ES2209885T3 - Peptidos insulinotropicos de larga duracion. - Google Patents

Abstract

Un péptido insulinotrópico modificado o un derivado o fragmento suyo que contiene: - un péptido insulinotrópico o un derivado o fragmento que tiene actividad insulinotrópica; y - un grupo maleimido acoplado al péptido insulinotrópico o derivado o fragmento, siendo capaz el grupo maleimido de reaccionar con grupos tiol de los componentes de la sangre para formar un enlace covalente estable.

Description

Péptidos insulinotrópicos de larga duración.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a péptidos insulinotrópicos modificados. En particular, esta invención se refiere a péptidos modificados similares al glucagón y péptidos de la exendina con larga duración de la acción para el tratamiento de la diabetes y otras enfermedades relacionadas con péptidos insulinotrópicos, la función gastrointestinal y actividades asociadas con los niveles de glucagón.

Antecedentes de la invención

El péptido similar a la hormona peptídica insulinotrópica glucagón (GLP-1) ha sido implicado como posible agente terapéutico para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 no dependiente de insulina así como de trastornos metabólicos relacionados, tales como la obesidad. Otros péptidos insulinotrópicos útiles incluyen la exendina 3 y la exendina 4. Aunque son útiles, el GLP-1, la exendina 3 y la exendina 4 adolecen de una limitada duración de la acción asociada con semividas cortas en el plasma in vivo, principalmente debido al rápido aclaramiento del suero y la degradación proteolítica. Se ha identificado la enzima responsable de la degradación del GLP-1, la dipeptidilpeptidasa IV. Se ha hecho un extenso trabajo para intentar inhibir la peptidasa o modificar el GLP-1 de tal manera que su degradación se haga más lenta aunque manteniendo todavía la actividad biológica. A pesar de estos extensos esfuerzos, no se ha producido un GLP-1 activo de larga duración. De por sí, la comunidad diabética tiene una tremenda necesidad de péptidos mejorados del GLP-1, la exendina 3 y la exendina 4.

Hay así una necesidad de modificar el GLP-1, la exendina 3, la exendina 4 y otros péptidos insulinotrópicos para proporcionar una más larga duración de la acción in vivo, aunque manteniendo su baja toxicidad y sus ventajas terapéuticas.

Sumario de la invención

Con el propósito de cumplir estas necesidades, la presente invención está dirigida a péptidos insulinotrópicos (ITP) modificados. Esta invención se refiere a nuevos derivados químicamente reactivos de péptidos insulinotrópicos que pueden reaccionar con funcionalidades disponibles de vehículos celulares incluidas las proteínas móviles de la sangre para formar enlaces covalentes. Específicamente, la invención se refiere a nuevos derivados químicamente reactivos de péptidos insulinotrópicos tales como el péptido similar al glucagón (GLP) y la exendina 3 y la exendina 4 que pueden reaccionar con funcionalidades disponibles de las proteínas móviles de la sangre para formar enlaces covalentes. La invención se refiere también a nuevos derivados químicamente reactivos o análogos de péptidos insulinotrópicos que puedan reaccionar con funcionalidades disponibles de proteínas móviles de la sangre para formar enlaces covalentes.

La presente invención se refiere a péptidos insulinotrópicos modificados que contienen un grupo reactivo que reacciona con grupos amino, grupos hidroxilo o grupos tiol de compuestos de la sangre para formar enlaces covalentes estables.

La presente invención se refiere a una hormona insulinotrópica que contiene un fragmento modificado del GLP-1 y sus derivados, especialmente la amida del GLP-1 (7-36). La invención hace referencia adicionalmente a los usos terapéuticos de tales compuestos, y especialmente al uso de la amida del GLP-1 (7-36) modificado para el tratamiento de la diabetes mellitus que aparece en la madurez (diabetes tipo II).

La presente invención se refiere además a fragmentos modificados de la exendina 3 y la exendina 4 y a usos terapéuticos de tales compuestos.

En particular, la presente invención está dirigida a GLP-1(1-36)-Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; GLP-1 (1-36)-Lys^{37} (\varepsilon-AAEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; GLP-1 (7-36)-Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; GLP-1 (7-36)-Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; exendina-4 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; exendina-4 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; exendina-3 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; exendina-3 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; Lys^{26} (\varepsilon-MPA)GLP-1(7-36)-NH_{2}; GLP-1 (7-36)-EDA-MPA y exendina-4(1-39)-EDA-MPA.

La presente invención se refiere además a composiciones que contienen los derivados de los péptidos insulinotrópicos y al uso de las composiciones para tratar la diabetes en seres humanos.

La invención hace referencia además a un método para incrementar la expresión de la insulina que comprende proporcionar a una célula de mamífero tipo beta de los islotes pancreáticos una cantidad efectiva de los péptidos insulinotrópicos modificados descritos anteriormente.

La invención hace referencia además a un método para tratar la diabetes mellitus de aparición en la madurez que comprende la administración de una cantidad efectiva de los péptidos insulinotrópicos anteriormente discutidos a un paciente que tenga necesidad de tal tratamiento.

\newpage

La invención hace referencia además al tratamiento de otras enfermedades y situaciones relacionadas con péptidos insulinotrópicos con los péptidos insulinotrópicos modificados de la invención.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Para asegurar una completa comprensión de la invención se proporcionan las siguientes definiciones:

Péptidos insulinotrópicos

Los péptidos insulinotrópicos (ITP) son péptidos con actividad insulinotrópica. Los péptidos insulinotrópicos estimulan, o causan la estimulación de, la síntesis o la expresión de la hormona insulina. Tales péptidos incluyen precursores, análogos, fragmentos de péptidos tales como el péptido similar al glucagón, la exendina 3 y la exendina 4 y otros péptidos con actividad insulinotrópica.

Péptido similar al glucagón

El péptido similar al glucagón (GLP) y los derivados del GLP son hormonas intestinales que estimulan generalmente la secreción de insulina durante la hiperglucemia, suprimen la secreción de glucagón, estimulan la biosíntesis de (pro)insulina y desacelera el vaciamiento gástrico y la secreción de ácido. Algunos GLP y derivados del GLP promueven la absorción de glucosa por las células pero no estimulan la expresión de insulina como se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 5.574.008 que se incorpora a la presente memoria como referencia.

Péptidos exendina 3 y exendina 4

Los péptidos y derivados de los péptidos exendina 3 y exendina 4 son péptidos de 39 aminoácidos que son homólogos aproximadamente en un 53% al GLP-1 y tienen actividad insulinotrópica.

Grupos reactivos

Los grupos reactivos son grupos químicos capaces de formar un enlace covalente. Tales agentes reactivos se acoplan o se unen a un péptido insulinotrópico de interés para formar un péptido insulinotrópico modificado. Los grupos reactivos generalmente serán estables en un entorno acuoso y habitualmente serán un grupo carboxi, fosforilo, o acilo conveniente, o como un éster o un anhídrido mixto, o un imidato, capaces por ello de formar un enlace covalente con funcionalidades tales como un grupo amino, un hidroxi o un tiol en el sitio diana de componentes móviles de la sangre. En su mayor parte, los ésteres implicarán grupos fenólicos, o serán ésteres de tiol, ésteres de alquilo, ésteres de fosfato, o similares. Los grupos reactivos incluyen grupos succinimidilo y maleimido.

Funcionalidades

Las funcionalidades son grupos de componentes de la sangre con los que reaccionan grupos reactivos de péptidos insulinotrópicos modificados para formar enlaces covalentes. Las funcionalidades incluyen grupos hidroxilo para formar enlaces con entidades reactivas tipo ésteres; grupos tiol para formar enlaces con maleimidas y grupos maleimido, imidatos y grupos tioéster; grupos amino para formar enlaces con grupos carboxi, fosforilo o acilo de entidades reactivas y grupos carboxilo para formar enlaces con grupos amino. Tales componentes de la sangre incluyen proteínas de la sangre.

Grupos enlazadores

Los grupos enlazadores son restos químicos que enlazan o conectan grupos reactivos con los ITP. Los grupos enlazadores pueden constar de uno o más grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo, propilo, butilo, etc., grupos alcoxi, grupos alquenilo, grupos alquinilo o grupos amino sustituidos con grupos alquilo, grupos cicloalquilo, grupos policíclicos, grupos arilo, grupos poliarilo, grupos arilo sustituidos, grupos heterocíclicos, y grupos heterocíclicos sustituidos. Los grupos enlazadores pueden constar también de polietoxiaminoácidos tales como el AEA (ácido (2-amino)etoxiacético) o un grupo enlazador preferido AEEA (ácido [2-(2-amino)etoxi)]etoxiacético).

Componentes de la sangre

Los componentes de la sangre pueden ser o fijos o móviles. Los componentes fijos de la sangre son componentes de la sangre no móviles e incluyen tejidos, receptores de membrana, proteínas intersticiales, proteínas de la fibrina, colágenos, plaquetas, células endoteliales, células epiteliales y sus receptores asociados a la membrana y membranosos, células corporales somáticas, células del músculo esquelético y del liso, componentes neuronales, osteocitos y osteoclastos y todos los tejidos corporales especialmente aquéllos asociados con los sistemas circulatorio y linfático. Los componentes móviles de la sangre son componentes de la sangre que no tienen una localización fija durante cualquier período extenso de tiempo, que generalmente no excede de 5, más habitualmente de un minuto. Estos componentes de la sangre no están asociados a la membrana y están presentes en la sangre durante períodos extensos de tiempo y están presentes a una concentración mínima de al menos 0,1 \mug/ml. Los componentes móviles incluyen albúmina de suero, transferrina, ferritina e inmunoglobulinas tales como IgM e IgG. La semivida de los componentes móviles de la sangre es al menos aproximadamente 12 horas.

Grupos protectores

Los grupos protectores son restos químicos utilizados para proteger los derivados de los péptidos de reaccionar consigo mismos. En la presente memoria y en el documento U.S. 5.493.007 que se incorpora a la presente memoria como referencia están descritos diversos grupos protectores. Tales grupos protectores incluyen acetilo, fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), t-butiloxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ), y otros similares. Los aminoácidos específicos protegidos se representan en la Tabla 1.

TABLA 1 Aminoácidos naturales y sus abreviaturas

Nombre	Abreviatura de 3 letras	Abreviatura de 1 letra	Aminoácidos protegidos
Alanina	Ala	A	Fmoc-Ala-OH
Arginina	Arg	R	Fmoc-Arg(Pbf)-OH
Asparagina	Asn	N	Fmoc-Asn(Trt)-OH
Ácido aspártico	Asp	D	Asp(tBu)-OH
Cisteína	Cys	C	Fmoc-Cys(Trt)
Ácido glutámico	Glu	E	Fmoc-Glu(tBu)-OH
Glutamina	Gln	Q	Fmoc-Gln(Trt)-OH
Glicina	Gly	G	Fmoc-Gly-OH
Histidina	His	H	Fmoc-His(Trt)-OH
Isoleucina	Ile	I	Fmoc-Ile-OH
Leucina	Leu	L	Fmoc-Leu-OH
Lisina	Lys	K	Fmoc-Lys(Mtt)-OH
Metionina	Met	M	Fmoc-Met-OH
Fenilalanina	Phe	F	Fmoc-Phe-OH
Prolina	Pro	P	Fmoc-Pro-OH
Serina	Ser	S	Fmoc-Ser(tBu)-OH
Treonina	Thr	T	Fmoc-Thr(tBu)-OH
Triptófano	Trp	W	Fmoc-Trp(Boc)-OH
Tirosina	Tyr	Y	Boc-Tyr(tBu)-OH
Valina	Val	V	Fmoc-Val-OH

Grupos funcionales sensibles

Un grupo funcional sensible es un grupo de átomos que representa un sitio potencial de reacción en un péptido ITP. Si está presente, un grupo funcional sensible puede ser elegido como el punto de unión para la modificación del grupo enlazador - grupo reactivo. Los grupos funcionales sensibles incluyen pero no se limitan a grupos carboxilo, amino, tiol, e hidroxilo.

Péptidos modificados

Un ITP modificado es un péptido que se ha modificado uniéndole un grupo reactivo, y que es capaz de formar un péptido estabilizado frente a las peptidasas a través de la conjugación con componentes de la sangre. El grupo reactivo puede estar unido al péptido terapéutico o por medio de un grupo enlazador, u opcionalmente sin utilizar un grupo enlazador. También se contempla que uno o más aminoácidos adicionales puedan ser añadidos al péptido terapéutico para facilitar la unión del grupo reactivo. Los péptidos modificados se pueden administrar in vivo de tal forma que con la conjugación con los componentes de la sangre ocurre in vivo, o se pueden conjugar primero con los componentes de la sangre in vitro y administrar in vivo el péptido resultante estabilizado frente a las peptidasas (tal como se definió anteriormente). Las expresiones "péptido terapéutico modificado" y "péptido modificado" pueden ser utilizadas de forma intercambiable en esta solicitud.

ITP estabilizado frente a las peptidasas

Un ITP estabilizado frente a las peptidasas es un péptido modificado que ha sido conjugado con un componente de la sangre por medio de un enlace covalente formado entre el grupo reactivo del péptido modificado y las funcionalidades del componente de la sangre, con o sin un grupo enlazador. Los péptidos estabilizados frente a las peptidasas son más estables en presencia de peptidasas in vivo que un péptido no estabilizado. Un péptido terapéutico estabilizado frente a las peptidasas tiene generalmente una semivida incrementada en al menos 10-50% en comparación con un péptido no estabilizado de idéntica secuencia. La estabilidad frente a las peptidasas se determina comparando la semivida en el suero o la sangre del ITP sin modificar con la semivida en el suero o la sangre de un péptido terapéutico modificado complementario. La semivida se determina tomando muestras del suero o la sangre después de la administración de los péptidos modificado y no modificado y determinando la actividad del péptido. Además de determinar la actividad, también se puede medir la longitud del ITP mediante HPLC y espectrometría de masas.

Descripción detallada de la invención

Teniendo en cuenta estas definiciones el foco de esta invención es modificar péptido insulinotrópicos para mejorar la biodisponibilidad, extender la semivida y la distribución a través de la conjugación selectiva con un vehículo proteico pero sin modificar sus notables propiedades terapéuticas. El vehículo de elección (pero sin limitarse a) para esta invención sería la albúmina conjugada a través de su tiol libre con un derivado de un péptido insulinotrópico al que se le ha unido un resto maleimido.

1. Péptidos insulinotrópicos A. GLP-1 y sus derivados

Se sabe que la hormona glucagón se sintetiza en forma de una molécula precursora de alto peso molecular que posteriormente se escinde proteolíticamente para dar tres péptido: glucagón, el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), y el péptido 2 similar al glucagón (GLP-2). El GLP-1 tiene 37 aminoácidos en su forma sin procesar como se muestra en la SEQ ID NO: 1. El GLP-1 sin procesar es esencialmente incapaz de mediar en la inducción de la biosíntesis de la insulina. El péptido GLP-1 sin procesar, sin embargo, se convierte de forma natural en un péptido de 31 aminoácidos de longitud (péptido 7-37) que tiene los aminoácidos 7-37 del GLP-1 ("GLP-1(7-37)") SEQ ID NO:2. El GLP-1(7-37) puede experimentar también un procesamiento adicional mediante la separación proteolítica de la glicina terminal del extremo carboxilo para producir GLP-1(7-36) que puede existir también predominantemente con el residuo terminal del extremo carboxilo, la arginina, en forma amidada como argininoamida, GLP-1(7-36)amida. Este procesamiento ocurre en el intestino y en mucho menor grado en el páncreas, y da como resultado un polipéptido con la actividad insulinotrópica del GLP-1(7-37).

Se dice que un compuesto tiene "actividad insulinotrópica" si es capaz de estimular, o causar la estimulación de, la síntesis o la expresión de la hormona insulina. La actividad hormonal del GLP-1(7-37) y el GLP-1(7-36) parece ser específica de las células beta del páncreas donde parece inducir la biosíntesis de insulina. La hormona péptido similar al glucagón de la invención es útil para el estudio de la patogénesis de la diabetes mellitus de aparición en la madurez, un estado caracterizado por hiperglucemia en el que las dinámicas de la secreción de insulina son anormales. Es más, el péptido similar al glucagón es útil en la terapia y el tratamiento de esta enfermedad, y en la terapia y el tratamiento de la hiperglucemia.

Los restos peptídicos (fragmentos) elegidos de la secuencia de aminoácidos determinada del GLP-1 humano constituyen el punto de partida del desarrollo que comprende la presente invención. Las expresiones intercambiables "fragmento peptídico" y "resto peptídico" está previsto que incluyan las secuencias de aminoácidos tanto sintéticas como presentes en la naturaleza que pueden derivar de una secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza.

La secuencia de aminoácidos del GLP-1 ha sido comunicada por varios investigadores (López, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:5485-5489 (1983); Bell, G. I. et al., Nature 302:716-718 (1983); Heinrich, G., et al., Endocrinol. 115:2176-2181 (1984)). La estructura del mRNA del preproglucagón y su correspondiente secuencia de aminoácidos es bien conocida. Se ha caracterizado el procesamiento proteolítico del producto del gen precursor, el proglucagón, para dar glucagón y los dos péptidos insulinotrópicos. Tal como se utiliza en la presente memoria, la notación de GLP-1(1-37) se refiere a un polipéptido del GLP-1 que tiene todos los aminoácidos desde el 1 (extremo amino) al 37 (extremo carboxilo). De forma similar, GLP-1(7-37) se refiere a un polipéptido del GLP-1 que tiene todos los aminoácidos desde el 7 (extremo amino) al 37 (extremo carboxilo). De forma similar, GLP-1(7-36) se refiere a un polipéptido del GLP-1 que tiene todos los aminoácidos desde el número 7 (extremo amino) al número 36 (extremo carboxilo).

En una realización, el GLP-1(7-36) y sus fragmentos peptídicos se sintetizan mediante medios convencionales como se detalla más adelante, tal como mediante la bien conocida síntesis peptídica en fase sólida descrita por Merrifield, J.M. (Chem. Soc. 85:2149 (1962)), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969), páginas 27-66), que se incorporan a la presente memoria como referencia. Sin embargo, es posible también obtener fragmentos del polipéptido proglucagón, o del GLP-1, fragmentando la secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza, utilizando, por ejemplo, una enzima proteolítica. Además, es posible obtener los fragmentos deseados del péptido proglucagón o del GLP-1 a través del uso de la tecnología del DNA recombinante, como ha sido descrito por Maniatis, T., et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982), que se incorpora a la presente memoria como referencia.

La presente invención incluye péptidos que pueden derivar del GLP-1 tales como el GLP-1(1-37) y el GLP-1(7-36). Se dice que un péptido "puede derivar de una secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza" si se puede obtener fragmentando una secuencia presente en la naturaleza, o si se puede sintetizar basándose en el conocimiento de la secuencia de la secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza o del material genético (DNA o RNA) que codifica esta secuencia.

Incluidas dentro del alcance de la presente invención están aquellas moléculas de las que se dice que son "derivados" del GLP-1 tales como el GLP-1(1-37) y especialmente el GLP-1(7-36). Tal "derivado" tiene las siguientes características: (1) comparte una homología sustancial con el GLP-1 o un fragmento de tamaño similar del GLP-1; (2) es capaz de funcionar como hormona insulinotrópica y (3) utilizando al menos uno de los ensayos proporcionados en la presente memoria, el derivado tiene o (i) una actividad insulinotrópica que excede la actividad insulinotrópica o del GLP-1, o con mayor preferencia, (ii) una actividad insulinotrópica que se puede detectar incluso cuando el derivado está presente a una concentración de 10^{-10} M, o, con la máxima preferencia, (iii) una actividad insulinotrópica que se puede detectar incluso cuando el derivado está presente a una concentración de 10^{-11} M.

Se dice que un derivado del GLP-1 comparte una "homología sustancial" con el GLP-1 si la secuencia de aminoácidos del derivado es al menos en un 80%, y con mayor preferencia al menos en un 90%, y con la máxima preferencia al menos en un 95%, la misma que la del GLP-1(1-37).

Los derivados de la presente invención incluyen fragmentos del GLP-1 que, además de contener una secuencia que es sustancialmente homóloga a la del péptido GLP-1 presente en la naturaleza pueden contener uno o más aminoácidos adicionales en sus extremos amino y/o carboxilo. Así, la invención hace referencia a fragmentos polipeptídicos del GLP-1 que pueden contener uno o más aminoácidos que pueden no estar presentes en una secuencia del GLP-1 presente en la naturaleza siempre y cuando tales polipéptidos tengan una actividad insulinotrópica que exceda la del GLP-1. Los aminoácidos adicionales pueden ser D-aminoácidos o L-aminoácidos o sus combinaciones.

La invención incluye también fragmentos del GLP-1 que, aunque contienen una secuencia que es sustancialmente homóloga a la del péptido GLP-1 presente en la naturaleza pueden carecer de uno o más aminoácidos adicionales en sus extremos amino y/o carboxilo que se encuentran de forma natural en un péptido GLP-1. Así, la invención hace referencia a fragmentos polipeptídicos del GLP-1 que pueden carecer de uno o más aminoácidos que están presentes normalmente en una secuencia del GLP-1 presente en la naturaleza siempre y cuando tales polipéptidos tengan una actividad insulinotrópica que exceda la del GLP-1.

La invención abarca también las variantes obvias o triviales de los fragmentos anteriormente descritos que tienen sustituciones intrascendentes de aminoácidos (y así tienen secuencias de aminoácidos que difieren de las de la secuencia natural) siempre y cuando tales variantes tengan una actividad insulinotrópica que sea sustancialmente idéntica a la de los derivados del GLP-1 anteriormente descritos. Los ejemplos de sustituciones obvias o triviales incluyen la sustitución de un residuo básico por otro (es decir Lys por Arg), la sustitución de un residuo hidrófobo por otro (es decir Ile por Leu), o la sustitución de un residuo aromático por otro (es decir, Tyr por Phe), etc.

Además de estos derivados del GLP-1 con actividad insulinotrópica, están dentro del alcance de esta invención los derivados del GLP-1 que estimulan la absorción de glucosa por las células pero que no estimulan la expresión o la secreción de insulina. Tales derivados del GLP-1 están descritos en la Patente de los EE.UU. Nº 5.574.008.

Los derivados del GLP-1 que estimulan la absorción de glucosa por las células pero que no estimulan la expresión o la secreción de insulina que encuentran uso en la invención incluyen:

R_{1}-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R_{2} (SEQ ID NO:3) en el que R_{1} se selecciona entre a) H_{2}N; b) H_{2}N-Ser; c) H_{2}N-Val-Ser; d) H_{2}N-Asp-Val-Ser; e) H_{2}N-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:4); f) H_{2}N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:5); g) H_{2}N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:6); h) H_{2}N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:7); i) H_{2}N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:8); j) H_{2}N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:9); o, k) H_{2}N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser (SEQ ID NO:10). En el péptido, X se selecciona entre Lys o Arg y R_{2} se selecciona entre NH_{2}, OH, Gly-NH_{2}, o Gly-OH. Estos péptidos son fragmentos terminales del extremo carboxilo del GLP-1 que no tienen actividad insulinotrópica pero que son sin embargo útiles para tratar la diabetes y los estados hiperglucémicos como está descrito en la Patente de los EE.UU. Nº 5.574.008.

B. Péptidos de la exendina 3 y la exendina 4

La exendina 3 y la exendina 4 son péptidos de 39 aminoácidos (que difieren en los residuos 2 y 3) que son homólogos en aproximadamente un 53% al GLP-1 y que encuentran uso como agentes insulinotrópicos.

La secuencia de la exendina 3 [SEQ ID No:11] es

HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS y

La secuencia de la exendina 4 [SEQ ID No:12] es

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS.

La invención abarca también los fragmentos insulinotrópicos de la exendina 4 que contienen las secuencias de aminoácidos: exendina-4(1-31) [SEQ ID No:13] HGEGTFTSDLSKQMEEAVR LFIEWLKNGGPY y exendina-4(1-31) [SEQ ID No:14] HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY.

La invención abarca también el fragmento inhibidor de la exendina 4 que contiene la secuencia de aminoácidos:

Exendina-4(9-39) [SEQ ID No:15]

DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

Otros péptidos insulinotrópicos como los presentados en los Ejemplos se muestran como SEQ ID NO:16 - 22.

La presente invención incluye péptidos que pueden derivar de los péptidos de la exendina 3 y la exendina 4 presentes en la naturaleza. Se dice que un péptido "puede derivar de una secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza" si se puede obtener fragmentando una secuencia presente en la naturaleza, o si se puede sintetizar basándose en el conocimiento de la secuencia de la secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza o del material genético (DNA o RNA) que codifica esta secuencia.

Incluidas dentro del alcance de la presente invención están aquellas moléculas de las que se dice que son "derivados" de la exendina 3 y la exendina 4. Tal "derivado" tiene las siguientes características: (1) comparte una homología sustancial con la exendina 3 o la exendina 4 o un fragmento de tamaño similar al de la exendina 3 o la exendina 4; (2) es capaz de funcionar como hormona insulinotrópica y (3) utilizando al menos uno de los ensayos proporcionados en la presente memoria, el derivado tiene o (i) una actividad insulinotrópica que excede la actividad insulinotrópica de la exendina 3 o la exendina 4, o, con mayor preferencia, (ii) una actividad insulinotrópica que se puede detectar incluso cuando el derivado está presente a una concentración de 10^{-10} M, o, con la máxima preferencia, (iii) una actividad insulinotrópica que se puede detectar incluso cuando el derivado está presente a una concentración de 10^{-11} M.

Se dice que un derivado de la exendina 3 y la exendina 4 comparte una "homología sustancial" con la exendina 3 y la exendina 4 si la secuencia de aminoácidos del derivado es al menos en un 80%, y con mayor preferencia al menos en un 90%, y con la máxima preferencia al menos en un 95%, la misma que la de la exendina 3 ó 4 o un fragmento de la exendina 3 ó 4 que tiene el mismo número de residuos de aminoácidos que el derivado.

Los derivados de la presente invención incluyen fragmentos de la exendina 3 o la exendina 4 que, además de contener una secuencia que es sustancialmente homóloga a la del péptido de la exendina 3 o la exendina 4 presente en la naturaleza pueden contener uno o más aminoácidos adicionales en sus extremos amino y/o carboxilo. Así, la invención hace referencia a fragmentos polipeptídicos de la exendina 3 o la exendina 4 que pueden contener uno o más aminoácidos que pueden no estar presentes en secuencias de la exendina 3 o la exendina 4 presentes en la naturaleza siempre y cuando tales polipéptidos tengan una actividad insulinotrópica que exceda la de la exendina 3 o la exendina 4.

De forma similar, la invención incluye fragmentos de la exendina 3 o la exendina 4 que, aunque contienen una secuencia que es sustancialmente homóloga a la del péptido de la exendina 3 o la exendina 4 presente en la naturaleza pueden carecer de uno o más aminoácidos adicionales en sus extremos amino y/o carboxilo que se encuentran de forma natural en un péptido de la exendina 3 o la exendina 4. Así, la invención hace referencia a fragmentos polipeptídicos de la exendina 3 o la exendina 4 que pueden carecer de uno o más aminoácidos que están presentes normalmente en una secuencia de la exendina 3 o la exendina 4 presente en la naturaleza siempre y cuando tales polipéptidos tengan una actividad insulinotrópica que exceda la de la exendina 3 o la exendina 4.

La invención abarca también las variantes obvias o triviales de los fragmentos anteriormente descritos que tienen sustituciones intrascendentes de aminoácidos (y así tienen secuencias de aminoácidos que difieren de la de la secuencia natural) siempre y cuando tales variantes tengan una actividad insulinotrópica que sea sustancialmente idéntica a la de los derivados de la exendina 3 o la exendina 4 anteriormente descritos. Los ejemplos de sustituciones obvias o triviales incluyen la sustitución de un residuo básico por otro (es decir Lys por Arg), la sustitución de un residuo hidrófobo por otro (es decir Ile por Leu), o la sustitución de un residuo aromático por otro (es decir, Tyr por Phe), etc.

2. Péptidos insulinotrópicos modificados

Esta invención se refiere a péptidos insulinotrópicos modificados y sus derivados. Los péptidos insulinotrópicos de la invención incluyen grupos reactivos que pueden reaccionar con funcionalidades reactivas disponibles en los componentes de la sangre para formar enlaces covalentes. La invención se refiere también a tales modificaciones, tales combinaciones con componentes de la sangre y métodos para su uso. Estos métodos incluyen extender la semivida terapéutica efectiva in vivo de los péptidos insulinotrópicos modificados.

Para formar enlaces covalentes con el grupo funcional de una proteína, se puede usar como grupo químicamente reactivo (entidad reactiva) una amplia variedad de grupos carboxilo activos, particularmente ésteres, donde el resto hidroxilo sea fisiológicamente aceptable a los niveles requeridos para modificar los péptidos insulinotrópicos. Aunque pueden emplearse numerosos grupos hidroxilo diferentes en estos agentes enlazadores, los más convenientes serían N-hidroxisuccinimida (NHS), N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS), maleimido-benzoil-succinimida (MBS), un éster de la gamma-maleimido-butiriloxi-succinimida (GMBS) y el ácido maleimidopropiónico (MPA).

Las aminas primarias son los blancos principales de los ésteres de la NHS tal como se esquematiza en el diagrama posterior. Los grupos \alpha-amino accesibles presentes en los extremos amino de las proteínas reaccionan con los ésteres de la NHS. Sin embargo, los grupos \alpha-amino de una proteína pueden no ser deseables o no estar disponibles para el acoplamiento con la NHS. Aunque cinco aminoácidos tienen nitrógeno en sus cadenas laterales, sólo el \varepsilon-amino de la lisina reacciona significativamente con los ésteres de la NHS. Cuando la reacción de conjugación del éster de la NHS reacciona con aminas primarias se forma un enlace amido liberándose N-hidroxisuccinimida como se demuestra en el esquema posterior. A estas succinimidas que contienen grupos reactivos se hace referencia en la presente memoria como grupos succinimidilo.

1

En las realizaciones preferidas de esta invención, el grupo funcional de la proteína será un grupo tiol y el grupo químicamente reactivo será un grupo que contenga un maleimido tal como (GMBA o MPA). GMBA son las siglas de la gamma-maleimido-butirilamida. A tales grupos que contienen maleimidas se hace referencia en la presente memoria como grupos maleido.

El grupo maleimido presente la mayor selectividad por los grupos sulfhidrilo de los péptidos cuando el pH de la mezcla de reacción se mantiene entre 6,5 y 7,4. A pH 7,0, la velocidad de reacción de los grupos maleimido con los sulfhidrilos es 1000 veces más rápida que con las aminas. Entre el grupo maleimido y el sulfhidrilo se forma un enlace tioéter estable que no se puede escindir en condiciones fisiológicas.

2

Los péptidos insulinotrópicos y derivados de péptidos de la invención se pueden modificar para el marcaje específico y el marcaje inespecífico de los componentes de la sangre.

A. Marcaje específico

Preferiblemente, los péptidos insulinotrópicos (ITP) modificados de esta invención están diseñados para reaccionar específicamente con grupos tiol de proteínas móviles de la sangre. Tal reacción se establece preferiblemente mediante la formación de un enlace covalente entre un péptido terapéutico modificado con un grupo enlazante maleimido (por ejemplo preparado a partir de GMBS, MPA u otras maleimidas) y un grupo tiol de una proteína móvil de la sangre tal como la albúmina de suero o una IgG.

En ciertas circunstancias, el marcaje específico con maleimidas ofrece varias ventajas sobre el marcaje no específico de proteínas móviles con grupos tales como NHS y sulfo-NHS. Los grupos tiol son menos abundantes in vivo que los grupos amino. Por ello, los derivados de maleimidas de esta invención formarán enlaces covalentes con menos proteínas. Por ejemplo, en la albúmina (la proteína más abundante de la sangre) hay sólo un único grupo tiol. Así, los conjugados de ITP-maleimida-albúmina tenderán a suponer aproximadamente una relación 1:1 en moles de ITP respecto a la albúmina. Además de la albúmina, las moléculas de IgG (clase II) tienen también tioles libres. Puesto que las moléculas de IgG y de albúmina del suero constituyen la mayoría de la proteína soluble de la sangre pueden suponer también la mayoría de los grupos tiol libres de la sangre que están disponibles para formar enlaces covalentes con los ITP modificados con maleimidas.

Además, incluso entre las proteínas de la sangre que contienen tioles libres, el marcaje específico con maleimidas conduce a la formación preferencial de conjugados ITP-maleimida-albúmina, debido a las características únicas de la albúmina misma. El único grupo tiol libre de la albúmina, altamente conservado entre especies, está localizado en el residuo del aminoácido 34 (Cys^{34}). Se ha demostrado recientemente que la Cys^{34} de la albúmina tiene una reactividad incrementada relativa a los tioles libres de otras proteínas que contienen tioles libres. Esto es debido en parte al muy bajo valor de pK de 5,5 de la Cys^{34} de la albúmina. Éste es mucho más bajo que los valores típicos de pK de los residuos de cisteína en general, que son típicamente aproximadamente 8. Debido a este bajo pK, en condiciones fisiológicas normales la Cys^{34} de la albúmina está predominantemente en la forma ionizada, lo que incrementa dramáticamente su reactividad, tal como ha sido comunicado. Además del bajo valor de pK de la Cys^{34}, otro factor que incrementa la reactividad de la Cys^{34} es su localización, que está en una grieta cerca de la superficie de un bucle de la región V de la albúmina. Esta localización hace a la Cys^{34} muy disponible para ligandos de todo tipo, y es un factor importante en el papel biológico de las Cys^{34} como trampa para radicales libres y eliminador de tioles libres. Estas propiedades hacen a la Cys^{34} altamente reactiva frente a las ITP-maleimidas, y la aceleración de la velocidad de reacción puede ser del nivel de 1000 veces relativa a las velocidades de reacción de las ITP-maleimidas con otras proteínas que contienen tioles libres.

Otra ventaja de los conjugados ITP-maleimida-albúmina es la reproducibilidad asociada con la carga 1:1 de péptido con respecto a la albúmina específicamente en la Cys^{34}. Otras técnicas, tales como la del glutaraldehído, DCC, EDC y otras activaciones químicas de, por ejemplo, aminas libres carecen de esta selectividad. Por ejemplo, la albúmina contiene 52 residuos de lisina, 25-30 de los cuales están localizados en la superficie de la albúmina y son accesibles para la conjugación. Activar estos residuos de lisina, o alternativamente modificar péptidos para acoplarlos a través de estos residuos de lisina, da como resultado una populación heterogénea de conjugados. Incluso si emplean relaciones 1:1 en moles de péptido respecto a la albúmina, el resultado consistirá en múltiples productos de conjugación, que contienen algunos 0, 1, 2 o más péptidos por albúmina, y que tienen cada uno de ellos péptidos acoplados al azar en uno cualquiera de los 25-30 sitios de lisinas disponibles. Dadas las numerosas combinaciones posibles, la caracterización de la composición exacta y la naturaleza de cada lote se vuelve difícil, y la reproducibilidad de lote a lote es de todo punto imposible, haciendo tales conjugados menos deseables como agentes terapéuticos. De forma adicional, aunque parecería que la conjugación a través de residuos de lisina de la albúmina tendría al menos la ventaja de suministrar más agente terapéutico por molécula de albúmina, los estudios han demostrado que se prefiere una relación 1:1 de agente terapéutico con respecto a la albúmina. En un artículo de Stehle, et al., "The Loading Rate Determines Tumor Targeting Properties of Methotrexate-Albumin Conjugates in Rats", Anti-Cancer Drugs, Vol. 8, pag. 677-685 (1997), incorporado en la presente memoria en su totalidad, los autores comunican que una relación 1:1 del anticancerígeno metotrexato con respecto a la albúmina conjugada vía glutaraldehído dio los resultados más prometedores. Estos conjugados eran absorbidos por las células tumorales, mientras que los conjugados que soportaban de 5:1 a 20:1 moléculas de metotrexato tenían alterados los perfiles de HPLC y eran absorbido rápidamente por el hígado in vivo. Se postula que a estas proporciones más elevadas, los cambios conformacionales en la albúmina disminuyen su efectividad como vehículo terapéutico.

A través de la administración controlada de los maleimido-ITP in vivo, se puede controlar el marcaje específico de la albúmina y la IgG in vivo. En las administraciones típicas, 80-90% de los maleimido-ITP administrados marcarán la albúmina y menos de un 5% marcará la IgG. También ocurrirá un marcaje traza de tioles libres tales como el glutatión. Se prefiere tal marcaje específico para el uso in vivo puesto que permite un cálculo preciso de la semivida estimada del agente administrado.

Además de proporcionar un marcaje específico controlado in vivo, los maleimido-ITP pueden proporcionar un marcaje específico de la albúmina del suero y la IgG ex vivo. Tal marcaje ex vivo implica la adición de los maleimido-ITP a la sangre, el suero o la solución salina que contiene albúmina de suero y/o IgG. Una vez modificados ex vivo con maleimido-ITP, la sangre, el suero o la solución salina se pueden readministrar a la sangre para el tratamiento in vivo.

En contraste con los NHS-péptidos, los maleimido-ITP son generalmente bastante estables en presencia de soluciones acuosas y en presencia de aminas libres. Puesto que los maleimido-ITP sólo reaccionarán con tioles libres, generalmente no son necesarios grupos protectores para impedir que los maleimido-ITP reaccionen consigo mismos. Además, la estabilidad incrementada del péptido permite el uso de etapas adicionales de purificación tales como HPLC para preparar productos altamente purificados adecuados para el uso in vivo. Por último, la estabilidad química incrementada proporciona un producto con una vida más prolongada en los anaqueles.

B. Marcaje no específico

Los ITP de la invención también se pueden modificar para el marcaje no específico de componentes de la sangre. Se emplearán generalmente enlaces con grupos amino, particularmente con la formación de enlaces amido para el marcaje no específico. Para formar tales enlaces, se puede usar como grupo químicamente reactivo acoplado al ITP una amplia variedad de grupos carboxilo activos, particularmente ésteres, donde el resto hidroxilo sea fisiológicamente aceptable a los niveles requeridos. Aunque pueden emplearse en estos agentes enlazadores numerosos grupos hidroxilo diferentes, los más convenientes serían la N-hidroxisuccinimida (NHS) y la N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS).

Otros agentes enlazadores que pueden utilizarse están descritos en la patente de los EE.UU. 5.612.034, que se incorpora por ello a la presente memoria.

Los diversos sitios con los que pueden reaccionar in vivo los grupos químicamente reactivos de los ITP no específicos incluyen células, particularmente glóbulos rojos (eritrocitos) y plaquetas, y proteínas, tales como inmunoglobulinas, incluyendo IgG e IgM, albúmina de suero, ferritina, proteínas que se unen a esteroides, transferrina, la proteína que se une a la tiroxina, \alpha-2-macroglobulina, y otras similares. Aquellos receptores con los que reaccionen los derivados de los ITP, que no son de larga vida, generalmente serán eliminados del ser humano hospedador en aproximadamente tres días. Las proteínas indicadas anteriormente (incluyendo las proteínas de las células) permanecerán en la corriente sanguínea al menos tres días, y pueden permanecer cinco días o más (que habitualmente no exceden los 60 días, que más corrientemente no exceden los 30 días) concretamente en lo que se refiere a la semivida, basada en la concentración en la sangre.

En la mayor parte de los casos, la reacción será con componentes móviles de la sangre, particularmente proteínas y células de la sangre, más concretamente proteínas de la sangre y eritrocitos. Por "móvil" se entiende que el componente no tiene una localización fija durante un período extenso de tiempo, que generalmente no excede de 5 minutos, más habitualmente de minuto, aunque algunos de los componentes de la sangre pueden estar relativamente estacionarios durante períodos extensos de tiempo. Inicialmente, habrá una población relativamente heterogénea de proteínas y células marcadas. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, la población diferirá sustancialmente de la población inicial en unos pocos días después de la administración, dependiendo de la semivida de las proteínas marcadas en la corriente sanguínea. Por ello, habitualmente en aproximadamente tres días o más, la IgG se convertirá en la proteína marcada predominante en la corriente sanguínea.

Habitualmente, hacia el día 5 después de la administración, la IgG, la albúmina del suero y los eritrocitos serán al menos aproximadamente el 60% en moles, habitualmente al menos aproximadamente el 75% en moles, de los componentes conjugados de la sangre, siendo la IgG, la IgM (en grado sustancialmente menor) y la albúmina del suero al menos aproximadamente el 50% en moles, normalmente al menos aproximadamente el 75% en moles, más corrientemente al menos aproximadamente el 80% en moles, de los componentes conjugados no celulares.

Los conjugados deseados de ITP no específicos con componentes de la sangre se pueden preparar in vivo mediante la administración de los ITP directamente al paciente, que puede ser un ser humano u otro mamífero. La administración se puede hacer en forma de inyección intravenosa rápida o introducirse lentamente a lo largo del tiempo mediante infusión utilizando un flujo controlado o similares.

Si se desea, los presentes conjugados se pueden preparar también ex vivo combinando sangre con derivados de los ITP de la presente invención, permitiendo la formación de enlaces covalentes entre los ITP modificados con funcionalidades reactivas de los componentes de la sangre y haciendo luego que retorne o administrando la sangre conjugada al hospedador. Es más, lo anterior se puede lograr también purificando primero un componente individual de la sangre o un número limitado de componentes, tales como glóbulos rojos, inmunoglobulinas, albúmina de suero, o similares, y combinando el componente o los componentes ex vivo con los ITP químicamente reactivos. La sangre marcada o los componentes marcados de la sangre se pueden hacer retornar luego al hospedador para proporcionar in vivo los presentes conjugados terapéuticamente efectivos. También se puede tratar la sangre para impedir la coagulación durante el manejo ex vivo.

3. Síntesis de ITP modificados A. Síntesis de los ITP

Los fragmentos de ITP se pueden sintetizar mediante métodos estándar de química de péptidos en fase sólida conocidos para los expertos comunes en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de ITP se pueden sintetizar mediante técnicas de química en fase sólida siguiendo los procedimientos descritos por Stewart y Young (Stewart, J.M. y Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, III., (1984) utilizando un sintetizador de Applied Biosystem. De forma similar, pueden sintetizarse múltiples fragmentos y unirse después para formar fragmentos más grandes. También pueden prepararse estos fragmentos sintéticos de péptidos con sustituciones de aminoácidos en localizaciones específicas.

Para la síntesis peptídica en fase sólida, puede encontrarse un compendio de muchas técnicas en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, pag. 46, Academic Press (Nueva York), 1973. Para la síntesis clásica en solución véase G. Schroder y K. Lupke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (Nueva York). En general, estos métodos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o de aminoácidos adecuadamente protegidos a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente o el grupo amino o el carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivado de aminoácido o se une luego a un soporte sólido inerte o se utiliza en solución añadiendo el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido y en condiciones adecuadas para formar el enlace amido. Se separa después el grupo protector de este residuo de aminoácido añadido recientemente y se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente.

Después de que todos los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia apropiada, se separa cualquier grupo protector (y cualquier soporte sólido) remanente de forma secuencial o simultánea para dar lugar al polipéptido final. Mediante la simple modificación de este procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido al mismo tiempo a una cadena en crecimiento, por ejemplo, acoplando (en condiciones que no racemicen los centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido protegido apropiadamente para formar, después de la desprotección, un pentapéptido.

Un método particularmente preferido de preparar compuestos de la presente invención implica la síntesis peptídica en fase sólida en la que el aminoácido \alpha-N-terminal está protegido mediante un grupo sensible a los ácidos o las bases. Tales grupos protectores deberían tener las propiedades de ser estables en las condiciones de formación de los enlaces peptídicos aun siendo fácilmente separables sin la destrucción de la cadena peptídica en crecimiento o la racemización de cualquiera de los centros quirales contenidos en ella. Son grupos protectores adecuados 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Cbz), bifenilisopropiloxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2-ciano-t-butiloxicarbonilo, y otros similares. Se prefiere particularmente el grupo protector 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc) para la síntesis de fragmentos de ITP. Otros grupos protectores preferidos para las cadenas laterales son, para los grupos amino de las cadenas laterales como los de la lisina y la arginina, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (pmc), nitro, p-toluensulfonilo, 4-metoxibencen-sulfonilo, Cbz, Boc, y adamantiloxicarbonilo; para la tirosina, bencilo, o-bromobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, isopropilo, t-butilo (t-Bu), ciclohexilo, ciclopentilo y acetilo (Ac); para la serina, t-butilo, bencilo y tetrahidropiranilo; para la histidina, tritilo, bencilo, Cbz, p-toluensulfonilo y 2,4-dinitrofenilo; para el triptófano, formilo; para el ácido aspártico y el ácido glutámico, bencilo y t-butilo y para la cisteína, trifenilmetilo (tritilo).

En el método de la síntesis peptídica en fase sólida, el aminoácido \alpha-C-terminal está unido a un soporte sólido o resina estable. Los soportes sólidos adecuados útiles para la síntesis anterior son aquellos materiales que son inertes con respecto a los reactivos y las condiciones de reacción de las reacciones por etapas de condensación-desprotección, así como que son insolubles en los medios utilizados. El soporte sólido preferido para la síntesis de los péptidos unidos por un carboxi \alpha-C-terminal es el 4-hidroximetilfenoximetil-copoli(estireno-1% de divinilbenceno). El soporte sólido preferido para los péptidos unidos por una amida \alpha-C-terminal es la resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamidoetílica disponible en Applied Biosystems (Foster City, California). El aminoácido \alpha-C-terminal se acopla a la resina por medio de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) o hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), con o sin 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), hexaflourofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) o cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfina (BOPCI), acoplamiento mediado durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas a una temperatura de entre 10º y 50ºC, en un disolvente tal como diclorometano o DMF.

Cuando el soporte sólido es la resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi-acetamidoetílica, el grupo Fmoc se escinde con una amina secundaria, preferiblemente piperidina, antes de acoplarla con el aminoácido \alpha-C-terminal como se ha descrito anteriormente. El método preferido para el acoplamiento con la resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi-acetamidoetílica desprotegida es hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equivalente) en DMF. El acoplamiento de los sucesivos aminoácidos protegidos se puede llevar a cabo en un sintetizador automático de polipéptidos como es bien conocido en la técnica. En una realización preferida, los aminoácidos \alpha-N-terminales de la cadena peptídica en crecimiento están protegidos con Fmoc. La separación del grupo protector Fmoc del extremo \alpha-N-terminal del péptido en crecimiento se logra mediante el tratamiento con una amina secundaria, preferiblemente piperidina. Cada aminoácido protegido se introduce luego en un exceso de aproximadamente 3 veces en moles, y el acoplamiento se lleva a cabo preferiblemente en DMF. El agente de acoplamiento es normalmente hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equivalente).

Al final de la síntesis en fase sólida, se separa el polipéptido de la resina y se desprotege, bien sucesivamente o en una única operación. La separación del polipéptido y la desprotección se pueden lograr en una única operación tratando el polipéptido unido a la resina con un reactivo de escisión que contiene tioanisol, agua, etanoditiol y ácido trifluoroacético. En los casos en los que el extremo \alpha-C-terminal del polipéptido es una alquilamida, la resina se escinde mediante aminolisis con una alquilamina. De forma alternativa, se puede separar el péptido mediante transesterificación, por ejemplo con metanol, seguida de aminolisis o mediante transamidación directa. El péptido protegido se puede purificar en este punto o llevarlo directamente a la siguiente etapa. La separación de los grupos protectores de las cadenas laterales se logra utilizando el cóctel de escisión anteriormente descrito. El péptido completamente desprotegido se purifica mediante una secuencia de etapas cromatográficas empleando cualquiera o la totalidad de los siguientes tipos: intercambio iónico en una resina débilmente básica (en forma de acetato); cromatografía de adsorción hidrófoba en poliestireno-divinilbenceno sin modificar (por ejemplo, Amberlita XAD), cromatografía de adsorción en gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico en carboximetilcelulosa; cromatografía de reparto, por ejemplo en Sephadex G-25, LH-20 o distribución a contracorriente; cromatrografía líquida de alta eficacia (HPLC), especialmente la HPLC en fase inversa en una columna rellena con una fase unida a octil- u octadecilsilil-sílice.

Los pesos moleculares de estos ITP se determinan utilizando Espectroscopía de Masas de Bombardeo con Átomos Rápidos (FAB).

Los ITP de la invención se pueden sintetizar con grupos protectores de los extremos amino y carboxilo para su uso como profármacos.

1. Grupos protectores del extremo N-terminal

Tal como se discutió anteriormente, la expresión "grupo N-protector" se refiere a aquellos grupos diseñados para proteger el extremo \alpha-N-terminal de un aminoácido o péptido o para proteger de otra manera el grupo amino de un aminoácido o péptido contra reacciones indeseables durante los procedimientos de síntesis. Los grupos N-protectores utilizados habitualmente se discuten en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Nueva York (1981)), que se incorpora a la presente memoria como referencia. De forma adicional, los grupos protectores se pueden utilizar como profármacos que se escinden fácilmente in vivo, por ejemplo, mediante hidrólisis enzimática, para liberar el precursor biológicamente activo. Los grupos \alpha-N-protectores incluyen grupos alcanoílo inferiores tales formilo, acetilo, ("Ac"), propionilo, pivaloílo, t-butilacetilo y otros similares; otros grupos acilo incluyen 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, -clorobutirilo, benzoílo, 4-clorobenzoílo, 4-bromobenzoílo, 4-nitrobenzoílo y otros similares; grupos sulfonilo tales como bencensulfonilo, p-toluensulfonilo y otros similares; grupos que forman carbamatos tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-etoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y otros similares; grupos arilalquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y otros similares y grupos sililo tales como trimetilsililo y otros similares.

2. Grupos protectores de carboxis

Tal como se discutió anteriormente, la expresión "grupo protector de carboxis" se refiere a un grupo éster o amido protector de un ácido carboxílico empleado para bloquear o proteger la función ácido carboxílico mientras se llevan a cabo las reacciones que implican otros sitios funcionales del compuesto. Los grupos protectores de carboxis están descritos en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", pag. 152-186 (1981), que se incorpora a la presente memoria como referencia. De forma adicional, se puede utilizar un grupo protector de carboxis como un profármaco en el que el grupo protector del carboxi se puede escindir fácilmente in vivo, por ejemplo mediante hidrólisis enzimática, para liberar el precursor biológicamente activo. Tales grupos protectores de carboxis son bien conocidos para los expertos en la técnica, habiéndose utilizado profusamente en la protección de grupos carboxilo en los campos de las penicilinas y las cefalosporinas como está descrito en las Patentes de los EE.UU. Nº3.840.556 y 3.719.667, las descripciones de las cuales se incorporan por ello a la presente memoria como referencia. Grupos protectores de carboxis representativos son alquilos inferiores de C_{1} - C_{8} (por ejemplo, metilo, etilo o t-butilo y similares); arilalquilos tales como fenetilo o bencilo y sus derivados sustituidos tales como grupos alcoxibencilo o nitrobencilo y similares; arilalquenilos tales como feniletenilo y similares; arilos y sus derivados sustituidos tales como 5-indanilo y similares; dialquilaminoalquilos tales como dimetilaminoetilo y similares; grupos alcanoiloxialquilo tales como acetoximetilo, butiriloximetilo, valeriloximetilo, isobutiriloximetilo, isovaleriloximetilo, 1-(propioniloxi)-1-etilo, 1-(pivaloiloxi)-1-etilo, 1-metilo-1-propioniloxi)-1-etilo, pivaloiloximetilo, propioniloximetilo y similares; grupos cicloalcanoiloxialquilo tales como ciclopropilcarboniloximetilo, ciclobutilcarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloximetilo, ciclohexilcarboniloximetilo y similares; aroiloxialquilos tales como benzoiloximetilo, benzoiloxietilo y similares; arilalquilcarboniloxialquilos tales como bencilcarboniloximetilo, 2-bencilcarboniloxietilo y similares; alcoxicarbonilalquilos o cicloalquiloxicarbonilalquilos tales como metoxicarbonilmetilo, ciclohexiloxicarbonilmetilo, 1-metoxicarbonil-1-etilo y similares; alcoxicarboniloxialquilos o cicloalquiloxicarboniloxialquilos tales como metoxicarboniloximetilo, t-butiloxicarboniloximetilo, 1-etoxicarboniloxi-1-etilo, 1-ciclohexiloxicarboniloxi-1-etilo y similares, ariloxicarboniloxialquilos tales como 2-(fenoxicarboniloxi)etilo, 2-(5-indaniloxicarboniloxi)etilo y similares; alcoxialquilcarboniloxialquilos tales como 2-(1-metoxi-2-metilpropan-2-oiloxi)etilo y similares; arilalquiloxicarboniloxialquilos tales como 2-(benciloxicarboniloxi)etilo y similares; arilalqueniloxicarboniloxialquilos tales como 2-(3-fenilpropen-2-iloxicarboniloxi)etilo y similares; alcoxicarbonilaminoalquilos tales como t-butiloxicarbonilaminometilo y similares; alquilaminocarbonilaminoalquilos tales como metilaminocarbonilaminometilo y similares; alcanoilaminoalquilos tales como acetilaminometilo y similares; heterociclocarboniloxialquilos tales como 4-metilpiperazinilcarboniloximetilo y similares; dialquilaminocarbonilalquilos tales como dimetilaminocarbonilmetilo, dietilaminocarbonilmetilo y similares; (5-(alquil inferior)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilos tales como (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares; y (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilos tales como (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares.

Los grupos representativos de amidas protectoras de carboxis son grupos aminocarbonilo y (alquil inferior)-aminocarbonilo.

Los compuestos preferidos con el carboxi protegido de la invención son compuestos en los que el grupos carboxi protegido es un éster de un alquilo inferior, cicloalquilo o arilalquilo, por ejemplo, éster de metilo, éster de etilo, éster de propilo, éster de isopropilo, éster de butilo, éster de sec-butilo, éster de isobutilo, éster de amilo, éster de isoamilo, éster de octilo, éster de ciclohexilo, éster de feniletilo y similares o un alcanoiloxialquilo, cicloalcanoiloxialquilo, aroiloxialquilo o un éster de arilalquilcarboniloxialquilo. Los grupos preferidos de amidas protectoras de carboxis son grupos (alquil inferior)-aminocarbonilo. Por ejemplo, el ácido aspártico puede protegerse en el extremo \alpha-C-terminal mediante un grupo lábil frente al ácido (por ejemplo t-butilo) y protegerse en el extremo \beta-C-terminal mediante un grupo lábil frente a la hidrogenación (por ejemplo bencilo) y luego desprotegerse selectivamente durante la síntesis.

B. Modificación de los ITP

La manera de producir los ITP modificados de la presente invención variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza de los diversos elementos que compongan el ITP. Los procedimientos sintéticos se seleccionarán de forma que sean sencillos, proporcionen altos rendimientos, y permitan un producto altamente purificado. Normalmente, el grupo químicamente reactivo se creará en el último estadio de la síntesis, por ejemplo, con un grupo carboxilo, esterificación para formar un éster activo. Los métodos específicos para la producción de ITP modificados de la presente invención se describen más adelante.

Cada ITP seleccionado para experimentar la modificación con un fragmento enlazador y un agente reactivo se modifica de acuerdo con los siguientes criterios: si un grupo carboxilo, no crítico para la retención de la actividad farmacológica, está disponible en el ITP original y no está presente en el ITP ninguna otra funcionalidad reactiva, entonces el ácido carboxílico se elige como punto de unión para la modificación con el fragmento enlazador-entidad reactiva. Si no está disponible ningún ácido carboxílico, se seleccionan entonces como punto de unión para la modificación con el fragmento enlazador-entidad reactiva otras funcionalidades no críticas para la retención de la actividad farmacológica. Si están disponibles en un ITP varias funcionalidades, se utilizará una combinación de grupos protectores de tal modo que después de la adición del fragmento enlazador/la entidad reactiva y la desprotección de todos los grupos funcionales protegidos, se obtenga todavía la retención de la actividad farmacológica. Si no está disponible en el ITP ninguna funcionalidad, los esfuerzos sintéticos permitirán una modificación del ITP original de tal modo que se obtenga la retención de la actividad biológica y la retención de la especificidad por el receptor o la diana.

La entidad químicamente reactiva se coloca en un sitio de forma que cuando el ITP esté unido al componente de la sangre, el ITP retenga una proporción sustancial de la actividad del ITP sin modificar.

Incluso más específicamente, cada ITP seleccionado para experimentar la formación de derivados con un fragmento enlazador y una entidad reactiva se modificará de acuerdo con los siguientes criterios: si un grupo carboxilo terminal está disponible en el péptido terapéutico y no es crítico para la retención de la actividad farmacológica, y no está presente en el ITP ningún otro grupo funcional sensible, entonces se elegirá el ácido carboxílico como punto de unión para la modificación con el fragmento enlazador-entidad reactiva. Si el grupo carboxilo terminal está implicado en la actividad farmacológica, o si no está disponible ningún ácido carboxílico, se seleccionará entonces como punto de unión para la modificación con el fragmento enlazador-entidad reactiva cualquier otro grupo funcional sensible no crítico para la retención de la actividad farmacológica. Si están disponibles en un ITP varios grupos funcionales sensibles, se utilizará una combinación de grupos protectores de tal modo que después de la adición del fragmento enlazador/la entidad reactiva y la desprotección de todos los grupos funcionales sensibles protegidos, se obtenga todavía la retención de la actividad farmacológica. Si no está disponible en el péptido terapéutico ningún grupo funcional sensible, los esfuerzos sintéticos permitirán una modificación del péptido original de tal modo que se obtenga la retención de la actividad biológica y la retención de la especificidad por el receptor o la diana. En este caso la modificación ocurrirá en el extremo opuesto del péptido.

Puede sintetizarse un derivado de la NHS a partir de un ácido carboxílico en ausencia de otros grupos funcionales sensibles en el péptido terapéutico. Específicamente, tal péptido terapéutico se hace reaccionar con N-hidroxisuccinimida en CH_{2}Cl_{2} anhidro y EDC, y el producto se purifica mediante cromatografía o se recristaliza a partir del sistema disolvente apropiado para dar el derivado de NHS.

De forma alternativa, puede sintetizarse un derivado de la NHS a partir de un ITP que contenga un grupo amino y/o tiol y un ácido carboxílico. Cuando está presente en la molécula un grupo amino o tiol libre, es preferible proteger estos grupos funcionales sensibles antes de llevar a efecto la adición del derivado de la NHS. Por ejemplo, si la molécula contiene un grupo amino libre, es necesaria una transformación de la amina en una amina protegida con Fmoc o preferiblemente protegida con tBoc antes de llevar a efecto la química anteriormente descrita. La función amina no se desprotegerá después de la preparación del derivado de la NHS. Por ello este método se aplica sólo a un compuesto en el que no se requiera que se libere su grupo amino para inducir un efecto farmacológico deseado. Además, puede sintetizarse un derivado de la NHS a partir de un péptido terapéutico que contenga un grupo amino o tiol y ningún ácido carboxílico. Cuando la molécula seleccionada no contiene ningún ácido carboxílico, puede utilizarse una batería de fragmentos enlazadores bifuncionales para convertir la molécula en un derivado reactivo de la NHS. Por ejemplo, bis(succinimidilsuccinato) de etilenglicol (EGS) y trietilamina disueltos en DMF y añadidos a la molécula que contiene el amino libre (con una relación 10:1 a favor del EGS) producirá el derivado mono-NHS. Para producir un derivado de la NHS a partir de un derivado de una molécula modificada con un tiol, se puede usar éster de N-[maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS) y trietilamina en DMF. El grupo maleimido reaccionará con el tiol libre y el derivado de la NHS se purificará a partir de la mezcla de reacción mediante cromatografía en sílice o mediante HPLC.

También puede sintetizarse un derivado de la NHS a partir de un ITP que contenga múltiples grupos funcionales sensibles. Cada caso tendrá que ser analizado y resuelto de manera diferente. Sin embargo, gracias a la amplia gama de grupos protectores y fragmentos enlazadores bifuncionales que están comercialmente disponibles, esta invención es aplicable a cualquier péptido terapéutico con preferiblemente sólo una etapa química para obtener el derivado del ITP o dos etapas protegiendo primero un grupo sensible o tres etapas (protección, activación y desprotección). Sólo en circunstancias excepcionales, se requeriría utilizar una síntesis con múltiples etapas (más allá de tres etapas) para transformar un péptido terapéutico en un derivado activo de la NHS o la maleimida.

También puede sintetizarse un derivado de la maleimida a partir de un ITP que contenga un grupo amino libre y un ácido carboxílico libre. Para producir un derivado de la maleimida a partir de un derivado de una molécula modificada con un amino, se puede utilizar el éster de N-[maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS) y trietilamina en DMF. El grupo éster de succinimida reaccionará con el amino libre y el derivado de la maleimida se purificará a partir de la mezcla de reacción mediante cristalización o mediante cromatografía en sílice o mediante HPLC.

Finalmente, puede sintetizarse un derivado de la maleimida a partir de un péptido terapéutico que contenga múltiples grupos funcionales sensibles diferentes de los anteriores y ningún ácido carboxílico libre. Cuando la molécula seleccionada no contiene ningún ácido carboxílico, puede utilizarse una batería de reactivos reticulantes bifuncionales para convertir la molécula en un derivado reactivo de la NHS. Por ejemplo se puede acoplar ácido maleimidopropiónico (MPA) con la amina libre para producir un derivado de la maleimida a través de la reacción de la amina libre con el grupo carboxílico del MPA utilizando la activación con HBTU/HOBt/DIEA en DMF.

Alternativamente pueden utilizarse muchos otros reactivos reticulantes heterobifuncionales comercialmente disponibles cuando se necesiten. Un gran número de compuestos bifuncionales está disponible para unirse a entidades. Los reactivos ilustrativos incluyen: azidobenzoilhidrazida, N-[4-(p-azidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio)propionamida), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, adipimidato de dimetilo, tartrato de disuccinimidilo, éster de la N-y-maleimidobutiriloxisuccinimida, 4-azidobenzoato de N-hidroxisulfosuccinimidilo, [4-azidofenil]-1,3'-ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehido, y 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo.

4. Usos de los ITP modificados

Los ITP modificados de la invención encuentran múltiples usos incluyendo el uso como un tratamiento de la diabetes, un sedante, un tratamiento de trastornos del sistema nervioso, uso para inducir un efecto ansiolítico en el CNS, uso para activar el CNS, uso para el tratamiento posquirúrgico y como tratamiento de la resistencia a la insulina.

A. Tratamientos de la diabetes

Los ITP modificados de la invención normalizarán generalmente la hiperglucemia a través de mecanismos dependientes de glucosa, dependientes de insulina e independientes de insulina. Como tales, los ITP modificados son útiles como agentes primarios para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II y como agentes adjuntos para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo I.

El uso de una cantidad efectiva de los ITP modificados como tratamiento de la diabetes mellitus tiene la ventaja de ser más potente que los ITP no modificados. Puesto que los ITP modificados son más estables in vivo, pueden administrarse para un tratamiento efectivo cantidades más pequeñas de la molécula. La presente invención es especialmente adecuada para el tratamiento de pacientes con diabetes, tanto del tipo I como del tipo II, por el hecho de que la acción del péptido es dependiente de la concentración de glucosa en la sangre, y así el riesgo de efectos secundarios hipoglucemiantes se reduce en gran medida con respecto a los riesgos de utilizar los métodos actuales de tratamiento.

La presente invención proporciona también un método para tratar la diabetes mellitus en un individuo, en el que dicho método comprende proporcionar una cantidad de ITP modificado suficiente para tratar la diabetes; donde la composición contiene un ITP modificado.

B. Tratamiento de trastornos del sistema nervioso

Los ITP modificados de la invención encuentran uso también como un sedante. En un aspecto de la invención, se proporciona un método para sedar a un sujeto mamífero con una anormalidad que da como resultado una activación incrementada del sistema nervioso central o periférico utilizando los ITP modificados de la invención. El método comprende administrar un ITP modificado al sujeto en cantidad suficiente para producir un efecto sedante o ansiolítico en el sujeto. El ITP modificado se puede administrar intracerebroventricularmente, oralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, o intravenosamente. Tales métodos son útiles para tratar o mejorar estados del sistema nervioso tales como ansiedad, trastornos del movimiento, agresión, psicosis, convulsiones, ataques de pánico, histeria y trastornos del sueño.

En un aspecto relacionado, la invención incluye un método para incrementar la actividad de un sujeto mamífero, que comprende administrar un ITP modificado al sujeto en cantidad suficiente para producir un efecto activador en el sujeto. Preferiblemente, el sujeto está en un estado que da como resultado una activación disminuida del sistema nervioso central o periférico. Los ITP modificados encuentran un uso particular en el tratamiento o mejora de la depresión, trastornos esquizoafectivos, apnea del sueño, síndromes de atención deficiente con poca concentración, pérdida de memoria, falta de memoria, y narcolepsia, por nombrar sólo unas pocas situaciones en los que la activación del sistema nervioso central puede ser ventajosa.

Los ITP modificados de la invención se pueden utilizar para inducir activación para el tratamiento o mejora de la depresión, trastornos esquizoafectivos, apnea del sueño, síndromes de atención deficiente con poca concentración, pérdida de memoria, falta de memoria, y narcolepsia. La eficacia terapéutica del tratamiento con los ITP modificados se puede seguir mediante entrevistas con los pacientes para evaluar su estado, mediante ensayos psicológicos/neurológicos, o mediante la mejora de los síntomas asociados con estos estados. Por ejemplo, el tratamiento de la narcolepsia se puede evaluar siguiendo la aparición de ataques narcolépticos. Como otro ejemplo, se pueden ensayar los efectos de los ITP modificados sobre la capacidad de un sujeto para concentrarse, o sobre la capacidad de memoria, utilizando uno cualquiera de una número de ensayos diagnósticos bien conocidos para los expertos en la técnica.

C. Tratamiento posquirúrgico

Los ITP modificados de la invención se pueden utilizar para tratamientos posquirúrgicos. Un paciente tiene necesidad de los ITP modificados de la presente invención durante aproximadamente 1-16 horas antes de que se lleve a cabo la intervención quirúrgica del paciente, durante la intervención quirúrgica del paciente, o después de la intervención quirúrgica del paciente durante un período de no más de aproximadamente 5 días.

Los ITP modificados de la presente invención se administran de aproximadamente dieciséis horas a aproximadamente una hora antes de que comience la intervención quirúrgica. El espacio de tiempo antes de la intervención quirúrgica en el que los compuestos utilizados en la presente invención deberían administrarse con el propósito de reducir los efectos catabólicos y la resistencia a la insulina es dependiente de un número de factores. Estos factores son generalmente conocidos por el médico con una experiencia normal, e incluyen, como lo más importantes, si el paciente está en ayunas o se le ha suministrado una infusión o bebida con glucosa, o alguna otra forma de sustento durante el período preparatorio antes de la intervención quirúrgica. Otros factores importantes incluyen el sexo del paciente, el peso y la edad, la severidad de cualquier incapacidad para regular la glucosa en sangre, las causas subyacentes de cualquier incapacidad para regular la glucosa en sangre, la severidad esperada del trauma causado por la intervención quirúrgica, la ruta de administración y la biodisponibilidad, la persistencia en el cuerpo, la formulación, y la potencia del compuesto administrado. Un intervalo de tiempo preferido dentro del cual comenzar la administración de los ITP modificados utilizados en la presente invención es de aproximadamente una hora a aproximadamente diez horas antes de que comience la intervención quirúrgica. El intervalo de tiempo que más se prefiere para comenzar la administración está entre dos horas y ocho horas antes de que comience la intervención quirúrgica.

La resistencia a la insulina posterior a un tipo concreto de intervención quirúrgica, la cirugía abdominal programada, es más profunda en el primer día postoperatorio, dura al menos cinco días, y puede tardar hasta tres semanas en normalizarse. Así, el paciente postoperatorio puede tener necesidad de la administración de los ITP modificados utilizados en la presente invención durante un período de tiempo posterior al trauma de la intervención quirúrgica que dependerá de factores que el médico con una experiencia normal entenderá y determinará. Entre estos factores está si el paciente está en ayunas o se le ha suministrado una infusión o bebida con glucosa, o alguna otra forma de sustento posterior a la intervención quirúrgica, y también, sin limitaciones, el sexo del paciente, el peso y la edad, la severidad de cualquier incapacidad para regular la glucosa en sangre, las causas subyacentes de cualquier incapacidad para regular la glucosa en sangre, la severidad real del trauma causado por la intervención quirúrgica, la ruta de administración y la biodisponibilidad, la persistencia en el cuerpo, la formulación, y la potencia del compuesto administrado. La duración preferida de la administración de los compuestos utilizados en la presente invención es de no más de cinco días después de la intervención quirúrgica.

D. Tratamiento de la resistencia a la insulina

Los ITP modificados de la invención se pueden utilizar para tratar la resistencia a la insulina independientemente de su uso en el tratamiento posquirúrgico. La resistencia a la insulina se puede deber a una disminución de la unión de la insulina a los receptores de la superficie de las células, o a alteraciones del metabolismo intracelular. El primer tipo, caracterizado por una disminución de la sensibilidad a la insulina, se puede superar típicamente mediante una concentración incrementada de insulina. El segundo tipo, caracterizado por una disminución de la capacidad de respuesta a la insulina, no se puede superar con grandes cantidades de insulina. La resistencia a la insulina posterior a un trauma se puede superar mediante dosis de insulina que son proporcionales al grado de resistencia a la insulina, y así está causada aparentemente por una disminución de la sensibilidad a la insulina.

La dosis de los ITP modificados efectiva para normalizar el nivel de glucosa en la sangre de un paciente dependerá de un número de factores, entre los cuales se incluyen, sin limitaciones, el sexo del paciente, el peso y la edad, la severidad de la incapacidad para regular la glucosa en sangre, las causas subyacentes de la incapacidad para regular la glucosa en sangre, si la glucosa, u otra fuente de hidratos de carbono, se administra simultáneamente, la ruta de administración y la biodisponibilidad, la persistencia en el cuerpo, la formulación, y la potencia.

5. Administración de los ITP modificados

Los ITP modificados se administrarán en un medio fisiológicamente aceptable, por ejemplo agua desionizada, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina, etanol acuoso u otro alcohol, plasma, soluciones proteináceas, manitol, glucosa acuosa, alcohol, aceite vegetal, u otras similares. Otros aditivos que se pueden incluir incluyen tampones, donde los medios están generalmente tamponados a un pH en el intervalo de aproximadamente 5 a 10, donde el tampón generalmente variará su concentración de aproximadamente 50 a 250 mM, sal, donde la concentración de sal variará generalmente de aproximadamente 5 a 500 mM, estabilizantes fisiológicamente aceptables, y otros similares. Las composiciones se pueden liofilizar para el conveniente almacenamiento y transporte.

Los ITP modificados se administrarán en su mayor parte oralmente, parenteralmente, tal como intravascularmente (IV), intraarterialmente (IA), intramuscularmente (IM), subcutáneamente (SC), o de formas similares. La administración puede ser mediante transfusión en situaciones apropiadas. En algunos casos, donde la reacción del grupo funcional es relativamente lenta, la administración puede ser oral, nasal, rectal, transdérmica o mediante aerosol, donde la naturaleza del conjugado permita la transferencia al sistema vascular. Habitualmente se empleará una única inyección aunque se puede utilizar más de una inyección, si se desea. Los ITP modificados se pueden administrar mediante cualesquiera métodos convenientes, incluyendo jeringa, trocar, catéter, u otros similares. La forma concreta de administración variará dependiendo de la cantidad a ser administrada, si se hace mediante inyección intravenosa rápida o administración continua, u otras similares. Preferiblemente, la administración será intravascular, donde el lugar de introducción no es crítico para esta invención, preferiblemente en un lugar donde haya un flujo rápido de sangre, por ejemplo, intravenosamente, en una vena periférica o central. Otras rutas pueden encontrar uso donde la administración esté acoplada a técnicas de liberación lenta o a una matriz protectora. La intención es que los ITP se distribuyan de forma efectiva en la sangre, de forma que sean capaces de reaccionar con los componentes de la sangre. La concentración del conjugado variará ampliamente, oscilando generalmente de aproximadamente 1 pg/ml a 50 mg/ml. El total administrado intravascularmente estará generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, más habitualmente de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml.

Uniéndolo a componentes de la sangre de larga vida, tales como la inmunoglobulina, la albúmina del suero, los glóbulos rojos y las plaquetas, se logra un número de ventajas. La actividad del compuesto de los ITP modificados se extiende de días a semanas. Sólo se necesita dar una administración durante este período de tiempo. Se puede lograr mayor especificidad, puesto que el compuesto activo se unirá primariamente a moléculas grandes, donde es menos probable que sea absorbido intracelularmente para interferir con otros procesos fisiológicos.

La formación del enlace covalente entre el componente de la sangre puede ocurrir in vivo y ex vivo. Para la formación del enlace covalente ex vivo, se añade el ITP modificado a sangre, suero o solución salina que contienen albúmina de suero humano o IgG para permitir la formación del enlace covalente entre el ITP modificado y el componente de la sangre. En un formato preferido, se modifica el ITP con maleimida y se le hace reaccionar con albúmina de suero humano en solución salina. Una vez que el ITP modificado ha reaccionado con el componente de la sangre, para formar un conjugado ITP-proteína, se puede administrar el conjugado al paciente.

De forma alternativa, se puede administrar al paciente directamente el ITP modificado de forma que el enlace covalente entre el ITP modificado y el componente de la sangre se forma in vivo.

6. Seguimiento de la presencia de ITP modificados

En la sangre del mamífero hospedador se puede hacer un seguimiento de la actividad de los ITP y/o de la presencia de los ITP modificados. Tomando una porción o muestra de la sangre del hospedador a tiempos diferentes, se puede determinar si el ITP se ha llegado a unir a los componentes de la sangre de larga vida en cantidad suficiente para ser terapéuticamente activo y, después de esto, el nivel del compuesto ITP en la sangre. Si se desea, se puede determinar también a cuál de los componentes de la sangre está unida la molécula de ITP. Esto es particularmente importante cuando se usan ITP no específicos. En el caso de maleimido-ITP específicos, es mucho más sencillo calcular la semivida de la albúmina de suero y la IgG.

El seguimiento de los GLP modificados se puede realizar utilizando ensayos de actividad insulinotrópica, HPLC-MS o anticuerpos dirigidos contra los ITP.

A. Ensayos de actividad insulinotrópica

La presente invención concierne a derivados de ITP modificados que tienen una actividad insulinotrópica que excede o iguala la actividad insulinotrópica de los ITP no modificados. La propiedad insulinotrópica de un compuesto se puede determinar proporcionando ese compuesto a células animales, o inyectando ese compuesto a animales y realizando un seguimiento de la liberación de insulina inmunorreactiva (IRI) a los medios o al sistema circulatorio del animal, respectivamente. La presencia de IRI se detecta a través del uso de un radioinmunoensayo que pueda detectar específicamente la insulina.

Aunque se puede emplear cualquier radioinmunoensayo capaz de detectar la presencia de IRI, es preferible utilizar una modificación del método de ensayo de Albano, J. D. M., et al., (Acta Endocrinol. 70:487-509 (1972)). En esta modificación, se emplea un tampón de fosfato/albúmina con un pH de 7,4. La incubación se prepara con la condición consecutiva de 500 \mul de tampón fosfato, 50 \mul de una muestra de perfundido o un patrón de insulina de rata en perfundido, 100 \mul de antisuero antiinsulina (Wellcome Laboratories; dilución 1:40.000), y 100 \mul de [^{125}I]-insulina, dando un volumen total de 750 \mul en un tubo desechable de vidrio de 10 x 75 mm. Después de la incubación durante 2-3 días a 4ºC, se separa la insulina libre de la insulina unida a anticuerpos mediante la separación con carbón activo. La sensibilidad del ensayo es generalmente 1-2 \mul U/ml. Con el propósito de medir la liberación de IRI al medio de cultivo celular de células crecidas en un cultivo de tejidos, se incorpora preferiblemente un marcaje radiactivo a la proinsulina. Aunque se puede utilizar cualquier marcaje radioactivo capaz de marcar un polipéptido, es preferible utilizar ^{3}H-leucina con el propósito de obtener el marcaje de la proinsulina. El marcaje se puede hacer durante cualquier período de tiempo suficiente para permitir la formación de un conjunto de moléculas de proinsulina marcadas de forma detectable; sin embargo, es preferible incubar células en presencia de una marca radiactiva durante un período de tiempo de 60 minutos. Aunque se puede utilizar cualquier línea celular capaz de expresar insulina para determinar si un compuesto tiene un efecto insulinotrópico, es preferible utilizar células de insulinoma de rata, y especialmente células RIN-38 de insulinoma de rata. Tales células se pueden hacer crecer en un medio adecuado; sin embargo, es preferible utilizar medio DME que contenga BSA al 0,1% y glucosa 25 mM.

La propiedad insulinotrópica de un ITP modificado se puede determinar también mediante infusión pancreática. La preparación de páncreas de rata perfundido aislado in situ es una modificación del método de Penhos, J. C., et al. (Diabetes 18:733-738 (1969)). De acuerdo con tal método, se anestesian ratas mantenidas en ayunas (preferiblemente ratas albinas macho de la cepa de Charles River), que pesen 350-600 g, con una inyección intraperitoneal de amital sódico (Eli Lilly and Co., 160 ng/kg). Se ligan los vasos sanguíneos renales, adrenales, gástricos, y los inferiores del colón. Se reseca el intestino entero excepto por aproximadamente cuatro cm de duodeno y el colon descendente y el recto. Con ello, sólo se perfunde una pequeña parte del intestino, minimizando así la posible interferencia de sustancias entéricas con inmunorreactividad insulinotrópica. El perfundido es preferiblemente un tampón de bicarbonato de Krebs-Ringer modificado con dextrano T70 al 4% y albúmina de suero bovino (fracción V) al 0,2%, en el que preferiblemente se hace burbujear O_{2} al 95% y CO_{2} al 5%. Se utiliza preferiblemente una bomba que soporta un rodillo de cuatro canales, para flujo no pulsátil (Buchler polistática, División de Instrumentos Buchler, Nuclear-Chicago Corp.), y el cambio de una fuente de prefundido a otra se logra preferiblemente cambiando la posición de una llave de paso de tres vías. La manera en la que la perfusión se realiza, modifica, y analiza sigue preferiblemente los métodos de Weir, G. C., et al., (J. Clin. Investigat. 54:1403-1412 (1974)), que se incorpora a la presente memoria como referencia.

B. HPLC-MS

Se puede utilizar HPLC acoplada a espectrometría de masas (MS) para ensayar la presencia de péptidos y péptidos modificados como es bien conocido para el experto en la técnica. Típicamente se utilizan dos fases móviles: TFA al 0,1%/agua y TFA al 0,1%/acetonitrilo. Las temperaturas de las columnas pueden variarse así como las condiciones de los gradientes. Los detalles particulares se perfilan en la sección de Ejemplos más adelante.

C. Anticuerpos

Otro aspecto de esta invención se refiere a métodos para determinar la concentración de los ITP o sus conjugados en muestras biológicas (tales como la sangre) utilizando anticuerpos específicos frente a los ITP y la utilización de tales anticuerpos como tratamiento para una toxicidad potencialmente asociada a tales ITP o conjugados. Esto es ventajoso porque la estabilidad y la vida incrementadas de los ITP in vivo en el paciente podría conducir a nuevos problemas durante el tratamiento, incluyendo una posibilidad incrementada de toxicidad. El uso de anticuerpos anti-ITP, o monoclonales o policlonales, que tienen especificidad por ITP concretos, puede ser de ayuda para mediar en cualquiera de tales problemas. El anticuerpo se puede generar o derivar de un hospedador inmunizado con el ITP modificado concreto, o con un fragmento inmunógeno del agente, o un inmunógeno sintetizado que se corresponda con un determinante antigénico del agente. Los anticuerpos preferidos tendrán alta especificidad y afinidad por las formas nativa, derivada y conjugada del ITP modificado. Tales anticuerpos se pueden marcar también con enzimas, fluorocromos, o radiomarcas.

Se pueden producir anticuerpos específicos frente a los ITP modificados utilizando ITP purificados para la inducción de anticuerpos específicos frente a los derivados de los ITP. Por inducción de anticuerpos, se entiende no sólo la estimulación de una respuesta inmune mediante la inyección a animales, sino etapas análogas en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de unión específica tales como el estudio sistemático colectivo de librerías de inmunoglobulinas recombinantes. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales se pueden producir mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la presencia de péptidos ITP en la corriente sanguínea. Las muestras de sangre y/o suero se pueden analizar mediante SDS-PAGE y transferencia tipo Western. Tales técnicas permiten el análisis de la sangre o el suero para determinar la formación de enlaces entre los ITP modificados y los componentes de la sangre.

Los anticuerpos anti-agente terapéutico se pueden utilizar también para tratar la toxicidad inducida por la administración del ITP modificado, y se pueden utilizar ex vivo o in vivo. Los métodos ex vivo incluirían el tratamiento de la toxicidad mediante inmunodiálisis empleando anticuerpos anti-agente terapéutico fijados a soportes sólidos. Los métodos in vivo incluyen la administración de anticuerpos anti-agente terapéutico en cantidades efectivas para inducir el aclaramiento de los complejos anticuerpo-agente.

Los anticuerpos se pueden utilizar para separar los ITP modificados y sus conjugados, de la sangre de un paciente ex vivo poniendo en contacto la sangre con los anticuerpos en condiciones estériles. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden fijar o inmovilizar de otra manera sobre una matriz de una columna y la sangre del paciente se puede extraer del paciente y hacerla pasar sobre la matriz. Los ITP modificados se unirán a los anticuerpos y la sangre que contiene una concentración baja del ITP, se puede hacer luego que retorne al sistema circulatorio del paciente. La cantidad de ITP modificado separada se puede controlar ajustando la presión y el caudal. La separación preferencial de los ITP modificados del componente plasmático de la sangre de un paciente se puede efectuar, por ejemplo, mediante la utilización de una membrana semipermeable, o de otra manera separando primero el componente plasmático del componente celular por medios conocidos en la técnica anterior para hacer pasar el componente plasmático sobre una matriz que contiene los anticuerpos antiterapéuticos. Alternativamente puede efectuarse la separación preferencial de las células sanguíneas conjugadas con ITP, incluyendo los glóbulos rojos, recogiendo y concentrando las células sanguíneas de la sangre del paciente y poniendo en contacto esas células con anticuerpos anti-ITP fijados para la exclusión del componente sérico de la sangre del paciente.

Los anticuerpos anti-ITP se pueden administrar in vivo, parenteralmente, a un paciente que ha recibido el ITP modificado o los conjugados para el tratamiento. Los anticuerpos se unirán a los compuestos y conjugados del ITP. Una vez unidos, la actividad del ITP se verá impedida si no completamente bloqueada reduciendo con ello la concentración biológicamente efectiva del compuesto ITP en la corriente sanguínea del paciente y minimizando los efectos secundarios perjudiciales. Además, el complejo ITP-anticuerpo unido facilitará el aclaramiento de los compuestos y conjugados del ITP de la corriente sanguínea del paciente.

La invención que ha sido descrita por complejo se ejemplifica ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos General

Se llevó a cabo la síntesis peptídica en fase sólida de los péptidos insulinotrópicos a una escala de 100 \mumoles utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc, aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) en una solución de N,N-dimetilformamida (DMF) y activación con N-metilmorfolina (NMM), y desprotección con piperidina de los grupos Fmoc (Etapa 1). Cuando se requirió, la desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAC (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). En algunos casos, la síntesis se reautomatizó después para la adición de un grupo AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético), la adición de ácido acético o la adición de un ácido 3-maleimidopropiónico (MPA) (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol a 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). Los productos se purificaron mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a 214 y 254 nm. La pureza se determinó del 95% mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

\newpage

Ejemplo 1 Preparación de Tyr^{32}-exendina 4(1-32)-NH_{2}

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Glu-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Tyr-amida

3

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc, aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) en una solución de N,N-dimetilformamida (DMF) y activación con N-metilmorfolina (NMM), y desprotección con piperidina de los grupos Fmoc (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

Ejemplo 2 Preparación de Tyr^{31}-exendina-4(1-31)

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Glu-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Tyr-amida

4

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc, aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) en una solución de N,N-dimetilformamida (DMF) y activación con N-metilmorfolina (NMM), y desprotección con piperidina de los grupos Fmoc (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

Ejemplo 3 Preparación de exendina-4(9-39)-NH_{2}

Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-amida

5

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc, aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) en una solución de N,N-dimetilformamida (DMF) y activación con N-metilmorfolina (NMM), y desprotección con piperidina de los grupos Fmoc (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

Ejemplo 4 Preparación de GLP-1 (1-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.5TFA

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.5TFA

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del grupo amino del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

6

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 5 Preparación de GLP-1 (1-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del grupo amino del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

7

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición de los dos grupos AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético) y del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray. ESI-MS m/z para C_{174}H_{265}N_{44}O_{56} (MH^{+}), calculado 3868, hallado [M+H_{2}]^{2+} 1934, [M+H_{3}]^{3+} 1290, [M+H_{4}]^{4+} 967.

Ejemplo 6 Preparación de GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.4TFA

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-
Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.4TFA

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se describe más adelante.

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 7 Preparación de GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.4TFA

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-
Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.4TFA

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se describe más adelante.

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición de los dos grupos AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético) y del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 8 Preparación de D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.4TFA

His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.4TFA

Se sintetizó D-Ala^{8}GLP-1 (7-36) amida como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

A. Preparación de D-Ala^{8}-GLP-1 (7-36) amida

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo del GLP-1 a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc, aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) en una solución de N,N-dimetilformamida (DMF) y activación con N-metilmorfolina (NMM), y desprotección con piperidina de los grupos Fmoc (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

B. Preparación de D-Ala^{8}-GLP-1 (7-36)-Lys^{37} (E-MPA) amida

\vskip1.000000\baselineskip

9

90

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-d-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición del ácido 3- maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 9 Preparación de D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.4TFA

His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.4TFA

El péptido GLP-1 modificado se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

10

100

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-d-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición de los dos grupos AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético) y del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 10 Preparación de exendina-4 (1-39)-Lys^{40}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.5TFA

La exendina 4 se sintetiza como se muestra en el esquema siguiente.

A. Preparación de exendina 4

11

La síntesis peptídica en fase sólida de la exendina 4 a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc. Los siguientes aminoácidos protegidos se añaden secuencialmente a la resina: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc- Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-His(Trt)-OH. Se disuelven en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de acuerdo con la secuencia, se activan utilizando hexaflourofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La separación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20% (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseada con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

B. Preparación de exendina 4 modificada (SEQ ID NO:18)

El péptido de la exendina 4 modificada se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

12

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Bpf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-His(Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 11 Preparación de exendina-4 modificada (1-39)-Lys^{40}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

El péptido de la exendina 4 modificada se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se muestra en el diagrama esquemático siguiente.

13

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Bpf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-His(Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición de los dos grupos AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético) y del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 12 Preparación de exendina-3 (1-39)-Lys^{40}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.5TFA

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.5TFA

A. Preparación de exendina 3

El péptido de la exendina 3 se sintetiza primero como se describe en el esquema siguiente.

14

La síntesis peptídica en fase sólida de la exendina 3 a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo utilizando síntesis manual en fase sólida y un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc. Los siguientes aminoácidos protegidos se añaden secuencialmente a la resina: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Boc-His(Trt)-OH. Se disuelven en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de acuerdo con la secuencia, se activan utilizando hexaflourofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La separación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20% (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (Etapa 1). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 2). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a 214 y 254 nm para dar lugar al péptido deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

B. Preparación de exendina 3 modificada

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Bpf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Boc-His(Trt)-OH (Etapa 1). La exendina 3 modificada se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido.

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 13 Preparación de exendina-3 (1-39)-Lys^{40}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.5TFA

El péptido de la exendina 3 modificada se sintetiza estableciendo enlaces a través del extremo \varepsilon-N del residuo de Lys añadido como se describe más adelante.

Utilizando síntesis peptídica automatizada, se añadieron secuencialmente a la resina de la amida de Rink de la MBHA los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Bpf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Boc-His(Trt)-OH (Etapa 1).

La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se llevó a cabo manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lavó luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatizó después para la adición de los dos grupos AEEA (ácido aminoetoxietoxiacético) y del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se llevó a cabo utilizando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin): elución con un gradiente de B al 30-55% (TFA al 0,045% en H_{2}O (A) y TFA al 0,045% en CH_{3}CN (B)) a lo largo de 180 minutos a 9,5 ml/minuto utilizando una columna Luna de Phenomenex de 10 \mu de fenilo-hexilo, de 21 mm x 25 cm y un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm. El producto tenía una pureza >95% como se determinó mediante espectrometría de masas acoplada a RP-HPLC utilizando un espectrómetro de la serie LCMS-1100 de Hewlett Packard equipado con un detector con un juego de diodos y utilizando ionización mediante electrospray.

Ejemplo 14 Preparación de Lys^{26}(\varepsilon-MPA)GLP-1(7-36)-NH_{2}

15

150

La síntesis peptídica en fase sólida del DAC:análogo del GLP-1 a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo manualmente y en un sintetizador de péptidos Symphony utilizando una resina de la amida de Rink de la MBHA protegida con Fmoc. Los siguientes aminoácidos protegidos se añaden secuencialmente a la resina: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Giy-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Trt)-OH. Se disuelven en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de acuerdo con la secuencia, se activan utilizando hexaflourofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La separación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20% (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (Etapa 1). La desprotección selectiva del grupo Lys(Aloc) se lleva a cabo manualmente y se logra tratando la resina con una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh_{3})_{4} disueltos en 5 ml de CHCl_{3}:NMM:HOAc (18:1:0,5) durante 2 horas (Etapa 2). La resina se lava luego con CHCl_{3} (6 x 5 ml), HOAc al 20% en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml). La síntesis se reautomatiza después para la adición del ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). La escisión de la resina y el aislamiento del producto se lleva a cabo utilizando TFA al 86%/TIS al 5%/H_{2}O al 5%/tioanisol al 2% y fenol al 2%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin) utilizando una columna Dynamax C_{18} de 60 \ring{A}, 8 \mum y 21 mm x 25 cm, equipada con una columna Dynamax C_{18}, de 60 \ring{A}, módulo guarda de 8 \mum y 21 mm x 25 cm, y con un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al DAC deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

16

160

Ejemplo 15 Preparación de GLP-1 (7-36)-EDA-MPA

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo del GLP-1 modificado a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo manualmente y sobre SASRIN (resina supersensible al ácido) en un sintetizador de péptidos Symphony. Los siguientes aminoácidos protegidos se añaden secuencialmente a la resina: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Trt)-OH. Se disuelven en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de acuerdo con la secuencia, se activan utilizando hexaflourofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La separación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20% (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (Etapa 1). El péptido totalmente protegido se escinde de la resina mediante el tratamiento con TFA al 1% / DCM (Etapa 2). Después se añaden secuencialmente al extremo carboxilo libre etilendiamina y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Luego se escinden los grupos protectores y el producto se aísla utilizando TFA al 86%/TIS al 5%/H_{2}O al 5%/tioanisol al 2% y fenol al 2%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin) utilizando una columna Dynamax C_{18} de 60 \ring{A}, 8 \mum y 21 mm x 25 cm, equipada con una columna Dynamax C_{18}, de 60 \ring{A}, módulo guarda de 8 \mum y 21 mm x 25 cm, y con un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al DAC deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP-HPLC.

Ejemplo 16 Preparación de exendina-4 (1-39)-EDA-MPA

El esquema siguiente ilustra la síntesis de la exendina-4 (1-39)-EDA-MPA.

18

180

La síntesis peptídica en fase sólida del análogo de la exendina-4 modificada a una escala de 100 \mumoles se lleva a cabo manualmente y sobre SASRIN (resina supersensible al ácido) en un sintetizador de péptidos Symphony. Los siguientes aminoácidos protegidos se añaden secuencialmente a la resina: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmac-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-His(Trt)-OH. Se disuelven en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de acuerdo con la secuencia, se activan utilizando hexaflourofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La separación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20% (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (Etapa 1). El péptido totalmente protegido se escinde de la resina mediante el tratamiento con TFA al 1% / DCM (Etapa 2). Después se añaden secuencialmente al extremo carboxilo libre etilendiamina y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Luego se escinden los grupos protectores y el producto se aísla utilizando TFA al 86%/TIS al 5%/H_{2}O al 5%/tioanisol al 2% y fenol al 2%, seguidos de la precipitación mediante Et_{2}O enfriado en hielo seco (Etapa 4). El producto se purifica mediante HPLC preparativa en fase inversa utilizando un sistema de HPLC binaria preparativa de Varian (Rainin) utilizando una columna Dynamax C_{18} de 60 \ring{A}, 8 \mum y 21 mm x 25 cm, equipada con una columna Dynamax C_{18}, de 60 \ring{A}, módulo guarda de 8 \mum y 21 mm x 25 cm, y con un detector de UV (Dynamax UVD II de Varian) a \lambda de 214 y 254 nm para dar lugar al DAC deseado con una pureza >95%, como se determina mediante RP- HPLC.

\vskip0.333000\baselineskip

<110> ConjuChem, Inc.

\hskip1cm

Bridon, Dominique P.

\hskip1cm

L'Archeveque, Benoit

\hskip1cm

Ezrin, Alan M.

\hskip1cm

Holmes, Darren

\hskip1cm

Leblanc, Anouk

\hskip1cm

St. Pierre, Serge

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<120> PÉPTIDOS INSULINOTRÓPICOS DE LARGA DURACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<130> 1610

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<140>

\vskip0.333000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<150> 60/159,783

\vskip0.333000\baselineskip

<151> 15-10-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<150> 60/134,406

\vskip0.333000\baselineskip

<151> 17-05-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<160> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val}

\sac{Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu}

\sac{Val Lys Gly Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

\newpage

\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly}

\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val}

\sac{Xaa Gly Arg Xaa Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Ser Asp val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu}

\sac{Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser}

\sac{Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu}

\sac{Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser}

\sac{Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln met Glu Glu}

\sac{Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu}

\sac{Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Met Ile Glu}

\sac{Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val}

\sac{Ser Ser Try Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu}

\sac{Val Lys Gly Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly}

\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu}

\sac{Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser}

\sac{Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu}

\sac{Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser}

\sac{Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu}

\sac{Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu met Glu Glu}

\sac{Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<440> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu}

\sac{Trp Leu Lys Gly Gly Pro Ser Ser Gly Pro Pro Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (24)

1. Un péptido insulinotrópico modificado o un derivado o fragmento suyo que contiene:

- un péptido insulinotrópico o un derivado o fragmento que tiene actividad insulinotrópica;

y

- un grupo maleimido acoplado al péptido insulinotrópico o derivado o fragmento, siendo capaz el grupo maleimido de reaccionar con grupos tiol de los componentes de la sangre para formar un enlace covalente estable.

2. El péptido modificado de la reivindicación 1, en el que el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en GLP-1, exendina-3, exendina-4 y sus análogos.

3. El péptido modificado de la reivindicación 2, en el que el péptido insulinotrópico es el GLP-1 (7-36) o un análogo suyo.

4. El péptido modificado de la reivindicación 1, en el que el componente de la sangre es la albúmina del suero.

5. El péptido modificado de la reivindicación 1, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15.

6. El péptido modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22.

7. Una composición que contiene un péptido insulinotrópico modificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para uso en un método para tratar la diabetes en un ser humano.

8. Un conjugado que contiene un péptido insulinotrópico modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 unido covalentemente a una proteína de la sangre.

9. Un conjugado según la reivindicación 8, en el que la proteína de la sangre es la albúmina del suero.

10. El uso de una composición para la fabricación de un medicamento que extiende la semivida in vivo de un péptido insulinotrópico en un paciente que padece diabetes, conteniendo la composición un derivado de un péptido insulinotrópico o un análogo suyo, conteniendo dicho derivado un grupo maleimido acoplado al péptido insulinotrópico, siendo capaz el grupo maleimido de reaccionar con grupos tiol de los componentes de la sangre para formar enlaces covalentes estables.

11. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en GLP-1, exendina-3, exendina-4 y sus análogos.

12. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que el derivado se hace reaccionar con la albúmina del suero.

13. El uso de la composición de la reivindicación 10, en el que dicho péptido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15.

14. Un péptido insulinotrópico seleccionado del grupo que consiste en GLP-1(1-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}; GLP-1(1-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AAEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; GLP-1(7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}; GLP-1(7-36)-Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; D-Ala^{8} GLP-1(7-36)-Lys^{37}-(\varepsilon-MPA)-NH_{2}; D-Ala^{8} GLP-1(7-36)-Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2},
exendina-4 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2}; exendina-4(1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}; exendina-3 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} y exendina-3 (1-39)-Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA).

15. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-(AEEA)_{n}-MPA)-NH_{2}, en el que n es un número entero de 0 a 2.

16. Un compuesto según la reivindicación 15, que es D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-MPA)-NH_{2}.

17. Un compuesto según la reivindicación 15, que es D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-NH_{2}.

18. Un compuesto según la reivindicación 15, que es D-Ala^{8} GLP-1 (7-36)-Lys^{37}(\varepsilon-AEEA-MPA)-NH_{2}.

19. Una composición que contiene un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. El uso de compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18 en la fabricación de un medicamento para tratar la diabetes o incrementar la expresión de la insulina en un paciente.

21. Un conjugado que contiene un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18 unido covalentemente a una proteína de la sangre.

22. Un conjugado según la reivindicación 21, en el que la proteína de la sangre es la albúmina.

23. Una composición que contiene un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 21 ó 22 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. El uso de la composición según la reivindicación 23 para la fabricación de un medicamento para extender la semivida in vivo de un péptido insulinotrópico en un paciente que padece diabetes.