TWI508737B - 具有延長的活體內功效的生長激素 - Google Patents

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Description

具有延長的活體內功效的生長激素
本發明係關於一種經由親水性間隔基連接至白蛋白結合殘基之生長激素化合物，以及製備及使用該等化合物之方法。此等生長激素接合物增強蛋白水解降解之抗性以及延長作用特徵，且適用於治療。
生長激素為由哺乳動物垂體前葉分泌之多肽激素。視物種而定，生長激素為由約190個胺基酸殘基構成之蛋白質，對應於約22kDa之分子量。生長激素結合至細胞表面受體(亦即生長激素受體(growth hormone receptors，GHR))且經由該等細胞表面受體進行信號傳導。生長激素對促進生長、維持正常身體組成、合成代謝及脂質代謝起關鍵作用。其亦對中間代謝(諸如降低葡萄糖吸收、增加脂肪分解、增加胺基酸吸收及蛋白質合成)具有直接作用。該激素亦對其他組織(包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結締組織及肌肉)發揮作用。重組人類生長激素(hGH)已有生產且可以例如以下購得：GenotropinTM (Pharmacia Upjohn)、NutropinTM 及ProtropinTM (Genentech)、HumatropeTM (Eli Lilly)、SerostimTM (Serono)、諾德欣(Norditropin)(Novo Nordisk)、奧尼普(Omnitrope)(Sandoz)、紐德欣(Nutropin Depot)(Genentech及Alkermes)。另外，在N-端具有一額外甲硫胺酸殘基之類似物亦以例如SomatonormTM (Pharmacia Upjohn/Pfizer)銷售。
生長激素與生長激素蛋白質家族之其他成員(促乳素(Prolactin，PRL)及胎盤生乳素(Placental Lactogen，PL))共有共同拓撲。生長激素歸類為四螺旋束蛋白(圖1)，其展現「上-上-下-下式」拓撲且具有兩個保守之二硫鍵聯。特定而言，野生型人類生長激素(hGH)由191個胺基酸殘基構成且在位置53、165、182及189具有四個半胱胺酸殘基，該等半胱胺酸殘基藉由形成兩個分別連接C53與C165及連接C182與C189的分子內二硫鍵而穩定蛋白質之三維結構(圖1)。hGH之結構已藉由X-射線結晶學呈自由形式(Chantalet L.等人，Protein and Peptide Letters 3, 333-340,(1995))及與其結合蛋白(人類GHR(hGHR)之細胞外域)之複合物形式(Devos,A.M.等人，Science 255, 306-312,(1992))實驗測定。此等結構已寄存於蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)中，且可公開獲得(PDB寄存代碼分別為1HGU及1HWG)。因此，可自公開之hGH結構鑑別出對hGH與hGHR之結合重要之殘基。此外，已藉由核磁共振(NMR)光譜學研究hGH之動態性質(Kasimova M.R.等人，J.Mol.Biol. 318, 679-695,(2002))。X-射線及NMR資料組合時可將hGH中良好結構化及明確界定之區域與較少結構化及動態之區域相區分。hGH之較少結構化及動態區域預期尤其易受蛋白水解裂解影響，且適當穩定化該等區域將使蛋白水解穩定性提高。
已對hGH進行廣泛突變誘發以試圖產生具有所需化學或生物性質之hGH類似物。特定而言，已描述用於若干目的之半胱胺酸突變體。
US 2003/0162949揭示GH超基因家族之成員的半胱胺酸變異體。提供產生此等蛋白質之位點特異性生物活性接合物的一般方法。該方法涉及使用定點突變誘發將半胱胺酸殘基添加至蛋白質之非必需區域或用半胱胺酸殘基取代蛋白質中之非必需胺基酸，及接著經由所添加之半胱胺酸殘基使半胱胺酸活性聚合物或其他類型之半胱胺酸活性部分共價偶合至蛋白質。
WO 02/055532描述具有至少一個共價連接之非多肽部分的經遺傳工程改造之hGH突變體，尤其為使用引入之半胱胺酸殘基進行聚乙二醇化的hGH突變體。
US 5,951,972描述經衍生化之生理活性天然及重組哺乳動物及人類蛋白質及多肽，其中蛋白質內之至少一個天然存在或併入之半胱胺酸殘基經各種取代基衍生化。
已詳細研究hGH之蛋白水解裂解。由殘基128至154構成之長環具有若干蛋白酶(諸如凝血酶、纖維蛋白溶酶、膠原蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶及類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶)之推定裂解位點。相應地，hGH之此部分已證實尤其易受蛋白水解裂解影響(Lewis,U.J.Ann. Rev. Physiol . 46,33-42,(1984))。據報導降解hGH之酶包括凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶、類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶及激肽釋放酶(kallikrein)。
大鼠組織中hGH之降解已進行了研究(Garcia-Barros等人,J. Endocrinol. Invest . 23,748-754,(2000))。
在大鼠甲狀腺中，最初發現偏好在龐大及親脂性胺基酸殘基處裂解之類胰凝乳酶蛋白酶裂解Y143與S144之間的肽鍵，產生一雙鏈分子，繼而在Y42與S43之間裂解，釋放N-端肽F1-Y42。藉由以類胰凝乳酶蛋白酶在F146與D147之間進一步裂解及進一步受羧肽酶作用來對該雙鏈分子中裂開之環進一步加工。
已報導產生針對蛋白水解降解穩定化之hGH類似物的若干方法。
Alam等人,J. Biotech. 65 ,183-190,(1998)藉由特定點突變設計出對凝血酶及纖維蛋白溶酶具有抗性之hGH突變體。凝血酶在R134與T135之間特異性裂解hGH，而雙重突變體R134D、T135P產生對凝血酶之裂解具有抗性之hGH變異體，而三重突變體R134D、T135P、K140A產生對纖維蛋白溶酶之抗性。此外，後一hGH突變體對人類血漿之蛋白質水解之抗性持續7天之時間。
EP 534568描述藉由將R134突變成丙胺酸、白胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸或組胺酸而針對蛋白水解降解穩定化之hGH突變體。
WO 2004/022593/Nautilus描述產生蛋白水解穩定性增強之經修飾細胞激素(包括GH變異體)的一般高產量定向進化方法。
WO 2006/048777/Nautilus特別描述具有提高之蛋白水解穩定性的經修飾hGH類似物。類似物在位置1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185及187-191含有1至5處突變。引入半胱胺酸殘基會潛在地導致形成不當二硫鍵連接之二聚體，且在WO 2006/048777中，用半胱胺酸取代胺基酸殘基特別自範疇中排除；在WO 2006/048777(第65頁)中寫到：「明確避免以半胱胺酸殘基置換胺基酸，因為此變化會潛在地導致形成分子間二硫鍵」。
明顯需要研發對蛋白水解降解具有抗性之hGH化合物。該等穩定之化合物應針對蛋白水解裂解展現增強之穩定性，同時保留hGH之所需生物性質。該等GH分子將具有增強之穩定性、較慢之清除率及/或延長之活體內半衰期。
此外，熟知藉由將恰當改變肽之性質的基團接合至肽來修飾肽之性質及特徵。該種接合一般需要肽中之一些官能基與接合基團中之另一官能基反應。典型地，已使用胺基(諸如離胺酸中之N-端胺基或-胺基)與適合醯化試劑之組合。或者，可將聚乙二醇(PEG)或其衍生物連接至蛋白質。關於評述，請參見Exp. Opion. Ther. Patent . 14,859-894,(2004)。已展示將PEG連接至生長激素可對生長激素之血漿半衰期具有積極影響(WO 03/044056)。
早先已描述使用羧肽酶來修飾肽之C-端。WO 92/05271揭示使用羧肽酶及親核化合物對C-端羧基進行醯胺化，且WO 98/38285揭示特別適用於此目的之羧肽酶Y之變異體。
EP 243 929揭示使用羧肽酶來將多肽、信息基團或細胞毒性劑併入蛋白質或多肽之C-端中。
WO 2005/035553描述藉由在肽之C-端酶催化地併入官能基來使肽選擇性接合的方法。
活化之鹵素衍生物及順丁烯二醯亞胺代表在將接合物併入至肽中之硫氫基時一些最常使用之官能基(G. T. Hermanson,Bioconjugate Techniques第2版2008,Elsevier)。
轉麩醯胺酸酶先前已用於改變肽之性質。在食品工業中且尤其在乳品工業中，多種技術可用於例如使用轉麩醯胺酸酶來交叉結合肽。其他文獻揭示使用轉麩醯胺酸酶改變生理活性肽之性質。EP 950665、EP 785276及Sato,Adv. Drug Delivery Rev. 54 ,487-504,(2002)揭示包含至少一個Gln之肽與經胺官能化之PEG或類似配位體之間在轉麩醯胺酸酶存在下直接反應，且Wada,Biotech. Lett. 23 ,1367-1372,(2001)揭示β-乳球蛋白與脂肪酸藉助於轉麩醯胺酸酶直接接合。公開為WO 2005/070468之國際專利申請案揭示使用轉麩醯胺酸酶來併入可供連接接合基團之柄狀物(handle)。
生長激素為不僅參與調節體細胞生長而且亦參與調節蛋白質、碳水化合物及脂質之代謝的關鍵激素。生長激素之主要作用為促進生長。人類生長激素為具有以下序列之具有191個胺基酸殘基之蛋白質：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEG SCGF(SEQ ID NO：1)。
投予人類生長激素及其密切相關之變異體用於治療多種生長激素缺乏相關性疾病。作為多肽，生長激素係非經腸投予，亦即藉助於針非經腸投予。此外，生長激素之特徵在於半衰期相對較短，因此需要頻繁投予而給患者帶來相應疼痛及不便。因此，對提供具有改良之藥理學性質(諸如延長之半衰期)的生長激素化合物仍存在需要。
本發明提供具有改良之藥物動力學及藥理學性質之新穎生長激素化合物接合物以及其製備方法。
皮下投予之醫藥化合物之生體可用率可與吸收速率相關。化合物通過皮下毛細血管之緊密連接的能力可能部分與其物理及化學性質以及化合物之分子大小或流體動力學體積相關。蛋白質接合物(諸如具有40kDa PEG之聚乙二醇化hGH(PEG-hGH))具有150-250kDa之表觀分子量。具有共價結合之白蛋白之hGH分子具有87kDa之分子量，而具有非共價結合之白蛋白的hGH分子將耗費一部分時間與白蛋白解離且因此具有22kDa之分子量。
預期解離狀態所耗費之時間至少部分取決於白蛋白結合部分之親和力。因此，具有非共價結合之白蛋白之hGH分子的吸收速率可快於PEG-hGH的吸收速率。當使用對白蛋白具有低親和力之白蛋白結合部分時可獲得增加之吸收速率。
另外，使白蛋白結合部分連接至hGH之連接子及/或間隔基之物理及化學性質將影響化合物之官能性。
本發明發明者已意外發現具有單一Cys突變及/或額外二硫橋鍵之生長激素化合物(GH)可經由親水性間隔基選擇性連接至白蛋白結合殘基，該親水性間隔基典型地以具有mLogP<0或cLogP<0.5之化學部分隔開GH與白蛋白結合殘基，從而獲得具有改良之性質之GH接合物，該等改良之性質為諸如高試管內效能或諸如活體內半衰期增加或諸如對蛋白水解降解之抗性增強，可能組合活體內作用特徵延長。藉由經由親水性間隔基將白蛋白結合殘基連接至單一Cys突變，可保留生物活性且可獲得一或多種上述改良。當經由親水性間隔基將白蛋白結合殘基連接至具有額外二硫橋鍵之生長激素(諸如連接至hGH之N-端、位置40或位置141)時，亦獲得該等改良。生長激素化合物亦可包含單一Cys突變及額外二硫橋鍵，在該態樣中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至單一Cys突變。
在一廣泛態樣中，本發明係關於包含生長激素化合物(GH)之生長激素接合物，該生長激素化合物(GH)具有a)單一Cys突變，b)額外二硫橋鍵，或c)單一Cys突變及額外二硫橋鍵，其中白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至該GH，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明之一具體實例中，穩定hGH化合物具有額外二硫鍵。二硫鍵在半胱胺酸對之間形成，該等半胱胺酸中之一或兩者係藉由點突變引入野生型hGH序列中。
在本發明之另一具體實例中，穩定hGH化合物具有額外半胱胺酸。該等半胱胺酸係藉由點突變引入野生型hGH序列中。
在本發明之另一具體實例中，穩定hGH化合物具有額外二硫鍵及一或多個額外半胱胺酸。額外二硫鍵在額外半胱胺酸對之間形成且額外半胱胺酸係藉由點突變引入野生型hGH序列中。
此外，本發明係基於以下觀測結果：可選擇性進行經由親水性間隔基在人類生長激素(hGH)中引入白蛋白結合殘基，其中保留大部分活性。較佳地，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基引入對應於所引入半胱胺酸之位置及/或具有SEQ ID NO: 1之序列的hGH中之位置麩醯胺酸40及/或位置麩醯胺酸141及/或N-端。使用轉麩醯胺酸酶(TGase)，且尤其來自茂原輪枝鏈黴菌(Streptoverticillium mobaraenae )或利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus )之TGase可將白蛋白結合殘基經由親水性間隔基選擇性引入位置40或位置141，且保持剩餘11個麩醯胺酸殘基不受影響，儘管麩醯胺酸為轉麩醯胺酸酶之受質。
因此，在本發明之一具體實例中，生長激素化合物(GH)經由親水性間隔基連接至一個白蛋白結合殘基。典型地，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至hGH之N-端或位置18、30、40、42、62、69、88、95、98、99、100、101、102、108、135、141或154。在其他具體實例中，兩個白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至hGH之單一Cys突變及上述位置中之任一者，諸如N-端、位置40或位置141。
本發明之生長激素化合物接合物相較於聚乙二醇化hGH具有較快之皮下吸收，且因此產生程度較輕之皮下脂肪萎縮(lipoathrophy)或不產生皮下脂肪萎縮。此外，白蛋白結合殘基及親水性間隔基與PEG相反地具有生物可降解性。
本發明之另一目的在於提供改良GH之性質的方法，其係藉由根據本發明之方法使該蛋白質接合來達成。
在其他態樣中，本發明係關於包含單一cys突變、額外二硫鍵的經分離之生長激素化合物(GH)或包含單一cys突變及額外二硫鍵的生長激素化合物。在本發明之另一目的中，該等化合物為可溶的。
定義
在本發明之上下文中，如本文所用之術語「生長激素化合物(growth hormone compound)」意謂哺乳動物來源之生長激素(諸如人類、牛或豬生長激素)及重組生長激素(諸如重組人類、牛或豬生長激素)及該等生長激素之變異體以及突變體。如本文所用之「GH」與「生長激素化合物」可互換。當GH為哺乳動物來源之生長激素(諸如hGH)及重組hGH之變異體時，該變異體應理解為藉由用另一天然或非天然胺基酸取代生長激素(例如hGH)序列中之一或多個胺基酸殘基；及/或藉由將一或多個天然或非天然胺基酸添加至生長激素(例如hGH)序列中；及/或藉由使一或多個胺基酸殘基自生長激素(例如hGH)序列中缺失所獲得之化合物，其中進行任何此等步驟之後可視情況對一或多個胺基酸殘基進行進一步衍生化。GH典型地與hGH具有至少80%一致性，且其活性典型地為hGH之生長激素活性的至少10%，如在本文之檢定(I)(實施例46)中所測定。
在本發明之上下文中，如本文所用之術語「白蛋白結合殘基(albumin binding residue)」意謂非共價結合人類血清白蛋白之殘基。連接至生長激素化合物(GH)之白蛋白結合殘基典型地對人類血清白蛋白具有低於約10 μM或甚至低於約1 μM之結合親和力。已知含有12-40個碳原子之直鏈及分支鏈親脂性部分、具有環戊菲骨架之化合物及/或具有10-45個胺基酸殘基之肽等中有多種白蛋白結合殘基。白蛋白結合性質可藉由如J. Biol. Chem . 277(38),35035-35042,(2002)中所述之表面電漿子共振來量測。
如本文所用之術語「親水性間隔基(hydrophilic spacer)」意謂以包含至少5個非氫原子(其中該等非氫原子之30%-50%為N或O)之化學部分隔開生長激素化合物與白蛋白結合殘基的間隔基。
在本發明之上下文中，術語「轉胺作用(transamination)」及相關術語意欲指示麩醯胺酸側鏈中之醯胺氮與另一化合物之氮(尤其另一含氮親核劑之氮)交換的反應。
轉麩醯胺酸酶(E.C.2.3.2.13)亦稱作蛋白質-麩醯胺酸-γ-麩胺醯基轉移酶且催化如下一般反應
Q-C(O)-NH2 (胺接受體)可表示含麩醯胺酸殘基之肽或蛋白質，且Q'-NH2 (胺供體)表示含胺親核劑。或者，Q-C(O)-NH2 及Q'-NH2 可分別表示胺接受體及含離胺酸之肽或蛋白質。然而，在本發明中，Q-C(O)-NH2 表示含麩醯胺酸殘基之生長激素，且Q'-NH2 表示如上文所指示之含胺親核劑。
適用轉麩醯胺酸酶之實例包括微生物轉麩醯胺酸酶，諸如來自茂原鏈黴菌(Streptomyces mobaraense )、肉桂鏈黴菌(Streptomyces cinnamoneum )及灰肉色鏈黴菌(Streptomyces griseocarneum )(所有皆揭示於US 5,156,956中，該文獻以引用之方式併入本文中)及淡紫鏈黴菌(Streptomyces lavendulae )(揭示於US 5,252,469中，該文獻以引用之方式併入本文中)及拉達卡鏈黴菌(Streptomyces ladakanum )(JP 2003/199569，該文獻以引用之方式併入本文中)的轉麩醯胺酸酶。應注意先前之輪枝鏈黴菌屬(genusStreptoverticillium )之成員現包括於鏈黴菌屬(genusStreptomyces )中(Kaempfer,J. Gen. Microbiol. 137,1831-1892,(1991))。其他適用微生物轉麩醯胺酸酶已自枯草桿菌(Bacillus subtilis) (揭示於US 5,731,183中，該文獻以引用之方式併入本文中)及各種黏菌(Myxomycetes)分離。適用微生物轉麩醯胺酸酶之其他實例為WO 96/06931(例如來自利迪桿菌(Bacilus lydicus )之轉麩醯胺酸酶)及WO 96/22366中所揭示之轉麩醯胺酸酶，該兩個文獻以引用的方式併入本文中。適用非微生物轉麩醯胺酸酶包括天竺鼠肝臟轉麩醯胺酸酶及來自各種海洋來源之轉麩醯胺酸酶，如扁魚真鯛(Pagrus major )(揭示於EP-0555649中，該文獻以引用的方式併入本文中)及日本牡蠣正牡蠣(Crassostrea gigas )(揭示於US 5,736,356中，該文獻以引用的方式併入本文中)。
在本發明之上下文中，術語「不可達(not accessible)」意欲指示某物不存在或在不可達到之意義上事實上不存在。當說明在欲接合之蛋白質中官能基不可達時，意欲指示該官能基在蛋白質中不存在，或若存在，則被某種方式阻止參與反應。舉例而言，該官能基可能深埋於蛋白質之結構中使其被遮蔽而不能參與反應。公認官能基是否可達取決於反應條件。可預計例如在變性劑存在下或在高溫下，蛋白質可伸展從而暴露否則不可達之官能基。應瞭解，「不可達」意謂「在針對特定相關反應所選擇之反應條件下不可達」。
術語「烷烴(alkane)」或「烷基(alkyl)」意欲指示飽和直鏈、分支鏈及/或環狀烴。除非說明具有另一碳原子數，否則該術語意欲指示具有1至30個(兩者皆包括)碳原子，諸如1至20個(兩者皆包括)，諸如1至10個(兩者皆包括)，例如1至5個(兩者皆包括)碳原子之烴。術語烷基及伸烷基分別指相應基團及雙基。
術語「C1-6 烷基(C1-6 alkyl)」係指具有1至6個(兩者皆包括)碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴。該等基團之實例包括(但不限於)甲基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基及正己基。
術語「C3-10 環烷基(C3-10 cycloalkyl)」典型地指環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環壬基及環癸基。
術語「烯烴(alkene)」意欲指示包含至少一個碳碳雙鍵之直鏈、分支鏈及/或環狀烴。除非說明具有另一碳原子數，否則該術語意欲指示具有2至30個(兩者皆包括)碳原子，諸如2至20個(兩者皆包括)，諸如2至10個(兩者皆包括)，例如2至5個(兩者皆包括)碳原子之烴。術語烯基及伸烯基分別指相應基團及雙基。
術語「炔烴(alkyne)」意欲指示包含至少一個碳碳參鍵之直鏈、分支鏈及/或環狀烴，且其可視情況包含一或多個碳碳雙鍵。除非說明具有另一碳原子數，否則該術語意欲指示具有2至30個(兩者皆包括)碳原子，諸如2至20個(兩者皆包括)，諸如2至10個(兩者皆包括)，例如2至5個(兩者皆包括)碳原子之烴。術語炔基及伸炔基分別指相應基團及雙基。
術語「同素環芳族化合物(homocyclic aromatic compound)」意欲指示芳族烴，諸如苯及萘。
術語「雜環化合物(heterocyclic compound)」意欲指示包含5、6或7個環原子且其中1、2、3或4個環原子為選自N、O及/或S之雜原子的環狀化合物。實例包括雜環芳族化合物，諸如噻吩、呋喃、哌喃、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡、嘧啶、嗒，以及其部分或完全氫化等效物，諸如哌啶、吡唑啶、吡咯啶、吡咯啉、咪唑啶、咪唑啉、哌及嗎啉。
術語「雜烷烴(hetero alkane)」、「雜烯烴(hetero alkene)」及「雜炔烴(hetero alkyne)」意欲指示如上文所定義之烷烴、烯烴及炔烴，其中一或多個雜原子或雜基團已插入該等部分之結構中。雜基團及雜原子之實例包括-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2 -、-C(O)-、-C(S)-及-N(R*)-，其中R*表示氫或C1 -C6 烷基。雜烷烴之實例包括
術語「基團(radical)」或「雙基(biradical)」意欲指示已分別移除一或兩個氫原子之化合物。當明確說明時，基團亦可指示藉由自化合物形式上移除較大原子群(例如羥基)而形成之部分。
術語「鹵素(halogen)」意欲指示週期表第七主族之成員，例如F、CI、Br及I。
在本發明之上下文中，術語「芳基(aryl)」意欲指示碳環芳族環基團或至少一個環為芳族環的稠合芳族環系統基團。典型芳基包括苯基、聯苯基、萘基及其類似基團。
如本文所用之術語「雜芳基(heteroaryl/hetaryl)」單獨或組合時係指具有例如5至7個成員原子之芳族環基團，或指具有例如7至18個成員原子之稠合芳族環系統基團，其中至少一個環為芳族，其含有一或多個選自氮、氧或硫雜原子之雜原子作為環原子，其中N-氧化物及硫單氧化物及硫二氧化物為容許之雜芳族取代。實例包括呋喃基、噻吩基(thienyl)、噻吩基(thiophenyl)、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、異噻唑基、吡啶基、嗒基、吡基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基及吲唑基及其類似基團。
術語「接合物(conjugate)」作為名詞意欲指示經修飾之蛋白質，亦即蛋白質具有鍵結於其之部分以修飾該蛋白質之性質。作為動詞，術語「接合(conjugate)」意欲指示使部分鍵結於蛋白質以修飾該蛋白質之性質的方法。
術語「單一cys(single cys)」或「自由半胱胺酸(free cysteine)」係指未以雙鍵接合之半胱胺酸殘基。蛋白質因此除一或多個額外二硫橋鍵之外亦可包括一或多個單一cys殘基，只要該等單一cys不產生內部二硫橋鍵即可。
如本文所用之術語「前藥(prodrug)」指示生物可水解醯胺及生物可水解酯，且亦包括：a)在本發明化合物中包括該種前藥中之生物可水解官能基的化合物，及b)在指定官能基處可生物氧化或還原以產生本發明之藥物的化合物。此等官能基之實例包括1,4-二氫吡啶、N-烷基羰基-1,4-二氫吡啶、1,4-環已二烯、第三丁基及其類似基團。
如本文所用之術語「生物可水解酯(biohydrolyzable ester)」為藥物(在此狀況下為本發明化合物)之酯，其a)不干擾母體物質之生物活性，但使該物質具有有利活體內性質，諸如作用持續時間、起始作用時間及其類似性質，或b)不具生物活性，但易於在活體內由個體轉化成生物活性成分。優勢為例如溶解性增加或生物可水解酯可經口自消化道吸收且在血漿中轉化成本發明之化合物。該等生物可水解酯之多種實例在此項技術中已知且包括例如低碳烷酯(例如C1 -C4 )、低碳醯氧基烷酯、低碳烷氧基醯氧基烷酯、烷氧基醯氧基酯、烷基醯胺基烷酯及膽鹼酯。
如本文所用之術語「生物可水解醯胺(biohydrolyzable amide)」為藥物(在此狀況下為本發明化合物)之醯胺，其a)不干擾母體物質之生物活性，但使該物質具有有利活體內性質，諸如作用持續時間、起始作用時間及其類似性質，或b)不具生物活性，但易於在活體內由個體轉化成生物活性成分。優勢為例如溶解性增加或生物可水解醯胺可經口自消化道吸收且在血漿中轉化成本發明化合物。該等生物可水解醯胺之多種實例在此項技術中已知且包括例如低碳烷基醯胺、α-胺基酸醯胺、烷氧基醯基醯胺及烷基胺基烷基羰基醯胺。
在本發明之上下文中，術語「醫藥學上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salt)」意欲指示對患者無害之鹽。該等鹽包括醫藥學上可接受之酸加成鹽、醫藥學上可接受之金屬鹽、銨鹽及烷基化銨鹽。酸加成鹽包括無機酸以及有機酸之鹽。適合無機酸之代表性實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸及其類似物。適合有機酸之代表性實例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、反丁烯二酸、乙醇酸、乳酸、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、杏仁酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、酒石酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、雙亞甲基水楊酸、乙烷二磺酸、葡萄糖酸、檸康酸、天門冬胺酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、對胺基苯甲酸、麩胺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸及其類似物。醫藥學上可接受之無機酸或有機酸加成鹽之其他實例包括J. Pharm. Sci. 66 ,2,(1977)(該文獻以引用的方式併入本文中)中所列之醫藥學上可接受之鹽。金屬鹽之實例包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽及其類似物。銨鹽及烷基化銨鹽之實例包括銨鹽、甲銨鹽、二甲銨鹽、三甲銨鹽、乙銨鹽、羥基乙銨鹽、二乙銨鹽、丁銨鹽、四甲銨鹽及其類似物。
如本文所用之化合物之「治療有效量(therapeutically effective amount)」意謂足以治癒、減輕或部分抑制指定疾病及其併發症之臨床表現的量。足以達成此目的之量定義為「治療有效量」。用於各目的之有效量將視疾病或損傷之嚴重程度以及個體之體重及一般狀況而定。應瞭解，可使用常規實驗，藉由建構值之矩陣且測試矩陣中之不同點來確定適當劑量，其全部處於受訓醫師或獸醫之一般技能範圍內。
如本文所用之術語「治療(treatment/treating)」意謂出於對抗病狀(諸如疾病或病症)之目的管理及護理患者。該術語意欲包括對於患者所罹患之指定病狀的全部範圍之治療，諸如投予活性化合物以減輕症狀或併發症、延遲疾病、病症或病狀之發展、減輕或緩解症狀及併發症及/或治癒或消除疾病、病症或病狀以及預防該病狀，其中預防應理解為出於對抗疾病、病狀或病症之目的管理及護理患者且包括投予活性化合物以預防症狀或併發症發作。待治療之患者較佳為哺乳動物；尤其為人類，但其亦可包括動物，諸如犬、貓、牛、綿羊及豬。
在一廣泛態樣中，本發明係關於包含生長激素化合物(GH)之穩定生長激素接合物，該生長激素化合物具有a)單一Cys突變，b)額外二硫橋鍵，或c)單一Cys突變及額外二硫橋鍵，其中白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至該GH，或其醫藥學上可接受之鹽。
當存在單一Cys突變時，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至該Cys之硫殘基。當存在額外二硫橋鍵(但無單一Cys突變)時，則白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至如本文所述之生長激素化合物中之位置，諸如hGH 之位置40、位置141或N-端。當兩個或兩個以上白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至生長激素化合物時，若存在單一Cys突變，則該等白蛋白結合殘基連接至該突變，或若僅存在額外二硫橋鍵，則白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至如本文所述之生長激素化合物中之位置。
在一具體實例中，生長激素化合物具有一處單一Cys突變。
在另一具體實例中，生長激素化合物具有兩處單一Cys突變。
在另一具體實例中，生長激素化合物具有額外二硫橋鍵。
在另一具體實例中，生長激素化合物具有一處單一Cys突變及一個額外二硫橋鍵。
在另一具體實例中，GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)具有至少90%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物。在其他具體實例中，GH與hGH具有至少80%，諸如至少85%，諸如至少95%一致性，與SEQ ID NO：1具有諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或諸如至少99%一致性。在其他具體實例中，該等與hGH之一致性與如在本文之檢定I中所測定活性為hGH生長激素活性之至少10%，諸如至少20%，諸如至少40%，諸如至少60%，諸如至少80%相結合。序列一致性具體實例中之任一者可與活性具體實例中之任一者組合，諸如GH與hGH具有至少80%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少60%；GH與hGH具有至少90%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少40%；GH與hGH具有至少95%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少80%等。如本文所述，HG可表示為MetHG，其指示包含額外N-端甲硫胺酸之序列。
在一具體實例中，GH為引入了單一Cys突變之生長激素變異體。在其他具體實例中，GH表示除單一Cys突變外亦含有1至5處突變之生長激素化合物。
在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至單一Cys突變。在一具體實例中，單一Cys突變位於GH之N-端、H1、H2、L2或H3中。在其他具體實例中，單一Cys突變位於N-端中，該突變為諸如T3C、P5C、S7C中之任一者；或位於H1(對應於AA9-35)中，該突變為諸如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C中之任一者；或位於L1(對應於AA36-71)中，該突變為諸如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C中之任一者或較佳為Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C中之任一者；或位於H2、L2或H3(對應於AA 72-98、AA 99-106及AA 107-127)中，該突變為諸如hGH(SEQ ID NO: 1)之E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C中之任一者；或位於L3或H4(對應於AA 128-154及AA 155-184)中，位於L3及H4(128-154及AA 155-184)中，該突變為諸如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C中之任一者；或位於C-端中，該突變為諸如E186C、G187C、G190C中之任一者。
若在hGH變異體中存在單一Cys突變，則該突變位於相應胺基酸殘基中。
在GH之特定具體實例中，單一Cys突變已引入相當於母體GH亦即相當於hGH(SEQ ID NO: 1)中選自由以下組成之群之位置的位置：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、K38、E39、Y42、S43、D47、P48、S55、S57、P59、S62、E65、Q69、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、G126、E129、D130、G131、P133、T135、G136、T142、D147、N149、D154、A155、L156、R178、E186、G187及G190，諸如由以下組成之群：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122及G126，GH接合物進一步在該單一半胱胺酸殘基之側鏈上包含白蛋白結合部分。
在其他具體實例中，單一Cys突變位於hGH中之AA 93-106中或hGH變異體中之相應殘基中。在其他特定具體實例中，單一Cys突變位於L2中，諸如位於AA 99-106或AA 99-103或相應殘基中。
當在本發明之生長激素化合物接合物中存在單一Cys突變時，典型單一Cys突變為E30C。另一典型單一Cys突變為Y42C。另一典型單一Cys突變為S55C。另一典型單一Cys突變為S57C。另一典型單一Cys突變為S62C。另一典型單一Cys突變為Q69C。另一典型單一Cys突變為S95C。另一典型單一Cys突變為A98C。另一典型單一Cys突變為N99C。另一典型單一Cys突變為S100C。另一典型單一Cys突變為L101C。另一典型單一Cys突變為V102C。另一典型單一Cys突變為S108C。
根據rhGH/受體複合物之晶體結構(PDB：3HHR)，螺旋束由四個主要螺旋組成：殘基9至34之第一螺旋(A)、殘基72至92及殘基94至100之第二螺旋(B)、殘基106至128之第三螺旋(C)及殘基155至184之第四螺旋(D)(M. R. Kasimova等人,J. Mol. Biol. 318 ,679-695,(2002))。四個主要螺旋稱作蛋白質之核心。不為螺旋區之部分的殘基定義為環殘基，且可為可撓性區域、環、β-轉角、髮夾及捲曲之部分。當hGH處於與其結合蛋白之複合物中時(PDB：1HWG)(其為上文所提及之螺旋定義)，獲得稍有不同之螺旋定位。
此外，本發明係關於一種包含至少一個引入之半胱胺酸殘基的GH接合物，該殘基已引入相當於hGH之螺旋或環區域中之位置的位置。特定而言，胺基酸殘基可引入螺旋或環區域中之表面暴露位置，例如在單獨hGH之模型結構中或在hGH與其兩個受體分子複合之模型結構中，該螺旋或環區域之側鏈超過25%暴露於表面，較佳其側鏈超過50%暴露於表面。在一較佳具體實例中，螺旋或環中之位置相當於hGH之受體結合位點外部的位置。表面暴露之殘基可使用計算化學算法來鑑別。舉例而言，可用來自Accelrys公司之電腦程式Quanta 2005，使用來自可公開獲得之結構(PDB寄存代碼：1HGU及1HWG結構)的原子座標及預設參數設定來計算相對表面可達性。關於算法之基本原則的描述可見於B. Lee及F.M. Richards,「The Interpretation of Protein Structures: Estimation of Static Accessibility」J. Mol. Biol . 55,379-400,(1971)中。
在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至具有額外二硫橋鍵之GH。典型地，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至hGH之N-端、位置40或位置141。
在另一具體實例中，GH在環區段與螺旋區段之間或在環區段內或在環區段之間或在螺旋區段之間包含額外二硫鍵。
在另一具體實例中，GH包含額外二硫鍵，其中在環區段，諸如胺基酸殘基128-154(L3)之環區段中存在至少一個半胱胺酸。
在另一具體實例中，GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋區段。
在另一具體實例中，GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋B或螺旋2(對應於AA 72-98)。
在另一具體實例中，GH包含額外二硫鍵，該額外二硫鍵連接螺旋2(對應於AA 72-98)與環3(對應於AA 128-154)。
在另一具體實例中，GH在對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間包含額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，GH之額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置的至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。額外二硫橋鍵典型地為Q84C/Y143C。
在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至具有單一Cys突變及額外二硫橋鍵之GH。白蛋白結合殘基典型地經由親水性間隔基連接至單一Cys突變。
在一特定具體實例中，GH具有額外二硫橋鍵Q84C/Y143C及白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接之單一突變L101C。
在其他具體實例中，GH具有額外二硫鍵及選自hGH(SEQ ID NO:1)中以下任一者之單一Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C 及 G190C，諸如以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C，或hGH變異體中之相應殘基。
在一特定具體實例中，GH具有額外二硫鍵及單一Cys突變，且該單一Cys突變已引入相當於母體GH亦即相當於hGH(SEQ ID NO:1)中選自由以下組成之群之位置的位置：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、K38、E39、Y42、S43、D47、P48、S55、S57、P59、S62、E65、Q69、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、G126、E129、D130、G131、P133、T135、G136、T142、D147、N149、D154、A155、L156、R178、E186、G187及G190，較佳選自以下之群：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122及G126。GH接合物進一步在該單一半胱胺酸殘基之側鏈上包含白蛋白結合部分。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於環區段與螺旋區段之間或環區段內或環區段之間或螺旋區段之間的額外二硫鍵。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段，諸如胺基酸殘基128-154(L3)之環區段中。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段(諸如胺基酸殘基128-154之環區段)與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2(對應於AA72-98))。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及額外二硫鍵，該額外二硫鍵連接螺旋2(對應於AA 72-98)與環3(對應於AA 128-154)。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置之至少一個胺基酸對之間的額外二硫橋鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。
親水性間隔基(B)之溶解度可以其logP值描述。LogP亦稱作分配係數，其為在平衡時化合物在兩種不可混溶溶劑之混合物的兩個相中之濃度比率的對數。典型地，一種溶劑為水，而第二溶劑係選自辛-1-醇、氯仿、環己烷及丙二醇二壬酸酯(propylene glycol dipelargonate，PGDP)。以此等不同溶劑量測之LogP值主要歸因於氫鍵結影響而顯示不同。辛醇可貢獻及接受氫鍵，而環己烷為惰性。氯仿可貢獻氫鍵，而PGDP僅可接受氫鍵。LogP值可藉由此項技術中已知之標準方法來量測。
在本發明之一具體實例中，親水性間隔基在辛-1-醇、氯仿、環己烷及丙二醇二壬酸酯(PGDP)中具有低於0，諸如低於0.5之LogP。
在另一具體實例中，親水性間隔基在辛-1-醇、氯仿、環己烷及丙二醇二壬酸酯(PGDP)中具有低於-1之LogP。
或者，可使用公開之算法(T. Fujita;J. Iwasa及C. Hansch,J. Am. Chem. Soc. 86 ,5175-5180,(1964)「A New Substituent Constant,Pi,Derived from Partition Coefficients」；C. A. Lipinski等人,Advanced Drug Delivery Reviews ,23 ,3-25,(1997)「Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings」；及I. Moriguchi,S. Hirono,I. Nakagome,H. Hirano,Chem. Pharm. Bull .42 ,976-978,(1994)「Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods」)將白蛋白結合劑部分或親水性間隔基部分之LogP值計算為mLogP及/或cLogP。
在本發明之一具體實例中，親水性間隔基(B)具有mLogP<0。
在另一具體實例中，生長激素化合物(GH)經由親水性間隔基(B)連接至一個白蛋白結合殘基。
在另一具體實例中，生長激素化合物(GH)經由偶合至生長激素化合物(GH)中之自由半胱胺酸的親水性間隔基(B)連接至白蛋白結合殘基。
在另一具體實例中，生長激素化合物(GH)經由一或兩個親水性間隔基連接至兩個白蛋白結合殘基。因此，在一實施例中，一個白蛋白結合殘基經由一個親水性間隔基(B)連接至單一Cys突變，且另一白蛋白結合殘基經由一個親水性間隔基(B')連接至位置40或位置141之麩醯胺酸，或者兩個白蛋白結合殘基經由一個親水性間隔基(B)連接至單一Cys突變或位置40、位置141之麩醯胺酸或N-端。在另一具體實例中，生長激素化合物(GH)經由一或多個親水性間隔基連接至三個白蛋白結合殘基。
在一具體實例中，親水性間隔基包含至少一個OEG基元，亦即基團8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，亦即-NH-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH2 -C(O)-。在另一特定具體實例中，親水性間隔基包含至少兩個OEG基元。在一具體實例中，該或該等OEG基元之取向使得-C(O)-最靠近生長激素化合物但不連接生長激素化合物與白蛋白結合劑連接子，且-NH-最靠近白蛋白結合殘基。在包含兩個OEG基元之其他具體實例中，兩個基元具有相同取向或不同取向。在一具體實例中，該兩個OEG基元彼此相鄰定位，而在替代具體實例中，該等OEG基元由一或多個共價連接之原子隔開。
在一具體實例中，親水性間隔基包含至少一個麩胺酸殘基。胺基酸麩胺酸包含兩個羧酸基團。其γ-羧基可用於與離胺酸之-胺基或與OEG分子(若存在)之胺基或與另一Glu殘基(若存在)之胺基形成醯胺鍵。α-羧基可替代地用於與離胺酸之-胺基或與OEG分子(若存在)之胺基或與另一Glu殘基(若存在)之胺基形成類似醯胺鍵。Glu之胺基轉而可與白蛋白結合殘基之羧基，或與OEG基元(若存在)之羧基，或與另一Glu(若存在)之γ-羧基或α-羧基形成醯胺鍵。一個Glu之胺基與第二Glu之γ-羧基的連接可稱作「γ-Glu」基元。
在一具體實例中，親水性間隔基包含至少一個組合之OEG-Glu基元(-NH-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH2 -C(O)NH-CH(C(O)OH)-(CH2 )2 -C(O)-)或至少一個組合之Glu-OEG基元(-NH-CH(C(O)OH)-(CH2 )2 -C(O)NH-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH2 -C(O)-)或其組合，其中該等Glu-OEG及OEG-Glu基元可由一或多個共價連接之原子隔開，或藉由Glu形成γ-Glu之醯胺鍵彼此直接鍵結。
在另一態樣中，本發明係關於一種生長激素接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：
A-W-B-GH　(I)
其中GH表示具有單一Cys突變之生長激素化合物，B表示連接至該Cys突變之硫殘基之親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。
在另一具體實例中，GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少90%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物。在其他具體實例中，GH與hGH(SEQ ID NO: 1)具有至少.80%，諸如至少85%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或諸如至少99%一致性。在其他具體實例中，該等與hGH之一致性與如在本文之檢定I中所測定活性為hGH生長激素活性之至少10%，諸如至少20%，諸如至少40%，諸如至少60%，諸如至少80%相結合。序列一致性具體實例中之任一者可與活性具體實例中之任一者組合，諸如GH與hGH具有至少80%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少60%；GH與hGH具有至少90%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少40%；GH與hGH具有至少95%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少80%等。
在其他具體實例中，接合物之GH具有單一Cys突變，該單一Cys突變選自GH之N-端、H1、H2、L2或H3區域中之單一Cys突變中之任一者。在其他此類具體實例中，單一Cys突變位於N-端中，該突變為諸如T3C、P5C、S7C中之任一者；或位於H1(對應於AA9-35)中，該突變為諸如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C中之任一者；或位於L1(對應於AA 36-71)中，該突變為諸如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C中之任一者或較佳為Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C中之任一者；或位於H2、L2或H3(對應於AA 72-98、AA 99-106及AA 107-127)中，該突變為諸如hGH(SEQ ID NO:1)之E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C中之任一者；或位於L3或H4(對應於AA 128-154及AA 155-184)中，位於L3及H4(128-154及AA 155-184)中，該突變為諸如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C中之任一者；或位於C-端中，該突變為諸如E186C、G187C、G190中之任一者。
若在hGH變異體中存在單一Cys突變，則該突變位於相應胺基酸殘基中。
其他具體實例包括如下GH接合物，其中GH中之單一cys突變係選自hGH(SEQ ID NO: 1)之以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C 及 G190C，諸如以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。在其他具體實例中，單一Cys突變位於hGH中之AA 93-106中或hGH變異體中之相應殘基中。在其他特定具體實例中，單一Cys突變位於L2中，諸如位於AA 99-106或AA 99-103或相應殘基中。在另一具體實例中，A係選自
其中*表示經由W連接至B。在另一具體實例中，W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 　係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 　係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
在其他具體實例中，B包含一或多個如上文所述之OEG及/或γ-Glu基元或由其組成。在另一具體實例中，B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 )n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2)m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。在另一具體實例中，11、12、13、14、15及16獨立地為0-6。在另一具體實例中，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0- 6。在另一具體實例中，m2及m5獨立地為0-10。在另一具體實例中，n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。在另一具體實例中，D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。在另一具體實例中，E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。在另一具體實例中，W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
在另一具體實例中，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中C1-6 烷基視情況經-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH取代。在另一具體實例中，-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。在另一具體實例中，X4 為價鍵且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。在另一具體實例中，B係選自
在另一具體實例中，GH接合物係選自
在另一態樣中，本發明係關於具有式(I)之生長激素接合物：A-W-B-GH(I)，其中GH表示具有額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B表示親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。
在另一具體實例中，GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少90%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物。在其他具體實例中，GH與hGH(SEQ ID NO: 1)具有至少80%，諸如至少85%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或諸如至少99%一致性。在其他具體實例中，該等與hGH之一致性與如在本文之檢定I中所測定活性為hGH生長激素活性之至少10%，諸如至少20%，諸如至少40%，諸如至少60%，諸如至少80%相結合。序列一致性具體實例中之任一者可與活性具體實例中之任一者組合，諸如GH與hGH具有至少80%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少60%；GH與hGH具有至少90%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少40%；GH與hGH具有至少95%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少80%等。在另一具體實例中，接合物之GH在環區段與螺旋區段之間或在環區段內或在環區段之間或在螺旋區段之間包含額外二硫鍵。
在另一具體實例中，接合物之GH包含額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段，諸如胺基酸殘基128-154之環區段中。在另一具體實例中，接合物之GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段(諸如胺基酸殘基128-154(H3)之環區段)與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2(對應於AA 72-98))。在另一具體實例中，接合物之GH包含額外二硫鍵，該額外二硫鍵連接螺旋2(對應於AA 72-98)與環3(對應於AA 128-154)。
在另一具體實例中，接合物之GH在對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間包含額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: l)中以下之位置的至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，接合物之GH在對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間包含額外二硫鍵：A17C/E174C、H21C/M170C、D26CA/102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。
在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。在另一具體實例中，接合物之GH在對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間包含額外二硫鍵：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。在另一具體實例中，接合物之GH在對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間包含額外二硫鍵：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。在另一具體實例中，A係選自
其中*表示經由W連接至B。
在另一具體實例中，W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。在其他具體實例中，B包含一或多個如上文所述之OEG及/或γ-Glu基元或由其組成。
在另一具體實例中，B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。在另一具體實例中，11、12、13、14、15及16獨立地為0-6。在另一具體實例中，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0-6。在另一具體實例中，m2及m5獨立地為0-10。在另一具體實例中，n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。在另一具體實例中，D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。在另一具體實例中，E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。
在另一具體實例中，W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
在另一具體實例中，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中C1-6 烷基視情況經-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH取代。在另一具體實例中，-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。在另一具體實例中，B係選自
在另一具體實例中，A經由B連接至對應於SEQ ID NO: 1中位置40、位置141之位置之麩醯胺酸殘基或生長激素化合物之N-端殘基。在另一具體實例中，GH接合物係選自
在另一態樣中，本發明係關於一種生長激素接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：A-W-B-GH　(I)其中GH表示具有單一Cys突變及額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B表示連接至該Cys突變之硫殘基之親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。在另一具體實例中，GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少90%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物。在其他具體實例中，GH與hGH(SEQ ID NO: 1)具有至少80%，諸如至少85%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或諸如至少99%一致性。在其他具體實例中，該等與hGH之一致性與如在本文之檢定I中所測定活性為hGH生長激素活性之至少10%，諸如至少20%，諸如至少40%，諸如至少60%，諸如至少80%相結合。序列一致性具體實例中之任一者可與活性具體實例中之任一者組合，諸如GH與hGH具有至少80%一致性且結合hGH之生長激素活性之。
至少60%；GH與hGH具有至少90%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少40%；GH與hGH具有至少95%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少80%等。在其他具體實例中，接合物之GH具有額外二硫鍵及單一Cys突變，該單一Cys突變選自GH之N-端、H1、H2、L2或H3區域中之單一Cys突變中之任一者。在其他此類具體實例中，單一Cys突變位於N-端中，該突變為諸如T3C、P5C、S7C中之任一者；或位於H1(對應於AA9-35)中，該突變為諸如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C中之任一者；或位於L1(對應於AA 36-71)中，該突變為諸如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C中之任一者或較佳為Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C中之任一者；或位於H2、L2或H3(對應於AA 72-98、AA 99-106及AA 107-127)中，該突變為諸如hGH(SEQ ID NO:1)之E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C中之任一者；或位於L3或H4(對應於AA 128-154及AA 155-184)中，位於L3及H4(128-154及AA 155-184)中，該突變為諸如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C中之任一者；或位於C-端中，該突變為諸如E186C、G187C、G190C中之任一者。
若在hGH變異體中存在單一Cys突變，則該突變位於相應胺基酸殘基中。
其他具體實例包括在GH中具有額外二硫鍵及單一cys突變之GH接合物，該單一cys突變係選自hGH(SEQ ID NO: 1)之以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及G190C，諸如以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。在其他具體實例中，單一Cys突變位於hGH中之AA 93-106中或hGH變異體中之相應殘基中。在其他特定具體實例中，單一Cys突變位於L2中，諸如位於AA 99-106或AA 99-103或相應殘基中。在其他具體實例中，額外二硫鍵可為位於環區段與螺旋區段之間或位於環區段內或位於環區段之間或位於螺旋區段之間的額外二硫鍵。
在另一具體實例中，GH包含單一cys突變體及額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段，諸如胺基酸殘基128-154(L3)之環區段中。在另一具體實例中，GH包含單一cys突變體及額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段(諸如胺基酸殘基128-154之環區段)與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2(對應於AA 72-98))。
在另一具體實例中，接合物之GH包含單一cys突變體及額外二硫鍵，該額外二硫鍵連接螺旋2(對應於AA 72-98)與環3(對應於AA 128-154)。在另一具體實例中，接合物之GH包含單一cys突變體及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。在另一具體實例中，額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置的至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
在另一具體實例中，接合物之GH包含單一cys突變體及位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置之一個胺基酸對之間的額外二硫鍵：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C及/或R94C/D107C。在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。在另一具體實例中，額外二硫鍵位於對應於SEQ ID NO: 1中以下之位置的一個胺基酸對之間：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。在另一具體實例中，GH在L2中包含單一半胱胺酸突變，且包含連接環區段(諸如胺基酸殘基128-154(H3)之環區段)與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2(對應於AA 72-98))的額外二硫鍵。
在一具體實例中，GH包含選自以下群組之突變的組合 ：A98C/Q84C/Y143C、A98C/S85C/Y143C、A98C/S85C/S144C、N99C/Q84C/Y143C、N99C/S85C/Y143C、N99C/S85C/S144C、S101C/Q84C/Y143C、S101C/S85C/Y143C、S101C/S85C/S144C、L101C/Q84C/Y143C、L101C/S85C/Y143C、L101C/S85C/S144C、C102C/Q84C/Y143C、C102C/S85C/Y143C及C102C/S85C/S144C。
在另一具體實例中，A係選自
其中*表示經由W連接至B。
在另一具體實例中，W具有下式：
-W7 -Y-，
其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
在其他具體實例中，B包含一或多個如上文所述之OEG及/或γ-Glu基元或由其組成。
在另一具體實例中，B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
在另一具體實例中，11、12、13、14、15及16獨立地為0-6。
在另一具體實例中，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0-6。
在另一具體實例中，m2及m5獨立地為0-10。在另一具體實例中，n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。在另一具體實例中，D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。在另一具體實例中，E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。在另一具體實例中，W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
在另一具體實例中，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中C1-6 烷基視情況經-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH取代。在另一具體實例中，-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。在另一具體實例中，X4 為價鍵且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。在另一具體實例中，B係選自
在另一具體實例中，GH接合物係選自
本發明之接合物典型地具有一個白蛋白結合殘基(A)經由親水性間隔基(B)(諸如一個親水性間隔基(B))連接至生長激素化合物(GH)。
然而，生長激素化合物(GH)可經由親水性間隔基連接至兩個白蛋白結合殘基。
因此，在另一態樣中，本發明係關於式(II)之生長激素接合物：A-W-B-GH-B'-W'-A'(II)其中GH表示具有單一Cys突變之生長激素化合物，B及B'獨立地為連接至該Cys突變之硫殘基的親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，W'為連接A'與B'之化學基團，A及A'獨立地表示白蛋白結合殘基，及其醫藥學上可接受之鹽。
此外，在另一態樣中，本發明係關於式(II)之生長激素接合物：A-W-B-GH-B'-W'-A'(II)其中GH表示具有額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B及B'獨立地為親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，W'為連接A'與B'之化學基團，A及A'獨立地表示白蛋白結合殘基，及其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明係關於式(II)之生長激素接合物：A-W-B-GH-B'-W'-A'(II)其中GH表示具有單一Cys突變及額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B及B'獨立地為連接至該Cys突變之硫殘基的親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，W'為連接A'與B'之化學基團，A及A'獨立地表示白蛋白結合殘基，及其醫藥學上可接受之鹽。
在如上文所述之式(II)接合物中，W'係選自與W相同之群組，A'係選自與A相同之群組，且B'係選自與B相同之群組，且應瞭解W與W'、A與A'及B與B'獨立地選自如本文所定義之個別群組中之任一者。因此，本文中W、A及B之任何具體實例亦為W'、A'及B'之具體實例。此外，適當時，本文所述之任一具體實例獨立地關於式(I)及(II)之接合物兩者，以及其廣泛態樣及具體實例。
除非說明一具體實例係關於本發明之某一態樣或某些態樣，否則上述具體實例以及下文將描述之具體實例應視為關於本文所述之任一態樣以及本文所述之任一具體實例。
在一具體實例中，GH為hGH之變異體，其中變異體應理解為藉由用另一天然或非天然胺基酸取代hGH序列中之一或多個胺基酸殘基；及/或藉由將一或多個天然或非天然胺基酸添加至hGH序列中；及/或藉由使一或多個胺基酸殘基自hGH序列中缺失所獲得之化合物，其中進行任何此等步驟後可視情況進一步對一或多個胺基酸殘基進行衍生化。
在另一具體實例中，GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少90%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物。在其他具體實例中，GH與hGH(SEQ ID NO: 1)具有至少80%，諸如至少85%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或諸如至少99%一致性。在其他具體實例中，該等與hGH之一致性與如在本文之檢定I中所測定活性為hGH生長激素活性之至少10%，諸如至少20%，諸如至少40%，諸如至少60%，諸如至少80%相結合。序列一致性具體實例中之任一者可與活性具體實例中之任一者組合，諸如GH與hGH具有至少80%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少60%；GH與hGH具有至少90%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少40%；GH與hGH具有至少95%一致性且結合hGH之生長激素活性之至少80%等。在另一具體實例中，GH為hGH(SEQ ID NO: 1)。
在其他具體實例中，B包含一或多個如上文所述之OEG及/或γ-Glu基元或由其組成。在式(I)或(II)之接合物的另一具體實例中，親水性間隔基B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1且烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯定-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
在另一具體實例中，W1 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W1 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 -。
在另一具體實例中，W2 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W2 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 -。
在另一具體實例中，W3 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W3 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 -。
在另一具體實例中，W4 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W4 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 -。
在另一具體實例中，W5 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W5 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 -。
在另一具體實例中，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。W6 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -或-NHC(O)C1-6 烷基。
在另一具體實例中，D1、D2、F皆為價鍵，16為0，且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。
在另一具體實例中，R1 係選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH。R1 典型地選自-C(O)OH、-C(O)NH2 或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。在另一具體實例中，R2 係選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH。R2 典型地選自-C(O)OH、-C(O)NH2 或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。在另一具體實例中，R3 係選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH。R3 典型地選自-C(O)OH、-C(O)NH2 或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。在另一具體實例中，R4 係選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH。R4 典型地選自-C(O)OH、-C(O)NH2 或℃1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。在另一具體實例中，R5 係選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH。R5 典型地選自-C(O)OH、-C(O)NH2 或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。在另一具體實例中，E1係選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。E1典型地選自-O-。
在另一具體實例中，E2係選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。E2典型地選自-O-。在另一具體實例中，E1及E2皆為-O-。在另一具體實例中，E1及E2皆為-N(R6 )-。在另一具體實例中，F為苯基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵。在另一具體實例中，D1係選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。D1典型地選自-N(R6 )-。在另一具體實例中，D2係選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。D1典型地選自-N(R6 )-。在另一具體實例中，11為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。
在另一具體實例中，12為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，13為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，14為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，15為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，16為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，m1為0-6，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，m2為0-10，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一具體實例中，m3為0-5，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，m4為0-5，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，m5為0-10，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一具體實例中，m6為0-5，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，m7為0-5，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，n1為0-10，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，n2為0-10，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，n3為0-10，諸如0、1、2、3、4、5或6。在另一具體實例中，n4為0-10，諸如0、1、2、3、4、5或6。
在另一具體實例中，X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 O]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -且X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 O]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，其中-{[(CH2 )n1 O]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 O]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。
在另一具體實例中，該親水性間隔基之莫耳重量處於80道爾頓(Dalton，D)至1500 D之範圍內或處於300 D至1100 D之範圍內。
在另一具體實例中，W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
在W之一具體實例中，Y為-(CH2 )17 -環己基-W8 -。在另一具體實例中，Y為價鍵。在一具體實例中，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W7 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 。在另一具體實例中，W3 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-或價鍵。W8 典型地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)2 。在另一具體實例中，17為0或1。
在另一具體實例中，本發明之親水性間隔基B係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。連接至本發明之生長激素化合物之白蛋白結合殘基(上述式(I)或(II)中之取代基A)為非共價結合白蛋白之親脂性殘基。白蛋白結合殘基典型地在生理pH值下帶負電，且對人類血清白蛋白具有低於約10 μM或甚至低於約1 μM之結合親和力。
在本發明之生長激素化合物之另一具體實例中，白蛋白結合殘基係選自直鏈烷基、分支鏈烷基、具有ω-羧酸基團或ω-羧酸同電子排列體(isoster)之基團。白蛋白結合殘基典型地具有6至40個碳原子。在另一具體實例中，白蛋白結合殘基具有8至26個碳原子。在另一具體實例中，白蛋白結合殘基具有8至20個碳原子。在另一具體實例中，A具有14至26個碳原子且包含ω-羧酸基團。在另一具體實例中，A具有14至26個碳原子且包含ω-羧酸同電子排列體(諸如四唑)。在另一具體實例中，A係選自
其中*表示經由W連接至B。親水性間隔基(B)較佳以選擇性方式引入生長激素化合物(GH)之位置以便能夠控制應將一個抑或兩個白蛋白結合殘基(A)併入生長激素化合物中。親水性間隔基(B)可連接至GH化合物之胺基酸側鏈。該等胺基酸側鏈可為GH化合物之經化學修飾之胺基酸側鏈。另一此類胺基酸側鏈可為GH化合物之經酶催化地修飾之胺基酸側鏈。較佳地，使用轉麩醯胺酸酶將親水性間隔基引入對應於SEQ ID NO: 1中位置40或位置141之位置的麩醯胺酸殘基中。另一選擇性引入親水性間隔基之方式為引入生長激素化合物(諸如hGH(SEQ ID NO: 1))之N-端殘基中。在式(I)之生長激素接合物中，片段A-W-B可為線性或分支片段。在一具體實例中，A-W-B不為線性肽。在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至對應於SEQ ID NO: 1中位置40之位置之麩醯胺酸殘基。
在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至對應於SEQ ID NO: 1中位置141之位置的麩醯胺酸殘基。在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至生長激素化合物(諸如hGH(SEQ ID NO:1))之N-端殘基。在另一具體實例中，白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至生長激素化合物(諸如hGH(SEQ ID NO:1))中對應於位置40、位置141之位置之麩醯胺酸殘基及N-端殘基。
本發明之生長激素接合物係選自
在另一態樣中，本發明係關於生長激素變異體，諸如本文所述之生長激素化合物(GH)。生長激素變異體可適用作治療劑或適用作製備生長激素接合物之中間物。生長激素化合物可藉由此項技術中已知或如本文所述之重組方法製備。在一具體實例中，生長激素變異體可溶。在另一態樣中，本發明係關於包含如本文所述之生長激素變異體的組成物。
在一具體實例中，該組成物包含生長激素變異體，該生長激素變異體包含選自以下群組之單一Cys突變：P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。
在本發明之一具體實例中，組成物之生長激素變異體在生長激素化合物之N-端(AA 1-8)、螺旋1、環1、螺旋2、環2或螺旋3中具有單一Cys突變。在一具體實例中，單一Cys突變位於N-端中，該突變為諸如P5C、S7C中之任一者。在一具體實例中，單一Cys突變位於H1(對應於AA 9-35)中，諸如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C中之任一者。在一具體實例中，單一Cys突變位於L1(對應於AA36-71)中，該突變為諸如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C中之任一者，或較佳為Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C中之任一者。在一具體實例中，單一Cys突變位於H2(AA 72-98)中，諸如E88C、Q91C、S95C及A98C中之任一者。在一具體實例中，單一Cys突變位於AA 99-127中。在一具體實例中，單一Cys突變位於L2(AA 99-106)中，諸如N99C、S100C、L101C、V102C及Y103C中之任一者。在一具體實例中，單一Cys突變位於H3(AA 107-127)中，該突變為諸如hGH(SEQ ID NO:1)之D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C中之任一者；或位於L3或H4(對應於AA 128-154及AA 155-184)中，該突變為諸如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C中之任一者；或位於C-端中，該突變為諸如E186C、G187C及G190C中之任一者。若在hGH變異體中存在單一Cys突變，則該突變位於相應胺基酸殘基中。
在其他具體實例中，單一Cys突變位於hGH中之AA 93-106中或hGH變異體中之相應殘基中。在其他特定具體實例中，單一Cys突變位於L2中，諸如位於AA 99-106或AA 99-104或相應殘基中。
在一具體實例中，本發明組成物包含生長激素變異體，該生長激素變異體包含單一cys突變及額外二硫鍵。在一具體實例中，單一cys突變為上述單一cys突變中之任一者。在一具體實例中，GH中之單一cys突變係選自hGH(SEQ ID NO:1)之以下任一者:T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及G190C，諸如以下任一者：P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C，或相應殘基。在一具體實例中，額外二硫鍵係選自半胱胺酸突變對之以下群組：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。在一具體實例中，生長激素變異體包含單一半胱胺酸及額外二硫鍵，該額外二硫鍵係選自以下半胱胺酸突變對：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C及/或S85C/S144C。
在一具體實例中，生長激素變異體在L2中包含單一半胱胺酸突變，且包含連接環區段(諸如胺基酸殘基128-154(H3)之環區段)與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2(對應於AA 72-98))之額外二硫鍵。在一具體實例中，生長激素變異體包含選自以下群組之突變之組合：A98C/Q84C/Y143C、A98C/S85C/Y143C、A98C/S85C/S144C、N99C/Q84C/Y143C、N99C/S85C/Y143C、N99C/S85C/S144C、S101C/Q84C/Y143C、S101C/S85C/Y143C、S101C/S85C/S144C、L101C/Q84C/Y143C、L101C/S85C/Y143C、L101C/S85C/S144C、C102C/Q84C/Y143C、C102C/S85C/Y143C及C102C/S85C/S144C。在一具體實例中，生長激素變異體包含選自以下群組之突變之組合：A98C/Q84C/Y143C、N99C/Q84C/Y143C、S101C/Q84C/Y143C、L101C/Q84C/Y143C及C102C/Q84C/Y143C。在一具體實例中，生長激素變異體包含突變L101C、Q84C及Y143C。在另一態樣中，本發明係關於包含生長激素化合物(GH)經由親水性間隔基連接至白蛋白結合殘基的生長激素接合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療。此外，在本發明之生長激素接合物中，GH、白蛋白結合殘基及親水性間隔基係選自上述具體實例中之任一者，特定而言，生長激素接合物具有式(I)或(II)。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含生長激素接合物或醫藥學上可接受之鹽視情況與醫藥學上可接受之賦形劑組合，該生長激素接合物包含生長激素化合物(GH)經由親水性間隔基連接至白蛋白結合殘基。如此項技術中已知之術語「一致性(identity)」係指兩個或兩個以上蛋白質之序列之間藉由比較該等序列所確定的關係。在此項技術中，「一致性」亦意謂蛋白質之間如由具有兩個或兩個以上胺基酸殘基之串之間的匹配數目所確定之序列相關性程度。「一致性」量測兩個或兩個以上序列中較小者之間的一致匹配百分比，其中空隙比對(若存在)利用特定數學模型或電腦程式(亦即「算法」)處理。相關蛋白質之一致性可易於藉由已知方法來計算。該等方法包括(但不限於)以下參考文獻中所述之方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A. M.編,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith,D. W.編,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A. M.及Griffin,H. G.編,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編,M. Stockton Press,New York,1991；及Carillo等人,SIAMJ. Applied Math., 48,1073,(1988)。
測定一致性之較佳方法經設計以得到所測試序列之間的最大匹配。測定一致性之方法描述於可公開獲得之電腦程式中。測定兩個序列之間之一致性的較佳電腦程式方法包括GCG程式包，包括GAP(Devereux等人,Nucl. Acid. Res., 12,387,(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madi-son,Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul等人,J. Mol. Biol., 215,403-410,(1990))。BLASTX程式可自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)及其他來源公開獲得(BLAST Manual,Altschul等人,NCB/NLM/NIH Bethesda,Md. 20894；Altschul等人,同上)。熟知之Smith Waterman算法亦可用於測定一致性。
舉例而言，使用電腦算法GAP(Genetics Computer Group,University of Wsconsin,Madison,Wis.)，將欲測定序列一致性百分比之兩個蛋白質進行對準以使其個別胺基酸最佳匹配(「匹配跨度(matched span)」，如由該算法所測定)。空隙空位罰分(gap opening penalty)(其計算為平均對角線的3倍；「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配給各完全胺基酸匹配的分數或數值)及空隙擴展罰分(gap extension penalty)(其通常為空隙空位罰分之{分數(1/10)}倍)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)聯合該算法一起使用。該算法亦使用標準比較矩陣(關於PAM 250比較矩陣，請參見Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷，增刊3,(1978)；關於BLOSUM 62比較矩陣，請參見Henikoff等人,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89，10915-10919,(1992))。
用於蛋白質序列比較之較佳參數包括以下：算法：Needleman等人,J. Mol. Biol, 48,443-453,(1970)；比較矩陣：Henikoff等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10915-10919,(1992)之BLOSUM 62；空隙罰分：12，空隙長度罰分：4，相似度臨界值：0。GAP程式適用於上述參數。上述參數為使用GAP算法進行蛋白質比較(且對於末端空隙無罰分)之預設參數。本發明化合物相較於相應未接合生長激素(其亦稱作母體化合物)具有改良之藥理學性質。該等藥理學性質之實例包括功能性活體內半衰期、免疫原性、腎臟過濾、蛋白酶保護及白蛋白結合。
術語「功能性活體內半衰期(functionalin vivo half-life)」以其通常含義使用，亦即在身體/目標器官中仍存在GH或GH接合物之生物活性的50%之時間，或GH或GH接合物之活性為其初始值之50%的時間。作為測定功能性活體內半衰期之替代方法，可測定「活體內血漿半衰期」，亦即在清除前於血漿或血流中有50%之GH或GH接合物循環的時間。測定血漿半衰期通常比測定功能性半衰期簡便，且血漿半衰期之量值通常可良好指示功能性活體內半衰期之量值。血漿半衰期之替代術語包括血清半衰期、循環半衰期(circulating half-life/circulatory half-life)、血清清除率、血漿清除率及清除半衰期。
與功能性活體內半衰期或血漿半衰期結合使用之術語「增加(increased)」用於指示GH接合物之相關半衰期相對於如在可比條件下所測定之母體GH之相關半衰期統計上顯著增加。舉例而言，相關半衰期可增加至少約25%，諸如至少約50%，例如至少約100%、150%、200%、250%或500%。在一具體實例中，本發明化合物之半衰期相對於母體GH之半衰期增加至少約5小時，較佳增加至少約24小時，更佳增加至少約72小時且最佳增加至少約7天。
可以如文獻中所述之多種方式進行活體內血漿半衰期之量測。活體內血漿半衰期之增加可定量為清除率(clearance，CL)降低或平均滯留時間(mean residence time，MRT)增加。如以適合檢定所測定CL降至母體GH之CL的70%以下，諸如50%以下，諸如20%以下，諸如10%以下的本發明之接合型GH視為具有增加之活體內血漿半衰期。在適合檢定中MRT增加至母體GH之MRT的130%以上，諸如150%以上，諸如200%以上，諸如500%以上的本發明之接合型GH視為具有增加之活體內血漿半衰期。可使用適合測試動物在標準藥物動力學研究中評估清除率及平均滯留時間。選擇適用於指定蛋白質之測試動物處於熟習此項技術者的能力範圍內。當然，在人類進行測試代表最終測試。適合測試動物包括正常史泊格多利(Sprague-Dawley)雄性大鼠、小鼠及食蟹獼猴。典型地，小鼠及大鼠以單次皮下快速注射(bolus)進行注射，而猴可以單次皮下快速注射或單次靜脈內給藥進行注射。注射量視測試動物而定。隨後，對於評估CL及MRT酌情經1至5天之時段取血液樣品。血液樣品宜藉由ELISA技術進行分析。
術語化合物之「免疫原性(Immunogenicity)」係指化合物在投予人類時引起有害免疫反應(體液、細胞抑或兩者)的能力。在任何人類子群中，可能存在對投予之特定蛋白質顯示敏感性的個體。免疫原性可藉由使用此項技術中已知之習知方法定量敏感個體體內生長激素抗體及/或生長激素反應性T細胞的存在來量測。在一具體實例中，本發明之接合型GH對敏感個體之免疫原性相對於母體GH對該個體之免疫原性降低至少約10%，較佳降低至少約25%，更佳降低至少約40%且最佳降低至少約50%。如本文所用之術語「蛋白酶保護(protease protection/protease protected)」意欲指示本發明之接合型GH相較於母體GH對血漿肽酶或蛋白酶更具抗性。血漿中存在之蛋白酶及肽酶已知參與降解循環蛋白質，諸如循環肽激素，諸如生長激素。該蛋白酶保護可藉由本文所述之實施例A之方法來量測。
生長激素可能對例如凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶及類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶的降解敏感。測定此等蛋白酶降解之檢定描述於J. Biotech., 65 ,183,(1998)中。在一具體實例中，GH接合物之水解速率為母體GH水解速率的70%以下，諸如40%以下，諸如10%以下。
哺乳動物物種之循環血液中最豐富之蛋白質組分為血清白蛋白，其通常以每100毫升全血約3至4.5公克之濃度存在。血清白蛋白為在循環系統中具有若干重要功能之具有約65,000道爾頓之血液蛋白質。其充當血液中存在之多種有機分子的輸送體，充當各種代謝物(諸如脂肪酸及膽紅素(bilirubin))經由血液之主要輸送體且由於其量豐富而充當循環血液之滲透調節劑。血清白蛋白之半衰期超過一週，且增加蛋白質之血漿半衰期的一種途徑為將結合血清白蛋白之基團接合至該蛋白質。白蛋白結合性質可如J. Med. Chem., 43,1986,(2000)中所述來測定，該文獻以引用的方式併入本文中。
式(I)或(II)之生長激素接合物發揮生長激素活性且因而可用於治療將受益於循環生長激素之量增加的疾病或病況。詳言之，本發明提供治療以下疾病之方法：生長激素缺乏(growth hormone deficiency，GHD)；透納氏症候群(Turner Syndrome)；普拉德-威利症候群(Prader-Willi syndrome，PWS)；努南氏症候群(Noonan syndrome)；唐氏症候群(Down syndrome)；慢性腎臟疾病；青少年類風濕性關節炎；囊腫性纖維化；接受HAART治療之兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；出生時小於胎齡(SGA)之矮小兒童(born short children born short for gestational age)；出生時出生體重極低(very low birth weight，VLBW)但SGA之兒童的身材矮小；骨骼發育不良；軟骨生成減退；軟骨發育不全；特發性身材矮小(idiopathic short stature，ISS)；成人GHD；長骨，諸如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、蹠骨及指骨中之骨折或其骨折；鬆質骨(spongious bone)，諸如頭蓋骨、手基部及足基部中之骨折或其骨折；例如手、膝或肩部腱或韌帶手術後之患者；有或經歷牽張成骨術(distraction oteogenesis)之患者；髖或關節盤置換、半月板修復、脊柱融合術或諸如膝、髖、肩、肘、腕或頜部之修復體安裝後之患者；已安裝了骨縫合材料(諸如釘、螺釘及板)之患者；骨折未接合或接合不良之患者；例如脛骨或第一腳趾骨切開術後之患者；移植物植入後之患者；由創傷或關節炎所致之膝關節軟骨退化；併發透納氏症候群之患者骨質疏鬆症；男性骨質疏鬆症；成年長期透析患者(adult patients in chronic dialysis，APCD)；APCD之營養不良相關性心血管疾病；APCD之惡病質逆轉；APCD之癌症；APCD之慢性阻塞性肺病；APCD之HIV；老年APCD；APCD之慢性肝病；APCD之疲勞症候群；克羅恩氏病(Crohn's disease)；肝功能異常；患有HIV感染之男性；短腸症候群；向心性肥胖；HIV相關性脂質營養不良症候群(HIV-associated lipodystrophysyndrome，HALS)；男性不育症；大型非急需手術後之患者；酒精/藥物解毒或神經創傷；老化；老年人虛弱；骨關節炎；創傷性軟骨損傷；勃起功能障礙；肌肉纖維疼痛；記憶障礙；抑鬱症；創傷性腦損傷；蛛網膜下出血；出生體重極低；代謝症候群；糖皮質激素肌病；或由糖皮質激素治療所致之兒童身材矮小，該方法包含投予有需要之患者治療有效量之式(I)或(II)之生長激素接合物。在另一態樣中，本發明提供加速肌肉組織、神經組織或創口之癒合；加速或改善受損組織之血流；或降低受損組織之感染率的方法，該方法包含投予有需要之患者治療有效量之式(I)或(II)之生長激素接合物。在另一具體實例中，本發明係關於式(I)或(II)之生長激素接合物之用途，其係用於製造受益於生長激素血漿含量增加之疾病，諸如上述疾病。
典型非經腸劑量處於每次投藥每公斤體重10-9 mg至約100 mg之範圍內。典型投藥劑量為每次投藥每公斤體重約0.0000001至約10 mg。確切劑量將視例如適應症、藥物、頻率及投藥方式；所治療個體之性別、年齡及一般狀況；所治療之疾病或病狀之性質及嚴重程度；所需治療效果；及其他對於熟習此項技術者明顯之因素而定。
典型給藥頻率為每天兩次、每天一次、每兩天一次、每週兩次、每週一次或給藥時間間隔更久。由於本發明之融合蛋白延長之半衰期，所以給藥時間間隔較長(諸如每週兩次、每週一次或給藥時間間隔更久)的給藥方案為本發明之一特定具體實例。
多種疾病在治療中使用同時投予或依序投予一種以上藥物來治療。因此，在本發明範疇內，在治療上述疾病之一的治療方法中將式(I)或(II)之生長激素接合物與一或多種通常用於治療該等疾病之其他治療活性化合物組合使用。同樣，亦在本發明範疇內，將式(I)或(II)之生長激素接合物與通常用於治療上述疾病之一的其他治療活性化合物組合使用來製造用於該疾病之藥物。
一般方法酶接合：在製備本發明之生長激素接合物中，典型地藉由使用如下文實施例中所說明之酶來製備在製備式(I)之A-W-B-GH接合物中形成之至少一個共價鍵。該酶可例如選自由轉麩醯胺酸酶、絲胺酸蛋白酶及半胱胺酸蛋白酶組成之群。該酶典型地為轉麩醯胺酸酶。該轉麩醯胺酸酶可例如選自由微生物轉麩醯胺酸酶、組織轉麩醯胺酸酶及因子XIII及其變異體組成之群。在另一具體實例中，該酶為半胱胺酸蛋白酶。本發明之生長激素接合物可藉由多種不同方法製備，非限制性實例展示於下文中。
本發明亦提供製備式(I)之A-W-B-GH接合物的方法。轉麩醯胺酸酶如上文所述，可藉由使用轉麩醯胺酸酶來製備在製備本發明之A-W-B-GH接合物中形成之至少一個共價鍵。轉麩醯胺酸酶可包括微生物轉麩醯胺酸酶，諸如自以下鏈黴菌屬物種分離者：茂原鏈黴菌、肉桂鏈黴菌、灰肉色鏈黴菌(US5156956，其係以引用之方式併入本文中)、淡紫鏈黴菌(US5252469，其係以引用之方式併入本文中)及拉達卡鏈黴菌(JP 2003/199569，其係以引用之方式併入本文中)。其他適用微生物轉麩醯胺酸酶已自枯草桿菌(揭示於US5731183中，該文獻以引用之方式併入本文中)及各種黏菌分離。適用微生物轉麩醯胺酸酶之其他實例為W01996/06931(例如來自利迪桿菌之轉麩醯胺酸酶)及W01996/22366中所揭示之轉麩醯胺酸酶，該等文獻均以引用的方式併入本文中。適用非微生物轉麩醯胺酸酶包括天竺鼠肝臟轉麩醯胺酸酶及來自各種海洋來源之轉麩醯胺酸酶，如扁魚真鯛(揭示於EP0555649中，該文獻以引用的方式併入本文中)及日本牡蠣正牡蠣(揭示於US5736356中，該文獻以引用的方式併入本文中)。其功能性類似物及衍生物亦可適用。
本發明方法中所用之TGase典型地為微生物轉麩醯胺酸酶。在一具體實例中，TGase來自茂原鏈黴菌，或其變異體，例如如WO2007/020290及WO2008/020075中所述。在另一具體實例中，TGase來自拉達卡鏈黴菌，或其變異體，例如如WO2008/020075中所述。可藉由TGase介導之修飾使得GH化合物之序列中視所用受質而定特定離胺酸(Lys)或麩醯胺酸(Gln)位置上發生選擇性改變來達成本發明GH與A-W-B之接合。使用胺作為受質將產生麩醯胺酸之修飾，而使用一級醯胺將產生離胺酸之修飾。hGH(SEQ ID NO: 1)在位置38、41、70、115、140、145、158、168及172具有9個離胺酸殘基，且在位置22、29、40、46、49、68、69、84、91、122、137、141及181具有13個麩醯胺酸殘基，然而並非所有此等殘基皆易於進行修飾或適用於修飾，因為此操作將會導致與生長激素結合蛋白之結合效能減弱，從而導致生物活性降低。hGH與其結合蛋白之間的X射線蛋白質晶體結構(pdb：3HHR)揭示至少4個離胺酸(38、41、168及172)參與與結合蛋白結合，而可能僅一個麩醯胺酸(Gln 46)參與與結合蛋白結合。此使得麩醯胺酸用作選擇性引入白蛋白結合劑連接子的目標更具吸引力。此等結構考慮進一步得到由N. Chene等人在Reprod. Nutr. Develop .29 ,1-25(1989)中所概述之研究結果支持，其中該文獻推斷，已發現影響離胺酸之化學修飾對GH之活體內生物活性及與肝臟受體之結合能力具有負面影響。
化學反應I在一態樣中，本發明係關於式(I)生長激素接合物之製備，其中使用TGase催化之化學反應用改良性質之基團處理GH化合物。最初，藉由兩步反應，使用胺基醇且隨後用高碘酸鹽處理該等胺基醇以藉由氧化裂解產生醛或酮官能基來安置醛或酮官能基。僅供說明之胺基醇的非限制性實例包括1,3-二胺基-2-丙醇及1-胺基-2,3-二羥基丙烷。在另一態樣中，本發明係關於式(I)生長激素接合物之製備，其包含用改良性質之基團衍生之苯胺或雜芳基胺處理自GH化合物衍生之醛或酮來產生胺(III→IV)。在一具體實例中，用改良性質之基團衍生之苯胺或雜芳基胺處理自GH化合物衍生之醛。
術語「GH化合物衍生之醛(或酮)(GH compound derived aldehyde(or ketone))」或「自GH化合物衍生之醛或酮(analdehyde or ketone derived from GH compound)」意欲指示醛或酮官能基已共價連接至GH化合物，或GH化合物上已產生了醛或酮官能基。GH化合物衍生之醛(諸如下文所說明之化合物(III))的製備為熟習此項技術者所熟知，且可使用任何此等已知程序來製備實現本文所揭示之本發明所需的GH化合物衍生之醛(III)。在一具體實例中，如下文所說明製備接合物A-W-B-GH(IV)：
利用GH(I)進行TGase介導之酶催化反應使得位置141及/或40之G1n得到修飾，產生(II)。用高碘酸鹽處理經修飾之GH(II)以裂解胺基醇，得到GH衍生之醛(III)。經由還原性烷基化使GH醛(III)與A-W-B1-NH2 接合(III→IV)。如本文所例示之還原性烷基化在此項技術中為公認的，且產生位置G1n(141)及/或40經修飾之GH化合物(IV)。
化學反應II在一具體實例中，如下文所說明在GH之N-端中使用還原性胺化來製備接合物A-W-B-GH：
經由還原性烷基化使GH與A-W-B1-CHO接合(GH→V)。如上文所例示之還原性烷基化在此項技術中公認可用於修飾GH之N-端。
化學反應III在一具體實例中，如下文所說明製備接合物A-W-B-GH：
其中半胱胺酸殘基視情況經保護成混合二硫醚(VI)(GH-S-S-R)，其中R為小有機部分。混合二硫醚之非限制性實例可包括胱胺(R=-CH2 CH2 NH2 )；半胱胺酸(R=-CH2 CH(C(O)OH)NH2 )；高半胱胺酸(R=-CH2 CH2 CH(C(O)OH)NH2 )；及麩胱甘肽(R=-CH2 CH(C(O)NH-CH2 C(O)OH)NH-C(O)CH2 CH2 CH(C(O)OH)NH2 )之間的二硫醚。
衍生化方法利用白蛋白結合連接子A-W-B1-LG，其中LG表示無機離去基，諸如-C1、-Br、-I；或有機離去基，諸如甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。經由親核取代使GH與A-W-B1-LG接合(VII→IX)。
化學反應IV在一具體實例中，如下文所說明製備接合物A-W-B-GH：
可使如上文自(VI)獲得之Cys脫除保護基之GH化合物(VII)與經順丁烯二醯亞胺取代之白蛋白結合劑連接子(X)反應，得到GH接合物A-W-B1-NHC(O)CH2 CH2 -吡咯啶-2,5-二酮-3-GH(XI)，其中親水性間隔基B1具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 ]m7 -，X4 為價鍵，11、12、13、14及15獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，E1及E2獨立地選自-O-、-NR6 -、-N(COR7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。
化學反應V在一具體實例中，如下文所說明製備接合物A-W-B-GH：
可使用如WO2009/024791中所述之S-亞硝醯基化學反應將白蛋白結合劑連接至單一cys GH衍生物。
藉由添加NO供體(諸如DEA NOnate(Sigma Aldrich))對Cys脫除保護基之GH化合物(VII)進行S-亞硝醯基化。
接著使亞硝醯基化之單一cys GH(XII)與經烯丙胺取代之白蛋白結合劑(XIII)反應，得到肟(XIV)，該肟在水解後得到GH接合物A-W-B1-C(O)NHCH2 C(O)CH2 -Cys GH(XV)，其中親水性間隔基B1具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 ]m7 -，X4 為價鍵，11、12、13、14及15獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。與天然肽關係密切一般視為包含投予此天然肽之變異體或類似物之治療性干預具有優勢，因為其使得例如任何不必要之抗體產生之風險降至最低。
GH可在其C-端中如WO2007/093594所述藉由使用羧肽酶Y(EC. 3.4.16.5)及適合經修飾受質來進行修飾。兩步程序如由B. Peschke等人,「C-Terminally PEGylated GH derivatives」Bioorg. Med. Chem . 15,4382-4395,(2007)所述，其中將C端丙胺酸酶催化地交換成Nε -(4-乙醯基苯甲醯基)離胺酸，繼而與本發明之白蛋白結合劑衍生物反應。如自上文顯而易見，本發明進一步係關於製備接合物A-W-B-GH中所用之中間連接子。該連接子化合物可使用式(III)描述：A-W-B1-U(III)其中A表示白蛋白結合殘基，B1表示親水性間隔基，W為連接A與B1之化學基團，且U表示接合部分。基於上述內容，接合部分將視所應用之接合方法而變化，其最後亦可見於最終hGH化合物(A-W-B-GH)中。在化合物A-W-B1-U之其他具體實例中，A及W係如任何上述具體實例中所定義。
當應用上文描述為化學反應IV之方法時，化合物A-W-B1-U可進一步定義為如下具體實例，其中U包含芳基、雜芳基、經取代之順丁烯二醯亞胺或吡咯啶-2,5-二酮(諸如-NHC(O)CH2 CH2 -吡咯啶-2.5-二酮)或由其組成。在化合物A-W-B1-U之替代具體實例中，U包含D1-(CH2 )16 -D2，其中D1及D2獨立地選自-O-、-N(R6)-、-NC(O)R7-或價鍵；其中R6及R7獨立地表示氫或C1-6 烷基。同樣地，應用如上文所述之化學反應III則應用如下連接子化合物，其中U包含離去基(諸如Cl、Br、I、-OH、-OS(O)2 Me、-OS(O)2 CF3 或-OTs)或由其組成；或較佳應用式(III)化合物，其中離去基為選自Cl、Br及I之鹵素化合物，較佳為Br。
連接子化合物(其應用於化學反應V中)之其他具體實例根據本發明由式(III)啶義，其中U包含烯丙胺(H2 C=CH-CH2 -NH2 )(諸如-C(O)NHCH2 -CH=CH2 )或由其組成。
當應用上文描述為化學反應I之方法時，化合物A-W-B1-U可進一步定義為如下具體實例，其中U包含胺(-NH2 )或由其組成。在替代具體實例中，U可包含醛(諸如-CHO)或由其組成。
該等化合物可隨後接合至包括「U」能夠接合之接受基團的任何類別之治療化合物。在一較佳具體實例中，治療化合物為多肽。肽可天然地包括可充當接受基團之AA殘基，諸如Gln殘基、Phe殘基及Cys殘基。或者，可將該等胺基酸殘基引入多肽中之適當位置。
醫藥組成物
另一目的在於提供一種醫藥組成物，其包含本發明之生長激素接合物，諸如式(I)或(II)之生長激素接合物，其以10-15 mg/mL至200 mg/mL，諸如10-10 mg/mL至5 mg/mL之濃度存在，且其中該組成物具有2.0至10.0之pH值。組成物可進一步包含醫藥賦形劑，諸如緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑。在本發明之一具體實例中，醫藥組成物為水性組成物，亦即組成物包含水。該組成物典型地為溶液或懸浮液。在本發明之另一具體實例中，醫藥組成物為水溶液。術語「水性組成物(aqueous composition)」定義為包含至少50% w/w水之組成物。同樣，術語「水溶液(aqueous solution)」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液(aqueous suspension)」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。
在另一具體實例中，醫藥組成物為冷凍乾燥組成物，醫師或患者臨使用前向其中添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一具體實例中，醫藥組成物為準備不經任何預先溶解即供使用之乾燥組成物(例如冷凍乾燥或噴霧乾燥)。在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含生長激素接合物(諸如式(I)或(II)之生長激素接合物)及緩衝劑之水溶液，其中該GH接合物以0.1-100 mg/mL或100 mg/mL以上之濃度存在，且其中該組成物具有約2.0至約10.0之pH值。在本發明之另一具體實例中，組成物之pH值係選自由以下組成之清單：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9及10.0。
在本發明之另一具體實例中，緩衝劑係選自由以下組成之群：乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及參(羥甲基)-胺基甲烷、N-二(羥乙基)甘胺酸(bicine)、N-三(羥甲基)甲基甘胺酸(tricine)、蘋果酸、丁二酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天門冬胺酸或其混合物。此等特定緩衝劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含醫藥學上可接受之防腐劑。在本發明之另一具體實例中，防腐劑係選自由以下組成之群：苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇及硫柳汞(thiomerosal)、溴硝丙二醇(bronopol)、苯甲酸、咪唑啶基脲(imidurea)、雙氯苯雙胍已烷(chlorohexidine)、去氫乙酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、苄索氯銨(benzethonium chloride)、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3-(對氯苯氧基)丙烷-1,2-二醇)或其混合物。在本發明之另一具體實例中，防腐劑以0.1 mg/mL至20 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，防腐劑以0.1 mg/mL至5 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，防腐劑以5 mg/mL至10 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，防腐劑以10 mg/mL至20 mg/mL之濃度存在。此等特定防腐劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。在醫藥組成物中使用防腐劑為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，請參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,2000。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含等張劑。在本發明之另一具體實例中，等張劑係選自由以下組成之群：鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、醛醣醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG 400)，或其混合物。可使用任何糖，諸如單醣、二醣或多醣，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚葡萄糖、聚三葡萄糖、糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉及羧甲基纖維素鈉。在一具體實例中，糖添加劑為蔗糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團之C4-C8烴，且包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇及阿糖醇。在一具體實例中，糖醇添加劑為甘露糖醇。上述糖或糖醇可個別或組合使用。所用量不存在固定限制，只要糖或糖醇可溶於液體製劑中且不會不利地影響使用本發明方法所獲得之穩定作用即可。在一具體實例中，糖或糖醇濃度在約1 mg/mL與約150 mg/mL之間。在本發明之另一具體實例中，等張劑以1 mg/mL至50 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，等張劑以1 mg/mL至7 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，等張劑以8 mg/mL至24 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，等張劑以25 mg/mL至50 mg/mL之濃度存在。此等特定等張劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。在醫藥組成物中使用等張劑為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，請參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,2000。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含螯合劑。在本發明之另一具體實例中，螯合劑係選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸及天門冬胺酸之鹽及其混合物。在本發明之另一具體實例中，螯合劑以0.1 mg/mL至5 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，螯合劑以0.1 mg/mL至2 mg/mL之濃度存在。在本發明之另一具體實例中，螯合劑以2 mg/mL至5 mg/mL之濃度存在。此等特定螯合劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。在醫藥組成物中使用螯合劑為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，請參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,2000。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含穩定劑。在醫藥組成物中使用穩定劑為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，請參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,2000。
更特定而言，本發明之組成物為穩定液體醫藥組成物，其治療活性組分包括可能在儲存期間於液體醫藥組成物中顯示聚集體形成之蛋白質。「聚集體形成」意指蛋白質分子之間導致形成可保持可溶之寡聚物或自溶液中沈澱之可見大聚集體的物理相互作用。「在儲存期間」意指液體醫藥組成物或組成物在製備後不即刻投予個體。而是在製備後，將其以液體形式、冷凍狀態或用於在以後復原成液體形式或適合於投予個體之其他形式的乾燥形式封裝以供儲存。「乾燥形式」意指藉由冷凍乾燥(亦即凍乾；參見例如Williams及Polli,J. Parenteral Sci. Technol., 38,48-59,(1984))、噴霧乾燥(參見Masters(1991),Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical,Essez,U.K.),第491-676頁；Broadhead等人,Drug Devel. Ind. Pharm . 18,1169-1206,(1992)；及Mumenthaler等人,Pharm. Res., 11,12-20,(1994))或空氣乾燥(Carpenter及Crowe,Cryobiology 25,459-470,(1988)；及Roser,Biopharm . 4,47-53,(1991))使液體醫藥組成物或組成物乾燥。在液體醫藥組成物儲存期間蛋白質形成聚集體會不利地影響該蛋白質之生物活性，使得醫藥組成物之治療功效喪失。此外，聚集體形成可能引起其他問題，諸如在使用輸注系統投予含蛋白質之醫藥組成物時會阻塞管道、膜或泵。
本發明之醫藥組成物可進一步包含足以在組成物儲存期間減少蛋白質聚集體形成之量的胺基酸鹼。「胺基酸鹼」意指胺基酸或胺基酸組合，其中任何指定胺基酸以其自由鹼形式或其鹽形式存在。在使用胺基酸組合時，所有胺基酸可以其自由鹼形式存在，所有胺基酸可以其鹽形式存在，或一些胺基酸可以其自由鹼形式存在，而其他胺基酸以其鹽形式存在。在一具體實例中，用於製備本發明組成物之胺基酸為具有帶電側鏈之胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸。特定胺基酸(甲硫胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸及其混合物)之任何立體異構體(亦即L或D異構體或其混合物)或此等立體異構體之組合或甘胺酸或有機鹼(諸如(但不限於)咪唑)可存在於本發明之醫藥組成物中，只要特定胺基酸或有機鹼以其自由鹼形式或其鹽形式存在即可。在一具體實例中，使用胺基酸之L-立體異構體。在一具體實例中，使用L-立體異構體。本發明之組成物亦可用此等胺基酸之類似物來調配。「胺基酸類似物」意指天然存在之胺基酸之衍生物，其在本發明之液體醫藥組成物儲存期間達成減少蛋白質聚集體形成的所需效果。適合精胺酸類似物包括例如胺基胍、鳥胺酸及N-單乙基L-精胺酸，適合甲硫胺酸類似物包括乙硫胺酸(ethionine)及丁硫胺酸(buthionine)，且適合半胱胺酸類似物包括S-甲基-L-半胱胺酸。如同其他胺基酸，胺基酸類似物以其自由鹼形式或其鹽形式併入組成物中。在本發明之另一具體實例中，胺基酸或胺基酸類似物以足以防止或延遲蛋白質聚集之濃度使用。
在本發明之另一具體實例中，當充當治療劑之蛋白質為包含至少一個易受氧化影響之甲硫胺酸殘基的蛋白質時，可添加甲硫胺酸(或其他含硫胺基酸或胺基酸類似物)以抑制甲硫胺酸殘基氧化成甲硫胺酸亞碸。「抑制」意指使甲硫胺酸氧化物質隨時間推移之聚集最少。抑制甲硫胺酸氧化使得蛋白質在更大程度上保持其適當分子形式。可使用甲硫胺酸之任何立體異構體(L或D異構體)或其任何組合。添加量應為足以抑制甲硫胺酸殘基氧化以使甲硫胺酸亞碸之量可為管理機構所接受的量。此典型地意謂組成物含有不超過約10%至約30%甲硫胺酸亞碸。一般而言，此可藉由添加甲硫胺酸以使所添加甲硫胺酸與甲硫胺酸殘基之比率處於約1:1至約1000:1，諸如10:1至約100:1之範圍內來達成。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含選自高分子量聚合物或低分子化合物之群的穩定劑。在本發明之另一具體實例中，穩定劑係選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L及HPMC)、環糊精、含硫物質(如單硫代甘油、硫代乙醇酸及2-甲基硫代乙醇)及不同鹽(例如氯化鈉)。此等特定穩定劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。
醫藥組成物亦可包含進一步增強其中所含治療活性蛋白質之穩定性的其他穩定劑。本發明特別關注之穩定劑包括(但不限於)甲硫胺酸及EDTA，其保護蛋白質以防甲硫胺酸氧化；及非離子型界面活性劑，其保護蛋白質以防與冷凍-解凍或機械剪切相關之聚集。
在本發明之另一具體實例中，組成物進一步包含界面活性劑。在本發明之另一具體實例中，界面活性劑係選自清潔劑；乙氧基化蓖麻油；聚乙二醇化甘油酯；乙醯化單酸甘油酯；脫水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)，諸如F68、泊洛沙姆188及407、粹通(Triton)X-100)；聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯及聚乙烯衍生物，諸如烷基化及烷氧基化衍生物(吐溫(tween)，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80及Brij-35)、其單酸甘油酯或乙氧基化衍生物、其二酸甘油酯或聚氧乙烯衍生物；醇；甘油；凝集素(lectin)；及磷脂(例如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、二磷脂醯甘油及鞘磷脂)；磷脂衍生物(例如二軟脂醯基磷脂酸)及溶血磷脂衍生物(例如軟脂醯基溶血磷脂醯-L-絲胺酸及乙醇胺、膽鹼、絲胺酸或蘇胺酸之1-醯基-sn-甘油-3-磷酸酯)；及溶血磷脂醯及磷脂醯膽鹼之烷基、烷氧基(烷酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂醯膽鹼之月桂醯及肉豆蔻醯衍生物、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼，及極性頭基之修飾，亦即膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘油、肌醇及帶正電DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP，溶血磷脂醯絲胺酸及溶血磷脂醯蘇胺酸，及甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油醣脂(例如哌喃半乳糖苷)、神經鞘醣脂(例如神經醯胺、神經節苷脂)、十二烷基磷醯基膽鹼、雞蛋溶血卵磷脂、夫西地酸(fusidicacid)衍生物(例如牛磺二氫夫西地酸鈉等)、C6 -C12 長鏈脂肪酸及其鹽(例如油酸及辛酸)、醯基肉鹼及衍生物；離胺酸、精胺酸或組胺酸之Nα -醯化衍生物，或離胺酸或精胺酸之側鏈醯化衍生物；包含離胺酸、精胺酸或組胺酸與中性或酸性胺基酸之任何組合之二肽的Nα -醯化衍生物；包含中性胺基酸與兩個帶電胺基酸之任何組合之三肽的Nα -醯化衍生物；DSS(多庫酯鈉(docusate sodium)，CAS登記號[577-11-7]；多庫酯鈣，CAS登記號[128-49-4]；多庫酯鉀，CAS登記號[7491-09-0])；SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)；辛酸鈉；膽酸或其衍生物；膽汁酸及其鹽以及甘胺酸或牛磺酸接合物、熊去氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、N-十六基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、陰離子型(烷基-芳基-磺酸根)單價界面活性劑、兩性離子型界面活性劑(例如N-烷基-N,N-二甲基銨基-1-丙烷磺酸鹽、3-膽醯胺基-1-丙基二甲基銨基-1-丙烷磺酸鹽)、陽離子型界面活性劑(四級銨鹼)(例如溴化十六烷基-三甲基銨、氯化十六烷基。比錠)、非離子型界面活性劑(例如十二烷基β-D-葡萄哌喃糖苷)、釙酸胺(poloxamine)(例如Tetronic's)(其為藉由將環氧丙烷及環氧乙烷依序加成至乙二胺所獲得之四官能性嵌段共聚物)，或界面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物之群。此等特定界面活性劑中之每一者構成本發明之一替代具體實例。
在醫藥組成物中使用界面活性劑為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，請參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,2000。
在本發明之醫藥組成物中可存在其他成分。該等其他成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、增積劑、張力調節劑、螯合劑、金屬離子、油性媒劑、蛋白質(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質)及兩性離子(例如胺基酸，諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸)。當然該等其他成分應不會不利地影響本發明醫藥組成物之總體穩定性。
含有本發明生長激素接合物之醫藥組成物可投予需要該治療之患者的若干部位，例如局部部位，例如皮膚及黏膜部位；繞過吸收之部位，例如投予動脈、靜脈、心臟中；以及涉及吸收之部位，例如投予皮膚中、皮膚下、肌肉中或腹中。
本發明醫藥組成物可經由若干投藥途徑投予需要該治療之患者，該等投藥途徑為例如經舌、舌下、經頰、口腔內、經口、胃部及腸道內、經鼻、肺部(例如經由細支氣管及肺泡或其組合)、表皮、真皮、經皮、陰道、直腸、眼部(例如經由結膜)、尿道以及非經腸投藥。
本發明之組成物可以若干劑型投予，例如溶液、懸浮液、乳液、微乳液、多重乳液、發泡體、油膏、糊劑、藥膏、軟膏、錠劑、包衣錠劑、漂洗劑、膠囊(例如硬明膠膠囊及軟明膠膠囊)、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用漂洗劑、陰道子宮托、陰道環、陰道軟膏、注射溶液、原位轉化溶液(例如原位膠凝、原位沈積、原位沈澱、原位結晶)、輸注溶液及植入物。
本發明之組成物可進一步例如經由共價、疏水及靜電相互作用混配於或連接至藥物載體、藥物傳遞系統及高級藥物傳遞系統以進一步增強生長激素接合物之穩定性、提高生體可用率、增加溶解度、減少不利影響、達成熟習此項技術者所熟知之時間治療(chronotherapy)及提高患者順應性或其任何組合。載體、藥物傳遞系統及高級藥物傳遞系統之實例包括(但不限於)聚合物，例如纖維素及衍生物、多醣(例如聚葡萄糖及衍生物)、澱粉及衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸及聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白(例如白蛋白)、凝膠(例如熱膠凝系統，例如熟習此項技術者所熟知之嵌段共聚合系統)、微胞、脂質體、微球體、奈米微粒、液晶及其分散液、L2相及其分散液(為熟習脂質-水系統中之相性質之技術者所熟知)、聚合微胞、多重乳液、自乳化劑、自微乳化劑、環糊精及其衍生物以及樹枝狀聚合物。
本發明之組成物適用於使用例如定劑量吸入器、乾粉吸入器及噴霧器(所有裝置皆為熟習此項技術者所熟知)肺部投予生長激素接合物之固體、半固體、粉末及溶液的組成物中。
本發明之組成物特別適用於控制、持續、延長、延遲及緩慢釋放藥物傳遞系統之組成物中。更特定而言(但不限於)，組成物適用於熟習此項技術者所熟知之非經腸控制釋放及持續釋放系統(兩種系統均使得投藥次數成倍減少)之組成物中。甚至更佳地，為皮下投予之控制釋放及持續釋放系統。不限制本發明之範疇，適用控制釋放系統及組成物之實例為水凝膠、油性凝膠、液晶、聚合微胞、微球體、奈米粒子。
產生適用於本發明之組成物之控制釋放系統的方法包括(但不限於)結晶、冷凝、共結晶、沈澱、共沈澱、乳化、分散、高壓均質化、膠囊化、噴霧乾燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發產生微球體、擠壓及超臨界流體方法。一般參考Handbook ofPharmaceutical Controlled Release (Wise,D.L.編,Marcel Dekker,New York,2000)；及Drug and the Pharmaceutical Sciences第99卷：Protein Composition and Delivery (MacNally,E.J.編,Marcel Dekker,New York,2000)。
非經腸投藥可藉助於注射器(視情況為筆式注射器)藉由皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射來進行。或者，非經腸投藥可藉助於輸注泵來進行。另一選擇為組成物可為用於以經鼻或經肺噴霧之形式投予生長激素接合物之溶液或懸浮液。作為另一選擇，含有本發明生長激素接合物之醫藥組成物亦可適於例如藉由無針注射或自貼片(視情況為離子滲透性貼片)經皮投予或經黏膜(例如經頰)投予。
術語「穩定組成物(stabitized composition)」係指組成物之物理穩定性增強、化學穩定性增強或物理及化學穩定性增強。
如本文所用之術語蛋白質組成物之「物理穩定性(physical stability)」係指由於蛋白質暴露於熱機械應力及/或與使其去穩定之界面及表面(諸如疏水性表面及界面)相互作用引起蛋白質形成無生物活性及/或不可溶之蛋白質聚集體的趨向。水性蛋白質組成物之物理穩定性係在使填充於適合容器(例如濾筒或小瓶)中之組成物在不同溫度下暴露於機械/物理應力(例如攪動)各種時段後藉助於目測檢查及/或濁度量測來評估。在黑暗背景下以銳聚焦光對組成物進行目測檢查。組成物之濁度藉由例如以0至3標度對濁度進行目測評分來特性化(組成物顯示無濁度對應於目測評分0分，且在日光下組成物顯示可見濁度對應於目測評分3分)。在組成物於日光下顯示可見濁度時，關於蛋白質聚集將組成物分類為具有物理不穩定性。或者，組成物之濁度可藉由熟習此項技術者熟知之簡便濁度量測來評估。水性蛋白質組成物之物理穩定性亦可藉由使用蛋白質之構形狀態之光譜劑或探針來評估。探針較佳為優先結合蛋白質之非天然構象異構體之小分子。蛋白質結構之小分子光譜探針之一實例為硫代黃素T(Thioflavin T)。硫代黃素T為已廣泛用於偵測類澱粉原纖維之螢光染料。在原纖維及或許其他蛋白質構型存在下，硫代黃素T當結合於原纖維蛋白質形式時在約450 nm下產生新激發最大值且在約482 nm下產生增強之發射。未結合之硫代黃素T在該等波長下基本上無螢光。
其他小分子可用作蛋白質結構自天然狀態變為非天然狀態之探針。舉例而言，優先結合蛋白質之暴露疏水性補丁(hydrophobic patch)之「疏水性補丁」探針。疏水性補丁在蛋白質呈天然狀態時一般嵌埋於該蛋白質之三級結構中，但隨著蛋白質開始伸展或變性而暴露。此等小分子光譜探針之實例為芳族疏水性染料，諸如蒽、吖啶、啡啉或其類似物。其他光譜探針為金屬-胺基酸錯合物，諸如疏水性胺基酸(諸如苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸及纈胺酸)之鈷金屬錯合物，或其類似物。
如本文所用之術語蛋白質組成物之「化學穩定性(chemical stability)」係指導致形成與天然蛋白質結構相比生物效能潛在較低及/或免疫原性性質潛在增強之化學降解產物的蛋白質結構之化學共價變化。可形成各種化學降解產物，視天然蛋白質之類型及性質以及蛋白質所暴露之環境而定。化學降解之消除很有可能不會完全避免，且在儲存及使用蛋白質組成物期間通常可見化學降解產物之量增加，如熟習此項技術者所熟知。大部分蛋白質傾向於脫醯胺，此為麩醯胺醯基或天門冬醯胺醯基殘基中之側鏈醯胺基水解形成自由羧酸的過程。其他降解路徑涉及形成高分子量轉化產物，其中兩種或兩種以上蛋白質分子經由轉醯胺及/或雙硫相互作用彼此共價結合，導致形成共價結合之二聚體、寡聚物及聚合物降解產物(Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahem. T.J. & Man-ning M.C.,Plenum Press,New York 1992 )。氧化(例如甲硫胺酸殘基之氧化)可作為化學降解之另一變化形式提及。蛋白質組成物之化學穩定性可藉由在暴露於不同環境條件(例如降解產物形成常因例如溫度升高而加速)後於不同時間點量測化學降解產物之量來評估。各個別降解產物之量常藉由使用各種層析技術(例如SEC-HPLC及/或RP-HPLC)視分子大小及/或電荷對降解產物進行分離來測定。
因此，如上文所概述之「穩定組成物」係指組成物之物理穩定性增強、化學穩定性增強或物理及化學穩定性增強。一般而言，組成物須在使用及儲存(遵照建議之使用及儲存條件)期間穩定直至到達失效日期為止。在本發明之一具體實例中，包含式(I)或(II)之生長激素接合物之醫藥組成物可穩定使用超過6週且穩定儲存超過3年。
在本發明之另一具體實例中，包含式(I)或(II)之生長激素接合物之醫藥組成物可穩定使用超過4週且穩定儲存超過3年。
在本發明之另一具體實例中，包含式(I)或(II)之生長激素接合物之醫藥組成物可穩定使用超過4週且穩定儲存超過2年。在本發明之另一具體實例中，包含式(I)或(II)之生長激素接合物之醫藥組成物可穩定使用超過2週且穩定儲存超過2年。本文所引用之所有參考案(包括公開案、專利申請案及專利)係以引用的方式併入本文中，其引用程度如同各參考案經個別地且特定地指示以引用的方式併入本文中且在本文中全文闡述一般。
本文中之所有標題及子標題僅出於方便之目的使用，而不應視作以任何方式限制本發明。除非本文另外指示或者上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素之任何組合的所有可能變化形式。除非本文另外指示或上下文明顯矛盾，否則如描述本發明之上下文中所用之術語「一(a/an)」及「該(the)」以及類似指示物應解釋為涵蓋單數及複數兩者(亦即一或多個)。除非本文另外指示，否則本文引述值之範圍僅欲用作個別提及屬於該範圍內之各個別值之簡寫方法，且各個別值係併入本說明書中，如同其在本文中經個別引述一般。除非另作說明，否則本文所提供之所有確切值表示相應近似值(例如，關於特定因數或量測值所提供之所有例示性確切值可視為亦提供適當時經「約」修飾之相應近似量測值)。
除非本文另外指示或者上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合次序執行。除非另外指示，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅欲更好地闡明本發明且不對本發明範疇構成限制。除非同樣明確說明，否則本說明書中之語言不應解釋為表明任何要素對於實施本發明必不可少。
本文引用及併入專利文件僅出於方便起見且不反映對該等專利文件之合法性、專利性及/或可執行性的任何觀點。下文提供描述本發明之具體實例的非詳盡清單。
具體實例清單：具體實例1：一種生長激素接合物，其包含具有以下之生長激素化合物(GH)：a)　單一Cys突變，b)　額外二硫橋鍵，或c)　單一Cys突變及額外二硫橋鍵，其中白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至該GH，或其醫藥學上可接受之鹽。2.如具體實例1之接合物，其中GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少80%一致性，諸如與hGH具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO: 1)。3.如具體實例1之接合物，其中GH或GH接合物具有hGH之生長激素活性之至少80%。4.如具體實例1至3中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至具有單一Cys突變之GH。
5.如具體實例4之接合物，其中該單一Cys突變位於選自GH之N-端、H1、H2、L2或H3之區域中之任一者中。6.如具體實例5之接合物，其中該GH具有選自以下任一者之單一Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。
7.如具體實例1至3中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至具有額外二硫橋鍵之GH。
8.如具體實例7之接合物，其中該額外二硫鍵位於環區段與螺旋區段之間或位於環區段內或位於環區段之間或位於螺旋區段之間。9.如具體實例7至8中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段中，諸如胺基酸殘基128至154(L3)之環區段中。10.如具體實例7至9中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋區段(諸如螺旋B或H2)。11.如具體實例7至10中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵連接L3與H2。
12.如具體實例7至11中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置之至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C，諸如Q84C/Y143C。
13.如具體實例1至3中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至具有單一Cys突變及額外二硫橋鍵之GH。
14.如具體實例13之接合物，其中該GH具有選自以下任一者之單一Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。
15.如具體實例13至14中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵位於環區段與螺旋區段之間或位於環區段內或位於環區段之間或位於螺旋區段之間。16.如具體實例13至15中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段中，諸如胺基酸殘基128至154(L3)之環區段中。17.如具體實例13至16中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋區段(諸如螺旋B或H2)。18.如具體實例13至17中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵連接環區段(諸如胺基酸殘基128至154L3之環區段)與螺旋B或H2。
19.如具體實例13至18中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置之至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C，諸如Q84C/Y143C。
20.如具體實例1至19中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基係選自
其中*表示經由連接白蛋白結合殘基與親水性間隔基之化學基團連接至親水性間隔基。
21.如具體實例1至20中任一具體實例之接合物，其中連接該白蛋白結合殘基與該親水性間隔基之該化學基團具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
22.如具體實例1至21中任一具體實例之接合物，其中該親水性間隔基具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4)14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH，-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
23.如具體實例1至22中任一具體實例之接合物，其中X4 為價鍵且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。
24.如具體實例22之接合物，其中該親水性間隔基係選自
25.一種生長激素接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：A-W-B-GH　(I)其中GH表示具有單一Cys突變之生長激素化合物，B表示連接至該Cys突變之硫殘基之親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。26.如具體實例25之接合物，其中GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少80%一致性，諸如與hGH具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO: 1)。27.如具體實例25之接合物，其中GH或GH接合物具有hGH之生長激素活性之至少80%。28.如具體實例25至27中任一具體實例之接合物，其中該單一Cys突變位於選自GH之N-端、H1、H2、L2或H3之區域中之任一者中。
29.如具體實例25至28中任一具體實例之接合物，其中該GH具有選自以下任一者之單一Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。30.如具體實例25至29中任一具體實例之接合物，其中A係選自
其中*表示經由W連接至B。
31.如具體實例25至30中任一具體實例之接合物，其中W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
32.如具體實例25至31中任一具體實例之接合物，其中B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
33.如具體實例25至32中任一具體實例之接合物，其中11、12、13、14、15及16獨立地為0-6，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0-6，m2及m5獨立地為0-10，及n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。34.如具體實例25至33中任一具體實例之接合物，其中D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。35.如具體實例25至34中任一具體實例之接合物，其中E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。36.如具體實例25至35中任一具體實例之接合物，其中W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。37.如具體實例25至36中任一具體實例之接合物，其中R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。
38.如具體實例25至37中任一具體實例之接合物，其中-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2 ]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。39.如具體實例25至38中任一具體實例之接合物，其中X4 為價鍵且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。40.如具體實例25至39中任一具體實例之接合物，其中B係選自
41.如具體實例25至40中任一具體實例之接合物，其中該化合物係選自
42.一種生長激素接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：A-W-B-GH　(I)其中GH表示具有額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B表示親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。
43.如具體實例42之接合物，其中GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少80%一致性，諸如與hGH具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO: 1)。44.如具體實例42之接合物，其中GH或GH接合物具有hGH之生長激素活性之至少80%。45.如具體實例44之接合物，其中該活性係在試管內BAF檢定(檢定I)中量測。
46.如具體實例42至45中任一具體實例之接合物，其中該GH在環區段與螺旋區段之間或在環區段內或在環區段之間或在螺旋區段之間包含額外二硫鍵。47.如具體實例42至46中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段中，諸如胺基酸殘基128至154(L3)之環區段中。48.如具體實例42至47中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋區段(諸如螺旋B或螺旋2)。49.如具體實例42至48中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中該額外二硫鍵連接L3(128-154)與螺旋B或螺旋2。
50.如具體實例42至49中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置之至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C，諸如Q84C/Y143C。
51.如具體實例42至50中任一具體實例之接合物，其中A係選自
其中*表示經由W連接至B。
52.如具體實例42至51中任一具體實例之接合物，其中W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
53.如具體實例42至52中任一具體實例之接合物，其中B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )l1 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )l2 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )l3 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )l4 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )l5 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )l6 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
54.如具體實例42至53中任一具體實例之接合物，其中11、12、13、14、15及16獨立地為0-6，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0-6，m2及m5獨立地為0-10，及n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。55.如具體實例42至54中任一具體實例之接合物，其中D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。56.如具體實例42至55中任一具體實例之接合物，其中E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。57.如具體實例42至56中任一具體實例之接合物，其中W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基或-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
58.如具體實例42至57中任一具體實例之接合物，其中R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。59.如具體實例42至58中任一具體實例之接合物，其中-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。60.如具體實例42至59中任一具體實例之接合物，其中B係選自
61.如具體實例42至60中任一具體實例之接合物，其中A經由B連接至對應於hGH SEQ ID NO: 1中位置40、位置141之位置之麩醯胺酸殘基或生長激素化合物之N-端殘基。
62.如具體實例42至61中任一具體實例之接合物，其中該化合物係選自
63.一種生長激素接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：A-W-B-GH(I)其中GH表示具有單一Cys突變及額外二硫橋鍵之生長激素化合物，B表示連接至該Cys突變之硫殘基之親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基；及其醫藥學上可接受之鹽。
64.如具體實例63之接合物，其中GH表示包含與人類生長激素(hGH)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少80%一致性，諸如與hGH具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之胺基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO: 1)。65.如具體實例64之接合物，其中GH或GH接合物具有hGH之生長激素活性之至少80%。66.如具體實例63至65中任一具體實例之接合物，其中該單一Cys突變位於選自GH之N-端、H1、H2、L2或H3之區域中之任一者中。
67.如具體實例63至66中任一具體實例之接合物，其中該GH具有選自以下任一者之單一Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及G190C，諸如以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。
68.如具體實例63至67中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵位於環區段與螺旋區段之間或位於環區段內或位於環區段之間或位於螺旋區段之間。69.如具體實例63至68中任一具體實例之接合物，其中該GH包含額外二硫鍵，其中至少一個半胱胺酸存在於環區段中，諸如胺基酸殘基128至154(L3)之環區段中。70.如具體實例63至69中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵連接環區段與螺旋區段(諸如H2)。71.如具體實例63至70中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫鍵連接L3與螺旋H2。
72.如具體實例63至71中任一具體實例之接合物，其中該額外二硫橋鍵位於對應於hGH(SEQ ID NO: 1)中以下之位置之至少一個胺基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C，諸如Q84C/Y143C。
73.如具體實例63至72中任一具體實例之接合物，其中A係選自
其中*表示經由W連接至B。
74.如具體實例63至73中任一具體實例之接合物，其中W具有下式：-W7 -Y-，其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0-6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
75.如具體實例63至74中任一具體實例之接合物，其中B具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 -W6 ]m7 -，X4 為F-D1-(CH2 )16 -D2-，11、12、13、14、15及16獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，F為芳基、雜芳基、吡咯啶-2,5-二酮或價鍵，其中芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，D1、D2、E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，W6 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s1 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基、-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中s1為0或1，且C1-6 烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。76.如具體實例63至75中任一具體實例之接合物，其中11、12、13、14、15及16獨立地為0-6，m1、m3、m4、m6及m7獨立地為0-6，m2及m5獨立地為0-10，及n1、n2、n3及n4獨立地為0-10。77.如具體實例63至75中任一具體實例之接合物，其中D1及D2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。78.如具體實例63至77中任一具體實例之接合物，其中E1及E2獨立地選自-O-或-N(R6 )-或價鍵。79.如具體實例63至78中任一具體實例之接合物，其中W1 至W8 獨立地選自由以下組成之群：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-NHC(O)C1-6 烷基或-C(O)NHC1-6 烷基或價鍵；其中烷基視情況經以下基團取代：側氧基、吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH；其中(*)指示CH之碳原子與X4 之連接點。
80.如具體實例63至79中任一具體實例之接合物，其中R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)2 OH或C1-6 烷基；其中烷基視情況經以下基團取代：-C(O)OH、-C(O)NH2 或-S(O)2 OH。81.如具體實例63至80中任一具體實例之接合物，其中-{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -及-{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -(其中E1及E2為-O-)係選自
其中*意欲表示連接點，亦即開鍵。82.如具體實例63至81中任一具體實例之接合物，其中X4 為價鍵且W6 係選自吡咯啶-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH2 COOH或-NHC(O)CH2 CH*COOH，其中(*)指示CH之碳原子與GH之連接點。83.如具體實例63至82中任一具體實例之接合物，其中B係選自
84.如具體實例1至83中任一具體實例之接合物，其中一個白蛋白結合殘基(A)經由親水性間隔基(B)連接至該GH。85.如具體實例63至84中任一具體實例之接合物，其中該化合物係選自
86.如具體實例1至85中任一具體實例之接合物，其中親水性間隔基具有mLogP<0。87.如具體實例1至86中任一具體實例之接合物，其中該親水性間隔基之莫耳重量處於80 D至1500 D之範圍內，或處於300 D至1100 D之範圍內。88.如具體實例1至87中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基為親脂性殘基。89.如具體實例1至88中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基非共價結合至白蛋白。90.如具體實例1至89中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基在生理pH值下帶負電。91.如具體實例1至90中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基對人類血清白蛋白具有低於約10 μM或低於約1 μM之結合親和力。92.如具體實例1至91中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基係選自直鏈烷基、分支鏈烷基、具有ω-羧酸基團或ω-羧酸同電子排列體之基團。93.如具體實例1至92中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基具有6至40個碳原子、8至26個碳原子或8至20個碳原子。
94.如具體實例1至93中任一具體實例之接合物，其中該白蛋白結合殘基為肽，諸如包含少於40個胺基酸殘基之肽。95.如具體實例1至94中任一具體實例之接合物，其中兩個白蛋白結合殘基(A)經由親水性間隔基(B)連接至該GH。96.如具體實例1至95中任一具體實例之接合物，其係用於治療。97.一種醫藥組成物，其包含如具體實例1至95中任一具體實例之接合物，視情況與醫藥學上可接受之賦形劑組合。
98.如具體實例97之醫藥組成物，其中該組成物可經由舌、舌下、經頰、口腔內、經口、胃部及腸道內、經鼻、肺部、表皮、真皮、經皮及非經腸投予患者。99.一種治療生長激素缺乏(GHD)之方法，該方法包含投予有需要之患者治療有效量之如具體實例1至95中任一具體實例之接合物。
100.一種治療以下疾病之方法：透納氏症候群；普拉德-威利症候群(PWS)；努南氏症候群；唐氏症候群；慢性腎臟疾病；青少年類風濕性關節炎；囊腫性纖維化；接受HAART治療之兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；出生時小於胎齡(SGA)之矮小兒童；出生時出生體重極低(VLBW)但SGA之兒童的身材矮小；骨骼發育不良；軟骨生成減退；軟骨發育不全；特發性身材矮小(ISS)；成人GHD；長骨，諸如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、蹠骨及指骨中之骨折或其骨折；鬆質骨，諸如頭蓋骨、手基部及足基部中之骨折或其骨折；例如手、膝或肩部腱或韌帶手術後之患者；有或經歷牽張成骨術之患者；髖或關節盤置換、半月板修復、脊柱融合術或諸如膝、髖、肩、肘、腕或頜部之修復體安裝後之患者；已安裝了骨縫合材料(諸如釘、螺釘及板)之患者；骨折未接合或接合不良之患者；例如脛骨或第一腳趾骨切開術後之患者；移植物植入後之患者；由創傷或關節炎所致之膝關節軟骨退化；併發透納氏症候群之患者骨質疏鬆症；男性骨質疏鬆症；成年長期透析患者(APCD)；APCD之營養不良相關性心血管疾病；APCD之惡病質逆轉；APCD之癌症；APCD之慢性阻塞性肺病；APCD之HIV；老年APCD；APCD之慢性肝病；APCD之疲勞症候群；克羅恩氏病；肝功能異常；患有HIV感染之男性；短腸症候群；向心性肥胖；HIV相關性脂質營養不良症候群(HALS)；男性不育症；大型非急需手術後之患者；酒精/藥物解毒或神經創傷；老化；老年人虛弱；骨關節炎；創傷性軟骨損傷；勃起功能障礙；肌肉纖維疼痛；記憶障礙；抑鬱症；創傷性腦損傷；蛛網膜下出血；出生體重極低；代謝症候群；糖皮質激素肌病；由糖皮質激素治療所致之兒童身材矮小，加速肌肉組織、神經組織或創口癒合；加速或改善受損組織血流；或降低受損組織感染率，該方法包含投予有需要之患者治療有效量之如具體實例1至95中任一具體實例之接合物。
101.一種如具體實例1至95中任一具體實例之接合物的用途，其係用於製造用於治療生長激素缺乏(GHD)之藥物。
102.一種如具體實例1至95中任一具體實例之接合物的用途，其係用於製造用於治療以下疾病之藥物：透納氏症候群；普拉德-威利症候群(PWS)；努南氏症候群；唐氏症候群；慢性腎臟疾病；青少年類風濕性關節炎；囊腫性纖維化；接受HAART治療之兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；出生時小於胎齡(SGA)之矮小兒童；出生時出生體重極低(VLBW)但SGA之兒童的身材矮小；骨骼發育不良；軟骨生成減退；軟骨發育不全；特發性身材矮小(ISS)；成人GHD；長骨，諸如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、蹠骨及指骨中之骨折或其骨折；鬆質骨，諸如頭蓋骨、手基部及足基部中之骨折或其骨折；例如手、膝或肩部腱或韌帶手術後之患者；有或經歷牽張成骨術之患者；髖或關節盤置換、半月板修復、脊柱融合術或諸如膝、髖、肩、肘、腕或頜部之修復體安裝後之患者；已安裝了骨縫合材料(諸如釘、螺釘及板)之患者；骨折未接合或接合不良之患者；例如脛骨或第一腳趾骨切開術後之患者；移植物植入後之患者；由創傷或關節炎所致之膝關節軟骨退化；併發透納氏症候群之患者骨質疏鬆症；男性骨質疏鬆症；成年長期透析患者(APCD)；APCD之營養不良相關性心血管疾病；APCD之惡病質逆轉；APCD之癌症；APCD之慢性阻塞性肺病；APCD之HIV；老年APCD；APCD之慢性肝病；APCD之疲勞症候群；克羅恩氏病；肝功能異常；患有HIV感染之男性；短腸症候群；向心性肥胖；HIV相關性脂質營養不良症候群(HALS)；男性不育症；大型非急需手術後之患者；酒精/藥物解毒或神經創傷；老化；老年人虛弱；骨關節炎；創傷性軟骨損傷；勃起功能障礙；肌肉纖維疼痛；記憶障礙；抑鬱症；創傷性腦損傷；蛛網膜下出血；出生體重極低；代謝症候群；糖皮質激素肌病；由糖皮質激素治療所致之兒童身材矮小；加速肌肉組織、神經組織或創口癒合；加速或改善受損組織血流；或降低受損組織感染率。
103.一種式(III)化合物，A-W-B1-U(III)其中A表示白蛋白結合殘基，B1表示親水性間隔基，W為連接A與B1之化學基團，且U表示接合部分。
104.如具體實例103之化合物，其中A及W係如上述具體實例中任一具體實例所定義。
105.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含芳基、雜芳基、經取代之順丁烯二醯亞胺或吡咯啶-2,5-二酮(諸如-NHC(O)CH2 CH2 -吡咯啶-2.5-二酮)，或由其組成。
106.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含D1-(CH2 )16 -D2，其中D1及D2獨立地選自-O-、-N(R6)-、-NC(O)R7-或價鍵；其中R6及R7獨立地表示氫或C1-6 烷基。107.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含離去基(諸如Cl、Br、I、-OH、-OS(O)2 Me、-OS(O)2 CF3 、-Ots)或由其組成。108.如具體實例107之化合物，其中離去基為選自Cl、Br及I之鹵素化合物，較佳為Br。109.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含烯丙胺(H2 C=CH-CH2 -NH2 )(諸如-C(O)NHCH2 -CH=CH2 )或由其組成。110.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含胺(諸如-NH2 )或由其組成。111.如具體實例103至110中任一具體實例之化合物，其中該治療化合物為多肽。112.如具體實例103至110中任一具體實例之化合物，其中該治療化合物為具有單一自由胱胺酸之多肽。113.如具體實例103或具體實例104之化合物，其中U包含醛(諸如-CHO)或由其組成。
114.如具體實例103至113中任一具體實例之化合物，其中親水性間隔基B1具有下式：-X1 -X2 -X3 -X4 -，其中X1 為-W1 -[(CHR1 )11 -W2 ]m1 -{[(CH2 )n1 E1]m2 -[(CHR2 )12 -W3 ]m3 }n2 -，X2 為-[(CHR3 )13 -W4 ]m4 -{[(CH2 )n3 E2]m5 -[(CHR4 )14 -W5 ]m6 }n4 -，X3 為-[(CHR5 )15 ]m7 -，X4 為價鍵，11、12、13、14及15獨立地選自0-16，m1、m3、m4、m6及m7獨立地選自0-10，m2及m5獨立地選自0-25，n1、n2、n3及n4獨立地選自0-16，R1 、R2 、R3 、R4 及R5 獨立地選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-NH-C(=NH)-NH2 、C1-6 烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基及雜芳基視情況經以下基團取代：鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH2 、-S(O)OH、-S(O)2 OH、-CN或-OH，E1及E2獨立地選自-O-、-N(R6 )-、-N(C(O)R7 )-或價鍵；其中R6 及R7 獨立地表示氫或C1-6 烷基，W1 至W5 獨立地選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s2 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。
除非上下文另作說明或明顯矛盾，否則本文中關於要素使用諸如「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」或「含有(containing)」之術語對本發明之任何態樣或具體實例進行描述意欲支持「由特定要素組成」、「基本上由特定要素組成」或「實質上包含」特定要素之本發明類似態樣或具體實例(例如，除非上下文另作說明或明顯矛盾，否則本文描述為包含特定要素之組成物應理解為亦描述由該要素組成之組成物)。
本發明包括本文所呈現之態樣或申請專利範圍中所述之標的物之所有修改及等效物達適用法律准許之最大程度。
本發明進一步由以下實施例說明，然而，該等實施例不應視作限制保護範疇。上文描述及下文實施例中所揭示之特徵單獨及呈其任何組合形式時可為以不同形式實現本發明之材料。
實施例
縮寫：
amu=原子質量單位
CV=管柱體積
hr(s)=小時
Hz=赫茲
L=公升
M=莫耳濃度
mbar=毫巴
mg=毫克
min.=分鐘
mL=毫升
mM=毫莫耳濃度
mm=毫米
mmol=毫莫耳
nmol=奈莫耳
mol=莫耳
μL=微升
N=當量濃度
nm=奈米
sec=秒
ppm=百萬分率
ESI=電噴霧電離
i.v.=靜脈內
m/z=質荷比
MS=質譜
HPLC=高壓液相層析
RP=逆相
HPLC-MS=高壓液相層析-質譜
NMR=核磁共振光譜
p.o.=經口
rt或RT=室溫
s.c.=皮下
tr=滯留時間
Boc=第三丁氧羰基
O -t -Bu=第三丁酯
t -Bu=第三丁基
Boc-4-ABZ-OH=4-第三丁氧羰基胺基-苯甲酸
DCM=二氯甲烷、CH2 Cl2 、亞甲基氯
DIC=二異丙基碳化二亞胺
DIPEA=N,N-二異丙基乙胺
DMF=N,N-二甲基甲醯胺
DMSO=二甲亞碸
DTT=二硫蘇糖醇
EDAC=1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽
Et2 O=乙醚
EtOAc=乙酸乙酯
Fmoc=9H-茀-9-基甲氧基羰基
Fmoc-Glu-O-t -Bu=N-Fmoc-麩胺酸-1-第三丁酯
Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(二苯基-對甲苯基-甲基)-胺基]-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-己酸
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-胺基)乙氧基]乙氧基)乙酸
OEG=(2[2-(胺基)乙氧基]乙氧基)乙醯基
Fmoc-Thx-OH=N-Fmoc-反-4-胺基甲基環己烷甲酸
H2 O=水
HOBt=1-羥基苯并三唑
MeCN=乙腈
MeOH=甲醇
MTP=3-甲基-硫代-1-丙醇
NaCl=氯化鈉
NaOH=氫氧化鈉
NMP=N-甲基吡咯啶-2-酮
OEG=(2[2-(胺基)乙氧基]乙氧基)乙酸
TFA=三氟乙酸
THF=四氫呋喃
TIS=三異丙基矽烷
CDCl3 =氘代氯仿
CD3 OD=四氘代甲醇
DMSO-d 6 =六氘代二甲亞碸
TNBS=三硝基苯磺酸
TSTU=四氟硼酸O-(N-丁二醯亞胺)-1,1,3,3-四甲基
實施例亦利用以下一般方法：
製備hGH化合物之一般方法
將編碼生長激素化合物之基因重組插入質體載體中。隨後使用質體載體轉型適合大腸桿菌(E. coli. )菌株。所表現之hGH或GH變異體可具有N-端甲硫胺酸或呈MEAE融合體形式，MEAE序列隨後自其裂解。在25%甘油中製備細胞儲備液且儲存於-80℃下。將甘油儲備液菌株接種於LB培養板中且隨後在37℃下培育隔夜。用LB培養基洗滌各培養板之內容物且在500 mL LB培養基中稀釋以供表現。在37℃下在220 rpm振盪下培育培養物直至OD600 達到0.6。在25℃下使用0.2 mM IPTG進行後續誘導6小時。最終藉由離心收集細胞。
隨後將細胞懸浮於含有0.05%吐溫20、2.5 mM EDTA、10 mM半胱胺及4 M尿素之10 mM Tris-HCl(pH=9.0)中，且使用細胞破碎機在30 kPSI下破碎。藉由離心收集上清液且隨後進行層析純化。
使用離子交換層析及疏水性相互作用進行純化，繼而使用由CHO細胞表現之人類二肽基肽酶I(human dipeptidyl peptidase I，hDPPI)移除肽標籤。藉由同種沈澱(isoprecipitation)及離子交換層析達成最終純化。純化亦可藉由使用(但不限於)熟習此項技術者已知之離子交換層析、疏水性相互作用層析、親和層析、尺寸排阻層析及基於膜之分離技術來達成。
經純化之生長激素化合物之蛋白質化學特性化 使用MALDI-MS分析完整純化蛋白質。所觀測到之質量對應於自胺基酸序列推導出之理論質量。預期鍵聯二硫鍵可藉由使用胰蛋白酶及AspN消化繼而在用DTT還原二硫鍵之前及之後對消化物進行MALDI-MS分析以進行肽定位來證明。
量測GH及hGH化合物接合物之蛋白酶降解速率的檢定 在適當緩衝液(例如PBS或碳酸氫銨)中於37℃下利用相關蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳酶、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧肽酶、DPPIV、中性肽鏈內切酶、顆粒溶解酶B(Granzyme B)、脯胺酸-肽鏈內切酶、葡萄球菌肽酶I(Staphylococcal peptidase I)、嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N肽鏈內切酶、卡斯蛋白酶1-10(Caspase 1-10)、梭菌蛋白酶(Clostripain)、腸激酶(Enterokinase)、麩胺醯基肽鏈內切酶、顆粒溶解酶B、LysC、LysN、脯胺酸-肽鏈內切酶及葡萄球菌肽酶I或組織萃取物)消化相關化合物達24小時。藉由HPLC檢定評估蛋白水解降解。
蛋白水解消化：在37℃下利用酶降解100 μL測試化合物於碳酸氫銨緩衝液中之1 mg/mL溶液達24小時。在不同時間點取子樣品，且藉由於1% TFA中10倍稀釋以便酸化樣品來停止蛋白水解反應。藉由逆相HPLC分析此等經稀釋之樣品以評估蛋白水解消化程度。
HPLC方法：將10 μL上述溶液注射於逆相Vydac C4 2×150 mm管柱上，用30分鐘時間內0.1% TFA水溶液至含0.1% TFA之100%乙腈的線性梯度以0.2毫升/分鐘之流速溶離。在214 nm下進行UV吸收度峰值偵測。由時間點t=T時之峰面積(AT )及t=0時之峰面積(A0 )根據(AT /A0 )×100%計算時間點t=T時完整化合物之百分比(%)。使用GraphPad Prims軟體版本5.01繪製完整化合物百分比(%)相對於時間的曲線。亦藉由GraphPad Prism軟體以單相衰變計算半衰期()。可使用之酶之實例為彈性蛋白酶(Sigma，來自豬胰臟)及胰凝乳酶(Roche，定序級)。緩衝液之實例為50 mM碳酸氫銨(pH=8.5)。
毛細管電泳：使用Agilent Technologies 3DCE系統(Agilent Technologies)進行毛細管電泳。使用Agilent Technologies 3DCE ChemStation進行資料擷取及信號處理。毛細管為64.5 cm(56.0 cm有效長度)且內徑為50 μm之「延長光路毛細管(Extended Light Path Capillary)」(來自Agilent)。在200 nm下(16 nm Bw，參照380 nm及50 nm Bw)進行UV偵測。電泳電解質為50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7)(方法A)。用0.1 M NaOH調節毛細管3分鐘，接著用Milli-Q水調節毛細管2分鐘且用電解質調節毛細管3分鐘。各次電泳後，用milli-Q水沖洗毛細管2分鐘，接著用磷酸沖洗2分鐘，且用milli-Q水沖洗2分鐘。在50毫巴下進行流體動力注射4.0秒。電壓為+25 kV。毛細管溫度為30℃且操作時間為10.5分鐘。
Maldi-Tof質譜：使用Autoflex Maldi-Tof儀器(Bruker)測定分子量。使用α-氰基-4-羥基-肉桂酸作為基質製備樣品。RP-HPLC：在Agilent 1100系統上使用Vydac 218TP54 4.6 mm×250 mm 5 μm C-18二氧化矽管柱(The Separations Group,Hesperia)進行RP-HPLC分析。利用UV在214 nm、254 nm、280 nm及301 nm下偵測。管柱用0.1%三氟乙酸/H2 O平衡且樣品用0%至90%乙腈對0.1%三氟乙酸/H2 O之適合梯度溶離。
LC-MS：在裝備有兩個Perkin Elmer系列200微型泵、Perkin Elmer系列200自動取樣器、Applied Biosystems 785A UV偵測器及Sedex 75蒸發光散射偵測器之PE-Sciex API 100 或150質譜儀上進行LC-MS分析。在室溫下以1.5毫升/分鐘溶離Waters Xterra 3.0 mm×50 mm 5 μ C-18二氧化矽管柱。該管柱用5% MeCN/0.1% TFA/H2 O平衡且用5% MeCN/0.1% TFA/H2 O溶離1.0分鐘，且接著用7分鐘內至90% MeCN/0.1% TFA/H2 O之線性梯度溶離。藉由在214 nm下之UV偵測及蒸發光散射進行偵測。將管柱溶離液之溶離份引入PE-Sciex API 100質譜儀之離子噴霧界面中。在操作期間每2秒掃描質量範圍300-2000 amu。
蛋白質定量：藉由使用NanoDrop ND-1000 UV-光譜光度計在280 nm下量測吸光度來評估蛋白質濃度。確定衍生化位點之酶催化肽定位：利用Asp-N消化還原及烷基化之蛋白質來進行肽定位。首先，根據標準程序用DTT及碘乙醯胺處理蛋白質。使用HPLC純化烷基化產物。隨後，用內切蛋白酶Asp-N(Boehringer)以1:100之酶：受質比率消化烷基化之經純化產物隔夜。使用C-18管柱及標準TFA/MeCN緩衝系統對消化物進行HPLC分離。將所得肽圖與未衍生化之hGH的肽圖進行比較，且收集滯留時間不同之溶離份且使用Maldi-tof質譜進一步分析。
SDS page：使用NuPAGE 4%-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen NP0321BOX)進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。對凝膠進行銀染色(Invitrogen LC6100)或庫馬斯(Coomassie)染色(Invitrogen LC6065)，且相關時亦如M. M. Kurfurst,Anal. Biochem . 200(2),244-248,(1992)所述用碘化鋇對PEG進行染色。蛋白質層析：在kta Explorer層析系統及管柱(來自GE Health Care)上進行蛋白質層析。使用Q-瓊脂糖HP 26/10管柱進行陰離子交換。起始緩衝液為20 mM三乙醇胺緩衝液(pH 8.5)，且溶離緩衝液為起始緩衝液+0.2 M NaCl。典型地用15管柱體積內0%-75%溶離緩衝液之梯度溶離化合物。使用HiPrep 26/10管柱進行去鹽及緩衝液交換。
TNBS測試 製備10% DIPEA於DMF中之溶液(溶液1)及1 M TNBS水溶液(溶液2)。將數個樹脂珠粒置放於小試管中，且添加1-3滴各溶液(1及2)。在短暫混合後，將混合物靜置於室溫下10分鐘，且檢查珠粒。強橙色或紅色珠粒指示陽性結果(亦即存在自由胺)；黃色或微橙色珠粒指示微陽性，且無色珠粒為陰性。
LogP計算 可使用公開之算法(J. Am. Chem. Soc, 86,5175-5180,(1964)「A New Substituent Constant,,Derived from Partition Coefficients」；C. A. Lipinski等人,Advanced Drug Delivery Reviews ,23,3-25(1997),「Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings」；及I. Moriguchi,S. Hirono,I. Nakagome,H. Hirano,Chem. and Pharm. Bull., 42,976-978,(1994)「Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods」)將白蛋白結合劑部分及/或親水性間隔基部分之LogP值計算為mLogP及/或cLogP。本文中用Tripos(http://www.tripos.com)clogP算法版本4.2之Sybyl 7.0以及如由BioByte公司所提供之其相關片段資料庫版本22(http://www.biobyte.com/)計算clogP(亦即珀瑪納學院logP(Pomona College logP))(辛醇/水分配係數)。
製備白蛋白結合劑實施例14-(1H-四唑-16-基-十六醯基胺磺醯基)丁醯基-OEG-γGlu-γGlu-OEG-N ε (C(O)CH 2 Br)Lys-OH(I)：
根據流程1利用ABI433合成器使用標準Fmoc-肽化學以1 mM規模於固體支撐物上合成化合物(I)。使用經Fmoc-OEG-OH及Fmoc-Glu-OtBu保護之胺基酸將肽組裝於Fmoc-Lys(MTT)-王樹脂(Wang resin)上。4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)使用2當量含DIC/NHS之DCM/NMP手動偶合4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)丁酸隔夜，TNBS測試展示反應完成。接著用50 mL DCM/TFA/TIS/水(94:2:2:2)以流過配置處理樹脂直至黃色消失為止(約20分鐘)，繼而用DIPEA/DMF洗滌及中和。用NHS與DIC之1 mM混合物活化DCM/NMP(1:1)中之溴乙酸(4 mM)，過濾且在再添加1 mM DIPEA下添加至樹脂中。1小時後，反應完成。用80 mL TFA/TIS//水(95:2.5:2.5)處理樹脂1小時。與N2 流一起蒸發，藉由添加Et2 O進行沈澱且用Et2 O洗滌且乾燥。以製備型HPLC(2次操作)用30%-80% 0.1 TFA/MeCN對0.1% TFA水溶液之梯度純化粗產物。收集溶離份且與約50% MeCN一起凍乾，得到化合物(I)。TOF-MS:質量1272.52(M+1)。
流程1
實施例2 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS:質量536.52(M+1)。實施例3 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量810.80(M+1)。實施例4 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量844.84(M+1)實施例5 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1151.27(M+1)。實施例6 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1272.30(M+1)。實施例7 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量984.01(M+1)實施例8 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量882.95(M+1)。實施例9 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量782.74(M+1)。實施例10 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1127.14(M+1)。實施例11 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH、碘乙酸及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1174.14(M+1)。實施例12 以與上述實施例1中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH、氯乙酸及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1061.89(M+1)。實施例13(19-羧基十九醯基)-Thx-γGlu-Glu-N-{3-[2-(2-{3-[3-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基]丙氧基}乙氧基)乙氧基]丙基}醯 胺(II)
使2-氯三苯甲基樹脂(2.0 g，2.6 mmol)在DCM中膨脹0.5小時。添加4,7,10-三氧雜-1,13-二胺於DCM中之溶液(30 mL)。在室溫下攪拌樹脂1小時。用DCM洗滌樹脂一次，接著添加DIPEA:MeOH:DCM(15 mL:15 mL:20 mL)溶液。振盪樹脂0.5小時，接著用DCM洗滌兩次。接著如下藉由標準肽化學使Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu-OtBu及FmocThexOH依序偶合：混合各Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt於NMP中之0.5 M溶液(11.7 mL)且在2分鐘後，添加至樹脂中。在室溫下振盪樹脂45分鐘，且接著用5×NMP及5×DCM洗滌。添加Ac2 O/DIPEA/NMP(1:1:5)溶液且在室溫下攪拌樹脂10分鐘。洗滌(5×NMP及5×DCM)樹脂。接著用含30%哌啶之NMP處理樹脂2×10分鐘，且最終用5×NMP及5×DCM洗滌。接著將肽添加至含有0.125 M HOAt(3當量)、0.125 M DIC(3當量)及0.125 M二甲基吡啶(3當量)之0.25 M二十烷二酸(6當量)溶液中。在室溫下振盪樹脂2小時，繼而用5×NMP及8×DCM洗滌。使用10%TFA-DCM使產物自樹脂裂解20分鐘。濾出樹脂且再用10%TFA-DCM處理一次，歷時20分鐘。收集合併之濾液，且蒸發至乾燥。
將上述乾燥產物溶解於DMF(6 mL)中，且添加經TSTU活化之3-順丁烯二醯亞胺基丙酸(藉由使TSTU與3-順丁烯二醯亞胺基丙酸在DMF(2 mL)中反應45分鐘預先製備)及DIPEA(200 μL)。在室溫下攪拌混合物1小時。將反應混合物蒸發至乾燥且將殘餘物溶解於95% TFA-MilliQ水中，且在室溫下攪拌20分鐘。將混合物蒸發至乾燥。向殘餘物中添加最少量水以使固體沈澱。濾出沈澱物且使其自MeCN中再結晶。收集晶體且用Et2 O充分洗滌，得到呈白色固體狀之化合物(II)。
TOF-MS：質量1094.39(M+1)。
實施例14
以與上述實施例1中所述及下文流程2中所述類似之方式，使用Boc-Gly-PAM樹脂作為起始物質以及單第三丁基-二十烷酸、4-Boc-胺基苯甲酸、Fmoc-Thx-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t -Bu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-t -Bu保護之胺基酸來製備以下化合物。適度脫除保護基後，使用2,2-二甲氧基乙胺使肽產物自樹脂裂解，繼而使用TFA去乙醯化，得到白蛋白結合劑(IV)。
TOF-MS：質量1128.38。
流程2：
實施例15 以與上述實施例14中所述類似之方式，使用Boc-Gly-PAM樹脂作為起始物質以及單第三丁基-二十烷酸、4-Boc-胺基苯甲酸、Fmoc-Thx-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t -Bu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-t -Bu保護之胺基酸來製備以下化合物。適度脫除保護基後，使用2,2-二甲氧基乙胺使肽產物自樹脂裂解，繼而使用TFA去乙醯化，得到白蛋白結合劑(V)。
TOF-MS: Rt=15.2分鐘，質量=967.11。
實施例16 以與上述實施例14中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-王樹脂作為起始物質以及單第三丁基-十八烷二酸、Boc-Ser(t -Bu)-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t -Bu)-OH及氧化Fmoc-Cys-OH保護之胺基酸來製備化合物(VI)。使用含2.5% TIS、2.5% H2 O之THF歷時3小時使肽產物自樹脂裂解且藉由製備型HPLC純化：管柱：2 cm C18溶離劑A：0.1% TFA i Milli-Q水溶離劑B：0.1% TFA i MeCN起始%B：40%最終%B：75%梯度：5分鐘，用10% MeCN維持5-10分鐘，經51分鐘至起始%B，5分鐘，最終為%B+10% MeCN維持約1小時藉由LC-MS-TOF分析溶離份。收集所需溶離份，彙集且凍乾，得到化合物(VI)。
TOF-MS: Rt=6.3分鐘，質量=955.1。
(VI)之氧化： MTP溶液：將3-甲基-硫代-1-丙醇(290 mg)溶解於4 mL 25 mM HEPES(pH=7.00)中。高碘酸鹽溶液：將96 mg NaIO4 溶解於2 mL Milli-Q水中。向化合物(VI)於Milli-Q水(1 mL)中之溶液中添加MTP溶液(3.6 mL)+高碘酸鹽溶液(560 μL)，且用1滴1 N NaOH將pH值調節至9.5。用錫箔覆蓋反應燒瓶且在室溫下攪拌1小時。再添加一份高碘酸鹽溶液(560 μL)且將反應混合物在環境溫度下靜置4.5小時。使所得混合物穿過兩個NAP管柱以除去NaIO4 。用25 mM HEPES(5×2.5 mL)(pH=7.0)預洗滌管柱。將樣品(2.5 mL)施加於各管柱上且用3.5 mL 25 mM HEPES(pH=7.00)溶離。彙集2×3.5 mL，總共10.5 mL含有酮基-醛(VII)，其直接用於與GH類似物接合。
TOF-MS：質量=924.08。實施例174-(1H-四唑-16-基-十六醯基胺磺醯基)丁醯基-OEG-γGlu-γGlu-OEG- (4-胺基苯甲醯基)Lys-NH 2 (VIII)：
根據流程3在固體支撐物上合成化合物(VIII)。稱取經Fmoc保護之Rink-醯胺-樹脂(2.2 g，0.6 mMol/g)放入燒瓶中。用NMP(3×30 mL)使樹脂膨脹2小時。將樹脂與含25%哌啶之NMP(30 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌啶之NMP(30 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×30 mL)洗滌。稱取Fmoc-Lys(Mtt)-OH及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍(bromo phenol blue)之NMP(30 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至上述排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物21小時。排乾樹脂且用NMP(6×30 mL)洗滌，繼而用DCM(3×30 mL)洗滌。用六氟異丙醇(20 mL)處理樹脂10分鐘。振盪10分鐘。排乾樹脂且用DCM(3×30 mL)洗滌。再用六氟異丙醇(20 mL)處理樹脂10分鐘且振盪10分鐘。排乾樹脂且用DCM(3×30 mL)洗滌，繼而排乾且用NMP(3×30 mL)洗滌。稱取4-(Boc-胺基)苯甲酸及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍之NMP(30 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至上述排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物。排乾樹脂且用NMP(6×30 mL)洗滌。將樹脂與含25%哌啶之NMP(10 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌啶之NMP(10 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×15 mL)洗滌。稱取Fmoc-OEG-OH及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍之NMP(15 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物23小時。排乾樹脂且用NMP(6×15 mL)洗滌。將樹脂與含25%哌啶之NMP(10 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌。啶之NMP(10 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×15 mL)洗滌。稱取Fmoc-Glu-O-t -Bu及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍之NMP(15 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物18小時。排乾樹脂且用NMP(6×15 mL)洗滌。將樹脂與含25%哌啶之NMP(10 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌啶之NMP(10 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×15 mL)洗滌。稱取Fmoc-Glu-O-t -Bu及HOBt放入燒瓶中，溶解於15 mL含0.5 mM溴酚藍之NMP中。將此溶液添加至排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物18小時。排乾樹脂且用NMP(6×15 mL)洗滌。將樹脂與含25%哌啶之NMP(10 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌啶之NMP(10 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×15 mL)洗滌。稱取Fmoc-OEG-OH及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍之NMP(15 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物。排乾樹脂且用NMP(6×15 mL)洗滌。將樹脂與含25%哌啶之NMP(10 mL)一起振盪10分鐘。排乾樹脂且用含25%哌啶之NMP(10 mL)處理1小時，繼而排乾且用NMP(6×15mL)洗滌。
稱取4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)丁酸及HOBt放入燒瓶中，溶解於含溴酚藍之NMP(15 mL，0.5 mM)中。將此溶液添加至排乾之樹脂中，繼而添加DIC。在環境溫度下振盪反應物21小時。排乾樹脂且用NMP(6×15 mL)洗滌，繼而排乾且用DCM(6×15 mL)洗滌。用95% TFA水溶液(10 mL)+DCM(0.25 mL)及TIS(0.25 mL)之混合物裂解樹脂。在環境溫度下振盪樹脂2小時且過濾至冰冷Et2 O(75 mL)中。藉由離心分離所得沈澱物，繼而用Et2 O(3×)洗滌，且在真空中乾燥48小時，得到300 mg粗化合物(VIII)。
以製備型HPLC(GILSON)(30%->80% MeCN)純化粗化合物(VIII)。將彙集之溶離份蒸發至乾燥且將殘餘物溶解於H2 O/MeCN(1:1)中且冷凍乾燥隔夜，得到170 mg化合物(VIII)。TOF-MS: Rt=4.7分鐘，質量1268.71。
流程3
實施例18 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1124.33。實施例19 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1333.64。實施例20 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1320.67。實施例21 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量2114.64。實施例22 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1534.82。實施例23 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量823.05。實施例24 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量980.22。實施例25 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量851.10。實施例26 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1258.51。實施例27 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及王樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1269.49。實施例28 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量841.04。
實施例29
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量863.07。實施例30 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量855.07。實施例31 以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量883.12。
實施例32
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1123.35。
實施例33
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：Rt=4.7分鐘，質量1267.45。
實施例34
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1310.67。
實施例35
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1308.58。
實施例36
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Glu(ODmab)-OH及2-氯三苯甲基氯樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1235.56。
實施例37
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Glu(ODmab)-OH及2-氯三苯甲基氯樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量1173.40。
實施例38
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量703.93。
實施例39
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH及Rink醯胺樹脂製備以下化合物。
TOF-MS：質量689.90。
實施例40
以與上述實施例17中所述類似之方式，使用FMOC-Glu(ODmab)-OH及2-氯三苯甲基氯樹脂製備以下化合物。
TOF-MS:　質量1182.34。
實施例4117-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-胺基戊基胺甲醯基)甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)-甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]-十七烷酸：
將N-第三丁氧基羰基屍胺(24.3 mg；0.12 mmol)添加至17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙基胺甲醯基}甲氧基)乙氧基]乙基胺甲醯基}丙基胺甲醯基)-十七烷酸(100 mg；0.12 mmol)及DIPEA(46.68 mg；0.36 mmol)於THF(2.0 ml)中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜，且接著在真空中濃縮。將殘餘物溶解於水(5 ml)與THF(2 ml)之混合物中，且藉由製備型HPLC(RP18管柱)純化。彙集含有經Boc保護之偶合產物之溶離份且進行乾燥。將殘餘物溶解於50% TFA-DCM(4 ml)中且在室溫下攪拌1小時，接著在真空中濃縮，得到54 mg(55%)呈三氟乙酸鹽形式之標題物質。TOF-MS：質量815.5。
製備GH白蛋白結合劑化合物：
實施例42
使用轉麩醯胺酸酶將柄狀物連接至GH先前已描述於WO2005/070468中，且根據本發明可用於連接白蛋白結合劑。所用TGase為根據US5156956來自茂原輪枝鏈黴菌之微生物轉麩醯胺酸酶。一般方法描述於上述章節化學反應I中。
1.轉胺基及氧化之GH化合物(I)與白蛋白結合劑(II)之偶合
製備以下溶液：緩衝液A：將三乙醇胺(119 mg，0.8 mmol)溶解於水(40 mL)中，且pH值調節至8.5。
(A)hGH(III)與1,3-二胺基-2-丙醇之轉胺基反應
在下一步驟中，向轉胺基之GH(III)中添加高碘酸鹽。典型地在低溫(諸如4℃至10℃)下視情況在黑暗中經30分鐘進行氧化。高碘酸鹽可將GH中之甲硫胺酸殘基氧化成其相應甲硫胺酸亞碸殘基。為使此氧化風險降至最低，可在高碘酸鹽氧化期間添加小分子有機硫醚。適合有機硫醚為3-甲基硫代丙-1-醇，但熟習此項技術者將能夠提出其他有機硫醚。
轉胺基之GH化合物(IV)的氧化：
可進行緩衝液更換以獲得有效氰基硼氫化鈉還原所需之酸性溶液。典型地使用過量A-W-B1-NH2胺，且可隨時間添加較小份氰基硼氫化鈉。
製備以下溶液：緩衝液A：將三乙醇胺(119 mg，0.8 mmol)溶解於水(40 mL)中，且pH值調節至8.5。
緩衝液B：將3-甲基硫代丙醇(725 mg，7.1 mmol)溶解於緩衝液A(10 mL)中。
緩衝液C：將HEPES(5.96 g)溶解於水(1.0 L)中且pH值調節至7.0。
高碘酸鹽：NaIO4 (48.1 mg，0.225 mmol)溶解於水(1.0 mL)中。
向(IV)(10 mg，0.5 μmol)之溶液中添加緩衝液B(0.2 mL)，繼而添加高碘酸鹽溶液(0.03 mL)。冷培育20分鐘後，用緩衝液C透析混合物4次。將殘餘物濃縮至1 mL。
(C)(I)與白蛋白結合劑(II)之還原胺化反應
可使用如實施例17至40中所述之白蛋白結合劑(II)。
將來自(B)之最終溶液(1 mL，10 mg，0.45 μmol(I))與白蛋白結合劑(II)溶液(2 mL，10 mg，0.3 μmol)在25 mM HEPES緩衝液(pH 7.0)中混合且在室溫下緩慢旋轉所得混合物1小時。1小時後，逐份添加NaCNBH3 (NaCNBH3 (20 mg)於水(0.5 mL)中之100 μL溶液)。混合物在黑暗中保持於室溫下18至24小時。
可如下進行後一反應：將氧化之轉胺基GH溶液添加至白蛋白結合劑連接子於AcOH(1.5 mL)與50 mM MES(0.5 mL)之混合物中的溶液(pH 6.00)中。在室溫下溫和振盪所得反應混合物30分鐘，此時添加NaCNBH3 溶液(15 μL，22 mg NaCNBH3 溶解於500 μL Milli-Q水+AcOH(15 μL)中)。用錫箔覆蓋樣品且在室溫下攪拌隔夜。
可如下藉由陰離子交換層析分離接合物：藉由使用Amicon Ultra15裝置(Ultracel 10K管)以4000轉/分鐘離心3次每次8分鐘將緩衝液更換為純水(3×)來移除乙酸。接著使用Amicon過濾器裝置將混合物緩衝液更換為20 mM TEA(pH 8.50)，且用20 mM TEA稀釋至50 mL之最終體積，之後將其裝載於HiLoad Q瓊脂糖26/10管柱上。最初用20 mM TEA(pH 8.50，緩衝液A)洗滌管柱，且接著用20 mM TEA、500 mM NaCl(pH 8.50，緩衝液B)，使用20 CV內0%至100%(B)梯度以2毫升/分鐘之流速溶離。使用Amicon Ultra15裝置(Ultracel 10K管)以4000轉/分鐘離心3次每次8分鐘將彙集之溶離份緩衝液更換為含10 mM碳酸氫銨緩衝液之純水5次。
使用來自實施例18之白蛋白結合劑將得到以下化合物。
42.1
TOF-MS：質量23301.63。
使用來自實施例41之白蛋白結合劑製備以下化合物。
42.2
TOF-MS：質量23727.6245。
向hGH(1 mg，45 nmol)及17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-胺基戊基胺甲醯基)甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]十七烷酸(2.10 mg；2250 nmol)於20 mM三乙醇胺(1000 μL；pH 8.5)中之溶液中添加TGase(0.12 nmol；茂原輪枝鏈黴菌)。在25℃下培育反應混合物146小時，此後獲得上式之雙重衍生化之hGH類似物。
實施例43
1.GH化合物(I)N-端與白蛋白結合劑(IV)之偶合(A)(I)與白蛋白結合劑醛(IV)之還原性烷基化反應
如上所示之衍生化方法利用白蛋白結合連接子A-W-B，其中B具有末端醛官能基。經由還原性烷基化進行hGH與A-W-B-CHO之接合(hGH→VI)。還原性烷基化在本文中例示且在此項技術中為公認的，且產生在N-端位置經修飾之hGH化合物。
如實施例14中所述獲得白蛋白結合劑(IV)。
合成：2-(C20 二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-甘胺醯胺)-乙基-Nα1 -hGH[Q84C、Y143C]
43.0
將hGH[Q84C、Y143C](23 mg)溶解於Hepes緩衝液(2.3 mL，0.25 mM，pH 7.0)中。用TFA(50 μL)處理C20 二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-Gly-二甲基縮醛(2 mg，參見上述實施例14)6分鐘，且在真空中蒸發至乾燥。用EtOH(200 μL)汽提殘餘物且在真空中蒸發至乾燥。將殘餘物溶解於DMF(100 μL)中且添加至hGH溶液中。形成沈澱物且藉由添加DMF(1 mL)再溶解。1小時後，逐份添加NaCNBH3 (20 mg，於0.5 mL MeCN中(230 μl))溶液且靜置20小時。藉由添加AcOH(2 mL)淬滅反應且用水稀釋至20 mL之總體積，且以製備型HPLC用C18管柱及40%-80%含0.1% TFA之MeCN對0.1% TFA水溶液的梯度純化。收集最後溶離之峰，用水自70% MeCN稀釋至10%且凍乾，得到4.51 mg 2-(C20 二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-甘胺醯胺)-乙基-Nα1 -hGH[Q84C、Y143C]。
TOF-MS: Rt=15.25分鐘，質量=23150。
以與上文所述類似之方式，使用來自實施例16之白蛋白結合劑製備以下化合物。
43.1
TOF-MS: Rt=15.2分鐘，質量=23033。
以與上文所述類似之方式，使用來自實施例15之白蛋白結合劑製備以下化合物。
43.2
TOF-MS: Rt=15分鐘，質量=22989.1。
實施例44
1.具有內部自由單一cys之GH化合物(VII)與白蛋白結合劑(VIII)之偶合
1)經由用適合選擇性還原劑還原二硫醚(VI)來釋放自由Cys GH(VII)；
2)用鹵素活化之白蛋白結合劑(VIII)對自由Cys GH(VII)進行烷基化，得到Cys接合型GH化合物(IX)
44.1
2-(C20 二酸-Trx-γGlu-OEG-OEG-δLys)-羰基亞甲基-S101 -hGH[L101C]
製備hGH[L101C](VII)：
如上文獲得之hGH[L101C]具有其自由半胱胺酸經麩胱甘肽及胱胺阻斷之部分。使用麩氧還原蛋白II(glutaredoxin II，Grx2)在含有GSH及GSSG之平衡緩衝液中酶催化地進行去阻斷。藉由在葡聚糖凝膠G25管柱上進行緩衝液交換將去阻斷之hGH[L101C]與低分子量GSH/GSSG分離。
白蛋白結合劑(VIII)與hGH[L101C](VII)之接合：
將來自實施例5之白蛋白結合劑(78 mg，5當量)溶解於170 mL含5%羥丙基-β-環糊精之HEPES/EDTA緩衝液中且添加MTP(2.1 mL，1%)及0.5 M NaCl(6.34 g)。向此混合物中添加濃縮之hGH[L101C](1當量，46 mL)且混合物在室溫下靜置隔夜。隔夜後溶液變得渾濁。由於HPLC指示有未反應之起始物質，所以再添加溶解於最少量NMP中之5當量來自實施例5之白蛋白結合劑。在室溫下再攪拌所得混合物16小時。
純化：
所用緩衝液：
緩衝液A：
20 mM三乙醇胺(TEA)+10%乙二醇
5.96 g三乙醇胺
200 ml乙二醇
添加MQ水至21
用1 N HCl將pH值調節至8.5
緩衝液B：
20 mM三乙醇胺(TEA)+1.0 M NaCl+10%乙二醇
5.96 g三乙醇胺
116.88 g NaCl
200 ml乙二醇
添加MQ水至21
用1 N HCl將pH值調節至8.5
在葡聚糖凝膠管柱上經3次操作將反應緩衝液更換為含乙二醇之TEA-緩衝液A：
管柱：50/30葡聚糖凝膠G25 fine
緩衝液A：
流速：10毫升/分鐘
溫度：室溫(在12℃下收集溶離份)
溶離份：每份溶離份30 mL
收集所需溶離份，彙集且接著用Q瓊脂糖管柱純化：
管柱：26/10 Q瓊脂糖HP
緩衝液A：
緩衝液B：
梯度1：0%-10%緩衝液B，1 CV；
梯度2：10%至40%緩衝液B，20 CV；
梯度3：40%-100%緩衝液B，1 CV；
流速：8毫升/分鐘
溫度：室溫(在室溫下收集溶離份)
溶離份：每份溶離份5 mL
收集所需溶離份，彙集且在葡聚糖凝膠G25管柱上緩衝液交換成10 mM碳酸氫銨(pH 8.0)：
管柱：50/30葡聚糖凝膠G25 fine
緩衝液A：10 mM碳酸氫銨(pH 8.0)
流速：10毫升/分鐘
溫度：室溫(在12℃下收集溶離份)
溶離份：每份溶離份30 mL
彙集五份溶離份且冷凍乾燥。
藉由MS分析彙集物且觀測到大量二聚體(MS 44491.7)。
將冷凍乾燥之小瓶溶解於緩衝液A中且再在新Q瓊脂糖管柱上純化：
管柱：26/10 Q瓊脂糖HP
緩衝液A：
緩衝液B：
梯度1：0%-10%緩衝液B，1 CV
梯度2：10%至40%緩衝液B，20 CV
梯度3：40%-100%緩衝液B，1 CV
流速：8毫升/分鐘
溫度：室溫(在室溫下收集溶離份)
溶離份：每份溶離份5 mL
彙集溶離份且藉由超濾脫鹽/緩衝液交換成10 mM碳酸氫銨。將彙集物濃縮至25 mL且藉由RP-HPLC及MS-TOF定量：
TOF-MS: Rt=16.15分鐘，質量=23315.96。
使用相同方法製備以下化合物。
44.2
TOF-MS: Rt=15.24分鐘，質量=22676.8。
44.3
TOF-MS: Rt=10.5分鐘，質量=22975.1。
44.4
TOF-MS: Rt=15.5分鐘，質量=23009。
44.5
TOF-MS: Rt=14.0 分鐘，質量=23305.5。
44.6
TOF-MS: Rt=15.27分鐘，質量=23148。
44.7
TOF-MS: Rt=16.40分鐘，質量=23048。
44.8
TOF-MS: Rt=15.3分鐘，質量=22884.4。
44.9
TOF-MS: Rt=14.6分鐘，質量=23291.4。
44.10
TOF-MS: Rt=15.05分鐘，質量=23097.76。
44.11
TOF-MS: Rt=14.2分鐘，質量=23420.83。
44.12
TOF-MS: Rt=15.7分鐘，質量=23289.6。
44.13
TOF-MS: Rt=17.0分鐘，質量=23324.55。
44.15
TOF-MS: Rt=12.85分鐘，質量=23337.5。
44.16
TOF-MS: Rt=15,24分鐘，質量=22676.8。
實施例45
1.具有內部自由單一cys之GH化合物(VII)與白蛋白結合劑(X)之偶合
1)用經順丁烯二醯亞胺取代之白蛋白結合劑(X)對自由Cys GH(VII)進行烷基化，得到Cys接合型GH化合物(XI)
可使如上文在實施例44中所獲得之Cys脫除保護基之GH化合物(VII)與經順丁烯二醯亞胺取代之白蛋白結合劑連接子(X)反應，得到GH接合物A-W-B1-NHC(O)CH2 CH2 -吡咯啶-2,5-二酮-3-hGH(XI)，其中B1係如上述化學反應IV中所述定義。
經順丁烯二醯亞胺官能化之白蛋白結合劑(X)與hGHL101C之接合
步驟(a)半胱胺酸殘基之去阻斷
使用麩氧還原蛋白II(Grx2)在含有GSH及GSSG之平衡緩衝液中將Cys經麩胱甘肽/半胱胺阻斷之hGH(VI)酶催化地去阻斷。在葡聚糖凝膠G25管柱上藉由緩衝液交換將Cys去阻斷之hGH(VII)與低分子GSH/GSSG分離。
步驟(b)偶合至經順丁烯二醯亞胺官能化之白蛋白結合劑(X)
將經順丁烯二醯亞胺官能化之白蛋白結合劑(X)溶解於含有5%羥丙基-β-環糊精之緩衝液中。接著將溶液添加至Cys去阻斷之hGH(VII)中且在室溫下反應隔夜。
接合後，在Q瓊脂糖HiLoad管柱上於含有10%乙二醇之20 mM三乙醇胺緩衝液(pH 8.5)中使用氯化鈉之梯度純化接合之蛋白質。彙集收集之溶離份且使用G25管柱轉移至10 mM碳酸氫銨中且凍乾。
45.1
TOF-MS: Rt=16.0分鐘，質量=23352。
45.2
TOF-MS: Rt=15.98分鐘，質量=23338。
45.3
TOF-MS: Rt=16.62分鐘，質量=23324.6。
45.4
TOF-MS: Rt=16.20分鐘，質量=23339.7。
45.5
TOF-MS: Rt=15.72分鐘，質量=23316.35。
45.7
TOF-MS: Rt=17.2分鐘，質量=23365.9。
45.8
TOF-MS: Rt=17.2分鐘，質量=23366。
45.9
TOF-MS: Rt=16.5分鐘鐘，質量=23366。
45.10
TOF-MS: Rt=16.8分鐘鐘，質量=23323.8。
45.11
TOF-MS: Rt=17.1分鐘，質量=23382。
45.12
TOF-MS: Rt=17.2分鐘，質量=23338.8。
45.13
TOF-MS: Rt=17分鐘鐘，質量=23353.9。
45.14
TOF-MS: Rt=15.65分鐘，質量=23323.7。
45.15
TOF-MS: Rt=16.5分鐘，質量=23365.8。
45.16
TOF-MS: Rt=17.2分鐘，質量=23365.9。
實施例46
檢定(I)測定生長激素活性之BAF-3GHR檢定
BAF-3細胞(來源於骨髓之鼠類原B淋巴樣細胞系)的生長及存活最初具有IL-3依賴性。IL-3活化JAK-2及STAT，後兩者與在刺激時活化GH之介體相同。在轉染人類生長激素受體後，細胞系變成生長激素依賴性細胞系。此純系可用於評估不同生長激素樣品對BAF-3GHR之存活的影響。
將BAF-3GHR細胞在饑餓培養基(無生長激素之培養基)中於37℃、5% CO2 下培養24小時。
洗滌細胞且再懸浮於饑餓培養基中且接種於培養板中。將10 μL不同濃度之生長激素化合物或人類生長激素或對照物添加至細胞中，且在37℃、5% CO2 下培育培養板68小時。
將AlamarBlue添加至各孔中，且接著再培育細胞4小時。AlamarBlue為氧化還原指示劑，且由細胞代謝固有之反應還原，且因此提供對活細胞數目之間接量度。
最終，在螢光板讀取器中量測細胞之代謝活性。樣品之吸光度表示為未受生長激素化合物或對照物刺激之細胞的百分比，且可自濃度-反應曲線計算出活性(刺激50%細胞之化合物的量)。
化合物45.4在BAF-3 hGH受體檢定中之試管內效能展示於下表1中。
如一般方法中所述藉由將化合物與胰凝乳酶或彈性蛋白酶一起培育4小時來測定化合物45.5之蛋白酶穩定性。量測完整GH化合物之百分比且結果包括於表1中。
實施例47
藥物動力學
利用雄性史泊格多利大鼠在靜脈內(i.v.)及皮下(s.c.)單次劑量投藥後研究實施例化合物之藥物動力學。
測試化合物在由以下組成之稀釋緩衝液中稀釋至1 mg/mL之最終濃度：甘胺酸20 mg/mL、甘露糖醇2 mg/mL、NaHCO3 2.5 mg/mL(pH值調節至8.2)。
利用體重為250 g之雄性史泊格多利大鼠研究測試化合物。以每公斤體重60 nmol之劑量用25 G針藉由在尾靜脈中靜脈內或在頸中皮下單次注射投予測試化合物。
對於各測試化合物，根據表2中提供之以下時程進行血液取樣。
在各取樣時間，使用25 G針自尾靜脈抽出0.25 ml血液。將血液取樣至塗有EDTA之試管中，且儲存於冰上直至以1200×G在4℃下離心10分鐘。將血漿轉移至Micronic管中且儲存於-20℃下直至進行分析。
藉由夾心ELISA使用天竺鼠抗hGH多株抗體作為捕捉劑，且使用經生物素標記之hGH結合蛋白(人類GH受體之可溶性部分)作為偵測劑來測定測試化合物濃度。檢定之偵測極限為0.2 nM。
使用WinNonlin Professional(Pharsight公司,Mountain View,CA,USA)對各測試化合物之平均濃度-時間曲線進行非隔室藥物動力學分析。計算終末半衰期()及平均滯留時間(MRT)之藥物動力學參數估算值。
實施例45.4之生體可用率經估算為48.3%。在皮下投予後達到最大血漿濃度之時間(t max)為8.0小時。在靜脈內及皮下投予後，Cmax分別為1670 nM及151 nM。在靜脈內投予後在時間零時之外推血漿濃度為1710 nM。
實施例48
如上文所述測定一系列化合物之試管內效能及半衰期。化合物之接合物相同，但經由藉由如表4中所述之突變引入之替代半胱胺酸連接。
實施例49
垂體經切除之史泊格多利大鼠中的活體內劑量-反應研究
利用垂體經切除之雄性史泊格多利大鼠研究活體內劑量-反應關係。垂體經切除之大鼠為熟知及公認的生長激素缺乏之動物模型，其中在手術移除垂體腺後不產生生長激素。此亦導致低循環含量之胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，胰島素樣生長因子-1為人類生長激素缺乏之另一重要臨床特徵。
對體重為90至100 g之4週齡雄性大鼠進行垂體切除術。手術後3至4週體重為100至110 g之動物進入研究。在手術後3至4週期間體重增加10%以上的動物不允許進入研究。
使用每隻大鼠1至150 nmol化合物45.4之五種劑量進行劑量反應研究。
在所有給藥組中，垂體經切除之史泊格多利大鼠的血漿IGF-1之基線含量為約80至100 ng/mL。單次給藥後，在第1天，IGF-1含量快速升高至800至1000 ng/mL，幾乎與劑量無關。在隨後幾天中血漿IGF-1含量再以劑量依賴性方式下降，其中在最低劑量下觀測到最快下降，且在最高劑量下觀測到最慢下降。在最高劑量下，IGF-1血漿含量在開始較快速下降之前維持於800至900 ng/mL歷時3天。第3天前所有給藥組之IGF-1血漿濃度含量相較於媒劑對照組較高。對於給藥組10 nmol、50 nmol及150 nmol，其在整個研究(7天)期間皆較高。
實施例50
消失
假定吸收速率與分子通過皮下毛細血管之緊密連接的能力(與分子大小相關之性質)相關。具有40 kDa PEG之PEG-hGH具有150至250 kDa之表觀分子量(mw)。具有共價結合之白蛋白之hGH分子具有mw=87 kDa，而具有非共價結合之白蛋白的hGH分子將耗費一部分時間與白蛋白解離且因此具有mw=22 kDa。解離狀態所耗費之時間將取決於白蛋白結合部分之親和力。因此，該等化合物之吸收速率應快於PEG-hGH之吸收速率，且吸收速率應隨著使用對白蛋白具有較低親和力之白蛋白結合部分而增加。
在由以下組成之標準緩衝液中稀釋測試溶液：甘胺酸20 mg/mL、甘露糖醇2 mg/mL、NaHCO3 2.4 mg/mL(pH值調節至8.2)。
由Chemistry & Isotope Lab. Novo Nordisk A/S用125 I進行碘化。最終放射性調配物具有3 μCi/mL之比放射活性且於3 mL筆式注射劑(Penfill)中供應。
使用前溶液儲存於2℃至8℃下。
利用5隻雜交LYD雌性豬量測所選化合物之消失速率。對豬進行稱重、禁食且配給專門「豬外套(pig coat)」以攜帶γ計數器及發射器且在開始研究前置於單個畜圈中。
所有豬在研究前禁食18小時。
用具有固定黑色針頭限制器(needle stopper)之Novopen3及NovoFine28G針分別在頸部左側及右側對動物進行皮下給藥(60 nmol)。注射深度為5 mm。
藉由攜帶型裝備量測放射性儲積物的消失率約24至48小時。
對於各個別動物，結果呈示為AUC(0至45小時)，如表5中所示。
如上文所述測定一系列化合物之試管內效能、半衰期及其他特徵且展示於表5中。
實施例51
豬之活體內研究
為進一步證實本發明hGH白蛋白接合物之功能性，選擇三種化合物用於在豬中進行其他藥物動力學研究。藉由在移除MAEA純化標籤後將白蛋白結合劑接合至hGH變異體來製備相當於化合物44.1、44.5及44.6之化合物。
在標準緩衝液(20mg/ml甘胺酸、2mg/ml甘露糖醇、2.4mg/ml NaHCO3 ，pH值調節至8.2)中將測試化合物稀釋至100nmol/mL之最終濃度。在研究中使用二十四隻體重為9至12kg之5月齡雄性格廷根小種豬(Gottingen minipig)。對8隻動物給予各測試化合物，其中四隻小種豬接受靜脈內快速注射投藥且四隻動物接受皮下投藥。靜脈內注射經由24G Venflon給予耳朵中。以快速注射形式經最多5秒給予劑量，繼而給予2ml 0.9% NaCl。在頸部右側距耳朵約5至7cm及距頸部中間7至9cm處給予皮下注射。各動物接受10nmol/kg測試化合物之單次劑量。在以下時間點自各動物收集血液樣品：給藥前、注射後第0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、18、24、48、72、96、120、168、240及336小時。自各血液樣品分離血漿且在分析測試化合物之前儲存於-20℃下。藉由非隔室藥物動力學方法分析血漿濃度-時間資料。
表6展示三種測試化合物之關鍵藥物動力學參數。AUC/劑量為測試化合物之劑量校正暴露量(dose corrected exposure)之估算值。T½ 為在吸收期完成後測試化合物之終末半衰期。MRT為對應於平均測試化合物分子處於體內之時間的測試化合物之平均滯留時間。MAT為相應平均吸收時間且為分子處於吸收期之平均時間的估算值。F為關於靜脈內投予之測試化合物之絕對生體可用率。
圖1表示生長激素之三維結構。
圖2表示野生型人類生長激素(hGH)之氨基酸序列。
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Claims (15)

  1. 一種生長激素接合物，其包含具有單一Cys突變之生長激素化合物(GH)，其中白蛋白結合殘基經由親水性間隔基連接至該GH之單一Cys之硫殘基，或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該生長激素接合物具有式(I)：A-W-B-GH (I)其中GH表示該生長激素化合物，B表示連接至該Cys突變之硫殘基的親水性間隔基，W為連接A與B之化學基團，及A表示白蛋白結合殘基。
  3. 如申請專利範圍第2項之接合物，其中該親水性間隔基連接至該生長激素化合物中存在之單一Cys突變，該單一Cys突變係選自hGH(SEQ ID NO：1)之以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及G190C。
  4. 如申請專利範圍第3項之接合物，其中該親水性間隔 基連接至該生長激素化合物中存在之單一Cys突變，該單一Cys突變係選自hGH(SEQ ID NO：1)之以下任一者：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及G126C。
  5. 如申請專利範圍第4項之接合物，其中該單一Cys突變為L101C且其中該親水性間隔基連接至L101C之硫。
  6. 如申請專利範圍第3項之接合物，其中該白蛋白結合殘基透過親水性間隔基連接至具有單一Cys突變與額外的二硫橋鍵的GH化合物。
  7. 如申請專利範圍第6項之接合物，其中該GH化合物在對應於hGH(SEQ ID NO：1)中以下位置之至少一個胺基酸對之間具有額外二硫橋鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C及/或V185C/S188C。
  8. 如申請專利範圍第6項之接合物，其中該額外的二硫 橋鍵之半胱胺酸之至少一者係存在於環區段。
  9. 如申請專利範圍第8項之接合物，其中該環區段為胺基酸殘基128-154(L3)。
  10. 如申請專利範圍第9項之接合物，其中該額外二硫鍵連接L3與螺旋2。
  11. 如申請專利範圍第1-10項中任一項之接合物，其中該GH與hGH(SEQ ID 1)具有至少95%一致性。
  12. 如申請專利範圍第3項或第6項之接合物，其中A係選自 其中*表示經由W連接至B。
  13. 如申請專利範圍第12項之接合物，其中W具有下式：-W7 -Y-其中Y為-(CH2 )17 -C3-10 環烷基-W8 -或價鍵，17為0至6，W7 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s3 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，W8 係選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2 -、-CH2 NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2 -、-S(O)2 NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2 -、-CH2 C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2 )s4 -、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。
  14. 如申請專利範圍第13項之接合物，其中B係選自
  15. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該化合物係選自
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