые продукты наблюдались в реакционных смесях РЕО альдегид БОН наряду с ^модифицированным БОН. Зги пэгилированные и непэгилированные продукты разделяли хроматографией на О-8срНаго5С. и затем было показано, что полученные очищенные моноРЕС-альдсгид-НСН продукты элюируются в виде едничного пика при неденатурирующей БЕС (чистота более 95%). Стадия хроматографии на О-8срНаго5С обеспечила эффективное удаление свободных РЕС, БОН и мультипэгилированных БОН продуктов из монопэгилированных БОН. Неденатурирующая 8ЕСНРЬС продемонстрировала, что эффективный размер различных пэгилированных БОН был намного больше, чем их соответственные теоретические молекулярные массы (табл. 1).
Таблица 1
Размер-эксклюзионная хроматография (БЕС)
| Молекулярная масса (теоретическая) | Размер (8ЕС) | |
| НОН | 22000 | 21000 |
| 4-6 х 5К РЕС-8РА ОН | 47000 | 128000 |
| 2-4 х 5К РЕО-СМНВА (ΝΗ8) ОН | 37000 | 71000 |
| 20К. РЕО-АЬП ОН | 42000 | 120000 |
| 20К разветвленный РЕС-АЕ1) ОН | 42000 | 114000 |
| 20К РЕО-СМНВА (ΝΗ8) ОН | 42000 | 115000 |
| 20К РЕС-Гидразид ОН | 42000 | 125000 |
| 2х20К РЕС-АББ ОН | 62000 | 250000 |
| ЗОК РЕС-АЬВ ОН | 52000 | 231000 |
| ЗОК РЕО-8РА ОН | 52000 | 183000 |
| 2х30К РЕО-8РА ОН | 82000 | 569000 |
| 40К разветвленный РЕО-АЬО ОН | 62000 | ЗЗОООО |
| 40К разветвленный ΡΕΟ-ΝΗ8 ОН | 62000 | 253000 |
Денатурирующая БЕС-НРЬС.
Взаимодействие различных метокси-РЕС с БОН, фракций анионообменной очистки и конечные очищенные продукты оценивали с использованием денатурирующей 8ЕС-НРБС. Аналитическую денатурирующую БЕС-НРЬС осуществляли с использованием колонки ТокоБаак ЗОООБХУХЬ 7,8 мм х 30 см, (То50Баз5 РЬапиас1а Вю!есБ, Р|5са1а\\ау. N1) в 100 мМ фосфате с рН 6,8, 0,1% 8ϋ8 при скорости потока 0,8 мл/мин. Пэгилирование сильно увеличивает гидродинамический объем белка, приводя к сдвигу к более раннему времени удерживания. Новые продукты наблюдались в реакционной смеси 20К РЕС альдегид БОН наряду с ^модифицированным БОН. Эти пэгилированные и непэгилированные продукты
-14008505 разделяли хроматографией на О-8ср11аго5С. и затем было показано, что полученный очищенный моно 20К РЕС-альдегид ИОН элюируется в виде единичного пика при денатурирующей 8ЕС (чистота более 95%). Стадия хроматографии на О-8ер11аго5е обеспечила эффективное удаление свободных РЕС, ИСН и мультипэгилированных ИСН продуктов из монопэгилированного ИСН.
8Ό8 РАСЕ/РУЭЕ перенос.
8Э8-РАСЕ использовали для оценки реакции различных РЕС реагентов с ИСН и очищенными конечными продуктами. Примеры этой методики показаны с использованием моно 20К линейного и разветвленного 20К и 40К РЕС альдегида и 4x6 5К 8РА РЕС (фиг. 1 и 2). δΌδ-РАСЕ осуществляли на 1020% ΤτΪ8 трициновых гелях толщиной 1 мм (Ιηνίΐτο^βη, СаткЬаб, СА) в восстановительных и невосстановительных условиях и окрашивали с использованием набора для окрашивания Νονβχ Со11о1ба1 Соотакые™ С-250 (ΙηνίίΓΟβοη, СатИЬаб, СА). Очищенные моно РЕС-альдегид ИСН продукты мигрируют в виде одной основной полосы на 8Э8-РАСЕ. Полосы блоттировали на РУЭЕ (поливинилиденфторидную) мембрану для последующей идентификации Ν-концевой последовательности.
Аналитическая анионообменная НРЬС.
Аналитическую анионообменную НРЬС использовали для оценки реакции различных тРЕС с ИСН, фракциями анионообменной очистки и конечными очищенными продуктами. Аналитическую анионообменную НРЬС осуществляли с использованием Токойаак 05Р\У или ЭЕАЕ-Р\У анионообменной колонки 7,5х75 мм (Токойаак РИаттааа Вю1есй, РБсаЕпуау, N1) в 50 мМ Тп§, рН 8,6, при скорости потока 1 мл/мин. Образцы элюировали линейным градиентом 5-200 мМ №С1.
НРЬС с обращенной фазой (КР-НРЬС).
Реакционные смеси РЕС-СН и очищенные пэгилированные продукты анализировали КР-НРЬС для идентификации ИСН продуктов, моно- и мультипэгилированных ИСН продуктов и для отслеживания окисленных форм ИСН, а также изоформ РЕС ИСН, имеющих единственный РЕС, связанный по различным сайтам (например, Ν-конец против ε-аминогрупп лизина). КР-НРЬС осуществляли с использованием колонки КР-НРЬС 2отЬах 8Β-ΟΝ 150 или 250х4,6 мм (3,5 или 5 мм). Эксперименты проводили при температуре окружающей среды при типичной загрузке 10 мг белка на образец. Буфер А представляет собой 0,1% трифторуксусную кислоту в воде, буфер В представляет собой 0,1% трифторуксусную кислоту в ацетонитриле. Градиент, который приводит к '/>% увеличению в В в минуту, следующий:
| Стадия | Время | Поток | %А | %В | Стадия |
| 0 | 0 | 1 | 60 | 40 | 0 |
| 1 | 3 | 1 | 60 | 40 | 0 |
| 2 | 20 | 1 | 50 | 50 | 1 |
| 3 | 2 | 1 | 60 | 40 | 1 |
| 4 | 6 | 1 | 60 | 40 | 0 |
Ν-концевая последовательность и пептидное картирование.
Химизм автоматизированного расщепления Эдмана использовали для определения М42-концевой последовательности белка. Секвенатор Аррйеб Вюкуйетк Мобе1 494 Ртосще (Регкш Е1тег, ХМеПеМеу, МА) использовали для расщепления. Соответствующие РТН-АА производные идентифицировали КРНРЬС анализом в оперативном режиме, используя Аррйеб Вюкуйетк Мобе1 140С РТН анализатор, снабженный колонкой РТН-С18 Реткш Е1тег/Вго^н1ее с внутренним диаметром 2,1 мм. Полосы белков 20К линейного и 20 и 40К разветвленного РЕС-АЬЭ ИСН, перенесенные на РУЭЕ мембраны, или растворы очищенных 20К линейного и разветвленного 20 и 40К РЕС-АЬЭ ИСН секвенировали. Наблюдался очищенный 20К линейный РЕС-ИСН, дающий основной сигнал (выход приблизительно 88%), который обладал ожидаемой последовательностью для ИСН, за исключением отсутствия Ν-концевой аминокислоты. Этот результат является таким, как и ожидалось для белка, пэгилированного по Ν-концу посредством химического взаимодействия с альдегидом. Остаток первого цикла является невыделяемым из-за присоединенной РЕС группировки. Минорный сигнал (выход приблизительно 12%) имел правильную Νконцевую аминокислотную последовательность. Учитывая, что пик, снятый с КР-НРЬС, является 100% пэгилированным, эти данные предполагают, что приблизительно 88% РЕС модификации имеет место по Ν-концу, а остальная часть, очевидно, связана с одним из нескольких возможных лизиновых остатков.
Триптические гидролизаты готовили в концентрации 1 мг/мл и, как правило, использовали 50 мкг материала на гидролизат. Трипсин добавляли так, чтобы отношение трипсина к РЕС-ИСН составляло 1:30 (мас./мас.). Ттщ-буфер присутствовал в концентрации 30 мМ, рН 7,5. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 16±0,5 ч. Реакции гасили путем добавления 50 мкл 1н. НС1 на мл гидролизного раствора. Перед помещением образцов в автодозатор образцы разводили до конечной концентрации 0,25 мг/мл в 6,25% ацетонитриле. Ацетонитрил добавляли первым (до 19,8% ацетонитрила), осторожно перемешивали, а затем добавляли воду до конечного объема (четырехкратный начальный объем). Избыточный гидролизный раствор можно удалить и хранить в течение вплоть до 1 недели при -20°С.
Для анализа использовали НРЬС систему \Уа1ег5 АШаисе 2695, но другие системы должны давать
- 15 008505 аналогичные результаты. Использовали полимерную колонку Л51се С-4 25 см х 4,6 мм с частицами 5 мкм. Эксперименты проводили при температуре окружающей среды при типичной загрузке 50 мкг белка на образец. Буфер А представляет собой 0,1% трифторуксусную кислоту в воде, буфер В представляет собой 0,085% трифторуксусную в ацетонитриле. Градиент следующий:
| Время | А% | В% | С% | ϋ% | Поток | Кривая |
| 0,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | 0,0 | 1,000 | 1 |
| 90,00 | 0,0 | 0,0 | 55,0 | 45,0 | 1,000 | 6 |
| 90,10 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | 1,000 | 6 |
| 91,00 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | 1,000 | 6 |
| 91,10 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | 0,0 | 1,000 | 6 |
| 95,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | 0,0 | 1,000 | 6 |
Колонку нагревали до 40°С, используя нагревательную рубашку. Пики определяли, используя \Уа1сг5 996 ΡΌΑ детектор, собирающий данные между 210 и 300 нм. Полученную при 214 нм хроматограмму использовали для анализа образцов для определения степени Ν-концевого пэгилирования (потеря фрагмента Т-1), как показано в табл. 2.
Таблица 2
| Образец | %Т-1 присутствующего | %Т-1 потерянного | %Т-1, присутствующего по сравнению с контролем |
| Альдегид | |||
| 5К ΑΕΌ | 2,0 | 98,0 | 7,4 |
| 20К | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 2х20К | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 30К | 1,3 | 98,7 | 4,5 |
| 40К разветвленный | 1,9 | 98,1 | 6,8 |
| ΝΉ8 | |||
| 4-6x5 8ΡΑ | 1,3 | 98,7 | 4,7 |
| 2-4x5 СМ | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 20К СМ | 23,1 | 76,9 | 84,1 |
| 30К | 18,2 | 81,8 | 63,9 |
| 2х30К | 5,7 | 94,3 | 19,9 |
| 40К разветвленный | 20,9 | 79,1 | 73,5 |
Пример 20. Фармакодинамические исследования.
Исследования эффективности на гипофизэктомированных крысах
Самок крыс 8ргадие Эа\\1су. гипофизэктомированных в Наг1ап ЬаЬк, предварительно исследовали на скорость роста в течение периода 7-10 дней. Затем исследования роста проводили в течение 11 дней. Крысы были разделены на группы по 6-8. Группа 1 состояла из крыс, которым либо ежедневно, либо в день 0 и в день 6 подкожно вводили дозу(ы) носителя. Группе 2 ежедневно подкожно вводили дозы СН (0,3 мг/кг/доза). Группе 3 подкожно вводили дозы СН в день 0 и в день 6 (1,8 мг/кг/доза). Группе 4 подкожно вводили дозы РЕС-СНк в дни 0, 6 (1,8 мг/кг/доза). Осуществляли мониторинг увеличения массы гипофизэктомированных крыс взвешиванием их, по меньшей мере, через день на протяжении всего исследования. Увеличения массы (среднее +/- 8ЕМ (среднеквадратическая погрешность измерения)) для 20К РЕС-ΑΕΌ ЙСН, 20К и 40К разветвленного РЕС-ΑΤΌ ЙСН, и 4-6х 5РЕС-8РА ЙСН, дозированных раз в неделю, были аналогичны увеличениям при ежедневном дозировании 11СН (фиг. 3 и 4). В табл. 3 суммировано общее увеличение массы (среднее +/- 8ЕМ) на день 11 при еженедельном дозировании различных пэгилированных молекул 11СН по отношению к ежедневному дозированию 11СН.
- 16 008505
Таблица 3
Увеличение массы крысы
| Соединение | Однократная еженедельная доза (мг/кг) | Ежедневное увеличение массы в граммах/день (день 0-день 11) (среднее ± 8ЕМ) | % увеличения массы относительно ежедевного ЬСН увеличения (среднее) |
| нон (непэгилироваиный) | 1,8 | 0,97 ±0,12 | 39% |
| ЗК линейный РЕО- АШ ОН | 1,8 | , 0,96 ± 0,27 | 36% |
| 2(Ж линейный РЕС- АЕПОН | 1,8 | 1,99 ±0,13 1,43 ±0,08 1,7 ±0,10 | 73% |
| 20К линейный СМ- НВА РЕО ОН | 1,8 | 2,36 ±0,11 | 99% |
| 20К линейный РЕС- НТО ОН | 1,8 | 2,62 + 0,22 | 99% |
| 20К разветэленный РЕО-АЬО ОН | 1,8 | 2,24 ± 0,07 | 87% |
| ЗОК линейный РЕ6- АЬО ОН | 1,8 | 2,11 ± 0,06 1,85 ±0,14 | 94% |
| ЗОК линейный РЕО- ЗРАОН | 1,8 | 2,6 ±0,1 | 117% |
| 40К разветвленный РЕО-АШ ОН | 1,8 | 2,57 ± 0,08 | 100% |
| 40К разветвленный ΡΕΟ-ΝΗ8 ОН | 1,8 | 2,53 ±0,09 | 121% |
| 2х20К РЕС-ΑΤϋ ОН | 1,8 | 2,66 ±0,10 | 128% |
| 4-6х5К 5РА-РЕО ОН | 1.8 | 3,18 ± 0,10 | 124% |
| 24х5К СМ-НВА- РЕС ОН | 1.8 | 3,54 ±0,15 | 134% |
| 2x3 (Ж линейный РЕ0-5РА ОН | 1,8 | 3,1 ±0,1 | 134% |
По завершении каждого исследования роста животных умерщвляли и анализировали длины костей (большеберцовых). На фиг. 6 показано изменение длины большеберцовой кости (среднее +/- 8ЕМ) на день 11 в ответ на различные конъюгаты РЕС-СН. дозированные в день 0 и день 6, или ИОН, дозированный ежедневно. Уровни ЮЕ-1 у гипофизэктомированных крыс
Эксперименты проводили, как указано выше для исследования увеличения массы, однако, образцы крови отбирали в день 0, 1, 2, 3, 4, 5 и при умерщвлении животных в день 9. Уровни ЮЕ-1 определяли с помощью ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ). На фиг. 7 представлено сравнение увеличений уровней ЮЕ-1 в сыворотке (среднее +/- 8ЕМ) у гипофизэктомированных крыс либо после ежедневного дозирования ИОН, либо после однократной дозы ЙОН, либо после дозирования пэгилированного ЙОН в день 0, день 6.
Фармакокинетические исследования
Фармакокинетические исследования проводили на нормальных, 8рга§ис-0а\\1су самцах крыс, мышах и обезьянах Супото1§и5. Инъекции делали либо в виде однократного подкожного (п.к.) болюса 1,8 мг/кг, либо в виде однократной в.в. (внутривенной) дозы 1,0 мг/кг СН или РЕС-СН крысам и мышам, используя 6 крыс и до 60 мышей на группу. У обезьян Супото1§и5 дозу СН или РЕС-СН 0,18 мг/кг использовали и для однократного подкожного болюса, и для в.в. инъекции, используя 2-4 обезьяны на группу. Образцы крови отбирали в течение 1-5 дней, где как подходит, для оценки релевантных ФК (фармакокинетических) параметров (табл. 4). (О = предельный период полужизни, (С1) = клиренс, (Ттах) = время до максимальной концентрации, У§8 = объемное распределение (видимое) в устойчивом состоянии, и (Стах) = максимальные уровни концентрации СН и РЕС-СН в крови, регистрируемые с использованием иммуноанализа при каждом отборе образца.
Иммуноанализ ЙСН
Уровни концентрации ЙСН и пэгилированного ЙСН белка в плазме крысы, мыши и обезьяны Супото1ди8 определяли с использованием ЙСН АиШЭЕЙП А набора для флуоресцентного иммуноанализа (РегкшЕйпег ЫГе 8с1спсс5). используя соответствующий РЕС ЙСН для построения стандартной кривой.
- 17008505
Таблица 4
| Вины | Параметры | 40К Вг АШ ПСИ | 40КВг ΝΗ5ЪСН | зок АЬВЬСН | 20К АЬПЬСН | 4-6х 5К 8РА |
| МЫШЬ | Дота (мг/кг) | в.в, 1,0 п.к. 1,8 | в.в. 1,0 п.к. 1,8 | в.в. 1,0 п.к. 1,8 | в.в. 1,0 п.к. 1,0 | в.в. 1,0 п.к. 1,8 |
| СЬ (мл/ч/кг) | 2.29 | 2.12 | 4,43 | 7,89 | 4,53 | |
| У55 (мл/кг) | 18 | 16 . | 24 | 17 | 51 | |
| Т|Ч,и- (ч) | 4.3 | 3,8 | 2,8 | 1,8 | 11 | |
| Т1Л^ (ч) | 4 | 6,2 | XI | 2,5 | 9 | |
| Ттах, лк. (ч) | и | 9 | 6 | 3 | 12 | |
| 8САЦС (площадь под кривой) (мкг/мл *ч) | 682 | 577 | 160 | 31 | 668 | |
| 5С Бнвдоступ- НОСТЬ (¾) | 87 | 67 | 39 | 24 | 167 | |
| крьтся | Д(ЛЗ (мг/кг) | В. В. 1,0 п.к, 1,8 | в.в. 1,0 п.к. 1,8 | в.в. 1,0 п.к. 1,8 | в.в. 1,8 п.к.1,8 | в.в, 1,0 п.к. 1Р8 |
| сь (мл/ч/кг) | 1Д6 | 1,75 | 5,75 | 9,9 | 2,9 | |
| Уза (мл/кг) | 19 | 25 | 44 | 33 | 36 | |
| Τιλ, м ¢4) | 5,4 | 5,8 | 3.6 | 2Д | 24 | |
| ΊΊΰ,η.κ. <Ч) | 5,8 | 7,1 | 6,7 | 2,9 | 29 | |
| Ттах, п.к. (ч) | 24 | 22 | 12 | 9 | 20 | |
| 8С лис (площадь под кривой) (мкг/мл*ч) | 398 | 344 | 97 | 70 | 249 | |
| 8С Биодоступность (%) | 30 | 33 | 31 | 39 | 40 | |
| Суп о | Доза (мг/кг) | в.в. 0,18 п.к. 0,18 | в.в. 0,18 п.к. 0,18 | в.в. 0,18 п.к. 0,18 | в.в, 0,18 п.к. 0,18 | в.в. 0,18 п.к. 0,18 |
| СЬ (мл/ч/кг) | 1,83 | 0,78 | 1,94 | 2,19 | 0,49 | |
| ν§5 (мл/кг) | 57 | 20 | 29 | 44 | 25 | |
| Т1Л, 8.8. (4) | 21 | 13,6 | 14,9 | 7,3 | 38 | |
| Т1д,вж, (4) | 19 | 21 | 12 | 8,3 | 35 | |
| Ттах, п.к. (ч) | 22 | 22 | 10 | 8 | 32 | |
| 8С лис (площадь под кривой) (мкг/мл*ч) | 100 | 483 | 125 | 38 | 242 | |
| 5С Биодоступность (%) | 64 | 77 | 97 | 44 | 66 |
-18008505
Перечень последовательностей <110> РЬаппаоха СохрохаНоп
Γίηη, Йогу
Ыао, Ηβί
31еде1, Не<3 <120> СНЕМ1САЬЬУ-МОС1Р1ЕЬ НЦМАЯ СКСЩТН ΗΟΒΜΟΝΕ СОШиСАТЕЗ <130> 03582/1/РСТ <150> из 60/331907 <151> 2001-11-20 <160> 1 <170> РаЬепЫп νβχβίοη 3.1 <210> 1 <211> 191 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 1
| РЬе | Рго | ТЬг | Не | Рхо | Ьеи | Зег | Агд | Ьеи | РЬе | Азр | Азр | А1а | Мег; | Ьеи | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| А1а | Н1з | Агд | Ьеи | Н1е | О1п | Ьеи | А1а | РЬе | Азр | ТЬг | Тух | О1п | О1и | РЬе | 01и |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| С1и | А1а | Туг | Не | Рго | Ьуз | е1и | 31п | Ьуе | Тух | Зег | РЬе | Ьеи | С1п | Азр | Рго |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| <31п | Ин | Зет | Ьеи | Суз | РЬе | Зег | 01и | Зег | Не | Рго | ТЬг | Рхо | Зег | Азр | Ахд |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 03582 | !_1_РСТ.ЗТ25. | ехе | |||||||||||||
| С1и | <31и | ТЬг | О1п | С1п | ьуз | Зег | Азр | Ьеи | Б1и | Ьеи | Ьеи | Агд | Не | Зег | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | Не | О1п | Зег | Тгр | Ьеи | С1и | Рго | νβΐ | (31п | Зег | Ьеи | Агд | Зег | ϊβΐ |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РЬе | А1а | Азр | Зег | Ьеи | Уа1 | Тух | <Э1у | А1а | Зег | Азр | Зег | Азр | Туг | Азр | |
| 100 | 105 | • | 110 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | Ьуз | Азр | Ьеи | С1и | С1и | е1у | Не | С1П | ТЬг | Ьеи | МеЬ | <Э1у Агд | Ьеи | |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| С1и | Азр | Б1у | Зег | Рго | Агд | ТЬг | Б1у | Б1П | Не | РЬе | Ьуз | 61п | ТЬг | туг | Зег |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ьуз | РЬе | Азр | ТЬг | Азр | Зег | Н1з | Азр Азр | Азр | А1а | Ьеи | Ьеи | Ьуз | Азр | Туг | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| С1у | Ьеи | Ьеи | Тух | Суз | РЬе | Агд | Ьуз | Азр | МеН | Азр | Ьуз | νβΐ | С1и | ТЬх | РЬе |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ьеи | Лтд | Не | Уа1 | <31п | Суз | Ахд | Зег Уа1 | 01и | б!у | Зег | Суз | 81у | РЬе |
130 1В5 190
- 19008505
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Конъюгат гормон роста человека (йСН)-полиэтиленгликоль (РЕС) формулыН тРЕС 'ЬСН где гормон роста человека (ЮН) содержит аминокислотную последовательность 8 ЕС Ш N0: 1, а тРЕС представляет собой метоксиполиэтиленгликоль, конъюгированный с аминоконцевой ос-аминогруппой в 8ЕС Ю ΝΟ: 1.
- 2. Конъюгат по π. 1, где указанная амино концевая α-амино группа находится на фенилаланине аминокислотной последовательности §Εζ) Ш N0: 1.
- 3. Конъюгат по и.2, где по меньшей мере 90% указанного метоксиполиэтиленгликоля конъюгировано с аминоконцевым фенилаланином.
- 4. Конъюгат по п.З, где указанный метоксиполиэтиленгликоль имеет молекулярную массу примерно 30 к Да.
- 5. Способ лечения пациента с нарушением роста или развития, выбранным из группы, состоящей из дефицита гормона роста (СЕЮ). синдрома Тернера, хронической почечной недостаточности, малого для гестационного возраста размера тела (8СА), при котором указанному пациенту вводят терапевтически эффективное количество 11СН конъюгата по пп.1, 2, 3 или 4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33190701P | 2001-11-20 | 2001-11-20 | |
| PCT/US2002/037270 WO2003044056A2 (en) | 2001-11-20 | 2002-11-20 | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200400565A1 EA200400565A1 (ru) | 2005-06-30 |
| EA008505B1 true EA008505B1 (ru) | 2007-06-29 |
Family
ID=23295870
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200400565A EA008505B1 (ru) | 2001-11-20 | 2002-11-20 | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека |
| EA200700431A EA200700431A1 (ru) | 2001-11-20 | 2002-11-20 | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700431A EA200700431A1 (ru) | 2001-11-20 | 2002-11-20 | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1453859A2 (ru) |
| JP (2) | JP2005525302A (ru) |
| KR (2) | KR20050044858A (ru) |
| CN (1) | CN1608079A (ru) |
| AP (1) | AP2004003050A0 (ru) |
| AU (1) | AU2002356990A1 (ru) |
| BR (1) | BR0214451A (ru) |
| CA (1) | CA2467731A1 (ru) |
| CO (1) | CO5580794A2 (ru) |
| EA (2) | EA008505B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP045114A (ru) |
| GE (1) | GEP20063860B (ru) |
| HR (1) | HRP20040448A2 (ru) |
| HU (1) | HUP0500997A2 (ru) |
| IL (1) | IL162031A0 (ru) |
| IS (1) | IS7268A (ru) |
| MA (1) | MA27544A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA04004809A (ru) |
| NO (1) | NO20042182L (ru) |
| OA (1) | OA13063A (ru) |
| PL (1) | PL374354A1 (ru) |
| RS (1) | RS53104A (ru) |
| TN (1) | TNSN04090A1 (ru) |
| WO (1) | WO2003044056A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200403907B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010021570A1 (ru) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| US6916962B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-07-12 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| US6956135B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-10-18 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| AU2002357806A1 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-23 | Sun Bio, Inc. | Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| US7041855B2 (en) | 2001-12-11 | 2006-05-09 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| KR100964411B1 (ko) * | 2002-01-18 | 2010-06-15 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 생물학적 활성 화합물과 컨쥬게이팅되는 잔기를 갖는 폴리알킬렌 글리콜 |
| EP1591467A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-11-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone |
| US7157546B2 (en) | 2002-09-09 | 2007-01-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Water-soluble polymer alkanals |
| US20040142870A1 (en) * | 2002-11-20 | 2004-07-22 | Finn Rory F. | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
| US20050281778A1 (en) * | 2003-03-28 | 2005-12-22 | Myung-Ok Park | Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer |
| ES2349743T3 (es) * | 2003-10-10 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Derivados de la il-21. |
| US7524813B2 (en) | 2003-10-10 | 2009-04-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Selectively conjugated peptides and methods of making the same |
| RU2385879C2 (ru) * | 2004-01-21 | 2010-04-10 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Способ конъюгации пептидов, опосредованной трансглутаминазой |
| AP2007003919A0 (en) * | 2004-08-31 | 2007-02-28 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | Glycerol branched polyethylene glycol human growthhormone conjugates, process for their prepation a nd methods of use thereof |
| SG161210A1 (en) * | 2004-12-22 | 2010-05-27 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| KR20070090023A (ko) * | 2004-12-22 | 2007-09-04 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형 인간 성장 호르몬 |
| DK2399893T3 (en) * | 2004-12-22 | 2018-10-08 | Ambrx Inc | COMPOSITIONS CONTAINING, INVOLVING PROCEDURES, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES |
| WO2006084888A2 (en) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | Novo Nordisk A/S | C-terminally pegylated growth hormones |
| EP1877439B1 (en) | 2005-04-18 | 2011-02-09 | Novo Nordisk A/S | Il-21 variants |
| AU2006286486A1 (en) | 2005-08-30 | 2007-03-08 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid formulations of pegylated growth hormone |
| RS51998B (en) * | 2005-11-08 | 2012-04-30 | Ambrx Inc. | ACCELERATORS FOR MODIFICATION OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND NON-NATURAL AMINO ACID POLYPEPTIDES |
| EP1968635B1 (en) | 2005-12-14 | 2014-09-17 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| AU2007271150A1 (en) | 2006-07-07 | 2008-01-10 | Novo Nordisk Health Care Ag | New protein conjugates and methods for their preparation |
| CN101108895B (zh) * | 2006-07-19 | 2011-10-26 | 北京键凯科技有限公司 | 聚乙二醇乙醛衍生物及其与药物的结合物 |
| AU2007310777A1 (en) | 2006-10-26 | 2008-05-02 | Novo Nordisk A/S | IL-21 variants |
| CL2008002399A1 (es) | 2007-08-16 | 2009-01-02 | Pharmaessentia Corp | Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c. |
| ES2453946T3 (es) | 2008-04-03 | 2014-04-09 | Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. | Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta |
| KR101104574B1 (ko) * | 2008-05-14 | 2012-01-11 | 성균관대학교산학협력단 | 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도 |
| JP5639585B2 (ja) * | 2008-07-31 | 2014-12-10 | ファーマエッセンティア コーポレイション | ペプチド−ポリマー共役体 |
| MX2011000847A (es) | 2008-08-06 | 2011-02-25 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. |
| JP5766118B2 (ja) * | 2008-09-11 | 2015-08-19 | ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション | ポリマー性アルファ−ヒドロキシアルデヒドおよびケトン反応剤ならびに抱合方法 |
| US8513192B2 (en) | 2009-01-22 | 2013-08-20 | Novo Nordisk A/S | Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation |
| JP6086528B2 (ja) | 2009-08-06 | 2017-03-01 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 長期のインビボ有効性を有する成長ホルモン |
| SG181648A1 (en) | 2009-12-15 | 2012-07-30 | Ascendis Pharma As | Dry growth hormone composition transiently linked to a polymer carrier |
| RU2012134974A (ru) | 2010-01-22 | 2014-02-27 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Стабилизированное соединение гормона роста |
| TWI508737B (zh) | 2010-01-22 | 2015-11-21 | 諾佛 儂迪克股份有限公司 | 具有延長的活體內功效的生長激素 |
| NZ603399A (en) * | 2010-05-17 | 2014-09-26 | Cebix Inc | Pegylated c-peptide |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
| EA019967B1 (ru) * | 2011-12-21 | 2014-07-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") | Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека |
| ES2841123T3 (es) | 2013-04-05 | 2021-07-07 | Formulacion Del Compuesto De La Hormona De Crecimiento | Formulación del compuesto de la hormona de crecimiento |
| EP4282485A3 (en) | 2014-11-06 | 2024-01-17 | PharmaEssentia Corporation | Dosage regimen for pegylated interferon |
| IL254389B2 (en) * | 2015-03-11 | 2023-03-01 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates and the il–7 group |
| SG11201802180TA (en) | 2015-09-18 | 2018-04-27 | Univ Miyazaki | Long-acting adrenomedullin derivative |
| CN114539384A (zh) * | 2020-11-19 | 2022-05-27 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992016555A1 (en) * | 1991-03-18 | 1992-10-01 | Enzon, Inc. | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
| WO1993000109A1 (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| DK0458064T3 (da) * | 1990-05-04 | 1998-04-27 | American Cyanamid Co | Stabilisering af somatotropiner ved modificering af cysteinrester |
| NZ250375A (en) * | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| DE69635026T2 (de) * | 1995-09-21 | 2006-05-24 | Genentech Inc., San Francisco | Varianten des menschlichen wachstumshormons |
| DE69838552T2 (de) * | 1997-07-14 | 2008-05-21 | Bolder Biotechnology, Inc., Louisville | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
| CA2359345A1 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| ES2204509T3 (es) * | 1999-01-29 | 2004-05-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugados de gcsf. |
| WO2001076639A2 (en) * | 2000-04-06 | 2001-10-18 | Pharmacia Corporation | Chemically-modified myelopoietin conjugates |
| WO2002055532A2 (en) * | 2001-01-11 | 2002-07-18 | Maxygen Aps | Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecular compounds |
-
2002
- 2002-11-20 CN CNA028259289A patent/CN1608079A/zh active Pending
- 2002-11-20 MX MXPA04004809A patent/MXPA04004809A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 RS YU53104A patent/RS53104A/sr unknown
- 2002-11-20 IL IL16203102A patent/IL162031A0/xx unknown
- 2002-11-20 KR KR1020047007708A patent/KR20050044858A/ko active IP Right Grant
- 2002-11-20 OA OA1200400143A patent/OA13063A/en unknown
- 2002-11-20 BR BRPI0214451-4A patent/BR0214451A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-20 AU AU2002356990A patent/AU2002356990A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-20 EA EA200400565A patent/EA008505B1/ru unknown
- 2002-11-20 EA EA200700431A patent/EA200700431A1/ru unknown
- 2002-11-20 HU HU0500997A patent/HUP0500997A2/hu unknown
- 2002-11-20 KR KR1020077011730A patent/KR20070072924A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 AP APAP/P/2004/003050A patent/AP2004003050A0/en unknown
- 2002-11-20 CA CA002467731A patent/CA2467731A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-20 WO PCT/US2002/037270 patent/WO2003044056A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 GE GE5599A patent/GEP20063860B/en unknown
- 2002-11-20 JP JP2003545691A patent/JP2005525302A/ja active Pending
- 2002-11-20 PL PL02374354A patent/PL374354A1/xx unknown
- 2002-11-20 EP EP02803695A patent/EP1453859A2/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-05-17 IS IS7268A patent/IS7268A/is unknown
- 2004-05-19 MA MA27686A patent/MA27544A1/fr unknown
- 2004-05-20 EC EC2004005114A patent/ECSP045114A/es unknown
- 2004-05-20 TN TNP2004000090A patent/TNSN04090A1/fr unknown
- 2004-05-20 HR HR20040448A patent/HRP20040448A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2004-05-20 ZA ZA200403907A patent/ZA200403907B/en unknown
- 2004-05-20 CO CO04046633A patent/CO5580794A2/es not_active Application Discontinuation
- 2004-05-26 NO NO20042182A patent/NO20042182L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-07-14 JP JP2006193577A patent/JP2006321808A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992016555A1 (en) * | 1991-03-18 | 1992-10-01 | Enzon, Inc. | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
| WO1993000109A1 (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MICHAEL J. KNAUF et al., Relationship of Effective Molecular Size to Systemic Clearance in Rats of Recombinant Interleukin-2 Chemically Modified with Water-soluble Polymers, 1988, 263, 15, P: 15064-70 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010021570A1 (ru) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200700431A1 (ru) | 2008-02-28 |
| OA13063A (en) | 2006-11-10 |
| KR20050044858A (ko) | 2005-05-13 |
| PL374354A1 (en) | 2005-10-17 |
| MXPA04004809A (es) | 2004-08-11 |
| EP1453859A2 (en) | 2004-09-08 |
| HUP0500997A2 (en) | 2007-11-28 |
| TNSN04090A1 (fr) | 2006-06-01 |
| JP2005525302A (ja) | 2005-08-25 |
| BR0214451A (pt) | 2006-05-30 |
| CN1608079A (zh) | 2005-04-20 |
| JP2006321808A (ja) | 2006-11-30 |
| HRP20040448A2 (en) | 2006-02-28 |
| CO5580794A2 (es) | 2005-11-30 |
| AU2002356990A1 (en) | 2003-06-10 |
| IL162031A0 (en) | 2005-11-20 |
| WO2003044056A2 (en) | 2003-05-30 |
| ECSP045114A (es) | 2004-07-23 |
| RS53104A (en) | 2006-10-27 |
| IS7268A (is) | 2004-05-17 |
| EA200400565A1 (ru) | 2005-06-30 |
| ZA200403907B (en) | 2007-12-27 |
| CA2467731A1 (en) | 2003-05-30 |
| AP2004003050A0 (en) | 2004-06-30 |
| MA27544A1 (fr) | 2005-10-03 |
| NO20042182L (no) | 2004-08-11 |
| KR20070072924A (ko) | 2007-07-06 |
| WO2003044056A3 (en) | 2003-08-21 |
| GEP20063860B (en) | 2006-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA008505B1 (ru) | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека | |
| US20220133898A1 (en) | Derivatisation of Insulin with Polysaccharides | |
| DE602005001445T2 (de) | N-terminal monopegylierte menschliche wachstumshormon-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung | |
| EP0730470B1 (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
| NL1032282C2 (nl) | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. | |
| JP5334347B2 (ja) | 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法 | |
| US5661020A (en) | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances | |
| US20030171285A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| WO2006024953A2 (en) | Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof | |
| US20040038892A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| US20090203589A1 (en) | Chemically modified human growth hormone receptor antagonist conjugates |